Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метилирование ДНК и экспрессия генов транскрипционных факторов CBF у растений капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Метилирование ДНК и экспрессия генов транскрипционных факторов CBF у растений капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации"

На правах рукописи

ФАРАФОНТОВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ CBF У РАСТЕНИЙ КАПУСТЫ BRASSICA OLERACEA L. ПРИ ХОЛОДОВОЙ АККЛИМАЦИИ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 ИЮН Z013

Уфа-2013

005060796

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Гималов Фуат Рамазанович

кандидат биологических наук

Вахитова Юлия Венеровна

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН зав. лабораторией молекулярной фармакологии и иммунологии Каримова Фатима Габдуллазяновна доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский Институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

зав. группой сигнальных систем

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится « 19 » июня 2013 г. в «/£-» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу. 450054, Уфа, проспект Октября, д. 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, проспект Октября, д. 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан « /у » МА^, 201 Зг.

Научный руководитель Официальные оппоненты

Ведущая организация:

Ученый секретарь ¿Л

диссертационного совета, к.б.н ^J^tt^l СМ" БикбУлатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Существенным фактором окружающей среды,

ограничивающим географическое распространение и сроки вегетации растений, является пониженная температура. Многочисленные исследования показали, что холодостойкость — комплексный признак, проявляющийся при слаженном действии различных систем растительного организма (Guy et al., 2008). Она достигается в ходе так называемой холодовой акклимации, которая происходит при экспозиции растений при низких незамораживающих температурах. Холодовая акклимация включает активацию множественных механизмов, вносящих вклад в повышение устойчивости растения к низкотемпературному стрессу. Понижение температуры приводит к индукции экспрессии определенных генов. Многие из этих генов, наряду с холодом, индуцируются также и некоторыми другими стрессовыми воздействиями. Показано, что гены холодового ответа кодируют разнообразный набор белков, включая ферменты дыхания и метаболизма углеводов и липидов, антиоксиданты, молекулярные шапероны, антифризные белки (Thomashow, 1999; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Walter et al.,' 2011).; '

Многие регулируемый холодом и дегидратацией гены в промоторных областях содержат одну или несколько копий последовательностей, обозначенных как DRE (dehydration-responsive element)/CRT (C-repeat) цис-элементы. С этими цис-элементами, в составе которых имеется консенсусная последовательность A/CCGACNT, связываются транскрипционные факторы CBF1, CBF2 и CBF3 (CRT-binding factor), в результате чего транскрипция генов; регулируемых холодом или дегидратацией, значительно активируется. Различия ■ в'устойчивости растений к низким температурам, определяемые экспрессией регулируемых холодом генов, могут быть обусловлены разным набором генов, относящихся к CBF-регулону, которых у теплолюбивых растений обнаруживается меньше, чем у растений, способных к холодовой акклимации, или отличиями в строении промоторных областей COR (co\d-

/-espons¡ve)-reHOB по количеству содержащихся в них CRT/DRE мотивов (Jagio et al., 2001; Zhang et al., 2004; Zhang et al., 2011). Известны и другие механизмы регуляции экспрессии генов, в частности, обусловленные изменениями конформации хроматинового комплекса за счет обратимой конверсии транскрипционно активного эухроматина в транскрипционно неактивный гетерохроматин, различающиеся степенью метилирования цитозина в симметричных CG и CNG последовательностях, а так же в несимметричной CNN последовательности, степенью ацетилирования гистонов и плотностью упаковки хроматина, что меняет доступность хроматина для РНК-полимераз (Bird, 2002).

Известно, что метилирование ДНК находится под контролем различных биотических и абиотических факторов, влияющих на рост и развитие растений. Например, установлено, что внешние воздействия вызывают деметилирование целого ряда цитозинов как в промоторных областях, так и в кодирующих последовательностях генов (Sherman, Talbert, 2002; Madlung, Cornai, 2004; Чемерис и др., 2007; Choi, Sano, 2007; González et al., 2011). Что касается холодового стресса, показано, что длительное охлаждение корней сои приводило к увеличению доли гетерохроматина и уменьшению доли эухроматина (Stepinski, 2012). Также было обнаружено, что холодовая обработка проростков кукурузы сопровождается общим снижением степени метилирования ДНК (Steward et al., 2002). Однако изменения уровня метилирования отдельных генов в связи с развитием устойчивости к холодовому воздействию изучены недостаточно.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы - выяснение механизмов регуляции экспрессии и уровня метилирования генов транскрипционных факторов CBF у растений капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи: 1. Определить нуклеотидные последовательности промоторных областей генов CBF капусты.

2. Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов СВР капусты, рапса, арабидопсиса и др.

3. Определить уровень экспрессии генов СВР закаленных и незакаленных растений в норме и при холодовом стрессе.

4. Определить характер и степень метилирования промоторных последовательностей генов СВР растений, выращенных в нормальных температурных условиях, при пониженной температуре, а также после снятия низкотемпературного стресса.

Научная новизна. Изучена экспрессия гена транскрипционного фактора СВР капусты, являющегося ключевым элементом в запуске механизма развития устойчивости растений к холодовому стрессу, в нормальных температурных условиях, при холодовом стрессе и при закаливании. Исследована степень метилирования цитозинов в промоторном участке гена СВР капусты у проростков, прошедших и не прошедших этап закаливания. Обнаружено, что у растений, прошедших этап холодового закаливания, происходит уменьшение степени метилирования последовательности ДНК промотора. Исследовано изменение статуса метилирования промоторной области гена СВР капусты после окончания цикла закаливания и показано частичное восстановление метилирования в ранее деметилированных участках промоторной области этого гена.

Полученные нами данные углубляют представления о процессах восприятия растениями холодового сигнала окружающей среды.

Научно-практическая значимость работы. Знание молекулярных механизмов развития холодостойкости и закаливания растений, а также выяснение возможной роли процессов метилирования/деметилирования в активации регулируемых холодом генов, может послужить основой для развития новых стратегий усиления холодостойкости и увеличения продуктивности, а также расширения области возделывания сельскохозяйственных культур.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VII съезде Общества физиологов растений (Нижний Новгород, 2011), II и III школе-конференции молодых ученых Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011; 2012), III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологии, экологии и химии» (Запорожье, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из перечня ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 220 наименований, в том числе 195 работ иностранных авторов. Работа изложена на ПО страницах и содержит 14 рисунков и 3 таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования являлись растения цветной капусты Brassica oleráceo L. В работе были использованы следующие экспериментальные условия (Таблица 1).

Таблица 1

Условия проведения экспериментов

Группа Условия П| зоизрастания

Температурный режим Фаза роста и длительность

I. Нормальные температурные условия 24°С Стадия 4-го листа

II. Нормальные температурные условия/холодовой стресс 24°С Стадия 4-го листа

1°С 0,5-3 часа

III. Нормальные температурные условия/закаливание/холодовой стресс 24°С Стадия 4-го листа

7-8°С 7 суток

1°С 0,25-24 часа

IV. Нормальные температурные условия/закаливание/нормальные температурные условия 24°С Стадия 4-го листа

7-8 °С 7 суток

24°С 14 суток

Высокомолекулярную ДНК из растений выделяли фенольно-детергентным методом по Грехему (Graham, 1978). РНК из растений выделяли реагентом Trizol по рекомендациям фирмы-изготовителя (Invitrogen, США). кДНК получали с помощью набора, содержащего обратную транскриптазу M-MLV (Силекс, Россия). Ппазмидную ДНК получали методами мягкого лизиса (Clewell, Helinski, 1969), быстрого щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979) и с помощью наборов для выделения плазмидной ДНК (Цитокин, Россия) по протоколу фирмы-изготовителя. Подготовку и трансформацию компетентных клеток проводили по методике Коэн (Cohen, 1972). Аналитический гель-электрофорез проводили в 1-2%-х агарозных или в 10-15%-х полиакриамидных гелях. Элюцию ДНК из агарозных гелей проводили с использованием набора для очистки ДНК (Цитокин, Россия). Оценку степени метилирования ДНК проводили по методу бисульфитной конверсии с помощью наборов EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, США) и MethylCode Bisulfite Conversion Kit (Invitrogen, США) по протоколам фирм-производителей. Изменения уровня метилирования анализировали с помощью программы СуМАТЕ (Hetzl J. et al., 2007). Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводили на автоматическом секвенаторе Genome-Lab фирмы Beckman Coulter (США). Сравнение нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы Megalign из пакета программ Lasergene фирмы DNASTAR Inc. (США). Поиск возможных сайтов связывания транскрипционных факторов проводили с помощью программы PLACE (Higo et al, 1999; Prestridge, 1991). ПЦР проводили со стандартным набором реагентов в приборах МС2 (ДНК-Технология), ПЦР-РВ - с использованием TaqMan проб на приборе iCycler iQ5 (В io-Rad Laboratories, США). Среднее арифметическое значение уровня экспрессии 3-х независимых экспериментов и стандартную ошибку среднего (SEM) находили с помощью модуля описательной статистики в программе Statistica 6.1 (StatSoft. Inc.). Сравнение

7

экспериментальных групп проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента для зависимых выборок (п = 3, р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 1. Определение нуклеотидной последовательности гена CBF капусты

Фрагмент гена CBF капусты, включающий в себя 5'-транскрибируемый участок, а также прилегающую к нему промоторную область, амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя праймеры, соответствующие аналогичным последовательностям арабидопсиса. Полученный фрагмент ДНК капусты клонировали в векторе pAL-TA (Евроген, Россия) и определяли нуклеотидную последовательность. Сравнение нуклеотидной последовательности этого фрагмента CiiF-гена цветной капусты с имеющимися в GenBank нуклеотидными последовательностями С&Р-подобных генов капусты, а так же с последовательностями генов CBF близкородственных растений, таких как Brassica napus, Brassica гара и Arabidopsis thaliana, показало, что данные последовательности имеют высокую степень гомологии с последовательностью гена CBF цветной капусты: 98% с последовательностью рапса; 76% с последовательностью репы; 77% с последовательностью гена CBF1 арабидопсиса; 77% с последовательностью гена CBF2 арабидопсиса; 77% с последовательностью гена CBF3 арабидопсиса (Рисунок 1).

BoCBF ------BMGTGGTCWE

BnCBF r^wkrtcägtctctäctttttctgaacttcttggctcrgagaac<3agtctccgg-------taggtggtcat

BrCBF ---TTÄAGCGGGEÄG

AtCBFl ^^CTCÄTTTTCAGCTT^TCTGRte^ ---------ÄGGCGGAGÄT

AtCBF2 ЙКйШСТЕЖТбТ^ОСТЭТИ^^ AtcBF3 йтсШАсттгтапйсгттст^

BoCBF sai^tecaTGTTi^GjKGÄGCTG'^

BrCBF ТА ПГСТСС- A' GCTGCCCGCai«CTGK«3AAGAAftCC: GCGGGT; GGÄÄGBAGTTTCGGGAGßC «СТСЛС

AtCBFl ЩтЙЙ^СЩЗТШ^С^^

AtCBF2

AtCBF3 TOTATiabCAC^fTlkGAGCRG^C^

восв f

BnCBF СССАТТта<Х(^«ЗАСУгеСЖсрТгг^^ BrCBF Сф\И?таДСАЙАё^^ AtCBFl (ЗЁАЩ'таЙАЕаЖ^

AtcBF2 ¿x^MTiatiAGaGra^^

AtcBF3

BoCBF jTCtAi^KTO^ BrCBF

AtCBF2 АЙзрШЙсЩ^Шс^^

AtcBF3 дсж&йзйт^!^^ к® а шсет'тс состтга

BoCBF ctct:gtgg^sggc<xct©xt^ BnCBF CTCO^i/feRGGCGCCTGCCT^^ BrCBF

AtCBFl ctccg^cc^tcagc^

AtCBF2

AtcBF3 ЩШШсс^тсаЩзЩт!^^ BoCBF

BnCBF ШШШаШтЙШШШ^сстНгеИ BrCBF

AtCBFl (зйошШйШ^ AtcBF2

AtCBF3 WfflfflHfflffi'lflWHff

Рисунок 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов CBF различных видов растений (BoCBF - капусты; BnCBF - рапса; BrCBF - репы; AtCBFl, AtCBF2, AtCBF3 - арабидопсиса).

Выведенные аминокислотные последовательности также имеют большое сходство, включая наличие последовательности, кодирующей домен AP2/EREBP (Рисунок 2). Стоит отметить, что консервативные участки PKKPAGR, АР2 и DSAWRL (Medina, 1999), по наличию которых гены относят к CBF подсемейству, совпадают.

BoCBF ^rovs»"3^LbGSBNteS£]—VGGDYCEMLnaSCPKKPaaRKKFREiBHP BnCBF MNS 4' STFSELM5SENESP|—VGGDYCPf.' / PACUKKFRETRHP

BrCBF MBSFSTSSEMb Ш'зЕМ^к ' i KKSBEIRHP

AtcBFi —

AtCB F2 KSOcjsAffSBK FggDYES^VSSjGGtr/SBKJ^TSCPKKPftORKKraBTRBP AtCBF3

_ _ДЕ2.___,

BoCBF lYRGVRi. laOVmftbMR

BnCBF к VHGVRLRKSGKWyCEVREPUKKSRIWLGTI- KTfiEtiteRAHDVaM,?. 3jR BrCBF IVRGVRI. KSBIKbGJ^L; ШДО&АХ&ЬЗ

AtCBFl iVRGVRQ. n K" FtmbGIFOTABMAftRMDVAAIAIiR

AtCBF2 'IXRGVRQRHSGKWO нт^шаегтотдаш^шютаАзаьа

AtCB F3 IVRGVJ^RtoSGK№?CEVW3OTKETRiraiGOTQ^£EMbMiaSDVaaiiabR

DSAWRL

BoCBF GRGÜClUB'ÜDSÄWRLRIPETTCAKDIQKaAaEAAL BnCBF GRGACLNFADSAWRLRIPETTCAKDIQKAAAEÄAL BrCBF GK S ЙСИЗИШаПИВЫ! IРЕТГСP KBIQKAAAEÄAV AtCBFl GRSACXNFADSAWRLRIPESTCAKDIQKAAAEAAL AtCBF2 GRSACLfJFÄDSAWRLR XPE3TC AKEIQKAЙЙЕААЬ AtCBF3 GRSACbNFADSABRLRIPESTCAKOIQKAAAEAAL

Рисунок 2. Сравнение аминокислотных последовательностей, кодируемых генами CBF (BoCBF - капусты; BnCBF - рапса; BrCBF - репы; AtCBFl-З -арабидопсиса). Сплошной линией отмечен AP2/EREBP домен, скобками -консервативные последовательности NLS, DSAWRL.

Сравнение 5'-участка клонированного фрагмента ДНК растений капусты с промоторными областями генов CBF арабидопсиса и некоторых растений рода капустных (Brassica): рапса, репы, а также теллунгиеллы солонцовой (Thellungiella salsuginea), показало различную степень гомологии между ними, а у арабидопсиса наибольшее сходство с данным фрагментом гена CBF капусты имеет промотор гена CBF2 (Рисунок 3).

BoCBF BllCBF BrCBF CTTj TsCBF !®CTI

S-TAT

тс,стссАтбтт'сс-осйсснс,- - - езюаслайгайй-жат ----- ..„^Д^ЬС&щи^А!^^

а1:свр |статнсттсаисасй|а-асаса^та|§т-ат^

ВоСВГ рв-^атсайбс-----САОСАСАСАСААСаС^-<5М,СТТСТТАСТОГАСТ?АТАСТАС---АСХС

впсвр ст->г&тсАаАС-----

вгсве ст-яатсдаасэ-----сассасасасаасал^-б 1'гастаастатаста£;тАс^стс

тзсвг ттс^йзссййя'аа----||сАтсАсв|Ьссм1|тст|трАсстА-----С^М----ТТ^ААС

аг.св? т1-атсатассатасааааааа0аслсдаатстт гс гаст!раст---СТА :тстса7лаааас

восвр ^ессттатссастататс,-

впсве абссттАтссАстт,тс|- - -йдадсаАСТОТсаасЕ-

т8свр стта^сса0тттдс|саааащ5рётт^с||тттйсттааасатсаааа atcbf сттд^ссабтттощзаа—асйсастастсттстеахсла-----------

Рисунок 3. Сравнение нуклеотидных последовательностей промоторов генов СВР различных видов растений (ВоСВР -капусты; ВпСВР - рапса; ВгСВР -репы; А1СВР2 - гена СВР2 арабидопсиса; ТэСВР - теллунгиеллы солонцовой).

Так, гомология промоторной последовательности гена СВР капусты составляет 79% с последовательностью промотора рапса; 97% с последовательностью промотора репы; с последовательностями

10

теллунгиеллы солонцовой и арабидопсиса гомологии значительно меньше. При этом промотор арабидопсиса оказался протяженнее на 5 п.н. по сравнению с промоторами растений рода капустных, а промотор теллунгиеллы солонцовой - на 17 п.н. В следующей серии экспериментов (прямой праймер соответствовал известным промоторам гена CBF близкородственных растений, обратный соответствовал полученной нами последовательности гена капусты) получен клон, включающий более протяженный фрагмент промотора гена CBF, составляющий 457 п.н. и имеющий высокую гомологию (99%) с промоторной последовательностью гена CBF репы (Рисунок 4).

BrcBF шН11т11й|И

bocbf BrcBF

BoCBF BrCBF

BoCBF BrcBF

bocb f aa^gägagßaataaata'rct*riöcaa!^cca^vcflgaac/ui^ätcttgltacl'1'ac татастас - - -ftcs

BrcBF пвтрпвшиишйй^е^

BoCBF СЙСОСтеаШЙ^^

BrcBF сгййлщкШЙ!ЩШШЙЙШЗДЙ&СС

Рисунок 4. Сравнение промоторной области гена CBF капусты и промоторной области CBF репы (BoCBF - промоторная область гена CBF капусты; BrCBF - репы).

Таким образом, клонированный фрагмент ДНК включал в себя 5'-транскрибируемый участок гена CBF капусты длиной 401 п.н., а также прилегающий к нему участок промоторной области длиной 457 п.н.

2. Экспрессия гена CBF растений капусты при холодовом стрессе Определение уровня экспрессии гена транскрипционного фактора CBF капусты при низкотемпературном стрессе проводили методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan

зондов. Результаты показали, что уже через полчаса после экспозиции растений при низкой температуре экспрессия гена САР повышается в 13-14 раз относительно контроля, через час она достигает своего пика, превышая значение контроля в 50-70 раз (Рисунок 5). После этого уровень экспрессии гена СВР постепенно снижается, но даже через 3 часа остается на уровне, значительно превышающем контрольные показатели.

время, ч

Рисунок 5. Изменение уровня экспрессии гена СВР растений капусты при низкотемпературном стрессе. Все различия статистически достоверны (п=3, р<0,05). Значения для каждого промежутка времени представлены в виде среднего ариф м етического±стандартная ошибка среднего. Процент активации рассчитывали по отношению к контролю, который принимали за 100 % (пунктирная линия).

3. Изменение уровня экспрессии гена СВР капусты при закаливании растений

Известно, что холодовое закаливание значительно повышает устойчивость растений к низким температурам. Учитывая значение генов СВР в активации генов холодового ответа, представляло интерес выяснение вопроса о том, как влияет закаливание на экспрессию генов СВР.

Определение уровня экспрессии гена транскрипционного фактора СВР капусты у закаленных растений проводили так же, как и в случае незакаленных растений. Растения, выращенные в климатокамере при 22°С, переносили в камеру с положительной температурой (7-8°С) и закаливали таким образом в течение недели. Затем растения переносили в

термостатированный бокс, охлажденный до 1°С, и выдерживали при данной температуре до суток. Экспрессию гена оценивали через 15 мин, 30 мин, 1, 2, 3,9, 12 и 24 час.

Уровень мРНК гена СВР закаленных растений сравнивали с уровнем мРНК гена СВР двух контрольных групп: первая - растения, прошедшие этап холодового закаливания, но не подвергавшиеся низкотемпературному стрессу; вторая — незакаленные контрольные растения, так же не подвергавшиеся воздействию низкой температуры. Было установлено, что у растений из первой контрольной группы экспрессия СВР превышает таковую у растений из второй группы в 3,5 раза (Рисунок 6), то есть закаливание повышает активность транскрипции мРНК гена СВР у растений.

а 6000-1

вреїчя, і

Рисунок 6. Изменение уровня экспрессии гена СВР закаленных растений капусты при низкотемпературном стрессе. Все различия статистически достоверны (п=3, р<0,05). Значения для каждого промежутка времени представлены в виде среднего арифметического±стандартная ошибка среднего. Процент активации рассчитывали по отношению к контролю, который принимали за 100 % (пунктирная линия).

При сравнении с первой контрольной группой было зафиксировано ожидаемое повышение уровня экспрессии гена СВР. Так, через 15 минут после воздействия холодового стресса количество мРНК увеличилось в 4 раза, а через полчаса - достигло 30-40-кратного превышения относительно контрольной группы и находилось на этом уровне в течение трехчасового стрессового воздействия. После 3-хчасового содержания растений в таких

условиях наблюдалось постепенное понижение уровня экспрессии данного гена: через 12 часов количество мРНК превышало контрольный уровень в 10 раз, спустя сутки в 3 раза (Рисунок 6).

Относительно контрольной группы, представленной незакаленными растениями, значения экспрессии мРНК гена СВР у закаленных растений были заметно выше. Как упоминалось ранее, содержание мРНК гена СВР у закаленных растений было в 3,5 раза больше, чем у незакаленных растений. Уже через 15 минут после низкотемпературного стресса содержание мРНК СВР у закаленных растений повышается в 14 раз, а через полчаса превышает контроль в 135 раз, оставаясь на этом уровне в течение 1-2 часа. Через 3 часа начинается постепенное понижение содержания транскрипта и через 24 часа уровень экспрессии превышает контрольную отметку в 11 раз (Рисунок 7).

время, ч

Рисунок 7. Изменение уровня экспрессии СВР гена закаленных растений капусты при низкотемпературном стрессе (относительно незакаленного контроля). Все различия статистически достоверны (п=3, р<0,05). Значения для каждого промежутка времени представлены в виде среднего арифметического±стандартная ошибка среднего. Процент активации рассчитывали по отношению к контролю, который принимали за 100 % (пунктирная линия).

Сопоставление уровня экспрессии генов СВР и ростовых процессов, как интегральных показателей функционирования растений и реализации генетической информации, позволяет хотя бы косвенно судить о защитной роли накопления соответствующих мРНК при холодовом стрессе. Для

проведения опыта по сопоставлению ростовых показателей незакаленных и закаленных растений после холодового стресса проростки в фазе 4-х листьев были разделены на 2 группы по 20 штук. Одна группа проростков прошла стадию закаливания при 7°С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 15 клк в течение 7 суток, другая группа проростков не закаливалась. Затем обе группы проростков были подвергнуты холодовому стрессу при температуре около 1°С в течение 1 суток, после чего были перенесены в климатокамеру с нормальной температурой выращивания. У данных растений через каждые сутки измеряли прирост биомассы отдельных проростков и использовали по несколько растений для выделения РНК и определения уровня мРНК гена СВР.

Рисунок 8. Изменение массы и выживаемость закаленных и незакаленных растений после низкотемпературного стресса. Все различия статистически достоверны (п=3, р<0,05).

Результаты показали, что растения, прошедшие этап холодового закаливания, значительно лучше перенесли низкотемпературный стресс, возвращаясь через сутки к положительной динамике прироста биомассы. Незакаленные проростки достигли исходной массы только через 4 суток роста при нормальной температуре выращивания и лишь на седьмые сутки после стресса значения прироста закаленных проростков и незакапенных выровнялись (Рисунок 8).

Выживаемость закаленных растений после стресса так же была выше. В течение двух недель после 24 часов низкотемпературного воздействия среди незакаленных растений выжило 58%, а среди закаленных 73%.

При этом содержание мРНК гена CBF у закаленных растений превышало данный показатель у незакаленных растений (Рисунок 7). Сопоставление параметров выживаемости, прироста биомассы с динамикой содержания мРНК гена CBF позволяет предположить, что, вероятно, наряду с другими приспособительными реакциями, повышающими адаптацию растений капусты к холоду, уровень экспрессии генов CBF также является фактором, способствующим защите растений от холодовых повреждений.

4. Степень метилирования ДНК промоторной области гена CBF цветной капусты Brassica oleracea L. при различных температурных условиях выращивания

Известно, что у высших растений ДНК в значительной степени метилирована по остаткам цитозина. Глобальное метилирование ДНК видо-, ткане-, органоспецифично, оно изменяется при прорастании семян, переходе растений к цветению (Ванюшин, 2009). Метилирование ДНК может существенно модулироваться различными биотическими и абиотическими факторами, влияющими на рост и развитие растений (Ванюшин, 2009).

Детекция метилированных цитозинов в промоторной и кодирующей последовательностях гена CBF проводилась методом бисульфитной конверсии с помощью специализированных наборов по протоколам фирм-производителей.

В предварительном опыте было показано, что в клонированном фрагменте гена CBF более половины (70 из 130) из всех цитозинов при бисульфитной обработке ДНК конвертировались в тимин, следовательно, в исходной ДНК это были неметилированные цитозины (Рисунок 9).

2 CAGCAGCCATACCACAAAGGTCAAGATGACACGTGGCAGCATATAAGTGA -310

2 TAGTAGTTATATTATAAAGGTTAAGATGATATGTGGTAGTATATAAGTGA -310

1 ATGAAAACAACGCATTCACACAAACCGTGGGATGATCAATTTAGCTGTGT -26 0

2 ATGAAAATAATGTATTTATATAAATTGTGGGATGATTAATTTAGTTGTGT -260

16

1 CGTGTCCACTTGGCACTCCGAGAGCCAAAAAAACACCGTGTTCTTTTCTA -210

2 CGTGTCCACTTGGCACTCCGAGAGCCAAAAAAACACCGTGTTCTTTTCTA -210

1 AAATCCAGCCCCACCCATTTCCAAATATCTCATGCCAATATAAACACCAA -16 0

2 AAATCCAGCCCCACCCATTTCCAAATATCTCATGCCAATATAAACACCAA -16 0

1 CTCTCGCTCCACTTTTCTCAAACCACAAACTTTTAACTCCACCTGAAAAG -110

2 CTCTCGCTCCACTTTTCTCAAACCACAAACTTTTAACTCCACCTGAAAAG -110

1 AAGATAAAAGAGAGAGAAATAAATATCTTATCAAACCAGACAGAACAGAG - 6 0

2 AAGATAAAAGAGAGAGAAATAAATATCTTATCAAACCAGACAGAACAGAG -60

1 ATCTTGTTACTTACTATACTACACTCAGCCTTATCCAGTTTTCAAAAGAA -10

2 ATCTTGTTACTTACTATATTATATTTAGTTTTATTTAGTTTTTAAAAGAA - 10

1 GTTTCAACTATGAACTCAGTCTCTACTTTTTCTGAACTTCTTGGCTCTGA +41

2 GTTTTAATTATGAATTTAGTTTTTATTTTTTTTGAATTTTTTGGTTTTGA +41

1 GAACGAGTCTCCGGTAGGTGGTGATTACTGTCCCATGTTGGCGGCGAGCT +91

2 GAATGAGTTTTTGGTAGGTGGTGATTATTGTTTTATGTTGGTGGTGAGTT +91

1 GTCCGAAGAAGCCGGCGGGTAGGAAGAAGTTTCGGGAGACACGTCACCCC +141

2 GTTTGAAGAAGTTGGTGGGTAGGAAGAAGTTTTGGGAGATATGTTATTTT +141

1 ATTTACCGAGGAGTTCGCCTTAGAAAATCAGGTAAG +177

2 ATTTATTGAGGAGTTTGTTTTAGAAAATTAGGTAAG +177

Рисунок 9. Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагмента гена CBF в исходной ДНК из растений капусты, растущих в нормальных температурных условиях, до бисульфитной обработки (1) и после бисульфитной обработки (2). Метилированные нуклеотиды отмечены красным цветом. Курсивом выделен старт инициации транскрипции.

В исследуемой последовательности ДНК неметилированными оказались остатки цитозинов, локализованных в диапазоне примерно до -262 и после -41 положений. При этом часть цитозиновых остатков, как в сайтах CG, CNG, так и в сайтах CNN, при бисульфитной обработке ДНК незакаленных растений остались неизменными, что указывает на то, что в исходной ДНК они были метилированы. Наибольшее количество таких метилированных цитозинов (60) обнаруживалось во фрагменте промотора, ограниченном положениями -261 и -40.

Уровень метилирования цитозинов в клонированных фрагментах ДНК промоторов гена CBF, ограниченных положениями -261 и -41, растений капусты, прошедших и не прошедших этап холодового закаливания, в сравнении с нуклеотидной последовательностью ДНК без бисульфитной

17

обработки, приведен в Таблице 2.

Таблица 2

Содержание метилированных цитозинов в гене СВР растений капусты,

выращенных в различных температурных условиях

Позиция иуклеотида Степень метилирования гена СБЕ у растений капусты (%)

без закаливания прошедших стадию закаливания перенесенных в нормальные условия роста после закаливания

-234 100 42,86±2,86 77,27±2,73

-216 100 80,95±0,95 100

-204 100 66,67±6,67 100

-203 100 71,43±1,43 100

-200 80±1,5 0 100

-199 80± 1,5 0 0

-198 80±1,5 0 0

-197 80±1,5 0 95,45±4,55

-195 100 0 0

-194 100 0 100

-193 100 19,05±0,95 100

-178 100 90,48±0,48 100

-158 70±1,5 80,95*0,95 100

-156 100 76,19±6,19 100

-152 100 80,95±0,95 100

-150 100 80,95±0,95 100

-136 100 80,95±0,95 100

-73 100 71,43±1,43 100

-63 100 80,95±0,95 100

-49 100 90,48±0,48 100

Можно отметить, что содержание метилированных и неметилированных цитозинов в ДНК закаленных и незакаленных растений незначительно отличалось. В различных клонах при закаливании деметилируются от 7 до 12 цитозиновых остатков, метилированных в исходной ДНК. При этом 6 цитозинов в положениях -200... -197 и -195, -194 были деметилированы во всех исследованных клонах.

Следующим этапом работы было выяснение вопроса о сохранении статуса метилирования ДНК у растений, прошедших этап холодового закаливания, а затем перенесенных для выращивания в нормальные

температурные условия. Оказалось, что экспрессия генов CBF у таких растений была на уровне контрольных растений до холодового закаливания, а содержание метилцитозинов в промоторной последовательности гена CBF близко к первоначальному уровню, обнаруживаемому в незакаленных растениях (Таблица 2). Из 20 CG, CNG и CNN сайтов, обнаруживаемых во фрагменте ДНК промотора от -261-го до -42-го нуклеотида после холодового закаливания проростков, 3 деметилировались полностью, 1 - частично. Таким образом, содержание метилцитозинов-в рассматриваемом фрагменте последовательности ДНК промотора гена CBF, снижающееся у растений, прошедших этап холодового закаливания, при снятии стрессовых условий приближается к исходному уровню.

Клонированную нами промоторную последовательность гена CBF

капусты сравнивали с промоторами генов растений арабидопсиса с целью

выявления в них сайтов связывания транскрипционных факторов, возможно,

влияющих на экспрессию исследуемого нами гена. Было обнаружено 6

мотивов также встречающихся в промоторах генов CBF арабидопсиса. Среди

них три MYC мотива, два MYB и один 1СЕг2 (Рисунок 10).

-4 50 TTAATAGATAAATACAGAGTTGTCCTGCTCAACCCATACATAGCCACACAT -4 01 -4 00 TCACCCAGTACAAGTTAAAACACATAAAAGTATAACGAGTGAAGAGTCAGC -351 -3 50 AGCCATACCACAAAGGTCAAGATGACACGTGGCAGCATATAAGTGAATGAA -301 -3 00 AACAACGCATTCACACAAACCGTGGGATGATCAATTTAGCTGTGTCGTGTC -2 51 -250 CACTTGGCgTCCGAGAGCCAAAAAAACACCGTGTTCTTTTCTAAAATCCA -201 -200 GCCCCACCCATTTCCAAATATCTCATGCCAATATAAACACCAACTCTCGCT -151 "ISO CCACTTTTCTCAAACCACAAACTTTTAACTCCACCTGAAAAGAAGATAAÄÄ -101 -100 GAGAGAGAAATAAATATCTTATC^AACCAGACAGAACAGAGATCTTGTTAC -050 -04 9 TTACTATACTACACTCAGCCTTATCCAGTTTTCAAAAGAAGTTTCAACT -001

Рисунок 10. Возможные сайты связывания транскрипционных факторов в промоторной области гена CBF капусты. Желтым цветом выделены MYC мотивы (CANNTG); синим цветом - MYB мотивы (WAACCA); зеленым -мотив ICEr2 (ACTCCG). Метилированная область промотора подчеркнута.

Большинство из мотивов, с которыми могут связываться транскрипционные факторы, находятся в метилированной области промотора. Мотивы MYC и ICEr2 (Chinnusamy et al., 2003; Zarka et al., 2003) схожи с таковыми у генов CBF арабидопсиса, у которого они узнаются

транскрипционным фактором ICE (Inducer of CBF expression) -положительно регулирующим экспрессию CBF. Мотивы MYB так же обнаруживаются в промоторных последовательностях арабидопсиса, с этими мотивами связывается белок MYB15, что приводит к снижению экспрессии гена CBF (Agarwal et al., 2006). Интерес представляют три цитозина — первый из них (нуклеотид в положении -234) находится в непосредственной близости к 1СЕг2 сайту связывания, этот нуклеотид деметилируется более чем у половины закаленных растений (57% изученных клонов), а так же это один из 4 цитозинов, который в ряде клонов остается деметилированным после: : переноса растений в нормальные температурные условия произрастания (23% клонов). Два других цитозина, которые могут представлять интерес - находятся в MYB сайтах, они так же, хоть и с меньшей частотой, частично деметилируются при закаливании (19% клонов в положении -136 и -73, соответственно).

Таким образом, можно отметить, что кодирующая часть исследуемого гена свободна от метилированных оснований, однако его промоторная область имеет метилированный участок. Большинство метилированных цитозинов остаются таковыми вне зависимости от температурных условий, в которых выращивалось растение. Однако, часть из них все же деметилируется при закаливании. Из шестидесяти метилированных нуклеотидов, в той или иной мере деметилируется двадцать. Девятнадцать из них - это цитозины, расположенные в ассиметричной последовательности CNN.

Наибольший уровень деметилирования при закаливании растений наблюдается в центре данного метилированного участка. В положениях от -200 до -194 все цитозины теряют метальную группу во всех исследованных нами клонах, а нуклеотид в положении -193 остается метилированным лишь в 20% случаях, в то время как в остальных положениях деметилирование носит частичный характер и метилированный цитозин обнаруживается в 7090% клонов.

Так же стоит отметить, что большинство цитозинов, утрачивающих метальную группу в ходе холодового закаливания, возвращаются в исходное состояние, если растение перенести в благоприятные условия произрастания (Рисунок 11).

Рисунок 11. Частота метилирования цитозинов в промоторе гена CBF капусты. 1 - растения, выращенные в нормальных температурных условиях; 2 - растения, прошедшие стадию холодового закаливания; 3 - растения, перенесенные в нормальные температурные условия после этапа закаливания.

Результаты исследований, представленные в данной работе, показали, что последовательности ДНК промотора гена CBF, у которых степень метилирования понизилась при закаливании, становятся более метилированными при переносе растений в благоприятные условия роста. Механизм данного процесса пока неясен и может быть предметом дальнейших исследований. В этой связи можно отметить действующую у растений систему метилтрансфераз и гликозилаз DME/ROS1, обеспечивающих обратимое деметилирование/метилирование

соответствующих последовательностей ДНК (Gong et al., 2002; Gehring et al., 2006) и способствующих адаптации к условиям среды (Матцке, Шеид, 2010). Можно предположить, что, возможно, деметилирование цитозинов в метилированной области промотора гена CBF капусты приводит к активации экспрессии этого гена при холодовой акклимации.

Выводы

1:<Впервые клонирован фрагмент гена CBF капусты протяженностью 858 пар нуклботидов, включающий промоторную область и транскрибируемую часть. Выявлена высокая гомология клонированной последовательности с CBF генами близкородственных видов растений (арабидопсис, репа, рапс и др.).

2. Показано, что экспрессия гена CBF капусты индуцируется холодом, превышая исходный уровень в несколько десятков раз в течение тридцати минут после холодового стресса. Установлено, что экспрессия гена CBF у растений, прошедших этап холодовой акклимации, носит значительно более интенсивный и долговременный характер по сравнению с экспрессией этого гена у растений без холодового закаливания.

3. В промоторной части гена CBF капусты обнаружена метилированная область, включающая в себя 60 метилированных цитозинов. Показано

.. отсутствие метилцитозинов в 5'-транскрибируемом участке данного гена.

4. Сравнение степени метилирования цитозинов в промоторном участке гена CBF у растений капусты, прошедших стадию холодовой акклимации, и у растений, выращенных в нормальных температурных условиях, показало, что закаливание приводит к частичному деметилированию в обнаруженной нами метилированной области.

5. При сравнении степени метилирования цитозинов в промоторной области гена CBF закаленных растений и растений, помещенных в нормальные температурные условия после закаливания, обнаружено, что при снятии стрессовых температурных условий часть деметилированных в процессе закаливания последовательностей промоторной области исследуемого гена метилируется вновь.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Гималов, Ф.Р. Экспрессия CSF-подобного гена цветной капусты (Brassica Oleracea L.) при холодовом стрессе / Ф.Р.Гималов, Д.С.Фарафонтов, Д.А.Чемерис, Р.Т.Матниязов, А.В.Чемерис // Агрохимия. - 2011. - № 11. - С. 71-77.

2. Гималов, Ф.Р. Изменение степени метилирования ДНК промоторной области CßF-гена капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации / Ф.Р.Гимапов, Д.С.Фарафонтов, Д.А.Чемерис, Р.Т.Матниязов, А.В.Чемерис // Вестник Башкирского университета. 2012. - Т. 17, № 1. - С. 82-85.

3. Гималов, Ф.Р. Степень метилирования ДНК промоторной области CßF-гена капусты Brassica oleracea L. при различных температурных условиях выращивания / Ф.Р.Гимапов, Д.С.Фарафонтов, Р.Т.Матниязов, А.В.Чемерис // Вестник Башкирского университета. 2012. - Т. 17, № 4. - С. 1749-1752.

4. Гималов, Ф.Р. Холодовая регуляция экспрессии CßF-подобного гена капусты Brassica oleracea L. / Ф.Р.Гимапов, Д.С.Фарафонтов, Д.А.Чемерис, Р.Т.Матниязов, А.В.Чемерис // Материалы VII Съезда Общества физиологов растений России. Нижний Новгород. - 2011. - С. 183.

5. Фарафонтов, Д.С. Изменение степени метилирования ДНК промоторной области CBF-гена капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации / Д.С.Фарафонтов, Д.А.Чемерис, Р.Т.Матниязов // II Всероссийская школа-конференция молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века». Уфа. - 2011. - С. 127.

6. Фарафонтов, Д.С. Влияние низкой температуры на степень метилирования ДНК промоторной области CBF-гена капусты Brassica oleracea L. / Д.С.Фарафонтов, Р.Т.Матниязов, Ф.Р.Гимапов // Материалы III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологии, экологии и химии». Запорожье. - 11-13 мая 2012 г. - С. 54-55.

7. Фарафонтов, Д.С. Зависимость степени метилирования ДНК промоторной области CÄF-гена капусты Brassica oleracea L. от температурных условий выращивания / Д.С.Фарафонтов, Р.Т.Матниязов, Ф.Р.Гимапов, А.В.Чемерис // II Всероссийская школа-конференция молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века». Уфа. -2012.-С. 110.

?

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+», заказ № 341, тираж 100. 450054, пр. Октября, 71.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фарафонтов, Дмитрий Сергеевич, Уфа

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра

Российской академии наук

МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ CBF У РАСТЕНИЙ КАПУСТЫ BRASSICA OLERACEA L. ПРИ ХОЛОДОВОЙ АККЛИМАЦИИ

03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

04201358860

Фарафонтов Дмитрий Сергеевич

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Гималов Фуат Рамазанович

Уфа - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................... 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................................................8

1.1. Адаптация растений к низкотемпературному стрессу............................................................................9

1.2. Регуляции экспрессии генов при холодовом стрессе................................................................................17

1.3. Статус метилирования ДНК растений и устойчивость к стрессовым

факторам среды..................................................................................................................................................................................................................26

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................................................................34

2.1. Объекты исследования............................................................................................................................................................34

2.2. Выделение и очистка ДНК растений................................................................................................................34

2.3. Выделение и очистка РНК растений..............................................................................................................................36

2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК....................................................................................................................37

2.5. Выделение ДНК из бактерий........................................................................................................................................................39

2.6. Аналитический гель-электрофорез ДНК....................................................................................................39

2.7. Препаративный гель-электрофорез и элюция ДНК..............................................................................40

2.8. Подготовка компетентных клеток E.coli..................................................................................................................41

2.9. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК............................42

2.10. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом........................43

2.11. Синтез кДЖ........................................................................................................................................................................................................43

2.12. Полимеразная цепная реакция................................................................................................................................43

2.13. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени..........................................45

2.14. Оценка степени метилирования ДНК......................................................................................................................46

2.15. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей......................................46

2.16. Статистическая обработка данных................................................................................................................................47

2.17. Реактивы и материалы..........................................................................................................................................................47

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ............................51

3.1. Определение нуклеотидной последовательности гена CBF капусты....................51

3.2. Экспрессия гена CBFкапусты при холодовом стрессе..................................................................58

3.3. Изменение уровня экспрессии гена CBF капусты при закаливании

растений..................................................................................................................... 60

3.4. Изменение степени метилирования ДНК промоторной области гена CBF капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации.................................... 65

3.5. Степень метилирования ДНК промоторной области гена CBF капусты Brassica oleracea L. при различных температурных условиях

выращивания..........................:.................................................................................. 71

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................... 82

Выводы...................................................................................................................... 85

Список сокращений и условных обозначений................................................ 86

ЛИТЕРАТУРА.......................................................................................................... 87

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Существенным фактором окружающей среды, ограничивающим географическое распространение и сроки вегетации растений, является пониженная температура. Многочисленные исследования показали, что холодостойкость - комплексный признак, проявляющийся при слаженном действии различных систем растительного организма (Guy et al., 2008). Она достигается в ходе так называемой холодовой акклимации, которая происходит при экспозиции растений при низких незамораживающих температурах. Холодовая акклимация включает активацию множественных механизмов, вносящих вклад в повышение устойчивости растения к низкотемпературному стрессу. Понижение температуры приводит к индукции экспрессии определенных генов. Многие из этих генов, наряду с холодом, индуцируются также и некоторыми другими стрессовыми воздействиями. Показано, что гены холодового ответа кодируют разнообразный набор белков, включая ферменты дыхания и метаболизма углеводов и липидов, антиоксиданты, молекулярные шапероны, антифризные белки (Thomashow, 1999; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Walter etal.,2011).

Многие регулируемые холодом и дегидратацией гены в промоторных областях содержат одну или несколько копий последовательностей, обозначенных как DRE (dehydration-responsive element)/CRT (C-repeat) цис-элементы. С этими цис-элементами, в составе которых имеется консенсусная последовательность A/CCGACNT, связываются транскрипционные факторы CBF1, CBF2 и CBF3 (CRT-binding factor), в результате чего транскрипция генов, регулируемых холодом или дегидратацией, значительно активируется. Различия в устойчивости растений к низким температурам, определяемые экспрессией регулируемых холодом генов, могут быть обусловлены разным набором генов, относящихся к CBF-регулону, которых у теплолюбивых растений обнаруживается меньше, чем у растений, способных к холодовой акклимации, или отличиями в строении промоторных областей COR (cold-responsive)-reHOB по количеству

содержащихся в них CRT/DRE мотивов (Jaglo et al., 2001; Zhang et al., 2004; Zhang et al., 2011). Известны и другие механизмы регуляции экспрессии генов, в частности, обусловленные изменениями конформации хроматинового комплекса за счет обратимой конверсии транскрипционно активного эухроматина в транскрипционно неактивный гетерохроматин, различающиеся степенью метилирования цитозина в симметричных CG и CNG последовательностях, а так же в несимметричной CNN последовательности, степенью ацетилирования гистонов и плотностью упаковки хроматина, что меняет доступность хроматина для РНК-полимераз (Bird, 2002).

Известно, что метилирование ДНК находится под контролем различных биотических и абиотических факторов, влияющих на рост и развитие растений. Например, установлено, что внешние воздействия вызывают деметилирование целого ряда цитозинов как в промоторных областях, так и в кодирующих последовательностях генов (Sherman, Talbert, 2002; Madlung, Cornai, 2004; Чемерис и др., 2007; Choi, Sano, 2007; González et al., 2011). Что касается холодового стресса, показано, что длительное охлаждение корней сои приводило к увеличению доли гетерохроматина и уменьшению доли эухроматина (Stepinski, 2012). Также было обнаружено, что холодовая обработка проростков кукурузы сопровождается общим снижением степени метилирования ДНК (Steward et al., 2002). Однако изменения уровня метилирования отдельных генов в связи с развитием устойчивости к холодовому воздействию изучены недостаточно.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы - выяснение механизмов регуляции экспрессии и уровня метилирования генов транскрипционных факторов CBF у растений капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить нуклеотидные последовательности промоторных областей генов CBF капусты.

2. Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов CBF капусты, рапса, арабидопсиса и др.

3. Определить уровень экспрессии генов CBF закаленных и незакаленных растений в норме и при холодовом стрессе.

4. Определить характер и степень метилирования промоторных последовательностей генов CBF растений, выращенных в нормальных температурных условиях, при пониженной температуре, а также после снятия низкотемпературного стресса.

Научная новизна. Изучена экспрессия гена транскрипционного фактора CBF капусты, являющегося ключевым элементом в запуске механизма развития устойчивости растений к холодовому стрессу, в нормальных температурных условиях, при холодовом стрессе и при закаливании. Исследована степень метилирования цитозинов в промоторном участке гена CBF капусты у проростков, прошедших и не прошедших этап закаливания. Обнаружено, что у растений, прошедших этап холодового закаливания, происходит уменьшение степени метилирования последовательности ДНК промотора. Исследовано изменение статуса метилирования промоторной области гена CBF капусты после окончания цикла закаливания и показано частичное восстановление метилирования в ранее деметилированных участках промоторной области этого гена.

Полученные нами данные углубляют представления о процессах восприятия растениями холодового сигнала окружающей среды.

Научно-практическая значимость работы. Знание молекулярных механизмов развития холодостойкости и закаливания растений, а также выяснение возможной роли процессов метилирования/деметилирования в активации регулируемых холодом генов, может послужить основой для развития новых стратегий усиления холодостойкости и увеличения продуктивности, а также расширения области возделывания сельскохозяйственных культур.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VII съезде Общества физиологов растений (Нижний Новгород, 2011), II и III школе-конференции молодых ученых Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011; 2012), III

Международной научно-практической конференции «Современные проблемы биологии, экологии и химии» (Запорожье, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из перечня ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 220 наименований, в том числе 195 работ иностранных авторов. Работа изложена на 110 страницах и содержит 14 рисунков и 3 таблицы.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды на растения существенным образом изменяет их метаболизм, вызывая тот или иной стрессовый ответ. Температура среды - один из основных экологических факторов, отличающихся очень высокой мобильностью. Для нее характерны суточные, сезонные, годовые колебания. Растения, температура которых, как правило, соответствует температуре окружающей среды, вынуждены приспосабливаться к температурным перепадам (1апБка е! а1., 2009).

Снижение температуры оказывает подавляющее влияние на все звенья метаболизма растения в целом. Реакция торможения метаболизма является защитной, поскольку неспецифически снижается скорость процесса повреждения и повышается стабильность и надежность функционирования элементов клеточной структуры, уменьшается степень истощения запасов субстрата в ферментативных реакциях.

Показано, что развитие холодостойкости является комплексным признаком, проявляющимся при слаженном действии различных систем растительного организма (Сиу е1 а1., 2008). Адаптивный ответ растения на холодовой стресс предполагает передачу внешнего сигнала внутрь клетки и активацию соответствующих генов при посредничестве различных клеточных интермедиатов. В настоящее время интенсивно исследуются отдельные этапы развития стрессового ответа (трансдукция сигнала, активация транскрипции генов, посттранскрипционные процессы) и уже накоплено достаточно много сведений о гормональном и транскрипционном контроле регуляции генов холодового ответа. Выяснение механизмов изменения генной экспрессии в растительных клетках при понижении температуры окружающей среды имеет потенциально большой интерес, и этот аспект проблемы развития холодостойкости растений, в частности, возможность получения устойчивых к холоду сортов с помощью технологии переноса тех или иных генов, также получил свое развитие в исследованиях последних лет.

Каждому растению характерен определенный температурный оптимум для роста и развития. При этом благоприятные температурные условия для одних растений могут оказаться совершенно неподходящими для других. Соответственно, растения проявляют различную степень устойчивости к повреждающему действию низких температур. Те из них, которые не устойчивы не только к отрицательным, но и даже к низким положительным температурам, относятся к теплолюбивым растениям (Hershkovitz et al., 2009; Saito et al., 2010; Chen et al., 2011).

Холодостойкие растения выносливы к любым низким положительным температурам, если при этом вода в них остается в переохлажденном состоянии. К морозостойким относятся растения, которые выживают после действия отрицательных температур и образования в них межклеточного льда (Дроздов, 1984; Kosova et al., 2010). При этом морозостойкость связана с определенной подготовкой к восприятию холода, иначе говоря, с закаливанием растений. К таковым относятся, главным образом, древесные растения и некоторые многолетние травянистые. Различают еще заморозкоустойчивость - способность выдерживать внезапное кратковременное воздействие отрицательных температур без существенного снижения продуктивности. Поэтому повреждения, вызываемые низкими температурами, можно подразделить на два вида. В первую группу следует отнести повреждения в результате охлаждения растений, примерно от 20°С до 0°С. При этом происходят нарушения в прорастании, развитии цветков и плодов, падает продуктивность. Второй вид повреждений происходит при замерзании растений, когда температура внешней среды опускается ниже температуры замерзания воды.

1.1. Адаптация растений к низкотемпературному стрессу

Многие растения регионов с умеренным климатом способны к уменьшению повреждающего воздействия низких температур. Разнообразные приспособления на разных уровнях структурной организации - от молекулярного до

организменного - позволяют растениям адаптироваться к таким воздействиям (Климов, 2001).

Растения показывают увеличенную морозоустойчивость после их экспозиции при низких положительных температурах. Этот процесс называется закаливанием. Во время закаливания происходят разнообразные биохимические, морфологические и физиологические изменения в растительных клетках, подготавливающие их к перенесению морозов: изменения в экспрессии определенных генов, транзиентное увеличение содержания АБК (абсцизовой кислоты), изменения в составе мембранных липидов, накопление совместимых осмолитиков (пролин, бетаин, полиолы и растворимые сахара), увеличение уровня антиоксидантов (Касперска-Палач,1983; Thomashow, 1998; Hare et al., 1998; Xin, Browse, 2000; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Taji et al., 2002; Hekneby et al., 2006; Guy et al., 2008; Miller et al., 2008; Bonnecarrere et al., 2011).

Большинство этих биохимических и физиологических изменений регулируются низкими температурами через изменения в экспрессии тех или иных генов. Исследования по выяснению структуры и организации подобных генов, их регуляции и вклада в развитие стрессового ответа растений проводятся достаточно давно, в настоящее время накоплен значительный объем сведений в этой области (Thomashow, 1999; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Колесниченко, Войников, 2003; Войников и др., 2004; Guy et al., 2008; Hirayama, Shinozaki, 2010).

Исследования транскрипционной модуляции во время холодовой акклимации с использованием различных микрочиповых технологий показали, что от 2 до 13% генов арабидопсиса регулируются холодом (Fowler, Thomashow, 2002; Vogel et al., 2005).

При холодовой акклимации происходит стабилизация мембран. Так, у арабидопсиса, например, установлено, что плазматические мембраны незакаленных растений под действием холода подвергаются индуцированному лизису и формированию инвертированной гексагональной фазы липидов, а мембраны закаленных растений - нет (Webb et al., 1994). Показана более высокая

текучесть мембран клеток листьев закаленных растений морозоустойчивого сорта Мироновская 808 по сравнению с маломорозостойкой пшеницей сорта Пеньямо 62 (Vigh et al., 1979). Анализ изменений жирнокислотного состава мембранных липидов у холодоустойчивых злаков - яровой пшеницы и пырейника сибирского и холодочувствительного злака кукурузы при действии низкой температуры показал, что различная способность этих растений адаптироваться к действию холода связана с увеличением у холодоустойчивых видов относительного содержания а-линоленовой, a не линолево