Технология генотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов

Анискина, Юлия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Технология генотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Технология генотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов"

На правах рукописи

АНИСКИНА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ТЕХНОЛОГИЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КУЛЬТУРНЫХ И ДИКОРАСТУЩИХ ФОРМ BRASSICA НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА МИКРОСАТЕЛЛИТОВ

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (г. Москва).

Научный руководитель: ведущий научный сотрудник

кандидат химических наук Шилов Илья Александрович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Иванов Павел Леонидович

кандидат сельскохозяйственных наук Монахос Григорий Федорович

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии РАСХН.

Защита состоится 5 декабря 2006 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42; тел.: (495) 976-65-44; факс: (495) 977-09-47; е-таП: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан «С/» 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.027.01 Меликова С.А.

кандидат биологических наук „

¿г/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Род Brassica отличается большим морфологическим разнообразием форм и является источником ценных масличных, овощных, пряных, кормовых и декоративных культур, широко используемых по всему миру. Большинство культурных форм Brassica произошло от шести основных видов: В. napus (масличный рапс, брюква), В. rapa (азиатские листовые капусты, репа и турнепс), В. oleráceo (кочанная, брюссельская и цветная капуста, брокколи, кольраби), В. juncea (горчица сарептская) В. carinata (горчица эфиопская) и В. nigra (горчица черная). Филогенетические взаимосвязи между этими видами хорошо описаны моделью так называемого «U-треугольника» [U, 1935]. Согласно этой модели в результате естественной гибридизации трех диплоидных видов В. rapa, В. nigra, В. oleráceo, геномы которых условно обозначены как АА, ВВ, СС, соответственно, возникли аллотетраплоидные формы В. juncea (ААВВ), В. napus (ААСС), В. carinóla (ВВСС). Таким образом, род Brassica представляет собой удобную модель для исследования генетического разнообразия и интрогрессии генетического материала в результате межвидовой и межродовой гибридизации.

Исследование генетического разнообразия культурных и дикорастущих видов Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae представляет большое научное значение для выяснения филогенетических взаимосвязей и эволюции геномов, уточнения границ таксонов и практическое значение для выявления потенциальных источников новых культур и доноров важных агрономических признаков, которые могут быть включены в различные селекционные программы.

Важной сферой описания и использования растительных генетических ресурсов является регистрация растительных форм. Новые сорта культурных растений должны пройти ряд тестов на отличимость, однородность и стабильность (DUS - Distinctness, Uniformity, Stability), которые составляют основу защиты интеллектуальной собственности селекционеров. Современная система диагностирования, основанная на ряде стандартизованных морфологических характеристик, требует длительных полевых испытаний и многочисленных статистических исследований. Кроме того, в связи с широким применением в селекции новейших биотехнологий растительные коллекции значительно пополнились гибридными сортами и генетически модифицированными формами, которые невозможно надежно различать и идентифицировать, используя ограниченное число морфологических характеристик. Для быстрого и надежного различения и идентификации растительных форм возникла необходимость анализа полиморфизма на генетическом уровне.

Наиболее перспективным подходом для исследования генетического полиморфизма представляется использование методов молекулярного анализа, основанных на анализе полиморфизма ДНК, позволяющих получить индивидуальную характеристику отдельного генотипа — ДНК-профиль. Существующие методы анализа геномов отличаются по сложности, надежности и объему получаемой информации. Метод анализа полиморфизма микросателлитов, позволяющий получать воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома, является наиболее перспективным для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как идентификация, паспортизация и сертификация сортов, поддержание генетических коллекций, составление родословных, зашита интеллектуальной собственности, подбор родительских пар при скрещивании, контроль интрогрессии генетического материала, и решения проблем молекулярной систематики и эволюции. В связи с этим, большое практическое значение представляет разработка надежной, высокопроизводительной и удобной в эксплуатации технологии генотипирования растений рода Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов. Цель работы. Разработка технологии генотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов.

Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Исследовать возможность применения метода микросателлитного анализа для генотипирования растений рода Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae. Разработать универсальную технологию для генотипирования растений рода Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов. Отобрать оптимальный набор праймеров к полиморфным микросателлитным локусам для различения и идентификации растений рода Brassica.

2. Применить технологию микросателлитного анализа для исследования генетического разнообразия представителей семейства Brassicaceae на родовом, видовом и внутривидовом уровне, а также для генотипирования близкородственных сортов и гибридов Brassica.

J. Изучить природу межвидового и внутривидового полиморфизма микросателлитных локусов.

4. Исследовать возможность применения технологии микросателлитного анализа для исследования филогенетических взаимосвязей видов Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae на модели «треугольника U», а также для осуществления контроля интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях.

Научная новизна. На основании проведенных исследований нами были отобраны 18 пар праймеров к микросателлитным локусам, являющиеся перспективными для идентификации

видов, сортов и дикорастущих форм Brassica. С применением технологии микросателлитного анализа были получены уникальные генетические профили 98 растительных форм родов Brassica, Sinapis, Raphanus и Camelina. В результате микросателлитного анализа впервые были идентифицированы фрагменты, специфичные для геномов А, В и С диплоидных видов Brassica и подтверждена их интро1рессия в амфидиплоедные виды, а также межвидовые и межродовые гибриды. Впервые показана возможность контроля интрогрессии генетического материала родительских форм (сортов В. rapa) в гибриды с помощью технологии микросателлитного анализа. В результате клонирования и секвенирования микросателлитных фрагментов локусов Nal2-A02 и BRMS-042 было установлено, что исследуемые фрагменты представляют собой сложные микросателлитпые повторы, включающие несколько вариабельных областей. На основе сравнительного анализа микросателлитных фрагментов локусов было установлено, что полиморфизм между геномами А, В и С определяется числом микросателлитных повторов и инсерциями/делециями во фланкирующих участках генома, а полиморфизм внутри геномов определяется исключительно числом микросателлитных повторов. Результаты анализа полиморфизма микросателлитов на генетическом уровне подтвердили филогенетические взаимосвязи шести видов Brassica, описанные моделью «U-треуголышка», тесную взаимосвязь А и С-геномов (В. rapa/B. olerácea) и более отдаленную связь с В-геномом (В. nigra).

Практическая значимость работы. Предлагаемая технология генотипирования на основе микросателлитного анализа позволяет надежно различать рода, виды и сорта, в том числе и близкородственные, выявлять генетическую разнородность фенотипически однородного материала, осуществлять контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в межродовые, межвидовые и сортовые гибриды. Показана перспективность применения технологии для идентификации, генетической паспортизации и сертификации, подбора генетически однородного материала для скрещиваний и контроля селекционной работы, а также для решения проблем молекулярной систематики и эволюции. В результате микросателлитного анализа выявлены фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, которые могут быть использованы в качестве маркеров интрогрессии генетического материала при межвидовых и межродовых скрещиваниях. На основе специфичной последовательности микросателлитного локуса Nal2-A02 создан локус-специфичный SCAR-маркер генома В Brassica, который может быть эффективен для контроля интрогрессии генома В при создании форм Brassica, устойчивых к болезням и неблагоприятным условиям среды, а также для исследования филогенетических взаимосвязей и эволюции видов Brassica.

Публикации и апробация работы. По результатам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Основные результаты исследований были представлены на III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 19 октября, 2004), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта, 2005) и на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 19-22 мая, 2005).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 204 библиографические ссылки. Работа изложена на 144 страницах печатного текста, содержит 17 таблиц и 30 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследования.

В работе использовали олигонуклеотиды, синтезированные ЗАО "Синтол" (г. Москва, Россия), дНТФ фирмы «Медиген» (Россия), ДНК-полимеразу ThermoStar, обеспечивающую «горячий старт» при проведении ПЦР, производство ВНИИСБ (лаб. Молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций, зав. лаб. Лунин В.Г.), термосеквеназу фирмы Amersham Biosciences (США), эндонуклеазы рестрикции Msp I, £coRI, Т4 ДНК-лигазу и соответствующие буферные растворы фирмы MBI Fermentas (Литва).

Растительный материал был получен из коллекций Всероссийского НИИ растениеводства им. П.И. Вавилова, Всероссийского НИИ кормов им. В.Р. Вильямса, Всероссийского НИПТИ рапса и Centre for Genetic Resources (CGN), Нидерланды. Геномную ДНК выделяли из зеленых листьев проростков с помощью модифицированного СТАВ метода [Kidwell, Osborn, 2001], а также с помощью метода выделения ДНК на силикагелевом сорбенте [Boom eta!., 1990].

Полимеразную, цепную реакцию осуществляли с помощью локус-специфичных пар праймеров, представленных в Табл. 1. Реакции проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20-50 нг ДНК, по Юпмоль каждого из праймеров (один из праймеров был помечен флуоресцентным красителем Су5), буферный, содержащий 100 мМ Трис-HCl (рН 8.3), 25 мМ MgCI2, 500 мМ КС1,400 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата и 1 ед. ДНК-полимеразу ThermoStar. Активация термостабильной ДНК-полимеразы происходила в результате экспозиции реакционной смеси при 95°С в течение 10 мин перед проведением ПЦР. Амплификация осуществлялась при следующих температурных условиях: 1 цикл: 95°С

- 10 мин, 30 циклов: У4°С - 30 сек, Тогж - 30 сек, 1 цикл: 72°С - 5 мин. Температура отжига праймеров (Тот») указана в Табл. 1. Для амплификации использовали термоциклеры «Mastercycler gradient» фирмы «Eppendorf» (Германия), GeneAmp PCR System 2400 фирмы «Perkin ElmeD> (США) и «Терцик» фирмы «ДНК-технология» (Россия).

Анализ флуоресцентно-меченых ПЦР-фрагментов проводили методом электрофореза в денатурирующих условиях с помощью автоматического анализатора ALFexpress II Amersham Biosciences (США). Полученные данные анализировали с помощью пакета прикладных программ ALFwin Software Fragment Analyser.

Амплифицнрованые фрагменты ДНК клонировали в состав вектора pGEM-T Easy (Promega, США). Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли по методу Сэнгера с использованием автоматического анализатора ALFexpress II Amersham Biosciences (США).

Для множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программы Clustal W и GenDoc, для построения дендрограмм использовали пакет прикладных программ TREECON [Van de Peer, de Wachter, 1994].

2. Микросателлитний анализ межвидового и внутривидового генетического разнообразия рода Brassica.

В основе предлагаемой технологии генотипирования лежит полиморфизм длин микросателлитных локусов, выявляемый посредством ПЦР-амплификации с использованием пар праймеров, комплементарных последовательностям, фланкирующим микросателлиты. Для эффективного различения и идентификации генотипов определяющее значение имеет отбор пар праймеров, специфичных к полиморфным микросателлитным локусам.

За последние годы число публично доступных праймеров к микросателлитным локусам Brassica значительно увеличилось, однако уступает другим важным культурным видам. В настоящий момент в международной базе данных Brassica Microsatellite Information Exchange flittp://www.brassica.info/ssr/SSRinfo.htm1 представлено 628 пар праймеров к фланкирующим областям микросателлитных локусов В. napus, В. гара, В. nigra и В. oleracea. Следует отметить, что не все микросателлитные локусы эффективны для исследования межвидового и внутривидового генетического разнообразия, интрогрессии генов и филогенетических взаимосвязей. Некоторые из них являются мономорфными или выявляют незначительный полиморфизм. При выборе оптимальных пар праймеров для исследования полиморфизма микросателлитов растений Brassica мы использовали праймеры к известным микросателлитным локусам, опубликованные Kresovich и соавт. (1995), Szewc-McFadden и соавт. (1996), Suwabe и соавт. (2002), Lowe и соавт. (2004).

Выбор праймеров определялся длиной амплифицируемых микросателлитных фрагментов и количеством выявляемых аллелей. Различие длин аллелей микросателлитного локуса определяется главным образом числом повторяющихся единиц, представляющих собой ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклеотиды. Для надежного различения ПЦР-фрагментов, отличающихся на несколько нуклеотидов, даже с помощью электрофореза высокого разрешения, их длина не должна быть большой (желательно не более 300 нуклеотидов). Важным критерием при выборе праймеров также является количество выявляемых ими аллелей, определяющее полиморфизм микросателлитного локуса. Поэтому на основании литературных данных были выбраны праймеры, позволяющие детектировать более трех аллелей.

На основе перечисленных критериев из 459 пар праймеров для исследования полиморфизма микросателлитных локусов Brassica первоначально были отобраны 40 пар праймеров. Эти праймеры мы предварительно тестировали на наличие/отсутствие ПЦР-продуктов. Кроме того, каждую пару праймеров тестировали на возможность образования ПЦР-продуктов при амплификации с использованием одного (прямого или обратного) праймера, чтобы исключить из исследования инвертированные последовательности.

Следующим этапом работы являлось исследование возможности использования отобранных пар праймеров для анализа генетического разнообразия растений шести видов рода Brassica: В. oleráceo (кочанная, цветная, брюссельская и португальская капуста), В. napus (масличный рапс), В. rapa (сурепица, турнепс, листовые формы капусты), В. juncea (горчица сарептская), В. nigra (горчица черная) и В. carinata (горчица эфиопская), а также родственных представителей семейства Brassicaceae — Sinapis alba (горчица белая), Raphamis sativus (редька, редис), Camelina sativa (рыжик полевой).

На рис. 1 в качестве примера представлены электрофореграммы разделения ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парами праймеров Nal0-D09, Nal 2-А02, 0112-А04, демонстрирующие межвидовой и внутривидовой полиморфизм. По данным парам праймеров для каждого исследуемого вида выявлен определенный набор фрагментов, отличающий его от других видов. Пара праймеров Nal0-D09 (рис. 1, А) позволяет различать все шесть видов Brassica, а также обнаруживает небольшой внутривидовой полиморфизм у видов В. nigra, В. carinata и В. olerácea. Данная пара праймеров позволяет выявить фрагменты, специфичные для геномов А, В и С. Электрофореграмма разделения ПЦР-фрагментов, полученных при амплификации с парой праймеров Nal2-A02 (рис. 1, Б), иллюстрирует пример значительного внутривидового и межвидового полиморфизма. С помощью данной пары праймеров можно выявить четыре зоны фрагментов с различной электрофоретической подвижностью, специфичные для генома А; четыре зоны,

ААСС АА ААВВ ВВ ВВСС СС

В. парт В. rapa В. juncea В. nigra В. сагтвш В. oleráceo

12 3 4 5 6 7 Я 9 tO II 12 13 141516171» 19 20 21 222324 25 26 27282930 313233 34 3536 373Я39

А2_ А1-

staSSS g«->ra«s»MB»iш>:а

200 и. н.

.В "С

В4_

BI-Í

А2— Alt'1

100 и. и. 250 п. н.

^_вз

*=В2

200 п. н.

К_A3

И.С2

3=С1 ISO п. н.

С2_

С]_р

А_

150 п. Ii.

100 п. н.

Рис. I. Электрофореграммы разделения в 8 %-ном полкакркламидиом геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парами праймеров Nal0-D09 (A), Nal2-A02 (Б) и 0112-А04 (В). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений Sinapis alba 4232 (2), В. napus: Bnal-02 (3), BnaVikros (4), BnaKhanna (5), BnaUral (6), Bna 10-02 (7), Bnal4-02 (8), B. rapa: Brll4 (9), Brl07 (10), Br350 (11), Br548557 (12), Br6832 (13), Br6818 (14), B. juncea: Bj4588 (15), Bj4594 (16), Bj6615 (17), Bj7154 (18), Bjl5191 (19), Bjl5193 (20), B. nigra: Bni6618 (21), Bni6619 (22), Bni6620 (23), Bni6628 (24), Bni6634 (25), Bni6635 (26), B. carinata: Bc3946 (27), Bc3950 (28), Bc3952 (29), Bc3976 (30), Bc4025 (31), Bc4035 (32), В. Ыегасеа: п/в botrytis: Bob699 (33), п/в cosíala-, Boc2218 (34), п/в gemmifera: Bog6998 (35), п/в capitata: Bocal92 (36), Boca2432 (37), Boca7022 (38). Дорожки 1 и 39 - маркер молекулярной массы. Фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, обозначены разными стрелками.

специфичные для генома В, и две зоны, специфичные для С-генома. Внутривидовой полиморфизм, выявленный в результате амплификации праймеров 0112-А04 (рис. 1, В) у видов В. napas, В. rapa, В. juncea и В. oleráceo, обусловлен полиморфизмом длин А- и С-геном-специфичных фрагментов.

В ходе данного исследования выяснилось, что полиморфизм длин микросателлитного локуса не всегда позволяет различать виды и отдельные формы Brassica, поскольку выявляемые по некоторым парам праймеров аллели не являются видо- или геном-специфичными и присутствуют у всех или нескольких видов Brassica. При анализе с некоторыми парами праймеров, ПЦР-фрагменты детектировались не во всех образцах. В этих случаях наличие/отсутствие продукта определялось видовой принадлежностью.

По результатам проведенного нами микросателлитного анализа растений рода Brassica было отобрано 18 пар праймеров (Табл. 1), позволяющих выявлять межвидовой и внутривидовой полиморфизм. Данные пары праймеров позволяют выявлять фрагменты, специфичные для простых геномов А, В и С, которые кодоминантно сочетаются в тетраплоидных формах, а также фрагменты, общие для всех или нескольких видов «треугольника U». Каждая пара праймеров позволяет выявлять в сумме от 4 до 19 аллелей у видов рода Brassica. Диапазон длин получаемых фрагментов составляет от 80 до 320 п.н.

Существенным моментом в изучении интрогрессии генетического материала в результате межвидовых скрещиваний является универсальность (transferability) — консервативность праймеров для всех или нескольких видов Brassica, образующих «треугольник U». Среди выбранных 18 пар праймеров 15 оказались универсальными, т.е. позволяли различать все шесть видов Brassica, одна пара (BRMS-043) - специфичной для генома А, две (BRMS-006 и NÍ2-F02) - для геномов А и С. Двенадцать универсальных пар праймеров одновременно выявляют фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, у исследуемого спектра видов, что позволяет проследить распределение генетического материала у видов Brassica. Исследованные нами пары праймеров выявляют внутривидовой полиморфизм у большинства видов, образующих треугольник U. Три универсальные пары праймеров (Nal2-A02, NÍ2-F02 и BRMS-046) обнаруживают полиморфизм у всех шести видов Brassica. Для некоторых праймеров универсальность распространяется за пределы рода, что позволяет провести сравнительный анализ и оценить генетические расстояния между формами рода Brassica и такими отдаленными формами, как Sinapis, Raphamis и Cornelina.

В данной работе в качестве моделей для исследования интрогрессии генетического материала мы использовали известный межродовой гибрид капусты (В. oleráceo) и редьки (R. sativus) - Raphanobrassica (RRCC) [Карпеченко, 1971] и межвидовой гибрид ß. xcomposita

Таблица 1. Праймеры для генотипирования видов и разновидностей Brassica.

№ Название праймера Последовательности лраймеров T отжига °C Диапазон длин ПЦР-фрагментов, л. и. Мотив Геном-специфичность Количество обнаруженных аллелей

1 Nal0-D09 F-AAGAACC-TCAAGATCCTCTGC R-ACCACCACGGTAGTAGAGCG 49 150-170 (01% ABC 6

2 Nal2-A02 F-AGCCrTCT7GCTZT7CAACG R-AGTGAATCGATGATCTCGCC 53 160-218 (СП, ABC 16

3 Nal2-F12 F-CGTTCTCAGCTCCGATAAGC R-TCCGATGTAGAATCAGCACC 55 170-190 (СССЪ ABC 8

4 Ni2-B02 P-CGCTGCAATTATACGAAAGC R-CCTCATCCTCTGCAAAGACC 49 80-110 (GGC)„ ABC 14

5 Ni2-C12 F-ACATICTTGGATGTTCATTCG R-AAAGGTCAAGTCCTTCC7TCG 49 112-150 «ЗА). AC 6

6 Ni2-F02 F-TGCAACGAAAAAGGATCAGC R-TGCTAAT7GACCAATAG7C-ATTCC 49 165-190 (СТ)„ ВС 8

7 Ni3-C04B F-A7ACTCGGGATAGG7GTGCG R-CATGTGGCAATCCTACATTTAC 55 80-140 (АО). ABC 15

8 OI12-A04 F-TGGGTMGTAACTGTGG7GCC R-AGAC-TTCGCATACTCTGGAGC 55 110-150 (CT), ABC 8

9 Ra2-E12 F-7GTCAG7GTG7CCAC77CGC R-AAGAGAAACCCAATAAACTAGAACC 55 125-165 (OA), ABC 10

10 BRMS-006 F-7GGTGGCTTGAGATTAGTTC R-ACTCGAAGCCTAATGAAAAG 51 140-175 (GA)n ABC 5

11 BRMS-036 F-GGTCCA77CCT7TTTGCATCTG R-CATGGCAAGGGG7AACAAACAT 55 125-165 (CA)m(GA)n A 7

12 BRMS-042 F-GGATCAGTTATCTGCACCACAA R-TCGGAATTGGA7AAGAATTCAA 48 81-136 (AATX(CT)m(Tb(CT)D ABC 8

13 BRMS-042-2 F-AGCTCCCGACAGCAACAAAAGA R-TrCGC?TCCT?TTCrGGGAATG 55 205-235 (GAUCTJi, A 8

14 BRMS-043 F-GCGATGTTTTTTCTTCAGTGTC R-TTAA7CCCTACCCACAATTTCC 48 280-320 (A)i(TUGT). A 4

15 BRMS-046 F-TTGGCC7TGC7ATTACGAGCTG R-ATC-CGCAAACCCTAATTTTGAC 48 125-270 (GA)k(CA)JGA)„ ABC 19

16 BRMS-050 F-AAC7TTGCTTCCACTGAT7TTT R-TTGCTTAACGCTAAATGCATAT 48 162-178 (ААТМТЩТТС). AB 9

17 BN6A2 F-CTT7GTGTGGACT77TAGAACTTTA R-CGCAGCTTTTGC-CGCACCTG 55 90-210 (GATT)a ABC 6

IS BN83BI F-GCC7TTCT7CACAACTGA7AGCTAA R-TCAGGTGCCTCGT7GA0T7C 48 170-230 (GAUAAG). ABC 10

(ААВВСС) [Монахос и др., 2001], полученный в результате гибридизации В. carinóla (ВВСС) и В. rapa (АА). В геноме аллогексаплоида В. xcomposita по отобранным парам праймеров были выявлены фрагменты, специфичные для геномов А, В и С. В геноме аллотетраплоида Raphanobrassica с помощью большинства исследованных пар праймеров были выявлены фрагменты, специфичные для генома С (В. oleráceo). Большинство выбранных нами праймеров оказались универсальными для рода Raphanus, что позволило идентифицировать в геноме Raphanobrassica характерные для этого рода фрагменты.

В микросателлитных профилях, получаемых по каждой паре праймеров, каждый аллель с известной молекулярной массой можно рассматривать как дескриптор генетического разнообразия. Для различения отдельных форм растений дескрипторов, выявляемых по одному локусу, часто оказывается недостаточно, так как в пределах вида генотипы повторяются (рис. 1 - Б, дорожки 4 и 5, 10 и 12 и т.п.), поскольку в процессе эволюции происходит накопление полезных аллелей. Выявленный в данном исследовании полиморфизм определяется частотой встречаемости аллелей у отдельных форм конкретного вида и ограничивается выборкой растительных форм. Микросателлитный анализ всей панели локусов позволяет получить набор дескрипторов, уникальный для каждого вида, подвида, сорта, на основе которого может быть составлен индивидуальный «генетический паспорт». Полученная информация о наличии/отсутствии каждого дескриптора может быть представлена в графической форме, в качестве набора аллелей всех локусов, в виде своеобразного штрих-кода, или в математической форме, в виде матрицы, представляющей совокупный цифровой профиль дескрипторов, выявленных по всем исследуемым локусам, где 1 означает наличие фрагмента в геноме, а 0 — его отсутствие.

В данной работе для исследуемого спектра видов с использованием 18 пар праймеров было выявлено 222 дескриптора генетического разнообразия. На основе полученных дескрипторов была создана матрица, которую вводили в программу TREECON для расчета генетических расстояний между генотипами в соответствии с алгоритмом, предложенным Nei и Li (1979). Далее на основе полученной матрицы генетических расстояний проводили кластерный анализ, используя алгоритм UPGMA [Sneath, 1973]. Результаты кластерного анализа были получены в виде дендрограммы, отражающей родственные связи между исследуемыми формами.

Дендрограмма видов и разновидностей Brassica (рис. 2), построенная на основе результатов микросателлитного анализа, соответствует ботанической классификации и цитогенетическим взаимосвязям, описанным моделью «треугольника U» [U, 1935]. Кластеризация растений в целом соответствует видовой принадлежности. Исключение

сс

составляют две формы В. nigra - Bni6635 и Btii6628 из Эфиопии, которые оказались в одном кластере с В. carinata (ВВСС).

Bob633 Bob762 Bob704 Bob699 ВоЬббЗ ВоЬ681 Bob343 Вог6998 Вос2218 Воса7022 ВоЬ578 Вос2568 Вое7004 Bog 14069 Воса11159 Boca 192 Воса15778 Boca2432 Bni6635 Bc3950 Bni6628 Be4035 Bc4025 Bc3976 Bc3952 Bc3946 Bc4530 Brll4 Bi€818 Br350 ВЛ832 Brl07 Br548557 B. x composita BnaVikros BnaKhanna Bna5065 BnaUral Bnal-02 Bnal0-02 Bna4405 Bnal4-02 Bna4641 Bni6618 Bn12656 Bni6634 Bni6620 Bni6619 Bil5191 Bjl5193 Bj4594 Bj4588 Bi6615 Bj7154 Sa4232

Raphanobrassica Rs2068 Rs 1891 Rs2842 Rs2844 Rs2073 Rs2199 Cs4I44 Cs4149 Cs4184 CS4185

BBCC

AACC

AABB

Рис. 2. Дендрограмма видов Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae, Жирным шрифтом отмечены формы В. nigra, оказавшиеся в одном кластере с представителями В. carinata.

В результате микросателлитного анализа по 18 отобранным парам праймеров в геномах данных форм наряду с фрагментами, характерными для В. nigra (ВВ), были также выявлены фрагменты, специфичные для генома С, что соответствует генотипу В. carinata (ВВСС) (рис. 3, А - Г, дорожки 5, 7). Чтобы подтвердить наше предположение о том, что эти фрагменты являются С-геном-специфичными, мы клонировали и секвенировали фрагменты, специфичные для генома С, выявленные у представителей В. carinata и В. oleráceo, а также фрагменты соответствующей длины, выявленные в образцах Bni6628 и Bni6635 в результате амплификации с парами праймеров Nal2-A02 (рис. 3 Б, дорожки 5, 7, 9 и 17) и NÍ2-F02 (рис. 3 Г, дорожки 5, 7,9 и 16).

ВВСС В. carinata

СС £ oleracea

В. nigra

'1 3 4 5 < 5 10 11 1113 "Í4 1516 171» lVl»

100 П.Н.

50 п.в.

200 п.н.

100 D.H. 200 п.и.

ISO п.в.

100 п.н.

Рис. 3. Элекгрофореграммы разделения в S %-ном полиакриламидном геле ПЦР-фрагментов, полученных с помощью пары праймеров NÍ3-G04b (A); Nal2-A02 (Б); Nal0-D09 (В); - NÍ2-F02 (Г). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений В. nigra (ВВ): Bni6618 (2), Bni6619 (3), Bn¡6620 (4), Bni6628 (5), Bn¡6634 (6), Bn¡6635 (7), B. carinata (ВВСС): Bc3946 (8), Bc3950 (9), Вс3952 (10), Вс3976 (11), Вс4025 (12), Вс4035 (13), В. oleracea (СС): п/в botrytis: Bob699 (14), п/в cosíala: Вос2218 (15), п/в gemmifera: Bog6998 (16), п/в capitata: Воса192 (17), Воса2432 (18), Воса7022 (19). Дорожки 1, 20 - маркер молекулярной массы. Стрелками отмечены фрагменты, специфичные для генома С.

Оказалось, что нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК Вт6628 и Втб635 и С-геном-специфичных фрагментов ДНК В. сагтаГа и В,о1егасеа идентичны. Следовательно, формы ВЫ6628 и Вш6635 действительно имеют генотип ВВСС, что

объясняет их объединение в один кластер вместе с В. carínata. Таким образом, метод анализа полиморфизма микросателлитов позволяет надежно различать и идентифицировать виды Brassica.

Интересно отметить, что формы растений с геномами А и С - В. oleráceo, В. carinata, В. rapa и В. rtaptis — образуют общий кластер, а формы с геномом В - В. juncea и В. nigra выделены в отдельный кластер. Полученные результаты согласуются с результатами геномных исследований видов Brassica, в которых установлено близкое родство геномов А и С и более отдаленная связь с геномом В [Schelfhout et ah, 2004, Warwick et ah, 2005]. Представители родов Camelina, Raphanus и Sinapis образуют отдельные кластеры. Ранее методом RFLP-анализа хлоропластной и митохондриальной ДНК было показано, что Raphanus принадлежит генеалогической ветви В. rapa/B. olerácea, тогда как анализ ядерной ДНК показал, что Raphanus принадлежит ветви В. nigra [Yang et ah, 1999]. Согласно дендрограмме, построенной на основе данных микросателлитного анализа, растения рода Raphanus равноудалены от В. rapa/B. oleráceo и В, nigra, и образуют отдельный кластер.

Следует также подчеркнуть, что метод микросателлитного анализа также позволяет различать подвиды и разновидности Brassica. Так, например, отдельно кластеризуются масличные (Bj4588, Bj4594, Bj6615 и Bj7154) и овощные (Bj 15191 и Bjl5193) разновидности В. junceae.

Таким образом, технология микросателлитного анализа позволяет исследовать генетическое разнообразие представителей семейства Brassicaceae и устанавливать филогенетические взаимосвязи на родовом, видовом и внутривидовом уровне.

3. Исследование природы полиморфизма микросателлитных локусов и интрогрсссии микросателлитов, специфичных для геномов А. В и С диплоидных видов Brassica, в тетраплоидные.

Для исследования природы межвидового и внутривидового полиморфизма микросателлитных локусов и подтверждения интрогрессии генетического материала диплоидных видов в тетраплоидные, мы установили первичные структуры фрагментов, специфичных для геномов А, В и С, выявленных у представителей В. napus, В. rapa, В. juncea, В. nigra, В. carinata и В. olerácea в результате амплификации с парами праймеров BRMS-042 и Nal2-A02. На рис. 4 приведена электрофореграмма разделения ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парой праймеров Nal2-A02. В результате амплификации с этой парой праймеров был выявлен значительный полиморфизм длин фрагментов, специфичных для геномов А (168, 172, 174 и 176 п.н.), В (208, 210 и 212 п.н.) и С (160 п.н.).

Анализ первичных структур этих геном-специфичных фрагментов показал, что исследуемые фрагменты представляют собой сложные микросателлитные повторы, включающие три вариабельные зоны: Ак, (СТ),„ и (САТ),, (рис. 5). Последовательности А- и

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

—-;-— 250 п. в.

Рис, 4, Элекгрофореграмма разделения в 8 %-ном полиакриламидном геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парой праймеров Nal2-A02. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК видов В. oleracea (СС) п/в capitata - Boca 192 (дорожки 2, 10), В. napus (ААСС) - BnaVikros (дорожка 3), В. rapa (АА) Вг350 (дорожка 4), В. juncea (ААВВ): Bj4594 (дорожка 5), В]7154(дорожка 6), В. nigra (ВВ): Вшб620 (дорожка 7), Bni6634 (дорожка 8), В. carinóla (ВВСС) - Вс3950 (дорожка 9). Дорожки 1, 11 - маркер молекулярной массы. Фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, обозначены разными стрелками.

С-геномов обнаруживают наибольшую гомологию по сравнению с геномом В. Различие длин фрагментов, принадлежащих к геномам А и С, определяется количеством повторов CT и 8-нуклеотидной инсерцией/делецией во фланкирующей области. Фрагменты, специфичные для B-генома, отличаются от гомеологичных фрагментов А- и С-геномов числом повторов А, CT, GAT и инсерцией в 18 нуклеотидов во фланкирующей области (рис. 5). Более ранние исследования геном-специфичных последовательностей, выявленных у видов Brassica, также свидетельствуют о высокой гомологии между последовательностями А- и С-геномов и структурных различиях с последовательностями B-генома [Hosaka et al., 1990, Chèvre et al., 1991]. Следует отметить, что полиморфизм длин аллелей в пределах каждого из трех геномов определяется исключительно количеством повторов СТ. Последовательности фрагментов, выявленных в результате амплификации с парой праймеров Nal2-A02 зарегистрированы в Генбанке под номерами DQ327820 - DQ327833.

Выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагментов каждого из исследуемых локусов показало, что первичная структура фрагментов ДНК амфидиплоидных видов В. napus, В. juncea и В. carinata идентична фрагментам ДНК соответствующей длины диплоидных видов В. гара, В. nigra и В. oleracea (рис. 5). Полученные данные свидетельствуют об интрогрессии генетического материала диплоидных видов в тетраплоидные.

Микросателлитные фрагменты, специфичные для генома В

BB-Bniri620-212 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACT—ATAACTGTATTCACCTTAAMCCGCCATT0AMCCTfCTTt'T3?A66dACACTTrTTCCTCrTTCCCAAGGAAAAAAAAAA- : 107

AABB-Bj4594-210 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACT—ATAACTGTATTCACCTTAAAACCGCCATTGAAACCTTCTTTTTACCCSACACTTTTTCCTCTTTCCCAAGGAAAAAAAAAA- : 107

ВВСС-Вс3950-2Ю AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACT— ATAACTGTATTCACCTTAAAACCGCCATTGAAACCtTCTWTfACCCACACTTTTTCCTCTTTCCCAAGGAAAAAAAAAA- : 107

В B-Bni6634-208 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACT—ATAACTGTATTCACTTTAAAACCGCCATTGAAACCTTCTTTTTACCCACACTTTTTCCTCTTTCCCAAGGAAAAAAAAAA- : 107

AABB-Bj7154-208 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACT--ATAACTGTATTCACTTTAAAACCGCCATTGAA?.CCTTCTt!t'{'TACC^ACACTTTTTCCTCTTTCCCAAGGAAAAAAAAAA- : 107

BBCC-Bc3950-208 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACT—ATAACTGTATTCACCTYAAAACCGCCATTQAAGCCTTC.TTXXTACCCACACTTTTTCCTCrTTCCCAAGGAAAAAAAAAA- : 107

BB-Bni6620-212 GAAACCGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGCGATGATGATGATGATGATGGCGGCGGAGCAAGTCGAGACTGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT : 212

AABB-Bj4594-210 GAAACCGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT—GCGATGATGATGATGATGATGGCGGCGGAGCAAGTCGAGACCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT : 210

BBCC-Bc3950-2ID GAAACCGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT—GCGATGATGATGATGATGATGGCGGCGGAGCAAGTCGAGACCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT ; 210

ВB-Bni6634-208 GAAACCGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT----GCGATGATGATGATGATGATGGCGGCGGAGCAAGTCGAGACCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT : 208

AABB-Bj7154-208 GAAACCGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT----GCGATGATGATGATGATGATGGCGGCGGAGCAAGTCGAGACCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT ; 208

BBCC-Bc3950-208 GAAACCGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT----GCGATGATGATGATGATGATGGCGGCGGAGCAAGTCGAGACCGTGGACAACGGCSAGATCATCGATTCACT : 208

Микросателлитные фрагменты, специфичные для генома А

AA-Br350-176 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACTCTATMCTGTATTCACCTTAAAACCGCCATT-~-~——-"-SACACTT--TCCTCTTTCCCAAG-MAAAA----Т : 85

АА-ВГ350-172 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACTCTATAACTGTATTCACCTTAAAACCGCCATT---------------------ACACTT--TCCTCTTTCCCAAG-AAAAAA----Т ; 85

AABB-8j7154-172 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACTCTATAACTGTATTCACCTTAAAACCGCCATT—-----------------АСАСТТ—TCCTCTTTCCCAAG-AAAAAA----Т : 85

AACC-BnaVikros-172 TTCCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACTCTATAACTGTATTCACCTTAAAACCGCCATT-----—-----——-ACACTT—TCCTCTTTCCCAAG-AAAAAA----Т : 85

АА-ВГ350-168 AAGCTTGTTGCTTTTCAACGTCACACTCTATAACTGTATTCACCTTAAAACCGCCATT—-—----¿АСАСТТ—TCCTCTTTCCCAAG-AAAAAA----Т : 85

АА-Вг350-176 САААССЛТСТСТСТСТСТСТСССТСТСТ------GCGAT—TGATGATGATG-

АА-Вг350-172 CAAACCATCTCTCTCTCTCTCTCT----------GCGAT—TGATGATGATG-

AABB-BJ7154-172 САААССДТСТСТСТСТСТСТСТСТ----------GCGAT—TGATGATGATG-

AACC-BnaVikros-172 CAAACCATCTCTCTCTCTCTCTCT----------GCGAT—TGATGATGATG-

AA-Br350-168 САААССДТСТСТСТСТСТСТ--------------GCGAT—TGATGATGATG-

GCGGCGCAAGTGGAGATCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT : 176

GCGGCGCAAGTGGAGATCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT : 172

■GCGGCGCAAGTGGAGATCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT : 172

GCGGCGCAAGTGGAGATCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT : 168

Микросателлитные фрагменты, специфичные для генома С

СС-Воса192-160 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCA--------CACTGTATTCACCTTAAAACCGCCATT--——^'-.-^—^ГГ-'-дсАСТТ—TCCTCTTTCCCAAG-AAAAAA----Т : 82

AACC-BnaVikros-160 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCA--------CACTGTATTCACCTTAATACCGCCATT—------------------ACACTT—TCCTCTTTCCCAAG-AAAAAA----Т : 82

BBCC-Bc3950-I60 AGCCTTGTTGCTTTTCAACGTCA--------CACTGTATTCACCTTAAAACCGCCATT^—----—————^АСАСТТ—TCCTCTTTCCCAAG-AAAAAA----Т : 82

СС-8оса192-160 CAAACCATCTCCCTCTCTCT--------------GCGAT—TGATGATGATG------GCGGCGCAAGTGGAGATCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT : 160

AACC-BnaVikros-160 CAAACCATCTCGCTCTCTCT--------------GCGAT—TGATGATGATG------GCGGCGCAAGTGGAGATCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT : 160

BBCC-Bc3950-160 CAAACCATCTCGCTCTCTCT--------------GCGAT—TGATGATGATG------GCGGCGCAAGTGGAGATCGTGGACAACGGCGAGATCATCGATTCACT : 160

Рис. 5. Первичная структура A-, В- и С-специфичных фрагментов локуса NaI2-A02, интрогрессируемых в тетраплоидные виды. Вариабельные микросателлитные области - Ak, (CT)™, (GAT)„ - подчеркнуты. Однонуклеотидные замены в последовательностях А-, и С-геномов выделены жирным шрифтом и курсивом. Последовательности праймеров выделены жирным шрифтом. Последовательность отмеченную цветом, планируется использовать в качестве прямого праймера для идентификации В- специфичных фрагментов.

4. Создание SCAR-маркера для анализа интрогрессии В-генома.

На основе инсерции длиной ] 8 нуклеотидных пар, выявленной в последовательностях

В-геном-специфичных микросателлитных фрагментов локуса Nal2-A02 (рис. 5), был

сконструирован прямой праймер Fb для специфичной амплификации фрагментов,

характерных для генома В. Праймер Fb в сочетании с обратным праймером Nal2-A02:

FB GAAACCTTCTTTTTACCCAC—3^ R 5/-AGTGAATCGATGATCTCGCC-3/

использовали для анализа представителей шести видов Brassica и межвидового гибрида

В. xcomposita. Полученная электрофореграмма (рис. 6) свидетельствует о специфичности

праймеров по отношению к B-геному. ПЦР-фрагменты соответствующей длины были

выявлены только в образцах, содержащих геном В: В. nigra (ВВ), В. juncea (ААВВ),

В. carinata (ВВСС) и аллогексаплоиде В. *composita (ААВВСС).

АА ВВ СС ААВВ ААСС ВВСС

В. rapa В. nigra В. oleracea В. juncea В. napus В. carinata

1 Т7Т S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Рис. б. Электрофореграмма разделения в 2 %-ном агарозном геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с праймерами FB и R (Nal2-A02). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений В. rapa: Вг114 (2), Вг107 (3), Вг350 (4), В. nigra: Bni6628 (5), Bn¡6620 (6), Bni6634 (7), В. oleráceo-. ВоЬб99 (8), Boc2218 (9), Воса192 (10), В. juncea: Bj4J88 (II), Bj4594 (12), Bj7154 (13), B. napus: Bnal-02 (14), BnaVikros (15), BnaKhanna (16), B. carinata: Bc3950 (17), Bc4035 (18), Bc4530 (19), B.xcomposita (20). Дорожки 1, 22 - маркер молекулярной массы pUC18/MspI. Дорожка 21 - отрицательный контроль. Стрелкой отмечены фрагменты, специфичные для генома В.

В результате анализа первичной структуры были определены точные длины исследуемых фрагментов: 156 п.н. (Bni6620), 154 п.н. (Bj4594, Вс3950) и 152 п.н. (Bni6634, Bj7154 и Вс3950). Было установлено, что первичная структура полученных исследуемых фрагментов идентична соответствующим участкам полноразмерных микросателлитных фрагментов, выявленных в результате амплификации с парой праймеров Nal2-A02. Полиморфизм длин выявленных аллелей определяется количеством повторов СТ. Таким образом, эти фрагменты представляют серию аллелей, характерных для генома В. Необходимо подчеркнуть, что полиморфизм этих фрагментов генома не связан с видовой специфичностью Brassica. Серия аллелей, выявленная в геномах видов В. nigra, В. juncea и В. carinata, зарегистрирована в Генбанке под номерами DQ465979 - DQ465984.

Для определения хромосомной локализации полученного маркера B-генома в лаборатории ДНК-маркеров ВНИИСБ был проведен анализ серии генотипов В. napus с

добавленными хромосомами В. nigra [Jahier et al, 1989]. Анализ дополненных линий В. napus - В. nigra показал, что этот маркер локализован на хромосоме III генома В.

Таким образом, нами был идентифицирован амплифицируемый В-геном-специфичный участок с известной последовательностью (SCAR- Sequence Characterized Amplified Region), на основе которого возможно создание тест-системы для первичного мониторинга интрогрессии генетического материала при межвидовых скрещиваниях. В настоящее время B-геном широко используется в качестве донора генов устойчивости к различным болезням, засухе и холоду [Plieske, Struss, 2001, Saal et а!., 2005 Yu et al., 2005]. Применение прямого теста на интрогрессию B-генома позволит значительно ускорить селекционный процесс. Данный SCAR-маркер также может быть полезен в исследовании филогенетических взаимосвязей в семействе Brassicaceae. Согласно цитогенетическим исследованиям В. nigra филогенетически ближе видам Sinapis, чем диплоидным геномам А и С Brassica [Warwik et al., 2005]. Использование SCAR-маркера позволит получить новые сведения об эволюции геномов Brassica.

5. Практическое применение метода мнкросателлитиого анализа в селекции. 5.1. Различение близкородственных сортов рапса (В. napus

Важное значение для селекции представляет различение близкородственных сортов растений. ВНИПТИ рапса были предоставлены 12 высокопродуктивных сортов ярового рапса (В. napus), обладающих сходными морфологическими характеристиками, но различающихся по таким признакам как урожайность, содержание масла, эруковой кислоты и глкжозинолятов, устойчивость к фузариозу, полеганию и осыпанию. Поскольку проявление количественных признаков определяется сложным взаимодействием многих генов и в значительной степени зависит от условий выращивания растений, различение и идентификация сортов по фенотипу представляются ненадежными. В связи с этим важное методологическое и практическое значение представляет исследование возможности применения технологии микросателлитного анализа для различения близкородственных сортов на генетическом уровне.

В результате микросателлитного анализа по шести парам праймеров были получены индивидуальные генетические профили, позволяющие надежно различать сорта рапса, в том числе близкородственные: Аргумент (Sr-l 50-87*Гло6аль), Рубеж (В. napus*B. гара: Глобальх\¥\¥1727), Визит (ГлобальхМонета) и Ратник [Fl (Глобаль*Зг-150-87) * Fl (Sr-l 10-87*Глобаль)], в селекции которых в качестве одной из родительских форм использовали сорт Глобаль (рис. 8). Полученные генетические профили в перспективе могут быть использованы для идентификации, генетической паспортизации и сертификации сортов.

200 п. п.

150 II. п.

100 п. и.

Рис. 8. Электрофореграммы разделения в 8 %-ном полиакриламидном геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парами праймеров Ха 12-А02 (А), 0112-А04 (Б), ВИМЯ-ОЗб (В), В1Ш8-043 (Г), ЫаЮ-ЕЮ9 (Д), N¡2^02 (Е). В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК сортов рапса (В. парш): Аргумент (2), Визит (3), Лира (4), Мадригал (5), Ратник (6), Ритм (7), Рубеж (8), Форум (9),Фрегат (10), Эввин (11), Топаз (12), №1 (13), Хана (14). Дорожки 1 и 15 - маркер молекулярной массы

250 п. н.

200 п. н.

150 н. н.

5.2. Исследование интрогрессии аллельных Форм микпосателлитных локусов листовых овощных сортов В. rana в их гибриды.

Для генотипирования листовых овощных сортов В. rapa (подвидов pekinensis, narinosa, chinensis и nipposinicá) были использованы праймеры, выявляющие высокий полиморфизм в пределах генома A: BRMS-036, BRMS-042-2, BRMS-043 и BRMS-050. Совокупный генетический профиль, полученный в результате анализа вышеперечисленных локусов, позволил надежно различать и идентифицировать подвиды и сорта В. rapa.

В результате амплификации с парой праймеров BRMS-050 был выявлен значительный полиморфизм длин микросателлитов, позволяющий различать подвиды и сорта В. rapa. В связи с этим особый интерес представляло исследование характера

наследования аллельных форм микросателлитного локуса BRMS-050 в поколении гибридов F1 исследуемых сортов. В результате микросателлитного анализа у каждого исследуемого гибрида были выявлены аллели обеих родительских форм (рис. 9).

) II III IV V VI Vil VIII IX X

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ТО II 12 13 14 15 1617 18 19 211 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3031 323334

200 п. п.

ISO п. II.

Рис. 9. Электрофореграмма разделения в 8 %-ном полиакриламидном геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парой праймеров BRMS-050. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК подвидов В. rapa pekinensis: Osaka Market (2, 6, 10, 13), Nakate Shirona (17, 20, 25, 31); B. rapa narinosa: Syao-bai-talsai (16, 23), Ta-gu-tsai (5, 28); B. rapa chinensis: Ching Pang Ju-Tsai (19), Nicanme Tai-sai (12, 22, 26); B. rapa nipposinica: Sensudzi Kio Minina (9, 30, 33) и их гибридов. Дорожки 1, 34 - маркер молекулярной массы. Фигурными скобками выделены скрещиваемые родительские формы (выделены жирным шрифтом) и их гибриды.

Для подтверждения интрогрессии генетического материала из родительских форм в гибриды нами было проведено определение нуклеотидных последовательностей микросателлитных фрагментов, выявленных у сортов Osaka Market (п/в pekinesis) и Sensudzi Kio Mizuna (п/в nipposinika) и их реципрокных гибридов (рис. 9, группа II). Анализ исследуемых фрагментов показал, что первичная структура фрагментов ДНК гибридов идентична первичной структуре фрагментов соответствующей длины родительских форм Osaka Market и Sensudzi Kio Mizuna, что свидетельствуют об интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды. Исследуемые микросателлитные локусы представляют собой простые динуклеотидные повторы (СТ)„, числом которых определяется различие длин аллелей.

Однако следует отметить, что не все выявленные у родительских форм аллели наследовались в гибридах (рис. 9, группы I, II, III, V, VI). В некоторых случаях у гибридов были выявлены аллели, отсутствующие, у обеих родительских форм (рис. 9, группа, X).

Для более детального исследования передачи аллелей по наследству были получены и проанализарованы образцы ДНК индивидуальных растений Osaka Market и Sensudzi Kio Mizuna и их реципрокных гибридов (рис. 10). Оказалось, что некоторые родительские формы являются генетически неоднородными. В смеси ДНК растений Osaka Market были выявлены два фрагмента (дорожка 4), тогда как генотипы индивидуальных растений Osaka Market могут быть представлены как двумя (дорожка 2), так и одним аллелем (дорожка 3). Генотипы индивидуальных растений Sensudzi Kio Mizuna представлены одним аллелем (дорожки 9, 10).

Однако в смеси ДНК растений ЗетисЫ Юо МЬипа помимо аллеля 174 п.н. в следовых количествах присутствуют дополнительные аллели (дорожка 11), что свидетельствует о генетической неоднородности растений БетиЛ:! Кю Шгипа. Предпочтительная амплификация аллеля 174 п.н. предположительно может быть связана с повышенной концентрацией этого аллеля в смеси ДНК.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12

*****] 200 п. н.

178-

Рис. 10. Электрофореграмма разделения в 8 %-ном полиакриламидном геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парой праймеров BRMS-050. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК сортов Osaka Market (2 и 3 - индивидуальные растения, 4 - смешанный образец) и Sensudzi Kio Mizuna (9 и 10 - индивидуальные растения, И - смешанный образец) и их гибридов: Osaka Market^Sensudzi Kio Mizuna (5 и 6), Sensudzi Kio Mizuna*Osaka Market (7 и 8). Дорожки 1, 12 - маркер молекулярной массы. Стрелками указаны кнтрогрессируемые фрагменты. 178, 174, 166 и 162 - молекулярная масса фрагментов, п. н.

Неоднородность родительского материала является причиной формирования различных генотипов реципрокных гибридов сортов Osaka Market и Sensudzi Kio Mizuna вопреки ожидаемому единообразию первого поколения гибридов (рис. 10, дорожки 5 - 8). Неоднородностью скрещиваемого материала можно объяснить появление у гибридов Fl аллелей, отсутствующих у родительских форм, например, появление аллеля 180 п.н. у гибрида 9 Osaka Market*(¡Sensudzi Kio Mizuna (дорожка 5). Для дальнейшего изучения характера наследования аллелей микросателлитного локуса необходим тщательный анализ и последующий отбор генетически однородного родительского материала для скрещивания.

Таким образом, технология генотипирования на основе микросателлитного анализа может являться мощным инструментом для селекционеров, который позволит отбирать генетически однородный материал для скрещиваний и контролировать селекционную работу, что представляет особую важность для селекции перекрестно опыляемых растений, таких как Brassica.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Описанная в данной работе технология генотипирования на основе микросателлитного анализа позволяет надежно различать рода, виды, сорта, выявлять генетическую неоднородность селекционного материала и осуществлять контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в межродовые, межвидовые и

сортовые гибриды. Данная технология предназначена для решения таких задач, как поддержание генетических коллекций, анализ родословных, подбор родительских пар для скрещивания, регистрация новых сортов, контроль генетической подлинности сортов и защита авторских прав селекционеров, а также для мониторинга трансгенов и филогенетических исследований.

Предлагаемая технология микросателлитного анализа видов Brassica разработана на основе использования современных методологических подходов, таких как выделение ДНК на силикагелевом сорбенте, ПЦР с «горячим стартом», автоматическая детекция ПЦР-продуктов, которые позволяют значительно ускорить скрининг большого числа растительных образцов и повысить воспроизводимость результатов. В результате проведенной работы нами был отобран ряд информативных микросателлитных локусов для надежного различения растений Brassica и оптимизированы условия их амплификации.

По результатам данной работы были подготовлены методические рекомендации для специалистов-биотехнологов, сельскохозяйственных биотехнологических и селекционных центров, научно-исследовательских институтов.

ВЫВОДЫ

1. Разработана универсальная технология генотипирования культурных и дикорастущих растений рода Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов. По результатам анализа 98 генотипов с помощью 40 пар праймеров предложен оптимальный набор из 18 пар праймеров для генотипирования растений рода Brassica.

2. Показано, что разработанная технология микросателлитного анализа позволяет различать и идентифицировать растения рода Brassica, составляющие треугольник U, и представителей других родов семейства Brassicaceae (Sinapis, Raphanus, Camelina) на родовом, видовом и внутривидовом уровне. Предложенная технология позволяет производить типирование отдельных сортов рапса (В. napus) и листовой овощной капусты (В. rapa).

3. Результаты микросателлитного анализа шести исследованных видов В. rapa, В. nigra, В. oleráceo, В. juncea, В. napus и В. carinóla полностью соответствуют их ботанической и цитогенетической классификации и могут быть использованы для решения задач молекулярной систематики представителей семейства Brassicaceae.

4. Впервые показано, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях. С помощью анализа нуклеотидных последовательностей микросателлитных локусов показана

интрогрессия генетического материала, специфичного для геномов А, В и С, в аллотетраплоидные виды Brassica, а также интрогрессия генетического материала сортов Osaka Market и Sensudzi Kio Mizuna вида В. гара в их реципрокные гибриды.

5. Анализом первичной структуры микросателлитных локусов BRMS-042 и Nal2-A02 впервые установлено, что полиморфизм между геномами А, В и С определяется числом микросателлитных повторов и инсерциями/делециями во фланкирующих участках, а полиморфизм внутри геномов определяется исключительно числом микросателлитных повторов.

6. На основе структурных различий, выявленных в результате секвенирования фрагментов микросателлитного локуса Nal2-A02, специфичных для геномов А, В и С, создан локус-специфичный SCAR-маркер генома В Brassica, который может быть использован в селекции для контроля интрогрессии генетического материала, а также для исследования филогенетических взаимосвязей и эволюции видов Brassica.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анискина Ю.В.. Бирюкова В.А., Велишаева U.C., Мартынов В.В., Панкин A.A., Прибылова Т.А., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК - генотипирование растений Brassica и Solanum II Сб. трудов III международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва. 19 октября 2004. С. 119-120.

2. Анискина Ю.В.. Мартынов В.В., Панкин A.A., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. Три метода ДНК генотипирования культурных форм Brassica // Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 14-18 марта 2005. Т. 1. С. 221.

3. Анискина Ю.В.. Шилов И.А., Хавкин Э.Е Использование метода анализа полиморфизма микросателлитов для оценки генетического разнообразия форм Brassica // Материалы всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Суздаль 19-22 мая 2005. С. 319-321.

4. Анискина Ю.В.. Бирюкова В.А., Велишаева U.C., Панкин A.A., Прибылова Т.А., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК - генотипирование растений родов Brassica и Solanum // Сельскохозяйственная биология. 2005. №1. С. 110-119.

5. Анискина Ю.В.. Велишаева Н.С., Шилов И.А., Хавкин Э.Е. Генотипирование пасленовых и крестоцветных растений методом микросателлитного анализа. Методические рекомендации. ВНИИСБ Москва. 2005. 21 С.

6. Анискина Ю.В.. Панкин A.A., Хавкин Э.Е., Шилов И.А. ДНК-маркер хромосомы III генома В Brassica. //Доклады РАСХН. 2006. № 4. С. 15-16.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анискина, Юлия Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Литературный обзор.

1.1. Род Brassica как объект исследования.

1.1.1. Систематика рода Brassica.

1.1.2. Эволюция и геномные взаимосвязи видов Brassica.

1.1.3. Селекция и регистрация культурных форм Brassica.

1.1.3.1. Селекция хозяйственно-ценных признаков.

1.1.3.2. Селекция культур Brassica, устойчивых к болезням и неблагоприятным условиям среды.

1.1.3.3. Регистрация сортов.

1.2. Молекулярные маркеры в генотипировании растений рода Brassica.

1.2.1. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP-маркеры).

1.2.2. Произвольно амплифицируемые ДНК-маркеры (RAPD-маркеры).

1.2.3. Анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP-маркеры).

1.2.4. Полиморфизм простых повторяющихся последовательностей

SSR-маркеры).

1.2.5.11олиморфизм межмикросателлитных последовательностей

ISSR-маркеры).

1.2.6. Полиморфизм селективно амплифицируемых микросателлитных локусов (ЙАМРЬ-маркеры).

1.2.7. Амплифицируемые маркеры с известной нуклеотидной последовательностью (8ТБ и БСАЯ-маркеры).

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы и реактивы.

2.2. Приборы и методы.

2.3. Общие методики.

2.3.1. Выращивание растений.

2.3.2. Выделение геномной растительной ДНК СТАВ-методом.

2.3.3. Выделение геномной растительной ДНК на силикагелевомсорбенте.

2.3.4. Выделение плазмидной ДНК.

2.3.5. Полимеразная цепная реакция.

2.3.6. Электрофорез в агарозном геле.

2.3.7. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.3.8. Визуализация ДНК в полиакриламидном геле с помощью нитрата серебра.

2.3.9. Анализ флуоресцентно-меченных ПЦР-фрагментов.

2.3.10. Секвенирование ДНК-матриц по Сэнгеру.

2.3.11. Приютовление маркера длины риС18/МБр1.

2.3.12. Проведение ферментативных реакций.

2.3.13. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК.

2.3.14. Трансформация и анализ клонов.

2.3.15. Анализ клонов с помощью ПЦР-амплификации.

2.3.16. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей микросателлитных фрагментов.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследование генетического разнообразия растений рода Brassica.

3.1.1. Выбор праймеров для анализа полиморфизма микросателлитных локусов.

3.1.2. Микросателлитный анализ видов Вгаччка и родственных представителей семейства Brassicaceae.

3.1.3. Оценка i енетического полиморфизма видов и разновидностей Brassica.

3.2. Исследование интрогрессии генетического материала геномов А, В и С

Brassica в межвидовые и межродовые гибриды.

3.3. Исследование природы полиморфизма микросателлитных локусов геномов А,

В и С Brassica.

3.4. Создание SCAR-маркера для анализа интрогрессии B-генома Brassica.

3.5. Практическое применение метода микросателлитного анализа в селекции.

3.5.1. Генотипирование близкородственных сортов рапса (В парт).

3.5.2. Исследование интрогрессии аллельных форм микросателлитных локусов листовых овощных сортов В rapa в их гибриды.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технология генотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов"

Семейство Brassicaceae (Капустные) насчитывает 350 родов и около 3500 видов Экономическую ценность семейства главным образом определяет род Brassica (Капуста). Естественный отбор в пределах рода Brassica привел к формированию большою морфологического разнообразия, на основе которого было создано многообразие выращиваемых по всему миру ценных масличных, овощных, пряных, кормовых и декоративных культур. Большинство культурных форм Brassica произошло от шести основных видов: В napus (масличный рапс, брюква), В rapa (восточноазиатские капусты, сурепица, рена и турнепс), В. oleráceo (кочанная, брюссельская и цветная капуста, брокколи, кольраби), В juncea (горчица сарептская) В carinala (юрчица эфиопская) и В nigra (горчица черная). Фило1енетические взаимосвязи между этими видами хорошо описаны моделью так называемого "U-треугольника". Согласно этой модели в результате естественной гибридизации трех диплоидных видов В rapa, В nigra, В oleracea, геномы которых условно обозначены как АА, ВВ и СС, возникли аллотетраплоидные формы В. juncea (ААВВ), В napus (ААСС), В carinala (ВВСС). Таким образом, род Brassica представляет собой удобную модель для исследования 1енетического разнообразия и интрогрессии генетического материала в результате межвидовой и межродовой гибридизации.

Исследование генетического разнообразия культурных и дикорастущих видов Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae представляет большое научное значение для выяснения филогенетических взаимосвязей и эволюции 1еномов, уточнения границ таксонов и практическое значение для выявления потенциальных источников новых культур и доноров важных агрономических признаков, которые могут быть включены в различные селекционные программы.

Важной сферой описания и использования растительных генетических ресурсов является регистрация растительных форм. Новые сорта культурных растений должны пройти ряд тестов на отличимость, однородность и стабильность (DUS - Distinctness, Uniformity, Stability), которые составляют основу защиты интеллектуальной собственности селекционеров. Современная система диагностирования, основанная на ряде стандартизованных морфологических характеристик, требует длительных полевых испытаний. Кроме того, в связи с широким применением в селекции новейших биотехнолошй растительные коллекции значительно пополнились ¡ибридными сортами и ¡енетически модифицированными формами, которые невозможно надежно различать и идентифицировать, используя ограниченное число морфологических характеристик. Для быстрого и надежного различения и идентификации растительных форм возникла необходимость анализа полиморфизма на генетическом уровне.

Наиболее перспективным подходом для исследования i енетического полиморфизма представляется использование методов молекулярною анализа, основанных на анализе полиморфизма ДНК (RFLP, RAPD, AFLP, SSR и т.п.), позволяющих получить индивидуальную характеристику отдельного генотипа - ДНК-профиль. Применение ДНК-технологий открывает новые возможности для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как поддержание генетических коллекций, подбор родительских пар при скрещивании, составление родословных, контроль интрогрессии генетического материала, паспортизация и сертификация сортов, защита интеллектуальной собственности, картирование и клонирование генов хозяйственно ценных признаков, а также в исследовании организации и эволюции геномов, в мониторинге трансгенов.

Существующие методы анализа геномов отличаются по сложности, надежности и объему получаемой информации. Для надежного различения и идентификации генотипов, исследования фило1енетических взаимосвязей и интрогрессии генетического материала, наиболее перспективным является метод анализа полиморфизма микросателлитов, позволяющий получать воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома.

Целью данной диссертационной работы являлась разработка технологии i епотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе микросателлитного анализа.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Анискина, Юлия Владимировна

выводы

1. Разработана универсальная технология генотипирования культурных и дикорастущих растений рода Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов. По результатам анализа 98 генотипов с помощью 40 пар ираймеров предложен оптимальный набор из 18 пар ираймеров для генотипирования растений рода Brassica.

2. Показано, что разработанная технология микросателлитною анализа позволяет различать и идентифицировать растения рода Brassica, составляющие треугольник U, и представителей других родов семейства Brassicaceae (Sinapis, Raphanus, Camelina) на родовом, видовом и внутривидовом уровне. Предложенная технология позволяет производить тонирование отдельных сортов рапса (В napus) и листовой овощной капусты (В. rapa).

3. Результаты микросателлитною анализа шести исследованных видов В rapa, В nigra, В. oleracea, В. juncea, В napus и В car mata полностью соответствуют их ботанической и цитогенетической классификации и могут быть использованы для решения задач молекулярной систематики представителей семейства Brassicaceae

4. Впервые показано, что предлагаемая технология микросателлитною анализа позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях. С помощью анализа нуклеотидных последовательностей микросателлитных локусов показана интрогрессия генетического материала, специфичною для геномов А, В и С, в аллотетраплоидные виды Brassica, а также интрофессия генетического материала сортов Osaka Market и Sensudzi Kio Mizuna вида В rapa в их реципрокные гибриды.

Автор выражает искреннюю благодарность за помощь и ценные советы при проведении и обсуждении данной работы проф., д.б.н. Хавкину Эмилю Ефимовичу, к.б.н. Лунину Владимиру Глебовичу, д.б.н. Карягиной Анне Станиславовне, к.б.н. Ворониной Ольге Львовне, к.б.н. Хорькову Нвгению Ивановичу и всем сотрудникам группы Анализа геномов, лаборатории Молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций и лаборатории ДНК маркеров растений Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнолог ии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Описанная в данной работе технология генотипирования на основе микросателлитного анализа позволяет надежно различать рода, виды, copia, выявлять генетическую неоднородность селекционного материала и осуществлять контроль интрофессии генетического материала от родительских форм в межродовые, межвидовые и сортовые гибриды. Данная техноло1 ия предназначена для решения таких задач, как поддержание 1енетических коллекций, анализ родословных, подбор родительских пар для скрещивания, регистрация новых сортов, контроль генетической подлинности сортов и защита авторских прав селекционеров, а также для мониторинг трансгенов и филогенетических исследований.

По результатам данной работы были подютовлены методические рекомендации для специалистов-биотехнолоюв, сельскохозяйственных биотехнологических и селекционных центров, научно-исследовательских институтов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анискина, Юлия Владимировна, Москва

1. Артемьева A.M., Фарбер СЛ. Листовые овощные растения Brassica rapa L // Скрининг генетических ресурсов овощных и бахчевых растений для целей селекции (труды по прикладной ботанике, генетике и селекции). 1999. Т. 157. С. 55-65.

2. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи. М: Колос. 1971.

3. Закон РФ «О селекционных достижениях» от 6 августа 1993 г., №5606-1.

4. Никифоров О.А. Селекция ярового рапса в северо-западном регионе России // сб. статей Рапс культура XXI века: аспекты использования на продовольственные, кормовые и энергетические цели. 2005. С. 47-49.

5. Ahmad П., Hasnain S., Khan A. Evolution of genomes and genome relationship among the rapeseed and mustard // Biotechnology. 2002. V. 1. N. 2-4. P. 78-87.

6. Allender C.J., Soengas P., Hand P., King G.J. (unpubl.) Selection and screening of Brassica SSR markers (http7/www.brassica.info/ssr/SSRinfo htm).

7. Anand I.J., Mishra P.K. and Angadi S.P. Mechanism of male sterility in Brassica juncea Identification and inheritance of pollen fertility restoration // Cruciferae Newsiett. 1986. №. 11. P. 51-53.

8. Ansan-Melayah D. Etude genetique de deux interactions race-cultivar chez le pathosysteme Leplosphaeria maculansl Brassica napus. Ph. D. Thesis, Universite de

9. Paris-Sud XI, Paris, France. 1996. P. 161.

10. Axelsson T., Bowman C.M., Sharpe A., Lydiate D. and Lagercrant/ U. Amphidiploid Brassica juncea contains conserved progenitor genomes // Genome. 2000. V. 43. P. 679-688.

11. Axelsson T., Shavorskaya 0., Lagercrantz U. Multiple flowering time QTLs within several Brassica species could be the result of duplicated copies of one ancestral gene // Genome. 2001. V. 44. P. 856-864.

12. Barth S., Melchinger A. E. and Lübberstedt T. Genetic diversity in Arabidopsis thaliana L. Heynh. investigated by cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) and inter-simple sequence repeat (ISSR) markers // Molecular Ecology. 2002. V.U. P.495-505.

13. Baswana K.S., Rastogi K.B. and Sharma P.P. Inheritance of stalk rot resistance in cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis L.) // Euphytica. 1991. V. 57. P. 93-96.

14. J Bell C.J., Ecker J.R. Assignment of 30 microsatellite 1 linkage map of Arabidopsis // Genomics. 1994. V. 19. 137-144.

15. Bett K.E., Lydiate D.J. Genetic analysis and genome mapping in Raphanus // Genome. 2003. V. 46. №. 3. P. 423-430.

16. Bohman S., Wang M. and Dixelius C. Arabidopsis thaliana-derived resistance against Leptosphaeria maculans in a Brassica napus genomic background // Theor. Appl. Genet. 2002. V. 105. P. 498-504.

17. Boivin K., Acarkan A., Mbulu R.-S., Clarenz O. and Schmidt R. The Arabidopsis genome sequence as a tool for genome analysis in Brassicaceae. A comparison of the Arabidopsis and Capsella rubella genomes // Plant Physiology. 2004. V. 135. P. 735— 744.

18. Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M., Jansen C. L., Wertheim-van Dillen P. M.

19. E., and Van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids //Journal of Clinical Microbiology. 1990. V. 28. №. 3. P. 495-503.

20. Borchers E.A. Characteristics of a male-sterile mutant in purple cauliflower (Brassica oleraceae L.) II Proc. Am. Soc. Hortic. Sci. 1966. V. 88. P. 406-410.

21. Botstein D., R.L. White M., Skolnick and Davis R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms // Am. J. Human Genet. 1980. V.32. P. 314-331.

22. Briggs W. H. and Goldman I. L. Genetic Variation and Selection Response in Model Breeding Populations of Brassica rapa Following a Diversity Bottleneck // Genetics. 2006. V. 172. P. 457—465.

23. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gressho P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers // Biotechnology.(N Y). 1991. V. 9. № 6. P. 553-557.

24. Cardie L., Ramsay L., Milbourne D., Macaulay M., Marshall D. and Waugh R. Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants // Genetics. 2000. V. 156. P. 847-854.

25. Chambers G.K., MacAvoy E.S. Microsatellites: consensus and controversy // Comparative Biochemistry and Physiology. 2000. Part B. V. 126. P. 455^76.

26. Chang C., Bowman J.L., Dejohn A.W., Landert E. S and Meyerowitz E. M. Restriction fragment length polymorphism linkage map for Arabidopsis thaliana II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. V. 85 P. 6856-6860.

27. Charters Y.M., Robertson A., Wilkinson M. J., Ramsay G. PCR analysis of oilseed rape cultivars (Brassica tiapus L. ssp. oleifera) using 5'-anchored simple sequence repeat (SSR) primers. Theor. Appl. Genet. 1996. V. 92. P. 442-447.

28. Chevre A.M., This P., Eber F., Deschamps M., Renard M., Delseny M., Quiros C.F.

29. Characterization of disomic addition lines Brassica napus-Brassica nigra by isozyme, fatty acid, and RFLP markers // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 81. P. 43-49.

30. Chiang M.S. and Crete R. Inheritance of clubroot resistance in cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata L.) // Can. J. Genet. Cytol. 1970. V. 12. P. 253-256.

31. Chuang H.-Y., Tsao S.-J., Lin J.-N., Chen K.-S., Liou T.-D., Chung M.-C. and Yang Y.-W. Genetic diversity and relationship of non-heading Chinese cabbage in Taiwan // Botanical Bulletin of Academia Sinica. 2004. V. 45. P. 331-337.

32. Coelho P.S., Monteiro A. Inheritance of downy mildew resistance in mature broccoli plants // Euphytica. 2003. V. 131. P. 65-69.

33. Cooke R.J. and Reeves J.C. Plant genetic resources and molecular markers: variety registration in a new era // Plant Genetic Resources. 2003.V. 1. № 2-3. P. 81-87.

34. Crute I.R., Phelps K., Barnes A., Buc/acki S.T. and Crisp P. The relationship between genotypes of three Brassica species and collections of Plasmodiophora brassicae II. Plant Pathol. 1983. V. 32. P. 405-420.

35. Delwiche P.A. and Williams P.H. Thirteen marker genes in Brassica nigra II J. Heredity. 1981. V. 72. P. 289-290.

36. Dickson M.H. A temperature male sterile gene in broccoli, Brassica oleracea L. var. Italica // J. Am. Soc. Hortic. Sei. 1970. V. 95. P. 13-14.

37. Divaret 1., Margale E., Thomas H.G. RAPD markers on seed bulks efficiently assess the genetic diversity of a Brassica oleracea L. collection // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 98. P. 1029-1035.

38. Fan Z., Rimmer S.R. and Stefansson B.R. Inheritance of resistance to Albugo Candida in rape {Brassica napus L.) // Can. J. Genet. Cytol. 1983. V. 25.P. 420-424.

39. Fang G.H. and McVetty P.B.E. Inheritance of male fertility restoration and allelism of restorer genes for the Polima cytoplasmic male sterility system in oilseed rape // Genome. 1989. V. 32. P. 1044-1047.

40. Ferreira M.E., Williams P.H. and Osborn T.C. RFLP mapping of Brassica napus using doubled haploid lines // Theor. Appl. Genet. 1994. V. 89. P. 615-621.

41. Gale M.D., Devos K.M. Plant compartive genetics after 10 years // Science. 1998. V. 282. P. 656-659.47J Gómez-Campo C. Morphology and morphotaxonomy of the tribe Brassiceae. // Brassica crops and wild allies. 1980. P. 3-31.

42. Gómez-Campo C., Tortosa M.E., Tewari I. and Tewari J.P. Epicuticular wax columns in cultivated Brassica species and in their close wild relatives // Ann. Bot. 1999. V. 83. P. 515-519.

43. Gootlieb M., Chavko M. Silver staining of native and denatured eukaryotic DNA in agarose gels. // Analitical Biochemistry. 1987. V. 165. P. 33-37.

44. Grandclement C. and Thomas G. Inheritance of two new sources of resistance to Plamodiophora brassicae W. in Brassica oleráceo L. // Cruciferae Newslett. 1996. V. 18. P. 110-111.

45. Hall A.E., Fiebig A., Preuss D. Beyond the arabidopsis genome: opportunities for comparative genomics // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 1439-1447.

46. Hansen L.N., Earle E.D. Novel flowering and fatty acid characters in rapid cycling Brassica napus L. synthesized by protoplast fusion // Plant. Cell. Rep. 1994. V. 14. P. 151-156.

47. Hansen L.B., Siegismund H.R., Jorgensen R.B Progressive introgression between Brassica napus (oilseed rape) and B. rapa II Heredity. 2003. V. 91. № 3. P. 276-283.

48. Harberd D. J. Cytotaxonomic studies of Brassica-related genera // The Biology and Chemistry of the Cruciferae. Edited by Vaughan J. G., MacLeod A. J., and Jones B. M. G. Academic Press. NewYork. 1976. P. 47-68.

49. Hasan M., Seyis F., Badani A.G., Pons-Kühnemann J., Friedt W., Liihs W., Snowdon R.J. Analysis of genetic diversity in the Brassica napus L. gene pool using SSR markers // Genetic Resources and Crop Evolution. 2005.

50. Hawk J.A. and Crowder L.V. 'I he inheritance of four mutants in early-flowering Brassica campestris L. H J. Heredity. 1978. V. 69. P. 125-127.

51. Hinata K., Okazaki K. and Nishio T. 1983 Gene analysis of self-incompatibility in Brassica campestris var. Yellow Sarson (a case of recessive epistatic modifier) // Proc. 6th Inter. Rapeseed Conf., Paris, France. V. 1. P. 354-359.

52. Hirai M., Harada T., Kubo N., Tsukada M., Suwabe K., Matsumoto S. A novel locus for clubroot resistance in Brassica rapa and its linkage markers. Theor. Appl. Genet. 2004. V. 108. №4. P. 639-643.

53. Holton T.A. Plant genotyping by analysis of microsatellites // Plant genotyping: The DNA fingerprinting of plants. CABI Publ., Wallingford, UK. 2001. P. 15-27.

54. Hosaka K., Kianian S.F., McGrath J.M., Quiros C.F. (1990) Development and chromosomal localization of genome-specific DNA markers of Brassica and the evolution of amphidiploids and n=9 diploid species // Genome. 1990. V. 33. P. 131142.

55. Hoser-Krauze J. Inheritance of self-compatibility and self-incompatibility in cauliflower Brassica oleracea L. var. bolrytis L. // Cruciferae Newslett. 1981. №. 6. P. 13.

56. Hoser-Krauze J., Lakowska-Ryk E. and Antosik J. The inheritance of resistance of some Brassica oleracea L. cultivars and lines to downy mildew -Peronospora parasitica (Pers. ex Fr.) // J. Appl. Genet. 1995. V. 36. P. 27-33.

57. Howell S.H. Molecular genetics of plant development // Cambridge Univ. Press. 1998.

58. Hu J., Li G., Struss D., Quiros C.F. SCAR and RAPD markers associated with 18-carbon fatty acids in rapseed, Brassica napus II Plant Breeding. 1999. V. 118. P. 145150.

59. James, R.V. and Williams P.H. Clubroot resistance and linkage in Brassica campestris II Phytopathology. 1980. V. 70. P. 776-779.

60. Jean M.,-Brown G. G., Landry B. S. Genetic mapping of nuclear fertility restorer genes for the 'Polima' cytoplasmic male sterility in canola (Brassica napus L.) using DNA markers //Theor. Appl. Genet. 1997. V. 95. P.321-328.

61. Ke L., Sun Y., Liu P., Yang G. Identification of AFLP fragments linked to one recessive genie male sterility (RGMS) in rapeseed (Brassica napus L.) and conversion to SCAR markers for marker-aided selection // Euphytica. 2004. V. 138. P. 163-168.

62. Kianian S.F. and Quiros C.F. Generation of a Brassica oleracea composite RFLP map: Linkage arrangements among various populations and evolutionary implications //Theor. Appl. Genet. 1992. V. 84. P. 544-554.

63. Kidwell, K.K., Osborn T.C. Plant Genomes: Methods for Genetic and Physical Mapping. Kluever Academic Publishers Group. A.H. Dordrecht, The Netherlands. 2001. P. 1-13.

64. Kirk J.T.O. and Huristone C.J. Variation and inheritance of erucic acid content in Brassica juncea HZ. Pflanzenzuchtg. 1983. V. 90. P. 331-338.

65. Kowalski S.P., Lan T.H., Feldmann K.A., Paterson A.H. Comparative mapping of Arabidopsis thaliana and Brassica oleracea chromosomes reveals islands of conserved organization // Genetics. 1994. V. 138. №. 2. P. 499-510.

66. Kresovich S., Williams J.G.K., Me Ferson J.R., Routman E.J., Schaal B.A. Characterization of genetic identities and relationships of Brassica oleracea L. via a random amplified polymorphic DNA assay // Theor. Appl. Genet. 1992. V. 85. P. 190-196.

67. Labra M., Grassi F., Imazio S., Fabio T. D., Citterio S., Sgorbati S., Agradi E. Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate in Brassica napus L. // Chemosphere. 2004. V. 54. P. 1049-1058.

68. Lagercrantz U, E.H., Andersson L. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. Nucleic Acids Res. 1993. V.21.P. 1111-1115.

69. Lagercrantz U. and Lydiate D. RFLP mapping in Brassica nigra indicates differing recombination rates in male and female meiosis // Genome. 1995. V. 38. P. 255-264.

70. Lagercrantz U. and Lydiate D. Comparative genome mapping in Brassica // Genetics. 1996. V. 144. P. 1903-1910.

71. Lan T.H., Paterson A.H. Comparative mapping of quantitative trait loci sculpting the curd of Brassica oleracea II Genetics. 2000a. V. 55. №. 4. P. 1927-1954.

72. Lan T.H., DelMonte T.A., Reischmann K.P., Hyman J., Kowalski S.P., McFerson J., Kresovich S., Paterson A.H. An EST-enriched comparative map of Brassica oleracea and Arabidopsis thaliana II Genome Res. 2000b. V. 10. №. 6. P. 776-788.

73. Laurens F. and Thomas G. Inheritance of resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae Wor.) in kale (Brassica oleracea ssp. acephala II Ilereditas. 1993. V. 119. P.253-262.

74. Lelivelt C.L.C., Lange W. and Dolstra O. Intergeneric crosses for transfer of resistance to the beet cyst nematode from Raphanus sativus to Brassica napus II Euphytica. 1993. V. 68. P. 111-120.

75. Li Y-C., Korol A.B., Fahima T., Nevo E. Microsatellites within genes: structure, function, and evolution // Molecular Biology and Evolution. 2004. V. 21. № 6. P. 9911007.

76. Lionneton E., Ravera S., Sanchez L., Aubert G., Delourme R., Ochatt S. Developmentof an AFLP-based linkage map and localization of QTLs for seed fatty acid content in condiment mustard (Brassica juncea) II Genome. 2002. V. 45. № 6. P. 1203-15.

77. Lionneton E., Aubert G., Ochatt S., Merah O. Genetic analysis of agronomic and quality traits in mustard (Brassica juncea) II Theor. Appl. Genet. 2004. V. 109. № 4. P. 792-9.

78. Love H.K., Rakow G., Raney J.P. and Downey R.K. Genetic control of 2-propenyl and 3-butenyl glucosinolate synthesis in mustard // Can. J. Plant Sci. 1990. V. 70. P. 425-429.

79. Lowe A.J., Jones A.E., Raybould A.F., Trick M., Moule C.J., Edwards K.J. Transferability and genome specificity of a new set of microsatellite primers among Brassica species of the U triangle // Mol. Ecol. Notes. 2002. V. 2. P. 7-11.

80. Lowe A.J., Moule C., Trick M., Edwards K.J. Efficient large-scale development of microsatellites for marker and mapping applications in Brassica crop species // Theor. Appl. Genet. 2004. V 108. P. 1103-1112.

81. Lukens L., Zou F., Lydiate D., Parkin I., Osborn T. Comparison of a Brassica oleracea genetic map with the genome of Arabidopsis thahana II Genetics. 2003. V. 164.№ LP.359-372.

82. Lydiate D., Sharpe A. Aligning genetic maps of Brassica napus using microsatellite markers // Plant animal genomes XI conference January 11-15, Town and country convention center San Diego, CA. 2003.

83. Lysak M.A., Koch M.A., Pecinka A., and Schubert I. Chromosome triplication found across the tribe Brassiceae // Genome Research. 2005. V. 15. P. 516-525.

84. Mahmood T., Ekuere U., Yeh F., Good A.G., Stringam G.R. Molecular mapping of seed aliphatic glucosinolates in Brassica juncea // Genome. 2003a. V. 46. №. 5. P.753-760.

85. Mahmood T., Ekuere U., Yeh F., Good A.G., Stringam G.R. RFLP linkage analysis and mapping genes controlling the fatty acid profile of Brassica juncea using reciprocal DH populations // Theor. Appl. Genet. 2003b. V. 107. №. 2. P. 283-90.

86. Mayerhofer R., Bansal V.K., Thiagarajah M.R., Stringam G.R. and Good A.G. Molecular mapping of resistance to Leptosphaeria maculans in Australian cultivars of Brassica napus II Genome. 1997. V. 40. P. 294-301.

87. Mizushima U., Karyogentic studies of species and genus hybrids in the tribe Brassicae of Cruciferae // Tohoku J. Agric. Res. 1950. V. 1. P. 4-14.

88. Mohammad A., Sikka S.M. and Aziz M.A. Inheritance of seed colour in some oleiferous Brassicae // Indian J. Genet. Plant Breeding. 1942. V. 2. P. 112-127.

89. Morgante M., Vogel J. Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms. U S patent application no. 08/326456. 1994.

90. Nou I.S., Lee II.Y., Kim J.H. and Hinata K. Analyses of morphological characters modifier gene, and S-locus glycoproteins in self-compatible Brassica campestris L. var. Yellow Sarson II Korean J. Genet. 1993. V. 15. P. 241-254.

91. Ogura H. Studies on the new male-sterility in Japanese radish, with special reference to the utilization of this sterility towards the practical raising of hybrid seeds // Mem. Fac. Agric.Kagoshima Univ. 1968. V. 6. P. 39-78.

92. Pang E.C.K, and Halloran G.M. The genetics of adult-plant blackleg (Leplosphaeria maculans) resistance from Brassica juncea in B napus II Theor. Appl. Genet. 1996. V. 92. P. 382-387.

93. Parkin I., Magrath R., Keith D., Sharpe A., Mithen R. and Lydiate D. Genetics of aliphatic glucosinolates. II. Hydroxylation of alkenyl glucosinolates in Brassica napus. Heredity. 1994. V. 72. P. 594-598.

94. Parkin I.A.P., Gulden S.M., Sharpe A.G., Lukens L., Trick M., Osborn T.C. and Lydiate D.J. Segmental Structure of the Brassica napus Genome Based on Comparative Analysis With Arabidopsis lhaliana II Genetics. 2005. V. 171. P. 765— 781.

95. Pearson O.H. Cytoplasmically inherited male sterility characters and flavor components from the species cross Brassica nigra (L.) Koch x B oleracea L. // J. Am. Soc. 1 Iortic. Sci. 1972. V. 97. P. 397-402.

96. Piao Z.Y., Deng Y.Q., Choi S.R., Park Y.J.,-Lim Y.P. SCAR and CAPS mapping of CRb, a gene conferring resistanceto Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp.pekinensis) II Theor. Appl. Genet. 2004. V. 108. P. 1458-1465.

97. Plieske J., Struss D., Robbelen G. Inheritance of resistance derived from the B-genome of Brassica against Phoma lingam in rapeseed and the development of molecular markers //Theor. Appl. Genet. 1998. V. 97. P. 929-936.

98. Plieske J., Struss. D. STS markers linked to Phoma resistance genes of the Brassica B-genome revealed sequence homology between Brassica nigra and Brassica napus. //Theor. Appl. Genet. 2001. V. 102. P. 483^88.

99. Plieske J., Struss D. Microsatellite markers for genome analysis in Brassica. I. Development in Brassica napus and abundance in Brassicaceae species // Theor. Appl. Genet. 2001. V. 102. P. 689-694.

100. Powell W., Machray G.C., Provan J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats // Trends in plant science. 1996. V. 1. № 7. P. 215-222.

101. Pradhan A.K., Gupta V., Mukhopadhyay A., Arumugam N. Sodhi Y.S., Pental D. A high-density linkage map in Brassica juncea (Indian mustard) using AFLP and RFLP markers // Theor. Appl. Genet. 2003. V. 106. № 4. P. 607-614.

102. Prakash S., Hinata K. Taxonomy, cytogenetics and origin of crop Brassicas, a review // Opera Bot. 1980. V. 55. P. 1-57.

103. Quiros C. F., Grellet F., Sadowski J., Suzuki T., Li G. Arabidopsis and Brassica comparative genomics:sequence, structure and gene content in the ABll-RPS2-Ckl chromosomal segment and related regions // Genetics. 2001. V. 157. P. 1321-1330.

104. Rakoc/y-Trojanowska M., Bolibok II. Characteristics and a comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants // Cellular and Molecular Bioligy Letters. 2004. V. 9. P. 221 238.

105. Rana D., van den Boogaart T., O'Neill C.M., Hynes L, Bent E., Macpherson L., Park J.Y., Lim Y.P., Bancroft I. Conservation of the microstructure of genome segments in Brassica napus and its diploid relatives // Plant J. 2004. V. 40. №. 5. P. 725-733.

106. Ripley V.L, Roslinsky V. Identification of an ISSR marker for 2-propenyl glucosinolate content in Drassica juncea L. and conversion to a SCAR marker // Molecular Breeding. 2005. V. 16. P. 57-66.

107. Robbelen, G., Beitrage zur analyse des Brassica genomes (in English: Observations on the analysis of Brassica genomes) // Chromosoma. 1960. V. 11. P. 205-228.

108. Roy J.K., Balyan H.S., Prasad M., Gupta P.K. Use of SAMPL for a study of DNA polymorphism, genetic diversity and possible gene tagging in bread wheat // Theor. Appl. Genet. 2002. P. 465-472.

109. Saal B., Struss D. RGA- and RAPD-derived SCAR markers for a Brassica B-genome introgression conferring resistance to blackleg in oilseed rape //Theor. Appl. Genet. 2005. V. 111.P.281-290.

110. Sambrook J., Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual // Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

111. Sabharwal V.,-Negi M. S., Banga S., Lakshmikumaran S M. Mapping of AFLP markers linked to seed coat colour loci in Brassica juncea (L.) Czern // Theor. Appl. Genet. 2004. V. 109. P. 160-166.

112. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminatinginhibitors // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

113. Sareen P.K. and Kakar S.N. Genetics of incompatibility in brown sarson (Brassica campeslris L.)//Z. Pflanzenzuchtg. 1975. V. 74. 291-297.

114. Schelfhout C.J., Snowdon R., Cowling W.A., Wroth J.M. A PCR based B-genome-specific marker in Brassica species//Theor. Appl. Genet. 2004. V. 109. P. 917-921.

115. Schlotterer, C., Tautz, D. Slippage synthesis of simple sequence DNA // Nucl. Acids Res. 1992. V.20. P. 211-215.

116. Schmidt R., Acarkan A., Boivin K. Comparative structural genomics in the Brassicaceae family// Plant Physiol. Biochem. 2001. V. 39. P. 253-262.

117. Schwetka A. Inheritance of seed color in turnip rape (Brassica campeslris L.) // Theor. Appl. Genet. 1982. V. 62. P. 161-169.

118. Scott K.D. Microsatellites derived from ESTs and their comparison with those derived by other methods In: Plant genotyping: The DNA fingerprinting of plants // Ed. R.J. Henry. CABI Publ., Wallingford, UK, 2001, P. 225-237.

119. Sharma B.R., Swarup V. and Chatteijee S.S. Inheritance to blackrot in cauliflower // Can. J. Genet. Cytol. 1972. V. 14. P. 363-370.

120. Sharma R., Aggarwal R.A., Kumar R., Mohapatra T., Sharma R.P Construction of an RAPD linkage map and localization of QTLs for oleic acid level using recombinant inbreds in mustard (Brassica juncea). II Genome. 2002. V. 45. № 3. P. 467-72.

121. Shavorskaya O.A. Identification of genes affecting flowering time variation in Brassica species // PhD dissertation. 2004. Swedish University of Agricultural Sciences. Uppsala.

122. Shirzadegan, M. Inheritance of seed color in Brassica napus L. // Z. Pflanzenzuchtg. 1986.V. 96. P. 140-146.

123. Sippell D.W., McNabb W., Hall R. and Patel J. Inheritance of resistance to blackleg1.ptosphaeria maculans) of canola // Proc. 8th Inter. Rapeseed Congr., Saskatoon, Canada. 1991. V. l.P. 232-237.

124. Sneath P.H.A., Sokal R.P. Numerical taxonomy. The principles and practice of numerical classification // San Francisco: W.H. Freedman and Co. 1973.

125. Snowdon R. J. and Friedt W. Molecular markers in Brassica oilseed breeding: current status and future possibilities // Plant Breeding. 2004. V. 123. P. 1-8.

126. Sobotka R., Dolanska L., Curn V., Ovesna J. Fluorescence-based AFLPs occur as the most suitable marker system for oilseed rape cultivar identification // J. Appl.Genet. 2004. V. 45. №2. P. 161-173.

127. Somers D.J., Rakow G., Prabhu V.K., Friesen K.R.D. Identification of a major gene and RAPD markers for yellow seed coat colour in Brassica napus II Genome. 2001. V.44. P.1077-1082.

128. Song K.M., Osborn T.C., and Williams P.H. Brassica taxonomy based on nuclear restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) 1. Genome evolution of diploid and amphidiploid species // Theor. Appl. Genet. 1988a. V. 75. P. 784-794.

129. Song K.M., Suzuki J.Y., Slocum M.K., Williams P.H., Osborn T.C. A linkage map of Brassica rapa (syn. campestris) based on restriction fragment length polymorphism loci // Theor.Appl.Genet. 1991. V. 82. P. 296-304.

130. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by electrophoresis//J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503-517.

131. Stringam G.R. Inheritance of seed color in turnip rape // Can. J. Plant Sci. 1980. V. 60. P. 331-335.

132. Sparrow P.A.C., Townsend T.M., Arthur A.E., Dale P.J., Irwin J.A. Genetic analysis of Agrobacterium tumefaciens susceptibility in Brassica oleracea II Theor. Appl. Genet. 2004. V. 108. P. 644-650.

133. Srivastava A., Gupta V., Pental D., Pradhan A.K. AFLP-bascd genetic diversity assessment amongst agronomically important natural and some newly synthesized lines of Brassica juncea Theor. Appl. Genet. 2001. V. 102. P. 193-199.

134. Suwabe K.,-Iketani H., Nunome T., Kage T., Hirai M. Isolation and characterization of microsatellites in Brassica rapa L. Theor. Appl. Genet. 2002. V. 104. P. 10921098.

135. Szewc-McFadden A.K., Kresovich S, Bliek S.M., Mitchell S.E., McFerson J.R.1.entification of polymorphic, conserved simple sequence repeats (SSRs) in cultivated Brassica species//Theoretical and Applied Genetics. 1996. V. 93. P. 534-538.

136. Tanhuanpaa P.K., Vilkki J.P., Vilkki H.J. Association of RAPD marker with linolenic acid concentration in the seed oil of rapeseed (Brassica napus L.) // Genome. 1995. V. 38. №2. P. 414-616.

137. Tanhuanpaa P. Identification and mapping of resistance gene analogs and a white rust resistance locus in Brassica rapa ssp. oleifera // Theor. Appl. Genet. 2004. V. 108. P. 1039-1046.

138. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers//Nucleic Acids Research. 1989. V. 17.№ 16. P. 6463-6471.

139. I'autz D.,Ren/ M. Simple sequences are ubiquitous repettive components of eukaryotic genomes //Nucleic Acids Research 1984. V. 12. № 10. P. 4127-4138.

140. Teklewold A., Becker H. C., Comparison of phenotypic and molecular distances to predict heterosis and F1 performance in Ethiopian mustard {Brassica carinata A. Braun) // Theor. Appl. Genet. 2005.

141. Teutonico R.A., and Osborn T.C., Mapping of RFLP and qualitative trait loci in Brassica rapa, and comparison to linkage maps of B napus, B oleracea, and Arabidopsis lhaliana II Theor. Appl. Genet. 1994. V. 89. P. 885-894.

142. U N. Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B napus and peculiar mode of fertilization // Jpn. J. Bot. 1935. V. 7. P. 389-452.

143. Uzunova M., Ecke W., Weissleder K., Röbbelen G. Mapping the genome of rapeseed (Brassica napus L.).I. Construction of an RFLP linkage map and localization of QTLs for seed glucosinolate content // Theor. Appl. Genet. 1995. V. 90. P. 194-204.

144. Uzunova M.I., Ecke W. Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in oilseed rape (Brassica napus L.) // Plant Breeding. 1999. V. 118. P. 323-326.

145. Van de Peer Y., de Wächter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the microsoft windows environment//Comp. Appl. BioSci. 1994. V. 10. P. 569-570.

146. Voorrips R.E. and Visser D.L. Recessive inheritance of resistance to clubroot in Brassica oleracea //Cruciferae Newslett. 1991. №. 14/15. P. 138-139.

147. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., Van de Lee T., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4407-4414.

148. Walsh J.A., Sharpe A.G., Jenner C.E., Lydiate D.J. Characterisation of resistance to turnip mosaic virus in oilseed rape (Brassica napus) and genetic mapping of TuRBO 1

149. Theor. Appl. Genet. 1999. V. 99.1149-1154.

150. Warwick, S.I., and Black, L.I). Molecular relationships in subtribe Brassicinae (Cruciferae, tribe Brassiceae). Can. J. Bot. 1993. V. 71. P. 906-918.

151. Warwick S.I., Sauder C.A. Phylogeny of tribe Brassiceae (Brassicaceae) based on chloroplast restriction site polymorphisms and nuclear ribosomal internal transcribed spacer and chloroplast trnL intron sequences // Can. J. Bot. 2005. V. 83. P. 467-483.

152. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. №24. P. 7213-7218.

153. Westman A.L., Kresovich, S. The potential for cross-taxa simple-sequence repeat (SSR) amplification between Arabidopsis thaliana L. and crop brassicas // Theor. Appl. Genet. 1998. V. 96. P. 272-281.

154. Westman A.L., Kresovich S. Simple sequence repeat (SSR)-based marker variation in Brassica nigra genebank accessions and weed populations // Euphytica. 1999. V. 109. P. 85-92.

155. Williams J.G., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNApolymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. №22. P. 6531-6535.

156. Williams P.H., Staub T. and Sutton J.C. Inheritance of resistance in cabbage to black rot // Phytopathology. 1972. V. 62. P. 247-252.

157. Wit F. Inheritance of reaction to clubroot in turnips // Hortic. Res. 1965. V. 5. P. 4749.

158. Yang G. and Fu T. The inheritance of polima cytoplasmic male sterility in Brassica napus L. // Plant Breeding. 1990. V. 104. P. 121-124.

159. Yang Y.W., Lai K.N., Tai P.Y., Ma D.P., Li W.H. Molecular phylogenetic studies of Brassica, Rorippa, Arabidopsis and allied genera based on the internal transcribed spacer region of 18S-25S rDNA // Mol. Phylogenet. Evol. 1999. V. 13. № 3. P. 455462.

160. Yu F., Lydiate D.J., Rimmer S.R. Identification of two novel genes for blackleg resistance in Brassica napus II Theor. Appl. Genet. 2005. V. 110. P. 969-979.

161. Zhi-wen L., Ting-dong F., Jin-xing T., Bao-yuan C. Inheritance of seed colour and identification of RAPD and AFLP markers linked to the seed colour gene in rapesecd

162. Zuberi M.I., Zuberi S. and Lewis D. The genetics of incompatibility in Brassica. I. Inheritance of self-incompatibility in Brassica campestris L. var. loria // Heredity. 1981. V. 46. P. 175-190.

163. ООО ООО ООО ООО I о I о I о I 11 о1.о 0 О I О I о О О I ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО О О I О О I О О I О О I О О I О О I О О I О I о О О I О О I О О I О I I

164. О I I о О I О I О I О I О I О I1 о о1.о о1.о о I о о0001 о о I О I I о о

165. ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО ООО О I о О О I1.о

Информация о работе

Анискина, Юлия Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Технология генотипирования культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы