Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия гена белка холодового шока капусты при низкотемпературном стрессе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гена белка холодового шока капусты при низкотемпературном стрессе"

На правах рукописи

Матниязов Рустам Тахирович

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА БЕЛКА ХОЛОДОВОГО ШОКА КАПУСТЫ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ СТРЕССЕ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2005

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Гималов Фуат Рамазанович

Научный консультант

Доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор Каримова Фатима Габдуллазяновна Кандидат биологических наук Самигуллин Татар Халафович

Ведущая организация

Институт биологии Уфимского научного центра РАН

Защита состоится декабря 2005 г: в _ часов на заседании

Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Адрес: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан " 2005 г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, к.б.н.

Бикбулатова С.М.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Приспособление растений к условиям произрастания предполагает наличие эффективного механизма восприятия и передачи сигналов из окружающей среды. Существенным фактором внешней среды является температура, характеризующаяся очень высокой изменчивостью и значительными перепадами. В силу своей прикрепленности к месту обитания растения вынуждены приспосабливаться к этим перепадам,

поскольку температурный режим обитания оказывает значительное воздействие на их метаболизм, рост, развитие и продуктивность (Воуег, 1982). Понижение температуры приводит к индукции экспрессии определенных генов. Экспрессия некоторых из этих генов носит специфический характер, поскольку вызывается только низкой температурой (Weretilnik, 1993), в то время как другие гены индуцируются, наряду с холодом, также и дегидратацией, солевым стрессом, в ответ на действие абсцизовой кислоты (Kurkela, Frank, 1990; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1994; Hughes, Dunn, 1996).

Многочисленные исследования показали, что развитие холодостойкости - комплексный признак, проявляющийся при слаженном действии различных систем растительного организма. В настоящее время интенсивно исследуются отдельные этапы развития стрессового ответа (трансдукция сигнала, активация транскрипции генов, посттранскрипционные процессы). Однако последовательность прохождения холодового сигнала и молекулярные механизмы этого процесса изучены недостаточно полно. Удобной моделью для подобных исследований является клонированный в нашей лаборатории ген белка холодового шока капусты CSP5 (Баймиев и др., 1999), активацию экспрессии которого можно принять на нуклеотидном уровне за конечную точку в последовательности событий стрессового ответа растений.

Широкое применение для простой и удобной количественной оценки уровня экспрессии различных генов, содержащих интроны, в том числе, и гена белка холодового шока капусты CSP5, может найти разработанный метод с применением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

(ПЦР-РВ) с переносом энергии от праймера к праймеру, которые имеют в своем составе красители с перекрывающимися спектрами испускания и возбуждения, обеспечивающие эффект флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET-эффект, Fluorescent Resonance Energy Transfer). В результате подбора места отжига праймеров по краям соседних экзонов при амплификации молекул РНК будет наблюдаться эффект переноса энергии, а вклад геномной ДНК, за счет удаленного расположения праймеров друг от друга, будет, таким образом, полностью отсечен, поскольку в этом случае эффекта переноса энергии не будет из-за большего расстояния между красителями.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы заключалась в исследовании молекулярных механизмов восприятия и передачи клетками растений капусты сигнала окружающей среды об изменениях температуры для активации гена белка холодового шока CSP5.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. провести исследование влияния состояния цитоплазматической мембраны и цитоскелета на экспрессию гена CSP5;

2. изучить влияние ионов Са2+ на экспрессию гена CSP5;

3. исследовать влияние активности протеинкиназ на экспрессию гена CSP5;

4. исследовать влияние 24-эпибрассинолида на экспрессию гена CSP5;

5. провести детекцию изменений в экспрессии гена CSP5 модифицированным методом ПЦР в реальном времени.

Научная новизна.

Показано, что передача низкотемпературного сигнала из внешней среды, вызывающего стрессовый ответ растения, происходит многоступенчато. Начальными этапами процесса трансдукции холодового сигнала являются активация кальциевых каналов и увеличение потока ионов кальция в цитоплазму, сопровождаемое активацией кальцийзависимых протеинкиназ, участвующих, по-видимому, в активации факторов транскрипции, задействованных в экспрессии гена белка холодового шока капусты CSP5.

Впервые было показано влияние 24-эпибрассинолида на экспрессию гена

СБР5.

Показана возможность применения варианта ПЦР-РВ с переносом энергии от праймера к праймеру для исследования уровня экспрессии гена СБР5 при различных условиях низкотемпературного стресса при существенном сокращении времени эксперимента.

Полученные нами данные углубляют представления о процессах восприятия растениями холодового сигнала окружающей среды и некоторых общих механизмах адаптации растений к неблагоприятным условиям обитания.

Практическая значимость работы. Знание молекулярных механизмов развития холодостойкости и закаливания растений может послужить основой для развития новых стратегий усиления холодостойкости и увеличения продуктивности, а также для расширения области возделывания сельскохозяйственных культур. Применение варианта ПЦР-РВ с переносом энергии от праймера к праймеру значительно ускорит исследование индуцируемых внешними воздействиями генов, характеризующихся наличием интронов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002); XIII конгрессе РЕвРВ (НегакИоп, 2002); V съезде Общества физиологов растений (Пенза, 2003); Всероссийской научной конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004); Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 207 названий. Работа изложена на 110 страницах и содержит 17 рисунков.

2.ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объекта были взяты проростки капусты сорта Аматер, выращиваемые в питательном растворе Мурасиге и Скуга, а также протопласты, полученные из растений капусты 4-х недельного возраста. Для холодового стресса проростки и протопласты переносили в термостатированную камеру на 5°С и выдерживали от 15 минут до нескольких часов. ДНК из 2-х суточных проростков выделяли фенольно-детергентным методом (Graham, 1978). Тотальную РНК выделяли, используя гуанидинтиоцианатный буфер (Boothe et al., 1995). Плазмидную ДНК выделяли методом мягкого лизиса (Clewel, Helinski, 1969) с некоторыми модификациями. Расщепление ДНК проводили в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками. Полимеразные цепные реакции (ПЦР) проводили в ДНК амплификаторе модели Терцик (ДНК-Технология, Россия). ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с переносом энергии от праймера к праймеру проводили в приборе iCycler iQ фирмы Bio-Rad. Перенос фрагментов ДНК из гелей на нитроцеллюлозные фильтры проводили по методу Саузерна (Southern, 1975) с некоторыми модификациями (Meinkoth, Wahl, 1979). Нозерн-блот и дот-блот анализы проводили согласно стандартным протоколам (Sambrook et al., 1989). Радиоактивное мечение препаратов ДНК осуществляли с помощью у-[32Р] АТФ и полинуклеотидкиназы фага Т4 (Maxam, Gilbert, 1977), а также используя Кленовский фрагмент ДНК полимеразы I и соответствующий [а-32Р] дНТФ (Sambrook et al., 1989). При определении активности протеинкиназ экстракцию белков проводили в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl (pH 7.5), 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, 250 мМ сахарозы, 10 мМ ЭДТА, 3% поливинилпирролидона, 1 мМ Na2W04 (ингибитор фосфатаз). Электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970) в полиакриламидном геле (ПААГ) с 0.1%-ным ДДС-Na с линейным градиентом акриламида (6-16%). Количество белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Определение активности протеинкиназ

проводили по методу Киккавы с сотр. (Kikkawa et al., 1983). Протопласты получали из 4-х недельных проростков капусты. Иммуноферментный анализ проводили, как описано у Хайруллина и др. (1993).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Начальные этапы низкотемпературной индукции экспрессии гена белка холодового шока капусты

Механизмы передачи низкотемпературного сигнала из внешней среды, приводящего к экспрессии регулируемых холодом генов, изучены недостаточно, несмотря на значительное внимание к этой проблеме. Было показано, что при воздействии холода на клетки растений усилению экспрессии индуцируемых холодом генов предшествовали резкое повышение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме и увеличение жесткости клеточной мембраны (Ding, Pickard, 1993; Orvar et al., 2000; Sangwan et al., 2001). Такого состояния мембран можно было достичь также и обрабатывая их диметилсульфоксидом (DMSO) при комнатной температуре и имитируя эффект холодового воздействия на мембраны (Orvar et al., 2000; Sangwan et al., 2001). Противоположный эффект достигался при воздействии на мембраны бензиловым спиртом (Orvar et al., 2000).

В наших опытах использованы протопласты капусты, полученные из листьев растений 4-х недельного возраста. Для повышения текучести плазматической мембраны суспензию протопластов капусты (106 клеток на 1 мл) инкубировали в среде, содержащей в двух концентрациях - 5 и 10 мМ и не содержащей (контроль) бензиновый спирт. Из таких протопластов выделяли РНК для дот-блот-анализа. Результаты с использованием в качестве зонда меченного 32Р фрагмента гена белка холодового шока капусты показали, что в протопластах, инкубированных при 5°С в присутствии бензинового спирта

(БС), экспрессия гена белка холодового шока существенно ниже по сравнению с контролем (рис. 1, а). Уменьшение текучести плазматической мембраны достигалось обработкой протопластов раствором ПМБО в концентрациях 1, 2 и 3%. Дот-блот-анализ мРНК, выделенных из необработанных и обработанных ОМБО протопластов (106 клеток на 1 мл), инкубированных при различных температурах, показал стимуляцию экспрессии данного гена как в протопластах капусты, инкубированных при 23°С и обработанных раствором ОМвО, так и в протопластах, инкубированных при 5°С (рис. 1, б).

[БС], мМ

PMSO], %

Рис 1. Экспрессия гена белка холодового шока CSP5 Br. oleráceo в

протопластах под влиянием бензилового спирта (БС, а) при 5°С или ДМСО (б) при нормальной температуре 23°С

Изменения в текучести плазматической мембраны, по-видимому, меняют силы натяжения в мембране и способствуют открыванию активируемых холодом кальциевых каналов, относящихся к механочувствительным ионным каналам (Ding, Pickard, 1993), т.е. при уменьшении текучести плазматической мембраны происходит увеличение потока ионов кальция в клетки растений.

Ранее на проростках рапса было показано, что модулирование интенсивности этого потока различными агентами отражалось на уровне экспрессии генов, регулируемых холодом (Sangwan, 2001). При обработке протопластов капусты хелатором ионов кальция EGTA уровень экспрессии

СвР5 при 5°С значительно снижался по сравнению с уровнем экспрессии этого гена на холоду в необработанных ЕОТА клетках (рис. 2). Однако полного подавления не наблюдалось. Отчасти это можно объяснить тем, что ЕСТА связывает внеклеточные ионы кальция, а общее повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме при стрессе достигается из различных депо Са2+. Воздействие на клетки при 23°С Са-ионофором А23187, стимулирующим приток в цитоплазму ионов кальция, связанных на клеточных стенках, вызывало существенное повышение уровня экспрессии С8Р5 (рис. 2, а).

500

б)

Контроль ЕСТА Са2+-ионофор

Контроль Нифедипин Цинаризин *«

Рис 2. Влияние реагентов, меняющих поток ионов кальция в цитоплазму (а), и блокирующих кальциевые каналы (б), на экспрессию гена СБР5

Было изучено влияние на уровень экспрессии С8Р5 блокаторов кальциевых каналов - нифедепина и цинаразина (рис. 2, б).

При этом нифедипин, блокирующий кальциевые каналы плазматической мембраны, оказывал эффект в подавлении экспрессии С8Р5, в то время как цинаразин - блокатор каналов внутриклеточных кальциевых депо -существенного влияния на экспрессию СвР5 не оказывал.

Следовательно, изменение концентрации ионов кальция в цитоплазме прямо отражается на уровне экспрессии гена белка холодового шока капусты.

Экспрессия гена белка холодового шока капусты при различной активности кальций-зависимых протеинкиназ

Фосфорилирование белков играет важную роль в регуляции экспрессии генов у растений и отмечено при воздействии на них различных биотических и абиотических факторов, в том числе, при холодовом стрессе (Мопгоу е1 а1., 1993). Известно, что эти воздействия первоначально вызывают флуктуации в концентрации ионов кальция в цитоплазме (ТаЬШоди е1 а1., 1997). Связывающим звеном между колебаниями концентрации Са2+ и изменениями в экспрессии генов и метаболизме, по всей видимости, является активность кальций-зависимых протеинкиназ.

В белковых экстрактах, выделенных из растений капусты, подвергнутых холоду, и без холодовой обработки, уровень фосфорилирования гистона, взятого в качестве субстрата для протеинкиназ, заметно отличался (рис.3).

23"С , 0,5 ч 1ч 2ч 6ч 5°С

Рис 3. Фосфорилирование гистона в экстрактах клеток растений, подвергнутых низкотемпературному стрессу

Холодовой стресс вызывал повышение фосфорилирования гистона уже через 30 мин. Значительное и быстрое повышение протеинкиназной активности после помещения проростков капусты на холод выявлено и в опытах по фосфорилированию белков в реакциях in vivo.

Рис 4. Фосформирование белков растений при низкотемпературном воздействии

При этом фосфорилируются белки с молекулярной массой 24,42 и 58 кДа (рис. 4). В случае предварительной инкубации проростков в питательной среде с добавлением хелаторов ионов кальция ЕвТА и ВАРТА уровень фосфорилирования белка с молекулярной массой 24 кДа существенно снижался, а белки с молекулярной массой 42 и 58 к Да на радиоавтографе не выявлялись, что подтверждает кальций-зависимый характер фосфорилирования данных белков при холодовом стрессе. В вариантах с использованием соединения ВАРТА, хелатирующего ионы кальция из внутриклеточных депо, подавление фосфорилирования белков по сравнению с вариантами с ЕОТА меньше, что указывает на больший вклад ионов кальция, поступающих из окружающей среды, на активацию протеинкиназ при холодовом стрессе.

Необходимость этапа фосфорилирования определенных белков для экспрессии гена С8Р5 подтверждается опытами с ингибиторами протеинкиназ.

На рис. 5 видно, что обработка растений стауроспорином - общим ингибитором протеинкиназ, а также вортманином, приводила к некоторому

уменьшению экспрессии СБР5 при холодовом стрессе. Однако разница в уровне экспрессии в этих вариантах не была достоверной, поэтому можно говорить лишь о тенденции к снижению экспрессии гена СвР5 при применении данных ингибиторов протеинкиназ.

Ц Контроль | Стауроспорин В| Вортманин

23 "С 1 0,5 ч

5 "С

Рис 5. Влияние ингибиторов протеинкиназ на экспрессию гена СБР5

Влияние реорганизации цитоскелета на экспрессию гена белка холодового

шока капусты

Известно, что компоненты цитоскелета связаны с плазматической мембраной и ионньми каналами (ТЫоп й а1., 1996). Орвар и сотр. (Огуаг е1 а1., 2000) предположили, что уменьшение текучести плазматической мембраны при низкой температуре вызывает реорганизацию цитоскелета и активацию кальциевых каналов с последующей индукцией экспрессии регулируемых холодом генов. Мы также исследовали экспрессию гена белка холодового шока капусты СБР5 в протопластах из растений капусты при воздействии на них реагентов, влияющих на реорганизацию цитоскелета, в различных условиях температурного режима.

В качестве реагентов, приводящих к реорганизации тубулинового цитоскелета, использовали таксол (1 мкМ/мл) и колхицин (100 мкг/мл). Для оценки воздействия этих веществ на экспрессию гена белка холодового шока

капусты СвР5, суспензию протопластов (106 клеток на 1 мл) инкубировали в среде, содержащей, соответственно, таксол или колхицин.

При обработке протопластов капусты таксолом, стабилизирующим тубулиновый цитоскелет, экспрессия гена СБР5 при 5°С заметно ингибируется, оставаясь практически на уровне экспрессии этого гена при комнатной температуре (рис. 6).

О.Е.

Рис 6. Оценка уровня экспрессии гена СБР5 при воздействии реагентов, влияющих на состояние цитоскелета. 1 - контроль; 2 - гипотермия; 3 -таксол+гипотермия; 4 - таксол + ДМСО; 5 - ДМСО; 6 - колхицин; 7 - колхицин + БС

В то же время стимуляция экспрессии гена СЯР5 наблюдается и без низкотемпературного стресса при воздействии на протопласты капусты диметилсульфоксидом (ДМСО), уменьшающим текучесть плазматической мембраны и имитирующим холодовой стресс. В этих условиях стабилизация тубулинового цитоскелета с помощью таксола значительно уменьшает экспрессию гена СБР5, снижая тем самым эффект ДМСО.

При действии на протопласты колхицина, ингибирующего полимеризацию тубулиновых белков и разрушающего микротрубочки, наблюдается заметное увеличение экспрессии гена СвР5 даже при комнатной температуре. Обработка протопластов одновременно колхицином и бензиловым спиртом, вызывающим повышение текучести плазматической мембраны, приводит лишь к незначительному, по сравнению с действием одного колхицина, уменьшению экспрессии гена С8Р5.

Реорганизация цитоскелета, по-видимому, приводит к активации кальциевых каналов, что в свою очередь обеспечивает поток ионов кальция в цитоплазму и дальнейшее прохождение холодового сигнала, завершающееся адекватным стрессовым ответом.

Влияние 24-эпибрассинолида на регуляцию экспрессии гена белка холодового шока капусты

Как известно, важная роль в регуляции интенсивности физиологических процессов, лежащих в основе роста и развития растительных организмов, отводится фитогормонам. На сегодняшний день имеются многочисленные данные о разнообразии физиологических эффектов этих соединений. В этом плане активно исследуются и брассиностероиды, близкие по своей структуре стероидным гормонам животных, впервые выделенные из липидной фракции пыльцы рапса (Grove et al., 1977). Результаты большого количества работ свидетельствуют о ярко выраженном ростстимулирующем, а также защитном действии брассиностероидов по отношению к широкому спектру неблагоприятных воздействий, что позволяет рассматривать их в качестве эффективных эндогенных регуляторов роста и развития растений (Хрипач и др., 1995; Шакирова, 2001).

Для выявления ростстимулирующего действия брассиностероидов

4

используют специфические для них биотесты, например, стимуляцию роста второго междоузлия фасоли (Mitchell et al., 1970), также биотест по оценке ,

скорости роста эпикотилей маша, который позволяет выявить стимулирующий эффект брассиностероидов в концентрации 10'10 М и ниже (Gregory, Mandava, 1982).

Предполагается, что влияние брассиностероидов на устойчивость растений к холоду и засолению связано с его действием на структуру и функции мембран (Кораблева, Платонова, 1995; Ершова, Хрипач, 1996).

Исследование влияния 24-эпибрассинолида (ЭБ) на регуляцию экспрессии гена белка холодового шока капусты, а также на рост растений капусты при низкотемпературном стрессе проводили на растениях капусты сорта Амагер на стадии появления 4-го листа. Постановку физиологических опытов с ЭБ проводили совместно с к.б.н. М.В.Безруковой.

Растения для опытов переносили в среду, содержащую 2% сахарозы и 0,4 мкМ ЭБ. Контрольные растения помещали в среду с сахарозой, но без ЭБ. В среде с ЭБ растения перед опытом выдерживали в течение 8 часов при комнатной температуре. Затем растения подвергали холодовому стрессу при 5°С в течение 1-10 дней и проводили измерения прироста биомассы.

Результаты показывают, что при понижении температуры прирост биомассы растений значительно падает (рис. 7).

контроль гипотермия ЭБ ЭБ + гипотермия

Рис 7. Влияние предобработки ЭБ на прирост проростков капусты в норме и гипотермии (5°С)

В то же время растения, предварительно обработанные ЭБ, уже на 2-й день достигают в приросте значений, близких к приросту контрольных

растений, выращиваемых при 23°С, что свидетельствует о явном антистрессовом действии 24-эпибрассинолида при понижении температуры.

Кроме того, оказалось, что 24-эпибрассинолид вызывает усиление экспрессии гена белка холодового шока капусты уже в течение 30 минут после обработки растений фитогормоном (рис. 8), сопоставимое с экспрессией данного гена при 5°С.

Высокий уровень экспрессии гена БХШ сохранялся в течение всего опыта (6 часов). Вызывая повышенную экспрессию гена белка холодового шока, соответственно, усиливая синтез самого белка, ЭБ, видимо, опять же способствует ускорению процесса адаптации растения к воздействию неблагоприятного фактора.

Известно, что холодовой стресс сопровождается повышением содержания в клетках растений АБК. В свою очередь, обработка растений экзогенной АБК вызывает стимуляцию экспрессии гена БХШ капусты (Баймиев и др., 1999). При одновременном воздействии холодового стресса и АБК на растения экспрессия гена БХШ была несколько выше, чем когда эти факторы действовали отдельно, но меньше их суммарного значения, что свидетельствует о существовании общих элементов в обоих путях регуляции

экспрессии гена БХШ капусты. Для того, чтобы выяснить, не опосредовано ли влияние брассиностероидов на экспрессию гена БХШ капусты через повышение эндогенного уровня АБК, мы провели анализ динамики содержания АБК в проростках капусты при воздействии на них ЭБ. Можно видеть, что обработка ЭБ вызывала заметное увеличение в уровне АБК на протяжении всего опыта, по сравнению с содержанием АБК в контрольных растениях, выращиваемых при 23°С. Однако в предобработанных ЭБ проростках в условиях гипотермии данный показатель был существенно ниже, в сравнении с необработанными (рис. 9).

Следовательно, можно говорить о независимой от АБК регуляции

♦ контроль в гипотермия —4—Эб —ЭБ + гипотермия Рис. 9. Влияние предобработки 24-эпибрассинолидом на концентрацию АБК при низкотемпературном воздействии

эпибрассинолидом экспрессии гена БХШ капусты. В растениях, предварительно обработанных ЭБ, в первые 30 мин холодового стресса наблюдается определенное повышение содержания АБК, затем ее уровень падает и в дальнейшем держится на уровне содержания в контрольных растениях. Это также, очевидно, указывает на снижение повреждающего действия низких температур в результате предобработки 24-эпибрассинолидом.

Детекция специфичных фрагментов ДНК и РНК в режиме реального времени с помощью полимеразной цепной реакции

С возникновением и развитием методов ДНК-амплификации в режиме реального времени у исследователей появилась возможность с высокой достоверностью количественно оценивать содержание тех или иных молекул мРНК. Однако возникает необходимость исключения возможного вклада самих генов (то есть молекул ДНК) в ДНК-амплификацию молекул РНК. Однако, если ген, работа которого анализируется, содержит интроны, то задача значительно упрощается.

Нами разработан упрощенный и улучшенный способ детекции целевых продуктов, основанный на переносе энергии между праймерами, применяемыми при проведении полимеразной цепной реакции. При этом методе праймеры подбираются таким образом, что происходит наработка целевого продукта ПЦР размером всего 40 - 50 пн, что ускоряет реакцию амплификации ДНК. Эти праймеры несут в своих составах флуоресцентные красители, один из которых служит донором, а другой - акцептором, и эти красители представляют собой пару с перекрывающимися спектрами испускания и возбуждения, обеспечивая эффект флуоресцентного резонансного переноса энергии, называемого также FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer), от первого ко второму. Вариант ПЦР-РВ с переносом энергии от праймера к праймеру удобен для количественной оценки уровня экспрессии различных генов, содержащих интроны, так как места отжига праймеров могут подбираться по краям соседних экзонов с таким расчетом, что при амплификации молекул РНК это приведет к FRET-эффекту, а вклад геномной ДНК, за счет удаленного расположения праймеров друг от друга, будет полностью отсечен, так как в этом случае переноса энергии не будет из-за большего расстояния между красителями (рис. 10).

Рис. 10. Схема расположения прямого (F) и обратного (R) праймеров в варианте ПЦР-РВ с переносом флуоресцентной резонансной энергии между донорным (F) и акцепторным (R) красителями для определения уровня экспрессии генов, содержащих интроны

Этот метод использован нами для определения транскрипционной активности гена белка холодового шока капусты. Для этого были подобраны праймеры, соответствующие концевым участкам второго и третьего экзонов гена CSP5. Праймеры имели следующие последовательности: 5 -gctggagcgT(FAM)ctgctcaaac-3 ' и 3 '-tccgatatcttcT(ROX)gtcctgcc-5 '. Донорным красителем служил FAM, акцепторным - ROX, которые были пришиты к тимидину.

Реакция была проведена в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 100 мМ трис-НС1, 16,6 мМ (NH4)2S04, 2,0 мМ MgCl2, 0,01% Tween-20, 0,1 мкг тотальной РНК, по 20 пМ каждого праймера, по 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ и 1 ед. ST-ДНК-полимеразы фирмы "Costar". ПЦР проводили по схеме: начальная денатурация (95°С, 2 мин); 30 циклов амплификации со следующими параметрами: 1) денатурация - 95°С, 30 с, 2) отжиг - 48°С, 30 с, 3) синтез -72"С, 30 с. Затем проводили инкубацию при 72°С в течение 2 мин.

ST-ДНК-полимераза обладает также и транскриптазной активностью, поэтому в реакционной среде одновременно идут реакции построения цепи ДНК на матрице РНК и построения второй комплементарной цепи ДНК. При этом нуклеотиды с пришитыми красителями FAM и ROX оказываются на достаточном расстоянии, чтобы проявился FRET эффект.

Для выравнивания исходного количества тотальной РНК использовали РТ-ПЦР с праймерами, подобранными на участок рРНК. В качестве

флуоресцентного красителя использовали SYBR Green I. С тотальной РНК после нескольких разведений проводили РТ-ПЦР. По кривым, получающимся в результате ПЦР, определялась концентрация опытных образцов тотальной РНК, что позволяло брать равное их количество для ПЦР с переносом энергии

Cyd»

Рис. 11. Определение концентраций РНК в опытных образцах

В качестве контроля протекания реакции амплификации с возможным образованием ложного продукта в результате залипания праймеров друг на друга взята проба, содержащая только праймеры без ДНК или РНК.

После проведения ПЦР с переносом энергии проводилось плавление полученных продуктов амплификации, при этом постепенная денатурация амплификата приводит к снижению свечения (рис. 12).

а) б)

imiiiiiiHaiiiiikiiiiiiiuiiiiMiiuiiiM^s'riMMii

IMIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIlilllllllRIIH

«*,в50 52ИИЯ6042М66« 70 72 74 76 78аОа2в4абММ92*96Эе

ДНК

опытные образцы опытные образцы

- котроль

Рис. 12. Кривая плавления продуктов амплификации (а); электрофоретическое разделение амплификатов в ПААГ (б)

Для измерения количества амплификатов проводили плавление стандартных проб, представляющих собой разведения предварительно синтезированного олигонуклеотида - полноразмерного продукта РТ-ПЦР с известной концентрацией (рис. 13).

£ 190 |

| 100

2 50

г-

/

О г 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 Э4 Э6 Эв 40 42 44 46 48 Суд»

Тур« ИонИЬг С1 исзд 90 ЗДМеяя С1Я5 вяЗО

ск $«Ш|1аг<1 5 19 10 (2000) 100ЕЛ2 100&02 №А 15 10

СП ЗмжЬгс! 6 1« 01 (3 000) 100ЫЗ 1 00&03 №А 1101

СП ЗШиЬп! 7 22 52 (4 000) 100Б04 1 00&04 №А 22 52

7 407 У--Э712Х

е Цлклоигя

Рис. 13. Проведение амплификации со стандартными разведениями контроля: а - синтез амплификатов; б - количественные данные; г -стандартная кривая

Количественные характеристики полученных кривых плавления стандартных разведений использовались программным обеспечением прибора для измерения количества продуктов амплификации в опытных образцах.

Таким путем получены результаты по экспрессии гена СвР5 при изменении потока ионов кальция в цитоплазму и воздействии ингибиторов протеинкиназ (рис. 14).

Сравнение этих результатов с теми, которые были получены ранее общепринятыми методами (иммобилизация РНК на нитроцеллюлозных фильтрах, гибридизация меченными 32Р фрагментами гена С8Р5, сканирование гибридизационных точек с помощью денситометра) (рис. 2а и 5), показало, что применение варианта ПЦР-РВ с переносом энергии от праймера к праймеру для

21

исследования уровня экспрессии гена СвР5 при различных условиях низкотемпературного стресса, отражает складывающуюся при этом ситуацию.

а)

■ контроль

■ ЕСТА

0 Са ионофор

23 °С

5°С 2 ч.

В контроль ■ стауроспорин Ваортманин

23°С 5°С 6ч.

Рис 14. Экспрессия гена СБРЗ при изменении потока ионов кальция в цитоплазму (а), и при ингибировании протеинкиназ (б) (по результатам, полученным с помощью метода ПЦР-РВ)

Но этот подход быстрее по времени, менее трудоемок в силу автоматизации процесса, кроме того, в данном случае нет необходимости применения радиоактивных изотопов.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что передача низкотемпературного сигнала из внешней среды происходит многоступенчато. Начальными этапами являются активация кальциевых каналов и увеличение потока ионов кальция в цитоплазму, сопровождаемое активацией кальций-зависимых протеинкиназ, участвующих, по-видимому, в активации факторов транскрипции, задействованных в экспрессии гена белка холодового шока капусты С8Р5.

2. Доказана роль процессов реорганизации цитоскелета в активации экспрессии гена белка холодового шока капусты С8Р5.

3. Впервые показана стимуляция экспрессии гена С8Р5 под влиянием 24-эпибрассинолида.

4. Использование гена белка холодового шока капусты С8Р5 как маркерного гена, чутко реагирующего на понижение температуры, показало

возможность применения варианта ПЦР-РВ с переносом энергии от праймера к праймеру для исследования уровня экспрессии гена CSP5 при низкотемпературном стрессе при существенном сокращении времени эксперимента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гималов Ф.Р., Баймиев Ан.Х., Матниязов Р.Т., Чемерис A.B., Вахитов В.А. Начальные этапы низкотемпературной индукции экспрессии гена белка холодового шока капусты // Ш съезд биохимического общества. 2002. Санкт-Петербург. С. 395-396.

2. Матниязов Р.Т., Баймиев Ан.Х., Гималов Ф.Р. Влияние активности протеинкиназ на экспрессию гена CSP 5 // 6-я Пущинская школа - конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 2002. Пущино. Т.1. С. 278.

3. Гималов Ф.Р., Баймиев А.Х., Матниязов Р.Т., Чемерис A.B., Вахитов В.А. Начальные этапы низкотемпературной индукции экспрессии гена белка холодового шока капусты //Биохимия. 2004. Т 36, №5. С. 575-579.

4. Гималов Ф.Р., Вахитов В.А., Чемерис A.B., Матниязов Р.Т., Баймиев А.Х. Влияние реорганизации цитоскелета и изменения активности протеинкиназ на экспрессию гена белка холодового шока капусты // Стрессовые белки растений. Материалы Всероссийской научной конференции. Иркутск. 2004. С. 31-34.

г 5. Гималов Ф.Р., Матниязов Р.Т., Чемерис A.B., Вахитов В.А. Влияние

фитогормона эпибрассинолида на регуляцию экспрессии гена белка холодового шока капусты // Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». 2005. Вологда. С. 45.

6. Матниязов Р.Т., Гималов Ф.Р., Баймиев А.Х., Чемерис A.B., Вахитов В.А. Новые технологии амплификации нуклеиновых кислот в режиме реального времени для изучения транскрипционной активности отдельных генов // Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». 2005. Вологда. С. 111.

РНБ Русский фонд

2006-4 29479

Матниязов Рустам Тахирович

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА БЕЛКА ХОЛОДОВОГО ШОКА КАПУСТЫ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ СТРЕССЕ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 24.11.2005 Отпечатано на ризографе. Формат 60x84 1/16. Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,7 Тираж 100 экз. Заказ №313. 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Матниязов, Рустам Тахирович

Список сокращений Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Действие низких положительных и отрицательных температур на растения. Закаливание растений

1.2. Функции белков холодового шока

1.3. Роль фосфорилирования белков в развитии холодостойкости растений

1.4. Регуляция экспрессии COR-генов растений

1.5. Начальные этапы восприятия холодового сигнала растительными клетками

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Объекты исследования

2.2. Выделение и очистка ДНК растений

2.3. Выделение РНК

2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.5. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами

2.6. Аналитический гель-электрофорез ДНК

2.7. Полимеразная цепная реакция

2.8. Перенос ДНК из агарозных гелей на мембранные фильтры (блоттинг)

2.9. Дот-блот анализ

2.10. Радиоактивное мечение препаратов ДНК

2.11. Блот-гибридизация ДНК

2.12. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК

2.13. Получение протопластов

2.14. Выделение белков из растений

2.15. Электрофорез белков

2.16. Определение протеинкиназной активности

2.17. Определение уровня фосфорилирования белков in vivo

2.18. Иммуноферментный анализ концентрации АВК

2.19. Реактивы и материалы

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1. Начальные этапы низкотемпературной индукции 59 экспрессии гена белка холодового шока капусты

3.2. Экспрессия гена белка холодового шока капусты при 64 различной активности кальций-зависимых протеинкиназ

3.3. Влияние реорганизации цитоскелета на экспрессию 67 гена белка холодового шока капусты

3.4. Влияние фитогормона эпибрассинолида на регуляцию 70 экспрессии гена белка холодового шока капусты

3.5. Детекция специфичных фрагментов ДНК и РНК в 76 режиме реального времени с помощью полимеразной цепной реакции

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия гена белка холодового шока капусты при низкотемпературном стрессе"

Актуальность темы. Приспособление растений к условиям произрастания предполагает наличие эффективного механизма восприятия и передачи сигналов из внешней среды. Существенным фактором внешней среды является температура, характеризующаяся очень высокой изменчивостью и значительными перепадами. В силу своей прикрепленности к месту обитания растения вынуждены приспосабливаться к этим перепадам, поскольку температурный режим обитания оказывает значительное воздействие на их метаболизм, рост, развитие и продуктивность (Воуег, 1982). Понижение температуры приводит к индукции экспрессии определенных генов. Экспрессия некоторых из этих генов носит специфический характер, поскольку вызывается только низкой температурой (Weretilnik, 1993), в то время как другие гены индуцируются, наряду с холодом, также и дегидратацией, солевым стрессом, в ответ на действие абсцизовой кислоты (Kurkela, Frank, 1990; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1994; Hughes, Dunn, 1996).

Многочисленные исследования показали, что развитие холодостойкости - комплексный признак, проявляющийся при слаженном действии различных систем растительного организма. В настоящее время интенсивно исследуются отдельные этапы развития стрессового ответа (трансдукция сигнала, активация транскрипции генов, посттранскрипционные процессы). Однако последовательность прохождения холодового сигнала и молекулярные механизмы этого процесса изучены недостаточно полно. Удобной моделью для подобных исследований является клонированный в нашей лаборатории ген белка холодового шока капусты CSP5, активацию экспрессии которого можно принять на нуклеотидном уровне за конечную точку в последовательности событий стрессового ответа растений (Баймиев и др., 1999).

Широкое применение для простой и удобной количественной оценки уровня экспрессии различных генов, содержащих интроны, в том числе и гена белка холодового шока капусты CSP5, может найти разработанный метод с применением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с переносом энергии от праймера к праймеру, которые имеют в своем составе красители с перекрывающимися спектрами испускания и возбуждения, обеспечивающие эффект флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET-эффект, Fluorescent Resonance Energy Transfer). В результате подбора места отжига праймеров по краям соседних экзонов при амплификации молекул РНК будет наблюдаться эффект переноса энергии, а вклад геномной ДНК, за счет удаленного расположения праймеров друг от друга, будет, таким образом, полностью отсечен, поскольку в этом случае эффекта переноса энергии не будет из-за большего расстояния между красителями.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы заключалась в исследовании молекулярных механизмов восприятия и передачи клетками растений капусты сигнала окружающей среды об изменениях температуры для активации гена белка холодового шока CSP5.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. провести исследование влияния состояния цитоплазматической мембраны и цитоскелета на экспрессию гена CSP5;

2. изучить влияние ионов Са2+ на экспрессию гена CSP5;

3. исследовать влияние активности протеинкиназ на экспрессию гена CSP5;

4. исследовать влияние 24-эпибрассинолида на экспрессию гена CSP5;

5. провести детекцию изменений в экспрессии гена CSP5 модифицированным методом ПЦР в реальном времени.

Научная новизна.

Показано, что передача низкотемпературного сигнала из внешней среды, вызывающего стрессовый ответ растения, происходит многоступенчато. Начальными этапами процесса трансдукции холодового сигнала являются активация кальциевых каналов и увеличение потока ионов кальция в цитоплазму, сопровождаемое активацией кальцийзависимых протеинкиназ, участвующих, по-видимому, в активации факторов транскрипции, задействованных в экспрессии гена белка холодового шока капусты CSP5.

Впервые было показано влияние 24-эпибрассинолида на экспрессию гена CSP5.

Показана возможность применения варианта ПЦР-РВ с переносом энергии от праймера к праймеру для исследования уровня экспрессии гена CSP5 при различных условиях низкотемпературного стресса при существенном сокращении времени эксперимента.

Полученные нами данные углубляют представления о процессах восприятия растениями холодового сигнала окружающей среды и некоторых общих механизмах адаптации растений к неблагоприятным условиям обитания.

Практическая значимость работы. Знание молекулярных механизмов развития холодостойкости и закаливания растений может послужить основой для развития новых стратегий усиления холодостойкости и увеличения продуктивности, а также расширения области возделывания сельскохозяйственных культур. Расширение области применения варианта ПЦР-РВ с переносом энергии от праймера к праймеру значительно ускорит исследование индуцируемых внешними воздействиями генов, характеризующихся наличием интронов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002); XIII конгрессе FESPB (Heraklion, 2002); V съезде Общества физиологов растений (Пенза, 2003); Всероссийской научной конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004); Международной конференции

Физиологические и молекулярно-геиетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 207 названий. Работа изложена на 110 страницах и содержит 17 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Матниязов, Рустам Тахирович

ВЫВОДЫ

1. Показано, что передача низкотемпературного сигнала из внешней среды происходит многоступенчато. Начальными этапами являются активация кальциевых каналов и увеличение потока ионов кальция в цитоплазму, сопровождаемое активацией кальций-зависимых протеинкиназ, участвующих, по-видимому, в активации факторов транскрипции, задействованных в экспрессии гена белка холодового шока капусты CSP5.

2. Доказана роль процессов реорганизации цитоскелета в активации экспрессии гена белка холодового шока капусты CSP5.

3. Впервые показана стимуляция экспрессии гена CSP5 под влиянием 24-эпибрассинолида.

4. Использование гена белка холодового шока капусты CSP5 как маркерного гена, чутко реагирующего на понижение температуры, показало возможность применения варианта ПЦР-РВ с переносом энергии от праймера к праймеру для исследования уровня экспрессии гена CSP5 при низкотемпературном стрессе при существенном сокращении времени эксперимента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование ответных реакций растений на изменяющиеся условия окружающей среды, в том числе и на понижение температуры, является важной проблемой в физиологии растений. В цепи восприятия и передачи холодового сигнала ключевое место отводится плазматической мембране, понижение текучести которой при низкой температуре вызывает активацию механочувствительных кальциевых каналов. В результате резко усиливается поток ионов кальция в цитоплазму, что приводит к запуску каскада реакций, включающего активацию определенных протеинкиназ, экспрессию генов транскрипционных факторов и, в конечном счете, индукцию экспрессии генов ответной реакции растения на низкотемпературный стресс. Изменение экспрессии гена белка холодового шока капусты CSP5 при модулировании текучести плазматической мембраны клеток капусты с помощью химических агентов служит подтверждением значительной роли плазматической мембраны в трансдукции холодового сигнала. В то же время есть данные о том, что поток ионов кальция в цитоплазму стимулируется и реорганизацией микротрубочек и микрофиламентов. Нами показано, что вещества, стабилизирующие микротрубочки, способствовали подавлению индукции гена CSP5 при воздействии низкой температуры, в то время как вещества, дестабилизирующие элементы цитоскелета, наоборот, вызывали индукцию этого гена при 25°С. Эти наблюдения подтверждают предположение Орвара и сотр. (Orwar et al., 2000), что в цепи трансдукции холодового сигнала этап реорганизации цитоскелета следует за уменьшением текучести плазматической мембраны. Реорганизация цитоскелета, по-видимому, приводит к активации кальциевых каналов, что в свою очередь обеспечивает поток ионов кальция в цитоплазму и дальнейшее прохождение холодового сигнала, завершающееся адекватным стрессовым ответом.

Также значительную роль в регуляции экспрессии генов у растений при воздействии на них различных биотических и абиотических факторов играет

86 фосфорилирование белков. Известно, что эти воздействия первоначально вызывают флуктуации в концентрации ионов кальция в цитоплазме. Связывающим звеном между колебаниями концентрации Са2+ и изменениями в экспрессии генов и метаболизме, по всей видимости, является активность кальций-зависимых протеинкиназ. Наши исследования с применением хелатора ионов кальция EGTA и Са-ионофора А23187, стимулирующего поток ионов кальция, также подтвердили значение потока ионов кальция на уровень экспрессии CSP5. Было изучено влияние на уровень экспрессии CSP5 блокаторов кальциевых каналов нифедепина и цинаразина. При этом нифедипин, блокирующий кальциевые каналы плазматической мембраны, оказывал эффект в подавлении экспрессии CSP5, в то время как цинаразин -блокатор каналов внутриклеточных кальциевых депо, существенного влияния на экспрессию CSP5 не оказал.

С использованием ингибиторов протеинкиназ было изучено влияние фосфорилирования белков на уровень экспрессии гена белка холодового шока капусты. Результаты показали, что при холодовой акклимации растений капусты наблюдается повышение активности протеинкиназ, выявляемое по увеличению уровня фосфорилирования белков из растений, выращенных в среде с содержанием Р -ортофосфата, а также по фосфорилированию гистона как субстрата для протеинкиназ в белковых экстрактах из акклиматизированных растений в реакциях in vitro.

Таким образом, показан многоступенчатый характер передачи низкотемпературного сигнала из внешней среды, вызывающего соответствующий стрессовый ответ растения, включающий активацию кальциевых каналов, в частности, в результате изменения состояния клеточных мембран, реорганизацию цитоскелета и увеличение потока ионов кальция в цитоплазму, подтверждаемое результатами опытов с хелаторами ионов кальция. Повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме приводит к активации кальций-зависимых протеинкиназ, участвующих, по всей видимости, в индукции транскрипционных факторов, необходимых для экспрессии регулируемых холодом генов стрессового ответа.

Несмотря на то, что в последние годы наблюдается существенный прогресс в изучении процессов холодового ответа растений, требуются дальнейшие исследования различных генов, задействованных в таком ответе. Очевидно, использование разработанного в нашей лаборатории метода с применением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с переносом энергии от праймера к праймеру может оказаться полезным для подобных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матниязов, Рустам Тахирович, Уфа

1. Аванов А .Я. Биологические антифризы и механизм их активности // Молекулярная биология. 1990. Т. 24, №3. С. 581-597.

2. Аллагулова Ч.Р., Гималов Ф.Р., Шакирова Ф.М., Вахитов В.А. Дегидрины растений: их структура и предполагаемые функции // Биохимия. 2003. Т. 68, вып.9. С. 1157-1165.

3. Баймиев Ан.Х., Гималов Ф.Р., Чемерис А.В., Вахитов В.А. Экспрессия гена аланин-богатого белка капусты при различных условиях холодовой акклимации // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 4. С. 605-609.

4. Блехман Г.И., Шеламова Н.А. Синтез и распад макромолекул в условиях стресса// Успехи современной биологии. 1992. Т. 112, № 2. С. 281-297.

5. Бокебаева Г.А. Защитное действие брассиностероидов на растения ячменя при засолении. 1991. Автореферат дис. канд. биол. наук. М.: МГУ. 25 с.

6. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г., Джекоб Л., Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Дж. Выделение мезофильных протопластов табака. В кн.: Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. М.: Мир, 1991. С 143-151.

7. Дроздов С.Н. Влияние температуры внешней среды на холодо- и теплоустойчивость активно вегетирующих растений // Терморезистентность и продуктивность сельскохозяйственных растений. Петрозаводск, 1984. С.З.

8. Зыкова В.В., Грабельных О.И., Владимирова С.В., Королева Н.А., Колесниченко А.В., Войников В.К. Стрессовый разобщающий белок БХШ 310 индуцирует перекисное окисление липидов в митохондриях пшеницы при гипотермии // Доклады РАН. 2000. С.

9. Зыкова В.В., Колесниченко А.В., Войников В.К. Участие активных форм кислорода в реакции митохондрий растений на низкотемпературный стресс // Физиология растений. 2002а. Т. 49. С. 302-310.

10. Карасев Г.С., Астахова Н.В., Райхман JI.A., Трунова Т.И. Действие низкой положительной температуры на содержание белков и ультраструктуру клеток огурца и томата // Физиология растений. 1995. - Т. 42. №6. - С. 855-861.

11. Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К., Корчуганова Е.Е., Абубакирова М.Р. Роль фосфорилирования белков и АТФаз в переносе Са и Na в клетках водоросли Dunaliella maritime // Цитология. 1996. Т. 38. №2. С. 207.

12. Каримова Ф.Г., Жуков С.Н. Влияние цАМФ на фосфорилирование белков листьев гороха при низкой положительной температуре // Докл. АН СССР. 1991. 316, №5. С. 1277-1279.

13. Касперска-Палач А. Механизмы закаливания травянистых растений. В кн.: Холодостойкость растений. М., «Колос». 1983. С. 112-123.

14. Колесниченко А.В., Боровский Г.В., Войников В.К., Мишарин С.И., Антипина А.И. Характеристика белка из озимой ржи, накапливающегося при гипотермии // Физиология растений. 1996. Т. 43, №6. С. 894-899.

15. Константинов Ю.М., Луценко Г.Н., Подсосоный В.А., Зыкова В.В. Исследование перекисного оксиления липидов в растительных митохондриях в связи с проблемой темпероатурного стресса // Стрессовые белки растений. Н.: Наукаю 1989. С. 88-113.

16. Кравец B.C. Развитие представлений об адаптации растений к низким температурам // Физиология и биохимия культурных растений. 1996. Т.28, №3. С. 167-182.

17. Левит Дж. Повреждения и выживание после замораживания и в связи с другими повреждающими воздействиями. В кн.: Холодостойкость растений. М., «Колос». 1983. С. 10-22.

18. Лукаткин А. С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. 1. Образование активированных форм кислорода при охлаждении растений // Физиология растенийю 2002а. Т. 49, №5. С. 697-702.

19. Лукаткин А. С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. 2. Активность антиоксидантных ферментов в динамике охлаждения. Физиология растений. 20026. Т. 49, №6. С. 878-885.

20. Лукаткин А.С., Шаркаева Э.Ш., Зауралов О.В. Изменения перекисного окисления липидов в листьях теплолюбивых растений при различной длительности стресса // Физиология растений. 1995. Т. 42. С. 607-611.

21. Медведев С.С. Кальциевая сигнализация в растениях // Санкт-Петербургский университет. 2000. № 20 (3543). С. 13-14.

22. Скулачев В.Г. О биохимических механизмах эволюции и роли кислорода//Биохимия. 1998. Т. 63. С. 1570-1579.

23. Филиппов П.П. Как внешние сигналы передаются внутрь клетки // Соросовский образовательный журнал. 1998. №3. С. 28-34.

24. Хохлова Л.П., Олиневич О.В. Реорганизация цитоскелета в клетках Triticum aestivum при закаливании растений к холоду и действии абсцизовой кислоты // Физиология растений. 2003. Т. 50, № 4. С. 528540.

25. Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Лахвич Ф.А. Перспективы практического применения брассиностероидов нового класса фитогормонов // Сельскохозяйственная биология. 1995ю Т. 1. С. 3-11.

26. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и еерегуляция. 2001. Уфа: Гилем. 160 с.

27. Шакирова Ф.М., Безрукова М.В. Изменение уровня АБК и лектина в корнях проростков пшеницыпод влиянием 24-эпибрассинолида и засоления//Физиология ратсений. 1998. Т. 45. С. 451-455.

28. Шакирова Ф.М. Максимов И.В., Хайруллин P.M. и др. О влиянии септориоза колоса на динамику накопления лектина и содержание фитогормонов в развивающихся зерновках пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. 1994. Т. 26. С. 40-45.

29. Allen G.J., Kuchitsu К., Chu S.P., Murata Y., Schroeder J.I. Arabidopsis abi 11 and abi2-l phosphatasemutations reduce abscisic acid-induced cytoplasmic calcium rises in guard cells // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1785-1798.

30. Alonso A., Queiroz C.S., Magalhaes A.C. Chilling stress leads to increased membrane rigidity in roots of coffee (Coffea arabica L.) seedlings // Biochem. Biophys. Acta. 1997. V. 1323. P. 75-84.

31. Antikainen M., Griffith M. Antifreeze protein accumulation in freezing-tolerant cereals//Physiol. Plantarum. 1997. V. 99. P. 423-432.

32. Baker J., Steele C., Dure I. Sequence and characterization of 6 lea proteins and their genes from cotton // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 277-291.

33. Baker S.S., Wilhelm K.S., Thomashow M.F. The 5-region of Arabidopsis thaliana cor 15a has cis-acting elements that confer cold-, drought- and ABA-regulated gene expression // Plant Mol. Biol. 1994. V 24. P. 701-713.

34. Bent A.F. Plant mitofen-activated proteinkinase cascades: negative regulatory roles turn out positive // PNAS. 2001. V. 98. No 3. P. 784-786.

35. Borge L., Calderini O., Binarova P., Mattauch M., Till S., Kiegerl S., Jonak C., Pollaschek C., Barker P., Huskisson N.S., Hirt H., Heberle-Bors E. A

36. MAP kinase is activated late in plant mitosis and becomes localized to the plane of cell division // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 101-113.

37. Bollen M., Beullens M. Signaling by protein phosphatases in the nucleus // Trends in Cell Biology. V. 12. No 3. P. 138-145.

38. Boothe J.G., Sonnichsen F.D., de Beus M.D., Johson-Flanagan A.M. Purification, characterization and structural analysis of a plant low-temperature-induced protein // Plant Physiol. 1997. V. 113, N2. P. 367-376.

39. Boyer J.S. Plant productivity and environment // Science. 1982. V. 218. P. 413448.

40. Bray E.A. Drought- and ABA-induced changes in polypeptide and mRNA accumulated in tomato leaves // Plant Physiol. 1988. - V.88, N4. - P. 12101214.

41. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye bindi // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-252.

42. Breton G., Vazquez-Tello A., Danyluk J., Sarhan F. Two novel intrinsic annexins accumulate in wheat membranes in response to low temperature // Plant Cell Physiol. 2000. V. 41(20). P. 177-184.

43. Browse J., Xin Z. Temperature sensing and cold acclimation // Current Opinion in Plant Biology. V. 4. P. 241-246.

44. Bush D.S. Regulation of cytosolic calcium in plants. Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 7-13.

45. Camoni L., Harper J.F., Palmgren M.G. 14-3-3 proteins activate a plant calcium-dependent protein kinase (CDPK) // FEBS Lett. 1998. V. 430. P. 381-384.

46. Cattivelli L., Bartels D. Molecular Cloning and characterization of cold-regulated genes in barley // Plant Physiol. 1990. V.93. P.1504-1510.

47. Chen H.H., Li P.H., Brenner M.L. Involvment of abscisic acid in potato cold acclimation // Plant Physiol. 1983. V.71, N2. P. 362-365.

48. Chen THH, Gusta L.V., Abscisic acid-induced freezing tolerance in cultured plants cells // Plant Physiol. 1983. V. 73. P. 71-75.

49. Clewell D.B., Helinsky D.R. Supercoiled circular DNA-protein complex in

50. E.coli purification and induced convertion to an open circular DNA form // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. 62, N4. P. 1159-1162.

51. Close J. Dehydrins: Testing the link between DHN genes and freezing tolerance in barley timothy // Plant Physiol. 1996. V. 111, No. 2. Suppl. P. 28.

52. Cohen S.N., Chang A.C.Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69, N8. P. 2110-2114.

53. Cook D., Fowler S., Fiehn O., Thomashow M.F. A prominent role for the cold ewsponse pathway in configuring the low-temperature methabolome of Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. N. 42. P. 1524315248.

54. Danyluk J., Carpentier E., Sarhan F. Identification and characterization of a low temperature regulated gene encoding an actin-binding protein from wheat. // FEBS Lett. 1996. V. 389. N. 3. P. 324-327.

55. Danyluk J., Perron A., Houde M., Limin A., Fowler В., Benhamou N., Sarhan

56. Denhardt D.T. A membrane-filter technique for detection of complementary DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1966. V. 23, N5. P. 641-652.

57. DeVries A.L.,Komatsu S.K., Feeney R.E. Chemical and physical properties of freezing point-depressing glycoproteins from Antarctic fishes // J. Biol. Chem. 1970. V. 245. P. 2901-2908.

58. Ding J.P., Pickard B.G. Modulation of mechanosensitive calcium-selective cation channels by temperature. Plant J. 1993. V. 3. P. 713-720.

59. Du L., Chen Z. Identification of genes encoding receptor-like protein kinases as possible targets of pathogen- and salicylic acid-induced WRKY DNA-binding proteins in Arabidopsis // Plant Journal. 2000. V. 24. No 6. P. 837847.

60. Duman J., Horwath K. The role of hemolymph proteins in the cold tolerance of insects //Annu. Rev. Physiol. 1983. V. 45. P. 261-270.

61. Dunlap J.R., Binzel M.A. Is indole-3-acetic acid part of the signal mechanism regulating salinity stress in tomato // Plant Physiol. 1994. V. 105, N 1. P. 24.

62. Dure L., Crouch M., Harada J., Ho D.T.-H., Mundy J., Quatrano R., Thomas Т., Sung Z.R. Common amino acid sequence domains among the Lea proteins of higher plants//Plant Mol. Biol. 1989. V. 12. P. 475-486.

63. Ellis R.J. Proteins as molecular chaperones // Nature. 1987. 328, No.l. P. 228232.

64. Gao M.-J., Allard G., Byass L., Flanagan A.M., Singh J. Regulation and characterization of four CBF transcription factors from Brassica napus // Plant Mol. Biol. 2002. V. 49. P. 459-471.

65. Gerke V., Moss S.E. Annexins and membrane dynamics // Biochem. Biophys. Acta. 1997. V. 1357. P. 129-154.

66. Gibson S., Arondel V., Iba K., Somerville C. Cloning of a temperature-regulated gene encoding a chloroplast omega-3-desaturase from Arabidopsis // Plant Physiol. 1994. V. 106. P. 1615-1621.

67. Gilmour S.J., Artus N.N., Thomashow M.F. cDNA Sequence analysis and expression of two cold-regulated genes of Arabidopsis thaliana // Plant Mol. Biol. 1992. V.18. P.13-21.

68. Gilmour S.J., Lin C., Thomashow M.F. Purification and properties of Arabidopsis thaliana COR (cold-regulated) gene polypeptides COR15am and COR6.6 expressed in Esherichia coli // Plant Physiol. 1996. V. 111. P. 293-299.

69. Gilmour S.J., Seblot A.M., Salazar M.P., Everard J.D., Thomashow M.F. Overexpression of Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation // Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 1854-1865.

70. Gilmour S.J., Zarka D.G., Schabenberger O., Thomashow M.F. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance // Science. 1998. V. 280. N 5360. P. 104-106.

71. Gilmour S.L., Thomashow M.F. Cold acclimation and cold-regulated gene expression in ABA mutants Arabidopsis thaliana // Plant Mol. Biol. 1991, N 17, P. 1233-40.

72. Gomez J., sanches-Martinez D., Stiefel V. et al. A gene induced by the plant hormone abscisic acid in response to water stress encodes a glycine-rich protein // Nature. 1988. - V. 334, N6179. - P. 262-264.

73. Gomus E., Jakobsen M.K., Axelsen K.B., Geisler M., Palmgren M.G. Chilling tolerance in arabidopsis involves ALAI, a member of a new family of putative aminophospholipid translocases // Plant Cell. 2000. V. 12. P. 2441-2454.

74. Gong M., van der Luit A.H., Knight M., Trewavas A.J. Heat-shock-induced changes in intracellular Ca level in tobacco seedlings in relation to thermotolerance // Plant Physiol. 1998. V. 116. P. 429-437.

75. Graciana A., Fosset M., Ranjeva R., Hetherington A.M., Lazdunski M. Calcium channel inhibitors that bind to plant cell membranes block calcium entry into protoplasts. Biochemistry. 1988. V. 27. P. 764-768.

76. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. V. 85. P. 609-613.

77. Gregory L.E., Mandava N.B. The activity and interaction of brassinolide and gibberelic acid in mung bean epicotyls. Physiol. Plant. 1982. V. 54. P. 239243.

78. Grove D.M., Spenser G.F., Rohwedder W.K. et al. Brassionolide, a plant growth-promoting steroid isolated from Brassica napus pollen //Nature. 1979. V. 281. P. 216-217.

79. Gu Y.-Q., Yang C., Thara V.K., Zhou J.m, Martin G.B. Pti4 is induced by ethylene and salicylic acid, and its product is phosphorilated by Pto kinase // Plant cell. 2000. V. 12. P. 771-786.

80. Guy C.L., Huber J.I.A., Huber S.C. Sucrose phosphate synthase and sucrose accumulation at low temperature // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 502-508.

81. Hanson P.L., Schulman H. Neuronal Ca/calmodulin-dependent protein kinases // Annu. Rev. Biochem. 1992. 61. P. 559-601.

82. Harmon A.C., Gribskov M., Harper J.F. CDPK's a kinase for every Ca signal? // Trends Plant Biol. 2000. V. 5. P. 154-159.

83. Heino P., Sandman G., Lang V., Nordin K., Palva E.T. Abscisic acid deficiency prevents development of freezing tolerance in Arabidopsis thaliana // Theoretical and applied genetics. 1990. V. 79. P. 801-816.

84. Hincha D.K., Smitt J.M. Cryoprotective leaf proteins: assay methods and heat stability // J. Plant Physiol. 1992. V. 140, N2. P. 236-240.

85. Hong S.W., Jon J.H., Kwak J.M., Nam H.G. Identification of a receptor-like protein kinase gene rapidly induced by abscisic acid, dehydration, high salt and cold treatment in Arabidopsis thaliana // Plant Physiology. 1997. V. 113. P. 1203-1212.

86. Horvath D., McLarney B.K., Thomashow M.F. Regulation of Arabidopsis thaliana L. (Heyn) cor 78 in response to low temperature // Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 1047-1053.

87. Hoyos M.E., Zhang S. Calcium-independent activation of salicylic acid-induced protein kinase and a 40-kilodalton protein kinase by hyperosmotic stress // Plant Physiology. 2000. V. 122. P. 1355-1364.

88. Hughes M.A., Dunn M.A. The molecular biology of plant acclimation to low temperature //J. Exp. Bot. 1996. V. 47. P. 291-305.

89. Hughes M.A., Dunn M.A., Pierce R.S., White A.J., Zhang L. An abscisic-acid-responsive, low temperature barley gene has homology with a maize phospholipid transfer protein // Plant Cell Environ. 1992. V. 15. P.861-865.

90. Hwang I., Sze H., Harper J.F. A calcium-dependent protein kinase can inhibit a calmodulin-stimulated Ca pump (ACA2) located in endoplasmic reticulum of Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 6224-6229.

91. Ichimura K., Mizoguchi Т., Yoshida R., Yuasa Т., Shinozaki K. Various abiotic stresses rapidly activate Arabidopsis MAP kinases ATMPK4 and ATMPK6 // Plant Journal. 2000. V. 24. No5. P. 655-665.

92. Jaglo-Ottosen K.R., Gilmour S J., Zarka D.G., Schabenberger O., Thomashow M.F. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance // Science. 1998. V. 280. P. 104-106.

93. Jang H.J., Pih K.T., Kang S.G., Lim J.H., Jin J.B., Piao H.L., Hwang I. Molecular cloning of a novel Ca-binding protein that is induced by NaCl stress // Plant Mol. Biol. 1998. V. 37(5). P. 839-847.

94. Janowiak F., Luck E., Dorffling K. Chilling toleranceof maize seedlings in the field during cold periods in spring is relared to chilling-induced increase in abscisic acid level // J. Agronomy and Crop Science. 2003. V. 189. P. 156161.

95. Jonak C., Kiegerl S., Ligterink W., Barker P. J., Huskisson N.S., Hirt H. Stress signaling in plants: a mitogen-activated protein kinase pathway is activated by cold and drought // PNAS. 1996. V. 93. No 20. P. 11274-11279.

96. Karimzadeh G., Francis D., Davies M.S. Low-temperature-induced accumulation of protein is sustained both in root meristems and in callus in winter wheat but not in spring wheat // Annals of Botany. 2000.V. 85. No 6. P. 769-777.

97. Katou S., Senda K., Yoshioka H., Doke N., Kawakita К. A 51 kDa protein kinase of potato activated with hyphal wall components from Phytophtora infestans // Plant Cell Physiol. 1999. V. 40(8). P. 825-831.

98. Kikkawa U., Minakuchi R., Takoi Y., Nishizuka Y. Calcium activated phospholipid dependent protein kinase (Protein kinase C) from rat brain // Methods Enzymology. 1983. V. 99. P. 288-289.

99. Knight H., Brandt S., Knight M.R. A history of stress alters drought calcium signaling pathways in Arabidopsis//Plant J. 1998. V. 16(6). P. 681-687.

100. Knight H., Trewavas A.J., Knight M.R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 489-503.

101. Knight H., Veale E.L., Warren G.J., Knight M.R. The sfr6 mutation in Arabidopsis suppresses low-temperature induction of genes dependent on the CRT/DRE sequence motif// Plant Cell. 1999. V. 11. P. 875-886.

102. Knight M.R., Campbell A.K., Smith S.M., Trewavas A.J. Transgenic plant aequarin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352. P. 524-526.

103. Knight M.R., Smith S.M., Trewavas A.J. Wind-induced plant motion immediately increase cytosolic calcium // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1992. 89. P. 4967-4971.

104. Kratsch H.A., Wise R.R. The ultrastructure of chilling stress // Plant, Cell and Environment. 2000. V. 23. P. 337-350.

105. Krishna P., Sacco M., Cherutti J.F., Hill S. Cold-induced accumulation of hsp 90 transcripts in Brassica napus // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 915-923.

106. Kurkela S., Franck M. Cloning and charactrerisation of a cold- and ABA-inducible Arabidopsis gene // Plant Mol. Biol. 1990. V. 15. P. 137 -144.

107. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 (1979) Nature, 227: 680-685.

108. Lang V., Palva E. T. The expression of a rab-reguiated gene, гаЫ8, is induced by abscisic acid during the cold acclimation process of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Plant Mol. Biol. 1992. V. 20. P. 951-962.

109. Lee J.Y., Yoo B.C., Harmon A.C. Kinetic and calcium-binding properties of three calcium dependent protein kinase isoenzimes from soybean // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 6801-6809.

110. Leung J., Giraudat J. Ascisic acid signal transduction// Annu. Rev. plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V.49. P. 199-222.

111. Lin Q., Ewart K.V., Yang D.S.C., Hew C.L. Studies of a putative ice-binding motif in winter flounder skin-type anti-freeze polypeptide // FEBS Letters. 1999. V. 453. P. 331-334.

112. Llorente F., Oliveros J.C., Martinez-Zapater J.M., Salinas J. A freezing-sensitive mutant of Arabidopsis, frs 1, is a new aba3 allele // Planta. 2000. V. 211. No 5. P. 648-655.

113. Mantyla E., Lang V., Palva E.T. Role of abscisic acid in drought-induced freezing tolerance cold acclimation and accumulation of LTI 78 and RAB 18 proteins in Arabidopsis thaliana// Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 141-148.

114. Martin M.L., Busconi L. Membrane localization of a rice calcium-dependent protein kinase (CDPK) is mediated by myristoylation and palmitoylation // Plant Journal. 2000. V. 24. No 4. P. 429-435.

115. Mason R.P., Moisey D.M., Shajenko L. Cholesterol alter the binding of calcium channel blockers to the membrane lipid bilayer. Mol.Pharmocol. 1992. V. 41. P. 315-321.

116. Maxam A., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74, N 2. P. 560-564.

117. Mazars C., Thion L., Thuleau P., Graziana A., Knight M.R., Moreau M., Ranjeva R. Organization of cytoskeleton controls changes in cytosolic calcium of cold-shocked Nicotiana plumbaginifolia protoplasts //Cell Calcium. 1997. V. 22. P. 413-420.

118. Meinkoth J. And Wahl G. Hybrization of nucleic acids immobilized on solid supports // Anal. Biochem. 1979. V. 138. P. 267.

119. Mitchell J.W., Mandava N., Worley J.F. et al. Brassins a new family of plant hormones from rape pollen // Nature. 1970. V. 225. P. 1065-1066.

120. Mizoguchi Т., Hayashida N., Yamaguchi-Shinozaki K., Kamada H., Shinozaki K. Two genes that encode ribosomal-protein S6 homologs are induced by cold or salinity stress in Arabidopsis thaliana // FEBS Letters. 1995. V.358.P. 199-204.

121. Mohapatra S.S., Poole R.J., Dhindsa R.S. Cold acclimation, freezing resistance and protein synthesis in alfalfa (Medicago sativa L. cv. Saranac) // J. Experimental Botany. 1987. V. 38, N. 195. P. 1697-1703.

122. Monroy A.F., Castonguay Y., Laberge S., Sarhan F., Vezina L.P., Dhindsa R.S. A new cold-induced alfalfa gene is associated with enhanced hardening at subzero temperature // Plant Physiol. 1993. V. 102, N3. P. 873-879.

123. Monroy A.F., Dhindsa R. Low-temperature signal transduction: induction of cold acclimation-specific genes of alfalfa by calcium at 25°C // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 321-331.

124. Monroy A.F., Sarhan F., Dhindsa R.S. Cold induced changes in freezing tolerance, protein phosphorylation and gene expression: evidens for a role of calcium//Plant Physiol. 1993. 102, N4. P.1227-1235.

125. Moreno M.L., Ferrero M.L., Torre C.D. The pattern of polypeptides in proliferating cells of Allium сера L. roots during cold and heat conditions // J. Plant Physiol. 1994. V. 143. P. 759-762.

126. Murata N., Los D.A. Membrane fluidity and temperature perception // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 875-879.

127. Nordin K., Heino P., Palva E.T. Separate Signal Pathways Regulate the Expression of a Low Temperature-Induced Gene in Arabidopsis thaliana // Plant Mol. Biol. 1991. V. 16. P. 1061-1071.

128. Nordin K.„ Vohale Т., Palya E. T. Differential expression of two related, low temperature-induced genes in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Plant Mol. Biol. 1993. V. 21. P. 641-653.

129. Ohme Takagi M., Shimshi H. Ethyleneinducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 173182.

130. Olinevich O.V., Khokhlova L.P., Raudaskoski M. Effect of abscisic acid and cold acclimation on the cytoskeletal and phosphorylated proteins in different cultivars of Triticum aestivum L. // Cell Biology International. 2000. V. 24. No 6. P. 365-373.

131. Orr W., lu В., White Т. C., Robert L. S., Singh J. Complementary sequence of a low temperature induced B-napus gene with homology to the Arabidopsis thaliana kin 1 gene // Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 1532-1534.

132. Orvar B.L., Sangwan V., Omann F., Dhindsa R.S. Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity // Plant J. 2000. V. 23: P. 785-794.

133. Patharkar O.R., Cushman J.C. A stress-induced calcium-dependent protein kinase from Mesembryanthemum crystallinum phosphorylates a two-component pseudo-response regulator // Plant Journal. 2000.V. 24. No 5. P. 679-691.

134. Pearce R.S. Extracellular ice and cell shape in frost-stressed cereal leaves: a low temperature scanning-electron-microscopy study // Planta. 1988. V. 175. P. 313-324.

135. Perras M., Sarhan F. Synthesis of freezing tolerance proteins in leaves, crown, and roots during cold acclimation of wheat // Plant Physiol. 1989. V. 89. P. 577-585.

136. Phillips J.R., Dunn M.A., Hughes M.A. mRNA stability and localization of the low-temperature-responsive barley gene family bit 14 // Plant Molecular Biology. 1997. V. 33. P. 1013-1023.

137. Polisensky D.H., Braam J. Cold-shock regulation og the arabidopsis TCH genes and the effects of modulating intracellular calcium levels // Plant Physiol. 1996. V. 111. P. 1271-1279.

138. Rajashekar C.B., Laflta A. Cell-wall changes and cell tension in response to cold acclimation and exogenous abscisic acid in leaves and cell cultures // Plant Physiology. 1996. V. 111. P. 605-612.

139. Rincon M., Boss W.F. myo-Inositol thisphosphate mobilizes calcium from fusogenic carrot (Daucus carrota L.) protoplasts. Plant Physiol. 1987. V. 83. P. 395-398.

140. Robertson A.J., Gusta L.V., Reaney M.J.T., Ishikawa M. Identification of proteins correlated with increased freezing tolerance in bromegrass (Bromus inermis Leyss. Cv. Manchar) cell cultures // Plant Physiol. 1988. V. 86. P. 344347.

141. Romeis Т., Piedras P., Jones J.D.G. Resistance gene-dependent activation of calcium-dependent protein kinase in the plant defence response // Plant Cell. 2000. V. 12. P. 803-816.

142. Saijo Y., Hata S., Kyozuka J., Shimamoto K., Izui K. Over-expression of a single Ca-dependent protein kinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants // Plant Journal. 2000. V. 23. No 3. P. 319-327.

143. Samuel M., Miles G.P., Ellis D.E. Ozone treatment rapidly activates MAP kinase signaling in plants // Plant Journal. 2000. V. 22. No 4. P. 367-376.

144. Sanders D., Brownlee C., Harper J.F. Communicating with calcium // Plant cell. 1999. V. 11. P. 691-706.

145. Sangwan V., Foulds I., Dhindsa R.S. Cold-activation of Brassica napus BN115 promoter is mediated by structural changes in membranes and cytoskeleton, and requires Ca influx // Plant Journal. 2001. V. 27. No 1. P. 112.

146. Sarokin P.L., Chua N.H. Binding sites for two novel phosphoproteins, 3Af5 and 3Af3, are required for rbc-3A expression // Plant Cell. 1992. 4, N2. P. 473-483

147. Schaffer M.A., Fischer R.L. Analysis of mRNAs that accumulate in response to low temperature identifies a thiol protease gene in tomato // Plant Physiol. 1988. V. 87. P. 431-436.

148. Schaller E.G., Harmon A.C., Sussman M.R. Characterization of a calcium and lipid-depended protein kinase associated with plasma membrane of oat // Biochemistry. 1992. V.31. P. 1721-1727.

149. Schneider A., Salamini F., Gebhardt C. Expression patterns and promoter activity of the cold-regulated gene ci21A of potato // Plant. Physiol. 1997. V. 113, N2. P. 335-345.

150. Shi J., Kim K.-N., Ritz O., Albrecht V., Gupta R., Harter K., Luan S., Kudla J. Novel protein kinases associated with calcineurin B-like calcium sensors in Arabidopsis //Plant Cell. 1999. V. 11. P. 2393-2406.

151. Shin H.J., Lee D.E., Shin D.H., Kim K.U., Kim H.Y., Ohashi Y., Han O., Baik M.G., Back K. Molecular cloning and cultivar specific expression of MAP kinases from Capsicum annuum // Molecules and Cells. 2001. V. 11. No l.P. 48-54.

152. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki. Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways // Current Opinion in Plant Biology. 2000. V. 3. P. 217-223.

153. Shibaoka N., Nagai R. The Plant Cytoskeleton // Curr. Opin. Cell Biol. 1994. V. 6. P. 10-15.

154. Siminovich D., Cloutier Y. Twenty-four-hour induction of freezing and drought tolerance in plumules of winter rye seedlings by desication stress at room temperature in the dark// Plant Physiol. 1982. V. 69. P. 250-255.

155. Skriver K., Mundy J. Gene response to ABAs and osmotic stress // Plant Cell. 1990. V. 2. P. 503-5012.

156. Southern E. Detection of specific sequens among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503.

157. Struglics A., Fredlunds K.M., Moller I.M., Allen J.F. Phosphoproteins and protein kinase activities intrinsic to inner membranes of potato tuber mitochondria//Plant Cell Physiol. 1999. V. 40. No 12. P. 1271-1279.

158. Suzuki I., Los D.A., Kanesaki Y., Mikami K., Murata N. The pathway for perception and transduction of low-temperature signals in Synechocystis // EMBO J. 2000. V. 19. P. 1327-1334.

159. Tahtiharju S., Sangwan V., Monroy A.F., Dhindsa R.S., Borg M. The . induction of kin genes in cold-acclimating Arabidopsis thaliana. Evidence of arole for calcium//Planta. 1997. V. 203(4). P. 442-447.

160. Tamminen I., Makela P., Heino P., Palva E.T. Ectopic expression of ABI3 gene enhances freezing tolerance in response to abscisic acid and low temperature in Arabidopsis thaliana// Plant Journal. 2001. V. 25. No 1. P. 1-8.

161. Thomashow M.F. Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 1-8.

162. Thion L., Mazars C., Thuleau P., Graciana A., Rossignol M., Moreau M., Ranjeva R. Activation of plasma membrane voltage-dependent calcium-permeable channels by disruption of microtubules in carrot cells // (1996) FEBS Lett., 393: 13-18.

163. Torrecilla I., Leganes F., Bonilla I., Fernandez-Pinas F. Use of recombinant aequorin to study calcium gomeostasis and monitor calcium transients in response to heat and cold shock in cyanobacteria // Plant Physiol. 2000. V. 123. P. 161-176.

164. Trewavas A., Gilroy S. Signal transduction in plant cell. 1991. Trends Genet. V. 7. P. 356-361.

165. Trewavas A.J., Malho R. Signal perception and transduction: the origin of the phenotype. Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1181-1195.

166. Uemura M., Steponkus P.L. Effect of cold acclimation on the incidence of two forms of freezing injury in protoplasts isolated from winter rye leaves // Plant Physiol. 1989. V.91.P. 1131-1137.

167. Urao Т., Yakubov В., Satoh R., Yamaguchi-Shinozaki K., Seki M., Hirayama Т., Shinozaki K. A transmembrane hybrid-type histidine kinase in Arabidopsis functions as an osmosensor // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 17431754.

168. Urrutia M. E., Duman J. G., Knight Ch. A, Plant thermal hysteresis proteins // Biochem Biophys. Acta. 1992. V. 1121. P. 199-206.

169. Verhey S.D., Gaiser J.C., Lomax T.L. Protein kinases in zucchini: characterization of calcium-requiring plasma membrane kinases // Plant Physiology. 1993. V. 103. P. 413-419.

170. Vigh L., Horvath I., Horvath L.I. et al. Protoplast plasmalemma fluidity of hardened wheats correlates with frost resistance // FEBS Lett. 1979. V. 107, N2. P. 291-294.

171. Vogel J.T., Zarka D.G., Van Buskirk H.A., Fowler S.G., Thomashow M.F. Roles of the CBF2 and ZAT12 transcription factors in configuring the low temperature transcriptome of Arabidopsis // Plant J. 2005. V. 41 (2). P. 195211.

172. Warren G., McKown R., Marin a., Teutonico R. Isolation of mutations affecting the development of freezing tolerance in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.//Plant Physiology. 1996. V. 11. P. 1011-1019.

173. Webb M.S., Uemura M., Steponkus P.L. A comparison of freezing injury in oat and rye: two cereals at the extremes of freezing tolerance // Plant Physiol. 1994. V. 104. P. 467-478.

174. Weretilnik E., Orr W., White T.C., Iu В., Singh J. Characterization of three related low-temperature-regulated cDNAs from winter Brassica napus // Plant Physiol. 1993. V.101. P. 171-177.

175. White T.C., Simmond D., Donaldson P., Singh J. Regulation of BN115, Low-Temperature-Responsive Gene from Winter Brassica napus // Plant Physiol 1994. V. 106. P.917-928.

176. Whitsitt M.S., Collins R.G., Mullet J.E. Modulation of dehydration tolerance in soybean seedlings dehydrin Matl is induced by dehydration but not by abscisic acid//Plant Physiology. 1997. V. 114. No. 3. P. 917-925.

177. Wilson J.M., Crawford R.M.M. Leaf fatty-acid content in relation to hardening and chilling injury // J. Exp. Botany. 1974. V. 25. P. 121-127.

178. Wood N.T., Allan A.C., Haley A., Viry-Mossaid M., Trewavas A.J. The characterization of differential calcium signaling in tobacco guard cells // Plant J. 2000. V. 24(3). P. 335-344.

179. Xin Z., Browse J. eskimol mutant of Arabidopsis are constitutively freezing-tolerant// Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1998. V.95. P. 7799-7804.

180. Xu H., Heath M.C. Role of calcium in signal transduction during the hypersensitive response caused by basidiospore-derived infection of the cowpea rust fungus // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 585-598.

181. Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. A Novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low-temperature, or high-salt stress // Plant Cell. 1994. V.6. P. 251-264.

182. Yoon G.M., Cho H.S., Ha H.J., Liu J.R., Lee H.S. Characterization of NtCDPKl, a calcium-dependent protein kinase gene in Nicotiana tabacum and the activity of its encoded protein // Plant Mol. Biol. 1999. V. 39 P. 9911001.

183. Yoshida S., Hotsubo K., Kawamura Y., Murai M., Arakawa K., Takezawa D. Alterations of intracellular pH in response to low temperature stresses // J. Plant Research. 1999. V. 112. No 1106. P. 225-236.

184. Yu X.-M., Griffith M., Wiseman S.B. Ethylene induced antifreeze activity in witer rye leaves // Plant Physiology. 2001. V. 126. P. 1232-1240.

185. Zhu В., Choi D. W., Fenton R., Close T.J. Expression of the barley dehydrin multigene family and the development of freezing tolerance // Molecular and General Genetics. 2000. V. 264. No. 1-2. P. 145-153.