Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рост, микроклубнеобразование и активность антиоксидантных ферментов у устойчивых к засолению генотипов картофеля in vitro

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Рост, микроклубнеобразование и активность антиоксидантных ферментов у устойчивых к засолению генотипов картофеля in vitro"

Ouow

На правах рукописи

ШУКУРОВА МУСАВВАРА ХАИТОВНА

РОСТ, МИКРОКЛУБНЕОБРАЗОВАНИЕ И АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ У УСТОЙЧИВЫХ К ЗАСОЛЕНИЮ ГЕНОТИПОВ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO

(03.01.05 - физиология и биохимия растений)

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АВТОРЕФЕРАТ

ДУШАНБЕ - 2011

005012602

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии Института ботаники, физиологии и генетики растений АН Республики Таджикистан

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

член-корреспондент АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук, профессор К.А. Алиев

доктор биологических наук, профессор Эргашев А.Э.

кандидат биологических наук, доцент Нарзуллаев М.С.

Таджикский аграрный университет им. Ш. Шотемура

Защита диссертации состоится « 20 УЛ.

час

на заседании диссертационного совета д 047.00f.01 при Институте ботаник физиологии и генетики растений АН Республики Таджикистан (73401 г. Душанбе, ул. Карамова, 27. E-mail: asrtkarimov@mail.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке и. Индиры Ганди АН Республики Таджикистан.

Автореферат разослан «Q^S»

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Джумаев Б.1

ШВДЕНИК

Актуальность работы. Клубнеобразование у картофеля является одной из основных форм репродуктивного процесса развития растений и зависит от фитохромного, гормонального и углеводного воздействий (Аксенова и др., 2002). Несмотря на достигнутые успехи в изучении процесса клубнеобразования остается еще много нерешенных вопросов, касающихся механизмов взаимодействия фитохромной и гормональной систем, регуляторов роста в процессе инициации и формирования микроклубней in vitro, особенно в условиях стрессорных воздействий.

Стрессовые природные факторы, такие как засуха, высокая температура, засоление, провоцируют в клетках растений сверхпродукцию активных форм кислорода (АФК), как проявление окислительного стресса (Mitteler, 2002).

Показано, что высокая концентрация хлористого натрия (NaCl) вызывает индукцию окислительного стресса, сопровождающегося разрушением мембран и деградацией хлорофилла (Meloni et al., 2003). При этом происходит образование малонового диальдегида (хМДА) - продукта перекисного окисления липидов мембран (Dionisio-Sese, Tobita, 1998).

Было установлено, что растения томата, хлопчатника и пшеницы обладают большей устойчивостью к повреждению в условиях стресса, особенно при засолении, благодаря высокой активности антиоксидантной системы (Shalata et al., 2001). Показано, что растения пшеницы, выращенные на питательной среде с аммонием, более устойчивы к развитию окислительного стресса в листьях, чем растения, выращенные на среде с нитратами (Полесская и др., 2006).

В связи с этим определенный интерес представляют изыскания регуляторных веществ, ослабляющих действие стресса на растение, главным образом солевого стресса. Нами ранее было показано, что паклобутразол (ПБ) - синтетический регулятор роста, ингибируя ростовые процессы пробирочных растений, резко стимулировал образование микроклубней in vitro (Шукурова и др., 2007). Другие исследователи показали, что ПБ ослаблял действие солевого стресса на растения гуавы, виноградной лозы (Mehomachietal., 1996) и пшеницы на стадии опыления (Хайихамеми и др., 2009). В то же время работы относительно картофеля практически отсутствуют.

Поэтому возможность регулирования регуляторами роста физиологического потенциала, заложенного в генотипе растения, можно использовать для повышения толерантности растений к стрессовым факторам среды.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось изучение реакции разночувствительных гибридов картофеля к засолению в условиях in vitro; возможности повышения устойчивости растений-регенерантов путем использования регуляторов роста, фитогормонов и разных форм азота, а также выявление роли ростовых процессов, активности антиоксидантных ферментов и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в формировании устойчивости растений к солевому стрессу.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- оценить устойчивость растений-регенерантов к засолению;

- выбрать индуцированную систему и определить концентрацию инициирующих факторов;

- разработать условия микроклубнеобразования и оптимизации получения исходного материала in vitro',

- изучить роль антиоксидантных ферментов в формировании устойчивости гибридов картофеля к солевому стрессу;

- изучить влияние фитогормонов на устойчивость генотипов картофеля к засолению.

Научная новизна работы. Показано, что применение паклобутразола и кинетина в определенных концентрациях в качестве регуляторных факторов способствует улучшению процесса микроклубнеобразования in vitro и повышению устойчивости растений картофеля к засолению.

Выявлено нарушение взаимовлияния цитокининов и ауксинов в регуляции морфофизиологических процессов у длительно культивируемых растений картофеля in vitro. При длительном культивировании растений in vitro происходит ослабление эпигенетических процессов, регулирующих рост, развитие регенерантов и стрессоляторных систем клетки, в отличие от вновь введенных в культуру меристемных и/или столоновых растений.

Получены результаты, которые дают основание утверждать, что интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ) и снижение антиоксидантного потенциала у растений-регенерантов в условиях нитратного питания (NO~) приводит к формированию "окислительного стресса", который более выражен у неустойчивых генотипов, чем у устойчивых, и является одним из физиологических механизмов, понижающим толерантность растений к стрессу.

Практическая ценность. Получение растений из меристемных и столоновых культур in vitro позволяет ускорить создание системы получения оздоровленного базисного семенного картофеля. Использование регуляторов роста и различных форм азота в системе in vitro может служить методом для изучения физиологических механизмов устойчивости к стрессорным факторам, а также может быть рекомендовано для тестирования толерантных форм картофеля и других видов культурных видов растений на солеустойчивость. Выявление гибридов картофеля с высокой активностью СОД может расширить набор пищевых диетических продуктов для человека как источников антиоксидантов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены/представлены на: научной конференции, посвященной памяти академика Ю.С. Насырова "Достижения современной физиологии растений: теоретические и прикладные аспекты" (Душанбе, 2008), международном тренинге "Использование ботанических семян для обеспечения населения продовольствием" (Душанбе, 2009), международном семинаре "Обеспечение улучшения продовольствия и

увеличение доходов и Юго-Западной и Центральной Азии (SWCA) через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическому стрессу", (Индия, Гуджарат, 2010), VI Московском Международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития", (Россия, Москва, 2011), совместном семинаре лабораторий молекулярной биологии и биотехнологии, биохимии растений, фотосинтеза и продуктивности растений, генетики растений Института ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из: введения; 4-х глав; выводов; списка литературы, приложения. Работа содержит 8 рисунков, 11 таблиц. Список цитируемой литературы включает 129 наименований, из которых 90 на иностранных языках.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований Объектами исследований служили меристемные и столоновые пробирочные растения картофеля (Solanum tuberosum L.) широко распространенного в Таджикистане сорта Пикассо (не устойчивый к NaCl), сорта Жуковский ранний и гибриды картофеля №1, №24, №6, №27 и JV°25, полученные из Международного Центра Картофеля CIP (Перу, Лима). Солеустойчивые гибриды отобраны нами путем скрининга в культуре in vitro на устойчивость к хлористому натрию. Впоследствии клон-гибрид X°1 (CIP 397077.16), устойчивый KNaCl, получил название сорт Файзабад. Растения-регенеранты из столонов были получены согласно проведенным ранее опытам (Шукурова и др., 2007).

Растения размножали клонированием in vitro на среде Мурасиге и Скуга (MC) (1962), содержащей витамины, агар и сахарозу. Растения культивировали при +20.. .+22°С при 16-часовом освещении люминесцентными лампами белого цвета (4000 люкс.).

В экспериментах использовали одноузловые черенки с одним листом, высаженные на среду MC, содержащую 2% сахарозы и разные концентрации паклобутразола (ПБ) (25; 50; 75 мкг/л среды), в зависимости от задач опыта, с добавлением различной концентрации кинетина и 1-нафтилуксусной кислоты (НУК). Растения культивировали в течение 28 дней, в обычном режиме культивирования in vitro. После этого часть растений переносили в режим клубнеобразования (культивировали в течение 70 дней при температуре 16=С, при 10-часовом освещении).

Получение микроклубней in vitro. Растения-регенеранты картофеля сначала культивировали в среде MC, содержащей агар - 0.6% и сахарозу - 8% при 16-часовом фотопериоде в течение 30 дней при температуре +20...+22°С. В культуральную среду добавляли 1 мг/л бензиламинопурина (6-БАП) или 1.25 мг/л кинетина и 1 мг/л нафтилуксусной кислоты (а-НУК). Затем растения переводили в условия короткого фотопериода - 8 ч освещения и выдерживали

в течение 35-40 дней при температуре + 18...+20°С. Для увеличения размера клубней растения переносили в темное помещение и выдерживали при температуре ^-20...~22SC в течение 20-25 дней. В ходе экспериментов анализировали также действие углеводов и ростовых веществ, таких как паклобутразол, в комбинации с минеральными солями, на качество микроклубней в период покоя. Для каждого эксперимента было использовано по 60 растений-регенерантов. В таблицах представлены средние значения экспериментальных данных, полученных с использованием всех показателей пробирочных растений (20-30 проб).

Опыты с использованием разных форм азота. Гибриды картофеля выращивали в условиях in vitro на среде МС, содержащей хлористый натрий (NaCl) в концентрациях от 100 до 300 мМ и разные формы азота: NOj -вариант-5 мМ KN03; в контроле соли нитрата заменили на эквимолярное по катионам количество CaSO.; NH+- вариант - 2-5 мМ (NH4)2S04.

Растения-регенеранты выдерживали в световой установке при температуре +23...+25°С, при 16-часовом фотопериоде. Освещенность составляла 5-7 клк. Растения выращивали в пробирках (18x200 мм), закрытых ватно-марлиевыми пробками. Объем питательной среды в пробирках составлял 12 мл. В каждом варианте использовалось по 10-12 пробирочных растений. Длительность культивирования растений-регенерантов in vitro составляла от 25 до 55 суток.

Устойчивость опытных растений к N'aCl оценивали по степени угнетения роста (высота, сырая масса побега, количество корней). При микрочеренковании отбирали по два одноузловых черенка с одинаково развитыми листьями и использовали черенки со средней части побега.

Во всех опытных и контрольных вариантах были определены активность супероксиддисмутазы (СОД), содержание малонового диальдегида (МДА) и фотосинтетические пигменты.

Содержание МДА определяли по методу, описанному в работе (Heath, Pusker,1968), с применением тиобарбитуриевой кислоты. Оптическую плотность супернатанта измеряли при двух длинах волн - 532 нм и 600 нм на спектрофотометре Ultraspec-II. Содержание МДА рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции£=156 мМ^-см"1, после вычисления неспецифического поглощения при 600 нм.

Активность СОД определяли с использованием нитросинего тетразолия по методу, описанному в работе (Giannopulitis, Ries, 1977). Оптическую плотность измеряли при длине волны 560 нм на спектрофотометре Ultraspec-II. За единицу активности СОД принимали 50%-ное ингибирование образования формазона.

Активность каталазы определяли по скорости разложения перекиси водорода (Н202) по методу (Kumar, Knowles, 1993).

Содержание Сахаров определяли по методу (Туркина, Соколова, 1971 ).

Пигменты выделяли экстрагированием из навески растений 80%-ым ацетоном и определяли содержание хлорофилла и каротиноидов по методу (Шлык, 1971). Чистоту материала проверяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью диагностических моновалентных тестов согласно рекомендации Международного Центра Картофеля CIР (Лима, Перу).

ГЛАВА 3. МИКРОКЛУВНЕОБРАЗОВАНИЕ С ТОЛОНОВЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ /А VITRO В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕ1IEPAHTOB

3.1. Рострастений-регенсрантов и размер микроклубней картофачя в зависимое! и от концентрации азота в культуральной среде

Одной из наших задач являлось изучение условий, способствующих интенсификации роста и образования микроклубней in vitro. Известно, что размер стеклянных пробирок и объем культуральных сред оказывает влияние на рост эксплантов и образование микроклубней. Нами было изучено влияние азота (N) на рост регенерантов и образование микроклубней in vitro. Для этого использовали среду с измененным составом минеральных солей.

В табл. 1 приведены данные, указывающие на зависимость роста растений-регенерантов от дозы нитратов в среде культивирования. В зависимости от увеличения концентрации нитрата в среде культивирования in vitro увеличивался и размер микроклубней. Наибольший эффект на размер микроклубней оказывала концентрация 120 мМ, при которой рост растений составлял 7.3 см, а диаметр микроклубня 1.14 см. Было обнаружено, что высокое содержание нитратов уменьшает сырой массы микроклубней примерно в два раза.

Таблица 1

Рост растений и размер микроклубней в зависимости от концентрации азота в культуральной среде in vitro

Содержание азота (KN03), мМ Рост растении, см Диаметр микроклубней, мм

84 5.1 0.37

120 7.3 1.14

168 9.9 0.93

336 13.4 0.82

Значительное увеличение размеров микроклубней было достигнуто при комбинированном использовании фитогормонов (кинетин) и стимуляторов роста растений (паклобутразол). Наибольший размер микроклубней был получен при добавлении в культуральную среду 0.5 мг/л кинетина и 50 мкг/л стимулятора роста паклобутразола (ПБ).

Повышение концентрации кинетина в культуральной среде до 1.5 мг/л в присутствии 50 мкг/л паклобутразола было пропорционально ингибированию сырой массы и размера микроклубней.

Паклобутразол (50 мкг/л) без присутствия кинетина стимулировал увеличение сырой массы и размера микроклубней in vitro несколько меньше - 485 мг и 19 мм соответственно.

Эти результаты инициировали дальнейшие исследования их роли в физиолого-биохимических процессах в зависимости от условий культивирования растений in vitro, что и послужило основой для более

детального анализа генотипов, различающихся по устойчивости к стрессорным факторам, в частности к засолению.

К таким генотипам относится сорт Файзабад (клон-гибрид Л® 1), устойчивый к засолению, и широко распространенный в Таджикистане сорт Пикассо и клон-гибриды Л° 6,25,27 - не устойчивые к засолению.

Более того, имеются сведения о возможности усиления солеустойчивости растений с помощью веществ, регулирующих ростовые и репродуктивные процессы. Одним из таких веществ является регулятор роста растений паклобутразол (ПБ).

3.2. Действие регуляторов роста на микроклубнеобразование in vitro

Были проведены опыты с содержанием в среде культивирования различных концентраций NaCl (от 0.5% до 1.5%) и регулятора роста ПБ (20; 50 и 75 мкг/л среды МС). Как видно из данных табл. 2, солевой стресс ингибировал высоту побегов пробирочных растений у обоих генотипов картофеля (солеустойчивый сорт Файзабад и солечувствительный сорт Пикассо). У солеустойчивого сорта Файзабад ингибирование побегов наблюдалось при всех использованных в эксперименте концентрациях NaCl. Высокую степень ингибирования роста побега можно было наблюдать при 1% концентрации NaCl. При 1 % концентрации NaCl снижение роста составляло примерно 50% от контроля.

Ингибирование роста также наблюдалось и у солечувствительного сорта Пикассо. Однако, у сорта Пикассо, в отличие от сорта Файзабад, рост побегов прекратился уже при концентрации 1% NaCl и составил примерно 9-10% от контроля, а при концентрации 1.5% NaCl образование побегов практически прекратилось.

Добавление в культуральную среду ПБ на фоне NaCl также приводило к снижению роста побегов пробирочных растений у обоих сортов картофеля. Однако, при добавлении в культуральную среду ПБ несколько усиливалось корнеобразование - и у сорта Файзабад, и у сорта Пикассо. Приведенные результаты (табл. 3) показывают, что сорт Файзабад сильнее реагировал на увеличение концентрации ПБ, чем сорт Пикассо. Оптимальная концентрация ПБ для корнеобразования и роста составляла 50 мкг/л, повышение концентрации до 75 мкг/л не оказывало влияния на длину корней растений.

Следует отметить, что более чувствительной к действию ПБ оказалась длина междоузлий. У обоих сортов длина междоузлий уменьшалась с повышением концентрации ПБ в культуральной среде in vitro. Однако, при концентрации 0.5% NaCl у сорта Пикассо прекратилось образование междоузлий.

Культивирование растений на фоне ПБ несколько увеличило сырую массу побегов у обоих генотипов картофеля, независимо от степени устойчивости к засолению (табл. 3). При концентрации 50 мкг/л ПБ сырая масса побегов и корней увеличилась до максимального уровня, а повышение концентрации до 75 мкг/л не оказало влияния.

Полученные результаты указывают на то, что добавление ПБ в культуральную среду in vitro способствует увеличению солеустойчивости картофеля. Особенно заметно было повышение солеустойчивости у сорта

Влияние lili на параметры роста растений картофеля, культивированных при разной степени засоления

Варианты, Параметры роста, см Концентрация ПБ, мкг/л

XaCI, % Контроль 25 50 75

Сорт Файзабад

Контроль 10.5 ±0.4 9.1 ±0.4 8.6 ±0.3 9.2 ±0.3

0.5 Высота 9.8 ±0.5 6.2 ± 0.3 4.4 + 0.3 4.0 ±0.2

1.0 растений 4.8 ±0.2 3.3 ± 0.1 2.5 ±0.1 2.2 ±0.1

1.5 3.7 ± 0.1 2.7 ±0.1 2.2 ±0.1 1.8 ± 0.1

Контроль 3.8 ±0.2 3.2 ±0.3 5.7 ±0.3 6.1 ±0.3

0.5 Длина 3.5 ±0.3 4.7 ±0.2 5.5 ±0.3 5.2 ±0.3

1.0 корней 2.9 ±0.2 3.5 ±0.1 4.6 ±0.2 4.4 ±0.2

1.5 1.8 ± 0.1 2.5 ±0.1 3.5 ±0.2 3.6 ±0.1

Контроль Длина междоузлий 0.6 ±0.02 0.4 ± 0.02 0.4 ±0.02 0.4 ±0.02

0.5 0.5 ±0.01 0.3 ±0.01 0.3 ±0.01 -

1.0 0.3 ±0.01 - - -

Сорт Пикассо

Контроль 9.8 ±0.5 9.1 ±0.4 9.2 ±0.4 8.4 ±0.3

0.5 Высота 6.3 ±0.4 5.8 ±0.3 4.8 ±0.3 3.8 ±0.2

1.0 растений 0.9 ±0.1 2.1 ±0.1 2.2 ±0.1 1.7 ± 0.1

1.5 - - - -

Контроль Длина корней 5.5 ±0.4 6.1 ±0.5 6.6 ±0.5 6.1 ±0.1

0.5 2.9 ±0.2 3.3 ±0.2 3.5 ±0.2 2.6 ±0.1

1.0 0.7 ±0.01 1.1 ±0.1 1.2 ± 0.1 -

Контроль Длина 0.6 ±0.1 0.3 ±0.03 0.3 ± 0.03 _

0.5 междоузлий 0.2 ±0.03 0.2 ±0.01 0.2 ±0.01

Примечание: "-" определение не проводилось.

Пикассо под действием ПБ - на фоне повышенной концентрации NaCl существенно увеличивалась масса побегов и корней.

Для достоверности полученных результатов нами были проведены опыты по определению фермента СОД при наличии ПБ в культуральной среде in vitro. Как видно из данных табл. 4, активность СОД у сорта Файзабад была примерно в 1.5 раза выше, чем у сорта Пикассо. Активность СОД у обоих сортов на фоне 0.5 и 1% NaCl и при добавлении ПБ (50 мкг/л, оптимальная концентрация) в культуральную среду выращивания усиливалась примерно одинаково.

Уровень активности СОД у солеустойчивого сорта Файзабад был гораздо выше, чем у солечувствительного сорта Пикассо. Но относительное увеличение активности СОД на фоне ПБ у обоих генотипов составляло от 120 до 140 %. Эти данные свидетельствуют о том, что один из факторов повышения солеустойчивости, которое было выявлено при действии ПБ, возможно связан с усилением активности СОД как протекторной системы окислительного стресса.

Таблица 3

Влиииис ПБ на величину сырой массы органов (г/орган) растений картофеля, культивированных при разной степени засоления

Варианты Органы Концентрации ПБ, мкг/л

NaCl, % растений контроль 25 50 75

Сорт Файзабад

Контроль 2.2 ±0.2 2.9 ±0.3 3.3 ±0.3 3.3 ±0.3

0.5 2.2 ±0.2 2.8 ±0.2 3.0 ±0.2 2.9 ±0.3

1.0 Побеги 2.1 ±0.2 2.9 ±0.2 3.0 ±0.2 2.8 ±0.2

1.5 1.7 ±0.1 2.2 ±0.2 2.5 ± 0.2 2.6 ±0.2

Контроль 0.22 ± 0.02 0.24 ±0.01 0.25 ± 0.02 0.26 ±0.02

0.5 0.22 ±0.02 0.25 ± 0.02 0.96 ±0.02 0.27 ±0.02

1.0 Корни 0.22 ±0.02 0.31 ±0.03 0.34 ±0.02 0.33 ± 0.02

1.5 0.08 ±0.01 0.33 ±0.02 0.38 ± 0.02 0.36 ±0.02

Сорт Пикассо

Контроль 1.9 ±0.2 2.2 ±0.2 2.7 ±0.2 2.6 ±0.2

0.5 Побеги 1.4 ±0.2 2.1 ±0.1 2.3 ±0.1 2.2 ±0.1

1.0 0.8 ±1.2 1.3 ±0.1 1.6 ±0.1 1.6 ±0.1

Контроль 0.8 ± 0.2 0.8 ±0.1 2.7 ±0.1 0.7 ±0.1

0.5 Корни 0.7 ±0.1 0.9 ±0.1 1.1±0.1 0.8 ±0.1

1.0 0.1 ±0.01 0.14 ±0.01 0.16 ±0.01 0.15 ±0.01

Как видно из табл. 5, ПБ также стимулировал возрастание средней массы микроклубня, но не влиял на образование количества клубней. У сорта Пикассо средняя масса микроклубня увеличилась примерно в 2.5 раза по сравнению с контролем, а у сорта Файзабад в 1.8 раза.

Итак, можно подвести итог, что ПБ оказывал стимулирующее влияние на укрупнение и увеличение массы образующихся в культуре in vitro микроклубней, что может быть связано с ингибированием биосинтеза гиббереллина и метаболизацией АБК и других гормонов (цитокинины). Более того, ПБ не только стимулировал нарастание массы микроклубней in vitro, но и повышал устойчивость растений к солевому стрессу.

Одним из возможных механизмов действия фитогормонов, регуляторов роста в условиях стрессорных воздействий может быть метаболизм Сахаров, что и послужило одной из задач наших исследований.

Таблица 4

Действие ПБ на активность сунероксиддис.мутазы (мкмоль/r сырого веса) в зависимости от степени засоления

Варианты, NaCI, Концентрация ПБ, мкг/л Увеличение,

О/ /о 50 75 %

Сорт Файзабад

Контроль 24.7 ±9.2 23.4 ±2.7 120

0.5 14.4-2.1 20.2 ±2.1 140

1.0 11.8 ± 1.4 17.7 ±2.3 124

Сорт Пикассо

Контроль 16.6± 1.5 20.3 ± 1.4 123

0.5 8.8 ¿0.7 12.4 ±1.2 d 140

1.0 8.9 ± 0.4 8.2 ±0.7 138

Таблица 5

Влияние ПБ на микроклубнеобразование картофеля in vitro

Варианты Количество пробирочных растений, шт. Общее количество микроклубней, шт. 05 и CJ Э и я я я — 3 ё ? О 2 Средняя масса 1 клубня, г Количество клубнсй/растснис, шт.

Сорт Пикассо

Контроль(без добавления в культуральную среду МС ПБ) 26 102 17.03 0.370*0.4 2.2±0.1

Опыт (добавление в культуральную среду МС ПБ 50 мкг/л) 32 103 32.3 0.801±0.7 2.7±0.3

Сорт Файзабад

Контроль(без добавления в культуральную среду МС ПБ) 44 112 18.25 410±5 2.5±0.3

Опыт (добавление в культуральную среду МС 50 мкг/л+ ПБ) 52 10В 38.47 740±8 2.1 ±0.3

3.3. Действие фитогормонов на микроклубнеобразование у различных по длительности культивирования растений-регенерантов картофеля in vitro

Длительное культивирование растений картофеля в системе in vitro приводит к постепенному снижению способности корнеобразования и заметным морфологическим изменениям (Мардямшин, Шарафудинова,2000). При этом наиболее заметным является плохое развитие корневой системы в почве (Reinecke, Bandurski, 1987). Одна из возможных причин потери жизнеспособности при длительном культивировании растений in vitro связана

с изменением содержания гормонов, которые влияют на образование корневой системы и процессы, способствующие адаптации растений в разных условиях среды (Evans, 1985).

В связи с этим для изучения влияния кинетина на формирование микроклубней нами были проведены опыты по их влиянию на разные по длительности культивирования меристемные и столоновые растения-регенеранты в условиях in vitro.

Как видно из результатов, приведенных в табл. 6, выживаемость растений при посадке в почву оздоровленных растений составляла от 96% до 100%, а у длительно культивируемых in vitro растений выживаемость при пересадке в почву резко снижалась. Степень выживаемости зависела также от генотипа картофеля. Так, у сорта Пикассо выживаемость длительно культивируемых растений in vitro составляла 77%, у клон-гибрида №25 (не устойчивого к засолению) - 64% и у клон-гибрида № 1 (сорт Файзабад, устойчивого к засолению) -96%.

Образование клубней у растений-регенерантов при посадке в почву также зависит, во-первых, от генотипа, во-вторых, от длительности культивирования растений in vitro. Наибольшее образование клубней отмечено у клон-гибрида № 1. У вновь оздоровленного этого клон-гибрида формировалось до 11 клубней, а при длительном культивировании образование клубней сокращалось до 8 шт. на одно растение.

При посадке в почву у вновь оздоровленных растений сорта Пикассо и клон-гибрида №25 количество клубней на растение составляло 7-8 шт., а у длительно культивируемых растений данного сорта и клон-гибрида №25 наблюдалось уменьшение количества клубней до 5 шт. на растение.

У длительно культивируемых растений in vitro происходило также уменьшение суммарной массы клубня: у сорта Пикассо - на24%, клон-гибрида №25 - на 31 % и у клон-гибрида № 1 - на 12%.

Эти результаты свидетельствуют о том, что количественные признаки продуктивности растений имеют генотипический характер и отчетливо проявляются при многократной пересадке культивируемых растений в условиях in vitro.

Выживаемость растений в условиях почвы, количественные характеристики продуктивности также зависят от устойчивости к стрессорным факторам. Очевидно, генотипы, обладающие устойчивостью к засолению, при длительном культивировании in vitro способны к меньшей потере массы клубней, чем чувствительные генотипы (табл.6).

Одной из причин этого, возможно, является неодинаковое снижение содержания фитогормонов при длительном культивировании растений, то есть процесс длительного культивирования in vitro может оказать влияние на содержание цитокининов и ауксинов, регулирующих морфологические процессы и продуктивность растений картофеля.

Показано действие кинетина на образование и массу микроклубней картофеля у вновь оздоровленных и длительно культивированных растений in vitro. Для микроклубнеобразования in vitro использовали среднюю часть

Выживаемость и продуктивность оздоровленных и длительно культивируемых in vitro растении картофеля при

пересадке в почву

Варианты опыта Количество высаженных в ночву растений, hit. Количество выживших в ii04 вс растении, шт. Выживас -мость, % Количество клубней, шт./растеннс Масса клубней/ растение, г Потерн массы клубней, %

Пикассо (контроль)

Вновь оздоровленные 100 98 98 7 374±11 -

Длительно культивируемые 100 77 77 5 285±7 24

Клон-гибрид JSli I (сорт Файзабад

Вновь оздоровленные 100 i 00 100 11 452± 14 -

Длительно культивируемые 100 96 96 8 398±12 12

Клон-гибрид №25

Вновь оздоровленные 100 97 100 8 385±14 -

Длительно культивируемые 100 64 96 5 265±13 31

пробирочных растений. В среду культивирования добавляли кинетин в концентрации от 0.3 мг до 1.5 мг на литр МС-среды. Растения выращивали при фотопериоде 8 ч света и 16 ч темноты.

Наблюдалось заметное увеличение массы микроклубней по мере повышения концентрации фитогормона, но до определенной его дозы в культуральной среде выращивания растений. Наивысшее накопление массы микроклубней наблюдалось при использовании концентрации фитогормона от 1.0 до 1.25 мг/л культуральной среды. При увеличении концентрации гормона до 1.5 мг/л имело место ингибирование клубнеобразования и их массы. При этом уменьшение массы клубней составило 40 - 45%.

Так, при оптимальных концентрациях гормона (1.0 мг/л) в культуральной среде накопление массы клубней у длительно культивируемых растений сорта Пикассо составило примерно 189 мг/растение, у клон-гибрида №1 - 325 мг/растение и у клон-гибрида №25 -137 мг/растение.

У вновь оздоровленных растений-регенерантов сохранялась та же тенденция к увеличению массы микроклубней: у сорта Пикассо - 388 мг/растение, у клон-гибрида№1 - 392 мг/растение иу клон-гибрида№25 -286 мг/растение.

Полученные данные существенны и достоверны, так как учитывалось среднее значение из 100 опытных пробирочных растений.

Анализ опыта показывает, что при низких концентрациях гормона образование клубней значительно ниже у длительно культивируемых растений, чем у вновь оздоровленных. Различия в клубнеобразовании у клон-гибрида №1 от концентрации гормона в обоих вариантах было небольшим и составляло от 25% при низких концентрациях (0.3 мг/л) до 12-17% при высоких концентрациях (0.75 мг/л - 1.5 мг/л) кинетина в культуральной среде выращивания. Полученные результаты показывают, что клон-гибрид №1 при длительном культивировании способен продуцировать гормоны, независимо от условий среды выращивания, для поддержания физиологического статуса растений, без существенного снижения продуктивности.

Микроклубнеобразование у сорта Пикассо и клон-гибрида №25 более зависимо от концентрации гормона, особенно у растений, прошедших длительное культивирование in vitro. Это очень важный факт, указывающий на возможность существования особого механизма адаптации растений к изменяющимся условиям среды и на различный уровень эпигенетической регуляции активности генов, ответственных за продукционный процесс.

Представляет интерес то, что у чувствительных к засолению генотипов при длительном культивировании заметно ухудшалось корнеобразование, и пересадка растений в почву приводило к потере количества высаженных растений (табл.6).

Ауксины также играют важную роль в процессе микроклубнеобразования in vitro. Согласно данным (Evans, 1985), росто- и корнестимулирующее действие ауксинов играет существенную роль в адаптации растений в почве.

Понижение уровня ауксинов у длительно культивируемых in vitro растений может быть связано с невысоким уровнем цитокининов, поскольку имеются данные о том, что цитокшшны влияют на продукцию ауксинов (Evans, 1985).

При пересадке в почву длительно культивируемых растений цитокинины, возможно, играют более значимую функциональную роль н регуляции координации генетических, эпигенетических и физиологических функций у растений в соответствии с условиями обитания. Не исключено, что способность длительно культивируемых растений продуцировать цитокинин может быть одной из причин, обуславливающих их неспособность адаптироваться в условиях почвы.

Можно предположить, что изменение гормонального статуса растений в процессе длительного культивирования in vitro является одной из причин снижения продуктивности пробирочных растений картофеля при пересадке их для выращивания в почве.

Таким образом, анализ полученных результатов показал, что при длительном культивировании растений in vitro происходит снижение эпигенетической активности, регулирующей рост, развитие и стрессоляторные системы растений, незамедлительно оказывающей отрицательное влияние на выживаемость и продуктивность растений, что не наблюдается у вновь введенных в культуру меристемных и столоновых растений-регенерантов in vitro.

ГЛАВА 4. АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ В УСЛОВИЯХ СОЛЕВОГО СТРЕССА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФОРМ АЗОТА В СРЕДЕ //V VITRO

Как показали результаты наших экспериментов, внесение в питательную среду NaCl в высокой концентрации приводило к деградации хлорофилла и накоплению малонового диальдегида (МДА) у неустойчивых генотипов растений-регенерантов, выращенных in vitro. Солевой стресс оказывал влияние на содержание МДА во всех вариантах опыта (NH* N0" и N-дефицитный), но в разной степени. В проведенных опытах, во всех вариантах также наблюдалась активность антиоксидантного фермента- су пероксиддисмутазы (СОД).

Как видно из данных табл. 7, у солеустойчивых генотипов картофеля (гибриды №1 и №24) на фоне азотного питания (NH* N0") наблюдалось неодинаковое содержание хлорофилла а, Ъ и каротиноидов.

У устойчивых генотипов (гибриды №1 и №24) содержание хлорофиллов было несколько меньше в варианте с N0", чем в варианте с NRj~ и в N-дефицитном варианте. Та же самая тенденция снижения содержания хлорофиллов сохранилась у неустойчивых гибридов (гибриды №6 и №27) на фоне N0", но различие с N-дефицитным вариантом было меньше. При этом наблюдалась более высокая деградация хлорофилла Ь, чем хлорофилла а.

Содержание каротиноидов в результате солевого стресса подверглось изменению не меньше, чем хлорофиллов. Наибольшее снижение содержания каротиноидов наблюдалось также на фоне МСГ,- типом питания.

При переводе растений на питательные среды с экстремальным содержанием NaCl, в концентрации 258 мМ, во всех вариантах у солеустойчивых гибридов, наблюдалось уменьшение содержания пигментов.

Небольшое снижение содержания хлорофилла а имело место в NH,-варианте и составило примерно 30% в сравнении с контрольным вариантом.

Снижение содержания хлорофилла а в NO"! - и N-дефицитно.м вариантах составляло примерно 40-50% в сравнении с контролем. Наибольшее снижение содержания хлорофилла b наблюдалось во всех трех вариантах. Однако у гибрида №27 наибольшее снижение содержания хлорофиллов наблюдалось на фоне N-дефицитного питания.

Содержание хлорофилла а оказалось более устойчивым к действию соли как у устойчивых, так и у не устойчивых к засолению генотипов.

Таким образом, можно подвести итог, что в условиях проведенных нами опытов фотосинтетические пигменты являются одним из компонентов клеточной системы, остро реагирующим на действие экстремальных стрессорных факторов. При этом содержание хлорофилла 6 снижалось в большей степени, чем содержание хлорофилла а. В результате солевого стресса содержание каротиноидов также имело тенденцию к снижению во всех вариантах опыта.

Снижение содержания фотосинтетических пигментов сопровождалось увеличением в растениях-регенерантах содержания МДА (табл.8).

Содержание МДА увеличилось у гибрида .Ye 1 на 40% в растениях с NH, -типом азотного питания, на 37% с NO" -типом питания и в N-дефицитных растениях-регенерантах на 66% (табл. 8).

Примерно то же самое наблюдалось у другого солеустойчивого гибрида -,4224. У данного гибрида при солевом стрессе содержание МДА увеличилось на 51% в варианте с NH4 -типом питания, на 25% с N0" -типом, и на 41% в N-дефицитных растениях-регенерантах. Следует отметить также, что у не устойчивых к солевому стрессу генотипов (гибриды №6 и №27) образование МДА было значительно больше, чем у устойчивых к солевому стрессу генотипов (гибриды №1 и №24). Особенно высокое содержание МДА проявилось у гибрида №27.

Как показано в табл. 9, устойчивость растений в варианте с NH4 коррелировала с явным увеличением активности СОД. При солевом стрессе активность СОД у гибрида №1 в варианте NH^ увеличилось на 100%, в NO" варианте на 42% и в N-дефицитно.м варианте на 62%. Такое же увеличение активности СОД наблюдалось также у гибрида - №24. У не устойчивых к NaCl гибридам также наблюдалось увеличение активности СОД, особенно на фоне NH^. Наибольшая активность этого фермента была свойственна гибриду № 1, по сравнению с другими гибридами.

На основе полученных нами результатов можно утверждать, что растения-регенеранты, выращенные в условиях in vitro на среде с NH4-ranoM питания, оказались более устойчивыми к засолению, чем растения, выращенные на среде с NO'-типом питания. Устойчивость растений-регенерантов в -варианте проявлялась с увеличением активности СОД, а увеличение содержания МДА указывало на уровень подверженности генотипов окислительному стрессу. При NO" -типе питания признаки оксилительного стресса были более выражены, чем при NH, -типе питания и в N-дефицитном варианте.

Содержание фотосин тетических пигментов (мг/г сырой массы) у разных генотипов картофеля в зависимости от

условий азотного питания

Условия эксперимента

Вдр1Ш[7Ы NH'j NOj Дефицит N

- Хлорофилл а Хлорофилл b Каротнноиды Хлорофилл it Хлорофилл Ь Кгфотшюнзы Хлорофилл и Хлорофилл b Каромшоиды

У aiwii 41/uit'.niomiiii ы

Контроль 2 I5a0.l t ОХ81ОО6 0 75Ю 07 1.75Ю.13 0 63Ю08 0.721006 2 05ii) 14 U 4410 03

с. Опыт (258 мМ Nadl 1.68*0.19 0 57Ю.18 0.70Ю.02 1.531:0.11 0.4110.02 06310.05 1.4HO.I3 (J.27KKI3 0 2710 01

L- Сшиенпе содержания. % 22 58 7 (3 35 13 32 39 7

Контроль 2 32Ю22 0.84±0.07 0.7210.06 1.871041 0 66Ю.07 0.5310.03 1.8110.23 0591000 0.55Ю 02

П Опыт (258 MMNaCI) 1 75i0 15 028±0.01 0 6410.03 1.53Ю.37 041Ю.03 0.4410.03 14810 13 О.ЗИООЗ 0.5Ш0.03

i Снижение содержания. °о 25 67 12 19 38 17 19 43 10

Ипсшойчивые :епошш1ы

п Контроль 1 8li0.03 0.4Si0.05 0 5210 02 1.63Ю 14 0.551007 0 5810.06 1.62Ю11 0.56 Ю.04 0 15к103

,1- Опыт (258 мМ NaCII 1 21Ю04 U.23J0.01 0 зад 02 1 2«Й 15 0 2710 01 0 38 to 05 1.27Ю 03 0 28 Ю.01 II 32H.I.D2

и~ Снижение содержания, "и 34 21 51 35 ■л 50 2ч

г- k*0HT|10.TL 2 55i0.l1» 1 14Ю 11 04210.01 2.2510.17 1.3 8Ю.27 0 59Ю06 LS6i0.il 0 8810 07 0 ЗНОШ

п Опыт (258 iiMNaCI) 1.6810,12 0.4210.03 0,3210.01 1.6410.02 0.8710.01 0.3910.04 0.9810,11 04310.04 0.2210.02

С— Снижение содержания, "о 35 64 24 28 37 34 48 51 30

Таблица 8

Действие соленого стресса на содержание малонового диальдсгида (мкМоль /г сырой массы) у разных генотипов картофеля

Гибриды Варианты Условия эксперимента

i NH; j % 1 NO, J % N- дефнинтный вариант %

^ cL 1С и Устойчивые генотипы

Контроль 10.6=1.3 100 11.2±0.8 100 11.9±0.5 100

Опыт (258мМ NaCI) 14.9±1.5 140 15.4±0.7 137 18.5±0.3 166

т fS % 5 5. to С Контроль I0.7±1.6 100 18.4±1.3 100 12.8=09 100

Опыт (258мМ NaCI) 16.2±1.4 151 23.1±1.4 125 18.1 ±0.6 141

Неустойчивые генотипы

о а ю Контроль 16.7±1.1 100 16.3±0.5 100 16.1±0.3 100

Опыт (258мМ NaCI) 28.2±1.7 168 29.6±1.7 182 25.4±1.1 158

Гибрид №27 Контроль 17.2±1.2 100 14.1 ±1.1 100 13.3±0.8 100

Опыт (258мМ NaCI) 29.1±1.5 169 28.8±1.8 204 20.1±1.4 151

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что азотное питание является фактором устойчивости растений к окислительному стрессу, однако для подтверждения данного факта требуются дополнительные исследования метаболизма растений, обладающих устойчивостью к солевому стрессу, и оценка роли органоидов клетки - хлоропластов, митохондрий.

Влияние Сахаров на регуляцию антиоксидантных ферментов при засолении. Проведенные эксперименты показали, что после краткосрочного действия NaCI (60, 120 и 180 мин) наблюдались некоторые изменения содержания Сахаров в листьях картофеля. При нормальных условиях (23SC) содержание растворимых Сахаров у устойчивого гибрида №1 было на 37% выше, чем у чувствительного к N'aCl сорта Пикассо. Такие результаты были получены после 60 мин

Таблица 9

Влияние солевого стресса на активность супсроксидднсмутазы (сд. активное гн/г сырой массы) у разных генотипов картофеля

Гибриды Условия эксперимента

Варианты >'»4 % NO; % N- дефицитныи вариант %

Гибрид №1 Устойчивые генотипы

Контроль 20.7±1.5 100 17.1±1.6 100 19.8±2.1 100

Опыт (258мМ NaCl) 42.7±3.5 206 24.3±3.1 142 32.2±2.7 162

-тг сч % 5 с. ю Контроль 25.2±1.7 100 20.5±1.2 100 18.2±1.3 100

Опыт (258мМ NaCl) 44.5±3.1 176 30.6±2.2 149 33.7±1.7 185

Неустойчивые генотипы

о ? с. о й Контроль 11.3±0.04 100 13.7±0.8 100 12.1 ±0.7 100

Опыт (258мМ NaCl) 20.2±1.8 178 17.2± 1.5 125 14.7±1.2 121

Гибрид №27 Контроль 14.6±1.1 100 16.7±1.2 100 13.8±0.4 100

Опыт (258мМ NaCl) 22.Ш.7 151 23.2±2.2 138 1б.6±1.7 120

воздействия NaCl. Изменение в содержании сахара у обоих генотипов было выявлено только после 120-180-минутного воздействия. Содержание Сахаров после 180 мин выдерживания растений в условиях засоления значительно снизилось и составило 25-30% от исходных значений у обоих генотипов.

Эти результаты дают основание утверждать о роли растворимых Сахаров в защите растений от окислительного стресса. Можно предполагать, что низкая скорость окислительных процессов у гибрида jVsl при повышенной скорости образование АФК связана с более высокой работой антиоксидантной системы защиты, чем у чувствительного сорта Пикассо, который имеет низкую антиоксидантную защиту, что возможно, связано с низким уровнем содержания Сахаров при засолении.

0% 2% 5% 8%

Концентрация сахарозы

0% 2% 5% 8%

Концентрация сахарозы

■ Сорт Пикассо Ш Сорт Файзабад

Рис. 1. Активность каталазы (А) и СОД (В) при выращивании пробирочных растений на средах, содержащих разные концентрации сахарозы (от 0% до 8%)

На рис. 1 показаны результаты опытов по действию сахарозы на активацию ферментов антиоксидантной системы (СОД и каталазы). Как видно из рисунка, при выращивании растений с сахарозой различной концентрации в питательной среде активность каталазы у сорта Файзабад увеличилась по мере повышения концентрации сахарозы, в отличие от сорта Пикассо. В то же время активность СОД при тех же самых концентрациях была выше у сорта Пикассо, чем у сорта Файзабад.

Из рисунка видно, что для сорта Пикассо была характерна обратная зависимость активности каталазы от концентрации сахарозы в культуральной среде.

Несколько другая картина активности антиоксидантных ферментов была обнаружена при добавлении в среду выращивания различных концентраций хлористого натрия (рис. 2).

i _ 0,25 A

i« 0,2 as I

£ § «.15 I I gl .iff

liIII!£

о

0% 0.5% 1.0% 1.5% H

NaCL

Nad

■ Сорт Пикассо Сорт Файзабад

Рис. 2. Активность каталазы (А) и СОД (В) при выращивании пробирочных растений сорта Пикассо и сорта Файзабад на средах, содержащих разные концентрации NaCI. Н - через 1.5 суток после переноса растений в нормальные условия (без IVaCl)

Активность каталазы (рис. 2А) в нормальной среде (без NaCI) и при 0.5% NaCI была несколько выше у сорта Пикассо, чем у сорта Файзабад. По мере повышения концентрации NaCI в среде выращивания резко снижалась активность каталазы у сорта Пикассо и, наоборот, увеличивалась у сорта Файзабад.

Из рис. 2В видно, что уровень активности СОД у растений обоих генотипов в нормальных условиях выращивания (без NaCI) и при минимальной концентрации NaCi в среде выращивания был практически одинаков. По мере увеличения концентрации NaCI в среде выращивания наблюдалось резкое снижение активности СОД у сорта Пикассо, а у сорта Файзабад увеличилась в два раза. Следует отметить, что спустя сутки после переноса растений в нормальные условия у сорта Пикассо активность ферментов почти восстановилась до уровня контроля (без NaCI), а у сорта Файзабад осталась повышенной.

ВЫВОДЫ

1. Подобраны условия культивирования столонов картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro, при которых интенсифицируется образование микроклубней, пригодных к использованию в качестве базисного семенного

материма. Показано влияние азота на размер микроклубней. Оптимальной концентрацией азота, влияющей на формирование размера микроклубней, оказалась концентрация 120 мМ.

2. Обнаружена стимулирующая роль комбинированного использования кинетина и регулятора роста растений паклобутразола (ПБ) на увеличение сырой массы и размер микроклубней in vitro. Оптимальной оказалась концентрация кинетина 0.5 мг/л и ПБ 50 мкг/л. ПБ без кинетина также оказывал влияние на размер и сырой массы микроклубней. Наибольший эффект оказала концентрация ПБ, равная 75 мкг/л. Повышение концентрации ПБ приводило к ингибированию ростовых процессов и микроклубнеобразования, а повышение концентрации азота уменьшало сырую массу микроклубней.

3. По уровню накопления малонового диальдегида (МДА) и активности супероксиддисмутазы (СОД) растения-регенеранты, выращенные в условиях in vitro на среде с аммонием, оказались более устойчивыми к засолению, чем растения, выращенные на среде с нитратом. Устойчивость растений-регенерантов в МН4 -варианте кореллировала с увеличением активности СОД. У растений-регенерантов, выращенных in vitro на среде с нитратами (N05-вариант), содержание МДА намного выше, чем в NH4 -варианте, т.е. признаки окислительного стресса были более выражены. Растения-регенеранты, выращенные in vitro на средах МС с разным типом азотного питания имеют разную толерантность к окислительному стрессу, вызванному солевым фактором, т.е. формирование устойчивости гибридных растений картофеля к солевому стрессу зависит от формы азотного питания в условиях in vitro.

4. Показано, что добавление в культуральную среду регулятора роста ПБ на фоне NaCl приводило к снижению роста побегов у двух сортов картофеля (сорт Пикассо и сорт Файзабад), но при этом заметно увеличилась сырая масса побегов и длина корней. Оптимальной концентрацией ПБ для корнеобразования и увеличения массы побегов роста оказалась концентрация 50 мкг/л. Более чувствительной к действию ПБ оказалась длина междоузлий. У обоих сортов длина междоузлий уменьшалась с повышением концентрации ПБ в культуральной среде in vitro. Паклобутразол также оказал влияние на увеличение сырой массы микроклубней in vitro. Средняя масса 1 клубня увеличилась примерно в 2.5 раза от контроля.

5. Показана роль воздействия Сахаров при краткосрочном засолении (60, 120 и 180 мин воздействия NaCl) на активность антиоксидантных ферментов (каталазы и СОД) у сорта Пикассо (солечувствительный) и сорта Файзабад (солеустойчивый). По мере увеличения концентрации сахарозы у сорта Файзабад увеличивалась активность каталазы, а у сорта Пикассо - активность СОД. Однако при добавлении в культуральную среду NaCl ( 0.5% -1.5%) активность каталазы была более высокой у сорта Пикассо при контрольной среде (без NaCl) и 0.5% NaCl, чем у сорта Файзабад, но по мере увеличения концентрации соли она понижалась у сорта Пикассо и увеличивалась у сорта Файзабад. Активность СОД была одинаковой у обоих генотипов в нормальных

условиях выращивания (без NaCl) и при минимальной концентрации NaCl в среде выращивания. Но по мере увеличения концентрации NaCl в среде выращивания активность СОД резко снижалась у сорта Пикассо, а у сорта Файзабад, наоборот, увеличивалась в два раза.

6. Показана роль кинетика и ауксина в регуляции клубнеобразования у различных по устойчивости генотипов картофеля к засолению. Устойчивый генотип (клон-гибрид Л"°1) к засолению имеет более повышенную выживаемость при посадке в почву, чем неустойчивые генотипы (клон-гибрид К°25 и сорт Пикассо).

7. Показано, что при длительном культивировании растений-регенерантов in vitro происходит снижение эпигенетических процессов, регулирующих рост, развитие, и, очевидно, стрессоляторных систем клетки, в отличие от вновь введенных в культуру регенерантов меристемных и столоновых регенерантов.

8. Показано, что у чувствительных генотипов содержание гормонов заметно ниже у длительно культивируемых растений по сравнению с вновь введенными в культуру. У устойчивых к засолению генотипов такого явного изменения содержания гормонов при длительном культивировании не наблюдалось, что свидетельствует о способности устойчивых генотипов продуцировать гормоны, независимо от условий среды выращивания, для поддержания физиологического статуса растений, без существенного снижения продуктивности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шукурова М.Х., Назарова H.H., Давлятназарова З.Б., Салимов А.Ф., Нозимов К., Алиев К.А. "Микроклубнеобразование столоновых растений картофеля in vitro в зависимости от условий культивирования растений-регенерантов". Известия АН РТ. Отделение биол. и мед. наук. 2007, №3, стр. 39-44.

2. Алиев К.А., Карли Карло, Азимов МЛ., Неъматуллоев З.С., Мирзохонова Г.О., Шукурова М.Х., Давлатназарова З.Б., Салимов А.Ф., Назарова H.H. "Испытание гибридов картофеля на устойчивость к NaCl и регенерация солеустойчивых гибридов in vitro". Доклады АН РТ, 2007, №8, стр.716-721.

3. Нематуллоев З.С., Азимов М.Л., Давлатназарова З.Б., Ашуров С., Шукурова М.Х., Назарова H.H., Карли Карло, Алиев К.А. "Некоторые особенности роста и микроклубнеобразования у гибридов картофеля в условиях in vitro". Известия АН РТ. Отделение биол. и мед. наук. №2,2008, стр. 56-62.

4. Шукурова М.Х., Назарова H.H., Ашуров С. Алиев К.А., и др., "Влияние абиотического стресса на антиоксидантную систему клон-гибридов картофеля". Материалы научной конференции, посвященной памяти академика IO.C. Насырова "Достижения современной физиологии растений: теоретические и прикладные аспекты", Душанбе, 2008, стр. 131.

5. Шукурова М.Х., Назарова H.H., Давлятназарова З.Б., Азимов М.Л., Карли Карло, Алиев К.А. "Активность антиоксидантных систем растений картофеля в условиях солевого стресса в зависимости от форм азота в среде а. Известия АН РТ. Отделение биол. и мед. наук. №2; 2010, стр. 37-48.

6. ФайзисваС.А., Шукурова М.Х., Ватаншоева H.A., Алиев К. "Биотехнология етресеоустойчивости сельскохозяйственных культур". Материалы научной конференции "Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане", посвященной 60-летию образования Академии наук Республики Таджикистан, Душанбе, 2011,стр. 126-128.

7. Шукурова М.Х., Назарова H.H., Гадоев С., Алиев К. "Регуляция микроклубнеобразования у генотипов, различающихся по толерантности к засолению". Материалы научной конференции "Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане", посвященной 60-летию образования Академии наук Республики Таджикистан, Душанбе, 2011, стр. 142-145.

Подписано в печать 24.11.2011 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать ризография. Тираж 100 экз.

Отпечатано в Типографии ООО "Азия-Принт"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шукурова, Мусаввара Хаитовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль фитогормонов и углеводов в регуляции клубнеобразования

1.2. Генномодифицированный картофель и вопросы регуляции ] клубнеобразования

1.3. Характеристика окислительной и антиокислительной систем ] у защиты растений

1.4. Ферменты окислительного стресса

1.4.1. Малоновый диальдегид

1.4.2. Фермент супероксиддисмутазы (СОД) растений

1.5. Физиологическая и биохимическая роль антиоксидантных систем растений при засолении

1.6. Экспрессия стресс устойчивых генов растений

1.7. Влияние экстремальных факторов на супероксиддисмутазу

1.8. Прикладные аспекты супероксиддисмутазы растений 33 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Краткая характеристика объекта исследований

2.2. Объекты исследований

2.3. Получение микроклубней in vitro

2.4. Опыты с использованием разных форм азота

2.5. Содержание МДА

2.6. Активность СОД 38 2.6. Определение хлорофилла

2.8. Окислительный стресс

2.9. Активность каталазы

2.10. Содержание сахара

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

ГЛАВА 3. МИКРОКЛУБНЕОБРАЗОВАНИЕ СТОЛОНОВЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ КУЛЬ ТИВИРОВАНИЯ РА СТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ 4О

3.1. Рост растений-регенерантов и размер микроклубней картофеля в ^q зависимости от концентрации азота в культуральной среде

3.2. Действие регуляторов роста на микроклубнеобразование in vitro

3.3. Действие фитогормонов на микроклубнеобразование у различных по длительности культивирования растенийрегенерантов картофеля in vitro

ГЛАВА 4. АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ

РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ В УСЛОВИЯХ СОЛЕВОГО СТРЕССА В

ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФОРМ АЗОТА В СРЕДЕ IN VITRO

Влияние Сахаров на регуляцию антиоксидантных ферментов при 53 засолении

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рост, микроклубнеобразование и активность антиоксидантных ферментов у устойчивых к засолению генотипов картофеля in vitro"

Актуальность работы

Различные факторы окружающей среды постоянно оказывают влияние на живые организмы. К ним относятся, как и биотические (прямые и косвенные) факторы, так и абиотические (климатические, почвенные, орографические) факторы. Соответственно, разные организмы реагируют по-разному на изменения окружающей среды. Данным воздействиям особенно подвержены растения, так как имеют прикрепленный образ жизни.

Крайне неблагоприятные для растений условия проживания характерны для многих стран. Наиболее распространенными неблагоприятными факторами являются засуха, низкие и высокие температуры, переувлажнение. Еще одним из таких неблагоприятных факторов, широко распространенных в окружающей среде, является гипоксия, другими словами недостаток кислорода. Чаще всего гипоксия наблюдается при переувлажнении или даже затоплении почв, вызванными обильными поливами и сильными дождями, быстрым таянием снегов (Кузнецов, Дмитриева, 2006), при образовании ледяной корки на поверхности почвы и т.д. Однако при нормальной влажности почвы растения не испытывают недостатка кислорода, но при переувлажнении вода заполняет почвенное пространство (особенно на глинистых почвах) тем самым вытесняя воздух. При высокой температуре корни растений быстро используют вес имеющийся кислород, что в результате и приводит к недостатку кислорода (гипоксии) или даже к его полному отсутствию (аноксии), что в свою очередь влияет на физиологические процессы или даже приводит к гибели растения (Кузнецов, Дмитриева, 2006). С гипоксическим или аноксическим воздействием также связано влияние другого неблагоприятного фактора - окислительного стресса.

В настоящее время биотехнологизация сельскохозяйственных растений/культур рассматривается как один из главных подходов в решении проблем повышении урожайности и создания стрессоустойчивых растений. Особое место в этом направлении занимает получение растений, обладающих устойчивостью к засолению и засухе. В будущем одним из факторов лимитирующих продуктивность культурных растений является засоление почвы. Подсчитано, что количество засоленных почв с каждым годом возрастает и через 25-30 лет достигнет угрожающего уровня. Примерно 40% пахотных земель будут непригодными для сельскохозяйственного возделывания растений. Поэтому особую актуальность приобретает изучение физиологических и молекулярных механизмов устойчивости культурных растений к стрессорным природным факторам.

Стрессорные природные факторы, такие как засуха, высокая температура, засоление почвы провоцируют в клетках растений сверхпродукцию активных форм кислорода (АФК), как проявление окислительного стресса (Mittler, 2002). Вместе с тем, роль образующегося при стрессе перекиси водорода двойственна. Во многих случаях перекись водорода участвует в передачах сигналов как вторичный мессенджер, который защищает растение от стресса, активируя синтез ферментов-антиоксидантов (Van Breusegem et all, 2001).

Показано, что высокая концентрация хлористого натрия (NaCl) вызывает индукцию окислительного стресса, сопровождающегося разрушением мембран и деградацией хлорофилла (Meloni et al., 2003). При этом происходит образование малонового диальдегида (МДА) — продукта перекисного окисления липидов мембран (Dionisio-Sese, Tobita, 1998).

Было установлено, что растения томата, хлопчатника и пшеницы обладают большей устойчивостью к повреждению в условиях стресса, особенно при засолении, благодаря высокой активности антиоксидантной системы (Shalata et. al., 2001). Анализ данных показал, что растения пшеницы, выращенные на питательной среде с аммонием, более устойчивы к развитию окислительного стресса в листьях, чем растения, выращенные на среде с нитратами (Полесская и др., 2006). Накопление МДА в условиях солевого стресса в листьях было четко выражено в N0;- и N-дефицитных растениях и не наблюдалось у растений, выращенных на среде с NH^.

В литературе обсуждается роль ионов азота как сигнальных соединений, оказывающих влияние на экспрессию генов, контролирующих активность фотосинтеза и усвоение азота (Полесская и др., 2004). Поэтому выборочное использование форм азота в культуре in vitro позволяет более точно ответить на вопрос о роли антиоксидантных систем клетки в усилении или уменьшении устойчивости растений к солевому стрессу.

В связи с этим определенный интерес представляют изыскания регуляторных веществ, ослабляющих действие стресса на растение, главным образом солевого стресса. Нами ранее было показано, что паклобутразол (ГГБ) -синтетический регулятор роста, ингибируя ростовые процессы пробирочных растений, резко стимулировал образование микроклубней in vitro (Шукурова и др., 2007). Другие исследователи показали, что ПБ ослабляет действие солевого стресса на растения гуавы, в частности виноградной лозы (Mehomachi et al., 1996) и пшеницы, на стадии опыления (Хайихамеми и др., 2009), но данных о его воздействии на растения картофеля практически отсутствуют.

Паклобутразол ((2RS, ЗЕ18)-1-(4-хлорфенил)-4,4-диметил-(1, 2, 4-триазол)- пентан-3-ол) является триазольным регулятором роста растений. Известно, что триазол в растениях катализирует микросомальные окислительные реакции и таким образом ингибирует биосинтез гиббереллиновой кислоты (ГК) и катаболизм абцисовой кислоты (АБК) (Abou et al., 1997). Возможно, ПБ блокирует биосинтез ГК, и поэтому ингибирует рост и развитие растений (Abou et al., 1997; Murashige, Skoog, 1962; Шукурова и др., 2010; Fletcher et al., 2000).

Поэтому возможность регулирования регуляторами роста физиологического потенциала, заложенного в генотипе растения, можно использовать для повышения толерантности растений к стрессовым факторам среды.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось изучение реакции разночувствительных гибридов картофеля к засолению в условиях in vitro; возможности повышения устойчивости растений-регенерантов путем использования регуляторов роста, фитогормонов и разных форм азота, а также выявление роли ростовых процессов, активности антиоксидантных фермен тов и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в формировании устойчивости растений к солевому стрессу.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• оценить устойчивость растений-регенерантов к засолению;

• выбрать индуцированную систему и определить концентрацию инициирующих факторов;

• разработать условия микроклубнеобразования и оптимизации получения исходного материала in vitro; изучить роль антиоксидантных ферментов в формировании устойчивости гибридов картофеля к солевому стрессу;

• изучить влияние фитогормонов на устойчивость генотипов картофеля к засолению;

Научная новизна работы. Показано, что применение паклобутразола и кинетина в определенных концентрациях в качестве регуляторных факторов способствует улучшению процесса микроклубнеобразования in vitro и повышению устойчивости растений картофеля к засолению.

Выявлено нарушение взаимовлияния цитокининов и ауксинов в регуляции морфофизиологических процессов у длительно культивируемых растений картофеля in vitro. При длительном культивировании растений in vitro происходит ослабление эпигенетических процессов, регулирующих рост, развитие регенерантов и стрессоляторных систем клетки, в отличие от вновь введенных в культуру меристемных и/или столоновых растений.

Получены результаты, которые дают основание утверждать, что интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ) и снижение антиоксидантного потенциала у растений-регенерантов в условиях нитратного питания (N0;) приводит к формированию «окислительного стресса», который более выражен у неустойчивых генотипов, чем у устойчивых, и является одним из физиологических механизмов, понижающих толерантность растений к стрессу.

Практическая ценность. Получение растений из меристемных и столоновых культур in vitro позволяет ускорить создание системы получения оздоровленного базисного семенного картофеля. Использование регуляторов роста и различных форм азота в системе in vitro может служить методом для изучения физиологических механизмов устойчивости к стрессорным факторам, а также может быть рекомендовано для тестирования толерантных форм картофеля и других культурных видов растений на солеустойчивость. Выявление гибридов картофеля с высокой активностью СОД может расширить набор пищевых диетических продуктов для человека как источников антиоксидантов.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на следующих конференциях, симпозиумах, совещаниях:

• Научная конференция памяти академика Ю.С. Насырова «Достижения современной физиологии растений: теоретические и прикладные аспекты». 2008. Душанбе.

• Международный тренинг «Использование ботанических семян для обеспечения населения продовольствием». Март, 2009. Душанбе. Институт физиологии растений и генетики АН РТ;

• Международный семинар «Обеспечение улучшения продовольствия и увеличение доходов в Юго-Западной и Центральной Азии (8\¥СА) через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическому стрессу», 29-30 ноября 2010 г. Индия (Гуджарат);

• VI Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»; 21-25 марта 20И г. Москва (Россия).

• На совместном семинаре лабораторий молекулярной биологии и биотехнологии, биохимии, генетики фотосинтеза и генетики растений Института ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из: введения; 4-х глав; выводов; списка литературы, приложения. Работа содержит 8 рисунков, 1 1 таблиц. Список цитируемой литературы включает 129 наименований, из которых 90 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шукурова, Мусаввара Хаитовна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подобранные условия культивирования столонов картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro, позволяют интенсифицировать образование микроклубней, пригодных к использованию в качестве базисного семенного материала. Показано влияние азота на размер микроклубней. Оптимальной концентрацией азота, влияющей на формирование размера микроклубней, оказалась концентрация 120 мМ в культуральной среде in vitro, при которой размер одного микроклубня достигал 1.14 см (приложения, рис. 1).

Обнаружена стимулирующая роль комбинированного использования кинетина и регулятора роста растений пакробутразола (ПБ) на сырой вес и размер микроклубней in vitro. Оптимальной оказалась концентрация кинетина 0.5 мг/л и ПБ 50 мкг/л. ПБ без кинетина также оказывал влияние на размер и сырой вес микроклубней. Наибольший эффект оказала концентрация ИВ, равная 75 мкг/л.

Действие экстремальных стрессовых факторов на растение заключается в развитии стресс-реакций. Один из механизмов стресса связан с нарушением динамического равновесия в системе прооксидантов и антиоксидантов, запускающих активацию процессов перекисного окисления липидов, и их активность может служить одним из косвенных показателей уровня устойчивости растения к стрессовым воздействиям. Пластиды как составная часть единой окислительной системы клетки во многом могут определять активность окислительных ферментов.

Для оценки воздействия соли (NaCl) на систему окислительных процессов и содержания фотосинтетических пигментов, как показателей физиологической активности растительной клетки, было проведено сравнительное изучение антиоксидантных систем у разных по устойчивости генотипов картофеля к засолению, с добавлением в среду культивирования разных форм азота (NH,M NO; и N-дефицитный).

Было определено, что по уровню накопления МДА и содержанию фотосинтетических пигментов у разных по устойчивости к засолению генотипов , растения-регенеранты, выращенные в условиях in vitro на среде с NH*, оказались более устойчивыми, чем растения, выращенные на среде с NO~. Определено, что фотосинтетические пигменты по разному реагируют на засоление. Хлорофилл а оказался более устойчивым к действию соли как у устойчивых, так и у неустойчивых к засолению генотипов. При этом содержание хлорофилла b снижалось в большей степени, чем содержание хлорофилла а особенно при NO3-типе питания. В результате солевого стресса содержание каротиноидов также имело тенденцию к снижению во всех вариантах опыта.

Устойчивость растений-регенерантов в NH" -варианте кореллировала с увеличением активности СОД. А у растений-регенерантов, выращенных in vitro на среде с нитратами (NO3-вариант) наоборот - увеличивалось содержание МДА, т.е. признаки окислительного стресса были более выражены. Увеличение содержания МДА при солевом стрессе не коррелировало с возрастанием активности СОД у чувствительных генотипов, что является важным признаком резистентности к экстремальным воздействиям.

Были проведены опыты по изучению действия регулятора роста ГГБ при засолении на параметры роста картофеля сорта Пикассо и сорта Файзабад. Результаты опыта показали, что при различных концентрациях соли ростовые процессы данных гибридов ингибировались по-разному. Наиболее чувствительным к действию соли оказался сорт Пикассо. У данного сорта ингибирование роста побегов наблюдалось уже при концентрации 0.5% NaCl, а при увеличении концентрации до 1.0% полностью прекратился и составил примерно 9-10%). У сорта Файзабад в отличие от сорта Пикассо ингибирование побегов наблюдалось при всех использованных в эксперименте концентрациях NaCl. Высокую степень ингибирования роста побега можно было наблюдать при 1% концентрации NaCl. При 1% концентрации NaCl снижение роста составляло примерно 50% от контроля. И практический прекратился рост при концентрации 1.5% NaCl.

Однако при добавлении в культуральную среду ПБ на фоне NaCl картина несколько менялась. ПБ на фоне NaCl также приводил к снижению роста побегов у обоих сортов картофеля, но при этом заметно увеличилась сырая масса побегов и длина корней. Оптимальной концентраций ПБ для корнеобразования и увеличения массы побегов роста оказалась концентрация 50 мкг/л. Более чувствительной к действию ПБ оказалась длина междоузлий. У обоих сортов длина междоузлий уменьшалась с повышением концентрации ПБ в культуральной среде in vitro. Различие было лишь в том, что у сорта Пикассо образование междоузлий прекратилось при концентрации 0.5% NaCl, а у сор та Файзабад при 1.0% NaCl.

ПБ также оказал влияние на увеличение сырой массы микроклубней in vitro. Средняя масса 1 клубня увеличилась примерно в 2,5 раза от контроля.

Такое изменение ростовых параметров возможно связано с изменением ауксин-цитокининового баланса под действием ПБ. По данным (Murashige, Skoog, 1962), снижение ростовых процессов растений происходит в результате триазол-индуцированного ингибирования биосинтеза гиббереллина, что приводит к подавлению высоты растений посредством торможения растяжения междоузлий, что и наблюдалось в ходе проведенных нами опытов, т.е. ПБ приводил к укорачиванию междоузлий растений картофеля. Очевидно, и на уровне пробирочных растений в условиях in vitro ПБ регулирует биосинтез ростовых веществ и гормонов.

Механизмы повышения солеустойчивости, вызванное ПБ, могут быть подобны механизмам физиологических систем солеустойчивости растений. ПБ способен повысить солеустойчивость даже у солевосприимчивых генотипов картофеля, но в меньшей степени. Торможение ростовых процессов при солевом стрессе имеет генотипическую специфику, что дает возможность на уровне пробирочных растений, в условиях in vitro, более точно оценивать устойчивость генотипов к солевому стрессу и другим экстремальным факторам.

Показана роль воздействия Сахаров при засолении на активность антиокидантных ферментов у клон-гибрида №25 (солечувствительный) и сорта Файзабад (солеустойчивый). При краткосрочном засолении (60, 120 и 180 мин воздействия NaCl) наблюдалась заметное снижение содержания Сахаров у обоих генотипов, особенно у сорта Файзабад после 180 минутного воздействия NaCl.

При выращивании растений с различными концентрациями сахарозы заметно изменялся уровень активности антиоксидантных ферментов - каталазы и СОД. При чем, по мере увеличения концентрации сахарозы у сорта Файзабад увеличивалась активность каталазы, а у сорта Пикассо - активность СОД.

Однако при добавлении в культуральную среду NaCl в концентрациях от 0.5% до 1.5% наблюдались другие результаты. Активность каталазы была высокой у сорта Пикассо при контрольной среде (без NaCl) и 0.5% NaCl, чем у сорта Файзабад, но, по мере увеличения концентрации соли она понижалась у сорта Пикассо и увеличивалась у сорта Файзабад.

Активность СОД была одинакова у обоих генотипов в нормальных условиях выращивания (без NaCl) и при минимальной концентрации NaCl в среде выращивания. Но при мере увеличении концентрации NaCl в среде выращивания, активности СОД резкое снизалась у сорта Пикассо, а у сорта Файзабад наоборот увеличилась в два раза. Спустя сутки после возвращения растений в нормальные условия, у сорта Пикассо активность ферментов почти восстановилась до уровня контроля (без NaCl), а у сорта Файзабад осталась повышенной.

Таким образом, мы считаем, что низкий уровень содержания сахара у восприимчивых к солевому стрессу растений, связан, очевидно, с ингибированием и/или низкой активностью ферментов углеводного метаболизма, а устойчивость растений к стрессорным воздействиям засолению), связана с эффективной работой актиоксидантной системы защиты растений

Микроклубнеобразование у восприимчивых к солевому стрессу генотипов более зависимо от концентрации гормонов, особенно у растений, прошедших длительное культивирование in vitro. Это очень важный факт, указывающий на возможность существования особого механизма адаптации растений к изменяющимся условиям среды и на различный уровень эпигенетической регуляции активности генов, ответственных за продукционный процесс. Косвенным подтверждением этому, могут быть результаты действия гормонов у различных по устойчивости генотипов картофеля к засолению.

Полученные нами результаты показывают, что у восприимчивых генотипов содержание гормона заметно ниже у длительно культивируемых растений по сравнению с вновь введенными в культуру. У устойчивых к засолению генотипов такого явного изменение содержания гормонов при длительном культивировании, не наблюдалось, что свидетельствует о способности устойчивых генотипов продуцировать гормоны независимо от условий среды выращивания, для поддержания физиологического статуса растений, без существенного снижения продуктивности.

Обнаружен тот факт, что длительное культивирование in vitro растений приводило к снижению продуктивности как при культивировании растений в пробирке, так и в почве, в отличие от вновь оздоровленных растений-регенерантов. Поскольку этот параметр не зависел от условий выращивания, вероятно, он генетически детерминирован, что может свидетельствовать о понижении способности продуцировать цитокинины в процессе длительного культивирования. Особенно это заметно у чувствительных к солевому стрессу генотипов картофеля.

Полученные результаты показывают, что у чувствительных к засолению генотипов при длительном культивировании заметно ухудшалось корнеобразование, и пересадка растений в почву приводило к возрастанию потери массы клубней, что связано с гормональным балансом. Ауксины также играют важную роль в процессе микроклубнеобразования in vitro. Согласно данным (Evans, 1985), росто- и корнестимулирующее действие ауксинов играет существенную роль в адаптации растений в почве. Именно в этих условиях, видимо, проявляется отрицательное действие длительного культивирования на способность растений обеспечить себя ауксинами, что незамедлительно оказывает влияние на ростовые процессы и продуктивность в условиях почвы.

Понижение уровня ауксинов у длительно культивируемых in vitro растений может быть связано с невысоким уровнем цитокининов, поскольку имеются данные о том, что цитокинины влияют на продукцию ауксинов (Evans, 1985). По этим причинам, возможно, при пересадке в почву длительно культивируемых растений имеет место снижение выживаемости по сравнению с вновь введенными в культуру растениями. В этих условиях цитокинины, возможно, играют более значимую функциональную роль, в регуляции координации генетических, эпигенетических и физиологических функций у растений в соответствии с условиями обитания. Не исключено, что способность длительно культивируемых растений продуцировать цитокинин может быть одной из причин, обуславливающих их неспособность адаптироваться в условиях почвы.

Таким образом, анализ полученных результатов показали, что при длительном культивировании растений in vitro происходит снижение эпигенетической активности, регулирующей рост, развитие и стрессоляторные системы растений, незамедлительно оказывающего отрицательное влияние на выживаемость и продуктивность растений, что не наблюдается у вновь введенных в культуру меристемных и столоновых растений-регенерантов in vitro.