Исследование антиоксидантной роли пролина у галофитов и участия АФК в регуляции его биосинтеза

Бакулина, Екатерина Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование антиоксидантной роли пролина у галофитов и участия АФК в регуляции его биосинтеза
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование антиоксидантной роли пролина у галофитов и участия АФК в регуляции его биосинтеза"

00460523

БАКУЛИНА Екатерина Андреевна

На правах рукописи

гт ¿/

ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ РОЛИ ПРОЛННА У ГАЛОФИТОВ И УЧАСТИЯ АФК В РЕГУЛЯЦИИ ЕГО БИОСИНТЕЗА

03.01.05 — Физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2010

1 ^ [!ЮН 2910

004605231

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Шевякова Нина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук, доцент

Балнокин Юрий Владимирович Пилыцикова Наталия Владимировна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН

Защита состоится «08» июня 2010 г. в 1300 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (495) 977 8018, e-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «_л мая 2010 г.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Накопление в растительных клетках избыточного количества активных форм кислорода (АФК) в последнее время приобретает универсальный характер, поскольку индуцируемый ими окислительный стресс является одним из ранних повреждающих факторов стрессовых воздействий на растения (Hernandes et al., 2001). Показано, что АФК повреждают мембраны; окисляют аминокислотные остатки в белках (тирозина, триптофана, фенилаланина, метионина, цистеина), что приводит к их инактивации; повреждают ДНК и другие важнейшие компоненты клетки (Asada, 1994; Mittler, 2002). При усилении в стрессовых условиях одноэлектронного восстановления кислорода при фотосинтезе в хлоропластах и транспорта электронов при дыхании в митохондриях, прежде всего, образуется синглетный кислород ('Ог), супероксид-радикал (Ог° ), затем продукт его дисмутации - Н2О2 и, наконец, самый токсичный гидроксильный радикал (ОН°).

Известно, что обезвреживание АФК у растений в стрессовых условиях эффективно обеспечивается многоступенчатой системой защиты, в которой участвуют антиоксидантные ферменты, среди которых важнейшими являются супероксиддисмутазы (Cu/Zn-СОД, Fe-СОД, Mn-СОД). Однако при окислительном стрессе антиоксидантные ферменты могут инактивироваться АФК и для восстановления их синтеза требуется определенное время. В этом случае, на первый план выходят низкомолекулярные метаболиты-антиоксиданты (Mittler, 2002).

К низкомолекулярным соединениям с антиоксидантными свойствами, участвующими в "тушении" оксирадикалов, относят ряд нетоксичных (совместимых) метаболитов, накапливающихся в растениях при действии абиотических стрессов: сорбит, мио-инозит, пролин (Smirnoff, 1993; Alia et al., 1993), маннит (Shen et al., 1997), сахара (Синькевич и др., 2009).

растительных клетках обладает мультифункциональным действием на клеточный метаболизм, помогая растениям адаптироваться к неблагоприятным условиям, защищая от инактивации белки, ДНК, ряд ферментов и другие важнейшие клеточные компоненты (Кузнецов, Шевякова, 1999).

Одним из химических свойств пролина, входящих в современную концепцию о противодействии накоплению в клетках АФК, значительно опережающих повреждающее действие многих абиотических факторов, является его способность "тушить" синглетный кислород ('0;>) и гидроксил радикал (ОН') (Smirnoff, Cumbes, 1989; Smirnoff, 1993; Alia et al., 1997; Matysik et al., 2002). Среди совместимых метаболитов, аккумулирующихся в растениях при стрессах, только для пролина показан эффект «тушения» синглетного кислорода, образующегося в первые часы действия стрессора (Alia et al., 1997). В работе Hong (Hong et al., 2000) на основании снижения в клетках продукции малонового диальдегида (МДА) - индикатора перекисного окисления липидов, также была показала антиоксидантная роль пролина в условиях NaCl-индуцированного окислительного стресса. Экзогенный пролин, добавленный в среду культивирования растений, снижал негативный эффект окислительного стресса, индуцированного паракватом (метилвиологеном), у растений шалфея (Salvia officinalis L.) (Радюкина и др., 2008).

Вместе с тем, до сих пор отсутствуют систематические исследования проявления антиоксидантных свойств пролина и роли пролина в поддержании редокс-гомеостаза клеток при накоплении АФК у растений-галофитов, адаптированным к стрессам и аккумулирующих пролин в высоких концентрациях (вплоть до 500 мкм/г сырой массы у экстремального галофита Thellungiella halophila) (Kant et al., 2006).

В последнее время продукция АФК в растительных клетках при стрессах стала рассматриваться не только как повреждающий фактор (Apel, Hirt, 2004), но и как первичный сигнал для включения экспрессии генов, участвующих в стресс-адаптации (Foer, Noctor, 2005; Cheeseman, 2007; Radukina et al., 2010). Супероксид-радикал (02° ), перекись водорода (Н2О2), гидроксил-радикал (ОН") являются частью сложного и разветвлённого процесса передачи стресс-сигналов. Они могут инициировать не только биосинтез ферментов-антиоксидантов, но и индукцию синтеза пролина через МАПК-сигнальный каскад подобно абсцизовой кислоте (Chinnusamy, Zhu, 2003). Однако,

регуляция экспрессии генов биосинтеза и деградации пролила (Р5С31 и РйН) в связи с проявлением пролином антиоксидантной роли практически не изучалась.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы: сравнительное исследование роли пролина как возможной "ловушки" АФК и участия АФК в регуляции биосинтеза и деградации пролина. В качестве модельных объектов использовали растения-галофиты МеветЬгуаЫИетит сгуякзШпит Ь. и ТУгеИипреИа Ьа1орЫ1а Меу.

Задачи исследования:

1. Исследовать взаимосвязь между конститутивным и стресс-индуцированным уровнем пролина и состоянием окислительного стресса у двух возрастных групп факультативного галофита М. сгузЫИпит. В качестве параметров развития окислительного стресса использовать изменение активности СОД, гваяколовой ПО, каталазы, интенсивности ПОЛ, содержания АФК (02'~ и Н202).

2. Исследовать проявление антиоксидантных свойств пролина по ряду косвенных критериев: активности СОД, содержанию Ог , хлорофилла, МДА и др., ответной реакции растений М. сгуМаШпит на обработку паракватом (Р(2), экзогенным пролином и совместным действием Р(2 и экзогенного пролина.

3. Получить каллусную культуру клеток из листьев экстремального галофита ТИ. Ъа1орЫ1а, чтобы исключить регуляцию накопления пролина и его межорганный транспорт на уровне целого растения и исследовать характер аккумуляции пролина и проявление его антиоксидантных свойстав на клеточном уровне.

4. Провести сравнительный анализ конститутивного и ЫаС1-индуцированного уровня пролина, а также проявления пролином антиоксидантных свойств на организменном и клеточном уровне у Тк Иа1орЫа

5. Исследовать антиоксидантную роль пролина у нативных растений и клеточной линии Тк У\а1орЫ1а в условиях моделирования Р(2-усиленного образования 02° и Н2О2.

6. Исследовать влияние Р<3 на экспрессию ключевых генов биосинтеза (РЗСЯ!) и деградации пролина (РИН) в каллусной культуре и у растений ТЬ. ШорЫ1а, произраставших в контрольных условиях и предварительно адаптированных к засолению.

Научная новизна. Впервые изучали возможность проявления пролином антиоксидантных свойств у двух галофитов МезетЬгуаМкетит сгу$1а11тит Ь. и ТЪеЦип^еЦа ШорЫ1а Меу., подвергавшихся действию засоления, про-оксиданта

параквата (Р(2) и их совместному действию. Для выявления антиоксидантных свойств пролина использовали ряд специфических критериев: активность СОД, ПО, содержание АФК, интенсивность ПОЛ и др.

Впервые показан антиоксидантный эффект экзогенного пролина у растений М. сгу$1аШпит с низким конститутивным и №С1-индуцированным уровнем эндогенного пролина, который состоял в снижении активности СОД, ПО, интенсивности ПОЛ и повышении содержания хлорофиллов (а+Ь), что могло свидетельствовать о "тушении" экзогенным пролином, прежде всего, супероксидного радикала (02°). Экзогенный пролин подавлял Р(3-индуцируемую стимуляцию активности СОД и снижал содержание супероксид-радикала в листьях. Установлено, что у растений с пониженным уровнем накопления пролина преимущественную роль в защите от окислительного стресса выполняла СОД, на что указывал высокий уровень как конститутивной, так и индуцируемой засолением и Р<2 активности фермента и содержания Н2О2 в листьях. Впервые получена каллусная культура из листьев Тк ШоркИа, которая отличалась от нативного растения более низкой солеустойчивостью и №С1-зависимой аккумуляцией пролина, но превосходила более высокой активностью СОД и ПО.

Впервые показано, что в ответ на увеличение в листьях Тк Иа!орЫ!а №С1-индуцированного пула пролина в них в 5 и более раз падала активность СОД, что косвенно указывало на способность эндогенного пролина вступать в реакцию с Ог° . Показано также, что при обработке Р(2 листьев нативного растения и каллусов Тк ЫорИНа, культивируемых в контрольных условиях или в присутствии №С1 (100 и 200 мМ) эндогенный пролин выступал как "тушитель" супероксид-радикала (Ог"-) и гидроксил-радикала (ОН"). Использование пролина на "тушение" АФК восполнялось последующей активацией экспрессии мРНК ключевого гена биосинтеза пролина (Р5С57), а соответствующее повышение экспрессии мРНК РОН могло быть связано с поддержанием в этих условиях пула глутамата.

Практическая значимость работы. Каллусная культура, полученная из листьев экстремального галофита Тк ШорЫ1а, может использоваться для получения суспензионной культуры и изучения молекулярных механизмов адаптации к засолению. Выявленные в процессе выполнения работы критерии, косвенно свидетельствующие об антиоксидантной роли пролина, могут использоваться в экспериментальных

исследованиях и при прочтении курса лекций по механизмам адаптации растений к абиотическим стрессам.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 11 международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» г. Пущино, (2007 г); годичном собрании общества физиологов растений России, Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», г. Екатеринбург (2008 г); годичном собрании общества физиологов растений России, Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего Севера», г. Апатиты, Мурманская область (2009 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из которых 1 - статья в журнале «Физиология растений». Одна работа подготовлена для печати.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и содержат 3 таблицы, 8 формул и 32 рисунка. Список цитируемой литературы включает 170 наименований, в т.ч. 151 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе в качестве объектов исследования использовали два галофита: МезетЬгуашИетит сг131а11тит Ь. (хрустальная травка) и Тке11ип&е11а Иа1орЫ1а Меу.

М. с^аШпиш - факультативный галофит, относящийся к семейству Ляоасеае. В основе выживания хрустальной травки лежит формирование адаптивпых систем водосберегающего типа, сопровождающихся аккумуляцией различных совместимых метаболитов, в т.ч. пролина и переключение СЗ-типа фотосинтеза на САМ тип. Усиление окислительного стресса у галофита хрустальной травки в условиях засоления описано как в течение СЗ-типа фотосинтеза, так и при переходе на САМ-тип (М15га15к1 й а1.1998; Нш^ е1 а1. 2004), что также определило выбор этого объекта для наших исследований. Более того, у хрустальной травки описаны резкие флуктуации в накоплении пролина при действии ЫаС1 (Кузнецов, Шевякова, 1999; Холодова и др. 2000,2005; Волков, 2006).

Семена хрустальной травки из коллекции лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации ИФР РАН проращивали на влажном перлите, а затем выращивали в условиях водной культуры в камере фитотрона в следующих условиях: 14-часовой фотопериод с искусственным освещением натриевыми лампами высокого давления Reflux Н220, мощностью 220 Вт (по две лампы на 1,5 м2). Уровень освещенности составлял 350 ± 50 мкмоль/м2*сек. Температура и влажность днем и ночью составляли 24°С/16°С и 55%/70% относительной влажности воздуха, соответственно.

Th. halophila - экстремальный галофит семейства Капустные (Brasscicaceaej, в последнее время активно используется как новая модель в физиологических и молекулярных исследованиях (Bressan et al., 2001; Zhu 2001, Amtmann, 2009). Большое внимание привлекает то, что стресс-индуцированная акумуляция пролина у этого вида может достигать более чем 300 мкмоль/г свежей массы (Kant, 2006). Преимущество Th. halophila перед M. cristallinum состоит в том, что этот галофит является близким родственником арабидопсиса, у которого функциональные гены биосинтеза и деградации пролина клонированы (Taji et al., 2004; Kant et al., 2006).

Использовались семена из коллекции Лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации ИФР, которые ранее были получены из Университета Глазго, Великобритания. Проращивание семян проводили в перлите в течение 2-х недель после предварительной стратификации. В условиях водной культуры растения выращивали в камере фитотрона при 12-часовом световом периоде и мощности освещения 37,6 Вт/м2 люминесцентных ламп Philips (F36W/54). Температура воздуха - 23±1°С/15±ГС, относительная влажность воздуха - 55/70% день/ночь.

Каллусы Th. halophila получали из листьев растения в фазе розетки в асептических условиях на среде Мурасиге-Скуга с добавлением общепринятых гормонов (бензиламинопурин (БАП) 0,2 мг/л и нафтилуксусной кислоты (НУК) 0,8 мг/л.). Каллусы культивировали в условиях фитотрона при 16-часовом освещении люминесцентными лампами белого света (освещенность 4 клк). Температура воздуха -22±1°С. Раз в месяц каллусы пассировались на свежую питательную среду.

В опытах с хрустальной травкой использовали 2 группы растенй: молодые (3-4 нед) и взрослые (7-8 нед). Растения подвергали засолению, обработке паракватом (PQ) по следующей схеме: контроль (без NaCl и PQ), PQ (листья обрабатывали 1 мл раствора,

содержащего 100 мкмоль параквата в 0.05% Твин-80), засоление питательной среды (100 мМ NaCl), паракват + NaCl (100 мкмоль PQ на листья +100 мМ NaCl в среде), паракват + экзогенный пролин (100 мкмоль PQ на листья +5 мМ пролина в среде), NaCl + пролин (100 мМ NaCl и 5 мМ пролина в среде). Во всех опытах с засолением до проведения обработки PQ растения в течение 3 дней произрастали на среде с NaCl. Сразу после завершения всех вариантов обработки листьев PQ сосуды с растениями переносили в темноту на 20 ч для более полного поступления параквата в листья, а затем - на свет (4 ч) для инициации образования супероксид-радикала.

Для опытов с Th. halophila использовали растения в возрасте 8 недель. Засоление среды (100 и 200 мМ NaCl) и обработку листьев паракватом (PQ, 100 мкмоль) проводили по той же схеме, что и для хрустальной травки, за исключением вариантов с обработкой экзогенным пролином.

В опытах с каллусной культурой использовалась та же схема засоления (от 25 до 300 мМ NaCl, 3 сут) и обработки PQ, что и для целых растений Th. halophila.

Образцы листьев M. cristallinum, Th. halophila и каллусов в различных вариантах опыта отбирали после 2-24 ч экспозиции растений на свету и фиксировали жидким азотом. Замороженный материал листьев хранили при - 70°С до проведения биохимических анализов.

Проведение биохимических анализов. Содержание пролина определяли по методу Бейтса с соавт. (Bates et al., 1973). Определение содержания перекиси водорода проводилось по Brennan и Frenkel (1977), супероксид-радикала - по Beckett et al. (2003). Определение активности каталазы проводилось по методу Maehly и Chance (1954), активности общей супероксиддисмутазы (СОД) - по Beauchamp и Fridovich (1971),. активности гваяколовой пероксидазы (ПО) проводили по методу, предложенному Ridge и Osbome.(1971). Концентрацию белка в ферментных препаратах измеряли по методу Esen (1978). Экстракцию свободных аминокислот из растительного материала и определение их содержания проводили на аминокислотном анализаторе согласно прописи Калининой и др. (1990). Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по методу Heath и Packer (1968). Определение доли мертвых клеток в каллусах проводили с использованием нитросииего тетразолия по методу Tanou et al. (2008).

Проведение молекулярных анализов. Общую РНК выделяли из растительного материала с использованием RNAeasy Plant Mini Kit («Qiagen», Германия) согласно протоколу производителя. Для синтеза кДНК методом обратной транскрипции использовали 200 ед. M-MuLV обратной транскриптазы («Fermentas», Латвия) согласно протоколу производителя.

Ранее в лаборатории были скопстрированы специфические праймеры с использованием кДНК последовательностей соотвествующих генов A. thaliana базы данных Национального Центра биотехнологической информации США, Национальной медицинской библиотеки (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) в среде Vector NTI 9.0.0, InforMax. Проверка продуктов ПНР на соответствие количеству пар оснований амплифицируемого участка последовательности гена проводили при помощи агарозного гель-электрофореза. В качестве внутреннего контроля уровня транскриптов генов использовали экспрессию гена ЛСТ2. Секвенирование кДНК последовательностей было проведено в ЦКП «Геном» института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта. Анализ секвенированных последовательностей ПЦР продуктов показал высокий процент сходства (более 65%) с предполагаемыми последовательностями генов синтеза и деградации пролина.

Результаты получены в трех биологических и трех аналитических повторностях. Обработку данных проводили общепринятыми методами математической статистики. Бары на рисунках обозначают стандартные отклонения от среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование антиоксидантной роли пролина у молодых растений М. crvstallinum. В листьях молодых растений хрустальной травки, произраставших в контрольных условиях (без засоления) и обработанных паракватом (PQ), резко повышалась активность СОД (рис. 1а) и содержание Н202 (рис. 16), что свидетельствовало об усилении всего каскада свободнорадикальных реакций. При этом активность каталазы понижалась, что не препятствовало накоплению перекиси водорода (рис. 16). При совместном действии PQ и NaCl (100 мМ) активация СОД была менее значима, но резко возрастала активность каталазы (рис. 1а, в). В ответ на активацию PQ окислительных реакций в листьях почти в 5 раз возрастало содержание свободного пролина (рис. 1г). Наиболее высокое накопление пролина найдено у растений, произраставших в условиях засоления. Тенденцию к снижению накопления пролина при

совместном действии Р<3 и ЫаС1 можно объяснить использованием его для "тушения" АФК (рис. 1г). Внесение экзогенного пролина (5 мМ) в питательную среду препятствовало снижению хлорофилла в листьях, вызванное обработкой Р(2 (рис. 2а). В этих же условиях образование МДА как индикатора окислительного повреждения мембран, показало лишь тенденцию к снижению (рис. 26).

d . боо с * U £

i t 400

° Е

X ^ m ~ х £

200

(а)

m га 1

(6)

Контроль РО

14 12 10 8 6 4 2 О

(в)

NaChPQ

л 16

2 2

S "5 S i 8

* * 4

0 5 n

5 т

-Ь

Контроль PQ

NaCI NaCH-PQ

* 1 С- с

(г)

ГЙ

PQ NaCI NaCH-PQ

действие на активность

Контроль PQ NaCI NaCi+PQ Контроль

Рис. 1. Влияние параквата (PQ), NaCI и их совместное антиоксидантных ферметов, содержание Н2О2 в листьях молодых растений хрустальной травки.

2S 1

(6)

ёп

Рис. 2. Влияние параквата (PQ), NaCI, экзогенного пролина (Pro) и их совместное действие на содержание хлорофилла (а+б) и МДА в листьях молодых растений хрустальной травки.

Таким образом, у молодых растений (рис. 1г) как конститутивный, так и NaCl-индуцируемый уровень пролина в листьях был достаточно высоким для проявления им антиоксидантных свойств. По этой причине повышение эндогенного уровня внесением

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Шевякова Нина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук, доцент

Балнокин Юрий Владимирович Пилыцикова Наталия Владимировна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН

Факс: (495) 977 8018, e-mail: ifi-@ippras.ru

Автореферат разослан «_л мая 2010 г.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Накопление в растительных клетках избыточного количества активных форм кислорода (АФК) в последнее время приобретает универсальный характер, поскольку индуцируемый ими окислительный стресс является одним из ранних повреждающих факторов стрессовых воздействий на растения (Hemandes et al., 2001). Показано, что АФК повреждают мембраны; окисляют аминокислотные остатки в белках (тирозина, триптофана, фенилаланина, метионина, цистеина), что приводит к их инактивации; повреждают ДНК и другие важнейшие компоненты клетки (Asada, 1994; Mittler, 2002). При усилении в стрессовых условиях одноэлектронного восстановления кислорода при фотосинтезе в хлоропластах и транспорта электронов при дыхании в митохондриях, прежде всего, образуется синглетный кислород ('02), супероксид-радикал (Ог° ), затем продукт его дисмутации - Н7О1 и, наконец, самый токсичный гидроксильный радикал (ОН°).

Известно, что обезвреживание АФК у растений в стрессовых условиях эффективно обеспечивается многоступенчатой системой защиты, в которой участвуют антиоксидантные ферменты, среди которых важнейшими являются супероксиддисмутазы (Cu/Zn-СОД, Fe-СОД, Мп-СОД). Однако при окислительном стрессе антиоксидантные ферменты могут инактивироваться АФК и для восстановления их синтеза требуется определенное время. В этом случае, на первый план выходят низкомолекулярные метаболиты-антиоксиданты (Mittler, 2002).

функционирование СОД как первой линии защиты от окислительного стресса не играло существенной роли, поскольку эндогенный пролин мог выступать как "тушитель" образующихся в результате действия стрессорных факторов АФК. Обратно коррелятивная связь между активностью СОД и эндогенным уровнем пролина ранее отмечалась в исследованиях с другими представителями галофитов (Радюкина и др. 2008).

Исследование антиоксидантной роли пролина у галофита Th. halophila. Для того чтобы выяснить, выполняет ли пролин антиоксидантную функцию у галофита с высокой не только устойчивостью, но и аккумуляцией пролина (Th. halophila) проводили сравнительный анализ действия NaCl и параквата на состояние окислительного стресса, степень аккумуляции пролина у целых растений и каллусной культуры, у которой исключалось влияние организменных систем регуляции, прежде всего межорганного транспорта пролина.

Сравнительный анализ действия NaCl на содержание пролина и состояние окислительного стресса у растений и каллусной ткани. Для этой цели была получена каллусная культура из листьев галофита, которая была охарактеризована по уровню солеустойчивости, аккумуляции пролина и функционированию антиоксидантных ферментов. Сравнительный анализ проводили у нативных растений (листья в фазе розетки) и каллусах, культивированных в течение 2-х нед в присутствии различных концентраций NaCl (25-300 мМ).

Содержание пролина в листьях Th. halophila постепенно возрастало с увеличением уровня засоления (рис. 6), а в присутствии 100 мМ NaCl превышало уровень пролина, который наблюдался в аналогичных условиях в листьях хрустальной травки. Причем конститутивный уровень пролина в листьях этого галофита изначально был намного выше, чем у М. crystallinum. Корни Th. halophila практически не изменяли содержание пролина в условиях засоления вплоть до 150 мМ NaCl (рис. 6).

В каллусах накопление пролина в клетках, начиналось уже при концентрации в среде культивирования 25 мМ соли (рис. 7). В целом каллусы накапливали в клетках пролин в 5 раз меньше, чем листья. Жизнеспособность каллусов, о которой судили по числу мертвых клеток (рис. 8), значительно уступала жизнеспособности нативных растений в условиях засоления.

«3«

* 2 О 5 О. >5

С О ®

5 X 5 X о Л и

£ "2 « ^

И Л

и 1"»

□ Лист 0 Корень

гЗЬ

25 50 100 МаС1, тМ

О 25 50 100 150 200 МаС|, тМ

а « . с о ' • Е-

* л 1 о. С

11 о | о

В.

50 100 150 N301, тМ

Рис. 6. Изменение содержания пролина в растениях Тк ШорИНа. под действием №С1.

Рис. 7. Изменение содержания пролина в каллусной культутре в ответ на действие №С1.

Рис. 8. Изменение содержания мертвых клеток в каллусах под действием засоления.

Таким образом, каллусная культура по сравнению с целым растением Тк ШорЫ1а, была менее жизнеспособна в условиях засоления и накапливала пролин в меньшем количестве, что соответствует ряду исследований по сравнению солеустойчивости растений на уровне целого организма и клеточном (Шевякова и др., 1998). В связи с этим представляло интерес исследовать: насколько клетки каллуса способны защищаться от окислительного стресса и сравнить их с целым растением. Как следует из изменений в активности СОД в листьях конститутивная активность этого фермента была почти в 2 раза ниже, чем в каллусной ткани (рис. 9а, 10а).

Рис. 9. Влияние засоления на активность СОД и каталазы в листьях и корнях нативных растений

С увеличением дозы засоления вплоть до 200 мМ ЫаС1 общая активность СОД в листьях и в корнях была понижена, а активность каталазы в них практически не изменялась (рис. 9а, б). В каллусной ткани, напротив, резкий подъем активности СОД начинался уже при минимальной концентрации соли (25 мМ), превышая контрольный уровень в 3,5 раза (рис. 10). На основании полученных данных заключили, что в каллусах ответная реакция клеток на засоление и сопровождающий его окислительный стресс была во много раз более ярко выражена, чем на организменном уровне. Более того, если в листьях и, особенно, в корнях преимущество в нейтрализации Н2О2 принадлежало каталазе, то в клетках каллуса основную роль играла гваяколовая пероксидаза.

Ш О I I з ■

а 01 г

25 50 100 150 200 МаС|, тМ

Рис. 10. Влияние засоления на активность антиоксидантных ферментов в каллусах в ответ на засоление.

0 25 50 100 150 200 №С1, тМ

Это может указывать на то, что в клетках каллусов главной мишенью действия АФК служили пластиды, что могло быть связано с низким содержанием в них хлорофилла и низкой активностью фотосинтеза по сравнению с целым растением. В целом, изменение биохимических показателей в каллусной культуре при действии солевого стресса (пролин, СОД, каталаза, пероксидаза), в большей степени отражало характер ответной реакции, найденный у растений хрустальной травки с пониженной способностью аккумулировать пролин.

Влияние обработки листьев и каллусов паракватом на содержание пролина и активность антиоксидантных Ферментов. Растения и каллусы сразу после обработки паракватом помещали в темноту, а затем переносили на свет для генерации супероксид-радикала. Через 2, 4, 8 и 24 ч облучения светом проводили биохимические анализы. В качестве контроля использовали образцы листьев и каллусов перед обработкой

паракватом. Содержание пролина в листьях понизилось по сравнению с контролем в первые 2 ч действия света, что могло происходить в результате использования части его клеточного пула как "ловушки" образующихся АФК (рис. 10а). О том, что в клетках паракват генерировал АФК указывало повышение активности СОД (рис. 106), свободной пероксидазы (рис. 116) и усиление повреждения мембран (ПОЛ) (рис. 11а).

Следует отметить, что при высоком конститутивном пуле пролина в листьях общая конститутивная активность СОД была относительно низкой (150 усл. ед./г. сырой массы). Это можно объяснить обратно коррелятивной связью между этими параметрами (Радюкина 2008), когда низкая активность СОД поддерживается в клетках из-за функционирования пролина как "тушителя" АФК, постоянно образующихся в растениях. Поэтому можно допускать, что внезапное повышение АФК при обработке растений PQ увеличивало как долю использования пролина для их нейтрализации, так и активность СОД как первой линии защиты от их накопления.

Следует обратить внимание на то, что в корнях после облучения светом листьев содержание пролина повысилось, что могло произойти вследствие оттока пролина из листьев в результате повреждения их мембран. При этом в корнях также произошло повышение активности пероксидазы, что указывает на возможное поступление в корни Н2Ог, образовавшейся как продукта дисмутации супероксид-радикала. В то же время появление "экзогенного" для корней пероксида не вызвало в них повышения активности каталазы (данные не представлены), что могло свидетельствовать о перехвате пероксида пероксидазой.

В аналогичных условиях обработки паракватом каллусной ткани (рис. 12) отмечалось резкое повышение содержания пролина через 2 ч генерации супероксид-радикала, затем падения через 4 ч и вновь подъем в 8 и 24 ч. Такой характер изменения

о.

о S ¡с X х 3 С

о а. с

Рис.

□ Лист Ш Корень

□ Лист

□ Корень

10. Измение содержания пролина и активности СОД в ответ на обработку PQ.

Рис. И. Измение содержания ПОЛ и активности свободной пероксидазы в листьях и корнях в ответ на обработку РС}.

л _

с л о о

лз_

1а)

Рис.12. Изменение содержания пролина в каллусной культуре в ответ на обработку Р(}.

(б)

Й 3500

=» г

й С 2000

£ : 5 =

о г

2 « I г

(в)

Рис. 13. Изменение содержания МДА, активности СОД и свободной пероксидазы в каллусной культуре в ответ на обработку Р<3.

ч?

содержания пролина сопровождала более выраженная реакция СОД и свободной пероксидазы (рис.136, в) и менее выраженное повреждение мембран (рисЛЗа).

Имея в виду более низкий конститутивный уровень пролина в каллусах по сравнению с листьями можно допускать, что имеющегося клеточного пула иминокислоты не хватало для полной нейтрализации АФК и этот дефицит восполнялся повышением его биосинтеза или снижением деградации. В нормальных условиях роста

клеток, образующиеся АФК, нейтрализовались гораздо более высоким конститутивным уровнем активности СОД (в 10 раз выше, чем в листьях) (рис. 10а и рис. 12в).

На основании сравнительного анализа ответных реакций листьев, корней и каллусов на искусственно созданный окислительный стресс при генерации PQ на свету

—а

С>2 , Н202 и, возможно, ОН", можно заключить, что найденные изменения в их метаболизме формировались с участием антиоксидантного действия пролина и антиоксидантных ферментов. В листьях 77г. halophila основную роль в защите от окислительного стресса играл высокий эндогенный уровень пролина, который, прежде всего, был способен "потушить" образующиеся при солевом стрессе АФК, что не требовало развития высокой активности антиоксидантных ферментов. В то же время, в полученной из листьев каллусной культуры для выполнения пролином защитной функции от резко повышенного образования АФК, о чем говорит высокая активность исследованных нами антиоксидантных ферментов (СОД, пероксидаза), имеющегося в клетках пула свободного пролина в условиях засоления, могло быть недостаточно для эффективного "тушения" токсичных форм кислорода. Более того, как показано в исследованиях (Smirnoff, Cumbes, 1989; Shen et al., 1997) при освещении хлсропластов наряду с образованием '02, 02" и Н2О2 в них постоянно присутствует гидроксил-радикал (ОН0), образуемый в реакции Haber-Weis или Fenton в присутствии транзитных металлов (Fe+2 и Cu+2) (Halliweell a Gutteridge 1980). Удаление ОН0 также необходимо для поддержания функциональной активности хлоропластов. В отличие от 0¿ и Н2О2 ферменты, нейтрализующие ОН° до сих пор не найдены. Начиная с работ, проведенных Смирновым и Камбес (Smirnoff, Cumbes, 1989), считается, что пролин, присутствующий в пластидах, является "скавенджером" этой самой токсичной формы АФК. По этой причине мы посчитали необходимым хотя бы косвенно проследить такую возможность у каллусной ткани, обработанной паракватом.

Возможное участие стресс-индуцированного пролина в каллусах в "тушении" гидроксил-радикала. Для доказательства такой роли пролина мы воспользовались для идентификации реакцией подавления пролином образования тирозина из фенилаланина в присутствии гидроксил-радикала, что ранее было показано на примере маннита (Kaur, Halliwell, 1994; Shen et al., 1997) (рис. 14).

Опыты по доказательству "тушения" пролином ОН° по реакции образования тирозина из фенилаланина мы проводили на примере каллусной культуры, которую

Рис. 14. Предлагаемая схема «тушения» гидроксил-радиикала пролином.

обрабатывали РС>. Для усиления роли пролина как возможного "скавенджера" образуемого в этой системе гидроксил-радикала, каллусную ткань предварительно (3 дн) культивировали в присутствии 100 мкМ ЫаС1 для стресс-индуцированного накопления пролина. Содержание пролина в каллусах в присутствии ЫаС1 возросло по сравнению с контролем в 3 раза, а при совместном действии засоления и параквата в 5 раз (рис. 15). При этом содержание в клетках предшественника пролина глутамата, резко упало, то есть увеличение содержания пролина происходило путем повышения его биосинтеза.

и Рго а в1и!

г «1 *

* . 1

|21

0 р о.оз

г § I

5 е- 0.02

1 § !

I * 0.01 4

Г. Реп С Туг / ^

о +-

I 100 мМ 100 мМ с ЫаС1 №С1+Р0

Рис. 15. Влияние обработки каллусов паракватом на повышение биосинтеза пролина из глутамата.

100 мМ ЫаС!

100 мМ №С1+РС!

Рис. 16. Торможение пролином реакции гидроксилирования фенилаланина при образовании тирозина в каллусах, предварительно культивировавшихмся в присутствии №С1 и обработанных Рр. Как следует из сравнения полученных данных (рис. 15 и 16) при усилении в

клетках биосинтеза пролина и его действия как "скавенджера" ОН°, образование

тирозина из фенилаланина имело тенденцию к торможению. Таком образом, можно

предполагать, что пролин служил "ловушкой" гидроксил-радикала.

Влияние ГО на биосинтез и деградацию пролина в листьях и каллусной культуре

П. Ьа1оуЫ1а. Для выяснения возможного действия Р<3 на экспрессию мРНК ключевых

генов биосинтеза (P5CSI) и деградации (PDH) пролина в связи с использованием пролина на "тушение" образующихся АФК.

Влияние PQ на биосинтез и деградацию пролина исследовали у нативных растений и каллусной линии, предварительно культивированных в условиях засоления (100 или 200 мМ NaCl) в течение 7 дн. Мы полагали, что у растений, адаптированных к засолению и уже имеющих повышенный пул пролина, ожидаемые ск novo изменения в содержании пролина и уровне транскриптов генов его биосинтеза и деградации могут быть инициированы исключительно действием АФК, образованных на свету в присутствии PQ.

У контрольных растений, произраставших в течение 7 дн на контрольной среде (без NaCl), в начале генерирования паракватом АФК в световых условиях (4 ч) конститутивный уровень пролина в листьях резко снижался, что могло указывать на расходование пролина для их "тушения" (рис. 17). Последующее восстановление содержания пролина могло бьггь результатом активации его биосинтеза, индуцированного продолжающимся нарастанием интенсивности окислительного стресса. Было показано, что восстановление содержания пролина в листьях действительно происходило путем активации экспрессии гена P5CSI и отсутствия существенных изменений в транскриптах гена деградации пролина (PDH). - юоо

л о

■е-

о о.

с <

О 2 4 6 » 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 В 10 12 14 К 18 20 22 24

®150 Р0Н Рис. 17. Действие обработки

параркватом листьев Гк ШоркИа, произраставших в отсутствии засоления, на экспрессию мРНК генов биосинтеза (Р5С81) и деградации (РйН) и на динамику пролина (ч).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 1« 20 22 24

В то же время у растений, предварительно адаптированных к засолению, аккумуляция пролина в листьях на фоне окислительного стресса, генерируемого РО, уже через 2 ч после темнового периода совпадала с транзиторной активацией в этих

условиях экспрессии мРНК гена биосинтеза (Р5С$1) (рис. 20). Следующий транскрипционный максимум в биосинтезе пролина проявился через 8 ч действия стресса, когда содержание пролина резко упало предположительно из-за его расхода на "тушение" АФК (рис. 22). Этот вывод подтверждался ходом изменения в этих условиях активности СОД, обезвреживающего супероксид, и находящейся в обратном отношении с динамикой аккумуляции пролина, что свидетельствовало об участии пролина в "тушении" супероксида (рис. 18). При этом уровень транскрипта гена РЭН резко повышался через 2 и 4 ч действия стресса, а затем постепенно снижался к концу экспозиции растений (8-12 ч) в присутствии параквата (рис. 18). Р5С51

с 2000

t 8 S

£ V т

о- 5. 1ооо с

! 800 ]

i* \

-В- J n 400 ■! о s '

С о.

г V %

Экспозиция, ч

.¿г

•V Ь % О-

Экспозиция, ч

PDH

—«— 200 мМ NaCI 100 мМ NaCI

о 4-

Рис. 18. Действие обработки РС! листьев ТЪ. ка!оркИа,

произроставших в течение 7 дней в присутствии 100 или 200 мМ ЫаС1, на содержание пролина, экспрессию мРНК генов биосинтеза (/\5CS7) деградации (Рй!Г).

Ч?

Экспозиция, ч

Мы полагали, что у растений, адаптированных к засолению и уже имеющих повышенный пул пролина, ожидаемые de novo изменения в содержании пролина и уровне транскриптов генов его метаболизма могли быть инициированы исключительно действием АФК, образованных на свету в присутствии параквата.

По той же схеме были проведены опыты с каллусной тканью. В клетках, адаптированных к меньшей концентрации NaCI (100 мМ) действие параквата вызвало менее выраженные изменения, как в накоплении продукта, так и активации генов его биосинтеза и деградации (рис. 19). При этом катаболизм пролина, регулируемый на транскрипционном уровне, активировался подобно его биосинтезу.

На основании проведенного анализа литературы и собственных исследований мы

предположили, что сигналом к стресс-индуцируемому усилению биосинтеза пролина может быть образование АФК как в условиях засоления, так и непосредственно в условиях окислительного стресса, вызываемого PQ. Мы исходили из того, что накопление в растениях АФК, одно из ранних проявлений повреждающего действия абиотических стрессоров. Действие PQ индуцировало свободно-радикальные реакции с участием кислорода, и одновременно с образованием супероксид-радикала в клетке мог образовываться синглетный кислород, супероксид-радикал (Foyer, Noctor, 2005), а также перекись водорода, которая в отличие от перечисленных выше АФК, способна к передвижению (Cheesman, 2007). Возможно также, что возникновение АФК опережает по времени появление других сигнальных соединений - АБК и салициловой кислоты, которые синтезируются de novo или освобождаются из коньюгированных форм в условиях стресса (Urano et al., 2004, Холодова и др. 2006; Шевякова и др., 2009).

PSCS1

* 2500

¡¡ 2Q00

§■ а1500

й «1000 л

С 500

— 100 MM NaCIi

— 200мМ NaCI

600 500 400 ! 300

200 100 О

Рис. 19. Действие обработки РС> каллусов, произроставших в течение 7 дней в присутствии 100 или 200 мМ №С1, на содержание пролина (а), экспрессии гена биосинтеза (Р5СБ1) (б), гена деградации (ТО//) (в).

Таким образом, полученные результаты позволяют предполагать, что в сигнальном каскаде, приводящему к дифференциальной экспрессии генов биосинтеза пролина в листьях и каллусной культуре клеток у галофита Тк Иа1орЫ1а участвуют АФК, и в частности, пероксид водорода, как наиболее подвижное соединение. Стресс-индуцируемое повышение уровней мРНК наблюдалось, прежде всего, для ключевых генов биосинтеза /\5CS7 и катаболизма РОИ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема образования в растительных клетках избыточного количества активных форм кислорода (АФК) и, в первую очередь, синглетного кислорода ('02) и супероксид-радикалов (О2 ) в последнее время приобретает универсальный характер. Считается, что первой линией защиты от накопления супероксид радикала в растительных клетках является активация супероксиддисмутаз (СОД). Однако, у некоторых видов растений, в частности у галофита Thelhmgiella halophila, был найден низкий конститутивный уровень этого фермента и отсутствие стресс-индуцируемого повышения его активности (Радюкина и др., 2007). В то же время у этого растения в листьях был высокий конститутивный уровень пролина и его необычно интенсивная аккумуляция (выше 300 мкмоль/г сырой массы) в ответ на солевой стресс (600-700 мМ NaCl) (Inan et al., 2004; Kant et al., 2006; Радюкина и др., 2007, 2008). В связи с этим мы предположили, что необычно высокий конститутивный уровень пролина и его NaCl-зависимая аккумуляция могут быть связаны с проявлением пролином антиоксидантной активности. Для проверки этой гипотезы мы провели сравнительный анализ характера изменения различных параметров окислительного стресса у двух модельных объектов факультативного галофита Mesembryanthemum crystallmum L., экстремального галофита Thellungiella halophila Меу и полученного из листьев этого растения каллусной культуры. Для решения поставленных задач использовали различные косвенные критерии проявления пролином антиоксидантной активности: ответную реакцию антиоксидантных ферментов (СОД, ПО, каталазы), интенсивности ПОЛ, образование О2 , Н2О2 на обработку растений экзогенным пролином и моделирование повышенного образования АФК при действии про-оксиданта параквата (PQ).

В проведенных исследованиях было установлено, что у растений и каллусной культуры с пониженной продукцией пролина основную защитную роль в условиях накопления АФК выполняли антиоксидантные ферменты (СОД, ПО, каталаза), а антиоксидантная роль пролина проявлялась у пролин-аккумулирующих растений, что было показано на примере обработки растений экзогенным пролином и PQ, индуцирующим усиление окислительного стресса. При совместном действии экзогенного пролина и PQ активность СОД падала, снижалась продукция О2 что свидетелствоало о "тушении" экзогенным пролином 02 и восстановление нормального содержания в листьях хлорофилла и низкой интенсивности ПОЛ. При инициации супероксидного стресса PQ на свету контрольных листьев и листьев, испытывающих

действие солевого фактора, было найдено статистически значимое снижение содержания в них эндогенного пролина в первые 2 ч действия света, что указывало на использование пролина для нейтрализации образовавшихся АФК. При этом использование пролина для "тушения" АФК в последующие часы действия света восполнялось повышением экспрессии мРНК ключевого гена биосинтеза пролина (P5CSI) и деградации (PDH). Усиление распада пролина в митохондриях также рассматривается как необходимость повышения в клетках пула глутамата-предшественника пролина, который в стрессорных условиях мог тратиться также для других метаболических процессов.

Совокупность полученных данных свидетельствует, что "суперпродукция" пролина у галофитов в условиях засоления наряду с проявлением пролином других защитных функций направлена на ликвидацию повышенного образования АФК и, в частности, "тушение" синглетного, супероксидного и гидроксильного радикалов.

ВЫВОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ изменения различных параметров окислительного стресса у растешш-галофитов (Mesembryanthemum crystallinum L. и Thellungiella halophila Mey), аккумулирующих пролин в условиях засоления, косвенно свидетельствующий о проявлении пролином антиоксидантных свойств.

2. Установлено, что обработка про-оксидантом паракватом (PQ) взрослых растений М. crystallinum с низким уровнем NaCl-зависимого накопления пролина резко повышала в листьях активность СОД, которая служила основной линией защиты от окислительного стресса у этой группы растений.

3. При совместном действии экзогенного пролина и PQ на растения с низким содержанием пролина активность СОД резко падала, что сопровождалось снижением в листьях содержания супероксид-радикала, повышением содержания хлорофилла и снижением интенсивности ПОЛ, т.е. экзогенный пролин выполнял роль "тушителя" сцупероксидного радикала (Ог ).

4. У молодых растений М crystallinum с повышенным уровнем NaCl-зэвисимой аккумуляции пролина активность СОД при усилении окислительного стресса обработкой листьев PQ практически не изменялась, что косвенно свидетельствовало о "тушении" эндогенным пролином образующихся de novo АФК.

5. Впервые проявление антиоксидантной активности пролина исследовали у экстремального галофита Th. halophila, обладающего необычно высоким конститутивным уровнем ' и стресс-индуцированной аккумуляцией пролина, но относительно низкой активностью СОД, что могло указывать на участие в этих условиях механизма "тушения " проливом АФК.

6. Анализ накопления пролина и активности СОД в каллусной культуре, полученной из листьев Th. halophila, показал резкое снижение солеустойчивости клеток и поддержание в них более низкого, чем у нативного растения как контрольного, так и стресс-индуцируемого уровня пролина. Вместе с тем, в каллусах найдена высокая конститутивная активность антиоксидантных ферментов (СОД и ПО) и возрастание их активности в ответ на засоление и обработку PQ. Повышенная активность этих ферментов в каллусной линии может указывать на то, что в этом случае понижение NaCl-зависимого накопления пролина может компенсироваться усилением активности антиоксидантных ферментов.

7. Исследование динамики накопления пролина при действии PQ на каллусную линию и листья нативного растения Th. halophila показало, что использование пролина на "тушение" образующихся АФК восполнялось активацией экспрессии мРНК ключевого гена его биосинтеза (P5CS1). Повышение в этих условиях уровня транскриптов мРНК гена деградации пролина (PDH) могло быть направлено на поддержание пула глугамата - предшественника пролина.

Список работ по материалам диссертации

1. Шашукова A.B., Бакулпна Е.А. Исследование защитных систем Mesembryanthemum cristallimim L. в ответ на действие NaCI И УФ-Б" // 11 международная Пущинкская школа-конференция молодых ученых «Биология наука 21 века» г. Пущино, 2007 г. С. 165-166.

2. Бакулпна Е.А., Идрешев А., Литонова Т.В., Шевякова Н И. Антиоксидантная роль пролина у галофита Thellungiella halophila Меу в условиях супероксидного стресса // Годичное собрание общества физиологов растений России, международная конференция «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», Екатеринбург. 2008г. С.61-62.

3. Шевякова Н.И., Бакулпна Е.А. Пролин защищает растения хрустальной травки

от супероксидного стресса И Годичное собрание общества физиологов растений России, международная конференция «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», Екатеринбург. 2008. С.436-437.

4. Бакулина Е.А., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Исследование антиоксидантной роли пролина при засолении и действии параквата // Международная научная конференция «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» Апатиты, Мурманская область. 2009. С.42-44.

5. Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Бакулина Е.А., Юренков A.A., Абдуллаев М.Н., Карташов A.B., Кузнецов Вл. В.. Участие пролина в защитном ответе растения Tellungiella halophila L. на действе абиотических стрессоров // Международная научная конференция «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» Апатиты, Мурманская область. 2009. С.243-275.

6. Шевякова Н. И., Бакулина Е. А., Кузнецов Вл. В. Антиоксидантная роль пролина у галофита Mesembryanthemum ctystallmum ответ на краткосрочный супероксидиый стресс, генерируемый парахватом Н Физиология растений. 2009. Т.56. № 5. С.1-7.

Подписано в печать:

04.05.2010

Заказ № 3685 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бакулина, Екатерина Андреевна

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Засоление как стрессовый фактор для жизнедеятельности растений

1.2. Роль совместимых метаболитов в защите растений от солевого стресса.

1.3. Накопление пролина при абиотических стрессах и его полифункциональная роль

1.4. Окислительный стресс

1.5. Фементативные системы защиты от окислительного стресса

1.6. Неферментативные механизмы детоксикации при окислительном стрессе.

1.7. Влияние пролина на активность ферментов-антиоксидантов

1.8. Антиоксидантная роль пролина при стрессах.

1.9. Сигнальная роль АФК

1.10. Биосинтез и деградация пролина, их регуляция.

1.11. Возможности моделирования окислительного стресса для изучения антиоксидантной роли пролина

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования

2.1.1 Mesembryanthemum cristallinum L.

2.1.2 Thellungiella halophila Mey.

2.1.3 Получение каллусной культуры Thellungiella halophila

2.2 Схемы проведения опытов

2.3 Методы биохимических исследований 54 2.4. Проведение молекулярных анализов 62 2.5 Математическая обработка данных

Глава 3. Исследование антиоксидантной роли пролина у галофита Mesembryanthemum. crystallinum L.

3.1 Ответная реакция молодых растений на супероксидный стресс и засоление

3.2 Ответная реакция взрослых растений на супероксидный стресс и засоление

Глава 4. Исследование антиоксидантной роли пролина у галофита Thellungiella halophila Mey.

4.1 Сравнительный анализ действия NaCl на содержание пролина и состояние окислительного стресса у растений и каллусной ткани

4.2 Влияние обработки листьев и каллусов паракватом на содержание пролина и активность антиоксидантных ферментов

4.3 Возможное участие стресс-индуцированного пролина в каллусах в "тушении" гидроксил-радикала

4.4 Влияние параквата на биосинтез и деградацию пролина в листьях и каллусной культуре Th. halophila.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование антиоксидантной роли пролина у галофитов и участия АФК в регуляции его биосинтеза"

Актуальность проблемы. Накопление в растительных клетках избыточного количества активных форм кислорода (АФК) в последнее время приобретает универсальный характер, поскольку индуцируемый ими окислительный стресс является одним из ранних повреждающих факторов стрессовых воздействий на растения (Hernandes et al., 2001). Показано, что АФК повреждают мембраны; окисляют аминокислотные остатки в белках (тирозина, триптофана, фенилаланина, метионина, цистеина), что приводит к их инактивации; повреждают ДНК и другие важнейшие компоненты клетки (Asada, 1994; Mittler, 2002). При усилении в стрессовых условиях одноэлектронного восстановления кислорода при фотосинтезе в хлоропластах и транспорта электронов при дыхании в митохондриях, прежде всего, образуется синглетный кислород ('02), супероксид-радикал (02° ), затем продукт его дисмутации — Н2Ог и, наконец, самый токсичный гидроксильный радикал (ОН°).

Среди них пролин привлекает наибольшее внимание, поскольку его аккумуляция возникает в растительных клетках при действии практически любых стрессовых факторов: холод (Трунова, 2007; Синькевич и др., 2009), засуха (Tyagi et al., 1999), тяжелые металлы (Шевякова и др., 2003; Холодова и др., 2005), ультрафиолет (Радюкина и др., 2008). Однако в течение почти 50 лет физиологи растений изучали аккумуляцию пролина в основном в связи с его осморегуляторной ролью (Aspinall, Paleq, 1981), хотя известно, что стресс-индуцированное накопление пролина в растительных клетках обладает мультифункциональным действием на клеточный метаболизм, помогая растениям адаптироваться к неблагоприятным условиям, защищая от инактивации белки, ДНК, ряд ферментов и другие важнейшие клеточные компоненты (Кузнецов, Шевякова, 1999).

Одним из химических свойств пролина, входящих в современную концепцию о противодействии накоплению в клетках АФК, значительно опережающих повреждающее действие многих абиотических факторов, является его способность "тушить" сингл етный кислород ('02) и гидроксильный радикал (ОН°) (Smirnoff, Cumbes, 1989; Smirnoff, 1993; Alia et al., 1997; Matysik et al., 2002). Среди совместимых метаболитов, аккумулирующихся в растениях при стрессах, только для пролина показан эффект «тушения» синглетного кислорода, образующегося в первые часы действия стрессора (Alia et al., 1997). В работе Hong (Hong et al., 2000) на основании снижения в клетках продукции малонового диальдегида (МДА) — индикатора перекисного окисления липидов, также была показана антиоксидантная роль пролина в условиях NaCl-индуцированного окислительного стресса. Экзогенный пролин, добавленный в среду культивирования растений, снижал негативный эффект окислительного стресса, индуцированного паракватом (метилвиологеном), у растений шалфея {Salvia officinalis L.) (Радюкина и др., 2008).

Вместе с тем, до сих пор отсутствуют систематические исследования проявления антиоксидантных свойств пролина и роли пролина в поддержании редокс-гомеостаза клеток при накоплении АФК у растений-галофитов, адаптированным к многим стрессам и аккумулирующих пролин в высоких концентрациях вплоть до 500 мкм/г сырой массы у экстремального галофита Thellungiella halophila (Kant et al., 2006).

В последнее время продукция АФК в растительных клетках при стрессах стала рассматриваться не только как повреждающий фактор (Apel, Hirt, 2004), но и как первичный сигнал для включения экспрессии генов, участвующих в стресс-адаптации (Foer, Noctor, 2005; Cheeseman, 2007; Radukina et al., 2010). Супероксид-радикал (02° ), перекись водорода (Н2О2), гидроксил-радикал (ОН°) являются частью сложного и разветвлённого процесса передачи стресс-сигналов. Они могут инициировать не только биосинтез ферментов-антиоксидантов, но и индукцию синтеза пролина через МАПК-сигнальный каскад подобно абсцизовой кислоте (Chinnasamy et al., 2005). Однако регуляция экспрессии генов биосинтеза и деградации пролина (P5CS1 и PDH) в связи с проявлением пролином антиоксидантной роли практически не изучалась.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: сравнительное исследование роли пролина как возможной "ловушки" АФК и участия АФК в регуляции биосинтеза и деградации пролина. В качестве модельных объектов использовали растения-галофиты Mesembryanthemum crystallinam L. и Thellungiella halophila Mey.

Задачи исследования:

1. Исследовать взаимосвязь между конститутивным и стресс-индуцированным уровнем пролина и состоянием окислительного стресса у двух возрастных групп факультативного галофита М. crystallinum. В качестве параметров развития окислительного стресса использовать: изменение активности СОД, гваяколовой ПО, каталазы, интенсивности ПОЛ, содержания АФК (02° и Н202).

2. Исследовать проявление антиоксидантных свойств пролина по ряду косвенных критериев: активности СОД, содержанию 02° , хлорофилла, МДА и др., ответной реакции растений М. crystallinum на обработку паракватом, экзогенным пролином и совместным действием параквата и экзогенного пролина.

3. Получить каллу сную культуру клеток из листьев экстремального галофита Th. halophila, чтобы исключить регуляцию накопления пролина и его межорганный транспорт на уровне целого растения и исследовать характер аккумуляции пролина и проявление его антиоксидантных свойстав на клеточном уровне.

4. Провести сравнительный анализ конститутивного и NaCl-индуцированного уровня пролина, а также проявления пролином антиоксидантных свойств на организменном и клеточном уровне у Th. halophila.

5. Исследовать антиоксидантную роль пролина у нативных растений и клеточной линии Th. halophila в условиях моделирования паракват-усиленного образования 02° и Н202.

6. Исследовать влияние параквата на экспрессию ключевых генов биосинтеза (P5CS1) и деградации пролина (PDH) в каллусной культуре и у растений Th. halophila, произраставших в контрольных условиях и предварительно адаптированных к засолению.

Научная новизна.

Впервые изучали возможность проявления пролином антиоксидантных свойств у двух галофитов Mesembryanthemum crystallinum L. и Thellungiella halophila Mey, подвергнутых действию засоления, про-оксиданта параквата и их совместного действия. Для выявления антиоксидантных свойств пролина использовали ряд специфических критериев: активность СОД, ПО, содержание АФК, интенсивность ПОЛ и др.

Впервые показан антиоксидантный эффект экзогенного пролина у растений М. crystallinum с низким конститутивным и NaCl-индуцированным уровнем эндогенного пролина, который состоял в снижении активности СОД, ПО, интенсивности ПОЛ и повышении содержания хлорофиллов (а+Ь), что могло свидетельствовать о "тушении" экзогенным пролином, прежде всего, супероксид-радикала (02° ). Экзогенный пролин подавлял паракват-индуцируемую стимуляцию активности СОД и снижал содержание супероксид-радикала в листьях. Установлено, что у растений с пониженным уровнем накопления пролина преимущественную роль в защите от окислительного стресса выполняла СОД, на что указывал высокий уровень как конститутивной, так и индуцируемой засолением и паракватом активности фермента и содержания Н2О2 в листьях. Впервые получена каллусная культура из листьев Th. halophila, которая отличалась от нативного растения более низкой солеустойчивостью и NaCI-зависимой аккумуляцией пролина, но превосходила более высокой активностью СОД и ПО.

Впервые показано, что в ответ на увеличение в листьях Th. halophila NaCl-индуцированного пула пролина в них в 5 и более раз падала активность СОД, что косвенно указывало на способность эндогенного пролина вступать в реакцию с 02° . Показано также, что при обработке PQ листьев нативного растения и каллусов Th. halophila, культивируемых в контрольных условиях или в присутствии NaCl (100 и 200 мМ) эндогенный пролин выступал как "тушитель" супероксид-радикала (02° ) и гидроксил-радикала (ОН°). Использование пролина на "тушение" АФК восполнялось последующей активацией экспрессии мРНК ключевого гена биосинтеза пролина (P5CS1), а соответствующее повышение экспрессии мРНК PDH могло быть связано с поддержанием в этих условиях пула глутамата.

Практическая значимость работы.

Каллусная культура, полученная из листьев экстремального галофита Th. halophila, может использоваться для получения суспензионной культуры и изучения молекулярных механизмов адаптации к засолению. Выявленные в процессе выполнения работы критерии, косвенно свидетельствующие об антиоксидантной роли пролина, могут использоваться в экспериментальных исследованиях и при прочтении курса лекций по механизмам адаптации растений к абиотическим стрессам.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на 11 международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» г. Пущино, (2007 г); годичном собрании общества физиологов растений России, Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», Екатеринбург (2008 г); годичном собрании общества физиологов растений России, Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего Севера», Апатиты, Мурманская область (2009 г).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать б печатных работ, из которых 1 — статья в журнале «Физиология растений».

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и содержат 3 таблицы, 8 формул и 32 рисунка. Список цитируемой литературы включает 170 наименований, в т.ч. 151 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Бакулина, Екатерина Андреевна

выводы

1. Проведен сравнительный анализ изменения различных параметров окислительного стресса у растений-галофитов {Mesembryanthemum crystallinum L. и Thellungiella halophila Mey), аккумулирующих пролин в условиях засоления, косвенно свидетельствующий о проявлении пролином антиоксидантных свойств.

3. При совместном действии экзогенного пролина и параквата на растения с низким содержанием пролина активность СОД резко падала, что сопровождалось снижением в листьях содержания супероксид-радикала, повышением содержания хлорофилла и снижением интенсивности ПОЛ, т.е. экзогенный пролин выполнял роль "тушителя" сцупероксидного радикала

О/")

4. У молодых растений М. crystallinum с повышенным уровнем NaCl-зависимой аккумуляции пролина активность СОД при усилении окислительного стресса обработкой листьев PQ практически не изменялась, что косвенно свидетельствовало о "тушении" эндогенным пролином образующихся de novo АФК.

5. Впервые проявление антиоксидантной активности пролина исследовали у экстремального галофита Th. halophila, обладающего необычно высоким конститутивным уровнем и стресс-индуцированной аккумуляцией пролина, но относительно низкой активностью СОД, что могло указывать на участие в этих условиях механизма "тушения " пролином of.

6. Анализ накопления пролина и активности СОД в каллусной культуре, полученной из листьев Th. halophila, показало резкое снижение солеустойчивости клеток и поддержание в них более низкого, чем у нативного растения как контрольного, так и стресс-индуцируемого уровня пролина. Вместе с тем, в каллусах найдена высокая конститутивная активность антиоксидантных ферментов (СОД и ПО) и возрастание их активности в ответ на засоление и обработку паракватом. Повышенная активность этих ферментов в каллусной линии может указывать на то, что в этом случае понижение NaCl-зависимого накопления пролина может компенсироваться усилением активности антиоксидантных ферментов.

7. Исследование динамики накопления пролина при действии параквата на каллусную линию и листья нативного растения Th. halophila показало, что использование пролина на "тушение" образующихся АФК восполнялось активацией экспрессии мРНК ключевого гена его биосинтеза (P5CS1). Повышение в этих условиях уровня транскриптов мРНК гена деградации пролина (PDH) могло быть направлено на поддержание пула глутамата - предшественника пролина.

Я сердечно благодарю и выражаю глубокую признательность д.б.н., профессору Нине Ивановне Шевяковой за научное руководство и помощь, оказанную при работе над диссертацией и зав. лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации, член-корреспонденту РАН Владимиру Васильевичу Кузнецову.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема образования в растительных клетках избыточного количества активных форм кислорода (АФК) и в первую очередь синглетного кислорода ('02) и супероксид-радикалов (02°) в последнее время приобретает универсальный характер. Это связано с тем, что индуцируемый ими окислительный стресс является одним из ранних повреждающих факторов, сопровождающих любое стрессорное воздействие на растения, в том числе действие засоления. Считается, что первой линией защиты от накопления супероксид радикала в растительных клетках является активация супероксиддисмутаз (СОД). Однако, у некоторых видов растений, в частности в листьях галофита Thellungiella halophila, был найден низкий конститутивный уровень этого фермента и отсутствие стресс-индуцируемого повышения его активности (Радюкина и др., 2007). В то же время у этого растения в листьях был найден высокий конститутивный уровень пролина и его необычно интенсивная аккумуляция (выше 300 мкмоль/г сырой массы) в ответ на солевой стресс (600-700 мМ NaCl) (Inan et al., 2004; Kant et al., 2006; Радюкина и др. 2007, 2008). В обзорной работе Матисик и соавторов (Matysik et al., 2002) приводятся прямые доказательства, что химические свойства пролина обуславливают его высокую способность служить "ловушкой" синглетного кислорода ('02) и самого токсичного из АФК гидроксил-радикала (ОН°).

Выше приведенные данные послужили основанием для проведения исследований по поиску косвенных доказательств существования взаимосвязи между стресс-индуцированной аккумуляцией пролина у растений и окислительным стрессом, сопровождающим действие на растения любых абиотических факторов. В связи с этим мы предположили, что необычно высокий конститутивный уровень пролина и его NaCl-зависимая аккумуляция у нового модельного объекта экстремального галофита

Thellungiella halophila возможно в значительной степени связана с проявлением пролином антиоксидантной активности. Для проверки этого предположения мы провели сравнительный анализ характера изменения различных параметров окислительного стресса у другого модельного объекта факультативного галофита Mesembryanthemum crystallinum L. с различной возрастной способностью аккумулировать пролин в условиях засоления. Для решения поставленных задач использовали различные косвенные критерии проявления пролином антиоксидантной активности: ответную реакцию антиоксидантных ферментов (СОД, ПО, каталазы), интенсивности ПОЛ, образование 02 , Н202 на обработку растений экзогенным пролином и моделирование повышенного образования АФК при действии про-оксиданта гербицида метилвиологена (параквата, PQ).

В проведенных исследованиях было установлено, что у растений М. crystallinum с повышенным статусом накопления стресс-индуцированного пролина активность СОД практически не изменялась, что косвенно свидетельствовало о "тушении" суперокисдного аниона пролином. Напротив, растения с пониженной продукцией пролина резко повышали активность СОД при действии параквата, т.е. имеющегося эндогенного пула пролина было недостаточно для нейтрализации супероксид-радикала. При совместном действии экзогенного пролина и параквата активность СОД также падала, но в этом случае первичной причиной могло быть "тушение" экзогенным пролином супероксид-аниона, о чем свидетельствовало о снижение продукции 02 и восстановление нормального содержания в листьях хлорофиллов и низкая интенсивность ПОЛ.

Дальнейшие опыты по получению косвенных доказательств проявления антиоксидантной функции пролина были проведены с интактными растениями Th. halophila и каллусной культурой, полученной из листьев этого галофита. Было установлено, что каллусы, произраставшие в течение 14 дн в присутствии различных концентраций NaCl (25 - 200 мМ), также обладали пролин-аккумулирующей способностью, но на более низком уровне, чем у нативного растения. У каллусов с пониженной продукцией пролина в условиях засоления активность СОД, ПО и каталазы была выше, чем у интактных растений. При этом высокой интенсивности стресс-индуцированного накопления пролина в листьях нативного растения, составившей почти 80% от суммы всех аминокислот, соответствовала низкая активность СОД, каталазы и гваяколовых ПО. Найденная закономерность могла свидетельствовать, что основную роль в нейтрализации образующихся АФК и в том числе ]02 в листьях Th. halophila выполнял пролин.

При инициации супероксидного стресса паракватом на свету контрольных листьев и листьев, испытывающих действие засоления, было найдено статистически значимое снижение содержания в них эндогенного пролина в первые 2 ч действия света, что указывало на использование пролина для нейтрализации образовавшихся АФК. При этом использование пролина для "тушения" АФК в последующие часы действия света восполнялось повышением экспрессии мРНК ключевого гена биосинтеза пролина (P5CS1) и деградации (PDH). Усиление распада пролина в митохондриях также рассматривается как необходимость повышения в клетках пула глутамата - предшественника пролина, который в стрессорных условиях мог тратиться также для других метаболических процессов.

В каллусной культуре, имеющей пониженный по сравнению с нативным растением пул пролина в клетках, в ответ на усиление образования АФК в контрольных условиях и в присутствии NaCI с помощью параквата наблюдались волнообразные колебания количества пролина, которым соответствовало плавное повышение экспрессии мРНК гена биосинтеза, что таюке указывало на необходимость поддержания более высокого пула пролина для нейтрализации АФК. Однако, для каллусной культуры, имеющей явно более низкий пул пролина, отмечена высокая активность СОД, ПО и каталазы, что может играть преимущественную роль в защите от окислительного стресса на клеточном уровне. Этот результат требует дальнейшего изучения на примере суспензионных культур, для которых может быть использована каллусная культура, полученная в данной работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бакулина, Екатерина Андреевна, Москва

1. Бараненко В.В. (2006) Супероксиддисмутаза в клетках растений. Цитология, 48, 465-474.

2. Бритиков Е.А., Мусатова Н.А., Владимерцева С.В. (1965) О метаболизме пролина в подрастающей пыльце и тканях пестика. Физиология растений, 12, 953-957.

3. Бухов Н.Г. (2004) Динамическая световая регуляция фотосинтеза. Физиология растений, 51, 825-837.

4. Волков К.С. (2006) Адаптация к действию повышенных концентраций меди и цинка и возможность использования в фиторемедиации растений Mesembryanhemum crystallinum L. Автореф. дисс. на соискание канд.биол.наук. 2006.

5. Калинина Л.Г., Назаренко Л.В., Гордеева Е.А. (1990) Модификационный метод выделения свободных аминокислот для определения на аминокислотном анализаторе. Физиология растений, 37, 617.

6. Карташов А.В., Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Пашковский ПЛ., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2008) Роль антиоксидантных систем при адаптации дикорастущих видов растений к солевому стрессу. Физиология растений, 55, 516-522.

7. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. (1999) Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция. Физиология растений, 46, 321-336.

8. Лин X., Лю Р. (2009) Лекарственное растение Rehmannia glutinosa: метаболиты, культура тканей, роста и его регуляция, функциональная геномика. Физиология растений, 56, 654-663.

9. Синькевич М.С., Дерябин А.Н., Трунова Т.И. (2009) Особенности окислительного стресса у растений картофеля с измененным углеводным метаболизмом. Физиология растений, 56, 186-192. Трунова Т.И. (2007) Растение и низкотемпературный стресс. М: Наука, 54 с.

10. Холодова В.П., Волков К.С., Кузнецов Вл.В. (2005) Адаптация к высоким концентрациям солей меди и цинка растений хрустальной травки и возможность их использования в целях фиторемедиации. Физиология растений, 52, 848-858.

11. Шашукова А.В. (2009) Участие пролина в регуляции уровня полиаминов и функционирования антиоксидантных ферментов у растений Salvia officinalis L. при действии УФ-Б облучения: Автореф. дисс. канд. биол. наук, Москва, 27 с.

12. Шевякова Н.И., Нетронина И.А., Аронова Е.Е., Кузнецов Вл.В.2003) Распределение Cd и Fe в растениях Mesembryanthemum crystallnum при адаптации к Cd-стрессу. Физиология растений, 53, 753-768.

13. Шевякова Н.И., Ракитин В.Ю., Музычко Л.М., Кузнецов Вл.В.1998) Стресс-индуцируемая аккумуляция пролина в связи с солеустойчивостью интактных растений и изолированных клеток. Прикладная биохимия и микробиология, 34, 320-325.

14. Adams R., Alvaro A.M., Tavares, Adi Salzberg, Hugo J. Bellen and David M. Glover (1998) Encodes a kinesin-like protein required to organize the central spindle and contractile ring for cytokinesis. Gens and development, 12, 10-15.

15. Ahmad I., Larhar F. and Stewart G. (1979) Sorbitol a compartible osmotic solute in Plantago miritime. New Physiol., 82, 671-675.

16. Ahmad J., Hellebust J.A. (1988) The relashionship between inorganic nitrogen metabolism and proline accumulation in osmoregulatory responses of two euryhaline microalgae. Plant Physiol., 88, 348-354.

17. Ahmad S. A., Hopkins T. L. (1993) Phenol betha-glucosyltransferases in six species of insects: Properties and tissue localization. Compar. Biochem. a. Physiol104, 515-519.

18. Alia Saradhi P.P., Mohanty P. (1993) Proline in relation to free radical production in seedlings of Brassica juncea raised under sodium chloride stress. Plant and Soil., 155/156,497-500.

19. Alia Saradhi P.P., Mohanty P. (1997) Involvement of proline in protecting thylakoid membranes against free radical-induced photodamage. J. Photochem. and Photobiol., 38, 253-257.

20. Amtmann, A. (2009) Learning from evolution: Thellungiella generates newknowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant, 2, 3-12.

21. Arabawa, Т., Timasheff, S.N. (1985). The stabilisation of proteins by osmolytes. Biophis. J., 47, 411.

22. Asada K. (1999). The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50,601-639.

23. Aspinall D., Paleq, L. G. (1981) Effect of water deficit on sporogenesis in wheat (Tviticumaestivum L.). Ann Bot., 48, 623-633.

24. Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. (1973) Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil., 39, 205-207.

25. Bieza K., Lois R. (2001) An Arabidopsis mutant tolerant to lethal ultraviolet-B levels shows constitutively elevated accumulation of flavonoids and other phenolics. Plant Physiol., 126, 1105—1115.

26. Binzel M., Hess F., Bressan A. and Hasegawa P. (1988) Intracellular Compartmentation of Ions in Salt Adapted Tobacco Cells. Plant Physiol., 86, 607-614.

27. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. (2003) Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Annals of Botany, 91,179-194.

28. Bogges S., Paleg L. and Asspinal D. (1975) P5CDH in barely, a proline-accumulating species. Plant Physiol., 56, 259-262.

29. Borkird C., Claes В., Caplan A., Simoens C., Van Montagu M. (1991) Differential expression of water-stress associated genes in tissues of rice plants. Plant Physiol.,. 138, 591-595.

30. Borrell A., Besford R.T., Altabella Т., Masgrau C., Tiburcio A.F. (1996) Regulation of arginine decarboxylase by spermine in osmotically-stressed oat leaves. Plant Physiol., 98, 105-110.

31. Brennan Т., Frenkel C. (1977) Involvement of Hydrogen Peroxide in the Regulation of Senescence in Pear. Plant Physiol., 59, 411-416.

32. Bressan R.A., Zhang C., Zhang H., Hasegawa P.M., Bohnert H.J., Zhu J.K. (2001) Learning from the Arabidopsis Experience. The Next Gene Search Paradigm. Plant Physiol., 127, 1354-1360.

33. Burkey K.O. (1999) Effects of ozone on apoplast: cytoplasm partitioning of ascorbic acid in snap bean. Physiol. Plantarum., 107, 188—193.

34. Bursell E. Slack E. (1976) Oxidation of proline by sarcosomes of the tsetse fly, Glossina morsitans. Insect Biochemistry, 6-2, 159-167.

35. Burssens, S. , Himanen K., van de Cotte В., Beeckman T, Van Montagu A, Inze D. Verbruggen N. (2000) Expression of cell cycle regulatory genes and morfological alterations in response to salt stress in Arabidopsis thaliana. Planta, 211, 632.

36. Chen Y., Shao G. and Chang R. (1997) The effect of salt stress on superoxide dismutase in various organelles of cotyledons of soybeen seedlings. Acta Agronomica Sinica, 23, 214.

37. Cheng L., Spangfort M. and Allen J. (1994) ATP-dependent effects on redox regulation of chloroplast protein synthesis. Biochim. Biophys., 1188, 151-157.

38. Chinnusamy V., Jagendorf A., Zhu J.-K. (2005) Understanding and Improving Salt Tolerance in Plants. Crop Set, 45, 437-448.

39. Chinnusamy V., Ohta, M., Kanrar, S., Lee, B.-h., Hong, X., Agarwal, M., and Zhu, J.-K. (2003) ICE1, a regulator of cold induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis. Genes & Dev., 17, 1043-1054.

40. Cushman C.J. and Bohnert H.J. (1997) Molecular Genetics of Crassulacean Acid Metabolism. Plant Physiol., 113, 667-676.

41. Cushman С. J. (2001) Crassulacean Acid Metabolism. A Plastic Photosynthetic Adaptation to Arid Environments. Plant Physiol., 127, 14391448.

42. Cushman C.J. and Bohnert H.J. (1999) Crassulacean Acid Metabolism. Molecular Genetics. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 50, 305-332.

43. De Ronde J.A, Spreeth M.H., and Cress W.A. (2000) Effect of antisense L-DL-pyrroline-5-carboxylate reductase transgenic soybean plants subjected to osmotic and drought stress. Plant Growth Regul., 32, 13 — 21.

44. Delauney A, Verma D. (1993) Proline biosyntesis and osmoregulation in plants. Plant J., 4, 215-223.

45. Elstner E.F. (1991) Mechanisms of oxygen activation in different tool compartments of plant cells. American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, p. 13-25.

46. Elthon Т. E., Stewart C.R. (1981) Submitochondrial location and electron transport characteristics of enzymes involved in proline oxidation. Plant Physiol, 67,780-784.

47. Elthon Т.Е., Stewart C.R. (1982) Proline oxidation in corn mitochondria. Plant Physiol., 70, 567-572.

48. Fenton E. (1984) Oxidation of tartaric acid in presence of iron. J. Chem. Soc., Trans. 65, 899-911.

49. Fenton M.A. (1894) Oxidation of tartaric acid in presence of iron. J. Chem. Soc., Trans., 65, 899-911;

50. Foyer C.H., Noctor G. (2009) Regulation in photosynthetic organisms: acclimation, and practical implifications. Antioxidants & Redox Signalling. 11, 861-905.

51. Foyer C.H., Noctor G. (2000) Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signalling. New. Phytol., 146, 359-388

52. Frohnmeyer H., Staiger D. (2003) Ultraviolet-B radiation-mediated responses in plants. Balancing damage and protection. Plant Physiol., 133, 1420-1428.

53. Garcia A.B, Engler JdA., Iyer S., Gerats Т., Van Montagu M., Caplan

54. A.B. (1997) Effects of Osmoprotectants upon NaCl Stress in Rice. Plant Physiol., 115, 159-169.

55. Goldstein S., Meyerstein D., and Czapski G. (1993) The Fenton reagents. Free Radical Biology and Medicine, 15, 435-445.

56. Gong Q., Li P., Ma S., Rupassara S.I., Bohnert H.J. (2005) Salinity Stress Adaptation Competence in the Extremophile Thellungiella halophila in Comparison with Its Relative Arabidopsis thaliana . Plant J., 44, 826— 839.

57. Griffiths D.W., Shepherd T. (2006) The effects of stress on plant cuticular waxes. New Phytol. 171. 469-499.

58. Gueta-Dahan Y. (1997) Salt and oxidative stress: Similar and spesific responses and their relation to salt tolerance in Citrus. Planta, 203, 460.

59. Halliwell B. (2006) Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life. Plant Physiol., 141, 312—322.

60. Hare P.D., Cress W.A. (1997) Metabolic, implications of stress-induced proline accumulation in plants. Plant Growth Regual., 21, 79-102.

61. He Y-Y., Hiider D-P. (2002) Reactive oxygen species and UV-B: effect on cyanobacteria. Photochem. andPhotobiol., 1, 729-736.

62. Heath R.L., Packer L. (1968) Photoperoxidation in isolated cloroplasts. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochem. andBiophys., 125, 189-198.

63. Hellmann H., Funck D., Rentsch D., Frommer W.B. (2000) Hypersensitivity of an Arabidopsis sugar signaling mutant toward exogenous proline application. Plant Physiol., 122, 357—367.

64. Hernandez J., Jimerez A., Mullineaux P. and Sevilla P.(2002) Tolerance of pea (Pisum sativum) to long-term salt stress is assisiated with induction of antioidant defenses. Plant Cell Biol., 23, 853.

65. Hernandez, J.A. Corpas F.J., Gemez M., de Rio L.A., Sevilla F. (2001) Antoixidant sistem and 02-/H202 production in the apoplast of pea leaves, Its relation with salt-induced necrotic lesions in minor veins. Plant Phisiol., 127, 817.

66. Hirt H., Shinozaki K. (2004) Plant Responses to Abiotic Stress. Springer-Verlag, Vol. 4, 300 p.

67. Huang A.H.C., Cavalieri A.J. (1979) Proline oxidase and water stress-induced proline accumulation in spinach leaves. Plant Physiol, 63, 531-535.

68. Iyer S., Caplan A. (1998) Products of proline catabolism can induce osmotically regulated genes in rice. Plant Physiol., 116, 203-211.

69. Jenkins G.I. (2009) Signal transduction in responses to UV-B radiation. Annu. Rev. Plant Biol., 60, 407-431.

70. Jithesh M.N., Prashanth S.R., Sivaprakash K.R., Parida A.K. (2006) Antioxidative response mechanisms in halophytes: their role in stress defense. J. of Genetics, 85, 237-254.

71. Kaul S., Sharma S.S., Mehta I.K. (2008) Free radical scavenging potential ofL-proline: evidence from in vitro assays. Amino Acids, 34, 315—320.

72. Kaur H., Halliwell B. (1994) Detection of hydroxyl radicals by aromatic hydroxylation. Methods in Enzymology, 233, 67-82.

73. Khedr A.H.A, Abbas M.A, Wahid A.A.A, Quick W.P.N (2003) Proline induces the expression of salt-stress-responsive proteins and may improve the adaptation of Pancratium maritimum L. to salt stress. J.Exp. Bot., 54, 2553-2562.

74. Kholodova V.P., Neto D.S., Kruglova A.G., Aleksandrova.N., Kuznetsov

75. VI.V. (2000) Possible novel role of proline in stress adaptation in Nitrogen in a sustainable ecosystem: from the cell to the plant. Ed: M.A.Martins1.u£ao and S.H. Lips. Buckhuys Publishers, Leiden, The Netherlands. 255259.

76. Kohl D.H., Kennelly E.J., Zhu Y., Schubert K.R., Shearer G. (1991) Proline accumulation, nitrogenase (C2H2 reducing) activity and activities of enzymes related to proline metabolism in drought-stressed soybean nodules. J Exp Bot., 42, 831-837.

77. Kohl D.H., Schubert K.R., Carter M.B., Hagedorn C.H., Shearer G. (1988) Proline metabolism in N2 fixing root nodules: energy transfer and regulation of purine synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 85, 2036-2040.

78. Kuo Т., Doehlert D. and Crawford C. (1990) Sugar metabolism in germinaeting soybeen seeds. Plant Physiol., 93, 1514.

79. Kuznetsov Vl.V., Rakitin V.Yu., Zholkevich V.N. (1998) Interaction of heat shock and drought stress in plants. In: Responses of plant metabolism to air pollution, De Kok L.J., Stulen I. Leiden (eds). The Netherlands: Backhuys Publ. pp. 359-366.

80. Labidi N., Lachaal M., Chibani F., Grignon C., Hajji M. (2002) Variability of the response to NaCl of eight ecotypes of Arabidopsis thaliana. J. Plant Nutr., 25, 2627.

81. Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C. (1994). H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell. 79, 583.

82. Libik M., Pater В., Elliot S., Slesak I., Miszalskia Z. (2003) Malate accumulation in different organs of Mesembryanthemum crystallinum L. following age-dependent or salinity-triggered CAM metabolism. Verlag der

83. Zeitschriftfur Naturforschung, 223-228, 0939.

84. Liewus F., Dickson D. (1982) Cytosols In Encyclopedia of Plant Physiology: Plant Carbohytrates. Intracellular Carbohydrates. Loewus F. and Tanner W., Eds., Springer-Verlag, Berlin, p. 193

85. Lim S., Kim Y-H., Kim S-H., Kwon S-Y. (2007) Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methylviologen-mediated oxidative strss and chilling. Mol. Breeding, 19, 227-239.

86. Logan B.A., Kornyeyev D., Hardison J., Holaday A.S. (2006) The role of antioxidant enzymes in photoprotection. Photosynth. Res., 88, 119-132.

87. О 98. Lutts S., Guerrier G. (1995) Peroxidase activities of two rice cultivarsdiffering in salinity tolerance as affected by proline and NaCl. Biologia Plantarum., 37, 577-586.

88. Maas, E.V. (1990) Crop solt tolerance In Agracultural Salinity Assessment and Management. ASCE Mauals and Report on Engineering No. 71, American Society of Civil Engineers, NY.

89. Mackerness S.A.-H. (2000) Plant responses to ultraviolet-B (UV-B: 280320 nm) stress: What are the key regulators? Plant Growth Reg., 32, 27-39.

90. Maehly A.C., Chance B. (1954) The assay of catalases and peroxidases. щ Methods of Biochemical Analysis, Glick, D. (eds.). Interscience, New York,pp. 357-408.

91. Martinoia. E., Rentsch, D. (1994) Malate compartmentation responses to a complex metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 45, 447467.

92. Matysik J., Alia, Bhalu В., Mohanty P. (2002) Molecular mechanisms of quenching of reactive oxygen species by proline under stress in plants. Curr. Sci, 82,525-532.

93. Mittler R., Simon L., Lam E. (2002) Pathogen-induced programmed cell death in tobacco. J. of Cell Science, 110, 1333-1344.

94. Munns R. (2002) Comparative phisiology of salt and water stress. Plant Cell Environ., 25, 239.

95. Munns R., Rawson H.M. (2009) Effect of salinity on solt accumelation reproductive development in the apical meristem of wheat and barley. Aust. J. Plant Phisiol., 26, 459.

96. Nanjo Т., Kobayashi M., Yoshiba Y., Kakubari Y., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (1999) Antisensense suppression of proline degradation improves tolerance to freesing and salinity in Arabidopsis thaliana. FEBSLett., 461, 205.

97. Netondo G.W., Onyango J.C., Beck, E. (2004) Sorgum and solinity: II. Gas exchange and chlorophyll fluorescence of sorgum under salt stress. Crop Sci., 44, 806.

98. Nicolopoulos D., Manetas Y. (1991) Compatible solutes and in vitro stability of Salsola soda enzymes: proline incompatibility. Phytochemistry, 30,411-413.

99. Nublat A., Desplans J., Casse F., Berthomieu P. (2001) Sasl, an Arabidopsis mutant overaccumulating sodium in the shoot, shows deficiency in the control of the root radial transport of sodium. Plant Cell, 13, 125—137.

100. Ozturk L., Demir Y. (2002) In vivo and in vitro protective role of proline. Plant Growth Regul., 38, 259-264.

101. Paul M.J. and Cockburn W. (1989) Pinitol, a Compatible Solute in Mesembryanthemum crystallinum L. Journal of Experimental Botany, 40, 1093-1098.

102. Pei Z.M., Murata Y., Benning G., Thomine S., Kluscner В., Allen G.J., Grill E., Schroeder J.I. (2000) Calcium channels activated by hydrogenperoxide mediate abscisic acid signaling in guard cells. Nature, 406, 731734.

103. Peng Z., Ku Q. and Verma D. (1996) Reciprocal regulation of P5CS and proline dehydrogenas genes control levels during and after osmotic stress in plants. Mol. Gen. Genet., 253, 334-341.

104. Phang J.M. (1985) The regulatory functions of proline and A1- pyrroline-5-carboxylic acid. Curr.Top. Cell. Regul., 25, 91-132.

105. Quesada V., Garcfa-Martinez S., Piqueras P., Ponce M.R., Micol J.L. (2002) Genetic Architecture of NaCl Tolerance in Arabidopsis Plant Physiology Preview, 130, 63-65.

106. Rajendrakumar C.S.Y., Reddy B.V.D., Reddy A.R. (1994) Proline-protein interactions: protection of structural and functional integrity of M4 lactate dehydrogenase. Boichem. Biophys. Res. Commun., 201, 957-963.

107. Rayapati P.J., Stewart C.R. (1991) Solubilization of a proline dehydrogenase from maize {Zea mays L.) mitochondria. Plant Physiol., 95, 787-791.

108. Rich P.R., Bonner W.D. (1978) The sites of superoxide anion generation in Higher plan mitochondria. Arch. Biochem. Biophis., 188, 206.

109. Ridge I., Osborne D.J. (1971) Role of peroxidase when hydroxyproline-rich protein in plant cell wall is increased by ethylene. Nature, 229, 205-208.

110. Rio L.A., Pastori G.M., Palma J.M., Sandalio L.M., Sevilla F., Corpas F.J., Jimenez A., Lopez-Huertas E., Hernandez J.A. (1998) The activated oxygen role of peroxisomes in senescence. Plant Physiol., 116, 1195-1200.

111. Sairam R., Chandrasekharm V., Srivastava G. (2001) Comparision of hexaplod and tetraploid wheat cultivars in their response to water stress. Biol. Plant., 44, 89.

112. Sairam R., Srivastava G. (2002) Chaneges in antioxidant activity in subcellular fractions of tolerant and susceptible wheat genotypes in response to long-term salt stress. Plant Sci., 162, 897.

113. Sairam R., Srivastava G. and Saxena D. (1998) Role of antyoxidant system in wheat genotypes tolerance to water stress. Biol Plant., 41, 384.

114. Sairam R., Srivastava G. and Saxena D. (2000) Increased antioxidant activity under elevated temperature: A mechanism of heat stress tolerance in wheat genotypes. Biol. Plant., 43, 245.

115. Sairam R.K. and Dube S.D. (1984) Effect of moisture stress on proline accumulation in wheat in rekation to drought tolerance. Indian J. Agric. Sci., 54, 146.

116. Sairam R.K., Tyagi A., Chinnusamy V. (2006) Plant-Environment Interactions. Ed. B.Huang. Taylor and Francis. P. 121-159

117. Samuel D., Kumar R. K.S., Jayaramoan G., Yang P.W., Yu C. (1997) Proline is a protein solubilizing solute. Bioch. Mol. Biol Intern., 41, 235242.

118. Saradbi A., Saradhi P.P. (1991) Proline accumulation under heavy metal stress. Plant Physiol, 138, 554-558.

119. Saradhi P.P., Arora S., Prasad V.V.S.K. (1995) Proline accumulation in plants exposed to UV radiation protects them against induced peroxidation. Boichem. Biophys. Res. Commun., 290, 1-5.

120. Savoure A., Jaoua S., Hua X.J., Ardiles W., Van Montagu M., Verbruggen N. (1995) Isolation, characterization and chromosomal location of a gene encoding the A'-pyrroline-5-carboxylate synthetase in Arabidopsis thaliana. FEBSLett., 372, 13-19.

121. Schobert В., Tschesche H. (1978) Unusual solution properties of proline and its interaction with proteins. Biochem. Biophys. Acta, 541, 270-277.

122. Schwab K.B., Gaff D.F. (1990) Influence of compatible solutes on soluble enzymes from desiccation —tolerant Sporobolus stapfians and desiccation — sensitive Sporobolus pyramidalis. Plant Physiol., 137, 208-211.

123. Seki, M., Narusaka M., Ishida J., Nanjo Т., Fujita M., Oono Y. (2002) Transkriptom changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic and cold stress. Plant Physiol., 130, 2119.

124. Sells D.D., Koeppe D.E. (1981) Oxidation of proline by mitochondria isolated from water-stressed maize shoots. Plant Physiol., 68, 1058-1061.

125. Shen В., Jensen R.C., Bohnert H.J. (1997) Mannitol protects against oxidation by hydroxyl radicals. Plant Physiol., 115, 527-532.

126. Siripornadulsil S., Train S., Verma d.P.S., Say re R.T. (2002) Molecular mechanisms of proline mediated tolerance toxic heavy metals in transgenic microalgae. Plant Cell., 14,2837-2847.

127. Smirnoff N. (2000) Ascorbate biosynthesis and function in photoprotection. Phil.Trans., 355, 1455-1464.

128. Smirnoff N., Cubmes Q.J. (1989) Hydroxyl Radicals Scavenging Activity of Compatible Solutes, Phytochemistry, 28, 1057-1059.

129. Soos V., Jori В., Szego D., Bratek Z., Racz I., Lazstity D., Szigeti Z. (2005) Role of transporters in the mechanism of paraquatt resistance of horseweed (Conyza canadensis (L.)) Cronq. 8th Plant Physiology,. 49, 191193.

130. Sreenivasulu N., Grimm В., Wobus U., Weschke W.(2000) Differential response of oxidant components to salinity stress in salt tolrant and saltsensitive seedlings of foxtail millet (Sateria italica). Phyisol. Plant., 109, 435.

131. Stewart C., Boggess S., Aspinall D., Paleg L. (1997) Inhibition of proline oxidation by water stress. Plant Physiol., 59, 930-932.

132. Sun K., Hunt K., Hauser B.A. (2002) Ovule abortion in Arabidopsis triggered by stress. Plant PhisioL, 135, 2358.

133. Szigeti Z. (2005) Mechanism of paraquat resistance from the antioxidant enzymes to the transporters. Proceeding of the 8-th Hungarian Congress on Plant Physiology and the 6th ungarian Conference on Photosynthesis. 177179.

134. Tarcynsky M.C., Jensen R.G., Bohnert H.J. (1993) Stress protectionof transgenic tabacco by production of the osmolite mannitol. Science, 259, 508.

135. Taybi Т., Cushman J.C. (1996) Signalling events leading to Crassulacean acid metabolism induction in the common ice plant. Plant Physiol., 121, 545-555.

136. Tayler C.B. (1996) Proline and water deficit: ups, down, ins, and out. The plant Cell, 8, 1221-1224.

137. Tester M., Davenport R.A. (2003) Na+ tolerance and Na+ transport in higher plants. Ann. Bot., 91, 503.

138. Tyagi A., Santha L.M., Mehta S.L. (1999) Effect of water stress on proline content and transcript levels in Lathyrus sativus. Indian J. Biochem. Biophys., 36, 207-212.

139. Urano K., Yoshiba Y., Nanjo Т., Igarashi Y. Seku M. (2003) Characterization of Arabidopsis genes involved in biosynthesis ofpolyamines in abiotic strss responses and developmental stages. Plant Cell Environ., 26, 1917-1926

140. Verbruggen N., Hermans C. (2008) Proline accumulation in plants: a review. Amino acids, 35, 753-759.

141. Vernon D., Bohnert H. (1992) A novel methyl transferase induces by osmotic stress in the facultative haliphytes Mesenbryantenmum crystallinum. EMBO J., 11,2077.

142. Volkov V., Wang В., Dominy P.J., Fricke W. Amtmann A. (2004) Thellungiella halophila, a salt-tolerant relative of Arabidopsis thaliana, possesses effective mechanisms to discriminate between potassium and sodium. Plant Cell and Environment, 21, 1-14.

143. Walton, E.F., Clark, C.J., and Boldingh, H.L. (1991). Effectof hydrogen cyanamide on amino acid profiles in kiwifruit buds during budbreak. Plant Physiol., 91, 1256-1259.

144. West G., Inze D., Beemster G.T. (2004) Cell cycle modiulation in the response of the primary root of Arabidipsis to salt stress. Plant Phisiol., 135, 1050.

145. Wiggins, P.M. (1990) Role of water in some biological processe. Microbial. Rev., 54, 432.

146. Winter K. (1973) C02-Fixierungsreaktionen bei der Salzpflanze Mesembryanthemum crystallinum unter variierten Aut3en- bedingungen. Planta, 114,75-85.

147. Winter K., Gademann R. (1991) Daily Changes in C02 and water vapor exchange, chlorophyll fluorescence, and leafwater rela tions in the halophyte

148. Mesembryanthemum crystallinum during the induction of Crassulacean acid metabolism in respons to high NaCl salinity. Plant Physiol., 95, 768-776.

149. Wong C.E., Li Y., Whitty B.R., Dyaz-Camino C., Akhter S.R., Brandle J.E., Golding G.B., Weretilnyk E.A., Moffatt B.A., Griffith

150. M. (2005) Expressed sequence tags from the Yukon ecotype of Thellungiella reveal that gene expression in response to cold, drought and salinity shows little overlap. Plant Molecular Biology, 58, 561—574.

151. Yokota A., Takahara K., Akashi K. (2006) Water Stress. In: Physiology and Molecular Biology of Stress Tolerance in Plants, Madhava Rao K.V., Raghavendra A.S, Junardhan Reddy K. (eds). The Netherlands: Springer, pp. 15-40.

152. Zhu J.K. (2000) Genetic Analysis of Plant Salt Tolerance Using Arabidopsis. Plant Physiol., 124, 941-948.

153. Zhu J.K. (2001) Plant Salt Tolerance. Trends Plant Sci., 6, 66-71.

154. Zhu J.K. (2002) Salt and drought stress signal transduction in plants. Ann. Rev. Plant Bol., 53, 247.

155. Zhu J.-K. (2003). Regulation of ion transport under salt stress. Plant Biol., 148, 467-469.

156. Zhu J.K. (2007) When will signaling meet small RNAs and epigenetic regulation? Curr. Opin. Plant Biol., 10, 433-435.

Информация о работе

Бакулина, Екатерина Андреевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Исследование антиоксидантной роли пролина у галофитов и участия АФК в регуляции его биосинтеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы