Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные особенности гена FRIGIDA у видов Brassica

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Структурные особенности гена FRIGIDA у видов Brassica"

На правах рукописи

Фалина Оксана Алексеевна

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНА FRIGIDA У ВИДОВ BRASSICA

Специальность 03.01.06. - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 ПАП 2014

Москва, 2014

005549153

Работа выполнена в лаборатории ДНК маркеров растений ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН в 2010-2014 гг.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Эмиль Ефимович Хавкин. Официальные оппоненты:

в.н.с. лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции ФБГУН ИФР РАН доктор биологических наук Галина Викторовна Новикова, зав. кафедрой генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА доктор биологических наук, профессор Александр Александрович Соловьев.

Ведущая организация: кафедра физиологии и биохимии растений СПбГУ

Защита диссертации состоится 30 июня 2014 г. в И часов на заседании диссертационного совета Д006.027.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская 42; тел. (499) 97765-44, факс (499) 977-09-47; e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии и на Интернет-сайте www.vniisb.ru.

Автореферат разослан « »_2014 г., размещен на Интернет-

сайте www.vniisb.ru «21» апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета.

кандидат биологических наук

Вобликова В. Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Переход к цветению - важнейшее событие в жизни растений. Ген FRIGIDA участвует в регуляции перехода растений семейства Brassicaceae к цветению под влиянием пониженных температур (путь вернализации, рис. 1). На примере арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) показано, что белок FRIGIDA служит структурной основой (scaffold) комплекса белков, который усиливает экспрессию гена FLOWERING LOCUS С, репрессора перехода к цветению (Choi et al., 2011; Ding et al., 2013; Geraldo et al, 2009).

Автономный FR! Вернализации путь I ¿S

I ^VIN3

Фотопериодический FLC путь

Вегетативный рост

Цветение

Рис. 1. Место гена FRIGID А в генетической сети, контролирующей переход растений A. thaliana к цветению (по Caicedo et. al., 2004). API - APETALA1, FLC - FLOWERING LOCUUS C, FRI - FRIGIDA, VIN3 - VERNALISATION INSENSITIVE 3, SOC1 - SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1, LFY - LEAFY, FT - FLOWERING LOCUUS T.

В опытах с арабидопсисом взаимодействие сильных и слабых аллелей генов FLOWERING LOCUS С и FRIGIDA во многих случаях объясняет различия по времени зацветания (Johanson et al., 2000; Shindo et al., 2005; Strange et al., 2011), Строение и функции гена FRIGIDA у систематически близких растений рода Brassica L. исследованы совершенно недостаточно.

Культурные виды Brassica L. включают яровые и озимые однолетние и двулетние жизненные формы, происходящие из субтропиков и умеренных широт и представленные диплоидными и тетраплоидными видами с геномами А, В и С: Brassica rapa L. (геном A), Brassica nigra (L.) W. D.J.Koch (геном В), Brassica oleracea L. (геном С), Brassica juncea (L.) Czern. (геном AB), B. napus L. (геном АС) и Brassica carinata A.Braun (геном ВС). Хорошо изученная эволюция геномов этих растений (Cheng et al., 2013; Cheung et al., 2009; Couvreur et al., 2010; Lysak et al., 2005) создает благоприятные предпосылки для исследования дивергенции гена FRIGIDA в роде Brassica. Исследования полиморфизма этого гена в связи с агроэкологическими особенностями возделывания культурных форм Brassica может способствовать селекции этих культур на такие хозяйственно ценные признаки, как время перехода к цветению и раннеспелость.

Цель и задачи исследования. Клонировать и провести сравнительный структурный анализ гена FRIGIDA в геномах А, В и С культурных видов Brassica. Создать на этой основе специфичные SCAR маркеры, пригодные для использования в селекции.

Научная новизна исследования. Обоснована двухлокусная модель гена FRIGIDA у растений рода Brassica. Получены новые данные о строении локусов F Ria и FRI.b в геномах А, В и С и дивергенции гена FRIGIDA у растений рода Brassica. Создана система SCAR маркеров для изучения разнообразия локусов FRI.a и FRI.b в геномах и субгеномах Brassica-, эти маркеры могут быть использованы для картирования и функционального анализа гена FRIGIDA.

Практическая значимость работы. Созданы локус- и геном-специфичные маркеры гена FRIGIDA, которые могут оказаться полезными для уточнения связи этого гена с QTL времени перехода к цветению. Эти маркеры могут также быть использованы и интрогрессивной селекции культурных форм Brassica, в том числе на время зацветания и скороспелость.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и «Заключение», выводов, списка литературы, включающего 144 названия, и одного приложения. Работа изложена на 147 машинописных страницах, содержит 32 рисунка и 11 таблиц.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы четыре статьи в рецензируемых изданиях.

Результаты исследования были представлены на VII съезде общества физиологов России (Нижний Новгород, 2011), на Международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2012), на Третьей Вавиловской Международной конференции «Идеи Н. И. Вавилова в современном мире» (Санкт - Петербург, 2012), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013).

Работа была поддержана грантом РФФИ (проект 09-04-00606а). Автор благодарит Центр коллективного пользования "ВНИИСБ" за секвенирование нуклеотидных последовательностей гена FRIGIDA.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал. Семена растений Brassica были получены из коллекций Centre for Genetic Resources Resources (CGN), Вагенинген, Нидерланды, Warwick Horticulture Research International, Уеллесборн, Великобритания (GK) и ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР), С. Петербург. Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге два дня и затем высаживали в почву. Растения выращивали при комнатной

5

температуре при постоянном освещении под лампами OSRAM Circolux EL (24 W).

Выделение ДНК. Геномную ДНК выделяли из молодых листьев с помощью набора AxyPrep™ Multisource Genomic DNA Miniprep Kit (Axygen Biosciences, США). Концентрацию выделенной ДНК измеряли при 260 нм на NanoPhotometer Р 300 (IMPLEN, Германия).

Амплификация геномной ДНК. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе DNA Engine РТС 200 (Bio-Rad, США) по универсальной программе: 1 цикл 30 с при 94°С; 30 циклов 30 с при 62°С, 3 мин 30 с при 72°С; один цикл 15 мин при 72°С. Для амплификации специфичных фрагментов гена FRIGIDA использовали следующую программу: 1 цикл 30 с при 94°С; 30 циклов 30 с при 58°С, 2 мин при 72°С; один цикл 15 мин при 72°С. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 0.8% агарозном геле при напряжении электрического поля 6-7 В/см. Гели фотографировали в ультрафиолете (длина волны 312 нм) с помощью цифровой системы Biotest ("Биоком", Россия) и Gel Logic 100 Imagyng System (Eastman Kodak, США).

Праймеры, использованные в работе. Праймеры для ПЦР (табл. 1) подбирали вручную на основании множественного выравнивания последовательностей FRIGIDA и оптимизировали с помощью программы Oligonucleotide Properties Calculator (http://www.basic.northwestern.edu/ biotools) по следующим параметрам: температура отжига, GC состав, возможное образование шпилек и димеров. Оптимизированные праймеры были проверены на возможность неспецифичного отжига с помощью программы BLAST. Все праймеры синтезированы компанией «Синтол», Москва (www.syntol.ru).

Клонирование гена FRIGIDA. Очищенные фрагменты ДНК

клонировали с помощью наборов PCR Cloning Kit InsTAclone™ с

использованием вектора pTZ57R/T и CloneJet PCR Cloning Kit с

использованием вектора pJet (Fermentas, страна). Далее плазмиду

6

нарабатывали в штамме Е. coli JM109 с использованием набора TransformAid (Fermentas). Для выделения плазмидной ДНК использовали набор АхуРгер Plasmid Miniprep Kit (Axygen Biosciences), согласно протоколу фирмы-производителя. Нуклеотидную последовательность вставки определяли при помощи автоматического анализатора ABI 3130 (Applied Biosystems, США). Хроматограммы нуклеотидных последовательностей были отредактированы вручную с использованием программы Chromas Lite 2.0 (www.technelysium.com.au/chromas_lite.html) и депонировали в Генбанке NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Номера регистрации этих последовательностей приведены в табл. 2.

Методы биоинформатики. Поиск гомологов гена FRIGIDA осуществляли в базах данных CoreNucleotide, EST, GSS и SRA NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), BRAD (http://brassicadb.org/brad; В. rapa BGI scaffolds v. 1.0) и INRA Brassica.FR (http://www.brassica.fr; 454-reads database) с использованием программы BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора и оптимизации ПЦР праймеров были использованы следующие программы: NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), Lasergene 7.0 (http://www.dnastar.com) и Oligonucleotide Properties Calculator (http://www.basic.northwestern.edu/biotools).

Для филогенетического анализа использовали алгоритм Maximum Likelihood в пакете MEGA5 (Tamura et al., 2011).

Для определения экзон-интронной структуры использовали алгоритм FGENSH (http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic=fgen). Аминокислотные последовательности были получены с использованием программы Expasy Translate tool (http://web.expasy.org/translate). Для распознавания характерных доменов белка FRIGIDA использовали базу данных Pfam. version 24.0 (http://pfam.janelia.org/search/sequence) с соответствующей программой поиска, а для предсказания биспиральных структур - программу COILS (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html). Для анализа

полиморфизма последовательностей ДНК использовали DnaSP 5.10.1 (Rozas et al., 2010).

Номенклатура локусов и маркеров FRIGIDA, полученных в данной работе. В соответствии с номенклатурой, принятой для геномов Brassica (Ostergaard., King, 2008), локус обозначается сокращением типа BolC.FRI.a, где Bol - В. oleracea, С - геном С, FRI -ген FRIGIDA, а -локус а.; Маркер обозначается сокращением типа BrX.Fri.Y, где Вг - вид В. rapa, X - геномная специфичность маркера (геном А, В или С); Y - локусная специфичность маркера. Так, например, маркер BrA.FRI.a специфичен для локуса FRIa из генома А В. rapa.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск и первичный анализ гомологов гена FRIGIDA с помощью методов in silico. Для выделения и структурного анализа последовательностей FRIGIDA в геномах Brassica мы использовали метод генов-кандидатов. В качестве гена-прототипа мы выбрали функциональный ген FRIGIDA из A. thaliana поздноцветущего экотипа Н51 (AF228499). Поиск структурных гомологов этого гена проведен в базах данных NCBI Genbank, BRAD (http://brassicadb.org/brad) и . French Brassica rapa (http://www.brassica.fr). С помощью алгоритма BLAST мы обнаружили анонимные фрагменты гомологов FRIGIDA у В. rapa, В. oleracea и В. napus. Таким же образом в фосмидном клоне В. rapa Chifu найдена полноразмерная последовательность гена FRIGIDA. В базе данных BRAD (подраздел Scaffolds v. 1.0) (http://brassicadb.org/brad/blastPage.php), содержащей полный геном дигаплоидной формы В. rapa ssp. pekinensis Chifu, были обнаружены два скаффолда (BGIScaffold000064 и BGIScaffold000108), содержащие гомологи гена FRIGIDA, условно названные FRI.a и FRI.b, с открытой рамкой считывания длиной 2178 и 2062 п.н., соответственно. В базе данных French Brassica rapa мы нашли большое число фрагментов генома В. rapa

Chifu (454 последовательности), которые были собраны в контиги, гомологичные на 100% выделенным из скаффолдов локусам FRI.a и FRI.b. Геномные контиги, содержащие гомологи FRI.a и FRI.b, картированы на разных группах сцепления генома А - соответственно, A3 и A4, что позволило определить FRI.a и FRI.b как два генетических локуса, в отличие от A. thaliana, в геноме которого этот ген представлен одним локусом. Таким образом, мы впервые обнаружили, что ген FRIGIDA представлен в геноме диплоидного вида двумя паралогичными локусами. В пользу двухлокусной модели свидетельствует и анализ FRIGIDA у В. napus (Wang et al., 2011). В случае В. oleráceo локусы BolC.FRI.a и BolC.FRI.b картированы на хромосомах СЗ и С9 (Irwin et al., 2012).

Определенные доказательства связи этого гена с переходом растений Brassica к цветению получены только для локуса FRI.a: Присутствие последовательностей В. rapa и В. oleracea, гомологичных локусам FRI.a и FRI.b, в базах данных EST в Генбанке NCBI указывает на то, что оба локуса транскрибируются. В случае В. napus показана связь FRI.a с QTL для времени перехода к цветению (Wang et al., 2011), а в случае В. oleracea ген FRI.a комплементировал неактивный ген /ri у мутантов А. thaliana (Irwin et al., 2012). Функция локуса FRI.b пока неизвестна.

Клонирование и сравнительный анализ последовательностей локусов FRIGIDA из геномов и субгеномов Brassica А, С и В. На основании всех извлеченных из баз данных последовательностей FRIGIDA видов Brassica мы сконструировали и оптимизировали систему локус-специфичных праймеров для клонирования последовательностей FRI.a и FRI.b из геномов Brassica (рис. 2, табл. 1). Для изучения гена FRIGIDA у В. nigra (геном В) мы разработали систему праймеров, специфичных для этого генома. Из-за отсутствия в базах данных последовательностей FRIGIDA из В. nigra мы не смогли подобрать праймеры для амплификации полноразмерной последовательности этого гена.

Таблица 1. Праймеры, использованные для ПЦР амплификации фрагментов и полноразмерных последовательностей гена FRIGIDA,

Локус Геном Праймер 5—3' последовательности праймеров* Темп, отжига, °C Размер ампликона, п.н.

BraA.FRI.a A BrAC.FRIaF ATCCCCAATGGCCGTCCG 62 -2500

BrA.FRIaR AAGCTTTCTGCTTGTTAAGCCC

BolC.FRI.a С BrAC.FRIaF ATCCCCAATGGCCGTCCG

BrC.FRIaR GATCCTAAGCTTTGTGTTTATTAAATAA

BraA.FRI.b A BrA.FRIbF CCCATGGCCTTTCGTAATGG -2100

BrAC.FRIbR CCTTTGTTACAWWTTTTACATTCCTC

BolC.FRI.b С BrC.FRIbF CCCATGGCCTTCCGTAATG

BrAC.FRIbR CCrTTGTTACAWWTTTTACATTCCTC

Frígida** A, B, С BrFRIF GGCTGCTGTTGCGTGGAAGAA 58 -1300

BrFRIR TGAGCAGTGTTGACTAAAAGGG

BniB.FRI.a В BrB.FRIaF TCCTGTGATTGGACAAAGCCAAGT 58 -940

BrFRIR TGAGCAGTGTTGACTAAAAGGG

BniB.FRI.b BrAB.FRIbF TTTTTAGCTGCGTTGTTATCAGTG 60 -500

BrB.FRIbR TCCATGAACTAGAGTGTGCCC

BraA.FRI.a BolC.FRI.a BraA.FRI.b BolC.FRI.b А, С BrAC.FRIaFRIbR TCTTCTTCCACGCAACAGCAG 56 -720

Примечание. * WW соответствует АТ/АА, ** Frígida — фрагмент гена FRI, который включает почти весь домен Frígida и большую часть С-концевой области.

С помощью созданной системы прайм еров мы клонировали FRI.a и FRI.b из шести видов Brassica (табл. 2) и проанализировали их последовательности в сравнении с геном FRIGIDA из A. thaliana.

Таблица 2. Последовательности гена FRIGIDA, клонированные из растений

Brassica в данном исследовании.

Форма Brassica Номер образца Локус Номер в Генбанке NCBI

В. гара subsp. pekinensis GK030074 BraA.FRI.a JNO15481

BraA.FRI.b JNO15482

В. гара subsp. chinensis CGN07209 BraA.FRI.a JN882592

BraA. FRI.b JN882593

В. oleracea var. acephala CGN11138 BolC.FRI.a JN882594

BolC.FRI.b JN882595

В. oleracea var. alboglabra GK97361 BolC.FRI.a JN989363

B. nigra var. abyssinica CGN06620 BniB.FRI.a KF896288

BniB. FRI.b KJ649744

B. nigra var. abyssinica CGN06634 BniB.FRI.a KF896289

BniB.FRI.b KJ649745

B. carinata CGN3978 BcaC.FRI.a KF896287

BcaC.FRI.b KJ145233

BcaB. FRI.a Banklt*

BcaB.FRI.b KJ145234

B. juncea group Oilseed CGN7152 BjuA.FRI.a KC937068

BjuA.FRI.b KJ649746

BjuB.FRI.a Banklt*

BjuB.FRI.b KJ145235

* Регистрация этих последовательностей не завершена.

Определение экзон-интронной структуры локусов FRIGIDA Brassica, а, следовательно, предсказание первичной структуры процессированных транскриптов и последовательностей белков, проводили тремя in silico методами: (1) выравнивание экзонов Fß/G/DA.арабидопсиса с локусами FRIGIDA Brassica-, (2) сравнение геномных последовательностей FRIGIDA Brassica с EST (mRNA) последовательностями Brassica-, (3) предсказание структуры транскрипта с помощью алгоритма FGENSH.

BrAC.FRIaFRIbR

BrA.FRIaR BrC.FRIaR

В

Bl'A.FRIbF BrC.FRIbF

N - концевой регион

Frígida домен

С — концевой регион

Рис. 2. Строение локусов FRIGIDA в геномах Brassica А, В и С. А - локус FRI.a в геномах А и С, Б - фрагмент гена FRIGIDA из генома В, В - локус FRI.b из геномов А и С. 1 - положение старт-кодона, 2178 и 2069 - положение стоп-кодонов. Интроны обозначены сплошной черной линией. Черными прямоугольниками и римскими цифрами обозначены экзоны. Арабскими цифрами и стрелками показано расположение и направление праймеров. Горизонтальной скобкой обозначено положение центрального консервативного домена Frígida. Шкала соответствует гену FRIGIDA JN015481.

Оказалось, что локусы FRl.a и FRI.b Brassica и FRIGIDA арабидопсиса не различаются по экзон-интронной структуре: в них три экзона и два интрона (рис. 2). Таким образом, гены FRIGIDA у видов Brassica и у Arabidopsis обнаруживают значительное сходство. На рис. 2 сопоставлено строение локусов FR La и FRI.b в геномах Brassica А, В и С. Анализ последовательностей этих локусов показал, что наиболее вариабельной областью гена является первый экзон. Область второго экзона наиболее консервативна и содержит однонуклеотидные замены, отличающие последовательности FRIGIDA из генома В от геномов А и С Brassica. Второй интрон имеет множество однонуклеотидных замен и делений, отличающих FRIGIDA из генома В от FRIGIDA геномов А и С. Начало первого и конец третьего экзона содержат множество геном-специфичных полиморфизмов.

Сравнение последовательностей FRI.a и FRI.b из Brassica с другими гомологами FRIGIDA в семействе Brassicaceae показало, что последовательности FRIGIDA из В. nigra сильно отличаются от FRIGIDA из геномов А и С Brassica и скорее напоминают FRIGIDA у Raphanus sativus L.

Сравнительный анализ нуклеотидного разнообразия экзонов и интронов последовательностей FRI.a и FRI.b геномов и субгеномов Brassica свидетельствует о том, что в локусе FRI.a наиболее вариабельной является область первого интрона (79%). В локусе FRI.b наиболее консервативной областью является второй экзон (99%), остальные интроны и экзоны вариабельны в равной степени (97%).

Изучение полиморфизмов экзонов FRI.a и FRI.b диплоидных и тетраплоидных видов Brassica показало, что несинонимичные замены присутствуют в основном в области первого экзона. Во втором и третьем экзоне несинонимичных замен существенно меньше (рис. 3). Таким образом, как и у Arabidopsis, кодирующая область гена FRIGIDA состоит из двух эволюционирующих с разной скоростью областей: первая включает первый экзон, а вторая состоит из второго и третьего экзонов. В первом экзоне гена FRIGIDA Brassica мы наблюдаем высокое соотношение несинонимичного и

500 1000 1500 2000 0 0,7

ОД

500 1000 1500 2000

500 1000 1500 2000

500 1000 1500 2000

Рис. 3 Внутривидовой полиморфизм кодирующей области локусов FRIGIDA Brassica.(A) - геном и субгеномы А, (Б) — геном и субгеномы С; ла — разнообразие несинонимичных полиморфизмов, л5 — разнообразие синонимичных полиморфизмов; njns _ соотношение несинонимичных замен к синонимичным заменам; п.н. — пар нуклеотидов. (Sliding-window анализ, длина окна: 100, шаг: 25 п.н.). И так же переставьте в дисс.

синонимичного разнообразия (njns). Для второго и третьего экзонов FRIGIDA синонимичное разнообразие (я5) значительно выше, чем несинонимичное (ла). Это предполагает, что на первую часть гена действовал положительный отбор, а на вторую - отрицательный отбор.

Таким образом, для последовательностей локусов FRI.a и FRI.b всех геномов и субгеномов Brassica наиболее консервативной является область второго экзона, а наиболее вариабельными — области, соответствующие С- и N-концевым участкам гена. Детальный анализ распределения несинонимичных и синонимичных замен вдоль кодирующей части гена FRIGIDA выявил заметные различия между локусами FRI.a и FRI.b и между различными участками гена. Возможно, мы обнаружили «горячие точки» в строении этого гена, с которыми связаны его эволюционные и

функциональные изменения после дупликации (Doebley and Lukens, 1998; Rensing, 2014).

Далее, мы сопоставили полученные нуклеотидные и аминокислотные последовательности FRIGIDA в субгеномах А и С аллотетраплоидов с соответствующими последовательностями у их предполагаемых диплоидных предков. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей FRI.a и FRI.b показал, что они на 95-99% сходны с ортологами из соответствующих геномов В. rapa и В. oleracea. Аминокислотные последовательности FRIGIDА.Д и FRIGIDA, b в субгеномах А и С также были на 96-99% сходны с последовательностями из соответствующих геномов В. rapa и В. oleracea (табл. 3). Почти полное соответствие (99% сходства) белков FRIGIDA.Û и FRIGIDA, b у диплоидов и тетраплоидов В. carinata и В. juncea показано также для генома В. Таким образом, последовательности гена FRIGIDA из геномов А, С и В у диплоидов В. rapa, В. oleracea и В. nigra сохраняются в субгеномах А, С и В трех аллотетраплоидных видов, В. carinata, В. juncea и В. napus.

Белок FRIGIDA в геномах и субгеномах Brassica А, С и В. Производные

аминокислотные последовательности FRIGIDA.a и FRIGIDA.b оказались

немного короче (555-596 а.о.), чем у прототипа из A. thaliana (609 а.о.). Все

полученные последовательности FRIGIDA содержат консервативный

участок, который соответствует центральному домену Frígida (286-308 а.о.),

характерному для суперсемейства белков FRIGIDA и FRIGIDA-LIKE 1 (Risk

et al., 2010), и С- и N- концевые области, важные для функциональной

активности белка (рис. 4 и 5). Присутствие специфичной 37-аминокислотной

последовательности в N-концевой части продуктов трансляции генов FRI.a и

FRI.b Brassica позволяет отнести эти белки к классу I FRIGIDA, а не к

FRIGIDA-LIKE. N-концевая область белков FRIGIDA является наиболее

вариабельной. Для этой области FRIGIDA.a из субгенома А В. napus

известны шесть однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных со

временем зацветания (Wang et al., 2011). Центральные, консервативные

15

Таблица 3. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей FRIGIDA.y видов Brassica

Белок FRIGlDA.a и FRIGlDA.b в диплоидных видах Brassica Белок FRIGID A.a Белок FRIGIDA.b

субгеном А субгеном С Субгеном В субгеном А субгеном С Субгеном В

BnaA.FRl.a (AFA43304) BjuA.FRl.a (AHM25020) BnaC.FRI.a (AFA43307) BcaC.FR!.а (AHJ09876) BjuB.FRl.a* BcaB.FRl.a* BnaA.FRlb (AFA43305) BjuA.FR/.b (AHW45708) BnaC.FRI.b (AFA43306) BcaC.FRI.b (AHW45707) BjuB.FRl.b (KJ649746) BcaB.FRI.b (AHW45709)

BraA. FRIGlDA.a Chifu (AEJ81950) 98 90 87 76 77 70 70 68 67 81 82

BraA. FRIGlDA.a PakChoi (AFC68976) 98 98 90 87 76 77 70 70 68 67 83 82

BolC. FRIGlDA.a A12DH (AFB73908) 89 88 У :-97Г- 99 78 79 68 68 70 69 84 83

BolC. FRIGlDA.a A12DH (AFC900I0) 89 88 99 78 79 68 68 70 69 84 83

BolC. FRIGlDA.a Frosty (AFC68978) 90 85 77 77 68 68 69 67 82 82

BolC. FRIGlDA.a E8 (AFB73850) 90 86 Щэ? у \ 96 77 77 69 69 69 67 82 82

BolC. FRIGlDA.a El (AFB7385I) 89 88 4^:97.of." 78 79 68 68 70 69 84 83

BraA. FRIGIDA.b Chifu (AEJ81951) 69 62 68 67 76 77 92 92 89 86

BraA. FRIGIDA.b PakChoi (AFC68977) 69 55 69 60 76 77 91 91 88 89

BolC. FRIGIDA.b Frosty (AFC68979) 68 63 67 68 73 74 91 90 ' 98 91 91

BolC. FRIGIDA.b A12DH (AFB73907) 68 63 68 68 74 74 92 91 100 99 ' 91 91

BniB. FRIGID A.a (AHJ09878) 76 77 78 79 98 99 78 76 74 73 78 77

BniB. FRIGIDA.b (KJ649744) 75 76 74 76 76 77 88 88 88 88 97 99

домены Frigida белков FRIGIDA.a и FRIGIDA.b Brassica различаются небольшим числом геном- и локус-специфичных полиморфизмов.

Белок FRIGIDA A. thaliana содержит coiled-coil домены в двух положениях, в N- и С-концевых областях (рис. 4 и 5). Известно, что С-концевой регион важен для функциональной активности белка FRIGIDA из A. thaliana, и биспиральная структура в этом регионе необходима для образования FRI-C комплекса, способствующего транскрипции гена FLOWERING LOCUS С (Choi et. al„ 2011). В случае Brassica, образование coiled-coil домена на С-концевом участке белка у всех проанализированных последовательностей FRIGIDA.a и FRIGIDA.b предсказано с высокой вероятностью (0.9-1.0). Что касается N-концевой области, то в этом случае coiled-coil домен предсказан с малой вероятностью (менее 0,05) как у раноцветущих, так и у поздноцветущих форм Brassica. Однако у FRIGIDA арабидопсиса, в белке FRIGIDA.a у В. oleracea (геном С) и В. carinata (субгеноме С), а также у В. juncea (субгеном А) образование этого домена предсказано с вероятностью 0,8. Оказалось, что для области, в которой coiled-coil домен предсказан с вероятностью 0,8, характерно наличие остатка глутаминовой кислоты (Е"). Замена этой аминокислоты в локусе FRIGIDA.a на глицин (G0), приводит к уменьшению вероятности образования coiled-coil домена, так как разница в зарядах нарушает стабильность домена. Наличие глутаминовой аминокислоты (Е') также характерно для этой области coiled-coil домена у гомологов FRIGIDA в других видах Brassicaceae.

При сравнительном анализе белков мы обнаружили характерные аминокислотные повторы в С-концевой области белка FRIGIDA. Эти повторы различаются числом, инсерциями и одиночными заменами. У FRIGIDA.a из генома и субгеномов А три повтора MEEARSIS, у FRIGIDA.a из генома и субгеномов С - два таких же повтора, для генома В характерен один повтор MEEEARAIS; у FRIGIDA.b из генома и субгеномов А и В - по одному повтору MEGEARSIS; для генома и субгеномов С характерен один

О 100 200 J00 400 500 О 50 100 150 200 250 300

в г

О 400 500 0 400 500

а. о.

Рис. 4. Предсказание coiled-coil структуры в белках FRIGIDA у A. thaliana и видов Brassica. А) Функциональный белок FRIGIDA у A. thaliana (AAG23414), (Б) Нефункциональный белок FRIGIDA у A. thaliana (NC_003075), (В) FRIGIDА.а из В. oleracea (AFC90010, AFC68978) и (Г) белки FRIGIDA.a из В. rapa (AEJ81950, AFC68976), В. carinata (AHJ09876) и В. juncea (АНМ25020), и FRIGIDA.b у В. rapa (AEJ81951, AFC68977) и В. oleracea (AFC68979), (Д) фрагмент белка FRIGIDA.a у В. nigra (AHJ09878), (Е) фрагмент белка FRIGIDA.b у В. nigra (KJ649744).

А

1Ш

1***1 ч......

I I

r--------J—1---------------------------

| A A A A AAA А AI

KSXDELAAFSVAVETFKRQFDDLQKmESIENAIDSK "__„С

яшг

(1) MEEKARSLS

JL

Геном А (3) MEEA-RSLS Геном С (2) MEEARSIS Геном В (1) МЕЕЕ ARAIS

1 * * * **** **i геном A(l) ЛЕЕ - GEARSIS

KSIVDLTALAAAV'DAFKRRVDELQSHMDVIGNAIDSN геном С(1) МЕ< >< ЕARSIS

Геном Bfl) ME-GEARSIS

- N- облапь

- домен Frígida

- С - область

coiled сoil домен

coiled coil домен с вероятностью образования 0,8

Рис. 5. Строение белка FRIGIDA. А - Белок FRIGIDA у A. thaliana, Б - Белок FRIGIDA.a у Brassica, В - Белок FRIGIDA.b у Brassica, MEEKARSLS, MEEARSIS, MEEEARAIS, MEGEARSIS и MEQGEARSIS - аминокислотные повторы (в скобках число повторов), А - С - геномы и субгеномы Brassica, (*** - 37-а.о. область, содержащая девять а.о. (*), характерных для класса I FRIGIDA.

повтор MEQGEARSIS. Эти повторы перекрываются с доменом Frígida и coiled-coil доменом в С-концевом участке белка.

Филогенетический анализ FRIGIDA в семействе Brassicaceae. Приведенная на рис. 6 дендрограмма нуклеотидных последовательностей наглядно иллюстрирует наши представления о двух локусах FRIGIDA и аллельном разнообразии этих локусов у видов Brassica. Отчетливо разделяются линии Brassicaceae I и II, трибы внутри каждой линии и локусы FRI.a и FRI.b в пределах рода Brassica, а однолетний диплоид A. thaliana с его редуцированным геномом отделен от многолетнего тетраплоидаА lyrata.

Вопрос о том, можно ли интерпретировать выявленный нами диморфизм FRIGIDA.у В. nigra в пользу двухлокусной модели, важен для определения времени дупликации этого гена, которая привела к возникновению двух локусов. Irwin и соавторы (Irwin et al., 2012) предложили модель возникновения двух локусов FRIGIDA у В. oleráceo (СЗ и С9), по которой сначала в результате трипликации генома предка Brassica, локусы FRIGIDA разместились на хромосомах С2, СЗ и С9, а затем в ходе эволюции третий локус FRIGIDA с хромосомы С2 был утерян. Далее виды Brassica сохранили два локуса FRIGIDA, а виды Arabidopsis - только один, причем у A. thaliana этот локус расположен на хромосоме 4, а у A. lyrata - на хромосоме 8. Примечательно, что все нуклеотидные последовательности FRI.b у Brassica больше похожи на FRIGIDA у A. lyrata, а последовательности FRI.a - на FRIGIDA у A. thaliana. Можно предположить, что у общего предка Brassicaceae ген FRIGIDA был дуплицирован и сохранился у линий Arabidopsis и Brassica. В процессе отделения от А. lyrata в геноме А. thaliana сохранился только один из дуплицированных генов, соответствующий FRI.a Brassica, а у A. lyrata со временем этот локус был утерян, и остался дупликат, соответствующий локусу FRI.b Brassica (см. Hu et al., 2011).

Если локус FRI.b не только экспрессируется, но и, действительно, участвует в регуляции перехода к цветению, то можно предположить, что он

сохранился в линии Brassica А/С в связи с особенностями фракционирования и неофункционализации дуплицированных генов у В. гара и В oleracea, эволюция которых происходила в более прохладных климатических условиях, а в последние 10 тыс. лет - и под сильным давлением искусственного отбора. В пользу такого предположения говорит

Brassiceae

Eutremeae

Camelineae

Геном А

— В.rapa

— В. rapa

— В. napus —в.juncea

1001—В. napus в oleracea В. oleracea 1001— в. carinata

. nigra ]Г«номВ W i— Raphanus satlMjs rapa В. napus

Л окус а

Brassice

ГеномА

J Ген о

В. rapa В, oleracea юо I— в. napus

В. nigra ^ГеиомВ Thellungíella halopnila Capsella rubella Capsella rubella Nesliapanlculata Arabls glabra Pacltycladon Stella юо i— Pac'tr/cladon Stella. A. lyrata A, arenosa I— A thsllana 671— A. thallana

Л окус b

Рис. 6. Дендрограмма нуклеотидных последовательностей гомологов гена FRIGIDA у видов семейства Brassicaceae. I и II - линии (lineages) семейства Brassicaceae. Алгоритм Maximum Likelihood; величины бутстрепа рассчитаны для 1000 повторений. Дерево укоренено относительно нуклеотидкой последовательности FRIGIDA из A. thaliana Н51 (AF228499).

избирательное сохранение у В. rapa множественных копий FLOWERING LOCUS С как ключевого гена перехода к цветению, столь критичного для адаптации к условиям внешней среды (Xiao et al., 2013).

SCAR маркеры для изучения отельного разнообразия гена FRI.a и FRI.b геномов А, В и С. Обнаруженные нами последовательности FRIGIDA в геномах Brassica были использованы для создания специфичных маркеров. С этой целью мы провели множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей гена FRIGIDA из геномов А и С. Присутствие специфичных полиморфизмов в этих последовательностях позволило нам сконструировать геном-специфичные праймеры и создать четыре пары SCAR маркеров, которые соответствуют полноразмерным последовательностям локусов FRI.a и FRI.b (2500 и 2100 п.н., соответственно) и различают эти локусы в геномах А и С (рис. 2, табл. 4). Для верификации локус-специфичных маркеров геномов и субгеномов А и С был проведен скрининг образцов В. rapa (геном А), В. oleracea (геном С), В. carinata (геном ВС), В. juncea (геном AB) и В. napus (геном АС). Все исследованные образцы Brassica одновременно содержали оба локуса FRI.a и FRI.b.

Множественное выравнивание полноразмерных нуклеотидных последовательностей локусов FRI.a и FRI.b из В. rapa, В. oleracea, В. juncea, В. carinata и В. napus и FRIGIDA у других видов Brassicaceae позволило выявить наиболее консервативные участки, которые могли сохраниться у В. nigra в ходе эволюции. На основании таких участков, присутствующих во всех последовательностях FRIGIDA, изолированных из Brassicaceae, была разработана и оптимизирована система праймеров (BrFRIF и BrFRIR), которые фланкируют фрагмент гена FRIGIDA длиной около 1300 п.н. Эти праймеры являются только ген-специифичными и не позволяют различать геном- и локус- специфичные формы гена (рис. 2, табл. 4). Для верификации локус-специфичных маркеров генома и субгеномов В был проведен скрининг образцов В. nigra (геном В), В. carinata (геном ВС) и В. juncea (геном AB).

Для массового скрининга локусов FRI.a и FRI.b у культурных видов Brassica мы создали систему локус-специфичных маркеров, дающих единичный сигнал амплификации. В геномах А и С в области первого интрона FRIGIDA найден участок, общий для обоих локусов FRI.a и FRI.b.

22

На основании этого участка был создан ген-специфичный праймер ВгАС.РШаРМЬ (см. рис. 2, табл. 4).

Таблица 4. Маркеры локусов FRIGIDA из геномов А, В и С Brassica.

Локус- и геном-специфичные SCAR маркеры для изучения аллельного разнообразия локусов FRIGIDA геномов и субгеномов А и С Brassica

Наименование маркера Наименование праймеров* Специфичность Размер ампликона, п.н.

Локус Геном

BrA.FRI.a BrAC.FRIaF BrA.FRIaR FRI.a А -2500

BrC.FRI.a BrAC.FRIaF BrC.FRIaR FRI.a С -2500

BrA.FRl.b BrA.FRIbF BrAC.FRIbR FRI.b А -2100

BrC.FRI.b BrC.FRIbF BrAC.FRIbR FRI.b С -2100

Ген-специфичные SCAR маркеры для изучения аллельного разнообразия локусов FRIGIDA Brassica

Наименование маркера Наименование праймеров* Специ< шчность Размер ампликона, п.н.

Локус Геном

Br.FRI.a Br.FRI.b BrFRIF BrFRIR нет нет -1300

Локус- и геном-специфичные маркеры для массового скрининга локусов FRIa и FRIb геномов А, В и С Brassica

Наименование маркера Наименование праймеров* Специфичность Размер ампликона, п.н.

Локус Геном

BrA.FRI.a BrAC.FRIaF BrAC.FRIaFRIbR FRI.a АиС -720

BrB.FRI.a BrB.FRIaF BrFRIR FRI.a В -940

BrC.FRI.a BrAC.FRIaF BrAC.FRIaFRIbR FRI.a АиС -720

BrA.FRI.b BrA.FRIbF BrAC.FRIaFRIbR FRI.b А -720

BrB.FRI.b BrAB.FRIbF BrB.FRIbR FRI.b В -500

BrC.FRI.b BrC.FRIbF BrAC.FRIaFRIbR FRI.b С -720

"•Последовательности праймеров указаны в табл. 1.Центровка

Для амплификации локуса FRI.a из генома и субгеномов А и генома С и субгеномов С Brassica использовали пару праймеров BrAC.FRIaF и BrAC.FRIaFRIbR. Для амплификации локуса FRI.b из генома и субгеномов А Brassica использовали пару праймеров BrA.FRIbF и BrAC.FRIaFRIbR, а для амплификации локуса FRI.b из генома и субгеномов С Brassica - пару праймеров BrC.FRIbF и BrAC.FRIaFRIbR. Размер созданных таким образом локус-специфичных маркеров составляет около 720 п.н. Множественное выравнивание полноразмерных нуклеотидных последовательностей локусов FRI.a и FRI.b из В. rapa, В. oleracea, В. juncea, В. carinata , В. napus и полученных нами последовательностей фрагментов FRI.a и FRI.b из генома и субгеномов В позволило выявить локус-специфичные участки, характерные только для генома В. На основании этих участков, была разработана и оптимизирована система геном-специфичных праймеров, которые различают локусы FRI.a и FRI.b в геноме и субгеномах В. Для амплификации локуса FRI.a использовали пару праймеров BrB.FRIaF и BrFRIR (ампликон размером около 900 п.н.), а для локуса FRI.b использовали праймеры BrAB.FRIbF и BrB.FRIbR (ампликон размером около 500 п.н.) (рис.2, табл. 4) Наличие специфичного локуса в исследуемом образце определяется по появлению сигнала амплификации. Для верификации созданных маркеров был проведен скрининг образцов культурных видов Brassica: В. rapa (геном А), В. nigra (геном В), В. oleracea (геном С), В. carinata (геном ВС), В. juncea (геном AB), и В. napus (геном АС). Присутствие сигналов амплификации целевых фрагментов выявлено во всех исследованных образцах Brassica. Пара праймеров BrAC.FRIaF и BrAC.FRIaFRIbR является специфичной для локуса FRI.a из геномов и субгеномов А и С Brassica, но не является геном-специфичной.

Последовательности FRIGIDA у фенотипически контрастных форм Brassica. Созданные нами SCAR маркеры позволили нам провести сравнительный анализ растений В. rapa, которые резко различаются по времени зацветания в отсутствие холодового воздействия. Существенных

24

различий в строении последовательностей FRIGIDA.a обнаружено не было. Это обстоятельство можно интерпретировать двояко: (1) критический для данного признака участок гена находится за пределами исследованной последовательности, возможно, в регуляторных элементах гена; (2) проявление уникальных для этих форм признаков, связанных с регуляцией перехода к цветению, контролируется генами, отличными от FRIGIDA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В качестве гена-кандидата для изучения гена FRIGIDA у культурных видов Brassica был выбран ген A. thaliana. На основании множественного выравнивания найденных in silico последовательностей гена FRIGIDA из культурных видов Brassica созданы локус-специфичные праймеры. С помощью этих праймеров из геномов Brassica были клонированы локусы FRI.a и FRI.b, и проведен подробный анализ полученных последовательностей.

Присутствие двух локусов FRIGIDA отличает культурные виды Brassica от А. thaliana с одним локусом FRIGIDA. Оба локуса FRIGIDA представлены у видов Brassica аллельными формами, специфичными для геномов А, В и С. Как и у А. thaliana, все последовательности локусов FRI.a и FRI.b включают три экзона и два интрона. Аминокислотные последовательности белка FRIGIDA.a и FRIGIDA.b содержат центральный консервативный домен Frígida и специфичные N- и С-концевые области, важные для функциональной активности белка. В С- концевой области FRIGIDA.a и FRIGIDA.b в геномах и субгеномах Brassica сохраняется coiled-coil домен, необходимый для белок-белкового взаимодействия с участниками комплекса FRI-C. Для N-концевой области образование такой структуры было предсказано только для FRIGIDA.a генома и субгенома С у В. oleracea, В. carinata и субгенома А у В. juncea. Исходя из этого, можно предположить, что наличие или отсутствие coiled-coil домена в этой области не является критичным для функциональной активности белков FRIGIDA.

Двухлокусная модель FRIGIDA доказана для геномов А и С растений Brassica. В случае В. rapa, скаффолды, в состав которых входят FRI.a и FRI.b локализованы на хромосомах A3 и A4. Для В. oleracea локусы FRI.a и FRI.b картированы на хромосомах СЗ и С9 (Irwin et. al., 2012). Для В. nigra (геном В) аналогичных данных нет. Однако отчетливый диморфизм этого гена позволяет предполагать, что ген FRIGIDA в геноме В также представлен двумя локусами на разных хромосомах или двумя локусами на одной хромосоме, возникшими в результате тандемной дупликации, как это показано для двух локусов FLC у А. lyrata (Nah and Chen, 2010, Kemi et. al., 2013).

Сравнительный анализ показал, что последовательности локусов гена FRIGIDA и продуктов их трансляции, характерные для геномов А, В и С диплоидов В. rapa, В. nigra и В. oleracea, сохраняются с высокой степенью консервативности (95-99 %) в субгеномах А, В и С трех аллотетраплоидных видов, В. carinata, В. juncea и В. napus.

На основании локус-специфичных полиморфизмов, характерных для геномов А, С и В Brassica, созданы локус- и геном-специфичные маркеры FRIGIDA. Эти маркеры могут быть использованы для изучения структурного и функционального полиморфизма гена FRIGIDA, для картирования гена FRIGIDA и уточнения связи этого гена с локусом признака «время перехода к цветению», а также применены в селекции культурных видов Brassica на скороспелость.

выводы

1. Впервые выявлены сравнительные особенности строения белка FRIGIDA у шести видов Brassica: аминокислотные последовательности FRIGIDA отличаются от прототипа у A. thaliana отсутствием coiled-coil домена в N-концевой области; геном-специфичные варианты FRIGIDA у видов Brassica различаются строением и числом характерных повторов в С-концевой области.

2. У трех геномов Brassica ген FRIGIDA представлен двумя локусами.

3. Сравнительный анализ локусов FRIGIDA у диплоидов Brassica (АА, СС, ВВ) и производных тетраплоидов (ААВВ, ААСС и ВВСС) обнаружил высокую консервативность этого гена.

4. Созданы и верифицированы локус- и геном-специфичные маркеры FRIGIDA, пригодные для картирования и функционального анализа этого гена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Fadina О. A., Pankin A. A., Khavkin Е. Е. Molecular characterization of the flowering time gene FRIGIDA in Brassica genomes A and С // Физиол. растений, 2013, Т. 60, С. 277-287.

Фадина О.А. Эволюция гена вернализации FRIGIDA у Brassica // Труды по прикл. бот., ген. и сел. СПб, ВИР. 2013. Т. 173. С. 39-48.

Фадина О.А., Хавкин Э.Е. Ген вернализации FRIGIDA у культурных видов Brassica II Физиол. растений, 2014, Т. 61, С. 334-342.

Фадина О.А., Хавкин Э.Е. ДНК маркеры гена вернализации FRIGIDA у культурных видов Brassica. Докл. РАСХН, 2014, №2, С. 3-6.

Отпечатано в ООО «Издательство Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 30.04.2014 г. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74, 778-45-60

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фадина, Оксана Алексеевна, Москва

всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии российчкой академии

сельскохозяйственных наук

На правах рукописи

04201458749

Фадина Оксана Алексеевна

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНА FRIGIDA У ВИДОВ

BRASSICA

Специальность 03.01.06. - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

профессор, доктор биологических наук

Э.Е. Хавкин

t

Москва - 2014 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................6

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ (ВВЕДЕНИЕ)....................................9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................14

1.1. Экономическое значение культурных видов Brassica.............................14

1.2. Систематика культурных форм Brassica...................................................17

1.2.1. Виды Brassica, составляющие треугольник U...................................17

1.2.2. Геномы Brassica А, В и С.....................................................................21

1.3. Цветение растений как экономическая проблема....................................24

1.4. Генетические системы, регулирующие переход растений к цветению. 25

1.4.1. Основные пути регуляции перехода к цветению...............................25

1.4.1.1. Фотопериодический путь...............................................................27

1.4.1.2. Вернализация...................................................................................30

1.4.1.3. Регуляция цветения температурой внешней среды.....................31

1.4.1.4. Путь гиббереллина..........................................................................32

1.4.1.5. Автономный путь............................................................................33

1.4.1.6. Некодирующие РНК.......................................................................33

1.4.1.7. Взаимодействие генетических систем, регулирующих переход к цветению..........................................................................................................35

1.4.2. Частные модели регуляции пути вернализации.................................36

1.4.3. Механизм вернализации на примере A. thaliana................................39

1.4.3.1. Гены FRIGIDA и FLOWERING LOCUS С.....................................39

1.4.3.2. Молекулярный механизм вернализации и эпигенетический контроль перехода к цветению......................................................................43

1.4.3.3. Белок FRIGIDA и его роль в процессе вернализации.................48

2

1.4.3.4. Эколого-географические особенности вернализации у арабидопсиса...................................................................................................51

1.5. SCAR маркеры как инструмент для выявления полиморфизма, различения и идентификации геномов Brassica................................................57

1.6. Обзор патентов, связанных с практическим использованием генов развития..................................................................................................................58

1.7. Заключение и постановка задач диссертационной работы.....................59

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................62

2.1. Растительный материал.................................................................................62

2.2. Методы исследования....................................................................................62

2.2.1. Выделение геномной ДНК из тканей растений....................................62

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК..................................................................62

2.2.3. Определение концентрации нуклеиновых кислот...............................62

2.2.4. Амплификация фрагментов геномной ДНК.........................................62

2.2.5. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК...........................63

2.2.6. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК.......................64

2.3 Методы биоинформатики...........................................................................65

2.4. Номенклатура маркеров..............................................................................66

2.5. Регистрация последовательностей ДНК в базу данных GenBank NCBI66

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.....................................................................................67

3.1. Поиск гомологов гена-прототипа FRIGIDA A. thaliana в генетических базах данных..........................................................................................................67

3.2. Поиск и первичный анализ полноразмерных гомологов FRIGIDA из генома А с помощью методов in silico................................................................67

3.3. Клонирование гомологичных последовательностей FRI.a и FRI.b из геномов А, С и В Brassica....................................................................................71

3.3.1. Создание и верификация локус-специфичных праймеров для клонирования FRI.a и FRI.b из геномов А и С Brassica................................71

3.3.2. Клонирование полноразмерных последовательностей локусов FRI.a и FRI.b из геномов А и С Brassica.......................................................................73

3.3.3. Создание и верификация ген-специфичных праймеров для амплификации консервативного участка гена FRIGIDA из генома В Brassica................................................................................................................75

3.3.4. Клонирование консервативного участка гена FRIGIDA из В генома

Brassica................................................................................................................76

3.4. Клонирование гомологичных последовательностей FRI.a и FRI.b из субгеномов А, С и В Brassica...........................................................................77

3.5. Строение нуклеотидных последовательностей FRI.a и FRI.b в геномах и субгеномах Brassica..............................................................................................79

3.5.1. Экзон-интронная структура клонированных нами нуклеотидных последовательностей FRI.a и FRI.b Brassica...................................................79

3.5.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей FRI.a и FRI.b Brassica......................................................................................................79

3.6. Анализ последовательностей белков FRIGIDA.a и FRIGIDA.b у видов Brassica...................................................................................................................85

3.7. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей FRI.a и FRI.b Brassica.........................................................................................................91

3.8. Локусы FRIGIDA у фенотипически контрастных форм Brassica...........91

3.9. SCAR маркеры, сконструированные на основе полиморфизмов гена

FRIGIDA.................................................................................................................93

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................................99

4.1. Полиморфизм гена FRIGIDA в семействе Brassicaceae...........................99

4.2. Строение белка FRIGIDA у Brassica.......................................................104

4.3. Возникновение двух локусов гена FRIGIDA в семействе Brassicaceae в контексте эволюции геномов Arabidopsis и линий Brassica...........................109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................117

ВЫВОДЫ.............................................................................................................119

БИБЛИОГРАФИЯ...............................................................................................120

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................................................134

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BRAD (Brassica database) -база данных, содержащая генетическую

информацию о геномах культурных видов Brassica

СВС ( nuclear cap-binding complex) - кэп-связывающий комплекс

Coiled-coil domain - домен белка, обладающий суперспиральной структурой

DMRs (differentially methylated regions) - дифференциально метилированных

регионов)

dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) - дезоксинуклеозидтрифосфат

EST (expressed sequence tag sequences) - экспрессирующиеся маркерные

последовательности

FM (floral meristem) - флоральная меристема

GSS (genome survey sequences) - последовательности, полученные при секвенировании геномов

GWA (genome wide association) - метод картирования полных геномов

InDel (insertion/deletion) - инсерция/делеция

IPTG - ИПТГ, изопропил-р-О-тиогалактозид

LB - питательная среда Лурия-Бертани

LncRNA (long noncoding RNA) - длинная некодирующая РНК

miRNA (microRNA) - микроРНК

NCBI (National Center for Biotechnology Information) - Национальный центр биотехнологической информации США

Pfu -ДНК полимераза - термостабильная ДНК-полимераза из Pyrococcus furiosus

QTL (quantitative trait locus) - локус количественного признака

SAM (shoot apical meristem) - апикальная меристема побега

SCAR (от sequence characterized amplified region) - охарактеризованная

последовательность амплифицированного участка ДНК.

SNP (single nucleotide polymorphism) - мононуклеотидный полиморфизм

SRA - high-throughput DNA and RNA sequence read archive - архив последовательностей ДНК и РНК высокого разрешения ТАЕ-буфер - трис-ацетатный буфер

7а#-ДНК полимераза - термостабильная ДНК-полимераза из Thermus aquaticus

UTR (untranslated regions) - нетранслируемые участки

X-Gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индоил-бета-0-галактопиранозид

a.o. - аминокислотный остаток

ДД - длинный день

ИШТ - изопропил-в-тиогалактозид

КД - короткий день

КО - кодирующая область

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Наиболее часто употребляемые сокращения названий генов:

AG-AGAMOUS

AGL24 - AGAMOUS-LIKE24

API - APETALA1

СО - CONSTANS

FES1 - FRIGIDA ESSENTIAL J

FLC - FLOWERING LOCUS С

FLX- FLOWERING LOCUS С EXPRESSOR

FRI- FRIGIDA

FRL1 - FRIGIDA-LIKE1

FT - FLOWERING LOCUS T

Hdl- HEADING DATE1

Hd3 - HEADING DA ТЕЗ

LFY-LEAFY

SOC1 - SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1

SUF4 - SUPPRESSOR OF FRIGID A 4 SVP - SHORT VEGETATIVE PHASE TFL1- TERMINAL FLOWERING 1 VIN3 - VERNALIZATION INSENSITIVE 3 VRN1 - VERNALIZA TION1 VRN2- VERNALIZA TI0N2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ (ВВЕДЕНИЕ)

Важным этапом жизненного цикла растений является переход от вегетативного к репродуктивному развитию, который запускается и контролируется различными эндогенными и экзогенными сигналами. В умеренных широтах в ходе эволюции в результате длительного воздействия изменяющихся условий внешней среды формировались экологические особенности конкретных видов растений, и тем самым увеличивалось их разнообразие. Повторяющаяся смена ледниковых и межледниковых эпох оказала сильное влияние на растительность: с наступлением ледниковых эпох теплолюбивые виды растений отступали к югу, в межледниковые эпохи они вновь возвращались на север. Изменялись рельефы поверхности Земли, состав почв, температура, влажность, продолжительность дня и ночи и освещенность. В результате одни типы растительности сменялись другими. Каждый раз, с изменением окружающей среды, растения приспосабливались к определенной экологической нише, вырабатывая определенные требования к условиям существования. Поэтому в каждой из природных зон (тундра, тайга, степь, пустыня) закрепились те жизненные формы растений, которые наилучшим образом приспособлены к конкретным условиям произрастания. В частности, в процессе эволюции, посредством изменчивости, наследственности и адаптации, возникли растения, различные по периодичности цветения: однолетние, двулетние, многолетние, монокарпики - и времени зацветания: ранне- и поздноцветущие формы.

Возможность возделывать ранне- и поздноцветущие формы культурных растений раздвигает границы полевого сезона, а в ряде случаев, обеспечивает круглогодичное получение хозяйственного урожая. Способность одних растений зацветать раньше, а других - позже регулируется сложным генетическим механизмом. На примере арабидопсиса

{Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) создана подробная модель генетической регуляции перехода к цветению, которая хорошо объясняет особенности этого процесса у многих групп однолетних растений.

Ключевым геном этой модели является FLOWERING LOCUS Т, продукт экспрессии которого входит в состав предсказанного М.Х. Чайлахяном флоригена - мобильного сигнала, необходимого для индукции цветения (Аксенова и др., 2006; Corbesier et al., 2007; Tamaki et al., 2007; Turk et al., 2008). На экспрессию FLOWERING LOCUS T влияют различные факторы внешней и внутренней среды (продолжительность освещения и качество света, температура, гормональный статус, углеводное питание и др.), поэтому при анализе генетической регуляции экспрессии FLOWERING LOCUS Т выделяют несколько механизмов индукции цветения: фотопериодический путь, путь гиббереллина, автономный путь, реакцию на температуру окружающей среды, включая путь вернализации, и др. Эти пути взаимодействуют между собой, и их относительный вклад изменяется в различных экологических условиях и у разных жизненных форм растений. Эта модель (Бернье и др., 1985; Amasino, 2004; Bernier and Perilleux, 2005) постоянно дополняется и усложняется по мере появления новой информации о генах, контролирующих ключевые гены каждого пути, включая гены эпигенетического контроля, и об участии miRNA в молекулярном механизме перехода к цветению (Adrian et al., 2009; Andres and Coupland, 2012; Kim et al., 2009; Moghaddam and Van den Ende, 2013; Rataj and Simpson, 2014; Song et al., 2012; Yamaguchi and Abe, 2012).

Изучение генов, регулирующих переход к цветению, может быть полезным при создании новых инструментов для селекции культурных растений на раннеспелость и продолжительность вегетационного периода. Одним из важных направлений селекционных работ является создание высокоурожайных сортов и гибридов, обеспечивающих круглогодичное получение сельскохозяйственной продукции. Другими экономическими характеристиками продуктивных форм культурных растений являются

ю

одновременное достижение хозяйственной спелости и морфологическая выравненность посева, необходимые для механизации их возделывания. Изучение генов, стоящих за этими признаками, также имеет большое практическое значение.

Процесс первичного одомашнивания растений и современная селекция используют полиморфизмы генов перехода к цветению и регулирующих их генов, которые, при генетическом анализе популяций, обнаруживаются как QTLs основных хозяйственных признаков. Особенно плодотворными оказались исследования, в которых результаты QTL анализа высокого разрешения совмещены с физическим картированием и клонированием генов перехода к цветению у культурных растений и их дикорастущих сородичей. Сравнительный исторический, экологический и эволюционный анализ природной и искусственно созданной изменчивости признаков, связанных со временем перехода к цветению и скороспелостью, позволяет не только прояснить роль этих признаков в одомашнивании и адаптации культурных растений в различных экологических зонах и разнообразных агроценозах, но и выявить гены, которые могут быть точкой приложения молекулярной селекции на основе традиционных методов гибридизации и отбора и с использованием методов генной инженерии (Alonso-Blanco et al., 2009; Blackman et al., 2011; Doebley et al., 2006; Ehrenreich et al., 2009; Lzawa, 2007; Olsen and Wendel, 2013).

В качестве масличных, овощных и технических культур растения рода Brassica L. занимают важное место в сельскохозяйственном производстве, в том числе в нашей стране. Растения Brassica представлены яровыми и озимыми однолетними и двулетними жизненными формами, происходящими из субтропиков и умеренных широт. Эти формы сильно различаются по времени зацветания. Шесть культурных видов Brassica образуют классический треугольник U (Nagaharu, 1935) из диплоидных видов с геномами А, В и С: Brassica rapa L. (геном A), Brassica nigra (L.) W. D.J.Koch (геном В), Brassica oleracea L. (геном С) и амфиплоидов Brassica júncea (L.)

íi

Czern. (геном AB), Brassica napus L. (геном АС) и Brassica carinata A.Braun (геном ВС).

Для климатических условий нашей страны особенно важна регуляция времени зацветания однолетних культурных растений Brassica под влиянием длительного воздействия низких положительных температур (путь вернализации). Этот путь наиболее подробно исследован на растениях арабидопсиса, близкого родственника растений Brassica. Ключевыми элементами этого пути у арабидопсиса являются гены FLOWERING LOCUS С и FRIGIDA (Johanson et al., 2000; Shindo et al., 2005); аллельное разнообразие и плейотропия этих генов во многом определяют адаптационный потенциал растений арабидопсиса в различных экологических условиях (Lovell et al., 2013; Strange et al., 2011).

У растений Brassica ген FLOWERING LOCUS С исследован достаточно подробно (см. Zou et al., 2012); напротив, ген FRIGIDA у растений Brassica к началу нашей работы оставался практически неизученным. Наше исследование строения гена FRIGIDA в геномах Brassica было призвано хотя бы отчасти восполнить этот пробел. За время нашего исследования появились публикации, подробно описывающие структурные и функциональные особенности гена FRIGIDA у В. napus (Wang et al., 2011) и В. oleracea (Irwin et al., 2012). Детально изученная эволюция геномов Brassica (Cheung et al., 2009; Couvreur et al., 2010; Lysak et al., 2005; Schranz et al., 2006) создает благоприятные предпосылки для анализа дивергенции FRIGIDA в связи с особенностями перехода к цветению у жизненных форм Brassica.

Цель и задачи исследования. Провести in silico анализ гомологов гена FRIGIDA А. thaliana среди культурных видов Brassica. Клонировать и провести сравнительный анализ строения гена FRIGIDA в геномах и субгеномах А, В и С культурных видов Brassica. Выявить локус- и геном-специфичные полиморфизмы гена FRIGIDA. Создать на этой основе

специфичные SCAR маркеры, пригодные для использования в интрогрессивной селекции, для картирования и функционального анализа гена FRIGIDA.

Научная новизна исследования. Обоснована двухлокусная модель гена FRIGIDA у растений рода Brassica. Получены новые данные о структурных особенностях двух локусов FRIGIDA в геномах А, В и С и дивергенции гена FRIGIDA у растений рода Brassica. Создана система SCAR маркеров для изучения разнообразия двух локусов FRIGIDA в геномах и субгеномах Brassica; эти маркеры могут быть использованы для картирования и функционального анализа гена FRIGIDA.

Практическая значимость работы. Созданы локус- и геном-специфичные маркеры гена FRIGIDA, которые могут оказаться полезными для уточнения связи этого гена с QTL времени перехода к цветению. Эти маркеры могут также быть использованы в интрогрессивной селекции культурных форм Brassica, в том числе на время зацветания и скороспелость.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экономическое значение культурных видов Brassica

Среди культурных растений рода Brassica особое место занимают шесть видов: В. rapa, В. oleracea, В. napus, В. nigra, В. juncea и В. carinata. Разнообразные формы этих видов возделываются как овощные, кормовые, масличные и декоративные культуры (Жуковский, 1971; Branca and Cartea, 2011).

Вид Brassica rapa L. включает экономически важные масличные, овощные и кормовые, листовые и корнеплодные культуры и широко распространен на земном шаре. К листовым культурам относятся всевозможные виды китайской (В. rapa