Изучение физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений картофеля к высокой температуре с использованием клеточной технологии

Авганова, Холиса Хокироевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений картофеля к высокой температуре с использованием клеточной технологии
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений картофеля к высокой температуре с использованием клеточной технологии"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И ГЕНЕТИКИ

АВГАНОВА ХОЛИСА ХОКИРОЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ К ВЫСОКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОЧНОЙ ТЕХНОЛОГИИ

(03.00.12 - физиология и биохимия растений)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологическх наук

Душанбе - 2006

Работа выполнена в Институте физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан

Научные руководители: член-корреспондент

АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук, профессор К. А. Алиев,

кандидат биологических наук, доцент М.Д. Дарвозиев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор, М.А.Бабаджанова,

кандидат биологических наук М.А. Анварова

Ведущяя организация: НПО "Богпарвар" Таджикской

Академии сельскохозяйственных наук Республики Таджикистан

Защита состоится 006 г. в_/^часов на заседании

диссертационного совета Д 047.001.01 при Институте физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан (734063, г. Душанбе, ул. Айни, 299/2). lab.gen@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Индиры Ганди АН Республики Таджикистан.

Автореферат разослан дЖ/^РЛ.2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совер^

доктор биологических наук С^Ш^^5"^ Джумаев Б.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В последние годы в сельскохозяйственном производстве все больше используются нетрадиционные технологии - генная и клеточная биотехнология. В биотехнологии растений особую роль играет клеточная селекция, при которой отбор клеточных линий и растений с новыми хозяйственно-ценными свойствами проводится на уровне культивируемых in vitro клеток.

Получение таким путем растений из отработанных в селективных условиях каллусных клеток возможно благодаря уникальному свойству растительной клетки - ее тотипотентности. Приемы культивирования растительных клеток и регенерации из них растений разработаны для многих сельскохозяйственных культур, они позволяют реализовать возможности клеточной селекции для создания новых сортов растений (Tal, 1983; Dix, 1986; Сидоров, 1990; Носов, 1999). Мощным источником генетического разнообразия растений является сомаклональная изменчивость, возникающая при прохождении растениями стадии неорганизованного роста, и/или при длительном культивировании в условиях in vitro (Носов, 1999; Высоцкая, 2003).

Вместе с тем, в селекции растений in vitro следует реально учитывать и ограничения клеточной технологии. Несмотря на большое количество работ методы целенаправленного улучшения хозяйственно-ценных признаков растений in vitro на основе технологии клеточной селекции все же остаются еще несовершенными. До настоящего времени использование клеточной технологии для получения клеточных линий и растений-регенерантов, резистентных к высокой температуре, остается нерешенным, что и определяет актуальность проведения таких исследований. Получение устойчивых к высокой температуре растений с помощью клеточ! юн технологии имеет для Таджикистана особую практическую значимость, т. к. у многих культурных растений, выращиваемых в Таджикистане (хлопчатник, картофель, овощные культуры), период накопления урожая приходится на самый жаркий период, что является одной из причин снижения урожайности и потери качества продукции (Алиев и др., 1997). Эта задача должна решаться в том числе за счет умелого использования достижений современной биотехнологии и природно-климатических факторов Таджикистана.

При равных условиях возделывания для получения высокого урожая картофеля и других культур наиболее значимы особенности сортов и качество семенного материала, определяемые системой семеноводства и методами получения семенного материала (Муминджанов, 2003; Каримов и др., 2004; Давлятназарова и др., 2004).

К сожалению, имеющиеся в производстве сорта не всегда отвечают запросам картофелеводства из-за неустойчивости к болезням и воздействию стрессовых природных факторов горных регионов республики. Поэтому создание форм, линий, сортов картофеля как методами традиционной селекции, так и современной биотехнологии (клеточной селекции, генной инженерии), адаптированных для каждой зоны, в будущем имеет большую перспективу.

В Таджикистане были предприняты попытки использования клеточной технологии для получения регенерантов разной степени устойчивости к условию внешних факторов среды (Aliev, Davlatnazarova, 1995; Давлятназаро-ва, 1997; Анварова, 1998; Давлятназарова и др., 2003; Муминджанов, 2003).

В настоящей работе проведена специальная постановка исследований клеточной технологии для получения устойчивых регенерантов к температурному фактору.

Цель и задачи работы. Получение клеточных линий картофеля, устойчивых к природным стрессовым воздействиям (высокой температуре, водному дефициту и т. д.), регенерирование из них фертильных растений методами современной биотехнологии и использование их как модели для изучения физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений к стрессу.

В связи с поставленной целью в задачи работы входило:

• подбор оптимальных условий культивирования;

• подбор культуральной среды, типа экспланта и оптимальных условий культивирования картофеля in vitro;

• изучение особенностей морфогенеза каллусных клеток при действии высокой температуры;

• подбор условий селективного отбора клеток и регенерантов, устойчивых к действию высокой температуры;

• изучение некоторых морфо-физиологических параметров темпера-туроустойчивых растений-регенерантов (ТУ-регенерантов) при действии высокой температуры;

• изучение некоторых биохимических особенностей температуроусгой-чивых растений-регенерантов (ТУ-регенерантов) при действии засухи (водного дефицита).

Научная новизна. Проведен скрининг морфо-физиологичсской характеристики компетенции в культуре in vitro растений картофеля сорта Жуковский ранний. Получен ряд линий, различающихся по некоторым физиологическим признакам и продуктивности.

При воздействии высокой температуры (+41°С, +45°С и +47°С) на культивируемые каллусные ткани картофеля отобраны темиературо- устойчивые линии. Полученные от них растения отличались по некоторым морфологическим признакам от исходных. Стабильными оказались изменения, вызванные действием более высокой температуры (+47°С), тогда как у сомакло-нальных линий при меньшей температуре (+41°С) они со временем терялись. Огселектировш и гый приз1 ик (повышенная резистентность к +47°С) сохранялся на протяжении нескольких лет испытаний в полевых условиях, а также in vitro. Полученные резистентные линии существенно отличались друг от друга по структуре урожая. Показано, что адаптированные к температурному стрессу регенеранты картофеля, полученные в результате клеточной селекции, характеризуются более высоким содержанием свободного пролина по сравнению контрольными растениями, и это можно использовать как тест -признак при оценке уровня устойчивости генотипов картофеля к температурному стрессу и другим природным неблагоприятным факторам.

Практическая ценность диссертации. Отработана система каллусоге-неза и регенерации картофеля, что позволило оптимизировать процесс регенерации в стрессовых условиях in vitro. Важным результатом работы является выделение регенерантов, устойчивых к высокой температуре и водному дефициту (засухе). Эти свойства можно использовать для расширения генетического базиса селекции как донора генов устойчивости к стрессу, а также для решения прикладных задач и в научных целях как модель физиологической, молекулярно-генетической и прикладной биотехнологии.

Апробация диссертации. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научно-практических конференциях: первой республиканской конференции "Экология и здоровье," 2001; конференции "Молодые ученые и современная наука", 2001; 2002; конференции "Вопросы сохранения и рационального использования растительного разнообразия Таджикистана", 2002; научно-педагогических конференциях Таджикского государственного национального университета, 2002-2005 г.

Структура и объем работы: работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, результаты исследований и их обсуждение, выводов, списка литературы. Работа изложена на 93 стр., содержит 17 рисунков, 10 таблиц. Количество цитированных источников 114.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 8 работ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом для исследований служили пробирочные растения картофеля (Solanum tuberosum L.) сорта Жуковский ранний.

Для культивирования in vitro растений и клеточных культур использовали питательную среду Мурасиге и Скуга (MC), содержащую агар-агар -6 % и сахарозу - 2 %.

Для получения и субкультивирования каллусных тканей из отрезков междоузлий пробирочных растений картофеля использовали среду MC, содержащую сахарозу - 3 %, агар-агар - 7 %, казеин - 0,5 %, а-НУК - 5 мг/л и 6-БАП-2 мг/л (среда А).

Регенерацию растений из клеточных культур проводили в два этапа с использованием следующих сред. На первом этапе регенерации растений из клеточных культур применяли среду MC, содержащую сахарозу - 2,5 %, манитол - 3 %, гидролизат казеина - 50 мг/л, а-НУК -1,0 мг/л, 6 -БАП - 0,5 мг/л, никотиновую кислоту - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л (среда Б). На втором этапе регенерации растений использовали ту же среду, что и на первом этапе, 6-БАП был заменен на зеатин - 0,5 мг/л, ß-ИУК - 1 мг/л (среда В).

Все растения in vitro и клеточные культуры поддерживали при температуре +20...+25°С, световой период - 16 ч, освещенность - 7000 лк, для клеточных растений - 3000 лк, влажность - 75-80 %.

Растения, полученные из каллусных линий in vitro, черенковали в пробирках (16x20 мм) и выращивали в стандартных условиях (освещенность -

7000 лк, световой период -16 ч). Устойчивость линий растений к высокой температуре оценивали на уровне пробирочных растений. Для этого получали по 400 пробирочных растений и переносили в камеру, где температура была +47°С (растения выдерживали в течение 24 ч при освещенности 3000 лк, влажности 75 %). По истечении этого срока все растения переносили в обычные условия выращивания, при которых наступала гибель растений. Все погибшие растения (4 варианта по 400 растений) сохраняли в течение 60 дней в обычных условиях выращивания. По истечении этого срока в варианте 4 (+47°С) в некоторых случаях наблюдалось позеленение нижней части стебля на уровне верхнего слоя агара. Эти части растения осторожно переносили в свежую среду для черенкования. Через 25-27 дней из этой части стебля образовались вторичные стебли, затем листочки, и сформировались нормальные растения. Эти растения использовали в дальнейших экспериментальных исследованиях.

Ошибки экспериментов не превышали уровня 5 %.

С целью изучения связи между физиологическим состоянием и формированием элементов продуктивности на разных этапах развития растений изучали следующие показатели:

1 .Оводненность - путем взвешивания растений (in vitro) или листьев (in vivo) на торзионных весах до и после высушивания в термостате при + 105°С до постоянной массы.

2.Водоудерживающую способность - методом "завядания" (по П.А. Геикелю, 1982) путем подсушивания растений, выращиваемых in vitro до и после подсушивания в течение 1 ч. Потери воды выражали в процентах.

Растения выращивали в торфо-почвенной культуре в оранжерее Института физиологии растений и генетики АН РТ (июнь-август). Во время бутонизации растений условия засухи создавали прекращением полива. Все эксперименты проводили на 2-3 верхних листьях.

Содержание хлорофилла определяли извлечением ацетоном с последующей спектрофотометрией на Ultrospec-II (Швеция).

Расчеты производили по формулам:

С хл. а = 13,70-Еш - 3,76-Еб49, Схл. в —25,80-Еш - 7,60-Е66у

Хроматографическое определение свободного пролина.

Для этого пробы в количестве 1 г сырого вещества (растений-регене-рантов или листьев картофеля) гомогенезировали в трициновом буфере, содержащем 0,02 М трицина, 0,1% глицерина, 0,01 М MgCl,, 0,001 М эти-лендиамин тетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,05% тритон JÍ-100, рН 3,5. Гомогенат быстро центрифугировали при 6000 об./мин в течение 10 мин. В надосадочной жидкости определяли содержание свободного пролина. Определение содержания свободного пролина в пробах проводили хроматог-рафическим методом на тонком слое целлюлозы по методике Н.Ф. Белан, З.Н. Абдурахмановой (1969). Для разгонки использовали органические

растворители в следующих пропорциях (изопропиловый спирт - муравьиная кислота - вода в соотношении 3:1:1).

Площадь, занимаемую на хроматографической пластинке пролином, определяли по формуле: 8=(0,252ХГ+ 0,398Х,)-12,21 при ширине слоя целлюлозы 0,2 - 0,4 мм, где: Б - площадь, занимаемая пролином (кв.см), X, -средняя длина площади, занимаемой пролином (мм), X, - средняя ширина площади,, занимаемой пролином (мм).

Калибровочную кривую составили согласно Р. Шталю (1965) по занимаемой пролином площади на хроматограмме.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение линии картофеля, устойчивой к высокой температуре

Отрезки междоузлий и/или кусочки листа пробирочных растений культивировали на среде А для формирования первичных каллусных клеток в течение 30 суток. Первичные каллусы, образовавшиеся на срезах междоузлий и/или кусочках листа, отделяли от экспланта и переносили на поверхность такой же питательной среды (среда А) и выращивали при температуре +37°С, +41°С, +45°С и +47°С в течение 16 ч в полной темноте.

В каждом варианте опыта было высажено по 12 каллусов. Контролем служил вариант с каллусами, выращиваемыми при +27°С. Через 9 дней культивирования наблюдали отличия каллусов в разных вариантах по их размеру и цвету. В варианте с воздействием на каллусы температуры +41°С наблюдалась некоторая стимуляция роста, при температуре +45°С интенсивность роста снижалась (табл. 1).

При +47°С была отмечена полная задержка роста. На 20 день культивирования в варианте с выращиванием каллусов при +37°С сохранялась тенденция к увеличению роста. При +41 °С рост каллусов был близок к контролю. При +45°С отмечалось резкое ингибирование роста, а в варианте +47°С рост был почти полностью ингибирован. Во всех вариантах, за исключением вариантов с выращиванием каллусов при +45°С и +47°С, образовались корни '1епоуо; цвет ткани был серо-зеленый без некроза. При +47°С некоторые каллусы побурели и образовались единичные корни (табл.2).

Для дальнейшей работы каллусы переносили на среды для регенерации (среда Б). Из каждого варианта было высажено на среду регенерации по 7075 каллусов.

Каллусы всех вариантов культивировали при нормальной температуре (+22°С) при 16-часовом световом режиме. Активная пролиферация наблюдалась у каллусов контрольного варианта и каллусов, образовавшихся при +41°С, +45°С и +47°С. После появления рыхлых зеленеющих глобулярных структур ткани переносили на среду регенерации В. На этой среде во всех вариантах наблюдали появление апикальных структур через 20-25 дней. В дальнейшем образовались побеги, т.е. растения-регеиеранты. Количество образовавшихся растений-регенерантов было неодинаковым. Самое высокое - в контроле. Единичные растения-регенеранты образова-

лись в варианте +47°С. Высота побегов снижалась по мере увеличения температуры. Количество корней в расчете на растение также было выше в контрольном варианте и далее снижалось при +45°С и +47°С. Наиболее сильное угнетение роста и наименьшее количество корней наблюдалось в варианте с выращиванием каллусов при +47°С (табл.1).

Таблица 1

Каллусогенез картофеля при действии высокой температуры

Вариант Количество Количество %

каллусов, шт. регенератов, шт. регенерангов

Контроль, 27°С 135 130 89

41°С 136 128 80

45°С 136 18 22

47°С 135 14 11

Как видно из данных табл. 1, по мере возрастания температуры уменьшалось количество эмбриогенных каллусов и регенерация из них полноценных растений. Количество морфогенных каллусов при воздействии высокой температуры на них резко сократилось и составило лишь 11%. Полученные данные показали, что при селекции каллусных культур необходимо иметь большое количество каллусных культур для достоверного отбора из них устойчивых к температурному фактору растений-регенерантов.

При воздействии температурного стресса на каллусогенез и рост каллусных тканей удалось получить большое разнообразие каллусов, отличающихся по морфологическому потенциалу (рост и цвет) (табл. 2). По мере повышения температурного воздействия изменились рост каллусов и их окраска. При температурном воздействии +27° и +410 С каллусы представляли собой плотную консистенцию и состояли из крупных гроздьев, имели серо-светлую и зеленоватую окраску.

Каллусы, образовавшиеся при +45° и +47°, состояли из мелких глобулярных структур, имели желто-темный цвет, диаметр примерно в три раза меньше, чем у каллусов, образовавшихся при температуре +22 и +23°С. Некоторые из этих глобулярных структур формировали корни и побеги.

Таким образом, в результате этой серии экспериментов удалось получить эмбриогенные каллусы, обладающие разным типом морфогенеза и побегообразованием.

Далее растения-регенеранты подвергались повторно воздействию высокой температуры. В опыте использовали до 800 пробирочных растений. Каждое растение-регенерант было размножено черенкованием и служило началом сомаклональной вариантной линии (клона).

Далее определяли чувствительность полученных растений-регенерантов к температурному режиму. Для этого мы выбрали только температуру +45°С и +47°С.

Повторные воздействия на растения-регенеранты всех вариантов температуры +45°С, +47°С в течение 24 ч привели к полной гибели контрольных растений как при +45°С, так и при +47°С.

Таблица 2

Влияние высокой температуры на рост каллусов (9-дневные культуры)

Вариант Диаметр каллусов, мм Диаметр каллусов, в % от контроля Окраска ткани

Контроль, 27 °С 10,1+0,24 100 Серо-зеленая

41<>С 8,9±0,27 88,2 Светло-зеленая

45°С 6.0±0,18 59,4 Желтовато-белая

47°С 3,2±0,13 31,7 Темно-зеленая

В дальнейшем мы выбрали растения-регенеранты для отбора устойчивых к температуре клонов (линий), которые представлены семью группами растений.

От каждой линии растений было высажено по 100 черенков для выделения устойчивых к температурному фактору растений. Испытуемые линии сравнивали с контрольными растениями, выращивая их при температуре +47"С, а в некоторых опытах при температуре +500С. Показателями оценки служили: высота растений, сухая масса побега, сухая масса корней. Все испытуемые линии превосходили контроль по устойчивости к температуре, величине сухой и сырой массы (табл. 3).

Таблица 3

Действие высокой температуры на образование сухой массы органов растений картофеля

Вариант Сухая масса растения без корней, мг/растение Общая сухая масса растения, мг/ растение Высота растения, см

Контрольные растения 6,2 ±0,2 8,4±0,3 6,4±0,2

Температуроустойчивые растения-регенеранты 10,1 ±0,3 12,8±0,3 12,1 ±0,3

Как показывают данные этой таблицы, растения-регенеранты, полу-чешше путем культуры тканей (каллусов), существенно отличались от контрольного варианта при воздействии на них высокой температуры. Растения этих вариантов были подвержены воздействию температуры (+47°С) в течение 16 ч. в термостатированной камере при влажности 60 % и затем перенесены в условия с температурой +27°С. Измерения проводились после 25-27 дней выращивания в условиях искусственного освещения. В экспери-

ментах использовались пробирочные оздоровленные растения-регенеран-ты картофеля. Как видно из данных табл. 3, растения-регенеранты имели почти в два раза больший сухой вес. Они отличались и по росту. Растения-регенеранты отличались повышенным ростом (в два раза) от растений контрольного варианта.

Для повторного воздействия высокой температуры из каждого варианта брали по 400 пробирочных растений и выдерживали в течение 24 ч. Влажность в камере поддерживали в диапазоне 67-70 %, а температуру - при +47°С. По истечении срока обработки пробирочные растения переносили в обычные условия выращивания (+20...+25°С, влажность - 70-75 %) и сохраняли в течение 60 дней. При таких условиях обработки пробирочных растений наблюдалось следующее: растения, полученные при обработке +41°С и +45°С, полностью погибли. В варианте с обработкой при температуре +47°С в 7 случаях из 400 пробирочных растений в нижней части стебля появились зеленоватового цвета участки. Из этих участков стебля в течение последующих 10-12 дней начали появляться вторичные стебли и далее образовались листочки. Эти растения пересаживали в свежую среду для регенерации. Из 7 регенерированных растений 5 оказались фертильными и 2 бесхло-рофилльными мутантами.

Фертильиые растения использовали для клонирования и полученные из них линии анализировали в полевых условиях. Структура урожая этих линий картофеля показана в табл. 4.

Таблица 4

Структура урожая линий картофеля, устойчивых к высокой температуре (первая полевая репродукция)

№ линий- реге-нерантов Макроклубни, г/куст Миниклуб-ни, г/куст Количество клубней на растение, шт. Средний вес клубня, г Общий вес клубней, г

1 295±12 54±5 9 ±2 38,8 349114

2 247±14 48±4 11±3 26,8 295111

3 427+11 73±9 6±2 81,6 49017

4 111 ±9 91+13 1013 20,2 20217

5 374±15 110114 712 69,8 484113

Как видно из данных табл. 4, полученные линии существенно отличались друг от друга по структуре урожая. Среди них были линии с низким урожаем. Некоторые линии являются перспективными и их можно использовать в селекционном процессе для получения семенного картофеля.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют об определенных успехах в отборе на температурную устойчивость с использованием каллусных культур и целых растений in vitro для оценки результатов отбора. Полученные таким путем линии растений являются сомаклональными вариантами. Давление на уровне неорганизованной пролиферации дало

возможность выявить резистентные к высокой температуре (+47°С) линии картофеля. Стабильными оказались изменения, вызванные действием более высокой (+47°С) температуры, тогда как у сомаклональных линий при более низкой температуре (+41°С) они со временем терялись, т.е. проявлялся эпигенетический эффект на уровне растений-регенерантов.

Полученные таким путем растения мы обозначили как тепературоус-тойчивые растения-регенеранты (ТУ-растения).

В связи с этим представляет большой интерес изучение физиологии растений-регенерантов картофеля, адаптированных к стрессовым экологическим факторам.

Некоторые физиологические особенности растений картофеля, полученные методом культуры тканей

Продуктивность. В последнее время широкое распространение получил метод размножения картофеля с помощью культивирования различных органов и тканей на искусственных питательных, средах (Мелик - Саркисов и др., 1984; Трофимец, 1991). По сравнению с традиционными методами размножения этот метод обладает рядом преимуществ: отбор форм с нужным полезным признаком непосредственно в культуре т уИго; высокий коэффициент размножения; возможность получать растения-регенеранты круглый год независимо от сезона.

В работе использовали сорт Жуковский ранний и полученные от него температуроустойчивые растения-регенератны (ТУ-регенеранты).

В условиях оранжереи были посажены в торфо-почвенной смеси пробирочные растения сорта Жуковский ранний и ТУ-регенеранты растений этого сорта.

Изучение проводили после 7-10 - дневной адаптации пробирочных растений в торфо-почвенной смеси. Опыты показали, что по приживаемости между контрольными и температуроусгойчивыми растениями-регенеран-тами (ТУ-регенеранты) существенных различий не наблюдалось.

Приживаемость пробирочных растений сорта Жуковский ранний (контроль) и растений-регенерантов при посадке в торфо-почвенную смесь составила 95%.

Результаты исследований некоторых морфологических показателей сорта Жуковский ранний и растений-регенерантов картофеля приведены в табл. 5.

Высоту стебля и количество листьев учитывали после 50 дней переноса пробирочных растений в торфо-почвенную смесь. Как видно из данных табл. 5, между растениями имеются существенные различия по морфологическим показателям. По морфологическим показателям растения, полученные методом клеточной технологии, имеют несколько более низкий рост и меньшее количество листьев, чем у растений контрольного варианта.

Таблица 5

Некоторые морфологические особенности растений картофеля сорта Жуковский и температуроустойчивых форм (в условиях оранжереи)

Вариант Высота стебля, см Количество листьев, шт./растение Количество клубней, шт ./растение Средний вес клубней на одно растение, г

Сорт Жуковский ранний (контроль) 35.5±2,4 9±1 12,3+1,3 379,0±28

ТУ-регенеранты (опыт) 27,4±1,7 7±1,2 10,2±1,1 453,б±32,0

Между этими растениями различия обнаружены по отношению диаметра стебля, окраски стебля и листьев. Растения, полученные методом клеточной технологии, имеют красноватый стебель и листья. Листья этих растений более плотные и опушенные.

Учет количества клубней на одно растение, веса клубней велся после 100 дней перевода пробирочных растений в торфо-почвенную смесь в условиях оранжереи. Как видно из табл. 5, по данным показателям между этими растениями (вариантами) отмечены большие различия.

Растения, полученные методом культуры тканей, имели меньше клубней на растение, но общий всс клубней оказался больше, чем у контрольного варианта (сорт Жуковский ранний).

Таким образом, растения, полученные методом клеточной модификации, существенно отличаются по морфологии растений и имеют также некоторые различия по клубневой продуктивности.

Устойчивость растений к засухе. У выращенных пробирочных растений в почвенно-торфяной культуре формирование бутонов наблюдалось после 50-55 дней. В этот период исходные (контроль) и измененные путем клеточной технологии (опыт) растения активно образовывали бутоны. На второй день засухи листья начали терять тургор. В дальнейшем почвенная засуха усиливалась и листья в большей степени теряли тургорное состояние. Почво-торфяная смесь подсыхала и к 5-му дню содержание воды в культивационных сосудах составляло 23,0-28,5 % (расчет на сухую массу почвы). В контрольных вариантах (исходные и ТУ растения -регеиеранты) уровень воды в почве поддерживали до 75-78 % путем постоянного полива.

Как видно из представленных на рис. 1 данных, в условиях достаточного водообеспечения исходные и растения-регенеранты почти не отличались по содержанию воды в листьях. По мере создания почвенной засухи листья растений-регенерантов теряли гораздо меньше воды на протяжении эксперимента на 3, 4 и 5-е сутки засухи. Оводненность листьев растений-регенерантов превышала на 23 % (расчет на сырую массу) этот показатель у контрольных растений.

Продолжительность опыта, сутки

Рис. I. Содержание воды при действии засухи (Температуроустойчивыерасте-ния-реге неранты ).

Изучение интенсивности транспирации у растений обоих вариантов показало, что в условиях полива наблюдался неодинаковый уровень транс-пирационной активности (рис. 2).

зоо-г/ 250 200 150 100 50

Исходные формы

ТУ-ре(енерант

§ »

4 5 3 4

Продолжительность опыта, сутки

Рис. 2. Интенсивность транспирации растений при действии засухи (Температуроустойчивые растения-регенеранты ).

У растений-регенерантов интенсивность транспирации в условиях достаточного водообеспечения была несколько выше, чем у растений исходной формы (контрольный вариант). При недостатке влаги в почве (после 5 суток засухи) интенсивность транспирации снижалась и у обоих вариантов выравнивалась. В условиях засухи интенсивность транспирации снижалась почти в 2-3 раза.

В этих условиях мы изучали водоудсрживающую способность листьев (рис. 3). Как видно из данных рис. 3, водоудерживающая способность листьев в условиях достаточного водообеспечения была практически одинаковой у растений изученных вариантов. Различия между контрольными рас-

тениями и растениями-регенерантами проявились при действии засухи. Во-доудерживающая способность растений-регенерантов при засухе было значительно выше, чем у контрольных растений.

3 4 5 3 4 5

Продолжительность опыта, сутки

Рис. 3. Водоудерживающая способность растений при действии засухи (Темпе-ратуроустойчивые растения-регенеранты ).

Полученные результаты показали, что по мере усиления водного дефицита (засухи) у растений-регенерантов проявлялись свойства, обеспечивающие их выносливость к обезвоживанию и перегреву почвы.

Морфология культуры тканей

Происхождение экспланта имеет важное значение не только как начальный источник дня каллусогенеза, но и является одним из определяющих факторов соматического эмбриогенеза (Давлятназарова и др., 2003 г.). Вместе с тем, интенсивность соматического эмбриогенеза и регенерации из них растений зависит от состава питательной среды. Как видно из представленных результатов (рис. 4), выход (частота) регенерантов (эмбриогенеза) для среды А составил 17,6 %, для среды Б - 21,5 % и для среды В -более 30 %. Наиболее оптимальной была среда В. Средняя частота эмбриогенеза - регенерантов составляла более 30 %. Они также имели наибольшую способность к регенерации растений. Среди них в дальнейшем были выделены клопы, обладающие высокими потенциальными возможностями для разработки методики получения большого количества растений-регенерантов. Клоны были размножены путем микроразмножения в условиях in vitro. Полученные данные позволили установить, что способность к соматическому эмбриогенезу картофеля определяется типом экспланта, генетическими особенностями, составом питательной среды, соотношением ауксинов и цитокининов в среде, а также определенную роль играют некоторые аминокислоты, в частности глутамин. Эксперименты с глута-мином проводились согласно Walker (1981), предлагавшему добавлять в питательную среду аминокислоты на этапе формирования соматического

эмбриогенеза. В качестве источника восстановленного азота аминокислоты принимают участие в метаболических процессах. Добавление в питательную среду Ь-глутамина в концентрации 3,0 мг/л положительно влияет на образование соматогенных зародышей и, следовательно, выход растений - регенерантов.

Рис. 4. Выход регенерантов при культивировании калуссов в различных питательных средах.

А - среда МС, дополненная 0,5 мг/л НУ К и 0,5 мг/л 6-БАП, Б - среда МС, дополненная 0,5 мг/л кинетина, 0,5 мг/л НУК, В - среда МС, дополненная 0,5 мг/л зеатина, 0,05 мг/л кинетина, 0,5 мг/л НУК, 35 мг/л гяуталшна.

На основании полученных данных для формирования соматического зародыша и повышения выхода растений-регенерантов необходимо введение в питательную среду аминокислоты глутамии. Такие же результаты были получены в экспериментах Б. Анапияева и др. (2003) для интенсификации формирования соматического зародыша люцерны и получения из него в дальнейшем растений-регенерантов. Глутамин, очевидно, играет важную роль в качестве вещества, предотвращающего вредное воздействие аммиака, образующегося при длительном культивировании экспланта in vitro.

В последующей работе (при переводе каллусов на среду регенерации) без воздействия температурного фактора были использованы ткани контрольных и подвергнутых воздействию температуры +41°С, +45°С и +47°С растений. На среду регенерации из каждого перечисленного вариантов было пересажено по 50-60 каллусов.

Во всех вариантах была отмечена пролиферация. Наиболее активная пролиферация отмечена в контрольном варианте и наименьшая - у каллусов, обработанных при +45°С, единичная - при +47°С. Через 35-40 дней наблюдалось появление апикальных структур и далее побегов (растения-регенеранты). Такие растения-регенеранты отделяли от каллуса и переносили на среду для микроклонального размножения. Каждый регенерант,

размноженный черенкованием, был отмечен отдельно, как начало сомак-лональной вариантной линии (клон).

Оценку полученных растений-регенерантов давали по степени чувствительности растений к высокой температуре. Пробирочные растения подвергали температурной обработке в течение 30 мин при +47°С или +50°С, с последующим переводом в обычные условия культивирования in vitro (+20°., .+23°С) при 16-часовом фотопериоде. Необходимо отметить, что при таком режиме обработки у исходных растений было отмечено сильное угнетение роста и уменьшение количества корневых систем. Вместе с тем, у сомаклонов обнаружена некоторая стимуляция роста и корней. Далее, контрольные растения (исходная форма) и опытные (растения-регенеранты) сравнивали по некоторым морфологическим параметрам: высоте растений, сырой массе побега, числу корней. Растения всех испытанных вариантов превышали исходную форму (контроль) по всем трем показателям.

Содержание свободного пролнна в условиях водного стресса

Необходимо констатировать, что для растений-регенерантов картофеля характерно увеличение жароустойчивости листьев в условиях засухи. Жароустойчивость растений-регенерантов значительно возрастает на 5-е сутки засухи.

Таким образом, полученные результаты опытов демонстрируют, что в процессе прогрессирующей засухи у температуроустойчивых растений-регенерантов картофеля проявляются свойства, обеспечивающие устойчивость при водном стрессе и перегреве. На протяжении 5 суток засухи овод-ненность, водоудерживающая способность и жароустойчивость у темпера-туроустойчивых растений-регенерантов были выше, чем у растений контрольного варианта, что указывает также на их высокую способность адаптации к неблагоприятным условиям. В этих условиях, очевидно, темпера-туроустойчивые растения-регенеранты накапливали меньше АБК и больше протекторных метаболитов, таких, как свободный пролин. Так, в ряде работ продемонстрировано, что потеря тургора листьями табака ведет к повышению уровня АБК в листьях и, следовательно, к потере засухоустойчивости (Пустовойтова и др., 2000). В связи с этим нами было изучено накопление свободного пролина при возрастающей засухе в обоих вариантах опыта (контрольные растения и ТУ-регенеранты).

В вытяжках из листьев исходной формы и ТУ-регенерантов картофеля определено содержание свободного пролина. Как видно из данных рис. 5, содержание пролина в условиях нормальной оводненности листа и почвы в листьях ТУ-регенерантов и контрольных растений было почти одинаково. При увеличении дефицита влаги в почве и глубокой засухе (5 суток засухи) содержание свободного пролина в листьях ТУ-регенерантов растений резко повышалось (почти в 5-7 раз). У контрольных растений имело место незначительное увеличение содержания свободного пролина - в 1,4-1,6 раз. Кроме того, необходимо отметить увеличение содержания аланина, глута-мина, глутаминовой кислоты и серина.

Полученные данные указывают на то, что в условиях засухи растения-регенеранты картофеля обладали повышенной устойчивостью к засухе. Содержание свободного пролина и других аминокислот в листьях этих растений существенно увеличивалось при действии водного дефицита.

В наших экспериментах обнаружен ряд веществ (пролин, амиды и органические кислоты), присутствие которых, очевидно, необходимо для повышения адаптационной устойчивости растений к стрессу. К ним относятся пролин, глутамин, органические кислоты, аспарагиновая кислота, глицин и серии, а также в значительном количестве обнаруживается алании и амиды -глутамин и аспарагин. При анализе свободных аминокислот у ТУ-регене-рантов и у контрольных растений мы акцентировали внимание на изменение только тех аминокислот и амидов, уровень содержания которых существенно различался. На пятые сутки засухи обнаруживалось, что суммарное содержание вышеперечисленных свободных аминокислот и амидов в листьях растений опытного варианта (ТУ-регенерантов) существенно превышало их содержание у контрольных растений (табл. 6). При сопоставлении содержания отдельных свободных аминокислот и амидов между исследованными растениями при засухе и в норме обнаружилось, что содержание пролина при засухе было в 10-18 раз больше у растений-регенерантов и в 2-3 раза больше у исходных (контрольных) растений. Содержание аланина у ТУ-регенеран-тов, наоборот, резко снижалось при засухе. Содержание глицина и сериаа у ТУ-регенерантов при засухе практически не изменялось. Некоторые изменения содержания глицина и серина наблюдались при засухе у исходных растений. Содержание глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и амидов резко увеличилось при засухе у ТУ-регенерантов. У контрольных растений их содержание при засухе изменилось незначительно.

Существенно увеличилось у температуроустойчивых растений содержание пролина, что, очевидно, способствовало их высокой устойчивости к засухе. Известно, что пролин участвует в осморегуляции. Вместе с тем, он обладает и функцией антиоксиданта, защищает макромолекулы, а также участвует в запасании азота. Видимо, по этой причине у температуроустойчивых растений картофеля обнаруживается высокое накопление амидов, глутаминовой и аспарагиновой кислот по сравнению с исходной формой растений.

Известно, что глутамин и аспарагин также участвуют в процессах обезвреживания аммиака.

Итак, из полученных результатов следует, что в условиях засухи тем-пературоустойчивые растения с высоким содержанием пролина, глутами-на и асларагина и некоторых других свободных аминокислот более адаптированы к водному дефициту и активация их синтеза, возможно, направлена на усиление осморегуляции и других приспособительных реакций организма к стрессовым воздействиям.

90 60 30

Содержание воды в почве, %

Рис.5. Содержание свободного пролина при возрастающей засухе.

1. Исходная форма (сорт Жуковский ранинй)

2. Температуроустойчивая форма (ТУ-регенеранты)

Таблица 6

Содержание некоторых свободных аминокислот в листьях контрольных растений и температуроустойчивых растений-регенерантов картофеля на 5-е сутки засухи (мкг/г сырого веса)

Аминокислоты, амиды Контрольные растения ТУ-регенеранты

полив засуха полив засуха

Пролин 2,72±0,06 4,55 ±0,07 25,36±2,11 83,4±4,20

Алании 3,25 ±0,05 4,71 ±0,06 4,11 ±0,31 5,02±0,44

Аспарагиновая кислота 1,22 ±0,01 1,35 ±0,01 1.33 ±0,03 2,47±0,03

Глутаминовая кислота 0,33 ±0,004 0,47 ±0,04 1,11 ±0,02 1,74±0,03

Глутамин 1,44 ±0,03 1,95 ±0,1 3,44±0,0б 1,41±1,91

Аспарагин 1,27 ±0,01 1,91 ±0,1 3,85 ±0,30 12,55±2,44

Глицин+серин 2,74 ±0,03 3,11 ±0,1 2,11 ±0,05 2,17±0,04

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при воздействии стрессовых факторов (водный дефицит) температуроус-тойчивые растения-регенеранты и исходные формы реагируют неоднозначно. Обнаружены различия в суммарном содержании некоторых свободных аминокислот и амидов у обоих исследованных форм растений картофеля при нормальном водообеспечении. Повышение содержания свободных аминокислот, таких, как пролин, глутаминовая кислота, аспарагино-вая кислота и амиды, в листьях ТУ растений-регенерантов указывает на их

существенный вклад в осморегулирующий процесс. Роль этих свободных аминокислот в осморегуляции резко возрастает по мере действия засухи, особенно у температуроустойчивых генотипов картофеля.

ВЫВОДЫ

1 .Показано, что первичные каллусы образуются на срезах междоузлий и/или кусочках листа картофеля в среде Мурасиге и Скуга, содержащей глутамин, зеатин и кинетин. Образовавшиеся каллусы отличались по размеру и цвету. В варианте с выращиванием каллусов при +37°С наблюдалось увеличение роста каллусов, при +41°С наблюдалась стимуляция роста каллусов, при +45°С отмечалось резкое ингибирование роста каллусов.

2. Активная пролиферация наблюдалась у каллусов контрольного варианта и каллусов, образовавшихся при температуре +41°С и +45°С. После перенесения их на среду регенерации во всех вариантах наблюдалось появление апикальных структур через 20-25 дней.

3 .Количество образовавшихся растений-регенерантов было самое высокое в контрольном варианте. Единичные растения-регенеранты образовались при +45"С и +47°С. Наиболее сильное угнетение роста и наименьшее количество корней наблюдалось в варианте с выращиванием каллусов при +47°С. При постепенном воздействии высокой температуры (+47°С) на уровне растений-регенерантов наиболее устойчивыми оказались регенеран-ты, полученные из каллусов, подвергавшихся воздействию высокой температуры.

4. Давление на уровне неорганизованной пролиферации выявило ряд форм растений, резистентных к высокой температуре (+47°С). Стабильными оказались изменения, вызванные действием более высокой (+47°С) температуры, тогда как у сомакло] [альных линий при более низкой температуре (+37°С, +41°С) они со временем терялись.

5 .Обнаружены различия между контрольными - исходными и темпера-туроустойчивыми растениями-регенерантами по высоте стебля, количеству листьев, содержанию хлорофилла и УПП листа. Растения, полученные методом клеточной технологии, имеют красноватый стебель и листья. Листья этих растений более плотные и опушенные.

6. Выявлены различия между контрольными растениями и температу-роустойчивыми (ТУ растения-регенеранты) при действии засухи. Содержание воды у ТУ-регенераптов при засухе было значительно выше, чем у контрольных растений, и они оказались более выносливыми к обезвоживанию и перегреву почвы (к засухе).

7.Анализ температуроустойчивых растений показал, что содержание пролина у них существенно выше, чем у исходных растений в нормальных условиях и при искусственно созданной засухе. Содержание пролина у ТУ-регенерантов при засухе было в 10-18 раз больше и в 2-3 раза больше у исходных контрольных растений. Содержание амидов также увеличилось при засухе у ТУ-регенерантов. У исходной формы растений их содержание при засухе изменилось незначительно.

8.Показано, что адаптированные к температурному стрессу регене-ранты картофеля, полученные в результате клеточной селекции, характеризуются более высоким содержанием свободного пролина по сравнению с контрольными растениями, и это можно использовать как тест - признак при оценке уровня устойчивости генотипов картофеля к температурному стрессу и другим природным неблагоприятным факторам.

9. Полученные результаты и разработанные биотехнологические методы способствуют расширению генетического базиса селекции картофеля путем создания ценных генотипов, а также выяснению физиолого-биохими-ческих механизмов устойчивости растений к стрессовым факторам среды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Авганова Х.Х., Диловарова II. Повышение экологической пластичности растений с использованием методов биоинженерии // Экология и здоровье. Душанбе. 2001. С. 9-10.

2.Авганова Х.Х., Бабаджанова М.П., Диловарова Н., Дарвозиев М., Алиев К.А. Молекулярная экология и адаптационные механизмы растений. // Олимони чавон ва илми муосир. Душанбе. 2001. С. 61-62.

3.Авганова Х.Х., Холов Ф., Диловарова Н., Дарвозиев М., Адаптационные возможности трансгенных и нетрансформированных растений картофеля к водному дефициту. // Олимони чавон ва илми муосир. Душанбе. 2001. С. 69-70.

4.Авганова Х.Х., Дарвозиев М. Влияние экологических условий на атрагирующую способность клубней картофеля. // Олимони чавон ва илми муосир. Душанбе. 2002. С. 58-59.

5. Давлятназарова З.Б., Алиев К.А., Бабаджанова М.П., Авганова Х.Х. Получение линий картофеля, устойчивых к высокой температуре, с использованием методов биотехнологии. // Докл. АН РТ, 2003, № 5-6. С. 61-69.

6.Давлятназарова З.Б., Каримов Б.К., Авганова Х.Х., Мирзохонова

Г.О., Назарова H.H.. Алиев К.А. Регуляция клубнеобразовапия in vitro. Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений. // Душанбе. Дониш, 2004. С.62-63.

7.Давлятназарова З.Б., Мирзохонова Г., Назарова Н., Файзиева С., Алиев М., Авганова Х.Х., Суфиева М., Салимов А., Наймов С., Алиев К.А. Регуляция клубнеобразования у различных генотипов картофеля in vitro // Республиканский симпозиум "Экономика и наука Горно-Бадахшан-ской автономной области: прошлое, настоящее, будущее". Хорог. 2005. С. 187-188.

8.Авганова Х.Х., Мирзохонова Г., Файзиева С. И Некоторые биохимические особенности адаптации растений картофеля к экологическому стрессу. Материалы научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава и студентов, посвященной 60-летшо победы в Великой Отечественной войне "Во имя мира и счастья на Земле". Душанбе. 2005. С. 110-111.

Подписано в печать 07.08.2006 г. Формат60х84 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100. Заказ № 07/02.

(У Отпечатано в Типографии ПК «Поликомп» рсагсомр г. Душанбе, 2 пр. Ш.Руставели, д. 6.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Авганова, Холиса Хокироевна

Введение.стр.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1 Молекулярные механизмы устойчивости к стрессовым факторам.

1.2 Некоторые вопросы клеточной селекции на устойчивость к срессовому фактору.

1.3 Клеточная селекция к температурному фактору in vitro.

1.4 Биохимическая адаптация растений к стрессам.

Глава 2.Экспериментальная часть. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты исследований.

3.1 Получение линий картофеля, устойчивых к высокой температуре.

3.2 Водный режим растений картофеля, полученных методом культуры тканей.

3.3 Устойчивость растений к засухе.

3.4 Жароустойчивость растений.

3.5 Морфология культуры тканей.

3.6 Содержание хлорофиллов.

3.7 Содержание свободного пролина в условиях водного стресса.

3.8 Удельная поверхностная плотность листьев (УППЛ).

3.9 Развитие и продуктивность температуроустойчивых растений и исходных форм в полевых условиях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений картофеля к высокой температуре с использованием клеточной технологии"

Актуальность темы. В последние годы для подъема сельскохозяйственного производства картофеля все больше используются нетрадиционные технологии, такие как генная и клеточная биотехнология. В биотехнологии растений особую роль играет клеточная селекция, при которой отбор клеточных линий и растений с новыми хозяйственно-ценными свойствами проводится на уровне культивируемых in vitro клеток.

Получение таким путем растений из отработанных в селективных условиях каллусных клеток возможно благодаря уникальному свойству растительной клетки - ее тотипотентности. Приемы культивирования растительных клеток и регенерации из них растений разработаны для многих сельскохозяйственных культур и они позволяют реализовать возможности клеточной селекции для создания новых сортов растений (Tall, 1983; Dix, 1986; Сидоров, 1990; Носов, 1999). Мощным источником генетического разнообразия растений является сомаклональная изменчивость, возникающая при прохождении растениями стадии неорганизованного роста, и/или при длительном культивировании в условиях in vitro (Носов, 1999; Высоцкая, 2003).

Вместе с тем в селекции растений in vitro следует реально учитывать и ограничения клеточной технологии. Несмотря на большое количество работ методы целенаправленного улучшения хозяйственно-ценных признаков растений in vitro на основе технологии клеточной селекции все же остаются еще несовершенными. До настоящего времени использование клеточной технологии для получения клеточной линии и растений-регенерантов, резистентных к высокому температурному фактору, остается нерешенным, что и определяет актуальность проведения таких исследований. Получение устойчивых к высокой температуре растений с помощью клеточной технологии имеет для Таджикистана особую практическую значимость, т. к. у многих культурных растений, выращиваемых в Таджикистане (хлопчатник, картофель, овощные культуры), период накопления урожая приходится на самый жаркий период, что является одним из факторов снижения урожайности и качества продукции (Алиев и др., 1997). Эта задача должна решиться в том числе за счет умелого использования достижений современной биотехнологии и природно-климатических факторов Таджикистана.

При равных условиях возделывания, для получения высокого урожая картофеля, так и других культур, наиболее значимы особенности сортов и качество семенного материала, определяемые системой семеноводства и методами получения семенного материала (Муминджанов, 2003; Каримов и др., 2004; Давлятназарова и др., 2004).

Цель и задачи работы: Получение клеточной линии картофеля, устойчивой к природным стрессовым воздействиям (высокой температуре, водному дефициту и т. д.), а также возможности регенерирования из них фертильных растений методами современной биотехнологии и использование их как модель изучения физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений к стрессу. В связи с поставленной целью в задачу исследования входило:

• Подбор оптимальных условий культивирования;

• Подбор культуральной среды, типа экспланта и оптимальных условий культивирования картофеля in vitro;

• Изучение особенностей морфогенеза каллусных клеток при действии высокой температуры;

• Подбор усолвий селективного отбора клеток и регенерантов, устойчивых к действию высокой температуры;

• Изучение некоторых морфо-физиологических параметров температуроустойчивых растений-регенерантов при действии высокой температуры;

• Изучение некоторых биохимических особенностей температуроустойчивых растений-регенерантов (ТУ-регенеранты) при действии засухи (водного дефицита).

Научная новизна. Проведен скрининг морфофизиологической характеристики компетенции в культуре in vitro растений картофеля сорта Жуковский ранний. Получен ряд линий, различающихся по некоторым физиологическим признакам и продуктивности.

При воздействии высокой температуры (41°С, 45°С и 47°С) на культивируемые каллусные ткани картофеля отобраны устойчивые линии. Полученные от них растения отличались по некоторым морфологическим признакам от исходного варианта. Стабильными оказались изменения, вызванные действием более высокой температуры - 47°С, тогда как у самоклональных, при меньшей температуре 41°С, они со временем терялись. Отселектированный признак (повышенная резистентность к 47°С) сохранялся на протяжении 8 лет испытания в полевых условиях, а также in vitro. Полученные резистентные линии существенно отличались друг от друга по структуре урожая. Показано, что адаптированные к температурному стрессу регенеранты картофеля, полученные в результате клеточной селекции, характеризуются более высоким содержанием свободного пролина по сравнению контрольными растениями, и это можно использовать как тест -признак при оценке уровня устойчивости генотипов картофеля к температурному стрессу и другим природным неблагоприятным факторам.

Практическая ценность диссертации. Отработана система каллусогенеза и регенерации картофеля, что позволило оптимизировать процесс регенерации в стрессовых условиях in vitro. Важным результатом работы является выделение регенерантов, устойчивых к высокой температуре и водному дефициту (засухе). Эти свойства можно использовать для расширения генетического базиса селекции как донора генов устойчивости к стрессу, а также для решения прикладных задач в научных целях как модель физиологической, молекулярно-генетической и прикладной биотехнологии.

Апробация диссертации. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научно-практических конференциях: первой республиканской конференции "Экология и здоровье," 2001; конференции "Молодые ученые и современная наука", 2001; 2002; конференция "Вопросы сохранения и рационального использования растительного разнообразия Таджикистана", 2002; научно-педагогической конференции Таджикского государственного национального Университета 2002-2005 г.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Авганова, Холиса Хокироевна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что первичные каллусы образуются на срезах междоузлий и/или кусочках листа картофеля в среде МС, содержащей глутамин, зеатин и кинетин. Образовавшиеся каллусы отличались по размеру и цвету. В варианте +37°С наблюдалось увеличение роста каллусов, в варианте +41°С наблюдалась стимуляция роста каллусов, в варианте +45°С отмечалось резкое ингибирование роста каллусов.

2. Активная пролиферация наблюдалась у каллусов контрольного варианта и каллусов, образовавшихся при температуре +41 С и +45°С. После перенесения их на среду регенерации во всех вариантах наблюдалось появление апикальных структур через 20-25 дней.

3. Количество образовавшихся растений-регенерантов было самое высокое в контрольном варианте. Единичные растения-регенеранты образовались при +45°С и +47°С. Наиболее сильное угнетение роста и наименьшее количество корней наблюдалось в варианте +47°С. При постепенном воздействии высокой температуры (+47°С) на уровне растений-регенерантов наиболее устойчивыми оказались регенеранты, полученные из каллусов, подвергавшихся воздействию высокой температуры.

4. Давление на уровне неорганизованной пролиферации выявила ряд форм растений, резистентных к высокой температуре (+47°С). Стабильными оказались изменения, вызванные действием более высокой (+47°С) температуры, тогда как у сомаклональных линий при более низкой температуре (+37°С, +41°С) они со временем терялись.

5. Обнаружены различия между контрольными - исходными и температуроустойчивыми растениями-регенерантами по высоте стебля, количеству листьев, содержанию хлорофиллов и УПП листа. Растения, полученные методом клеточной технологии, имеют красноватый стебель и листья. Листья этих растений более плотные и опушенные.

6. Выявлены различия между контрольными растениями и температуроустойчивыми (ТУ растения-регенеранты) при действии засухи. Так, содержание воды у ТУ-регенерантов при засухе было значительно выше, чем у контрольных растений, и они оказались более выносливыми к обезвоживанию и перегреву почвы - засухи.

7. Анализ температуроустойчивых растений показал, что содержание пролина в них существенно выше, чем у исходного в нормальных условиях и при искусственно созданной засухе. Содержание пролина у ТУ-регенерантов было в 10-18 раз больше при засухе и в 2-3 раза у исходных контрольных растений. Количество амидов также увеличилось при засухе у ТУ-регенерантов. У исходной формы растений их количество при засухе изменилось незначительно.

8. Показано, что адаптированные к температурному стрессу регенеранты картофеля, полученные в результате клеточной селекции, характеризуются более высоким содержанием свободного пролина по сравнению контрольными растениями, и это можно использовать как тест - признак при оценке уровня устойчивости генотипов картофеля к температурному стрессу и другим природным неблагоприятным факторам.

9. Полученные результаты и разработанные биотехнологические методы способствуют расширению генетического базиса селекции картофеля путем создания ценных генотипов исходной формы, а также выяснению физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений к стрессовым факторам среды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Авгонова Х.Х., Диловарова Н. Повышение экологической пластичности растений с использованием методов биоинженерии // Экология и здоровье. Душанбе-2001. С. 9-10.

2. Авгонова Х.Х., Бабаджанова М.П., Диловарова Н., Дарвозиев М., Алиев К.А. Молекулярная экология и адаптационные механизмы растений. // Олимони чавон ва илми муосир. Душанбе-2001. С. 61-62.

3. Авгонова Х.Х., Холов Ф., Диловарова Н., Дарвозиев М., Адаптационные возможности трансгенных и нетрансформированных растений картофеля к водному дефициту. // Олимони чавон ва илми муосир. Душанбе-2001. С. 69-70.

4. Холов Ф.Х., Ахмедов Н.А., Бобохонов Р.С., Авгонова Х.Х., Каримов М.К. Махсулноки ва мубодилаи об дар растанихои тагйирдодашудаи гении картошка. // Мачмуи маколахои илми. Душанбе-2001. С. 93-97.

6. Авгонова Х.Х., Дарвозиев М. Влияние экологических условий на аттаргирующую способность клубней картофеля. // Олимони чавон ва илми муосир. Душанбе-2002. С. 58-59.

7. Давлятназарова З.Б., Каримов Б.К., Авгонова Х.Х., Мирзохонова Г.О., Назарова Н.Н., Алиев К.А. Регуляция клубнеобразования in vitro. Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений. // Душанбе-2004. С.62-63. Изд-во "Дониш".

8. Давлятназарова З.Б., Мирзохонова Г., Назарова Н., Файзиева С., Алиев М., Авгонова Х.Х., Суфиева М., Салимов Р., Наймов С., Алиев К.А. Регуляция клубнеобразования у различных генотипов картофеля in vitro // Республиканский симпозиум "Экономика и наука Горно-Бадахшанской автономной области: прошлое, настоящее, будующее".спонсор симпозиума - Хукумат ГБАО - 2005. С. 187-188.

9. Авгонова Х.Х., Мирзохонова Г., Файзиева С. // Некоторые биохимические особенности адаптации растений картофеля к экологическому стрессу. Материалы научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава и студентов, посвященной 60-летию победы в великой отечественной войне "Во имя мира и счастья на земле". Душанбе-2005. С. 110-111.

Заключение

Исследование водообмена растений было и остается главным элементом продукционного процесса растений и издавна привлекает внимание исследователей, поскольку обусловлено важностью и многогранностью функций, которые он выполняет. Водообмен как важнейший регулятор водного статуса клеток является ведущим звеном во взаимодействии растений с водной фазой почвы и атмосферы. Более того, он является прямым индикатором состояния влагообеспеченности и жизнедеятельности растений.

Исследования водообмена растений можно разделить на пять этапов -осмотический, коллоидно-химический, термодинамический, биохимический, биофизический.

В последние годы большое развитие получил термодинамический подход к исследованию водообмена растений. Этот подход получил свое развитие в работах B.C. Шардакова (1953), основанный на системе показателей (почва - растение - атмосфера). Предлагался ряд терминов для обозначения водного статуса в растениях: сосущая сила, дефицит воды, водоудерживающая способность, активность воды, гидратация и диффузия. Далее было введено понятие потенциал воды (Slatyer,Taylor, 1960; Krammer et. al. 1966), отражающий степень уменьшения химического потенциала клеточного раствора относительно чистой воды. Водный потенциал является собирательным понятием для характеристики следующих параметров водообмена: осмотический потенциал - это влияние на активность воды химических частиц растворенных в воде веществ, матричный потенциал -адаптация воды на тканевом веществе, то есть матриксе, потенциал давления - гидростатический или тургорное давление. В работе (Тугее, Karamanos, 1981) получил развитие матричный потенциал для оценки состояния воды в клетке (определение количества связанной воды), как экологически менее значимый параметр и осмотический потенциал, являющийся важнейшим экологическим параметром.

Напротив, А.А. Завьялов (1984) считает, что более значимым параметром является термодинамический потенциал воды в клетке, поскольку он полнее отражает состояние воды в растениях.

В.Н. Жолкевич и др. (1989) указывает на неприемлемость уподобления растения простой гидравлической машине, где действуют чисто физические законы циркуляции воды в водных растворах. Он указывает на непосредственное участие живых клеток в транспорте воды и его эндогенной регуляции. Это представление получило развитие в работе некоторых исследователей (В. Кундт, М. Робник, 1998).

Вместе с тем, в работе последних лет приводятся данные, указывающие на то, что водный потенциал не является универсальным методом измерения водообмена растений. В ряде случаев определение относительного содержания воды гораздо информативней, чем измерение водного потенциала (Емельянов, Анкуд, 1992). Все выше приведенные факты указывают, что водообмен растений - это интегральный процесс, который объединяет процессы поступления, передвижения, выделения и состояние воды в растениях. Поэтому водообмен не может быть охарактеризован каким-то одним признаком и, следовательно, он объединяет комплекс физических и физиологических процессов, протекающих в целостном организме растений. Поэтому измерение параметров водного режима, занимает особое место, в настоящее время, в связи с появлением новых типов растений с измененной генетической конструкцией, то есть генетически модифицированных растений.

Обычно, генмодифицированные растения конструируют путем введения генов с помощью Agrobacterium tumerfaciens, то есть методом генетической инженерии или путем воздействия на культуры каллусов определенными стрессовыми факторами, такими как высокая температура, высокая доза солей и др., то есть методом клеточной селекции. Культура клеток in vitro дает возможность в контролируемых условиях исследовать зависимость ростовых и репродуктивных органов растений от дозированного воздействия стрессовых и других факторов. Такая техника эксперимента позволяет отобрать сомаклоны растений с желаемыми параметрами устойчивости к неблагоприятным условиям, таких как соли (Бургутин и др., 1996), высокая температура (Давлятназарова и др., 2003), к растениям, устойчивым к высокой температуре (ТУ-растения) которые получили согласно применяемой схеме (рис.17).

В известных работах по сравнительной устойчивости клонов растений картофеля in vitro к NaCl авторы ограничивались по несколько штук пробирочных растений (от 4 до 10) (Бургутин и др., 1996). Такие эксперименты не дают положительного ответа на вопрос о возможности эффективной селекции растений in vitro на спонтанном уровне при столь ограниченной выборке, хотя и не отрицает возможности неконтролируемой селекции в системах микроклонального размножения. Поэтому в работе А.Б. Бургутина и др. (1996) были выработаны системы целых растений in vitro для оценки солеустойчивости картофеля и отбора столоноустойчивых сомаклонов. Они показали, что достаточно высокая концентрация хлористого натрия на уровне каллусогенеза привела к стабильным изменениям, а при более низких уровнях засоления возникающие варианты теряли приобретенные свойства.

В наших работах (Давлятназарова, Авгонова и др., 2004 г.) исследования проводились с пробирочными растениями, что позволило проследить за каждым растением отдельно на протяжении всего периода выращивания in vitro. Полученные нами данные свидетельствуют об определенных преимуществах отбора на устойчивость к высокой температуре с использованием целых растений in vitro для оценки результатов отбора. Оценивая результаты отбора культивируемых каллусов на целых растениях (полученных от этих каллусов), можно избежать существующих противоречий, когда устойчивость к высокой температуре на уровне каллусных линий не совпадает с устойчивостью целого растения. Воздействие на уровне неорганизованной пролиферации с последующим получением резистентных растений картофеля повторного воздействия на уровне целых растений выявило более устойчивые к более высокой температуре сомаклональные варианты - линии. Полученные таким путем растения-регенеранты обладают повышенной устойчивостью к высокой температуре и имеют существенные различия по ряду морфофизиологических признаков (Авгонова и др., 2005 г.). растение -регенерат получение каллуса суспензия клеток

Воздействие высокой температуры отоор устойчивых клеток проверка устойчивости к стрессовым воздействиям клонирование получение микроклубней молекулярно--генетические исследования

Получение растения-регенеранта картофеля, устойчивого к воздействиям факторов среды

Рис.17. Схема получения устойчивости растений картофеля к температурному фактору

Воздействием на каллусные культуры и регенеранты in vitro высокой температуры нами получены сомаклоны растений картофеля с измененной генной конструкцией. Установлено, что воздействие на растения-регенеранты температуры 45°С и 47°С в течение 16 часов привели к полной гибели растений, как при 45°С, так и при 47°С. Температурно-устойчивые клетки сохранили жизнедеятельность даже при выдерживании растений при 47°С в течении 24 ч. При таких условиях обработки пробирочных растений наблюдалось следующее: растения, полученные при обработке 41°С и 45°С - полностью погибли. В варианте с обработкой при температуре 47°С в 7 случаях из 400 пробирочных растений в нижней части стебля появились зеленоватые участки. Из этих участков стебля в течение последующих 10-12 дней начали появляться вторичные стебли и далее образовались листочки. Эти растения пересаживали в свежую среду для регенерации. Из 7 регенерированных растений 5 оказались фертильными и 2 безхлорофилльными мутантами.

Фертильные растения использовали для клонирования и получения линии и анализировали в полевых условиях.

Полученные линии существенно отличались друг от друга по структуре урожая. Среди них имеются линии, с низким урожаем. Некоторые линии являются перспективными и их можно использовать в селекционном процессе для получения семенного картофеля. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют об определенных успехах в отборе на температурную устойчивость с использованием каллусных культур и целых растений in vitro для оценки результатов отбора. Полученные таким путем линии растений являются сомаклональными вариантами. Деление на уровне неорганизованной пролиферации дало возможность выявить резистентные к высокой температуре (47°С) линии картофеля. Стабильными^оказались изменения, вызванные действием более высокой (47°С) температуры, тогда как у сомаклональных линий при более низкой температуре (41 °С) они со временем терялись. Регенеранты, обладающие устойчивостью к высокой температуре обозначались как (ТУ-растения-регенеранты).

Как известно, показателями устойчивости растений к засухе являются водоудерживающая способность и жароустойчивость (Генкель, 1982).

Из анализа проведенных нами исследований на протяжении 5 суток засухи интенсивность транспирации, водоудерживающая способность были значительно выше у модифицированных растений картофеля, чем у исходной формы (сорта Жуковский ранний). Это показывает, что они адаптированы к неблагоприятным факторам среды. По мере усиления засухи в листьях картофеля накапливался свободный пролин, причем его содержание в листьях модифицированных растений в несколько раз выше, чем у контрольных. Синтез свободных аминокислот и амидов также был значительно усилен у ТУ-регенерантов картофеля. Повышенное содержание аминокислот и амидов в листьях трансгенных (модифицированных) растений, вероятно, указывает на их участие в осморегуляции. Предположительно, в растениях сорта Жуковский (Жолкевич и др., 1997) участие свободных аминокислот и амидов в осмотическом давлении возрастает по мере действия засухи, особенно у засухоустойчивого генотипа растений.

В наших опытах при 5 суточной засухе значительно возрастало содержание свободного пролина. Известно, что свободный пролин участвует во многих физиолого-биохимических процессах, способствующих устойчивости растений к неблагоприятным условиям. Он защищает от разрушения макромолекул (белков, нуклеиновых кислот), участвует в запасании азота, выполняет энергетическую функцию, а также является антиоксидантом (Кузнецов, Шевякова, 1999). Другие авторы обнаружили изменение содержания 9 основных аминокислот при засухе (Пуставойтова и др., 2000). Они также показали, что у трансгенных форм табака при засухе усиливается синтез основных аминокислот, особенно пролина и триптофана нежели у исходной формы.

В наших экспериментах обнаружили ряд аминокислот, присутствие которых, очевидно, необходимо для нормального протекания адаптированной устойчивости растений к стрессу. К ним относятся накопление свободного пролина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина и серина., а также в значительном количестве обнаруживается аланин и амиды: глутамин и аспарагин. При анализе свободных аминокислот у клеточно-модифицированных и обычных растений мы акцентировали внимание на изменении только тех аминокислот и амидов, уровень которых существенно различается. На пятые сутки засухи обнаруживается, что суммарное содержание выше перечисленных свободных аминокислот и амидов в листьях опытного варианта растений существенно превышали их количество у контрольных растений. Сопоставление содержания отдельных свободных аминокислот и амидов между исследованными растениями при засухе и в норме, обнаруживалось, что количество пролина превышало в 10-18 раз у ТУ-растений-регенерантов и в 2-3 раза у исходных (контрольных) растений. Количество аланина у модифицированных растений, наоборот, резко снижалось при засухе. Сумма глицин+серин у модифицированных растений при засухе не изменялось. Некоторые изменения суммы глицин+серин наблюдались при засухе у исходных растений. Количество глютаминовой кислоты, аспарагиновой и амидов резко увеличивалось при засухе у модифицированных растений. У контрольных растений их количества изменялись незначительно при засухе.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при воздействии стрессовых факторов (водный дефицит) клеточно-модифицированные растения и исходные формы реагируют не однозначно.

Обнаружены различия в суммарном содержании некоторых свободных аминокислот и амидов у обоих исследованных форм растений картофеля при нормальном водообеспечении. Повышение содержания свободных аминокислот, таких как пролин, глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота и амиды в листьях модифицированных растений указывают на их существенный вклад в осморегуляционный процесс. Роль этих свободных аминокислот в осморегуляции резко возрастает по мере действия засухи, особенно у клеточно-модифицированных генотипов картофеля.

Из полученных данных следует, что в условиях водного дефицита (засухи) модифицированные растения картофеля с высоким содержанием пролина более адаптированы к обезвоживанию. Видимо защитные реакции модифицированных растений направлены на включение генов синтеза пролина, а адаптационный процесс направлен на перестройку физиолого-биохимического механизма и изменение процессов осморегуляции.

Таким образом, полученные результаты и разработанные нами биотехнологические методы направлены на расширение генетического базиса селекции картофеля путем создания ценных генотипов исходной формы, не только ускоряющие процессы селекции, но и раскрывающие механизмы физиолого-биохимических процессов продуктивности растений, а также способствует развитию исследований в области генной инженерии с целью получения улучшенных растений картофеля, устойчивых к неблагоприятным факторам среды.

Регенерация растений in vitro позволила увеличить генотипическую изменяемость исходного сорта картофеля и получить ценный генетический материал с новой экспрессией генов. Нами получены данные по стабильности экспрессии генов устойчивости к высокой температуре и их сохранение при ведении пробирочной культуры растений in vitro, а также в полевых условиях (первый год испытания). В культуре ткани листа путем многократного скрининга к температурному фактору получены регенеранты растений с большой вариабельностью по морфологическим показателям. При исследовании сомаклональной изменчивости регенерантов растений у одних отмечены различия по некоторым признакам, которые сохранились в течении длительного культивирования по ряду признаков in vitro. У других морфофизиологические отклонения усиливались от пасажа к пасажу. И появились химерные растения. У третьих на стадии каллусного роста, предшествующего регенерации происходили как генетические так и эпигенетические изменения. Из 800 регенерантов остались единичные фертильные растения (всего 3 растения), которые были пригодны в физиолого-биохимических и молекулярно-биологических исследованиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Авганова, Холиса Хокироевна, Душанбе

1. Абдуллаев Х.А., Каримов Х.Х. Индекс урожая хлопчатника Изд-во "Дониш"- 2001. с.

2. Алиев К.А., Каримов Б.К., Каримов Б.Б. Возделывание оздоровленного картофеля в Таджикистане. Изд-во "Дониш"-1997.43 с.

3. Александров B.J1. Цитофизиологические и цитоэкологические исследования устойчивости растительных клеток к действию высоких и низких температур // Тр.БИН АН СССР. 1963. Сер. 4. Вып. 16. С. 234.

4. Анапияев Б.Б., Исхакова К.М., Рахимбаев И.Р. Некоторые особенности процессов эмбриогенеза в культуре микроспор triticum aestivum \ll VII International conference. The biology of plant Cells in vitro and Biotechnology. Saratov. 2003. P.23.

5. Бабаева Ж.А., Бутенко Р.Г., Строганов Б.П. Влияние засоления питательной среды на рост изолированных тканей моркови // Физиология растений. 1968. - Т. 15.-ВЫП. 1 .-С.93-109.

6. Белан Н.Ф., Абдурахманова З.Н. Разделение продуктов фотосинтеза методом хроматографии в тонких слоях, ДАН Тадж ССР, 1969, т. 12. № 10. с. 61-65.

7. Бобохонов Р.С. Содержание и активность рибулозо-1,5бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы у оздоровленных растений картофеля в связи с продуктивностью. Автореф. канд. дисс. Душанбе, 1999.

8. Боровский Г.Б., Войников В.К. Локализация белков холодового шока на поверхности и внутри митохондрий кукурузы // Физиология растений. 1993. - Т.40. - №4. - С.596-598.

9. Ю.Боровский Г.Б., Ступникова И.В., Пешкова А.А., Дорофеев Н.В., Войников В.К. Термостабильные белки проростков и узлов кушения растений озимой пшеницы // Физиология растений, 1999, Т.46, №5, с.777-783.

10. П.Бургутин А.Б., Бутенко Р.Г., Кауров Б.А., Ниссанка Иддагода. Селекция картофеля in vitro на устойчивость к хлористому натрию // Физиология растений. М.: 1996. Т. 43. № 4, с. 597-605.

11. Войников В.К., Иванова Г.Г., Гудиковский А.В. Белки теплового шока растений // Физиология растений. 1984. Т. 31, № 5. С. 970-979.

12. Войников В.К. Температурный стресс и митохондрии растений. Новосибирск, 1987.

13. Н.Войников В.К., Корытов М.В., Калачева Е.А. Низкотемпературная индукция синтеза стрессовых белков растений // Физиология растений. 1989. Т.Зб.с.107-1 И.

14. Войников В.К., Корытов М.В. Синтез стрессовых белков в проростках озимой пшеницы при закаливании к холоду // Физиология растений. 1991. Т. 38. Вып. 5 С. 960.

15. Войников В.К., Корытов М.В. Влияние условий гипотермии на синтез стрессовых белков в проростках озимой пшеницы //Физиология растений. 1993. Т.40. - №4. - С.589-594.

16. Высоцкая О.Н. Криосохранение меристем земляники садовой (Fragaria X Ananassa) с помощю метода ветрификации //VII International conference. The biology of plant Cells in vitro and Biotechnology. Saratov. 2003. P.355.

17. Генкель Б.А. Физиология устойчивости растительной клетки. М.:

18. Изд-во «Наука», 1967.-С.325.

19. Генкель Б.А. Физиология жаро- и засухоустойчивости растений. М.: Наука, 1982.280 с.

20. Дианова И.И., Солганин Р.И. Индуцированный синтез белков теплового шока пшеницы и их роль в адаптации к действию высоких температур //Стрессовые белки растений. Новосибирск: «Наука», 1989.-С.43.

21. Давлятназарова З.Б., Алиев К.А., Бабаджанова М.П., Авганова Х.Х. Получение линий картофеля, устойчивых к высокой температуре, с использованием методов биотехнологии // Д.АН РТ 2003. №5-6. с.61-69.

22. Давлятназарова З.Б., Каримов Б.К., Авгонова Х.Х., Мирзохонова Г.О., Назарова Н.Н., Алиев К.А. Регуляция клубнеобразования in vitro. // Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений. Душанбе-2004. с.62-63.

23. Емельянов Л.Г., Анкуд С.А. Водообмен и стресоустойчивость растений. Изд-во "Наука и техника", 1992,144 с.

24. Жолкевич В.Н., Гусев Н.А., Капля А.В. Пахомова Г.И., Пальщикова Н.В., Самуилов Ф.Д., Славный П.С., Шмотько И.Г. Водный обмен растений. М.: Наука, 1989.256 с.

25. Жолкевич В.Н., Гусев Н.А., Капля А.В., Пахомова Г.И., Пилыникова Н.В., СамуиловФ.Д., Славный П.С., Шматько И.Г. Водный обмен растений. М.:Наука, 1989. 250с.

26. Завьялов А.А. Физиолого-термодинамический аспект транспорта воды по растению. М. 1984.

27. Иванов А.А., Силина А.А., Цельникер Ю.Л. О методе быстрого взвешивания для определения транспирации в естественных условиях // Ботан. Жур, 1950. Т. 35. С. 171-185.

28. Каримов Б., Мукимов Т., Алиев К., Анварова М., Давлятназарова 3., Шеров Д. Семеноводство картофеля на основе биотехнологии // Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений. Душанбе 2004 - С. 73-76.

29. Каримов Б., Т. Мукимов, Д. Шеров. Выбор сортов важное условие высоких урожаев картофеля // Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений. Душанбе - 2004. -с. 76-78.

30. Кузнецов В.В., Кимпел Д., Гокджиян Д., Ки Д. Элементы неспецифичности реакции генома растений при холодовом и тепловом стрессе //Физиология растений. 1987. - Т. 34. - С. 859868.

31. Кузнецов В.В. Индуцибельные системы и их роль при адаптации растений к стрессовым факторам. Дис. . докт. биол. наук. -Кишинев: ИФР АН РМ, 1992. - 72 с.

32. Кузнецов В.В. Индуцибельные системы и их роль при адаптации растений к стрессовым факторам. Дисс. . докт. биол. наук. -Кишинев: ИФР АН РМ, 1992 г. - 72 с.

33. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. - Т.46. - № 2. С. 321-336.

34. Кулаева О.Н., Кулиева Ф.Б., Шамина З.Б., Строганов Б.П. Действие высоких концентраций хлористого натрия на размножение клеток Crepis capillaries in vitro//Физиология растений. 1975.-Т. 22.-вып. 1.-С. 131-136.

35. Кундт В., Робник. Водные помпы в корнях растений // Физиология растений. 1998. Т. 45. С. 308-316.

36. Муминджанов Х.А. Физиолого-биотехнологический подход к селекции и семеноводству картофеля. Душанбе 2003.

37. Насыров Ю.С. Физиологическая стратегия селекции растений // Селекция продуктивных сортов. Знание. Новое в жизни, науке, технгике. М., 1986. 12. С. 31-43.

38. Носов A.M. Культура клеток высших растений уникальная система, модель, инструмент // Физиология растений, М.: 1999, том 46, № 6, с. 837-844.

39. Попова Т.Н. Изоцитр тригидрогеназы: формы, локализация, свойства и регуляция//Биохимия, 1993, т. 58. с. 1861-1879.

40. Попова О.В., Попова Т.Н., Измайлов С.Ф. Влияние солевого стресса на НАД, НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и глутамат декарбоксилазу проростков гороха // Физиология растений. М.: 1999, Т. 46. №5, с. 784-789.

41. Пустовойтова Т.Н. Стрессовые воздействия и изменения уровня регуляторов роста растений // Рост растений и дифференцировка. М.: Наука, 1981. С. 225.

42. Пустовойтова Т.Н., Баварина Т.В., Жданова Н.Е. Особенности засухоустойчивости трансгенных растений табака с генами iaam и iaan биосинтеза ауксина // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 431-436.

43. Салимов А.Ф. Фотосинтетическая деятельность и донорно-акцепторные отношения в связи с продуктивностью оздоровленных растений картофеля: Автореф. Дисс. . канд. биол. наук. Душанбе, 1999.

44. Сидоров В.А. Клеточная селекция. Киев: Наукова Думка, 1990. -280.С. 12.

45. Тооминг Х.Г. Экологические принципы максимальной продуктивности посевов. Гидрометеоиздат, 1984. - 264 с.

46. Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации. -М.: Мир, 1977.-384 с.

47. Цельникер Ю.Л. Физиологические основы теневыносливости растений. М: Наука, 1978, с.215.

48. Шапигузов А.Ю. Аквапорины: строение, систематика и особенности регуляции// Физиология растений, 2004, Т.51.№1, с.142-152.

49. Шардаков B.C. Водный режим хлопчатника. Ташкент, 1953.

50. Шевякова Н.И. Метаболизм и физиологическая роль пролина при водном и солевом стрессе // Физиология растений. 1983: - Т. 30. - С. 768-783.

51. Шевякова Н.И., Рощупкин Б.В., Парамонова Н.В., Кузнецов В.В. Стрессорный ответ клеток Nicotina sylvestris L. На засоление и высокую температуру. 1. Аккумуляция пролина, полиаминов, бетаинов и Сахаров // Физиология растений. 1994. - Т.41. - С. 558565.

52. ШталяЭ. Хроматография в тонких слоях. Изд-во "Мир", 1965, с. 374.

53. Abel G.H. Inheritance of the capacity for chloride inclusion and chloride exclusion by soybeans // Crop. Sci. 1969. - V.6. - P.697-698.

54. Bienz M. Transient and Developmental Activation of reat shock genes //Trends Biochem. Sci. 1985. - V.10. - N4. - P. 157.

55. Bray E.A. Molecular responses to water deficit //Plant Physiol. 1993. -V.I03.-P. 1035-1040.

56. Bressan R.A., Singh N.K., Handa A.K. Stable and unstable tolerance to.NaCl incultured tobacco cells // Plant Genetics. New York: Liss, 1985. - P. 755-769.

57. Brenda G. Leicht, JJose Bonner Biochemistry. V. 83. - N2. - P.361-365.

58. Cortes V., Pellicez A. Journal of Biological Chemistry (USA). 1984. -VC. 256.-N23.

59. Croughan T.P., Stavarek S.J., Rains D.W. Selection of NaCl tolerant line of cultured alfalfa cells // Crop Sci. 1978. - V. 18. - H. 959-963.

60. Dean L.L., Grogan CO., Stockmeyer E.W., Everett H.L. Genetic control of aluminium tolerance in corn // Crop Sci. 1978. - V. 18. - N 6. - P.l063-1067.

61. Devine Т.Е. Genetic fitting of crops to problem soils // Breeding plants for less favourable environments. New-York: Wileu and Sons. - 1982. -P. 143-173.

62. Dix P.J. Cell line selection // Plant Cell Culture Technology. Oxford; London: Blackwell Sci. Publ. - 1986. - P. 143-201.

63. Dix P.J., Street H.E. Selection of plant cell lines with enhanced chilling resistance // Ann. Bot. (Gr. Brit.) 1976. - 40. - P. 903-910.

64. Eillen D., Hickey, Lee A. Weber. Modulation of heat-shock polipeptid synthesis in Hela cells during hyperthernia and recovery // Biochemistry. 1982. - V. 21. - V. 21. - N 7. - P. 1513 -1521.

65. Elizabeth Vierling, Joe L. Key. P.N. Academy of Sciences of USA, 1986. Vol. 83.22. P. 361-365.

66. Epstein E. Mineral nutrition of plants: Principles and perspectives. — New York: Wiley and Sons. 1972. - 381 p.

67. Flowers T/J., Troke P.F., Yeo A.R. The mechanisms of Salt tolerance in Halophytes // Annu. Rev. Plant Physiol. 1977. - V. 28. - P. 81-121.

68. Galvez S., Godal P.O. The function of the NADP-dependent isocitrate dohydrogenese isoenzymes in living organizmse I I Plant Sci. 1995. V. 105. p. 1-14.

69. Gilissen L.J.W., Staveren M.J. Zink-resistant cell lines of Haplopappus gracillis II Plant Physiol. 1986. - V. 125. - P. 95-103.

70. Harms C.T., Oertli J.J. The use of osmotically adopted cell cultures to study salt tolerance in vitro // Plant Physiol. 1985. - V. 120. - P. 29-38.

71. Hasegawa H., Mori S. Non-proline-accumulating rice mutants resistant to hydroxyl-L-proline // Theor. And Appl. Genet. 1986. - V. 72. - P. 226-230.

72. Heikkila J.J., Papp J.E.T., Schultz G.A. et al. Induction of heat shock protein messenger RNA in maize mesocotyls by water stress, abscisic acid, and wounding // Plant Physiol. 1984. - V. 76. - P. 270-274.

73. Hendrick J.P., Hartl F.U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu Rev Biochem, 1993. V.62, p.349-384.

74. Hickey E.D., Weber L.A. // Biochemistry. 1982. - V. 21. - N7. - P. 1513-1521.

75. Huitema J.B. Culture for plant improvement. Vienna: JAEA. - 1986. -P. 321- 327.

76. Huang A.H.C., Cavalieri AJ. Proline Oxidase and water stress-induced praline accumulation in spinach leaves // Plant Physiol. 1979. - V. 63. - P. 531 -535.

77. Ingram J. Bartels D. The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annu Rev. Plant Biol, 1996. V.47, p.377-403.

78. Janice A. Kimpel, Joe L. Key. Presens of heat-shoock mRNA in Field grown saubeans // TrPlant Physiology. 1985. - V.73. - No3. - P. 672688

79. Joe L. Key, Chen Y.M. Heat-shoock proteins of higher plants. P.N. Academy of sciences, USA. - 1986. - V.78. - No6. - P. 3526-3530.

80. Joe L. Key. Syntesis of the low molecular weight heat-shoock proteins in plants. Plant Physiology. 1987. - No84. - P. 1007-1017.

81. Key J.L., Lin C.Y., Chen Y.M. Heat shock proteins of higher plants //Proc. Natl. acad. Sci. USA. 1981. - V. 78. -N 6. - P. 3526.

82. Kimpel A., Key J.L. Heat shock in plants // Trends Biochem. Sci. 1985.-V. 10.-N. 8.-P. 353.

83. Kishor K.P.B., Hong L. Miao G. Ни С. - A.A., Verma D.P.S. Overexpression of Д1 - pirroline-5-carboxilate synthetase Increases Proline Production and Cjnfer Osmotolerance in Transgenic Plants // Plant Phisiol. 1995. V. 108. P. 1387-1394.

84. Krammer P.J., Knipling E.B. Miller L.N. Terminology of cell water relations // Scienc.1966. Vol. 153, № 3738. P.889-890.

85. Kuznetsov V.V., Shevyakova N.I. Stress Responses of Tobacco cells to high temperature and salinity. Proline accumulation and phosphorylation of polypeptides // Plant Physiol. 1997. - V.100. - P. 320326.

86. Kuznetsov V.V., Rakitin V.Yu., Sholkevich V.N. Interaction of heat shock and drought stress in plants // Responses of plant metabolism to air pollution/ Eds De Kok L.J., Stulen I. Leiden. The Netherlands: Backhuys Publ.- 1998.-P. 359-360.

87. Le Rudulier D., Strom A.R., Dankekar A.M., Smith L.T., Valentine R.C. Molecular biology of osmoregulation // Science. 1984. - V. 224. - P. 1064-1068.

88. Michael A., Mansfield, Joe L. Key. Cytoplasmics distribuzion of heat shock proteins in soubean // Plant Physiology. 1986. - V. 80. - N 2. -P. 1240-1246.

89. McKersie B.D., Thompson J.E. Influence of plant sterols on the phase properties of phospholipids bilayers // Plant. Physiol. 1979. -63.-h. 802-805.

90. Muchowski P.J., Clark J.l. Atp-enhance molecular chaperone functions of the small heat shock protein human В crystalline. Biochemistry, 1998. V95, p. 1004-1009.

91. Murashige Т., Skoog F.A. Rivised for rapid grown and bioassays with tobaco tissue cultures // Phisiologia planta rum. 1962. V. 15. P. 473-493.

92. Nabors M.W., Gibb S.E., Bernstein S., Meis M.E. NaCl-toleranttobacco plant from cultured cells // Z. Pflanzenphysiol. 1980. - V. 97. - P. 13-17.

93. Necchi A., Marelli S. // Plant Physiology. 1987. - V. 84. - No4. - P. 1378-1384.

94. Pelham H. Activation of heat shock genes in Eukaryotes // Trends Genet. -1985. V.l.-Nol.-P.3L

95. Pam Cooper Ho. // Plant Physiology. 1985. - No 4. - P. 887-890.

96. Peter K. Sorger. // Nature. 1987. - V. 323.

97. Sachs M.M., Ho T.H.D. Alteration of gene expression during environmental stress in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. 1986. - V. 37. -P. 363-376.

98. Schoffl F., Prandl R., Reindl A. Regulation of the heat-shok response. Plant Physiol, 1998. VI17, p.l 135-1141.

99. Shod-Mind Xido. // Plant Physiology. 1985. - No 4. - P. 887-890.

100. Shuan S. Kee, Park S. Nobel. // Plant Physiology. 1986. - V. 80. -No 2. - P. 596- 598.

101. Slatyer R.O., Taylor S.A. Terminology in plant and soil water relationships//Nature. 1960. Vol. 187. P. 922-924.

102. Smirnoff N.Plant resistance to environmental stress. Curr Opin Biotech, 1998. №9, p.214-219.

103. Stefle M., Trcka I., Vratny P. Prolin biosynthesis in winterplants due to exposure to low temperatures // Biol. Plant. 1978. - 20. - P. 119-128.

104. Swaaij A.C., Nijdam H., Jacobsen E., Feenstra WJ. Increased frost tolerance and amino acid content in leaves, tubers and leaf callus of regenerated hydroxyproline resistant potato clones // Euphytica. -1987. 36 - P. 369-380.

105. Tal M. Selection for stress tolerance // Handbook of Plant Culturel. -New-York. 1983. V.I. -P.461-489.

106. O.Taylor C.B. Proline and Water deficit: Ups, Down, Ins., and Outs // Plant Cell. 1996.-V. 8.-P. 1221-1224.

107. Tyree M.T., Karamanos A.S. Water stress as an ecological factor // Plants and threis Atmos. Environ. 21st Symp. Brit. Ecol. Soc. Oxford e. a., 1981. P. 237-261.

108. Yelonosky G. Accumulation of free praline in citrus leaves during cold hardening of young trees in controlled temperature regimes // Plant Phisiol. -1979. -64. P.425-427.

109. Yancey P.H., Clark M.E., Hand S.C. Living with water stress: evolution of osmolyte systems // Science. 1984 -V. 217.- P. 12141217.

Информация о работе

Авганова, Холиса Хокироевна
кандидата биологических наук
Душанбе, 2006
ВАК 03.00.12

Диссертация

Изучение физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений картофеля к высокой температуре с использованием клеточной технологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы