Новые технологии детекции точечных мутаций и анализа полиморфизма повторяющихся последовательностей геномов

Шилов, Илья Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые технологии детекции точечных мутаций и анализа полиморфизма повторяющихся последовательностей геномов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Новые технологии детекции точечных мутаций и анализа полиморфизма повторяющихся последовательностей геномов"

На правах рукописи

ШИЛОВ ИЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВИЧ

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДЕТЕКЦИИ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ И АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМОВ

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2006

003067319

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (г. Москва).

Научный консультант:

доктор биологических наук Карягина-Жулина Анна Станиславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

доктор биологических наук, профессор Зиновьева Наталья Анатольевна

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Ведущая организация:

Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Пущино)

Защита состоится «_£_/>> МиЬргЯ 2007 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42; тел.: (495)-976-6544; факс: (495)-977-0947; E-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан « ^ » XHS^Lfrf 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.027.01

кандидат биологических наук / ^ МеликоваС.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Анализ известных точечных мутаций в ДНК является одним из основных направлений современной ДНК-диагностики и находит широкое применение при выявлении предрасположенности человека к различным наследственным заболеваниям, при анализе устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам, в миграционных исследованиях, а также в фармакогеномике

Существующие методы детекции известных точечных мутаций можно разделить на две группы В одной группе методов анализ мутаций проводится после амплификации исследуемого участка ДНК. Точечные мутации обнаруживают по расщеплению анализируемых фрагментов ДНК соответствующими рестриктазами, с помощью аллель-специфической гибридизации или удлинения праймера на один нуклеотид. Ко второй группе методов относятся те, в которых амплификация является частью системы детекции Эти методы основаны на лигировании специфических олигонуклеотидных зондов в месте потенциальной мутации и аллель-специфической полимеразной цепной реакции. Тем не менее, при всем существующем многообразии методов не один из них пока не является полностью подходящим для клинического использования К общим недостаткам методов первой группы, ограничивающим их применение в клинической практике и крупномасштабных исследованиях, можно отнести трудоемкость, наличие стадии постреакционной обработки продуктов амплификации (это способствует контаминации), долгое время анализа и низкую производительность. Кроме того, наиболее используемый в клинической диагностике метод первой группы, основанный на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, имеет существенные ограничения по применению, поскольку требует наличия сайта рестрикции в месте предполагаемой мутации Методы второй группы являются более предпочтительными с точки зрения использования их в клинической практике, т к. они позволяют проводить генотипирование в одну стадию, что сокращает время анализа и значительно упрощает анализ Однако, эти методы также являются малопроизводительными, что ограничивает их широкое применение. Кроме того, метод аллель-специфического олигонуклеотидного лигирования характеризуется низким выходом продукта реакции. Таким образом, разработка новых, удобных в эксплуатации, быстрых, высокопроизводительных и надежных методов детекции известных точечных мутаций в ДНК является актуальной задачей современной биотехнологии

конкретного организма к той или иной группе не является чисто академической Основанная на точных критериях систематика живых организмов, определяющая эволюционное родство между ними, помимо чисто теоретического представляет и большой практический интерес. В частности, определение источника патогенных микроорганизмов при больничных инфекциях позволило бы выработать эффективные меры защиты против их распространения. Идентификация микроорганизмов важна не только для медицинской практики, но также и в других областях, например, при сертификации продуктов питания, при определении экологической чистоты воды и почвы и т.д В настоящее время молекулярно-генетические методы позволяют осуществлять идентификацию личности в судебно-медицинских исследованиях, а также решать в спорных случаях проблему определения отцовства Применение технологий генотипирования в сельском хозяйстве открывает новые возможности для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как поддержание генетических коллекций, подбор родительских форм для скрещивания, составление родословных, контроль интрогрессии генетического материала, паспортизация и сертификация сортов, создание «генетических паспортов» сельскохозяйственных растений, представляющих собой основу защиты интеллектуальной собственности селекционеров

Наиболее важным подходом для исследования генетического полиморфизма представляется использование методов молекулярного анализа, позволяющих получать индивидуальную характеристику отдельного генотипа - ДНК-профиль Существующие методы ДНК-типирования геномов отличаются по сложности, надежности и объему получаемой информации Для надежного различения и идентификации генотипов, исследования филогенетических взаимосвязей и интрогрессии генетического материала, наиболее перспективным является метод анализа полиморфизма микросателлитов, позволяющий получать воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома.

Целью данной работы явилась разработка новых подходов для детекции точечных мутаций, а также разработка принципов стандартизации технологий генотипирования, основанных на анализе полиморфизма микросателлитов. Исследования были направлены на создание конкретных технологических решений, обеспечивающих применение разработанных подходов к идентификации геномов в практике клинических, судебно-медицинских исследований и в сельском хозяйстве

Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ' 1 Исследовать возможность применения лигазной цепной реакции (ЛЦР) для детекции однонуклеотидных полиморфизмов

2. Разработать технологию детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе электрофореза высокого разрешения.

3. Разработать методологию конструирования аллель-специфических праймеров для выявления мутаций в любых интересующих генах путем анализа продуктов АС-ПЦР на автоматическом анализаторе ДНК

4 Применить разработанную технологию для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G-»A) и V (1691G—>А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)А в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах al-коллагена типа 1 (2046G—>Т), рецептора витамина D3 (45082G—>А) и эстрогенового рецептора а (938Т-»С и 984А—>G).

5. Разработать методические подходы, позволяющие стандартизировать технологию молекулярно-генетической идентификации личности, основанную на анализе количества тандемных повторов в микросателлитных локусах геномной ДНК человека

6. Исследовать возможность применения метода микросателлитного анализа для генотипирования растений родов Solanum и Brassica. Разработать универсальную технологию для генотипирования картофеля, культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов. Отобрать оптимальные наборы праймеров к полиморфным микросателлитным локусам для различения и идентификации растений родов Solanum и Brassica, соответственно.

7 Применить технологию микросателлитного анализа для исследования генетического разнообразия представителей родов Solanum и Brassica как на внутри- и межвидовом уровне, так и для генотипирования сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, а также близкородственных сортов и гибридов Brassica.

8. Изучить природу межвидового и внутривидового полиморфизма исследуемых микросателлитных локусов

9. Исследовать возможность применения технологии микросателлитного анализа для осуществления контроля интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Технология детекции мутаций на основе АС-ПЦР с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе капиллярного электрофореза.

2 Методология конструирования аллель-специфических праймеров для выявления мутаций в любых интересующих генах путем анализа продуктов АС-ПЦР на автоматическом анализаторе ДНК.

3 Разработанные тест-системы для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (2021 ОС—»А) и V (1691G—»A) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, TI74M, G(-6)А в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах al-коллагена типа 1 (2046G—>Т), рецептора витамина D3 (45082G—>А), эстрогенового рецептора а (938Т->С и 984A-»G)

4 Основные принципы стандартизации технологии молекулярно-генетической идентификации личности, основанной на анализе количества тандемных повторов в микросателлитных локусах геномной ДНК человека.

5. Технология генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей на основе анализа 20 микросателлитных локусов

6. Технология генотипирования культурных и дикорастущих растений рода Brassica на основе анализа 18 микросателлитных локусов.

Научная новизна работы. В настоящей работе осуществлено комплексное исследование вопросов идентификации геномных полиморфизмов. В процессе выполнения исследования создан ряд научно обоснованных технологических решений, имеющих приоритетное значение для современной ДНК-диагностики

1. Впервые разработана методология создания тест-систем для детекции мутаций на основе АС-ПЦР и капиллярного электрофореза, адаптированная для использования в клинической практике. На основе предложенной технологии разработаны диагностические наборы реагентов для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G—>А) и V (169IG—>А) свертываемости крови, полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)A в гене ангиотензиногена человека, а также для нуклеотидных замен в генах a 1-коллагена типа 1 (2046G—>Т), рецептора витамина D3 (45082G—>А) и эстрогенового рецептора а (938Т—>С и 984А—»G).

2. В рамках задачи создания технологии детекции точечных мутаций, адаптированной для использования в клинической практике, разработан и создан прибор для

автоматизированного анализа фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза «Мультиген» Генетический анализатор «Мультиген» основан на оригинальной оптической схеме, защищен патентом на изобретение (Шилов И А и др, 2000) и рекомендован для применения в медицинской практике Комитетом по новой медицинской технике Министерства здравоохранения Российской Федерации

3. На основании комплексного исследования источников возможных ошибок при проведении молекулярно-генетической идентификации личности разработаны основные подходы к стандартизации этой технологии, а именно принцип единого технологического цикла, принципы создания наборов реагентов для идентификации личности, а также способы, обеспечивающие однозначную идентификацию аллелей при проведении генетических экспертиз с использованием автоматических анализаторов

4. В результате проведенных исследований были отобраны 20 микросателлитных локусов, являющихся перспективными для идентификации видов и сортов картофеля. С применением технологии микросателлитного анализа были получены уникальные генетические профили 85 образцов растений рода Solanum, 44 из которых являются сортами картофеля отечественной и зарубежной селекции.

5. Впервые показано, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта На основе экспериментального анализа первичных структур ряда микросателлитных локусов показана возможность контроля интрогрессии генетического материала дикого вида S bulbocastanum и сорта Ласунак в гибрид L 4-11, а также интрогрессии генетического материала родительских форм, участвовавших в селекции сорта Скороплодный.

6 На основании проведенных исследований были отобраны 18 микросателлитных локусов, являющиеся перспективными для идентификации видов, сортов и дикорастущих форм Brassica. Показано, что с помощью технологии микросателлитного анализа можно различать и идентифицировать растения рода Brassica, составляющие треугольник U, а также представителей других родов семейства Brassicaceae (Smapis, Raphanus, Camehna) на родовом, видовом и внутривидовом уровне.

7. В результате микросателлитного анализа впервые были идентифицированы фрагменты, специфичные для геномов А, В и С диплоидных видов Brassica и подтверждена их интрогрессия в амфидиплоидные виды, а также межвидовые и межродовые гибриды Впервые показана возможность контроля интрогрессии

генетического материала родительских форм (сортов В гара) в гибриды с помощью технологии микросателлитного анализа.

Научно-практическое значение работы. В результате проведенной работы созданы наборы реагентов АСП-МТГФР, АСП-ПР и АСП-Ф5Л для детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (202100—>А) и V (1691 в—»А) свертываемости крови, соответственно. Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации С использованием разработанных наборов реагентов было проведено обследование пациенток с нормальным течением беременности и гестозом; при этом выявлена более высокая частота встречаемости вышеупомянутых мутаций у пациенток с гестозом. Также была выявлена высокая частота встречаемости данных мутаций в ДНК беременных женщин с варикозной болезнью. Данные результаты свидетельствуют о связи этих мутаций с предрасположенностью к гестозу и варикозной болезни во время беременности.

Разработанная технология может служить основой для создания новых тест-систем для выявления мутаций в любых интересующих генах.

На основании разработанных в данной работе технологических подходов созданы наборы реагентов для идентификации личности СТ\УА и ГРТЬ. Эти наборы реагентов зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.

Показана перспективность применения технологии микросателлитного анализа для исследования генетического разнообразия сельскохозяйственных культур, а также их идентификации, генетической паспортизации и сертификации, подбора генетически однородного материала для скрещиваний и контроля селекционной работы, а также для решения проблем молекулярной систематики и эволюции.

Продемонстрирована возможность различения близкородственных сортов картофеля Альтаир и Аксамит, в селекции которых участвовали одни и те же родительские формы; различения сортов отечественной и зарубежной селекции (сорт Скороплодный и \Vauseon), различения близкородственных генотипов - сортов Голубизна и Скороплодный, являющихся полусестринскими сортами картофеля На примере сорта Голубизна показано, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет отслеживать и подтверждать сортовую подлинность экспертных образцов, сохраняемых и поддерживаемых в различных опытно-производственных хозяйствах.

Полученные в работе результаты микросателлитного анализа шести исследованных видов В rapa, В nigra, В oleracea, В juncea, В. napiis и В carinata полностью соответствуют их ботанической и цитогенетической классификации и могут быть использованы для решения задач молекулярной систематики представителей семейства Brassicaceae В результате микросателлитного анализа выявлены фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, которые могут быть использованы в качестве маркеров интрогрессии генетического материала при межвидовых и межродовых скрещиваниях.

Личный вклад автора. В цикле исследований, включенных в диссертацию, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии во всех этапах исследования - от постановки задачи, проведения молекулярно-биологических и физико-химических экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов

Апробация диссертации. Разработанные методики апробированы и применяются в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (г. Москва), Российском государственном медицинском университете (г. Москва), Приморском краевом клиническом центре охраны материнства и детства (г. Владивосток), Центральном институте травматологии и ортопедии (ЦИТО) им H.H. Приорова (г. Москва), Российском центре судебно-медицинской экспертизы (г. Москва), Бюро СМЭ Московской области, Бюро СМЭ департамента здравоохранения г. Москвы, Республиканском Бюро СМЭ Татарстана, Республиканском Бюро СМЭ Башкортостана, Бюро СМЭ Новосибирской области, Бюро СМЭ Комитета по здравоохранению Ленинградской области, Бюро СМЭ г. Санкт-Петербурга, Бюро СМЭ Рязанской области, Бюро СМЭ Воронежской области, Бюро СМЭ Саратовской области, Бюро СМЭ Иркутской области, Алтайском краевом Бюро СМЭ (г. Барнаул), Приморском краевом Бюро СМЭ (г. Владивосток), Бюро СМЭ Новгородской области, Бюро СМЭ Самарской области, Бюро СМЭ Тюменской области, Бюро СМЭ Ярославской области, Республиканском Бюро СМЭ Северной Осетии-Алании, Красноярской государственной медицинской академии, Оренбургской государственной медицинской академии и в ряде других учреждений.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 283 страницах печатного текста, содержит 30 таблиц и 70 рисунков Список литературы включает 284 источника.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Исследование возможности применения лигазной цепной реакции (ЛЦР) для детекции точечных мутаций.

В рамках задачи создания технологии детекции точечных мутаций, которая может быть пригодной для клинического использования, на первоначальном этапе было проведено исследование возможности применения дня этой цели лигазной цепной реакции (ЛЦР).

С теоретической точки зрения метод ЛЦР представляется достаточно перспективным для детекции точечных мутаций, поскольку реакция происходит только в случае, если в месте лигирования праймеров не происходит локального нарушения вторичной структуры ДНК, т е в условиях полной комплементарное™ праймеров матрице. Кроме того, в отличие от аллель-специфического олигонуклеотидного лигирования метод ЛЦР является амплификационным, что делает его значительно более чувствительным и открывает возможность детекции малых количеств ДНК

Высокая точность работы фермента является основным фактором, определяющим возможность применения ЛЦР для детекции точечных мутаций. Из литературных источников известно, что ни одна ДНК-лигаза не обладает 100 %-ной специфичностью при лигированин субстратов, имеющих неспаренные основания в сайте лигирования (Ьио 1. е! а1, 1996)

Как видно из рис. 1 В, эффективность действия обеих ДНК-лигаз примерно одинакова (дорожки 1 и 2; 3 и 4; 5 и 6, 7 и 8). В дальнейшем, в работе использовали препарат 77й ДНК-лигазы. Кроме того, на элекгрофореграмме видно, что лигирование происходит также и в случаях использования матриц с заменой одного нуклеотида в сайте лигирования, хотя и с меньшей эффективностью (дорожки 3-8) Таким образом, имеет место проблема неспецифического лигирования Так как ЛЦР - процесс экспоненциальный, то даже в случае значительно меньшей эффективности неспецифическое лигирование недопустимо для поставленной цели - идентификации точечных мутаций, поскольку вновь образовавшиеся «неправильные» ДНК-матрицы могут далее амплифицироваться и давать ложный сигнал

Для преодоления неспецифического лигирования была предложена система с коррекцией лигирования при помощи специального фермента - термостабильной структуро-специфической эндонуклеазы (так называемой Cleava.se) Этот фермент представляет собой Тац ДНК-полимеразу, в которой путем замены одной аминокислоты в активном центре инактивирована полимеразная активность

Фермент Оеауаве удаляет выступающие (некомплементарные) однотяжевые 5'-концевые участки в ДНК-дуплексах в результате гидролиза фосфодиэфирной связи, происходящего строго после первого спаренного основания

OL-3 OL-1

Ъ'-p*GCACTGTAGAATAAACGCGCA pGTGACTCTCTCGTTAGCTCTTC -3' 3'- CGTGACATCTTATTTGCGCGT--CACTGAGAGAG С ААТС GA GAA G -5' (матрица)

3'- CGTGACATCTTATTTGCGCGT--GACTGAGAGAGCAATGGAGAAG -5 ' (Templ-G)

31- CGTGACATCTTATTTGCGCGT--AACTGAGAGAGCAATCGAGAAG -b1 (Tempi-A j

3'- CGTGACATCTTATTTGCGCGT--TACTGAGAGAGCAATCGAGAAG -5' (Tempi-T)

место расщепления Clcavast

Ь'-cgcc^atatg / OL3-1 З'-g // OLl-lO

S'"P*GCACTGTAGAATAAACGCGCA/ GTGACTCTCTCGTTAGCTCTTC -3' 3' CGTGACATCTTATTTGCGCGT--cactgagagagcaatcgagaag -Ь'

Рис. 1. Исследование специфичности действия ' I ■ 1 1 t: l- if • к Taij и Tth ДНК-лига-*. А. Контрольная система

для лигирования на матрице. Б. Система для ^ щ » лигирования с коррекцией Cleavage. В. Лнаниз

лигирования на природной и мутаитиых матрицах Б контрольной системе (дорожки 1 8) и в системе для лигирования с коррекцией ('leavast (дорожки 9 16). Для лигирования [файмеров OL-3 и OL-1 использовали Taq ДНК-лигазу (дорожки I, 3, 5 и 7) и Tth ДНК-лигазу (дорожки 2, 4, 6 и 8). Для лигирования прайм еров 01,1-! и 01,1-10 использовали Tth ДНК-лигазу (дорожки 9 Ift). В реакциях лигирования использовали природную матрицу (дорожки 1, 2, 9 и 10), матрицу Templ-G (дорожки 3. 4, И и 12), матрицу Tcmpl-A (дорожки 5, 6, 13 и 14} и матрицу Tcmpl-T (дорожки 7, 8, !5 и 16) Реакцию лигирования прайм еров OL3-1 и OLl-lO проводили как с добавлением Cleavase (дорожки 10. 12. 14 и 16), так и без добавления Cleavasc i дорожки 9. II, 13 и 15), Дорожка К контроль длине.! продукта лигирования.

Поэтому С tea vase называют структуре-специфической эндонуклеазой Необходимость использования именно термостабильного фермента обусловлена тем, что реакция ЛЦР происходит при достаточно высоких температурах (60 - 94 "С). Для изучения действия термостабильной С lea vase был синтезирован специальный субстрат (рис. 2, А),

Действие Пен vase проверяли при различных концентрациях фермента (I, 5 и 50 ед.), различном времени воздействия на данную структуру (2 и 10 мин), в разных буферных растворах (буферном растноре для Taq Д] ]К-пол имеразы и Taq Д] IК-ли газы) Изучаемая вилкообразная структура содержала радиоактивную метку на 5'- конце. Для того, чтобы убедиться в том, что С lea vase расщепляет эту структуру специфично, т.е. после первого

спаренного нуклеотида (в данном случае - после С), была проведена реакция метилирования tío G и последующее расщепление модифицированной ДНК пиперидином (рис. 2, Б).

Как видно из рис. 2 Б. СIcavase - действительно специфичный фермент (расщепление идет после первого спаренного основания). Кроме того, очень важным оказалось и то обстоятельство, что фермент одинаково хорошо «раб^ггаеп» как в п од и м ерачном (дорожки 1 - 6). так и в лигазном буферных растворах (дорожки 7 12). Это открывает перспективы создания тест-системы, в которой реакции .мш ировании ДНК-лигазой и коррекции С!cavase проводятся в ОДНОЙ пробирке

. место расщепления ( ¡cavase

5'-ATAGGGAGAC / С

" GG А А Т Т CGAGCTCSC С 3'- ATCGT Г A TGTGC С Т Г A A GCТСGAGCG G

1234567В9 10 1113 G

Рис. 1. Анализ специфичности терм о -стабильной структуро-специфической эндо-нуклеазы (Cleavasc). А. Олигонукпеотидный субстрат для анализа специфичности □cavase. К Электрефоретичсский анализ продуктов расщепления субстрата с Помощью cieavase. К 21) ниоль IJIJ-мечен ого 56-звенногС1 субстрата для Cleavase добавляли I ед (лорпжки 3, 6, 9 и 12), 5 ед. (дорожки 2, 5, 8 и II) и S0 ед, Cieavase (лорожки 1. 4. 7 и 101 в буфере для Taq Д11К-полимеразы (дорожки ! (i) и в буфере д;ш ЛЦР (дорожки 7 12). Реакцию вели 2 мин (дорожки 1 .1:7 9) и 10 мин (дорожки 4 -б; 10 - 12), Дорожка <i соответствует реакции расщепления пиперидином субстрата, модифицированного диметилсульфатом

Основываясь на полученных данных о свойствах Оеауаке была создана система для лигироваиия с использованием этого фермента. Проводили лнгнрованне двух прайм еров п рай мера 01Л-Ю. который имеет 5'-концевой не комплементарный матрице десятизвенный участок (его длина соответствует длине одиотяжевого участка в исследованной вилкообразной структуре), и праймера 01,.1-1. содержащего неспаренныЙ нуклеотид (у).

который займет место в - первого спаренного с матрицей нуклеотида в соседнем праймере, удаляемого при действии Cleava.sc (рис. 1, Б)

Система была проверена на природной и трех мутантных матрицах (Тешр1-0, Тетр1-А и Тетр1-Т). Результаты электрофоретического разделения продуктов реакции лигирования представлены на рис. 1, В. Из этого радиоавтографа видно, что в отсутствие Оеауаве лигирования не происходит (дорожки 9, 11, 13 и 15), в присутствии Оеауаве лигирование проходит только на природной матрице (дорожка 10). Таким образом, с применением Скауаве удается значительно повысить точность и специфичность реакции лигирования

Одним из перспективных способов детекции продуктов ЛЦР (ДНК-дуплексов) является колориметрический метод Для колориметрической детекции используются две пары праймеров, причем праймер из одной пары содержит на 5'-конце дополнительный некомплементарный матрице участок (иР-участок). Праймер из другой пары содержит на 5'-конце биотин, который связывается со стрептавидином, находящимся в лунках микропланшета В результате ЛЦР образуется ДНК-дуплекс, который содержит и биотин, и однотяжевой иР-участок. К этому иР-участку далее гибридизуют олигонуклеотид, несущий на З'-конце, например, щелочную фосфатазу. Субстратом для щелочной фосфатазы является КАЕ)РН, который в результате ее действия превращается в ЫАБН КАОН, в свою очередь, принимает участие в окислительно-восстановительной реакции: окисляясь до ЫАО+ он восстанавливает формазановый краситель, в результате чего последний меняет цвет (регистрируется поглощение при 490 нм) Если лигирования не прошло, то изменения цвета не происходит

С использованием метода колориметрической детекции в данной работе была предложена система для ЛЦР, исключающая нематричное лигирование. Для этого праймеры были спланированы таким образом, что после их отжига на матрице «разрывы» в верхней и нижней цепях окажутся «сдвинутыми» друг относительно друга (рис 3) В этом случае, при отжиге комплементарных праймеров друг на друга после действия Cleava.se получаются ДНК-дуплексы с некомплементарными 3'-концами Это исключает возможность нематричного лигирования Лигирование (и сама реакция ЛЦР) может происходить только в результате отжига праймеров на ДНК-мишени

Праймер ОЬ2-51!Р содержит на З'-конце иР-участок (для гибридизиции с олигонуклеотидом, несущим щелочную фосфатазу), а на 5'-конце содержит 5-звенный некомплементарный матрице участок (удаляемый при действии Скауаэе); праймер ОЫ-5В содержит биотин на З'-конце и пентануклеотидный некомплементарный матрице участок на 5'-конце (удаляемый при действии Cleava.se). Праймеры 01,4-1 и ОЬЗ-1 на З'-конце содержат неспаренный с матрицей нуклеотид, который займет место нуклеотида, удаленного

Cleavase из соседнего праймера (рис. 3) Для сравнения ЛЦР с коррекцией Cleavase на описанной выше системе с обычной ЛЦР была использована система праймеров, предложенная в коммерческом наборе реагентов AmpliTek LCR Kit фирмы Bio-Rad (США)

Место расщепления Clea\ase

Место растеплеипя СЛеа»а«

Рис. 3. Модифицированный метод ЛЦР с колориметрической детекцией продуктов реакции

Следует отметить, что в отличие от обычного метода ЛЦР использование такой специальной системы праймеров с коррекцией С1еауаяе действительно исключает нематричное лигирование (Табл 1).

Однако, несмотря на высокую специфичность, чувствительность этого модифицированного метода ЛЦР оказалась небольшой (Табл. 1) Поэтому перспективы развития метода ЛЦР с коррекцией С1еауазе для диагностических целей могут быть связаны либо с применением специализированных высокочувствительных приборов для детекции, либо с проведением предварительной стадии оценки количества исследуемой ДНК (например, с помощью ПЦР в реальном времени)

Табл. 1. Результаты колориметрической детекции продуктов обычной ЛЦР и ЛЦР с коррекцией

Cleavase

Количество ДНК-матрицы, моль Поглощение при 490 им после обычной ЛЦР Поглощение при 490 нм после ЛЦР с коррекцией Cleavase

3 х 10"'4 - 0,68 ±0,10

3 х 1015 - 0,31 ±0,05

3 х Ю" 1,05 ±0,15 0,28 ± 0,05

3x10" 1,22 ±0,16 0,12 ±0,02

3x10'" 1,15 ±0,15 0

3 х Ю-'" 1,04 ±0,15 0

0 0,42 ± 0,06 0

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о необходимости комплексного подхода для решения задач идентификации генетических полиморфизмов

Этот подход должен включать в себя не только разработку принципа диагностики, но и обязательную апробацию методики с помощью существующих аппаратных средств, позволяющих надежно детектировать тот или иной полиморфизм

В рамках этого подхода следующим этапом работы явилась разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР (АС-ПЦР) с применением автоматических анализаторов ДНК, адаптированной для использования в клинической практике, и ее апробация для выявления ряда практически значимых нуклеотидных замен в генах человека

2.2. Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР (АС-ПЦР) с применением автоматических анализаторов ДНК.

В основе АС-ПЦР лежит та особенность полимеразной цепной реакции, что для ее эффективного осуществления 3'-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду ДНК-матрицы В противном случае эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается и при определенных сочетаниях нуклеотидов может отсутствовать вообще (Goodman М F., 1995, Патрушев Л И, 2000). Поэтому, в АС-ПЦР используются два аллель-специфических праймера, З'-концевые нуклеотиды которых соответствуют месту расположения детектируемой нуклеотидной " замены в ДНК. При этом, 3'-концевой нуклеотид у одного из праймеров комплементарен «мутантному» нуклеотиду ДНК-матрицы, а у другого - соответствующему нуклеотиду «нормальной» ДНК-матрицы, не несущей мутацию. Следовательно, в зависимости от наличия или отсутствия мутации в ДНК происходит удлинение соответствующего аллель-специфического праймера. Последующий же анализ образующихся при этом продуктов реакции позволяет идентифицировать нуклеотидную замену

Преимуществом АС-ПЦР является то, что она позволяет получать информацию не только о наличии мутации в геномной ДНК, но также и об ее аллельном распределении. Тем не менее, данный метод редко используется в клинической практике. Это связано, прежде всего, с тем, что продукты АС-ПЦР, как правило, мало различаются по длине, что затрудняет их идентификацию с помощью электрофореза в агарозном геле и делает метод неудобным для использования

Применение автоматических анализаторов ДНК на основе электрофореза в ПААГ и капиллярного электрофореза (КЭ) обеспечивает ряд преимуществ' очень высокое разрешение, простоту детектирования фрагментов ДНК в режиме реального времени, короткое время анализа Эти достоинства делают автоматические анализаторы более

подходящими для идентификации продуктов ПЦР в клинической практике, нежели классический электрофорез в агарозном геле

А: Гомозигота "нормальная"

ф [ < т

Ф1-. П1

Аллель 1, 2 :

Б: Гомотгота "мутантная"

Аллель 1, 2

В: Гетерозигота

Ф!

Аллель 2

Рис. 4. Принцип выявления точечных мутаций с помощью АС-ПЦР при использовании капиллярного электрофореза П1, П2 - флуоресцентно-меченные с помощью красителя Ф1 праймеры, специфичные к «нормальному» аллелю и аллелю, несущему нуклеотидную замену, соответственно ПЗ - общий праймер Пики, обозначенные цифрами 1 и 2 на электрофеграммах соответствуют продуктам ПЦР, полученным удлинением праймеров П1 и П2, соответственно Пик, обозначенный пунктиром, соответствует маркеру длины, меченному красителем Ф2. Стрелками на схемах А, Б и В обозначено направление удлинения праймеров, черным треугольником обозначена нуклеотвдная замена А. В случае «нормальной» ДНК происходит удлинение праймера П1 с образованием продукта 1 и отсутствует удлинение праймера ГО Б. В том случае, если нуклеотвдная замена присутствует в обоих аллелях, удлиняется праймер П2 с образованием продукта 2 и не происходит удлинение праймера П1 В. Если нуклеотидная замена присутствует только в одном из аллелей, то происходит удлинение обоих аллель-специфических праймеров П1 и П2 с образованием двух продуктов реакции 1 и 2

Предлагаемая в данной работе технология детекции точечных мутаций заключается в том, что ПЦР проводится с тремя праймерами: двумя аллель-специфическими П1 и П2, меченными по 5'-концам флуорофором Ф1, и одним общим праймером ПЗ (рис. 4). При этом используемые аллель-специфические праймеры П1 и П2 различаются по длине их 5'-концевых последовательностей, что приводит к образованию ПЦР-продуктов разной длины. Перед электрофорезом ПЦР-продукты смешивают с маркером длины, те со специально синтезированным фрагментом ДНК, длина которого является промежуточной между длинами продуктов АС-ПЦР, и меченным при этом флуорофором Ф2. Далее проводят анализ продуктов с помощью капиллярного электрофореза При этом на электрофореграмме

наблюдается один пик (рис 4, А и Б), если ДНК является гомозиготной по «нормальному» аллелю (мутация отсутствует в обоих аллелях) или гомозиготной по «мутантному» аллелю (мутация содержится в обоих аллелях), соответственно, и два пика (рис. 4, В) - в случае, если ДНК гетерозиготна по анализируемой мутации.

2.2.1. Разработка методологии конструирования аллель-специфических праймеров для АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом.

Для того чтобы идентифицировать в ДНК человека конкретные мутации, для каждой из них было разработано два аллель-специфических праймера: AS-(N)-WT (где N -уникальное для каждой мутации обозначение), специфичный к «нормальному» аллелю, и AS-(N)-MT, специфичный к ДНК, содержащей мутацию, а также один общий праймер, которые использовали в одной реакционной смеси. Праймеры AS-(N)-WT и AS-(N)-MT различались З'-концевыми нуклеотидами. При этом, их специфичность зависит от того, насколько сильно ингибирует удлинение праймера некомплементарная пара, которую образуют 3'-концевой нуклеотид праймера и соответствующий нуклеотид ДНК-матрицы Так, наиболее неблагоприятными для продолжения синтеза ДНК являются пары нуклеотидов пурин-пурин и пиримидин-пиримидин (Goodman M.F., 1995; Патрушев ЛИ., 2000) Тем не менее, вероятность удлинения праймера сохраняется даже в случае образования самой неблагоприятной для удлинения пары нуклеотидов Поэтому, для того, чтобы увеличить аллельную селективность праймеров, были введены дополнительные некомплементарные матрице нуклеотиды на их 3'-концах. Они вводились в одно и тоже положение (-1 или -2), что важно для получения сравнимой эффективности амплификации для двух аллель-специфических праймеров (Ulvik A. et al., 1998) Кроме того, дополнительные неспаренные нуклеотиды на З'-конце, в случае, если они различаются для парных аллель-специфических праймеров, приводят к большему различию образуемых ПЦР-продуктов, что также снижает вероятность неспецифического отжига праймеров на них

Чтобы выявить гетерозиготное состояние мутации праймеры AS-(N)-MT, определяющие специфичность к мутантному аллелю, были удлинены на 12 нуклеотидов (некомплементарных матрице) с 5'-конца, что приводит к образованию ПЦР-продуктов большей длины. При этом, в структуре праймеров AS-(N)-WT два 5'-концевых нуклеотида были заменены на некомплементарные матрице с тем, чтобы в случае образования гетеродуплексов между короткими и длинными ПЦР-продуктами не происходило «ложного» накопления более длинного «мутантного» ПЦР-продукта

Для того, чтобы иметь возможность разделять продукты разных реакций в одном капилляре, что повышает производительность процесса и сокращает время анализа,

праймеры планировались таким образом, чтобы длины продуктов разных реакций лежали в разных диапазонах длин В рамках данной работы были выбраны три диапазона длин предполагаемых амплификатов. 120-140 п н , 170-190 п н. и 230-250 п.н

2.2.2. Создание систем детекции мутаций (G20210A) и (G1691A) в генах факторов II и V свертываемости крови человека; (С677Т) в гене метилентетрагидрофолатредуктазы;

С1015Т, Т1198С и G(-6)A в гене ангиотензиногена; (G2046T) в гене al-коллагена типа I; (G45082A) в гене рецептора витамина D3 и (Т938С и A984G) в гене

эстрогенового рецептора а человека методом АС-ПЦР. В рамках данной работы проводилась разработка систем детекции ряда значимых с диагностической точки зрения мутаций в генах человека Нуклеотидные замены 677С—>Т, 20210G—»А и 1691G—>А в генах метилентетрагидрофолатредукгазы (МТГФР), факторов II и V свертываемости крови, соответственно, могут определять предрасположенность к таким патологиям, как например, тромбофилия или варикозная болезнь (Rosendaal F.R et al., 1995, Endler G. et al., 2001; Poort S R. et al, 1996) Три мутации в гене ангиотензиногена человека (AGT) наиболее значимы с точки зрения их связи с предрасположенностью к гестозу и первичной гипертонии (Jeunemaitre X. et al, 1992; Inoue I et al, 1997) Это две мутации, приводящие к аминокислотным заменам - М235Т и Т174М и одна мутация G(-6)A в промоторной области гена ангиотензиногена На основе литературных данных также были определены наиболее значимые мутации в генах al-коллагена типа I (COLIA1), рецептора витамина D3 (VDR) и эстрогенового рецептора a (ER) человека для связи с предрасположенностью к остеопорозу (Stewart T.L. et al, 2000, Grant S et al, 1996, Kobayashi S. et al., 1996). Это мутация в 1-ом интроне гена COLIA1, приводящая к замене гуанозина на тимидин в 2046-м положении в сайте узнавания белка Spl; мутация в 8-м интроне гена VDR, приводящая к замене гунозина на аденозин в 45082-м положении в сайте рестрикции Bsm\, а также мутация 938Т—»С в сайте рестрикции Pvul\ и мутация 984А—»G в сайте рестрикции ХЪа\ гена ER.

Создание системы детекции мутаций на основе АС-ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК предполагало следующие этапы работы:

1) амплификацию соответствующего фрагмента генома, и отбор нормального, гетерозиготного и мутантного генотипов с помощью секвенирования ПЦР-фрагментов;

2) создание аллель-специфических праймеров согласно разработанной методологии и оптимизациию условий АС-ПЦР,

3) анализ образцов с использованием автоматического анализатора ДНК, в частности, прибора для капиллярного электрофореза;

4) подтверждение результатов анализа методом прямого секвенирования

Первый этап работы, как отмечено выше, заключался в амплификации фрагментов образцов геномной ДНК, содержащих области с предполагаемыми мутациями, и в последующем определении их генотипов с помощью секвенирования Образцы ДНК с известными генотипами далее использовались для последующего подбора праймеров и оптимизации условий АС-ПЦР.

Следующая стадия работы заключалась в создании аллель-специфических праймеров согласно разработанной методологии их конструирования. Для усиления специфичности действия праймеров в ряде случаев некомплементарные матрице нуклеотиды были введены в -2, а не в -1 позиции от З'-конца. Это связано с тем, что пары пуринов А-в и С-С, которые образуются между некомплементарным нуклеотидом в -2 позиции и нуклеотидом ДНК-матрицы, лучше ингибируют амплификацию, чем пары пиримидинов Т-Т и Т-С, которые образовывались бы в случае некомплементарного взаимодействия нуклеотидов в -1 позиции. Конечные варианты последовательностей праймеров, размеры ПЦР-продуктов и маркера длины приведены в Табл. 2.

С целью исключения ложных результатов необходимо было подобрать такие условия реакции, при которых происходило бы сравнимое по эффективности удлинение обоих аллель-специфических праймеров при сохранении их специфичности Для этого варьировали температуру и время денатурации ДНК, гибридизации и удлинения праймеров, а также концентрации дНТФ и ДНК-полимеразы. Поскольку праймер А5-(Тчт)-МТ,

специфичный к ДНК, несущей мутацию, за счет большей длины вступает в реакцию эффективнее праймера А5-(М)-\УТ, специфичного к «нормальной» ДНК, то варьировали также и концентрации аллель-специфических праймеров с целью подобрать их оптимальное соотношение, при котором в случае гетерозиготной ДНК образовывались бы одинаковые по интенсивности сигналы во время разделения продуктов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза В итоге, оптимальными были признаны условия, при которых реакционная смесь включала в себя 20 пмоль общего обратного праймера, 10 пмоль праймера А5-(Ы)-\¥Т и 8 пмоль праймера А8-(К)-МТ. Оптимальные условия циклирования представлены в Табл 2.

Для создания технологии детекции точечных мутаций, адаптированной для использования в клинической практике, на базе научно-производственной фирмы «АТГ-Биотех» (Россия) был создан отечественный прибор для автоматизированного генетического анализа на основе капиллярного электрофореза - «Мультиген»

Табл. 2. Прайм еры и условия ПЦР, используемые для детекции точечных мутаций с помощью АС-ПЦР.

Геи Мутация Названия праймеров1' Последовательность праймеров (5'-3') Размер продуктов АС-ПЦР н маркера длины (п.н.) Условия циклирования

VDR G45082-»A (fisml) AS-BsmI-WT AS-BsmI-MT Bsml-F JOE - CTGCAGAGCCTGAGTATTGGGAATTC JOE - AATTTTCATGTTGAGCAGAGCCTGAGTATTGGGAATCT ACTGCCCTTAGCTCTGCCTTG 125 21 137 131 95°С-12мин, 30 циклов: 94'С-ЗОсек, 60°С — 30 сек, (62°С - 30 сек, в случае мутации G45082A), 72*С 30 сек; 72*С - 5 мин

МТГФР С677—>Т AS-MTHFR-WT AS-MTHFR-MT MTHFR-R JOE - CCGAAGGTGTCTGCGGGCGC JOE - GAGCTGGATCGTCGAGAAGGTGTCTGCGGGTGT AAGATCCCGGGGACGATGG 125 138 131

Фактор II G20210-»A AS-P-WT AS-P-MT P-F JOE - CCATAGCACTGGGAGCATTGAGGATC JOE - GCAGTTCACGCCTGAATAGCACTGGGAGCATTGAGGGTT GTTCCGCCTGAAGAAGTGGATACAGAA 174 187 180

ФакгорУ G1691->A (Leiden) AS-L-WT AS-L-MT L-F JOE - AATCAAGGACAAAATACC TGTATTCCAC JOE - GTCTGTCTGTCTCTTCAAGGACAAAATACC TGTATTCCGT GGCAGGAACAACACCATGATCAG 233 245 239

AGT С1015-УГ (T174M) AS-174-WT AS-174-MT 174-R JOE - GTGGCCCAGCTGCTGCTGTCAAC JOE - С. ATCAGATGCTACAGGCCCAGCTGCTGCTGTCGAT AAGTCCAGAGAGCGTGGGAGGAC 125 137 131

T1198->C (М235Т) AS-235-WT AS-235-MT 23S-F JOE - CCTGCTGTCCACACTGGCTCCAA JOE - ATCGCTCTAACAGGTGCTGTCCACACTGGCTCCGG CAATCCTGGGTGTTCCTTGGAAG 174 187 180

G(-6)-»A AS-G6A-WT4 AS-G6A-MT3 G6A-F3 JOE - AGTACCCAGAAC AACGGCAGCTTCTTCCATC JOE - GTAGTATAGGAGACCCAGAACAACGGCAGCTTCTTCCACT CTCTGTTCAGCAGTGAAACTCTGCATCG 236 245 239 95 °С - 12 мин, 30 циклов: 94°С — 40 сек, 58°С — 30 сек, (65'С-ЗОсек, в случае мутации G2046T), 72'С-ЗОсек; 72*С - 5 мин

ER Т938->С (/•vail) AS-Pvu-WT AS-Pvu-MT Pvu-F JOE - AEAGTTCCAAATGTCCCAGAT JOE - ATTTTCCTATAATGAGTTCCAAATGTCCCAGGC TTTTGCAGGAATATACAATTAT 125 137 131

A984->G (Xbal) AS-Xbal-WT AS- Xbal-MT Xbal-F JOE - TGCAATGCTCATCCCAACTAT JOE - AAATTCACAGATACCAATGCTCATCCCAACTGC ACTGATATCCAGGGTTATGTGG 174 186 180

COL1A1 G2046-»T AS-COL-WT AS-COL-MT COL-R JOE - GGACCCCACCTGCCCAGGGAATTG JOE - TAATAAGAATTTCCACCCCACCTGCCCAGGGAATCT GAAATAAAAACCACAGGGTGAGAGGGGG 173 185 180

Примечание:- два верхних праймера - аллель-специфические, нижний - общий праймер;2> - верхнее значение - размер ПЦР-продукта, образующегося в результате реакции с прайм ерами АБ-(М)- УГТ (где И- уникальное для каждой мутации обозначение) и общего, среднее значение - в реакции с прайм ерами АЭ-(Ы)-МТ и общего, нижнее значение - размер соответствующего маркера длины. Жирным шрифтом в последовательностях прайм еров обозначены нуклеотиды, соответствующие «нормальному» или «мутантному» нуклеотиду ДНК-матрицы, подчеркиванием выделены нуклеотиды, некомплементарные ДНК-матрице.

Генетический анализатор «Мультиген» основан на оригинальной оптической схеме, защищен патентом на изобретение (Шилов И А. и др, 2000), и рекомендован для применения в медицинской практике Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ. Поскольку прибор «Мультиген» позволяет осуществлять флуоресцентную детекцию фрагментов ДНК в диапазоне от 550 до 615 нм, для анализа продуктов АС-ПЦР была использована «двухцветная» детекция на основе коммерчески доступных красителей JOE (для мечения продуктов ПЦР, Табл. 2) и ROX (для мечения маркеров длины)

Рис. 5. Электрофореграммы разделения продуктов АС-ПЦР, полученных при анализе полиморфизма Т1198С в гене AGT, с помощью КЭ Каналы регистрации ПЦР-продукгов и маркеров длины (обозначены стрелками) представлены отдельно На верхних электро-фореграммах представлены пики, образуемые маркерами длины, размер которых составляет 131 пн, 180 пи и 239 пн На нижних - пики, соответствующие анализируемым продуктам АС-ПЦР. А. Разделение продуктов, полученных при анализе ДНК гомозиготной по аллелю 1198Т гена AGT (длина продукта -174 пн) Б. Анализ ДНК гомозиготной по аллелю 1198С (длина продукта - 187 пн) В. Анализ ДНК, гетерозиготной по полиморфизмуТ1198С(длинапродуктов-174пн и187пн)

На рис 5 представлена электрофореграмма разделения продуктов АС-ПЦР, полученных при анализе полиморфизма Т1198—»C в гене AGT с помощью КЭ.

В случае ДНК гомозиготной по аллелю 1198Т наблюдается один пик, соответствующий ПЦР-продукту длиной 174 п н , расположенный слева от маркера длины размером 180 п.н (рис 5, А). В случае ДНК гомозиготной по аллелю 1198С пик соответствующего ПЦР-продукта (187 п н) наблюдается справа от маркера длины (рис. 5, Б). Пики обоих ПЦР-продукгов (174 п.н. и 187 п.н.) наблюдаются по обе стороны от маркера длины в случае ДНК гетерозиготной по данному аллелю (рис. 5, В)

При разработке систем для детекции мутаций в генах МТГФР, факторов II и V свертываемости крови человека в рамках данной работы также была предпринята попытка создания диагностикума на основе мультиплексной ПЦР, предполагающего одновременный анализ нескольких полиморфизмов. Для всех трех полиморфных маркеров были подобраны праймеры, имеющие одинаковую температуру отжига (Табл. 2).

L . А ! . 1 ' ц

_А. J-.....................................^ : |

24 26 2i 31» 32 34 16 » ♦ 4

18 20 12 24 2b 2S <0 Ii 41 36 18 40

ili AL : A i 1 1

! П i 1

IS Ю 32

Нремя diiajliHd. чип

«mlwJrmtrnUm rrfrr ',»>1 M

□ZU

-ДЛ.

uLi

JLJJA-J

Время анлчша. мин

Ряс. 6. Электрофореграммы одновременного разделения продуктов двух и трех различных АС-ПЦР в одном капилляре. Каналы регистрации ПЦР-продуктов и маркеров длины (обозначены стрелками) представлены отдельно На верхних электрофоре-граммах представлены пики, образуемые маркерами длины, размер которых соответствует 131 пн„ 180 пи и 239 пн На нижних - пики, соответствующие анализируемым продуктам АС-ПЦР. А. Разделение ПЦР-продуктов, полученных при анализе ДНК гетерозиготной по мутации С677Т гена МТГФР (длина продуктов - 125 пн и 138 пн), гомозиготной по

20210G аллелю гена фактора II (длина продукта -174 п н.) и гетерозиготной по мутации Leiden гена фактора V свертываемости крови (длина продуктов - 233 пни 245 п н ) Б. Анализ гетерозиготы по полиморфизму G45082A гена VDR (длина продуктов -125 пн и137пн)и гомозиготы по аллелю 2046Т гена COLIA1 (длина продукта - 185 п н ) В. Анализ гомозиготы по аллелю 938С гена ER (длина продукта - 137 п н ) и гетерозиготы по полиморфизму A984G гена ER (длина продуктов - 174 пни 186 пн)

Тем не менее, оказалось, что проведение в одной пробирке шести разных реакций не приводит к получению достоверно воспроизводимых результатов Поэтому более надежной является такая стратегия детекции нескольких мутаций, при которой АС-ПЦР для каждой мутации проводится отдельно, а уже анализ продуктов нескольких АС-ПЦР может проводиться в одном капилляре

На рис 6 приведены данные электрофореза при анализе в одном капилляре продуктов, полученных в результате двух или трех различных АС-ПЦР и смешанных перед нанесением на гель. На рис 6, А представлена электрофореграмма, полученная при анализе ДНК, гетерозиготной по мутации С677Т гена МТГФР, гомозиготной по 20210G аллелю гена фактора II и гетерозиготной по мутации Leiden гена фактора V свертываемости крови. В этом случае наблюдаются два пика (125 п н и 138 п.н.), расположенные по обе стороны от маркера длины, размером 131 п.н.; один пик, соответствующий продукту реакции длиной 174пн. и расположенный слева от маркера длины размером 180п.н., а также два пика (233 п.н. и 245 п.н.), расположенных по обе стороны от маркера, длиной 239 п н., соответственно. Электрофореграммы разделения в одном капилляре продуктов ПЦР, полученных при анализе по одному полиморфизму в генах COLI AI и VDR, а также двух полиморфизмов в гене ER представлены на рис. 6, Б и В, соответственно.

Результаты анализа нуклеотидных замен с помощью разработанных систем были выборочно подтверждены методом прямого секвенирования предварительно амплифицированных фрагментов ДНК, содержащих области с предполагаемыми мутациями, что свидетельствует о надежности разработанных систем.

2.2.3. Концепция создания наборов реагентов для детекции точечных мутаций.

Конечным продуктом разрабатываемой технологии, который будет использоваться в клинической практике, является набор реагентов для детекции конкретной мутации Такой набор должен включать в свой состав все реагенты, необходимые для проведения анализа по единой технологической схеме, начиная от реагентов для выделения ДНК, заканчивая реагентами для детекции (в данном случае, специальными маркерами длины) и подробную инструкцию по эксплуатации набора реагентов.

Используемая в ПЦР ДНК-матрица не должна содержать примесей (белков, полисахаридов и низкомолекулярных веществ), способных ингибировать действие ДНК-полимеразы, поскольку их наличие может приводить к неоднозначным и трудно интерпретируемым результатам В случае АС-ПЦР, где праймеры содержат некомплементарные матрице нуклеотиды, требования к качеству препарата амплифицируемой ДНК возрастают. Поэтому, в настоящей работе было уделено отдельное внимание выбору оптимального способа выделения ДНК.

Для методов, основанных на ПЦР, особое значение имеет качество фермента -термостабильной ДНК-полимеразы, качество других реагентов для амплификации ДНК и хорошая «подобранность» всех компонентов набора. В процессе выполнения работы для каждой системы потребовался индивидуальный дизайн аллель-специфических праймеров, подбор оптимального фермента, условий амплификации и т.п. Кроме того, для удобства использования наборов в клинической практике реакции по разным системам оптимизировали так, чтобы было возможно проводить анализ нескольких мутаций одновременно, используя единую программу амплификации (Табл. 2).

В случае диагностических систем также очень важно иметь внутренний контроль, чтобы исключить ложноотрицательные результаты Например, можно в одной пробирке с аллель-специфической ПЦР проводить амплификацию какого-либо фрагмента другого гена (РаЦизИеу Ы. е1. а1., 1998). Этот дополнительный амплификат и является внутренним контролем. Его отсутствие свидетельствует о том, что условия реакции не являются подходящими для проведения АС-ПЦР. Недостаток такого внутреннего контроля может заключаться в том, что его синтез иногда может мешать протеканию АС-ПЦР. Преимуществом проведения реакции с тремя праймерами (рис 4) является то, что при этом

использования такого специального внутреннего контроля не требуется. В качестве внутренних контролей будут выступать сами аллель-специфические продукты' образование одного из них обязательно произойдет, если условия реакции соблюдаются.

Таким образом, результатом этого этапа исследований явилось создание надежной технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК, адаптированной для использования в клинической практике

К преимуществам разработанной технологии можно отнести

• генотипирование в одну стадию, исключающее пост-реакционную обработку ПЦР-продуктов,

• возможность детекции всех типов нуклеотидных замен и получение информации не только об их наличии в ДНК, но также и об их гомо- или гетерозиготности;

• высокую производительность и быстроту выполнения анализа за счет использования автоматических анализаторов ДНК,

• надежность и наличие внутреннего положительного контроля за счет того, что во время АС-ПЦР в одной пробирке протекают сразу две реакции, при этом одна из них должна пройти обязательно;

• однозначность интерпретации результатов анализа за счет использования маркера длины, расположенного между двумя возможными продуктами амплификации

На основе разработанной технологии было создано три набора реагентов: для выявления мутации Gl691А (Leiden) в гене фактора V системы свертываемости крови методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции для определения генотипа пациентов по Ф5 (АСП-Ф5Л), для выявления мутации G20210 в гене протромбина человека методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции для определения генотипа пациентов по протромбину (АСП-ПР), а также для выявления мутации С677Т в гене метилентетрагидрофалатредуктазы человека методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции для определения генотипа пациентов по МТГФР (АСП-МТГФР) К настоящему времени завершены государственные медицинские испытания данных наборов Инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ

2.3. Концепция стандартизации технологии молекулярно-генетической идентификации

личности.

Анализ индивидуальных генетических отличий людей представляет собой самый совершенный и точный способ идентификации личности на сегодняшний день. Для

проведения такого рода анализа достаточно следовых количеств любого биологического материала - крови, слюны, фрагмента ткани, волос. В процессе анализа исследуют специальные изменчивые участки ДНК (мини- и микросателлитные локусы, содержащие различное количество повторяющихся нуклеотидных последовательностей), определенная комбинация которых, своего рода «генетический паспорт», является уникальной характеристикой каждого человека.

Традиционный способ анализа ДНК при выполнении генетической экспертизы включает несколько последовательных стадий

• выделение ДНК из исследуемого биологического материала,

• проведение амплификации специфических участков генома, содержащих различное число тандемных повторов,

• разделение амплифицированных фрагментов ДНК с помощью электрофореза в полиакриламидном геле;

• окрашивание геля с целью визуализации фрагментов ДНК;

• интерпретацию результатов путем сопоставления ПЦР-фрагментов с соответствующим стандартом длины (аллельной лестницей)

Качество выполнения каждой стадии работы определяет конечный результат анализа. Особое внимание следует обратить на то, что достоверность анализа во многом определяется качеством стандарта длины, применяемого для идентификации аллелей.

Большую опасность в плане ложного генотипирования представляет использование в качестве маркеров для идентификации аллелей так называемых гетерологичных полинуклеотидов - фрагментов ДНК, соответствующих по длине, но не соответствующих по нуклеотидной последовательности истинным аллелям данного локуса Дело в том, что при определенных условиях фрагменты ДНК одинаковой длины, но с различной нуклеотидной последовательностью имеют разную конформацию и, соответственно, с разной скоростью движутся в геле под действием электрического поля. Даже при использовании «гомологичных» аллельных лестниц в некоторых случаях незначительные различия, выражающиеся в наличии точечных мутаций или полиморфизмов в анализируемых фрагментах ДНК, могут оказывать влияние на подвижность в геле На рис. 7, А приведен результат разделения в 6 %-ном неденатурирующем ПААГ смеси фрагментов ДНК, соответствующих аллелям локуса Р13А01. Фрагменты, соответствующие аллелям 5, 9 и 13, имеющие однонуклеотидные замены в области тетрануклеотидных повторов, как было показано при секвенировании этих фрагментов (рис 7, В), характеризуются аномальной подвижностью при электрофорезе. Это выражается в неравномерности аллельной лестницы

и а смещении «мутангного» фрагмента ДНК аллельноЙ лестницы, соответствующего аллелю 5. относительно «нормального» фрагмента ДНК, соответствующего аллелю 5 анализируемого образна.

Ам

* I» » *» и»

т* 1(тгвт'*е1I

ШМА

и л 1:4 14 ... ..

Рис, 7. Примеры аномальной подвижности гомологичных фрагментов ДНК при различных условиях электрофореза. Л. Элпттрофорсти^сское Га щелздэж тлплифищтргаатт&х фрагметпов Д^К (дорожка I) и гомологичного аллельного маркера (дорожка 2) локуса Р13А01 и 6 %-иом : IА АI и не денатурирующих условиях (окраска бромистым этидием). В дорожке ! стрелкой обозначен фрагмент ДНК ,'шиной 127 п.и., соответствующий аллелю 5. В дорожке 2 стрелками отмечены фрагменты ДНК с аномальной подвижность«! из-за имеющихся в их составе нуклеотилных замен. Эти фрагменты соответствуют аллелям 5 (127 П.Н.). 9 (143 1111 и 13 (159 п.н,), Б. Электрофоретическое разделение амнлифицированньР( фрагментов ДНК (дорожка !) и гомологичного аллельпого маркера (дорожка 2) локуса КIЗА01 в денатурирующих условиях (окраска серебром). В. Результаты секвенирования областей тетрануклеотидпых повторов аллеля 5 (с аномальной подвижностью) из аллельной лестницы (дорожка 2) И нормального аллеля 5 (дорожка I). Однонуклеотилная замена Т—»С отмечена стрелкой

Однако эти различия в подвижности практически нивелируются при проведении электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 7, В). Следует отметить, что при этом также существенно снижается время, затрачиваемое на проведение электрофореза и. соответственно, общее время на проведение экспертизы.

Поэтому основным принципом стандартизации технологии молекулярко-генстичсского анализа для идентификации личности является необходимость проведения анализа но единой гели «логической схеме. основанной ¡1а использовании сертифицированных реагентов для всех стадий от одного производителя на рекомендуемом им оборудовании и в рекомендуемых им условиях.

Создание наборов реагентов для молекулярно-генетической идентификации личности - сложный технологический процесс, при котором следует учитынать целый ряд условий, невыполнение которых может привести к получению инструмента, не способного обеспечить получение правильного результата. Поэтому разработка и производство наборов реагентов, соответствующих необходимым требованиям, могуг быть осуществлены только в

специализированных лабораториях, имеющих необходимый опыт работы и подходящую производственную базу

Наборы реагентов для проведения молекулярно-генетических экспертных исследований с использованием технологии анализа ПДАФ (Иванов ПЛ., 1999), должны удовлетворять следующим требованиям.

• включать в свой состав все реагенты, необходимые для проведения анализа по единой технологической схеме, начиная от реагентов для выделения ДНК и заканчивая реагентами для выявления фрагментов ДНК в геле,

• обеспечивать высокую чувствительность и специфичность;

• быть удобными в использовании.

Как уже отмечалось ранее, особое значение имеет взаимная «подгонка» всех компонентов набора. Все компоненты должны быть соответствующим образом протестированы как по отдельности, так и в составе набора, с тем, чтобы обеспечивать необходимый уровень чувствительности и специфичности в течение всего срока годности набора реагентов Для повышения удобства работы с наборами могут быть использованы особые технические приемы, например, разработка аллельных маркеров со специфическим набором фрагментов. Для таких аллельных лестниц характерно отсутствие одного или нескольких фрагментов ДНК, соответствующих определенньм аллелям. Наличие такого «гэпа» облегчает интерпретацию результатов и позволяет избежать возможных ошибок при идентификации аллелей в исследуемых образцах. Необходимо, чтобы используемый аллельный маркер был гомологичен анализируемой ДНК, т е чтобы маркерные фрагменты ДНК аллельной лестницы точно соответствовали аллелям анализируемого локуса не только по длине, но и по нуклеотидной последовательности. Только при этом условии можно добиться однозначного соответствия подвижности фрагментов, получаемых при амплификации анализируемой матричной ДНК и фрагментов аллельной лестницы

При анализе следовых количеств биологического материала, что является стандартной практикой при производстве судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз, особенно важна высокая чувствительность Применение специальных термостабильных ДНК-полимераз со встроенным «горячим стартом» для ПЦР и тщательный подбор условий реакции позволяют повысить чувствительность, а также избежать появления дополнительных артефактных полос на геле при амплификации «проблемных» локусов.

Этой же цели - получению надежных и достоверных результатов - служит проведение электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, поскольку при этом нивелируется влияние на электрофоретическую подвижность в геле различий во вторичной

структуре анализируемых полинуклеотидов, возможных мутаций и полиморфизмов (рис. 7). Предпочтительно также комплектовать наборы реагентами, которые обеспечивают выявление фрагментов ДНК после проведения электрофореза путем прокраски геля серебром. Этот способ визуализации фрагментов ДНК существенно повышает чувствительность анализа по сравнению с прокраской бромистым этидием.

Существенно облегчить интерпретацию результатов и, в целом, повысить эффективность и надежность судебно-экспертного типирования ДНК, можно за счет уменьшения длины анализируемых фрагментов Это достигается путем разработки новых праймерных пар для анализируемых локусов. Дело в том, что в случае относительно длинных полинуклеотидов - длиной более 250 п.н, для хорошего разделения фрагментов ДНК и, соответственно, получения достоверных результатов генотипирования, необходимо значительно увеличивать время электрофореза Это увеличивает общее время анализа и не всегда хорошо сказывается на качестве получаемой картины разделения фрагментов ДНК Кроме того, уменьшение размера амплифицируемых фрагментов важно с точки зрения получения хороших результатов при анализе образцов, содержащих деградированную ДНК. Оптимальным представляется диапазон размеров анализируемых фрагментов ДНК от 100 до 250 п.н.

Следует отметить, что к настоящему времени для экспертных целей разработано несколько десятков молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе микросателлитных локусов Во многих странах мира разработаны стандартные наборы локусов, которые должны подвергаться анализу при производстве молекулярно-гентических экспертиз. В США это система CODIS (Combined DNA Indexing System), в которую включено 13 микросателлитных локусов, в Европе рабочей группой ENFSI (European Network of Forensic Science Institutes) отобрано 7 микросателлитных локусов, в Латинской Америке GITAD (Grupo Iberoamericano de Trabajo en Análisis de DNA) выбрано 6 микросателлитных локусов, а Интерпол установил набор из четырех микросателлитных локусов в качестве пан-Европейского стандарта (Табл. 3).

Выбор именно таких локусов обусловлен тем, что они находятся на разных хромосомах (Табл. 3), наследуются независимо и, кроме того, благодаря популяционным исследованиям, проводимым в различных странах на протяжении последних лет, охарактеризовано аллельное разнообразие данных локусов

Учитывая важность этой группы локусов для судебно-медицинских экспертных исследований, на основе разработанных выше требований в рамках данной работы были созданы наборы реагентов для идентификации личности CTWA (на основе анализа локусов

Табл. 3. Михросателлитные лохусы, использующиеся при производстве молекулярно-генетических экспертиз в различных странах мира, а также выпускаемые фирмой Ргоп^а (США)

Promega (США) CODIS ENFSI Interpol CITAD Хромосомная локализация

CSF1PO CSF1PO CSF1PO 5q33.3-34

FGA FGA FGA FGA TH01 4q28

ТН01 TH01 TH01 TH01 llpl5-15.5

ТРОХ TPOX TPOX 2p23-2pter

vWA vWA vWA vWA 12pl2-pter

D3S1358 D3S1358 D3S1358 3p21

D5S818 D5S818 5q21-q31

D7S820 D7S820 D7S820 7q

D8S1179 D8S1179 D8S1179 D13S317 8

D13S317 D13S317 13q22-q31

D16S539 D16S539 D16S539 16q22-24

D18S51 D18S51 D18S51 18q21 3

D21S11 D21S11 D21S11 D21S11 21qll-q21

F13A01 6p24-25

LPL 8p22

FESFPS 15q25-qter

F13B Iq31-q32 1

протоонкогена рецептора CSF-1 (CSF1PO), интрона 10 гена тироид пероксидазы (ТРОХ), фактора VIII коагуляции (vWA) и амелогенина (Amel) геномной ДНК человека) и FFTL (на основе анализа локусов протоонкогена c-FES/FPS (FESFPS), гена (З-субьединицы фактора XIII коагуляции (F13B), интрона 1 гена тирозингидроксилазы (ТН01) и интрона 6 гена липопротеинлипазы (LPL) геномной ДНК человека) В настоящее время эти наборы реагентов зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники

2.4. Разработка и стандартизация технологий генотипирования растений.

В настоящее время все большее применение получают методы анализа генетического полиморфизма растений. Применение ДНК-технологий открывает новые возможности для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как поддержание генетических коллекций, подбор родительских пар при скрещивании, составление родословных, контроль интрогрессии генетического материала, паспортизация и сертификация сортов, защита интеллектуальной собственности, картирование и клонирование генов хозяйственно ценных признаков, а также в исследовании организации и эволюции геномов

Наиболее перспективным методом различения и идентификации генотипов является анализ полиморфизма микросателлитов, или простых повторяющихся последовательностей

(SSR - simple sequence repeats), позволяющий получать воспроизводимые информативные профили известных фрагментов генома В основе этого метода анализа лежит полиморфизм длин микросателлитных локусов, выявляемый посредством ПЦР с использованием пар праймеров, фланкирующих области коротких тандемных повторов. Следует отметить, что в отличие от генома человека геномы растений являются гораздо менее изученными И, если микросателлитные локусы, по которым проводится молекулярно-генетический анализ идентификации личности, на сегодняшний день, в основном, определены (Табл 3), то соответствующие технологии различения и идентификации растений требуют отдельной разработки для каждой группы объектов

2.4.1. Исследование межвидовой и внутривидовой вариабельности растений рода Solanum методом микросателлитного анализа.

При выборе праймеров для исследования полиморфизма микросателлитных локусов растений Solanum учитывались следующие критерии. Во-первых, диапазон длин амплифицируемых фрагментов генома исследуемого объекта, содержащего микросателлитные последовательности, должен составлять от 100 до 300 пн Поскольку различие длин аллелей микросателлитного локуса определяется числом повторяющихся единиц, представляющих собой ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклеотиды, то с помощью высокоразрешающего электрофореза ПЦР-фрагменты, отличающиеся всего на несколько нуклеотидов, разделяются надежнее, если они имеют не очень большую длину. Во-вторых, при выборе праймеров большое значение представляют сведения о количестве аллелей и природе повторяющихся единиц, содержащихся внутри того или иного микросателлитного локуса.

На основании литературных данных (Milbourne D. et al 1998; Ashkenazi V. et al 2001, McGregor C.E. et al 2000) было проанализировано около 200 пар праймеров к микросателлитным локусам, после чего для генотипирования представителей рода Solanum было выбрано 30 пар праймеров.

С помощью метода микросателлитного анализа в работе было проанализировано 6 клубненосных видов Solanum (5 kurtzianum, S stoloruferum, S chacoense, S bulbocastanum, S. demissum и S tuberosum) и один бесклубневый вид (S. lycopersicoides). На рис. 8 представлены элекгрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 %-ном полиакриламидном геле, полученных с четырех пар праймеров (РОТ 47-48, STIIKA, STS 1-2 и STM0031), выявляющих в сумме от 6 до 12 аллельных вариантов для исследуемых микросателлитных локусов картофеля

Рис. 8. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в В % -ном полиакриламидном геле, полученных с праймеров РОТ 41АЧ (А), STIIKA (Б), STS 1-2 (В) и STM0031 (Г) В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений S lycopersicoides

(2), S kurtzianum PI 472923

(3), S chacoense PI 133713 (4), S stolomferum PI 255532 (5), S demissum PI 498012 (6), 5 bulbocastanum Sbk (7), S tuberosum 78563-76 (8). (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках) Дорожка 1 маркер молекулярной массы.

Анализ представленных на рис. 8 данных показывает, что с помощью ряда праймеров к микросателлитным локусам картофеля можно получать уникальные для каждого образца ДНК-профили. В целом, совокупный генетический профиль, полученный в результате анализа нескольких локусов, позволяет надежно различать клубненосные и неклубненосные формы Solanum

Следующим этапом работы было исследование уровня генетического полиморфизма внутри видов Solanum Для проведения анализа использовали два североамериканских вида. S stolomferum, S demissum, и один южноамериканский вид S chacoense. На рис. 9 представлены генетические профили 5-6 представителей каждого вида, полученные с пар праймеров РОТ 81-82 и STM0019 Как видно из представленных на рис 9 электрофореграмм, внутри каждого локуса все три вида Solanum имеют свои уникальные микросателлитные профили, однако, отдельные растения каждого вида обладают низким уровнем полиморфизма, что может свидетельствовать о том, что внутри того или иного локуса разные виды Solanum проявляют различный уровень генетического разнообразия Так, например, внутри локуса РОТ 81-82 (рис 9, А) все 6 растений 5 stolomferum имеют идентичный микросателлитный профиль; среди 5 растений S demissum только S demissum CGN 17805 (рис. 9, A, дорожка 17) имеет отличный от остальных растений ДНК-профиль; наибольший полиморфизм проявляют растения южноамериканского вида

5 скасос'ш-е, среди которых 5 из 6 анализируемых генотипов имеют уникальные ДНК-профили; неразличимы только генотипы 5 сИасоепяе Р1 189219 и 5. сИасоете Р[ 133713 (рис.9, А, дорожки 8 и 9). Внутри локуса БТМ 0019 (рис 9, Б) формы 5 .чЮ/от/етт проявляют больший (по сравнению с локусом РОТ 81-82) полиморфизм

S uttlamfcruui

Н h

ч ь

g » I« 11 12 13 14 15 И 17 U

Рис. 9. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламид-ном геле, полученных с праймеров РОТ 81-82 (А) и STM0019 (Б) В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений S stoloniferum PI 230490 (2), S stolomferum Р1 255532 (3), S stolomferum CGN 18348 (4), 5 stolomferum CGN 23072 (5), S stolomferum 513 (6), S stolomferum 590 (7), S chacoense PI 189219 (8), S chacoense PI 133713 (9), S chacoense PI 472828 (10), S chacoense PI 472810 (11), S chacoense CGN 20583 (12), S chacoense 135 (13), S demissum Pl 161715 (14), S demissum PI 205514 (15), 5 demissum PI 498012 (16), 5 demissum CGN 17805 (17), 5 demissum 253(18) (Соответствующие дорожки электрофореграммы указаны в скобках) Дорожка 1 - маркер молекулярной массы

В результате проведенных экспериментальных исследований были отобраны 20 пар праймеров (Табл. 4), являющихся перспективными для идентификации растений рода Solanum

2.4.2. Исследование полиморфизма генома картофеля методом микросателлитного

анализа.

В данной работе для исследования полиморфизма нетранслируемых последовательностей генома картофеля были использованы сорта отечественной и зарубежной селекции. Технология анализа микросателлитных последовательностей генома картофеля позволяет различать сорта по ряду микросателлитных локусов, причем перечень этих локусов не универсален и варьирует в зависимости от характера и количества анализируемых генотипов Внутри одного и того же локуса для определенной выборки

Ill 11 12 13 14 15 16 17 I» 19 21» 21 22 23 24 25 2« 27 28 29 30

Рис. 10. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламидном геле, полученных с помощью праймеров STM 2005. В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений Скороплодный (2), Брянский ранний (3), Эффект (4), Голубизна (5), Ресурс (6), Никулинский (7), Белоснежка (8), Жуковский ранний (9), Atlantic (10), Ильинский (11), Луговской (12), Удача (13), Синецвет (14), Лукьяновский (15), Петербургский (16), Невский (17), Kameraz (18), Смена-20 (19), Saturna (20), Desiree (21), Romano (22), Katahdin (23), Russet Burbank (24), Kennebec (25), Wauseon (26), Lady Rosetta (27), Maris Piper (28), Альтаир (29), Аксамит (30). В скобках указаны соответствующие дорожки электрофореграммы. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

1 2 3 4 5 * 7 а 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 21 23 24 25

25* пл.

2Мпл.

15» иь

Рис. 11. Электрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламидном геле, полученных с помощью праймеров РОТ 4748. В качестве матриц дня ПЦР использовали образцы ДНК растений Olev (2), Агрономический (3), Aquila (4), Jubel (5), Приекульский ранний (б), Смена-20 (7), Kameraz (8), Голубизна (9), Осень (10), 128-6 (11), Эффект (12), Раменский (13), Скороплодный (14), Anoka (15), Удача (16), Брянский ранний (17), Березка (18), Atlantic (19), Wauseon (20), Katahdin (21), Kennebec (22), Superior (23), Альтаир (24), Аксамит (25). В скобках указаны соответствующие дорожки электрофореграммы. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.

генотипов можно получить микросателлитные профили, позволяющие различать либо всю панель исследуемых генотипов, либо часть представленных образцов растений

Таким образом, можно говорить о том, что выбор информативного локуса для генотипирования образцов методом микросателлитного анализа во многом зависит от характера и представительности выборки генотипов для проведения подобного эксперимента На рис. 10 представлены микросателлитные профили сортов картофеля, обнаруженные для локуса STM2005. Как видно, внутри локуса STM2005 (рис 10) можно наблюдать наличие 7 различных генетических профилей анализируемых сортов, среди которых 2 являются уникальными: сорт Никулинский и Kennebec (дорожки 7 и 25).

Специального внимания заслуживает задача генотипирования близкородственных сортов картофеля методом анализа микросателлитных последовательностей. В качестве примера на рис. 11 приведен анализ генетических профилей ряда близкородственных сортов по локусу РОТ 47-48. Как видно из рис 11, практически все представленные генетические профили имеют сложный и схожий набор аллелей. Среди анализируемых образцов ДНК имеются 2 пары генотипов: сорт Голубизна (Гатчинский G128-6) и Осень (Granóla □ 128-6) (дорожки 9 и 10); сорт Скороплодный (128-6 □ Anoka) и Удача (Vilnia □ Anoka) (дорожки 14 и 16), в селекции которых участвовали родительские формы, среди которых одна была общая (генотипы выделены жирным шрифтом) Как видно из электрофореграмм генотипы сортов можно различать между собой внутри каждой полусестринской пары

Еще более сложной, но крайне необходимой и важной задачей в селекции растений является различение и идентификация растений, полученных в результате скрещивания одних и тех же родительских форм, получивших статус сорта В рамках данной работы был проведен анализ сортов белорусской селекции, являющихся сестринскими линиями: Аксамит (Добро □ 77540-57) и Альтаир (Добро □ 77540-57) Генотипы сортов Аксамит и Альтаир по ряду локусов имеют различный набор аллелей, что позволяет надежно различать два растения.

Таким образом, разработанная система генотипирования растений рода Solanum на основании использования 20 пар праймеров (Табл 4), позволяет различать известные генотипы между собой (включая близкородственные сорта)

2.4.3. Микросателлитный анализ видов и разновидностей Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae.

Семейство Brassicaceae (Капустные) насчитывает 350 родов и около 3500 видов Экономическую ценность семейства главным образом определяет род Brassica (Капуста)

Табл. 4. Микросателлитные локусы и соответствующие праймеры для генотипирования растений рода Solanum.

№ Название праймера Последовательности праймеров 5' —* У 'С Диапазон длин ПЦР-фрагментов, п.н. Мотив Количество обнаруженных аллелей

I STIIKA F-TTCGTTGCTTACCTACTA R-CCCAAGATTACCACATTC 45 100-250 М<*)р 12

2 STS 1-2 F-TCTCTTGACACGTGTCACTGAAAC R-TCACCGATTACAGTAGGCAAGAGA 50 200-270 (<atc)n 9

3 ТОМ 8-9 F-GCATTGATTGAACTTCATTCTCGT R-ATTTTTGTCCACACCAACTAACCG 56 120-170 (alt). 8

РОТ 47-48 F-AACATTACAACACATTAGCA R-AACTTATCTGAAACTCTCGT 45 150-270 6

5 РОТ 83-84 F-GGGACATCACAGTCT R-GGTGCTCCTATTGGTG 42 100-200 (tg). 6

6 ST 15-16 F-AATTCATGTTTGCGGTACGTC R-ATGCAGAAAGATGTCAAAATTGA 52 200-300 (aag)„ 5

7 РОТ 53-54 F-GCAAAATACAGGCTCCATAG R-TTCTCAACAACTTCCCATCC 55 150-250 (ctX,(ca)m 4

8 РОТ 57-58 F-TTGCGTGAAGCAGCCGTAAA R-GCCCAGTAAGTAAAACATTG 55 100-200 (tg). 6

9 РОТ 81-82 F-ATAAACCGCATGAGAAGC R-ATGGGATAGATTTGTTAG 48 50-170 (ag).(gt)„(ag)p 8

10 ST5-6 F-CTTGCAACTTGTTAGTACCCCC R-AAATCCTTTGTGACCTCCCC 55 100-200 (teMtaK 4

11 STM0031 F-CATACGCACGCACGTACAC R-TTCAACCTATCATTTTGTGÄGTCG 54 50-200 (acV (ac)m(gcac) (ac)p(gcac)q 8

12 STM 1005 F-ATGCCTCTTACGAATAACTCGG R-CAGCTAACGTGGTTGGGG 55 150-200 (gta)„ 3

13 STM1016 F-TTCTGATTTCATGCATGTTTCC R-ATGCTTGCCATGTGATGTGT 55 200-300 (•«)„ 9

14 STM 1019 F-TAGATTTTATTATTCCCAACAAGCA R-CAACTACCTTCTCCCCACATAG 55 200-250 (atc)„ 4

15 STM0019 F-AATAGGTGTACTGACTCTCAATG R-TTGAAGTAAAAGTCCTAGTATGTG 46 70-150 (atWgt)o.(at)p(gt)4(gcMgt). 9

16 STM 1057 F-TTATGTTTCGGTTAAAATGTA R-AAATTAAATGGAAGACAACC 47 100-150 (aaat). 5

17 STM 1097 F-TGATTTAGTTGCTTGTTTG R-GCTTTCGATCCTAATACACC 47 100-200 (cgttt). 4

18 STM 2005 F-TTTAAGTTCTCAGTTCTGCAGGG R-GTCATAACCTTTACCATTGCTGGG 55 150-200 («gttg)„ 3

19 STM2013 F-TTCGGAATTACCCTCTGCC R-AAAAAAAGAACGCGCACG 55 150-200 (teta). 4

20 STM 1105 F-AAACCTGCTACAAATAAGGC R-CAGAAATAATTGGAGGAGATG 52 70-150 (actc)„ 9

Естественный отбор в пределах рода Brassica привел к формированию большого морфологического разнообразия, на основе которого было создано многообразие выращиваемых по всему миру ценных масличных, овощных, пряных, кормовых и декоративных культур. Большинство культурных форм Brassica произошло от шести основных видов: В. napus (масличный рапс, брюква), В. гара (восточноазиатские капусты, сурепица, репа и турнепс), В. oleracea (кочанная, брюссельская и цветная капуста, брокколи, кольраби), fi juncea (горчица сарептская) В carinata (горчица эфиопская) и В mgra (горчица черная) Филогенетические взаимосвязи между этими видами хорошо описаны моделью так называемого «U-треугольника» (U, 1935) Согласно этой модели в результате естественной гибридизации трех диплоидных видов В. гара, В mgra, В oleracea, геномы которых условно обозначены как А, В, С возникли аллотетраплоидные формы В juncea (ААВВ), В napus (ААСС), В carinata (ВВСС). Таким образом, род Brassica представляет собой одну из удачных систем для исследования возможности применения метода микросателлитного анализа для оценки генетического разнообразия, установления филогенетических взаимосвязей и исследования интрогрессии генетического материала в результате межвидовой и межродовой гибридизации

За последние годы число публично доступных праймеров к микросателлитным локусам Brassica значительно увеличилось, однако уступает другим важным культурным видам В настоящий момент в международной базе данных Brassica Microsatellite Information Exchange представлено 628 пар праймеров к фланкирующим областям микросателлитных локусов В napus, В. гара, В mgra и В oleracea Следует отметить, что не все микросателлитные локусы эффективны для исследования межвидового и внутривидового генетического разнообразия, интрогрессии генов и филогенетических взаимосвязей. Некоторые из них являются мономорфными или выявляют незначительный полиморфизм

В данной работе выбор праймеров для исследования полиморфизма микросателлитов растений Brassica определялся, как уже отмечалось выше, длиной амплифицируемых фрагментов ДНК и количеством выявляемых аллелей. Из 459 пар праймеров для исследования полиморфизма микросателлитных локусов Brassica первоначально были отобраны 40 пар праймеров. Эти праймеры предварительно тестировали на возможность образования ПЦР-продуктов с использованием как обоих, так и только одного (прямого или обратного) праймера, чтобы исключить из исследования инвертированные последовательности

Следующим этапом данной работы являлось исследование возможности использования отобранных пар праймеров для анализа генетического разнообразия растений шести видов рода Brassica. В oleracea, В napus, В. гара, В juncea, В mgra и В. carinata, а

также родственных представителей семейства Brassicaceae - Sinapis alba (горчица белая), Raphanus sativus (редька, редис), Camehna sativa (рыжик посевной).

На рис. 12 в качестве примера представлены электрофореграммы разделения ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парами праймеров Nil0-D09, Nal2-А02, 0112-А04, демонстрирующие межвидовой и внутривидовой полиморфизм. По данным парам праймеров для каждого исследуемого вида выявлен определенный набор фрагментов, отличающий его от других видов. Пара праймеров Nal0-D09 (рис. 12, А) позволяет различать все шесть видов Brassica, а также обнаруживает небольшой внутривидовой полиморфизм у видов В mgra, В carmata и В. oleracea. Данная пара праймеров позволяет выявить фрагменты, специфичные для геномов А, В и С Электрофореграмма разделения ПЦР-фрагментов, полученных с пары праймеров Nal2-A02 (рис 12, Б) иллюстрирует яркий пример значительного внутривидового и межвидового полиморфизма С помощью данной пары праймеров можно выявить четыре зоны фрагментов с различной электрофоретической подвижностью, специфичные для генома А; четыре зоны, специфичные для генома В, и две зоны, специфичные для С-генома Внутривидовой полиморфизм, выявленный в результате амплификации праймеров 0112-А04 (рис. 12, В) у видов В napus, В. гара, В juncea и В oleracea, обусловлен полиморфизмом длин А- и С-геном-специфичных фрагментов.

В ходе данного исследования выяснилось, что полиморфизм длин микросателлитного локуса не всегда позволяет различать виды и отдельные формы Brassica, поскольку выявляемые по некоторым парам праймеров аллели не являются видо- или геном-специфичными и присутствуют у всех или нескольких видов Brassica При анализе с некоторыми парами праймеров, ПЦР-фрагменты детектировались не во всех образцах. В этих случаях наличие/отсутствие продукта определялось видовой принадлежностью.

По результатам проведенного микросателлитного анализа растений рода Brassica было отобрано 18 пар праймеров (Табл 5), позволяющих выявлять межвидовой и внутривидовой полиморфизм Данные пары праймеров позволяют выявлять фрагменты, специфичные для простых геномов А, В и С, которые кодоминантно сочетаются в тетраплоидных формах, а также фрагменты, общие для всех или нескольких видов треугольника U. Каждая пара праймеров позволяет выявлять в сумме от 4 до 19 аллелей у видов рода Brassica Диапазон длин получаемых фрагментов составляет от 80 до 320 п.н.

Существенным моментом в изучении интрогрессии генетического материала в результате межвидовых скрещиваний является универсальность (transferability) -консервативность праймеров для всех или нескольких видов Brassica, образующих треугольник U. Среди выбранных 18 пар праймеров 15 оказались универсальными, те. позволяли различать все шесть видов Brassica, одна пара (BRMS-043) - специфичной для

ААСС АА ААВВ ВВ ВВСС СС

В. парus В. rapa В. juncea В. nigra В. carina/a В. oleráceo

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2S 26 27 28 29 30 313233 34 35 36 37 38 39

Рис. 12. Межвидовой и внутривидовой полиморфизм растений рода Brassica. Пары праймеров А - NÍ10-D09, Б - Nal2-A02, В - 0112-А04. 1, 39 - маркер молекулярной массы. 2 - Sinapis alba 4232, В napus: 3 - Bnal-02, 4 - BnaVikros, 5 - BnaKhanna, 6 - BnaUral, 7 - Bnal0-02, 8 - Bnal4-02, В rapa• 9 - Brl 14, 10 - Brl07, 11 - Вг350, 12- Вг548557, 13 - Вг6832, 14 - Вг6818, В juncea 15 - Bj4588, 16 - Bj4594, 17 - Bj6615, 18 - Bj7154, 19 - Bjl5191, 20 - Bjl5193, В nigra- 21 - Bni6618,22 - Bni6619,23- Bni6620,24 - Bni6628,25 - Bni6634,26 - Bni6635, В carinóla 27 - Bc3946, 28 - Bc3950,29 - Вс3952,30 - Вс3976, 31 - Вс4025,32 - Вс4035, В. oleráceo: п/в botrytis: 33 - Bob699, п/в costata: 34 - Вос2218, п/в gemmifera: 35 - Bog6998, п/в capitata. 36 - Воса192,37 - Воса2432, 38 - Воса7022. Фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, обозначены разными стрелками

Табл. 5. Микросагеллитные локусы и соответствующие праймеры дом генотипирования видов и разновидностей Brassica.

№ Название араймеря Последовательности праймеров T отжига "С Диапазон длин ПЦР-фрагментов, п. в. Мотив Геном-специфичность Количество обнаруженных аллелей

1 Nal0-D09 F-AAGAACGTCAAGATCCTCTGC R-ACCACCACGGTAGTAGAGCG 49 150-170 (ОТ). ABC 6

2 Nal2-A02 F-AGCCTTGTTGCTTTTCAACG R-AGTGAATCGATGATCTCGCC 53 160-218 (CT). ABC 16

3 Nal2-F12 F-CGTTCTCACCTCCGATAAGC R-TCCGATGTAGAATCAGCAGC 55 170-190 (CCG). ABC 8

4 Ni2-B02 F-CGCTGCAATTATACGAAAGC R-CCTCATGCTCTCCAAAGACC 49 80-110 (GGC)„ ABC 14

5 Ni2-C12 F-ACATTCTTGGATCTTGATTCG R-AAAGGTCAAGTCCTTCCTTCG 49 112-150 (ОА). AC 6

6 Ni2-F02 F-TGCAACGAAAAAGGATCAGC R-TGCTAATTGAGCAATAGTGATTCC 49 165-190 (CT). ВС 8

7 Ni3-G04B F-ATACTCGGGATAGGTGTGCG R-CATGTGGCAATCCTACATTTAC 55 70-140 (AG). ABC 15

8 0112-A04 F-TGGGTAAGTAACTGTGGTGGC R-AGAGTTCGCATACTCTGGAGC 55 110-150 (CT). ABC 8

9 Ra2-E12 F-TGTCAGTGTGTCCACTTCGC R-AAGAGAAACCCAATAAAGTAGAACC 55 125-165 (GA). ABC 10

10 BRMS-006 F-TGGTGGCTTGAGATTAGTTC R-ACTCGAAGCCTAATGAAAAG 51 140-175 (GA). ABC 5

11 BRMS-036 F-GGTCCATTCCTTTTTGCATCTG R-CATGGCAAGGGGTAACAAACAT 55 125-165 (CA)„(GA)„ А 7

12 BRMS-042 F-GGATCAGTTATCTGCACCACAA R-TCGGAATTGGATAAGAATTCAA 48 81-136 (AATMCTJ^iCT). ABC 8

13 BRMS-042-2 F-AGCTCCCGACAGCAACAAAAGA R-TTCGCTTCCTTTTCTGGGAATG 55 205-235 (GA)„(CT)» А 8

14 BRMS-043 F-GCGATGTTTTTTCTTCAGTGTC R-TTAATCCCTACCCACAATTTCC 48 280-320 (АМШОТ). А ' 4

15 BRMS-046 F-TTGGCCTTGCTATTACGAGCTG R-ATGCGCAAACCCTAATTTTCAC 48 125-270 (GAWCA)m(GA)„ ABC 19

16 BRMS-050 F-AACTTTGCTTCCACTGATTTTT R-TTGCTTAACGCTAAATCCATAT 48 162-178 (АА1\(ТС)га(ТТС)п AB 9

17 BN6A2 F-CTTTGTGTGGACTTTTAGAACTTTA R-CGCAGCTTTTGGCCCACCTG 55 90-210 (GATT). ABC 6

18 BN83B1 F-GCCTTTCTTCACAACTGATAGCTAA R-TCAGGTGCCTCGTTGAGTTC 48 170-230 (GA)„(AAG)„ ABC 10

генома А, две (BRMS-006 и Ni2-F02) - для геномов А и С Двенадцать универсальных пар праймеров одновременно выявляют фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, у исследуемого спектра видов, что позволяет проследить распределение генетического материала у видов Brassica. Исследованные пары праймеров выявляют внутривидовой полиморфизм у большинства видов, образующих треугольник U. Три универсальные пары праймеров (Nal2-A02, Ni2-F02 и BRMS-046) обнаруживают полиморфизм у всех шести видов Brassica Для некоторых праймеров универсальность распространяется за пределы рода, что позволяет провести сравнительный анализ и оценить генетические расстояния между формами рода Brassica и такими отдаленными формами, как Sinapis, Raphanus и Camehna.

В данной работе в качестве моделей для исследования интрогрессии генетического материала также были использованы межродовой гибрид капусты (В. oleráceo) и редьки (R sativiis) - Raphanobrassica (RRCC) и межвидовой гибрид В Ccomposita (ААВВСС) (Монахос Г.Ф. и др., 2001), полученный в результате гибридизации В. carmata (ВВСС) и В rapa (АА) В геноме аллогексаплоида В □ composita по отобранным парам праймеров были выявлены фрагменты, специфичные для геномов А, В и С. В геноме аллотетраплоида Raphanobrassica с помощью большинства исследованных пар праймеров были выявлены фрагменты, специфичные для генома С (В oleráceo). Большинство отобранных праймеров оказались универсальными для рода Raphanus, что позволило идентифицировать в геноме Raphanobrassica характерные для этого рода фрагменты

Таким образом, разработанная система генотипирования на основании использования 18 пар праймеров (Табл. 5) позволяет надежно различать подвиды и разновидности растений рода Brassica, а также позволяет исследовать генетическое разнообразие представителей семейства Brassicaceae и устанавливать филогенетические взаимосвязи на родовом, видовом и внутривидовом уровне

2.4.4. Практическое применение метода микросателлитного анализа в селекции.

2.4.4.1. Различение близкородственных сортов рапса (В. napus).

Важное значение для селекции представляет различение близко родственных сортов растений ВНИПТИ рапса (г. Липецк) были предоставлены образцы 12 высокопродуктивных сортов ярового рапса (В napus), обладающих сходными морфологическими характеристиками, но различающихся по таким признакам как урожайность, содержание масла, эруковой кислоты и глюкозинолятов, устойчивость к фузариозу, полеганию и осыпанию. Поскольку проявление количественных признаков определяется сложным взаимодействием многих генов и в значительной степени зависит от условий выращивания

растений, различение и идентификация сортов по фенотипу представляются ненадежными. В связи с этим важное методологическое и практическое значение представляет исследование возможности применения технологии микросателпитного для различения близкородственных сортов на генетическом уровне.

1 2 3 4 * 6 7 8 9 1(1 11 12 13 14 15

НОп.н. 150 п. и.

11)0 п. и.

Рис. 13. Электрофореграммы разделения в 8 %-ном полиакриламидном геле ПЦР-фрагментов, полученных в результате амплификации с парами праймеров №12-А02 (А), 0112-А04 (Б), ВЯМБ-ОЗб (В), В1Ш8-043 (Г), N310-009 (Д), №2-Р02 (Е) В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК сортов рапса (В парих) Аргумент (2), Визит (3), Лира (4), Мадригал (5), Ратник (6), Ритм (7), Рубеж (8), Форум (9),Фрегат (10), Эввин (11), Топаз (12), №1 (13), Ханна (14) В скобках указаны соответствующие дорожки электрофореграммы Дорожки 1 и 15 - маркер молекулярной массы

| 29 п. п

! В результате микросателлитного

анализа по шести парам праймеров } н были получены индивидуальные генетические профили (рис 13), позволяющие надежно различать

II п. н.

сорта рапса, в том числе близкородственные Аргумент (Эг-15»п.п. 150-87 СГлобаль), Рубеж (В napu.sU В гара: Глобальг\У\\'1727), Визит (Глобаль[Монета) и Ратник [П(Глобаль[Зг-150-87) [Т1(8г-110-87 ГГлобаль)], в селекции которых в качестве одной из родительских форм использовали сорт Глобаль. Полученные генетические профили в перспективе могут быть использованы для идентификации, генетической паспортизации и сертификации сортов

2.4.4.2. Оценка эффективности передачи генетического материала при межвидовой гибридизации картофеля.

В настоящее время одним из основных методов селекции картофеля является межвидовая гибридизация, в частности, гибридизация с дикими видами картофеля Однако

передача полезных признаков от диких видов путем их непосредственного скрещивания с S tuberusum осложняется по ряду причин, одной из которых является филогенетическая отдаленность видов. В целях преодоления межвидовой несовместимости, вызывающей отклонения от нормального процесса формирования гибридных семян, прибегают к использованию метода сомаклональной гибридизации. Для оценки эффективности передачи генетического материала при межвидовой гибридизации было проведено исследование растительного материала, любезно предоставленного Г. А Яковлевой (Институт картофелеводства HAH, Беларусь), представляющего собой соматические гибриды и их семенное поколение, полученные при скрещивании S bulbocastanum и S tuberosum. Для установления природы интрогрессируемых фрагментов ДНК от родительских форм в гибриды в работе использовали образцы ДНК растений S bulbocastanum, S tuberosum (сорт Ласунак) и гибрида L 4-11 (рис. 14)

Для экспериментального подтверждения факта интрогрессии генетического материала соответствующие аллели родительских форм и гибрида L 4-11 размером 96, 104 и 114 п.н. (рис. 14, А), а также аллели размером 154 и 166 п н. (рис 14, Б) были клонированы и секвенированы.

Рис. 14. Элекгрофореграммы разделения продуктов ПЦР в 8 % -ном полиакриламидном геле, полученных с праймеров БТМ 1105 (А) и вТМ 2005 (Б) В качестве матриц для ПЦР использовали образцы ДНК растений 5 Ьи1Ьоса5Шпит (БЬк, дорожка 2), Ь 4-11 (БЬк □ Ласунак, дорожка 3), 5 шЬегоьит (сорт Ласунак; дорожка 4) (Соответствующие родительские пары и/или дорожки элекгрофореграммы указаны в скобках) Дорожка 1 - маркер молекулярной массы 96, 104, 114, 154, 166 - размер аллелей соответствующего локуса, п н

Проведенный анализ первичных структур аллелей локуса БТМ1105 (рис. 15) позволяет говорить о полиморфизме микросателлитных последовательностей, основанном не только на различии в количестве тандемных повторов, но и на вариабельности областей, прилегающих к микросателлитным повторам. Анализ первичных структур микросателлитных повторов локуса БТМ 2005 позволяет объяснять полиморфизм длин аллелей только лишь различием в количестве повторяющихся гексануклеотидных единиц (СТСПЧЗ) (рис 16).

Las. 114 AAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTTACACTCACTCACTCACTCACTCACTC : 64

L4-11.114 AAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCTTACACTCACTCACTCACTCACTCACTC : 64

L4-11.104 AAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCT—С--------ACTCACTCACTCACTC : 54

Las. 104 AAACCTGCTACAAATAAGGCAGGCACCTCCTCATTCT—С--------ACTCACTCACTCACTC : 54

Sbk.96 AAACCTGCTACAAATAAGGC----ACCTCCTCATTCT—CAC—ACTC--------------------------------: 40

L4-11. 96 AAACCTGCTACAAATAAGGC----ACCTCCTCATTCT —CAC—ACTC--------------------------------. 40

Las. 114 ACACAGCTCAAC-------AAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTG : 114

L4-11.114 ACACAGCTCAAC-------AAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTG . 114

L4-11 104 ACACAGCTCAAC-------AAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTG : 104

Las 104 ACACAGCTCAAC-------AAGTGGTAACTTTTACTCATCTCCTCCAATTATTTCTG : 104

Sbk.9 6 ACACAGCTCAACACTCAACAAGTGGTAACTTTTAC-CATCTCCTCCAATTATTTCTG 9 6

L4-11.96 ACACAGCTCAACACTCAACAAGTGGTAACTTTTAC-CATCTCCTCCAATTATTTCTG : 96

Рис. 15. Первичная структура аллелей локуса STM 1105 интрогрессируемых из родительских форм S bulbocastanum (Sbk) и S tuberosum (сорт Ласунак, Las) в соматический гибрид Sbk □ Ласунак (L4-11). 96, 104, 114 - размер соответствующего аллеля, пи Повторяющийся мотив (АСТС)„ подчеркнут Последовательности праймеров отмечены жирным шрифтом.

Las. 166 TTTAAGTTCTCAGTTCTGCAGGGAAGTACTTCATATAACATATATTTCTGTGTAAACGACGAAATA 66

L4-11 166 TTTAAGTTCTCAGTTCTGCAGGGAAGrACTTCArArAACATArATrTCTGTGTAAACGACGAAATA 66

Sbk. 154 TTTAAGTTCTCAGTTCTGCAGGGAAGTACTTCATATAACTTATATTTCTGTGTAGACGACGAAATA 66

L4-11.154 TTTAAGTTCTCAGTTCTGCAGGGAAGTACTTCATATAACTTATATTTCTGTGTAGACGACGAAATA 66

107

Las 166 AACAATGCTGCTGTTGCTGTTGCTGGTGCTGTTGCTGGTGCTGCTAAGAGGGGACTATCGTGCCAA 132 L4-11 166 AACAATGCTGCTGTTGCTGTTGCTGGTGCTGTTGCTGGTGCTGCTAAGAGGGGACTATCGTGCCAA 132

Sbk. 154 AACAATGCTGCTGTTGCTGTTGCTGGTG------------TTGCTAAGAGGGGACTATCGTGCCAA 120

L4-11 154 AACAATGCTGCTGTTGCTGTTGCTGGTG------------TTGCTAAGAGGGGACTATCGTGCCAA 120

Las.166 TGTAGCCGAACCCAGCAATGGTAAAGGTTATGAC 166 L4-11 166 TGTAGCCGAACCCAGCAATGGTAAAGGTTATGAC 166 Sbk. 154 TGTAGCCGAACCCAGCAATGGTAAAGGTTATGAC 154 L4-11.154 TGTAGCCGAACCCAGCAATGGTAAAGGTTATGAC 154

Рис. 16. Первичная структура аллелей локуса STM 2005 интрогрессируемых из родительских форм S bulbocastanum (Sbk) и S tuberosum (сорт Ласунак, Las) в соматический гибрид Sbk □ Ласунак (L4-11) 154, 166 - размер соответствующего аллеля, пн Повторяющийся мотив (CTGTTG)n подчеркнут Последовательности праймеров и нуклеогиды в позициях 40, 107 отмечены жирным шрифтом

Интересно отметить, что в этих двух микросателлитных локусах обе родительские формы имеют уникальные первичные структуры' нуклеотидные последовательности AGGC...TA...T (S tuberosum) и АСТСААС (S bulbocastanum), образующие соответствующие инсерции/делеции в первичных структурах аллелей (рис. 15), или точечные нуклеотидные замены в позициях 40 и 107 (рис 16), которые отчетливо наследуются гибридом L 4-11.

Таким образом, применение технологии микросателлитного анализа позволяет эффективно осуществлять контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в гибриды

выводы

1 Разработана общая технология детекции мутаций в геномной ДНК на основе аллель-специфической полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе электрофореза высокого разрешения.

2 Разработана общая методология конструирования аллель-специфических праймеров для выявления мутаций в любых интересующих генах путем анализа продуктов АС-ПЦР на автоматическом анализаторе ДНК

3 Разработаны тест-системы для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)A в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах al-коллагена типа 1 (2046G—>Т), рецептора витамина D3 (45082G—>А), эстрогенового рецептора а (938Т->С и 984A-+G)

4. Созданы наборы реагентов АСП-МТГФР, АСП-ПР и АСП-Ф5Л для детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, соответственно Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

5. Разработаны основные принципы стандартизации технологии молекулярно-генетической идентификации личности, основанной на анализе количества тандемных повторов в микросателлитных локусах геномной ДНК человека. На основании разработанных в данной работе технологических подходов созданы наборы реагентов для идентификации личности CTWA и FFTL. Наборы зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники

6. Разработана универсальная технология генотипирования растений рода Solanum на основе анализа 20 микросателлитных локусов С помощью этой технологии проведено межвидовое и внутривидовое различение растений рода Solanum, а также ДНК-типирование 44 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции На примере сорта Голубизна проведено подтверждение сортовой подлинности экспертных образцов картофеля, полученных из различных опытно-производственных хозяйств

7. Разработана универсальная технология генотипирования культурных и дикорастущих растений рода Brassica на основе анализа 18 микросателлитных локусов Показано, что разработанная технология позволяет различать и идентифицировать растения рода

Brassica, составляющие треугольник U, а также представителей других родов семейства Brassicaceae (Smapis, Raphanus, Camelina) на родовом, видовом и внутривидовом уровне

8. Показано, что разработанные технологии генотипирования растений позволяют осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях На основе экспериментального анализа первичных структур ряда микросателлитных локусов показана возможность контроля интрогрессии генетического материала дикого вида S bulbocastanum и сорта Ласунак в гибрид L4-11, а также интрогрессии генетического материала сортов Osaka Market и Sensudzi Кю Mizuna вида В гара в их реципрокные гибриды

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Demchinskaya AV, Shilov IA, Karyagina AS, Lunin VG, Sergienko OV, Voronina OL, Leiser M, Plobner L. A new approach for point mutation detection based on a ligase chain reaction // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V. 50. No. 1. P. 79-89.

2.Ванюшева OB., Шилов И.А, Карягина AC., Файзуллин Л.З, Сухих Г.Т., Швец В.И Разработка технологии идентификации аллелей однонуклеотидных полиморфных маркеров на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК // Биотехнология, 2005, № 4, С. 20-28.

3.Шилов И.А, Карягина А С , Сумерин В.В , Михайлов Д А., Шилов О А. Многоканальный капиллярный генетический анализатор. // Патент Российской Федерации № 2145078 от 27 января 2000 г.

4.Badoeva F.S., Ahmedova Е.М., Zjdanov А V., Demchinskaya A.V., Shilov I.A , Karyagina A.S., Murashko L E, Sukhikh G.T. Higher rate of the thrombophylic mutations in women with complicated pregnancy. // Am. J. Reprod. Immunol. 2001. No. 1. P. 46.

5.Vanyusheva O.V., Shilov IA , Karyagina A S. Elaboration and usage of AS-PCR method for detection the Spl polymorph у sm in collagen type I al gene, BsmI polymorphism in vitamin D receptor gene, and Xbal and Pvull polymorphisms in estrogen receptor a gene in women with postmenopausal osteoporosis //Eur J. Hum Genet V. 12. Suppl. 1. 2004. P. 270.

6 Vanyusheva O.V., Shilov I A., Karyagina A S. Elaboration and usage of point mutation detection technology based on AS-PCR using automated DNA analyzer. // Eur. J. Hum. Genet. V 13, Suppl 1,2005, P. 360

7.Бирюкова B.A., Зайцев В С., Хавкин Э.Е., Хромова Л.М, Шилов И.А. ДНК-маркеры в селекции картофеля // Достижения науки и техники АПК, 2003, № 10, С. 38-41.

8 Бирюкова В А., Велишаева Н С., Зайцев В С , Хавкин Э.Е., Хромова Л.М , Шилов И А

ДНК-дакгилоскопия картофеля и его дикорастущих сородичей. // Вопросы картофелеводства. Материалы «Школы молодых ученых», г. Москва, 2004, С. 114-123.

9 Анискина Ю.В , Бирюкова В А, Велишаева Н С , Панкин А.А, Прибылова Т.А., Хавкин

Э Е, Шилов И.А. ДНК-генотипирование растений родов Brassica и Solarium II Сельскохозяйственная биология, 2005, № 1, С. 110-119.

10. Анискина Ю В , Велишаева Н С , Шилов И А, Хавкин Э Е. Генотипирование пасленовых и крестоцветных растений методом микросателлитного анализа // Методические рекомендации ВНИИСБ, г. Москва. 2005 21 С

11. Велишаева Н.С., Шилов И.А, Хавкин ЭЕ. Использование технологии микросателлитного анализа для различения сортов картофеля и его дикорастущих

сородичей // Вопросы картофелеводства Актуальные проблемы науки и техники, г. Москва, 2006, С. 228-235

12 Анискина Ю.В., Панкин А. А, Хавкин ЭЕ, Шилов И А. ДНК-маркер хромосомы III генома В Brassica // Доклады РАСХН, 2006, № 4, С 15-16

13 Велишаева H С., Шилов И.А, Хавкин Э.Е. Генотипирование картофеля и его дикорастущих сородичей методом анализа полиморфизма микросателлитов // Доклады РАСХН, 2006, № 5, С. 3-5.

14 Журавлева ЮН., Луговцев В.Ю., Воронина О Л., Шилов И А., Ванюшева OB., Лунин

B.Г., Наумова М.А, Мамаева Т.А., Тихонова Н.Т. Генетический анализ диких штаммов вируса кори, изолированных в Европейской части РФ. // Вопросы вирусологии, 2003, Т. 48, № 4, С. 29-35.

15 Дмитренко О А, Шагинян И А , Прохоров В .Я, Матвеев С.М., Аляпкина Ю С., Ванюшева О В , Шилов И.А, Лунин В Г, Гинцбург А.Л. Исследование полиморфизма коагулазного гена методом секвенирования у метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах различных регионов России и Беларуси. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2005, № 3, С 27-32

16. Бирюкова В.А , Зайцев В С , Панкин А.А , Хавкин Э.Е, Шилов И.А Генотипирование растений рода Solanum с помощью рассеянных повторяющихся последовательностей и микросателлитов // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», г. Москва, 10-14 ноября 2003 г, Т. 1,С. 185.

17. Анискина Ю.В., Бирюкова В.А, Велишаева НС, Мартынов ВВ, Панкин А А, Прибылова Т.А, Хавкин Э.Е, Шилов И.А. ДНК генотипирование растений Brassica и Solanum. II Сб трудов III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», г. Москва, 19 октября 2004 г , С 119120

18. Велишаева НС., Бирюкова В А, Шилов И А., Хавкин Э.Е Использование технологии микросателлитного анализа для генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей // Материалы научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», г Казань, 17-18 июня 2004 г. С 8-9

19. Shilov I A. Genotyping of Solanaceae and Brassicaceae using microsatellite polymorphism // Materials of Bulgarian-Russian Seminar "The application of molecular diagnostic in breeding, variety testing and analysis of transgenic plants", Varna, Bulgaria, July 3-7, 2004 P. 25

20. Шилов И A, Велишаева H С., Анискина Ю В. Генотипирование пасленовых и крестоцветных на основе полиморфизма микросателлитов // Материалы Российско-Болгарского симпозиума "Актуальные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии", г Москва, 16 декабря 2005 г., С. 26-27.

21 Анискина Ю.В., Мартынов В В., Панкин A.A., Хавкин Э Е, Шилов И А Три метода ДНК генотипирования культурных форм Brassica. II Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития», г. Москва, 14-18 марта 2005 г., Т 1,С. 221

22. Бекетова M П., Бирюкова В.А, Велишаева H С., Дробязина П Е., Зайцев B.C., Хавкин Э Е., Шилов И.А., Яковлева Г.А ДНК маркеры интрогрессии устойчивости к фитофторозу картофеля // Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», г. Москва, 14-18 марта 2005 г., Т. 1,

C. 227.

23 Анискина Ю В , Шилов И А , Хавкин Э.Е Использование метода анализа полиморфизма микросателлитов для оценки генетического разнообразия форм Brassica II Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье», г. Суздаль, 19-22 мая 2005 г, С. 319-321.

24. Faisulin L S , Badoeva F.S., Ahmedova E.M., Zjdanov A.V., Demchinskaya A V., Shilov I.A., Karyagina A.S , Murashko L.E , Sukhikh G T. Higher rate of the thrombophylic mutations in women with complicated pregnancy. // VIII International Congress of Reproductive Immunology, Opatija, Croatia, July 2-6,2001. Program and Abstracts. P. 97.

25 Сухих Г.Т., Мурашко JIE., Файзуллин Л.З., Бадоева Ф.С., Ахмедова Е.М., Мурашко

A.В , Демчииская А В , Шилов И.А., Карягииа А.С. Тромбофилические мутации и гипергомоцисгеинемия у женщин с гестозом. // Материалы III Российского форума «Мать и дитя», г. Москва, 22-26 октября 2001 г., С. 212-213

26 Mourachko L.E., Faisulin L.S., Ahmedova Е.М, Mourachko А V., Badoeva F.S., Sukhih G.T., Vanjusheva O.V., Cvetkova T N„ Demchinskaya A.V., Karyagina A.S., Shilov I.A C677T MTHFR mutation influence on homocysteine serum level and haemostasis m patients with physiological and gestosis pregnancy. И J. Hungarian Family - friendly Society and Society of Pathophysiology of Pregnancy. 2002 Special ed P. 33

27 Mourachko A.V., Faisulin L.S., Ahmedova E.M , Shilov I.A., Karyagina A S., Vanjusheva O.V Methyltetrahydrofolate reductase C677T mutation rate in pregnant with varicose veins. // J. Hungarian Family - friendly Society and Society of Pathophysiology of Pregnancy 2002. Special ed P. 34.

28. Мурашко А.В , Файзуллин Л 3., Сухих Г.Т., Ванюшева О.В., Демчинская А.В., Карягина А С., Шилов И.А. Частота мутации С677Т метилентетрагидрофолатредуктазы у беременных, страдающих варикозным расширением вен. // Материалы IV Российского форума «Мать и дитя», г. Москва, 21-25 октября 2002 г., Т. 1, С. 416.

29. Сухих Г.Т., Файзуллин Л.З , Ахмедова Е М., Бадоева Ф С., Казарян Л М, Мурашко Л.Е., Ванюшева О В., Цветкова Т.Н., Демчинская АВ, Карягина А.С, Шилов И А. Роль мутаций в генах, контролирующих различные функции системы кровообращения, в развитии гестоза. // Материалы IV Российского форума «Мать и дитя», г. Москва, 21-25 октября 2002 г., Т. 1, С 589-590

30 Сухих Г.Т, Файзуллин Л.З, Ахмедова Е М., Бадоева Ф.С , Мурашко Л Е , Ванюшева О В., Цветкова Т.Н, Карягина А.С., Шилов И.А Генетический полиморфизм метилентетрагидрофолатредуктазы и уровни сывороточного гомоцистеина и эритроцитарных витаминов группы В у женщин с нормальным течением беременности и гестозом // Материалы IV Российского форума «Мать и дитя», г. Москва, 21-25 октября 2002 г., Т. 1, С 591-594.

31 Мурашко ЛЕ., Ахмедова Е.М, Бадоева ФС., Сухих Г.Т, Файзуллин Л.З., Ванюшева О В., Карягина А С., Шилов И.А. Тромбофилические мутации и гипергомоцисгеинемия у женщин с гестозом. // Проблемы беременности, 2002, № 6, С. 44-48.

32 Шилов И А, Карягина А С , Ванюшева О В., Цветкова Т Н., Файзуллин Л 3, Ахмедова Е.М, Бадоева Ф С., Мурашко Л Е., Сухих Г.Т. Исследование генетического полиморфизма метилентетрагидрофолатредуктазы у женщин с нормальным течением беременности и гестозом. // Сб трудов научно-практического симпозиума "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", г. Москва, 20-21 июня 2002 г., С. 5758

33. Шилов И.А, Карягина АС., Лунин В.Г. Новые технологии генодиагностики с применением автоматических анализаторов ДНК // Сб трудов IV Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний", г Москва, 22-24 октября 2002 г, С 188-190.

34 Журавлева Ю Н , Луговцев В Ю., Воронина О.Л , Шилов И А., Ванюшева О В , Лунин

B.Г., Наумова М.А., Мамаева Т А., Тихонова Н Т. Идентификация генома вируса кори методом полимеразной цепной реакции. II Сб. трудов IV Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний", г. Москва, 22-24 октября 2002 г., С. 210-211

35. Сухих Г.Т., Мурашко Л Е , Менжинская И В , Файзуллин Л 3 , Ахмедова Е.М , Бадоева

Ф С , Очан Т.Б , Ванюшева О В , Цветкова Т.Н, Карягина А С., Шилов И.А Взаимосвязь между антифосфолипидными антителами, гипергомоцистеинемией и мутацией С677Т в гене 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы при беременности, осложненной гестозом. // Материалы V Российского форума «Мать и дитя», г Москва, 6-10 октября 2003 г., С 227228.

36. Сухих Г.Т , Мурашко Л Е., Ахмедова Е.М, Бадоева Ф С , Файзуллин Л 3., Ванюшева О.В , Цветкова Т.Н., Карягина А.С, Шилов И.А Влияние мутации С677Т в гене фермента 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы на риск развития тяжелых форм гестоза // Материалы V Российского форума «Мать и дитя», г Москва, 6-10 октября 2003 г., С. 228-229

37. Кулаков В И., Мурашко А В., Файзуллин Л 3, Шилов И А, Цветкова Т.Н, Карягина А.С., Разумихин М В, Ванюшева О В Генетическая предрасположенность к варикозной болезни у беременных, возможное подтверждение? // Проблемы беременности, 2003, № 7, С 31-35.

38. Дмитренко О А., Шагинян И.А, Ванюшева О В., Шилов И.А., Прохоров В Я., Лунин В Г., Гинцбург А Л. Генотипирование метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus методами исследования полиморфизма коагулазного гена и типа тес ДНК. // Сб. трудов V Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний", г. Москва, 19-21 октября 2004 г., Т 2, С. 20-23.

39. Коваленко Т.Ф., Патрушев Л.И, Ванюшева О.В , Шилов И А., Сосин Д В., Суховерхова А С, Козлова Т.В., Бокарев И Н., Сорокина А В., Озолиня Л.А. Исследование промоторов генов MTHFR при гипергомоцистеинемии и PTEN при злокачественных и доброкачественных опухолях эндометрия и яичников. // Биоорганическая химия, 2006, Т. 32, №4, С. 373-381

40. Ванюшева О В., Шилов И А., Карягина А С Технология детекции точечных нуклеотидных замен на основе аллель-специфической ПЦР с применением капиллярного электрофореза // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье», г Суздаль, 19-22 мая 2005 г., С. 331-332.

41.Шилов И.А., Карягина АС Иванов П.Л. О возможных неблагоприятных последствиях использования in-house компонентов дм судебно-экспертных молекулярно-генетических технологий. // Судебно-медицинская экспертиза, 2005, № 4, С. 20-23.

42 Иванов П.Л., Шилов И А, Карягина А С. К вопросу о регламентировании в Российской Федерации разработки и производства компонентов для молекулярно-генетических технологий // Материалы VI Всероссийского съезда судебных медиков «Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской науки и практики», г. Тюмень, 7-8 сентября 2005 г., С. 114-116.

43. Иванов П Л., Шилов И А , Карягина А.С О необходимости регулирования в Российской Федерации производства компонентов для судебно-медицинских молекулярно-генетических технологий и совершенствования нормативно-правовой базы судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз. // Судебно-медицинская экспертиза, 2006, №3, С. 21-24.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шилов, Илья Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Роль точечных мутаций в патогенезе различных заболеваний человека.

1.1.1. Мутации в генах факторов И, V свертываемости крови, метилентетрагидро-фолатредуктазы человека и их связь с предрасположенностью к тромбозам и гипергомоцистеинемии.

1.1.2. Мутации в гене ангиотензиногена человека и их связь с предрасположенностью к первичной гипертонии и преэклампсии.

1.1.3. Мутации в генах рецептора витамина D3, al-коллагена типа 1, эстрогенового рецептора а человека и их связь с предрасположенностью к остеопорозу.

1.2. Современные методы детекции точечных мутаций.

1.2.1. Метод детекции точечных мутаций, основанный на удлинении праймера на один нуклеотид.

1.2.1.1. Анализ точечных мутаций с помощью капиллярного электрофореза.

1.2.1.2. Анализ точечных мутаций с помощью флуоресцентной поляризации.

1.2.1.3. Анализ точечных мутаций с помощью масс-спектрометрии.

1.2.2. Метод детекции точечных мутаций на основе полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени.

1.2.3. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфического олиго-нуклеотидного лигирования.

1.2.4. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической гибридизации олигонуклеотидов.

1.2.5. Методы детекции точечных мутаций, основанные на анализе конформационного полиморфизма ДНК.

1.2.5.1. Гетеродуплексный анализ.

1.2.5.2. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов

1.2.6. Методы детекции точечных мутаций, основанные на использовании эндонуклеаз.

1.2.6.1. Аллель-специфический анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции.

1.2.6.2. Анализ с использованием эндонуклеаз, специфичных к неспаренным нуклеотидам в ДНК.

1.2.7. Метод детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической поли-меразной цепной реакции.

1.2.8. Практическая реализация технологии детекции точечных мутаций.

1.2.8.1. Наборы реагентов, основанные на удлинении праймера на один нуклеотид.

1.2.8.2. Наборы реагентов, основанные на полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени.

1.2.8.3. Наборы реагентов, основанные на использовании аллель-специфической гибридизации олигонуклеотидов.

1.2.8.4. Наборы реагентов, основанные на использовании эндонуклеаз и ферментов репарации.

1.2.8.5. Наборы реагентов, основанные на аллель-специфической полимеразной цепной реакции.

1.3. Современные методы идентификации геномов (ДНК-типирования).

1.3.1. Метод прямого секвенирования полиморфных участков генома.

1.3.2. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

1.3.3. Генетическое типирование с использованием праймеров произвольной первичной структуры.

1.3.4. Генетическое типирование с использованием геномных фингерпринтов.

1.3.5. Микросателлитный анализ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы и материалы.

2.2. Приборы и методы.

2.3. Общие методики.

2.3.1. Ферментативное введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды.

2.3.2. Реакция химической модификации ДНК.

2.3.3. Определение активности Tth ДНК-лигазы.

2.3.4. Определение активности термостабильной структуро-специфичекской эндонуклеазы (Cleavase).

2.3.5. Проведение реакции лигирования на матрице и лигазной цепной реакции (ЛЦР).

2.3.5.1. Проведение лигирования на матрице и ЛЦР с радиоактивной детекцией продуктов реакции.

2.3.5.2. Проведение ЛЦР с флуоресцентной детекцией продуктов реакции.

2.3.5.3. Проведение ЛЦР с колориметрической детекцией продуктов реакции.

2.3.6. Проведение ПЦР с твердофазной детекцией продуктов реакции.

2.3.7. Выращивание растений.

2.3.8. Выделение геномной ДНК.

2.3.8.1. Выделение ДНК с использованием протеиназы К и фенольной экстракции.

2.3.8.2. Выделение ДНК с использованием сорбента Chelex 100.

2.3.8.3. Выделение ДНК с помощью силикагелевого сорбента.

2.3.8.4. Выделение ДНК из растений СТАВ-методом.

2.3.9. Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция.

2.3.10. Амплификация фрагментов ДНК, содержащих микросателлитные последовательности.

2.3.11. Электрофорез в агарозном геле.

2.3.12. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.3.13. Визуализация ДНК в полиакриламидном геле с помощью нитрата серебра.

2.3.14. Капиллярный электрофорез.

2.3.15. Приготовление стандартов длины для капиллярного электрофореза.

2.3.16. Анализ флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК на автоматическом анализаторе ALFexpressII.

2.3.17. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК.

2.3.18. Трансформация клеток Е. coli и анализ клонов.

2.3.19. Выделение плазмидной ДНК.

2.3.20. Проведение ферментативных реакций.

2.3.21. Секвенирование ДНК методом Сэнгера.

2.3.22. Анализ нуклеотидных последовательностей.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Разработка новых подходов для детекции точечных мутаций.

3.1.1. Исследование возможности применения лигазной цепной реакции (ЛЦР) для детекции точечных мутаций.

3.1.1.1. Проблема неспецифического лигирования.

3.1.1.2. Повышение точности лигирования с использованием структуро- 107 специфической эндонуклеазы (Cleavase).

3.1.1.3. Разработка системы детекции продуктов ЛЦР.

3.1.1.3.1. Исследование возможности флуоресцентной детекции продуктов ЛЦР после сорбции их на твердой фазе.

3.1.1.3.2. Колориметрическая детекция продуктов ЛЦР.

3.1.1.3.3. Система детекции точечных мутаций модифицированным методом ЛЦР. 115 3.1.2. Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР (АС-ПЦР) с применением автоматических анализаторов ДНК. 118 3.1.2.1. Разработка методологии конструирования аллель-специфических праймеров для АС-ПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом.

3.1.2.2. Создание систем детекции мутаций (G20210A) и (G1691A) в генах факторов II и V свертываемости крови человека; (С677Т) в гене метилен-тетрагидрофолатредуктазы; С1015Т, Т1198С и G(-6)A в гене ангиотензиногена; (G2046T) в гене al-коллагена типа I; (G45082A) в гене рецептора витамина D3 и

Т938С и A984G) в гене эстрогенового рецептора а человека методом АС-ПЦР.

3.1.2.2.1. Дизайн праймеров и оптимизация условий АС-ПЦР.

3.1.2.2.2. Анализ продуктов АС-ПЦР с помощью автоматических анализаторов

ДНК с флуоресцентной детекцией.

3.1.2.2.2.1. Современные системы для автоматического анализа флуоресцентно-меченых фрагментов ДНК.

3.1.2.2.2.2. Создание отечественного генетического анализатора «Мультиген» и его использование для анализа точечных мутаций.

3.1.2.3. Концепция создания наборов реагентов для детекции точечных мутаций.

3.2. Разработка подходов к стандартизации технологий генотипирования, основанных на анализе полиморфизма микросателлитов.

3.2.1. Концепция стандартизации технологии молекулярно-генетической идентификации личности.

3.2.1.1. Принципы создания наборов реагентов для идентификации личности.

3.2.1.2. Автоматизация анализа идентификации личности с использованием генетического анализатора «Мультиген».

3.2.2. Разработка и стандартизация технологий генотипирования растений.

3.2.2.1. Исследование генетического разнообразия растений рода Solatium методом микросателлитного анализа.

3.2.2.1.1. Выбор локусов для генотипирования растений рода Solanum.

3.2.2.1.2. Исследование межвидовой и внутривидовой вариабельности растений рода Solanum.

3.2.2.1.3. Исследование полиморфизма генома картофеля методом микросателлитного анализа.

3.2.2.2. Исследование генетического разнообразия растений рода Brassica.

3.2.2.2.1. Выбор локусов для микросателлитного анализа растений рода Brassica.

3.2.2.2.2. Микросателлитный анализ видов и разновидностей Brassica и родственных представителей семейства Brassicaceae.

3.2.2.2.3. Исследование интрогрессии фрагментов геномов А, В и С Brassica в межвидовые и межродовые гибриды.

3.2.2.2.4. Исследование природы полиморфизма микросателлитных локусов геномов А, В и С Brassica.

3.2.2.3. Практическое применение технологии микросателлитного анализа в селекции.

3.2.2.3.1. Определение сортовой подлинности образцов картофеля.

3.2.2.3.2. Различение близкородственных сортов рапса (B.napus).

3.2.2.3.3. Контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в гибриды.

3.2.2.3.3.1. Оценка эффективности передачи генетического материала при межвидовой гибридизации картофеля.

3.2.2.3.3.2. Исследование интрогрессии аллельных форм микросателлитных локусов листовых овощных сортов В.г ара в их гибриды.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые технологии детекции точечных мутаций и анализа полиморфизма повторяющихся последовательностей геномов"

Возникновение многих заболеваний человека обусловлено наследственной предрасположенностью, которая во многих случаях вызвана точечными нуклеотидными заменами (мутациями) в геномной ДНК. Наличие мутации в гомозиготном состоянии, а также доминантной мутации в гетерозиготном состоянии вызывает образование мутантного фенотипа, что обуславливает возникновение патологии или предрасположенности к ней, как в случае мультифакториальных заболеваний, возникновение которых происходит в результате совокупного влияния мутаций во многих генах и факторов окружающей среды. Поскольку мутации, обуславливающие наследственную предрасположенность, содержатся в геномной ДНК каждой клетки организма на протяжении всей жизни, то посредством их диагностирования можно узнать о предрасположенности к патологии задолго до ее развития. Это может помочь либо совсем избежать ее проявления, либо уменьшить риск возникновения осложнений во время болезни, назначить индивидуальное лечение. Таким образом, детекция мутаций является одной из важных задач современной медицинской диагностики.

Существующие методы детекции известных точечных мутаций можно разделить на две группы. В одной группе методов анализ мутаций проводится после амплификации исследуемого участка ДНК. Точечные мутации обнаруживают по расщеплению анализируемых фрагментов ДНК соответствующими рестриктазами, с помощью аллель-специфической гибридизации или удлинения праймера на один нуклеотид. Ко второй группе методов относятся те, в которых амплификация является частью системы детекции. Эти методы основаны на лигировании специфических олигонуклеотидных зондов в месте потенциальной мутации и аллель-специфической полимеразной цепной реакции. Тем не менее, при всем существующем многообразии методов не один из них пока не является полностью подходящим для клинического использования. К общим недостаткам методов первой группы, ограничивающим их применение в клинической практике и крупномасштабных исследованиях, можно отнести трудоемкость, наличие стадии пост-реакционной обработки продуктов амплификации (это способствует контаминации), долгое время анализа и низкую производительность. Кроме того, наиболее используемый в клинической диагностике метод первой группы, основанный на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, имеет существенные ограничения по применению, поскольку требует наличия сайта рестрикции в месте предполагаемой мутации. Методы второй группы являются более предпочтительными с точки зрения использования их в клинической практике, т.к. они позволяют проводить генотипирование в одну стадию, что сокращает время анализа и значительно упрощает анализ. Однако, эти методы также являются малопроизводительными, что ограничивает их широкое применение. Кроме того, метод аллель-специфического олигонуклеотидного лигирования характеризуется низким выходом продукта реакции. Таким образом, разработка новых, удобных в эксплуатации, быстрых, высокопроизводительных и надежных методов детекции известных точечных мутаций в ДНК является актуальной задачей современной биотехнологии.

Результаты многочисленных научных исследований, полученные при изучении структуры и организации геномной ДНК животных, растений и микроорганизмов, существенным образом отразились на методологии их систематизации, ранее основанной, главным образом, на анализе фенотипических признаков. Проблема адекватного отнесения конкретного организма к той или иной группе не является чисто академической. Основанная на точных критериях систематика живых организмов, определяющая эволюционное родство между ними, помимо чисто теоретического представляет и большой практический интерес. В частности, определение источника патогенных микроорганизмов при больничных инфекциях позволило бы выработать эффективные меры защиты против их распространения. Идентификация микроорганизмов важна не только для медицинской практики, но также и в других областях, например, при сертификации продуктов питания, при определении экологической чистоты воды и почвы и т.д. В настоящее время молекулярно-генетические методы позволяют осуществлять идентификацию личности в судебно-медицинских исследованиях, а также решать в спорных случаях проблему определения отцовства. Применение технологий генотипирования в сельском хозяйстве открывает новые возможности для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как поддержание генетических коллекций, подбор родительских форм для скрещивания, составление родословных, контроль интрогрессии генетического материала, паспортизация и сертификация сортов, создание «генетических паспортов» сельскохозяйственных растений, представляющих собой основу защиты интеллектуальной собственности селекционеров.

Наиболее важным подходом для исследования генетического полиморфизма представляется использование методов молекулярного анализа, позволяющих получать индивидуальную характеристику отдельного генотипа - ДНК-профиль. Существующие методы ДНК-типирования геномов отличаются по сложности, надежности и объему получаемой информации. Для надежного различения и идентификации генотипов, исследования филогенетических взаимосвязей и интрогрессии генетического материала, наиболее перспективным является метод анализа полиморфизма микросателлитов, позволяющий получать воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома.

1. Исследовать возможность применения лигазной цепной реакции (ЛЦР) для детекции однонуклеотидных полиморфизмов.

4. Применить разработанную технологию для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—*Т), факторов II (20210G—»А) и V (1691G—»А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)A в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах а 1-коллагена типа 1 (2046G—+Т), рецептора витамина D3 (45082G—+А) и эстрогенового рецептора а (938Т-+С и 984А—>G).

7. Применить технологию микросателлитного анализа для исследования генетического разнообразия представителей родов Solanum и Brassica как на внутри- и межвидовом уровне, так и для генотипирования сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, а также близкородственных сортов и гибридов Brassica.

8. Изучить природу межвидового и внутривидового полиморфизма исследуемых микросателлитных локусов.

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Методология конструирования аллель-специфических праймеров для выявления мутаций в любых интересующих генах путем анализа продуктов АС-ПЦР на автоматическом анализаторе ДНК.

3. Разработанные тест-системы для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—»А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)A в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах al-коллагена типа 1 (2046G—►Т), рецептора витамина D3 (45082G—>А), эстрогенового рецептора a (938Т—>С и 984А—>G).

4. Основные принципы стандартизации технологии молекулярно-генетической идентификации личности, основанной на анализе количества тандемных повторов в микросателлитных локусах геномной ДНК человека.

5. Технология генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей на основе анализа 20 микросателлитных локусов.

20210G—>А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)A в гене ангиотензиногена человека, а также для нуклеотидных замен в генах а 1-коллагена типа 1 (2046G—>T), рецептора витамина D3 (45082G—>А) и эстрогенового рецептора а (938Т—>С и 984А—>G).

2. В рамках задачи создания технологии детекции точечных мутаций, адаптированной для использования в клинической практике, разработан и создан прибор для автоматизированного анализа фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза - «Мультиген». Генетический анализатор «Мультиген» основан на оригинальной оптической схеме, защищен патентом на изобретение (Шилов И.А. и др., 2000) и рекомендован для применения в медицинской практике Комитетом по новой медицинской технике Министерства здравоохранения Российской Федерации.

4. В результате проведенных исследований были отобраны 20 микросателлитных локусов, являющихся перспективными для идентификации видов и сортов картофеля. С применением технологии микросателлитного анализа были получены уникальные генетические профили 85 образцов растений рода Solarium, 44 из которых являются сортами картофеля отечественной и зарубежной селекции.

5. Впервые показано, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта. На основе экспериментального анализа первичных структур ряда микросателлитных локусов показана возможность контроля интрогрессии генетического материала дикого вида S. bulbocastanum и сорта Ласунак в гибрид L4-11, а также интрогрессии генетического материала родительских форм, участвовавших в селекции сорта Скороплодный.

6. На основании проведенных исследований были отобраны 18 микросателлитных локусов, являющиеся перспективными для идентификации видов, сортов и дикорастущих форм Brassica. Показано, что с помощью технологии микросателлитного анализа можно различать и идентифицировать растения рода Brassica, составляющие треугольник U, а также представителей других родов семейства Brassicaceae (Sinapis, Raphanus, Camelina) на родовом, видовом и внутривидовом уровне.

7. В результате микросателлитного анализа впервые были идентифицированы фрагменты, специфичные для геномов А, В и С диплоидных видов Brassica и подтверждена их интрогрессия в амфидиплоидные виды, а также межвидовые и межродовые гибриды. Впервые показана возможность контроля интрогрессии генетического материала родительских форм (сортов В. гара) в гибриды с помощью технологии микросателлитного анализа.

Научно-практическое значение работы. В результате проведенной работы созданы наборы реагентов АСП-МТГФР, АСП-ПР и АСП-Ф5Л для детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—^Т), факторов II (20210G—»А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, соответственно. Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации. С использованием разработанных наборов реагентов было проведено обследование пациенток с нормальным течением беременности и гестозом; при этом выявлена более высокая частота встречаемости вышеупомянутых мутаций у пациенток с гестозом. Также была выявлена высокая частота встречаемости данных мутаций в ДНК беременных женщин с варикозной болезнью. Данные результаты свидетельствуют о связи этих мутаций с предрасположенностью к гестозу и варикозной болезни во время беременности.

На основании разработанных в данной работе технологических подходов созданы наборы реагентов для идентификации личности CTWA и FFTL. Эти наборы реагентов зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.

Продемонстрирована возможность различения близкородственных сортов картофеля Альтаир и Аксамит, в селекции которых участвовали одни и те же родительские формы; различения сортов отечественной и зарубежной селекции (сорт Скороплодный и Wauseon); различения близкородственных генотипов - сортов Голубизна и Скороплодный, являющихся полусестринскими сортами картофеля. На примере сорта Голубизна показано, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет отслеживать и подтверждать сортовую подлинность экспертных образцов, сохраняемых и поддерживаемых в различных опытно-производственных хозяйствах.

Полученные в работе результаты микросателлитного анализа шести исследованных видов В. гара, В. nigra, В. oleracea, B.juncea, В. napus и В. carinata полностью соответствуют их ботанической и цитогенетической классификации и могут быть использованы для решения задач молекулярной систематики представителей семейства Brassicaceae. В результате микросателлитного анализа выявлены фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, которые могут быть использованы в качестве маркеров интрогрессии генетического материала при межвидовых и межродовых скрещиваниях.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Шилов, Илья Александрович

выводы

1. Разработана общая технология детекции мутаций в геномной ДНК на основе аллель-специфической полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе электрофореза высокого разрешения.

2. Разработана общая методология конструирования аллель-специфических праймеров для выявления мутаций в любых интересующих генах путем анализа продуктов АС-ПЦР на автоматическом анализаторе ДНК.

3. Разработаны тест-системы для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)A в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах al-коллагена типа 1 (2046G—^Т), рецептора витамина D3 (45082G-+A), эстрогенового рецептора a (938Т^С и 984А-Ю).

4. Созданы наборы реагентов АСП-МТГФР, АСП-ПР и АСП-Ф5Л для детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>'Г), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, соответственно. Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

6. Разработана универсальная технология генотипирования растений рода Solanum на основе анализа 20 микросателлитных локусов. С помощью этой технологии проведено межвидовое и внутривидовое различение растений рода Solanum, а также ДНК-типирование 44 сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции. На примере сорта Голубизна проведено подтверждение сортовой подлинности экспертных образцов картофеля, полученных из различных опытно-производственных хозяйств.

7. Разработана универсальная технология генотипирования культурных и дикорастущих растений рода Brassica на основе анализа 18 микросателлитных локусов. Показано, что разработанная технология позволяет различать и идентифицировать растения рода Brassica, составляющие треугольник U, а также представителей других родов семейства Brassicaceae {Sinapis, Raphanus, Camelina) на родовом, видовом и внутривидовом уровне.

8. Показано, что разработанные технологии генотипирования растений позволяют осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях. На основе экспериментального анализа первичных структур ряда микросателлитных локусов показана возможность контроля интрогрессии генетического материала дикого вида S. bulbocastanum и сорта Ласунак в гибрид L4-11, а также интрогрессии генетического материала сортов Osaka Market и Sensudzi Kio Mizuna вида В. гара в их реципрокные гибриды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований была разработана надежная технология детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК, адаптированная для использования в клинической практике. Эта технология была применена для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т), факторов II (G20210A) и V (G1691 А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)A в гене ангиотензиногена, а также нуклеотидных замен в генах а 1-коллагена типа 1 (G2046T), рецептора витамина D3 (G45082A), эстрогенового рецептора а человека (Т938С и A984G). При использовании данных систем было обследовано 139 беременных женщин с неосложненным течением беременности и с гестозом различной степени тяжести, наблюдавшихся и проходивших лечение в Научном Центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (г. Москва) на наличие мутаций в гене ангиотензиногена, метилентетрагидрофолатредуктазы, факторов II и V свертываемости крови, а также 130 больных с остеопорозом, наблюдавшихся в медицинском центре ОАО "Медицина" (г. Москва) и Центральном институте травматологии и ортопедии (ЦИТО) им. Н.Н. Приорова (г. Москва) на наличие мутаций, ответственных за предрасположенность к остеопорозу.

В результате работы созданы наборы реагентов для детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т), факторов II (G20210A) и V (G1691 А) свертываемости крови. К настоящему времени завершены государственные медицинские испытания данных наборов. Инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Одним из важных итогов данной работы явилась разработка принципов стандартизации технологии молекулярно-генетической идентификации личности и создание на их основе наборов реагентов CTWA и FFTL. Эти наборы реагентов зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники. В настоящее время наборы реагентов для идентификации личности CTWA и FFTL успешно применяются в 15 региональных Бюро судебно-медицинской экспертизы Российской Федерации.

Проведенные в работе экспериментальные исследования позволили создать технологии генетической идентификации растений родов Solanum и Brassica, включающие виды большого сельскохозяйственного значения, такие как картофель, масличный рапс, различные виды капусты и др. Эти технологии генотипирования позволяют надежно различать рода, виды, сорта и предназначены для решения задач современной селекции, таких как поддержание генетических коллекций, анализ родословных, подбор родительских форм для скрещивания, контроль интрогрессии генетического материала, регистрация новых сортов, создание «генетических паспортов» сельскохозяйственных растений, представляющих собой основу защиты интеллектуальной собственности селекционеров.

Разработанные методики легли в основу методических рекомендаций, изданных Всероссийским научно-исследовательским институтом сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН для специалистов-биотехнологов, сельскохозяйственных биотехнологических и селекционных центров.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шилов, Илья Александрович, Москва

1. Bertina R.M., Koeleman В.Р., Koster Т., Rosendaal F.R., Dirven R.J., Ronde H., Velden P.A., Reitsma P.H. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance activated protein С //Nature. 1994. V. 369. P.64-67.

2. Rosendaal F.R., Koster Т., Vandenbroulke J.P., Reitsma P.H. High risk of thrombosis in patients homozygous for factor V Leiden (activated protein С resistance)//Blood. 1995. V. 85. P. 1504-1508.

3. Cohen D. Inherited thrombophilia and pregnancy: complications, diagnosis, and treatment//Am. Biotech. Lab. 2002. V. 4. P. 22-24.

4. Gerhardt A., Scharf R.E., Beckmann M.W., Struve S„ Bender H.G., Pillny M., Sandmann W., Zotz R.B. Prothrombin and factor V mutations in women with a history of thrombosis during pregnancy and the puerperium // N. Engl. J. Med. 2000. V. 342. P. 374-80.

5. Lin J., August P. Genetic thrombophilias and preeclampsia: a meta-analysis // Obstet. Gynecol. 2005. V. 105. P. 182-192.

6. Hobikoglu G.F., Akyuz U., Akyuz F., Ozer O., Guney D., Narin A., Unaltuna N. Factor V Leiden is a risk factor for myocardial infarction in young Turkish men // Acta. Cardiol. 2004. V. 59. P. 594-597.

7. Seligsohn U., Lubetsky A. Genetic susceptibility to venous thrombosis // N. Eng. J. Med. 2001. V. 344. P. 1222-1231.

8. Gadelha T, Andre C., Juca A.A., Nucci M. Prothrombin 2021 OA and oral contraceptive use as risk factors for cerebral venous thrombosis // Cerebrovasc. Dis. 2005. V. 19. P. 49-52.

9. McGlennen R.C., Key N.S. Clinical and laboratory management of the prothrombin G20210A mutation // Arch. Pathol. Lab. Med. 2002 V. 126. P. 1319-1325.

10. Botto L.D., Yang Q. 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase gene variants and congenital anomalies: a huge review // Am. J. Epidemiol. 2000. V. 151. P. 862877.

11. Park H., Kim Y.J., На E.H., Kim K.N., Chang N. The risk of folate and vitamin В12 deficiencies associated with hyperhomocysteinemia among pregnant women // Am. J. Perinatal. 2004. V. 21. P. 469-475.

12. Kang S.S., Wong P.W., Bock H.G., Horwitz A., Grix A. Intermediate hyperhomocysteinemia resulting from compound heterozygosity of methylenetetrahydrofolate reductase mutations // Am. J. Hum. Genet. 1991. V. 48. P. 546-551.

13. Shen H., Newmann A.S., Hu Z., Zhang Z., Xu Y., Wang L., Ни X., Guo J., Wang X., Wei O. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms/haplotypes and risk of gastric cancer: a case-control analysis in China // Oncol. Rep. 2005. V. 13. P. 355360.

14. Kang S.S., Wong P.W., Susmano A., Sora J., Norusis M., Ruggie N. Thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase: an inherited risk factor for coronary artery disease // Am. J. Hum. Genet. 1991. V. 48. P. 536-545.

15. Grody W.W., Telatar M. Multiplex SNP analysis: screening factor V R506Q (Leiden) mutations // Am. Biotech. Lab. 2003. V. 2. P. 34-37.

16. Liew M., Pryor R., Palais R., Meadows C., Erali M., Lyon E., Wittwer C. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons // Clin. Chem. 2004. V. 50. P. 1156-1164.

17. Чистяков Д.А., Чугунов JI.А., Шамхалова М.Ш., Шестакова М.В., Миленькая Т.М. Полиморфизм гена сосудистого рецептора ангиотензиногена II и микроангиопатия при инсулинзависимом сахарном диабете // Генетика. 1999. Т.35. С. 1289-1293.

18. Jeunemaitre X., Soubrier F., Kotelevtsev Y., Lifton R., Williams C., Charru A. Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen // Cell. 1992. V. 71. P. 169-180.

19. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: в 2-х томах. Т. 2. Пер. с англ. //М.: Мир. 1993.415 с.

20. Walker W., Whelton P., Saito H., Russel R. Relation between blood pressure and renin, renin substrate, angiotensin II, aldosterone and urinary sodium and potassium in 574 ambulatory subjects // Hypertension. 1979. V. 1. P. 287-291.

21. Hata A., Namikawa C., Sasaki M., Sato K., Nakamura Т., Tamura K., Lalouel J.-M. Angiotensinogen as a risk factor for essential hypertension in Japan.// J. Clin. Invest. 1994. V. 93. P. 1285-1287.

22. Schunkert H., Hense H., Gimenez-Roqueplo A., Stieber J., Keil U. The angiotensinogen T235 variant and the use of antihypertensive drugs in a population-based cohort//Hypertension. 1997. V. 29. P. 628-633.

23. Staessen J., Ginocchio G., Wang J., Saavedra A., Soubrier F., Vlietinck R., Fagard R. Genetic variability in the renin-angiotensin system: prevalence of alleles and genotypes II J. Cardiovask. Rise. 1997. V. 4. P. 401-422.

24. Schunkert H., Hense H.W., Gimenez-Roqueplo A.P., Stieber J., Keil U., Riegger G.A., Jeunemaitre X. The angiotensinogen T235 variant and the use ofantihypertensive drugs in a population-based cohort. // Hypertension. 1997. V. 29. P. 628-633.

25. Shoji M., Tsutaya S., Takamatu H., Yasujima M. Hypertension and gene polymorphisms // Rinsho. Byori. 2001. V. 49. P. 157-160.

26. Jeunemaitre X., Inoue I., Williams C.,Tichet J., Powers M. Haplotypes of angiotensinogen in essential hypertension // Am. J. Hum. Genet. 1997. V. 60. P. 1448-1460.

27. Sasaki N. The relationship of salt intake to hypertension in the Japanese // Geriatrics. 1964. V. 19. P. 735-744.

28. Caulfield M., Lavender P., Newell-Price J., Farrall M., Kamdar S. Linkage of the angiotensinogen gene locus to human essential hypertension in African Caribbeans // J. Clin. Invest. 1995. V. 96. P. 687-692.

29. Mondry A., Loh M., Liu P., Zhu A.L., Nagel M. Polymorphisms of the insertion / deletion ACE and M235T AGT genes and hypertension: surprising new findings and meta-analysis of data // BMC Nephrol. 2005. V. 6. P. 1-11.

30. Caulfield M., Lavender P., Farrall M., Munroe, P., Lawson M., Turner P., Clark A. Linkage of the angiotensinogen gene to essential hypertension // New Eng. J. Med. 1994. V. 330. P. 1629-1633.

31. Fardella C., Zamorana P., Mosso L., Gomes L., Pinto M., Soto J. A(-6)G variant of angiotensinogen gene and aldosterone levels in hypertensives // Hypertension. 1999. V. 34. P. 779-81.

32. Yanai K., Nibu Y., Murakami K., Fukamizu A. A cis-acting DNA located between TATA box and transcription initiation site is critical in response to regulatory sequence in human angiotensinogen gene // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 1598115986.

33. Morishita R., Higaki J., Tomita N., Aoki M., Moriguchi A., Tamura K. Role of transcriptional cis-elements? Angiotensinogen gene-activating elements of angiotensinogen gene in blood pressure regulation // Hypertension. 1996. V. 27. P. 502-507.

34. Ward K., Hata A., Jeunemaitre X., Helin C., Nelson L., Namikawa C., Farrington P. A molecular variant of angiotensinogen associated with preeclampsia // Nature Genet. 1993. V. 4. P. 59-61.

35. Arngrimsson R., Purandare S., Connor M., Walker J., Bjornsson S., Soubrier F. Angiotensinogen: a candidate gene involved in preeclampsia? // Nature Genet. 1993. V.4. P. 114-115.

36. Morgan L., Baker F., Pipkin F., Kalsheker N. Pre-eclampsia and the angiotensinogen gene // Br. J. Obstet. Gynaecol. 1995. V. 102. P. 489-490.

37. Bouba I., Makrydimas G., Kalaitzidis R., Lolis D.E., Siamopoulos K.C., Georgiou I. Interaction between the polymorphisms of the renin-angiotensin system in preeclampsia// Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2003. V.l 10. P. 8-11.

38. Chesley L., Cooper D. Genetics of hypertension in pregnancy: possible single gene control of pre-eclampsia in the descendants of eclamptic women // Br. J. Obstet. Gynaecol. 1990. V. 97. P. 762-769.

39. Ikedife D. Eclampsia in multipara // Br. Med. J. 1980. V. 1. P. 985-986.

40. Tornton J., Onwude J. Pre-eclampsia: discordance among identical twins // Br. Med. J. 1991. V. 303. P. 1241-1242.

41. Pipkin F., Roberts J. Hypertension in pregnancy // J. Hum. Hypertens. 2000. V. 14. P. 705-724.

42. Morgan Т., Craven C., Ward K. Human spiral artery renin-angiotensin system // Hypertension. 1998. V. 32. P. 683-687.

43. Morgan J., Craven C., Nelson L., Lalouel J.M., Ward K. Angiotensinogen T235 expression is elevated in decidual spiral arteries // J. Clin. Invest. 1997. V. 100. P. 1406-1415.

44. Brenner D., Labreuche J., Poirier O., Cambien F., Amarenco P. Renin-angiotensin-aldosterone system in brain infarction and vascular death. // Ann. Neurol. 2005. V. 58. P. 131-138.

45. Kiema T.R., Kauma H., Rantala A., Lilja M., Reunanen A. Variation at the angiotensin-converting enzyme gene and angiotensinogen gene loci in relation to blood pressure // Hypertension. 1996. V. 28. P. 1070-1075.

46. Guo G., Wilton A., Fu Y., Qui H., Brennecke S. Angiotensinogen gene variation in a population case-control study of preeclampsia/eclampsia in Australians and Chinese //Electrophoresis. 1997. V. 18. P. 1646-1649.

47. Риггз Б.Л., Мелтон Л.Д. Остеопороз: этиология, диагностика, лечение // М.: Невский диалект. Бином. 2000. 560 с.

48. Eisman J.A. Genetic of osteoporosis // Endocrine Rev. 1999. V. 20. P. 788-804.

49. Stewart T.L., Ralston S.H. Genetic of osteoporosis // J. Endocrinol. 2000. V. 166. P. 235-245.

50. Haussler M.R. Vitamin D receptors: nature and function // Annu. Rev. Nutr. 1986. V. 6. P. 527-562.

51. Morrison N.A., Qi J.C., Tokita A. Contribution of trans-acting factors alleles to normal physiological variability: vitamin D receptor gene polymorphismand circulating osteocalcin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 6665-6669.

52. Farrow S. Allelic variations of vitamin D receptor // Lancet. 1994. V. 343. P. 1242.

53. Gross C., Krishnan A.V., Malloy P.J., Eccleshall T.R., Zhao X.Y., Feldman D. The vitamin D receptor gene start codon polymorphism: a functional analysis of Fokl variants // J. Bone Miner. Res. 1998. V. 13. P. 1691-1699.

54. Morrison N.A., Qi J.C., Tokita A., Kelly P., Crofts L., Nguyen T.V., Sambrook P. N., Eisman J. A. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles // Nature. 1994. V. 367. P. 284-287.

55. Ingles S.A., Ross R.K., Yu M.C., Irvine R.A., La Pera G., Haile R.W., Coetzee G.A // J. Natl. Cancer Institute. 1997. V. 89. P. 6-10.

56. Кольман Я., Рем К. -Г. Наглядная биохимия // М: Мир. 2000. 322 с.

57. Grant S.F.A., Reid D.M., Blake G., Herd R., Fogelman I., Ralston S.T. Reduced bone density and osteoporosis associated with a polymorphic Spl binding site in the collagene type I al gene // Nat. Genet. 1996. V. 14. P. 203-205.

58. Qureshi A.M., McGuigan F.E., Seymour D.G., Hutchison J.D., Reid D.M., Ralston S.H. Association between COLIA1 Spl Alleles and femoral neck geometry // Calcif. Tissue Int. 2001. V. 69. P. 67-72.

59. Weichetova M., Stepan J.J., Michalska D., Haas Т., Pols H.A., Uitterlinden A.G. COLIA1 Polymorphism contributes to bone mineral density to assess prevalent wrist fractures // Bone. 2000. V. 26. P. 287-290.

60. Liden M., Wilen В., Ljunghall S., Melhus H. Polymorphism at th Spl binding site in the COLIA1 gene does not predict bone mineral density in postmenopausal women in Swedish // Calcif. Tissue Int. 1998. V. 63. P. 293-295.

61. Sano M., Inoue S., Hosoi Т., Ouchi Y., Emi M., Shiraki M., Orimo H. Association of estrogen receptor dinucleatide polymorphism with osteoporosis // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1995. V. 217. P. 378-383.

62. Kobayashi S., Inoue S., Hosoi Т., Shiraki M., Orimo H. Association of bone mineral density with polymorphisms of the estrogen receptor gene in post-menopausal women // J. Bone Miner. Res. 1996. V. 11. P. 306-311.

63. Sowers M., Willing M., Burns Т., Deschenes S., Hollis В., Crutchfield M., Jannausch M. Genetic markers, bone mineral density and serum osteocalcin levels // J. Bone Miner. Res. 1999. V. 14. P. 1411-1419.

64. Langdahl B.L., Gravholt C.H., Brixen K., Eriksen E.F. Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and bone mass, bone turnover and osteoporotic fractures // Eur. J. Clin. Invest. 2000. V. 30. P. 608-617.

65. Kikuchi R., Uemura Т., Gorai I., Ohno S., Minaguchi H. Early and late postmenopausal bone loss is associated with BsmI vitamin D receptor gene polymorphism in Japanese women // Calcif. Tissue Int. 1994. V. 64. P. 102106.

66. Sokolov B.P. Primer extension technique for the detection of single nucleotide in genomic DNA // Nucl. Acids. Res. 1990. V. 18. P. 3671.

67. Sanchez J.J., Borsting C., Morling N. Typing of Y chromosome SNPs with multiplex PCR methods // Methods Mol. Biol. 2005. V. 297. P. 209-228.

68. Ben-Avi L., Durst R., Shpitzen S., Leitersdorf E., Meiner V. Apolipoprotein E genotyping: accurate, simple, high throughput method using ABI Prism SNaPshot Multiplex System // J. Alzheimers Dis. 2004. V. 6. P. 497-501.

69. Il'ina E.N., Malakhova M.V., Generozov E.V., Nikolaev E.N., Govorun V.M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (mass spectrometry) for hepatitis С virus genotyping // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. P. 2810-2815.

70. Li J., Butler J.M., Tan Y., Lin H., Royer S. Single nucleotide polymorphism determination using primer extension and time-of-flight mass spectrometry // Electrophoresis. 1999. V. 20. P. 1258-1265.

71. Ross P., Hall L., Smirnov I., Haff L. High level multiplex genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry // Nat. Biotech. 1998. V. 16. P. 1347-1351.

72. Xiao M., Phong A., Lum K., Greene R., Buzby P., Kwok P.-Y. Role of excess inorganic pyrophosphate in primer-extension genotyping assays // Genome Res. 2004. V. 14 P. 1749-1755.

73. Kornher J.S., Livak K.J. Mutation Detection using nucleotide analogs that alter electrophoretic mobility // Nucl. Acids. Res. 1989. V. 17. P. 7779-7784.

74. Syvanen A.C., Aalto-Setala K., Haiju L., Kontula K., Soderlimd H. A primer-guided nucleotide incorporation assay in the genotyping of apolipoprotein E // Genomics. 1990. V. 8. P. 684-692.

75. Lee J.S., Anvret M. Identification of the most common mutation within the porphobilinogen deaminase gene in Swedish patients with acute intermittent porphyria//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 10912-10915.

76. Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing // Genome Res. V. 11. P. 3-11.

77. Ahmadian A., Gharizadeh В., Gustafsson A.C., Sterky F., Nyren P., Uhlen M., Lundeberg J. Single nucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing // Anal. Biochem. 2000. V. 280. P. 103-110.

78. Wilde J.T., O'Sullivan J.J., Roper J.L., Aerts P., Horowitz M., Navot N. A novel ELISA-based primer extension assay for the detection of the factor V Leiden mutation//British J. Haematology. 1999. V. 106. P. 427.

79. Andersen P.S., Jespersgaard C., Vuust J., Christiansen M., Larsen L.A. Capillary electrophoresis-based single strand DNA conformation analysis in high-throughput mutation screening // Human Mutat. 2003. V. 21. P. 455-465.

80. Marziali A., Akeson M. New DNA sequencing methods // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2001. V. 3.P. 195-223.

81. Kwok P.-Y. Methods of genotyping of single nucleotide polymorphisms // Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001. V. 2. P. 235-258.

82. Chen X., Levine L., Kwok P.-Y. Fluorescence polarization in homogeneous nucleic acid analysis // Genome Res. 1999. V. 9. P. 492-498.

83. Greene R.A., DiMeo J.J., Malone M.E., Swartwout S., Liu J., Buzby P.R. Acyclo-prime, a novel method for SNP analysis using fluorescence polarization // Proc. SPIE. 2002. V. 4626. P. 332-339.

84. Lyamichev V., Brow M.A., Dahlberg J.E. Structure specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases // Science. 1993. V. 260. P. 778 783.

85. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. V. 6. P. 986-994.

86. Alves A.M., Carr F.J. Dot blot detection of point mutations with adjacently hybridizing synthetic oligonucleotide probes // Nucl. Acids Res. 1988. V. 16. P. 8723.

87. Landegren U., Kaiser R., Sanders J., Hood L. A ligase-mediated gene detection technique//Science. 1988. V. 241. P. 1077-1080.

88. Sekiguchi J., Shuman S. Nick sensing by vaccinia virus DNA ligase requires a 5' phosphate at the nick and occupancy of the adenylate binding site on the enzyme // J. Virol. 1997. V. 71. P. 9679-9684.

89. Conner B.J., Reyes A.A. Detection of sickle cell beta S-globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 278282.

90. Farr C.J., Saiki R.K., Erlich H.A., McCormick F., Marshall C.J. Analysis of ras gene mutations in acute myeloid leukemia by polymerase chain reaction and oligonucleotide probes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 16291633.

91. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 6230-6234.

92. Day I.N., O'Dell S.D., Cash I.D., Humphries S.E., Weavind G.P. Electrophoresis for genotyping: temporal thermal gradient gel electrophoresis for profiling of oligonucleotide dissociation // Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 2404-2412.

93. Dahlen P., Carlson J., Liukkonen L., Lilja H., Siitari H. Europium-labeled oligonucleotides to detect point mutations: application to PIZi-antitrypsin deficiency //Clin. Chem. 1993. V. 39. P. 1626-1631.

94. Tong D., Kucera E., Stimpfl M., Kolbl H., Leodolter S., Zeillinger R. Detection of p53 polymorphism at codon 72 by PCR and allele-specific oligonucleotide hybridization on microtiter plates // Clin. Chem. 2000. V. 46. P. 124-126.

95. Kozlowski P., Krzyzosialc W.J. Structural factors determining DNA length limitations in conformation-sensitive mutation detection methods // Electrophoresis. 2005. V. 26. P. 71-81.

96. Kleparnik K., Grochova D., Skopkova Z., Adam T. Detection of the major mutation M467T causing cystinuria by single-strand conformation polymorphism analysis using capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 57-64.

97. Esteban-Cardenosa E., Duran M., Infante M., Velasco E., Miner C. High-throughput mutation detection method to scan BRCAI and BRCA2 based on heteroduplex analysis by capillary array electrophoresis // Clin. Chem. 2004. V. 50. P. 313-320.

98. Sozen M., Whittall R., Humphries S.E. Mutation detection in patients with familial hypercholesterolaemia using heteroduplex and single conformation polymorphism analysis by capillary electrophoresis // Atherosclerosis Suppl. 2004. V. 5. P. 7-11.

99. Atha D.H., Wenz H.M., Morehead H., Tian J., O'Connell C.D. Detection of p53 point mutations by single strand conformation polymorphism: analysis by capillary electrophoresis//Electrophoresis. 1998. V. 19. P. 172-179.

100. Goodman M.F. DNA polymerase fidelity: misinsertions and mismatched extensions. In: Innis M.A. PCR strategies // San Diego: Academic Press. 1995. P. 17-31.

101. Arguello JR, Little AM, Pay AL, Gallardo D, Rojas I, Marsh SG, Goldman JM, Madrigal JA. Mutation detection and typing of polymorphic loci throughdouble-strand conformation analysis // Nat. Genet. 1998. V. 18. P. 192-194.

102. Kozlowski P., Krzyzosiak W.J. Combined SSCP/duplex analysis by capillary electrophoresis for more efficient mutation detection // Nucl. Acids Res. 2001. V. 29. P. e71.

103. Orita M., Suzuki Y., Sekiya Т., Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorohisms using the polymerase chain reaction // Genomics. 1989. V. 5. P. 874-879.

104. Hayashi K., Wenz H.M., Inazuka M., Tahira Т., Sasaki Т., Atha D.H. SSCP analysis of point mutations by multicolor capillary electrophoresis // Methods Mol. Biol. 2001. V. 163. P. 109-126.

105. Ellis L.A., Taylor C.F., Taylor G.R. A comparison of fluorescent SSCP and denaturing HPLC for high throughput mutation scanning // Hum. Mutat. 2000. V. 15. P. 556-564.

106. Tsang T.C., Bentley D.R., Nilsson I.M., Giannelli F. The use of DNA amplification for genetic counseling related diagnosis in haemophilia В // Thromb. Haemost. 1989. V.61.P. 343-347.

107. Chen J., Viola M.V. A method to detect ras point mutations in small subpopulations of cells //Anal. Biochem. 1991. V. 195. P. 51-56.

108. Khan S.M., Jiang W., Culbertson T.A. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via "enriched" PCR amplification // Oncogene. 1991. V. 6. P. 1079-1083.

109. Zhao C., Xu G., Gao P., Yang J., Shi X., Tian J. Rapid identification of pathogenic bacteria by capillary electrophoretic analysis of rRNA genes // J. Separation Sci. 2005. V. 28. P. 513-521.

110. Ho H.-T., Chang P.-L., Hung C.-C., Chang H.-T. Capillary electrophoretic restriction fragment length polymorphism patterns for the Mycobacterial hsp65 gene // J. Clin. Microbiology. 2004. V. 42. P. 3525-3531.

111. Qiu P, Shandilya H, D'Alessio JM, O'Connor K, Durocher J, Gerard GF. Mutation detection using Surveyor nuclease // Biotechniques. 2004. V. 36. P. 702-707.

112. Till В., Burtner C., Comai L., Henikoff S. Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases // Nucl. Acids Res. 2004. V. 32. P. 2632-2641.

113. Marziali A., Akeson M. New DNA sequencing methods // Ann. Rev. Biomed. Eng. 2001. V. 3. P. 195-223.

114. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 2503-2516.

115. Wu D.Y., Ugozzoli L., Pal B.K., Wallace R.B. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 2757-2760.

116. Sommer S.S., Cassady J.D., Sobel J.L., Bottema C.D. A novel method for detecting point mutations or polymorphisms and its application to population screening for carriers of phenylketonuria // Mayo Clin. Proc. 1989. V. 64. P. 1361-1372.

117. Rust S„ Funke H., Assmann G. Mutagenically separated PCR (MS-PCR): a highly specific one step procedure for easy mutation detection // Nucl. Acids Res. 1993. V. 21. N. 16. P. 3623-3629.

118. Okayama H., Curiel D.T., Brantly M.L., Holmes M.D. and Crystal R.G. Rapid, nonradioactive detection of mutations in the human genome by allele-specific amplification//J. Lab. Clin. Med. 1989. V. 114. P. 105-113.

119. Gibbs R.A., Nguyen P.N., Caskey C.T. Detection of single DNA base differences by competitive oligonucleotide priming // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 2437-2448.

120. Chehab F.F., Kan Y.W. Detection of specific DNA sequences by fluorescence amplification: a color complementation assay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 9178-9182.

121. Kropp G.L., Fucharoen S., Embury S.H. Asymmetrically primed selective amplification/temperature shift fluorescence polymerase chain reaction to detect the hemoglobin constant spring mutation // Blood. 1991. V. 78. P. 26-29.

122. Li H., Cui X., Arnheim N. Direct electrophoretic detection of the allelic state of single DNA molecules in human sperm by using the polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 4580-4584.

123. Dutton C. and Sommer S.S. Simultaneous detection of multiple single-base alleles at a polymorphic site // Biotechniques. 1991. V. 11. P. 700-702.

124. Lo Y.M., Patel P., Newton C.R., Markham A.F., Fleming K.A., Wainscoat J.S. Direct haplotype determination by double ARMS: specificity, sensitivity and genetic applications//Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 3561-3567.

125. Sommer S.S., Groszbach A.R., Bottema C.D. PCR amplification of specific alleles (PASA) is a general method for rapidly detecting known single-base changes // Biotechniques. 1992. V. 12. P. 82-87.

126. Ferrie R.M., Schwarz M.J., Robertson N.H. Development, multiplexing and application of ARMS tests for common mutations in the CFTR gene // Am. J. Hum. Genet. 1992. V. 51. P. 251-262.

127. Germer S., Higuchi R. Single-tube genotyping without oligonucleotide probes // Genome Res. 1999. V. 9. P. 72-78.

128. Xiao M., Phong A., Lum K., Greene R., Buzby P., Kwok P.-Y. Role of excess inorganic pyrophosphate in primer-extension genotyping assays // Genome Res. 2004. V. 14. P. 1749-1755.

129. Decker K., Trager Т., Missel A., Heitz K., Kobsch S., Machura K., LafFert D. Optimizing probe hybridization in real-time PCR for quantification and SNP genotyping // Qiagen News. 2002. V. 4. P. 13-16.

130. Huang J., Lu J., Barany F., Cao W. Multiple cleavage activities of endonuclease V from Thermotoga maritima: recognition and strand nicking mechanism // Biochemistry. 2001. V 40. P. 8738-8748.

131. Vaughan P., McCarthy T.V. A novel process for mutation detection using uracil DNA-glycosylase // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 810-815.

132. Shagin D.A., Rebrikov D.V., Kozhemyako V.B., Altshuler I.M., Shcheglov A.S., Zhulidov P.A., Bogdanova E.A., Staroverov D.B., Rasskazov V.A., Lukyanov S.A.

133. A novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from Crab hepatopancreas // Genome Res. 2002. V. 12. P. 1935-1942.

134. BotsteinD., Write R.L., SkolnikM., Davis R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms // Am. J. Hum. Genet. 1980. V. 32. P. 314-331.

135. Картель H. А., ПроснякМ.И., КорзунВ.Н. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК и его использование в генетике и селекции растений // Сельскохозяйственная биология. 1991. № 5. С. 41-48.

136. КорзунВ.Н., Плашке И., БернерА., Картель Н.А. ПДРФ-картирование гена карликовости ctl в геноме ржи Secale cereale L. // Генетика. 1995. Т. 31. № 9. С. 1282-1286.

137. Apuya N.R., Frazier B.L., Keim P., Roth E.J., Lark K.G. Restriction fragment length polymorphisms as genetic markers in soybean // Theor. Appl. Genet. 1988. V. 75. P. 889-901.

138. Bonierbale M.W., Plasted R.L., Tanksley S.D. RFLP maps based on a common set of clones reveal modes of chromosomal evolution in potato and tomato // Genetics. 1988. V. 120. P. 1095-1103.

139. Chang C., Bowman J.L., DejohnA.W., Lander E.S., Meyerowitz E.M. Restriction fragment length polymorphism linkage map for Arabidopsis thaliana II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 6856-6860.

140. Helentjaris T. A genetic lineage map for maize based on RFLP // Trends in Genetics. 1992. V. 3. P. 215-219.

141. McCouch S.R., KochertG., YuZ.H., WangZ.Y., KhushG.S., CoffmanW.R., Tankersly S.D. Molecular mapping of rice chromosomes // Theor. Appl. Genet. 1988. V. 76. P. 815-829.

142. Williams J.G., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.

143. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers //Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 7213-7218.

144. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gressho P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers // Biotechnology. 1991. V. 9. P. 553-557.

145. JoshiC.P., Nguyen H.T. Application of random amplified polymorphic DNA technique for the detection of polymorphism among wild and cultivated tetraploid wheats // Genome. 1993. V. 36. P. 602-609.

146. Koller В., Lehmann A., McDermott J.M., Gessler C. Identification of apple cultivars using RAPD markers // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 85. P. 901-904.

147. MultaniD.S., LyonB.R. Genetic fingerprinting of Australian cotton cultivars with RAPD markers//Genome. 1995. V. 35. P. 1005-1008.

148. Оганисян A.C., КочиеваЕ.З., Рысков А.П. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR // Генетика. 1996. Т. 32. № 3. С. 448451.

149. Somers D.J., Rakow G., Prabhu V.K., Friesen K.R.D. Identification of a major gene and RAPD markers for yellow seed coat colour in Brassica napus II Genome. 2001. V. 44. P. 1077-1082.

150. Ge Z„ Taylor D.E. Helicobacter pylori molecular genetics and diagnostic typing // Br. Med. Bull. 1998. V. 54. P. 31-38.

151. Abba M.C., Golijow C.D. Herpes simplex virus genotyping: multiple optional PCR-based RFLP systems and a non-isotopic single-strand conformation polymorphism method // J. Virol. Methods. 2004. V. 118. P. 73-76.

152. MorganteM., HanaferM., Powell W. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetetive DNA in plant genomes // Nat. Genet. 2002. V. 30. P. 194-200.

153. Gur-ArieR., CobenCJ., EitanY., Shelf I., Hallerman E.M., KashiY. Simple sequence repeat in Escherichia coli: abundance, distributions, composition, and polymorphism // Genome Res. 2000. V. 10. P. 62-71.

154. Chambers G.K., MacAvoy E.S. Microsatellites: consensus and controversy // Сотр. Biochem. Physiol. 2000. V. 126. P. 455-476.

155. PanaudO., ChenX., McCouchS.R. Frequency of microsatellite sequence in rice (Oryza sativa L.) // Genome. 1995. V. 38. P. 1170-1176.

156. Hancock J.M. The contribution of slippage-like processes to genome evolution // J. Mol. Evol. 1995. V. 41. P. 1038-1047.

157. Beckmann J.S., Weber J.L. Survey of human and rat microsatellites // Genomics. 1992. V. 12. P. 627-631.

158. Lagercrantz U., EllegrenH., AnderssonL. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates // Nucl. Acids Res. 1993. V.21.P. 1111-1115.

159. TautzD., Schl6tterer C. Simple sequences // Curr. Opin. Genet. Dev. 1994. V. 4. P. 832-837.

160. Toth G., Gaspari Z., Jurka J. Microsatellites in different eucariotic genomes: survey and analysis // Genome Research. 2000. V. 10. P. 967-981.

161. KruglyakS., DurrettR.T., SchugM.D., AquadroC.F. Equilibrium distribution of microsatellite repeat length resulting from a balance between slippage events and point mutation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 10774-10778.

162. Jeffreys A.J., MacLeod A., Tamaki K., Neil D.L., Monckton D.G. Minisatellite repeat coding as digital approach to DNA typing // Nature. 1991. V. 354. P. 204209.

163. Bishop M.D., Kappes S.M., Keele J.W., Stone R.T., Sunden S.L., Hawkins G.A., Toldo S.S., Fries R., Grosz M.D., Yoo J. A genetic linkage map for cattle // Genetics. 1994. V. 136. P. 619-639.

164. Barendse W., Armitage S.M., Kossarek L.M., Shalom A., Kirkpatrick B.W., Ryan A.M., Clayton D., Li L., Neibergs H.L., Zhang N. A genetic linkage map of the bovine genome //Nature Genet. 1994. V. 6. P. 227-235.

165. Озеров М.Ю., Тапио М., Марзанов Н.С., Насибов М.Г., Шайдуллин И.Н., Кантанен Ю. Микросателлитный анализ эволюционно-генетических связей у различных пород овец // Доклады РАСХН. 2006. № 2. С. 30-33.

166. Ferretti L., Leone P., Pilla F., Zhang Y., Nocart M., Guerin G. Direct characterization of bovine microsatellites from cosmids: polymorphism and synteny mapping //Anim. Genet. 1994. V. 25. P. 209-214.

167. Swinburne J.E., Marti E., Breen M., Binns M.M. Characterization of twelve new horse microsatellite loci: AHT12-AHT23 // Anim. Genet. 1997. V. 28. P. 453.

168. Maxam A., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages // Methods Enzymol. 1980. V. 65. P. 499-560.

169. New England Biolabs Inc. 1998/99 Catalog // P. 91.

170. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M. Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M., van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P. 495-503.

171. Kidwell, K.K., Osborn T.C. Plant Genomes: Methods for Genetic and Physical Mapping // Kluever Academic Publishers Group. A.H. Dordrecht, The Netherlands. 2001. P. 1-13.

172. Sambrook J., Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual // Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

173. Gootlieb M., Chavko M. Silver staining of native and denatured eukaryotic DNA in agarose gels//Analytical Biochemistry. 1987. V. 165. P. 33-37.

174. Sanger F., NicklenS., CoulsonA.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

175. Sneath P.H.A., SokalR.P. Numerical taxonomy. The principles and practice of numerical classification // San Francisco: W.H. Freedman and Co. 1973.

176. Van de Peer Y., De Wacheter R. TREECON for Windows: A software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment//Сотр. Appl. Biosci. 1994. V. 10. P. 569-570.

177. Luo J., Bergstrom D., Barany F. Improving the fidelity of Thermus thermophilus DNA ligase // Nucl. Acids Res. 1996. V. 24. P. 3071-3078.

178. Патрушев Л.И. Экспрессия генов // M.: Наука 2000.527 с.

179. Locht L. Т., Kuypers A.W., Verbruggen B.W., Linssen Р.С., Novakova I.R., Mensink E. J. Semi-automated detection of the factor V mutation by allele specific amplification and capillary electrophoresis // Thromb. Haemost. 1995. V. 74. P. 1276-1279.

180. Rust S., Funke H., Assmann G. Mutagenically separated PCR (MS-PCR): a highly specific one step procedure for easy mutation detection // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 3623-3629.

181. Mitterer M., Lanthaler A.J., Mair W., Giacomuzzi K., Coser P. Simultaneous detection of FV Q506 and prothrombin 2021 OA variation by allele-specific PCR // Haematologica. 1999. V. 84. P. 204-207.

182. Hezard N., Cornillet-Lefebvre P., Gillot L„ Potron P., Nguyen P. Multiplex ASA PCR for a simultaneous determination of factor V Leiden gene, G->A 20210

183. Prothrombin gene and C-»T 677 MTHFR gene mutations // Thromb. Haemost. 1998. V. 79. P. 1054-1055.

184. Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material // Biotechniques. 1991. V. 10. P. 506-513.

185. Patrushev L.I., Zykova E.S., Kayushin A.L., Korosteleva M.D., Miroshnikov A.I., Bokarew I.N., Leont'ev S.G., Koshkin V.M., Severin E.S. New DNA diagnostic system for detection of factor V Leiden // Thromb. Res. 1998. V. 92. P. 251-259.

186. ГОСТ Р 51088-97 «Наборы реагентов для клинической лабораторной диагностики». Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 14 августа 1997 г. № 277.

187. Приказ МЗ РФ от 10 мая 2000 г. № 156 «О разрешении на применение в медицинских целях изделий медицинского назначения и медицинской техники отечественного и зарубежного производства в Российской Федерации».

188. GenePrint STR Systems (Silver Stain Detection). Technical Manual TMD004. Promega Corporation, Madison, WI, 1999.

189. Yoshida К., Sekiguchi К., Kasai К., Sato H., Seta S., Sensabaugh G. F. Evaluation of new primers for CSF1PO // Int. J. Legal Med. 1997. V. 110. P. 36-38.

190. Mills K.A., Even D., Murray J.C. Tetranucleotide repeat polymorphism at the human alpha fibrinogen locus (FGA) // Hum. Mol. Genet. 1992. V. 1. P. 779.

191. Polymeropoulos M.H., Xiao H., Rath D.S., Merril C.R. Tetranucleotide repeat polymorphism at the human tyrosine hydroxylase gene (TH) // Nucl. Acids Res. 1991. V.19. P. 3753.

192. Anker R., Steinbrueck T. and Donis-Keller H. Tetranucleotide repeat polymorphism at the human thyroid peroxidase (hTPO) locus // Hum. Mol. Genet. 1992. V. 1. P.137.

193. Kimpton C.P., Walton A., Gill P. A further tetranucleotide repeat polymorphism in the vWF gene // Hum. Mol. Genet. 1992. V. 1. P. 287.

194. Li H., Schmidt L., Wei M.-H., Hustad Т., Lerman M.I., Zbar В., Tory K. Three tetranucleotide polymorphisms for loci: D3S1352, D3S1358, D3S1359 // Hum. Mol. Genet. 1993. V. 2. P. 1327.

195. Lins A.M., Micka K.A., Sprecher C.J., Taylor J.A., Bacher J.W., Rabbach D., Bever R.A., Creacy S., Schumm J.W. Development and population study of an eight-locus short tandem repeat (STR) multiplex system // J. Forensic Sci. 1998. V. 43. P. 11681180.

196. Barber M.D., Parkin B.H. Sequence analysis and allelic designation of the two short tandem repeat loci D18S51 and D8S1179 // Int. J. Leg. Med. 1996. V. 109. P. 62-65.

197. Sharma V., Litt M. Tetranucleotide repeat polymorphism at the D21S11 locus // Hum. Mol. Genet. V. 1. P. 67.

198. Polymeropoulos M.H., Rath D.S., Xiao H., Merril C.R. Tetranucleotide repeat polymorphism at the human coagulation factor XIIIA subunit gene (F13A1) // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 4306.

199. Zuliani, G. and Hobbs, H.H. Tetranucleotide repeat polymorphism in the LPL gene // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 4958.

200. Polymeropoulos M.H., Rath D.S., Xiao H., Merril C.R. Tetranucleotide repeat polymorphism at the human c-fes/fps proto-oncogene (FES) // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 4018.

201. Nishimura D.Y., Murray J.C. A tetranucleotide repeat for the F13B locus // Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 1167.

202. Walsh P.S., Fildes N.J., Reynolds R. Sequence analysis and characterization of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWA // Nucl. Acids Res. 1996. V. 24. P. 2807-2812.

203. Hu G. DNA polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3' end of a DNA fragment // DNA Cell. Biol. V. 12. P. 763-770.

204. Watts D. Genotyping STR loci using an automated DNA sequencer // Methods Mol. Biol. 1998. V. 98. P. 193-208.

205. Kadash K., Kozlowski B.E., Biega L.A., Duceman B.W. Validation study of the TrueAllele automated data review system. // J. Forensic Sci. 2004. V. 49. P. 660667.

206. Matsumoto Т., Yukawa W., Nozaki Y., Nakashige R., Shinya M., Makino S., Yagura M., Ikuta Т., Imanishi Т., Inoko H., Tamiya G., Gojobori T. Novel algorithm for automated genotyping of microsatellites // Nucl. Acids Res. 2004. V. 32. P. 60696077.

207. Johansson A., Karlsson P., Gyllensten U. A novel method for automatic genotyping of microsatellite markers based on parametric pattern recognition // Hum. Genet. 2003. V. 113. P. 316-324.

208. Palsson В., Palsson F., Perlin M., Gudbjartsson H., Stefansson K., Gulcher J. Using quality measures to facilitate allele calling in high-throughput genotyping // Genome Res. 1999. V. 9. P. 1002-1012.

209. Idury R.M., Cardon L.R. A simple method for automated allele binning in microsatellite markers // Genome Res. 1997. V. 7. P. 1104-1109.

210. Cooke R.J., Reeves J.C. Plant genetic resources and molecular markers: variety registration in a new era // Plant Genet. Resources. 2003. V. 1. P. 81-87.

211. KnappS., BohsL., NeeM., SpoonerD.M. Solanaceae a model for linking genomics with biodiversity // Сотр. and Funct. Genomics. 2004. V. 5. P. 285-291.

212. Broun P., Tanskley S.D. Characterization and molecular genetic mapping of simple repeat sequences in tomato genome // Mol. Gen. Genet. 1996. V. 250. P. 39-49.

213. He C., Poysa V., Yu K. Development and characterization of simple sequence repeat (SSR) markers and their use in determining relationships among Lycopersicon esculentum cultivars // Theor. Appl. Genet. 2003. V. 106. P. 363-373.

214. VosmanB., ArensP. Molecular characterization of GATA/GACA microsatallite repeats in tomato // Genome. 1997. V. 40. P. 25-33.

215. Prince J.P., Lackney V.K., Angeles C., Blauth J.R., Kyle M.M. A survey of DNA polymorphism within the genus Capsicum and the fingerprinting of peper cultivar // Genome. 1995. V. 36. P. 404-417.

216. Paran I., Aftergoot E., Shifriss C. Variation in Capsicum annum revealed by RAPD and AFLP markers // Euphytica. 1998. V. 99. P. 167-173.

217. Rodriguez J.M., BerkeT., EngleL., NienhuisJ. Variation among and within Capsicum species revealed by RAPD markers // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 99. P. 147-156.

218. Lee J.M., Nahm S.H., Kim Y.M., Kim B.D. Characterization and molecular genetic mapping of microsatellite loci in pepper // Theor. Appl. Genet. 2004. V. 108. P. 619627.

219. LefebreV., PalloixA., CarantaC., Pochard E. Construction of an intraspecific integrated linkage map of pepper using molecular markers and doubled-haploid progenies//Genome. 1995. V. 38. P. 112-121.

220. Lee J.M., Kim B-D. Combined genome mapping of RFLP-AFLP-SSR in pepper // Genomics & Informatics. 2003. V. 1. P. 108-112.

221. Sanwen H., Baoxi Z., Milbourne D., Cardie L., Guimei Y., Janzhen G. Development of pepper SSR markers from sequence databases // Euphytica. 2000. V. 117. P. 163167.

222. NunomeT., IshiguroK., YoshidaT., HiraiM. Mapping of fruit shape and color development traits in eggplant (Solanum melongena L.) based on RAPD and AFLP markers //Breed. Sci. 2001. V. 51. P. 19-26.

223. KarihalooJ., BraunerS., Gottlieb L.D. Random amplified polymorphic DNA variation in the eggplant, Solanum melongena L. (Solanaceae) // Theor. Appl. Genet. 1995. V. 90. P. 767-770.

224. MaceE.S., Lester R.N., GebhardtC.G. AFLP analysis of genetic relationships among the cultivated eggplant, Solanum melongena L., and wild relatives (Solanaceae) // Theor. Appl. Genet. 1999. V. 99. P. 626-633.

225. Kawchuk L.M., Lynch D.R., Thomas J., Penner В., Sillito D., Kulcsar F. Characterization of Solarium tuberosum simple repeats and application to potato cultivar identification // Am. Potato J. 1996. V. 73. P. 325-333.

226. Powell W., Machray G.C., Provan J. Polymorphism by simple sequence repeats // Trends in Plant Sci. 1996. V. 1. P. 215-222.

227. MilbourneD., Meyer R.C., Collins A.J., Ramsay L.D., GebhardtC., WaughR. Isolation, characterization and mapping of simple sequence repeat loci in potato // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 259. P. 233-245.

228. Ashkenazi V., Chani E., Lavi U., Levy D., Hillel J., Veilleux R.E. Development of microsatellite markers in potato and their use in phylogenetic and fingerprinting analyses // Genome. 2001. V. 44. P. 50-62.

229. McGregor C.E., Lambert C.A., Greyling M.M., LouwJ.H., WarnichL. A comparative assessment of DNA fingerprinting techniques (RAPD, ISSR, AFLP and SSR) in tetraploid potato {Solarium tuberosum L) // Euphytica. 2000. V. 113. P. 135144.

230. NeiM., LiW.H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of rectriction endonucleases // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 5269-5273.

231. Humans R.J., Spooner D.M. Geographic distribution of wild potato species // Am. J. Botany. 2001. V. 88. P. 2101-2112.

232. U N. Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization // Jpn. J. Bot. 1935. V. 7. P. 389-452.

233. Lowe A.J., Jones A.E., Raybould A.F., Trick M., Moule C.J., Edwards K.J. Transferability and genome specificity of a new set of microsatellite primers among Brassica species of the U triangle // Mol. Ecol. Notes. 2002. V. 2. P. 7-11.

234. Lowe A.J., Moule С., Trick M., Edwards K.J. Efficient large-scale development of microsatellites for marker and mapping applications in Brassica crop species // Theor. Appl. Genet. 2004. V 108. P. 1103-1112.

235. Ryder C.D., Smith L.B., Teakle G.R., King G.J. Contrasting genome organisation: two regions of the Brassica oleracea genome compared with collinear regions of the Arabidopsis thaliana genome // Genome. 2001. V. 44. P. 808-817.

236. Szewc-McFadden A.K., Kresovich S, Bliek S.M., Mitchell S.E., McFerson J.R. Identification of polymorphic, conserved simple sequence repeats (SSRs) in cultivated Brassica species // Theor. Appl. Genet. 1996. V. 93. P. 534-538.

237. Sharpe A.G., Lydiate G.J. Mapping the mosaic of ancestral genotypes in a cultivar of oilseed rape (Brassica napus) selected via pedigree breeding // Genome. 2003. V. 46. P. 461-468.

238. Suwabe K., Iketani H., Nunome Т., Kage Т., Hirai M. Isolation and characterization of microsatellites in Brassica rapa L. // Theor. Appl. Genet. 2002. V. 104. P. 10921098.

239. Uzunova M.I., Ecke W. Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in oilseed rape (Brassica napus L.) // Plant Breed. 1999. V. 118. P. 323-326.

240. Bell C.J., Ecker J.R. Assignment of 30 microsatellite 1 linkage map of Arabidopsis // Genomics. 1994. V. 19.137-144.

241. Tongue M., Griffiths P.D. Transfer of powdery mildew resistance from Brassica carinata to Brassica oleracea through embryo rescue // Plant Breed. 2004. V.123. P. 1-3.

242. Westman A.L., Kresovich S. Simple sequence repeat (SSR)-based marker variation in Brassica nigra genebank accessions and weed populations // Euphytica. 1999. V. 109. P. 85-92.

243. Plieske J., Struss D. STS markers linked to Phoma resistance genes of the Brassica B-genome revealed sequence homology between Brassica nigra and Brassica napus. II Theor. Appl. Genet. 2001. V. 102. P.483^188.

244. Westman A.L., Kresovich S. The potential for cross-taxa simple-sequence repeat (SSR) amplification between Arabidopsis thaliana L. and crop brassicas // Theor. Appl. Genet. 1998. V. 96. P. 272-281.

245. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи. М: Колос. 1971.

246. Schelfhout C.J., Snowdon R„ Cowling W.A., Wroth J.M. A PCR based B-genome-specific marker in Brassica species // Theor. Appl. Genet. 2004. V. 109. P. 917-921.

247. Song K.M., Osborn T.C., Williams P.H. Brassica taxonomy based on nuclear restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) 1. Genome evolution of diploid and amphidiploid species // Theor. Appl. Genet. 1988. V. 75. P. 784-794.

248. Warwick S.I., Sauder C.A. Phylogeny of tribe Brassiceae (Brassicaceae) based on chloroplast restriction site polymorphisms and nuclear ribosomal internal transcribed spacer and chloroplast trnL intron sequences // Can. J. Bot. 2005. V. 83. P. 467-483.

249. Yang Y.W., Lai K.N., Tai P.Y., Ma D.P., Li W.H. Molecular phylogenetic studies of Brassica, Rorippa, Arabidopsis and allied genera based on the internal transcribed spacer region of 18S-25S rDNA // Mol. Phylogenet. Evol. 1999. V. 13. P. 455-462.

250. Карпеченко Г.Д. Избранные труды. М. 1971.

251. Hosaka К., Kianian S.F., McGrath J.M., Quiros C.F. Development and chromosomal localization of genome-specific DNA markers of Brassica and the evolution of amphidiploids and n=9 diploid species // Genome. 1990. V. 33. P. 131-142.

252. Chevre A.M., This P., Eber F., Deschamps M., Renard M., Delseny M., Quiros C.F. Characterization of disomic addition lines Brassica napus-Brassica nigra by isozyme, fatty acid, and RFLP markers // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 81. P. 43-49.

Информация о работе

Шилов, Илья Александрович
доктора биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Новые технологии детекции точечных мутаций и анализа полиморфизма повторяющихся последовательностей геномов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы