Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ динамических и точковых мутаций при наследственных неврологических заболеваниях

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попова, Светлана Николаевна, Москва

•/ ff) : / / ■ ; А. ^ / %

/

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ

/

На правах рукописи

Попова Светлана Николаевна

АНАЛИЗ ДИНАМИЧЕСКИХ И ТОЧКОВЫХ МУТАЦИЙ ПРИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

03.00.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д.б.н., профессор С.А. Лимборская к.б.н., ПАСломинский

МОСКВА, 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

1. Введение 5

2. Обзор литературы 10

2.1 Микросателлитные и минисателлитные повторы в геноме человека: распространенность и нормальный

полиморфизм 10

2.2 Нестабильные повторы в геноме человека и динамические мутации 12

2.3 Поиск полиморфных тринуклеотидных повторов

в геноме человека 17

2.4 Модели возникновения динамической мутации 20

2.5 . иотоническая дистрофия как заболевание,

вызываемое динамической мутацией 26

2.6 Динамические мутации и формирование

клинических проявлений 31

2.7 Точковые мутации при ДОФА-зависимой

торзионной дистонии 35

2.7.1 Клиническая характеристика торзионой дистонии 35

2.7.2 ДОФА-зависимая торизионная дистония и

мутации в гене ГТФ циклогидролазы I 36

3. Материалы и методы 40

3.1 Выделение ДНК из периферической крови человека 40

3.2 Реакция кинирования 41

3.3 Методика проведения ПЦР 42

3.4 Денатурирующий элуектрофорез в

полиакриламидном геле 44

3.4.1 Исходные растворы 44

3.4.2 Проведение денатурирующего электрофореза в ПААГ 45

3.5 Определение размера экспансии у больных

миотонической дистрофией 46

3.6 Определение наличия мутации у больных

торзионной дистонией 47

3.7 Статистическая обработка результатов 48

4. Результаты и обсуждение 50

4.1 Характеристика нормального полиморфизма локуса миотонической дистрофии в различных этнических группах 50

4.2 Изучение экспансии у больных миотонической дистрофией 66

4.3 Молекулярно-генетический анализ торзионной дистонии 73

5. Заключение 79

6. Выводы 80

7. Список литературы 82

Список принятых сокращений

СЕРН - среднеевропейская популяция;

DM-PK - миотонин-протеинкиназа;

DM-локус - локус миотонической дистрофии;

FRAXA - синдром ломкой Х-хромосомы;

GDA - Genetic Data Analysis.

HD - болезнь Гентингтона;

SB MA - спино-бульбарная мышечная атрофия

SCA1 - спиноцеребеллярная атаксия (тип Г ;

SSR - simple sequence repeat;

ДЗД - ДОФА-зависимая дистония;

KB - классическая взрослая форма миотонической дистрофии;

КЮ - классическая ювенильная форма миотонической дистрофии;

МД - миотоническая дистрофия;

МП -ген - ген миотонин-протеинкиназы

ПА/ Г - полиакриламидный гель;

РД — ранняя детская форма миотонической дистрофии;

сМ - сантиморганида;

ТД — торзионная дистония;

ТН1 - тринуклуеотидный повтор;

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы все большее значение в патологии человека приобретают наследственные болезни. Заболевания с наследственной предрасположенностью и моногенные наследственные болезни составляют достаточно большую долю всех заболеваний человека. 5% новорожденных имеют те или иные дефекты наследственной природы, обусловленные нарушением структуры или работы отдельных генов или хромосомными аберрациями. В течение первых двадцати лет жизни наследственные болезни проявляются еще у 5% населения. Кроме того, известно достаточно много заболеваний с наследственной предрасположенностью - мультифакториальных и полигенных- где роль наследственной компоненты в патологии проявляется не так отчетливо, но, тем не менее, она очевидна (Краснопольская К.Д., 1986).

Среди этих болезней наследственные заболевания нервной системы по своей значимости выходят на первый план как в связи с достаточно широкой распространенностью многих из них, так и из-за тоге что они, затрагивая важнейшие функции организма, приводит к ранней инвалидизации, а иногда и смерти больного. Молекулярная природа наследственных болезней нервной системы, их выраженный клинический полиморфизм, существование фенокопий и генетическая гетерогенность обуславливают использование молекулярно-генетических методов как основных дифференциально-

диагностических тестов. Результатом широкого внедрения молекулярно-генетических методов в неврологии стало картирование на разных хромосомах свыше 150 генов нервной системы, а также идентификация мутантных генов при более чем 70 психоневрологических заболеваниях (Краснопольская К.Д., 1986).

В настоящее время достоверно известны генетические механизмы возникновения целого ряда широко распространенных

неврологических заболеваний, таких как различные варианты миодистрофий, спинальная амиотрофия, наследственные атаксии разных типов (МсКиэюк УА., 1994; Наследственные болезни нервной системы, 1998). Разработка и внедрение косвенных и прямых методов определения мутаций у больных и лиц из группы риска, последующее изучение механизмов реализации мутаций на клеточном и молекулярном уровне, как и изучение белковых продуктов соответствующих генов позволило выработать новые подходы к диагностике, терапии и профилактике наследственных болезней.

Используя методы молекулярной генетики, удается выявлять даже минимальные изменения структуры ДНК - замены, вставки, утраты единичных пар оснований. В связи с этим их широко используют при исследовании заболеваний нервной системы, основной причиной которых является нарушение функции какого-либо фермента. Одним из таких заболеваний является торзионная дистония (ТД) - тяжелое генетически гетерогенное наследственное заболевание, характеризующееся гиперкинезами, изменением мышечного тонуса с формированием патологических поз, прогрессирующим течением, приводящее к инвалидизации больных (Маркова Е.Д., 1989; БаЬп Б., 1988). С клинической точки зрения выделяют два типа ТД - ригидную ДОФА-зависимую дистонию (ДЗД), характеризующуюся высокой чувствительностью к малым дозам Ь-ДОФА и гиперкинетическую-дистоническую ДОФА-независимую дистонию, при которой терапия Ь-ДОФА не эффективна (Nygaard Т.е., 1988) В основе развития этих патологических состояний лежат разные генетические дефекты. При ДЗД повреждению подвергается ген ГТФ-циклогидролазы 1, играющей ключевую роль в процессе синтеза дофамина. В настоящее время обнаружен ряд различных мутаций в этом гене, вызывающих развитие болезни (1сЫпозе Н., 1994; Тапака Н, 1995; Вапс1тап О., 1996;

Illarioshkin S.N., 1998). В тоже время показано, что в 50% случаев ДЗД изменений в кодирующей области гена ГЦГ-1 нет (Beyer К., 1997).

Несколько лет назад был открыт новый тип мутагенеза -«динамическая мутация», связанная с увеличением числа копий простых повторов. Этот тип мутагенеза лежит в основе молекулярного механизма ряда нервномышечных заболеваний. При этом расширенные области тринуклеотидных повторов могут лежать как в транслируемой области гена (при болезни Гентингтона, спиноцеребеллярной атаксии), так и в нетранслируемой области (при миотонической дистрофии, синдроме ломкой Х-хромосомы). Большинство известных нервномышечных заболеваний, являющихся результатом динамической мутации, связано с расширением областей тринуклеотидных повторов (поэтому их часто называют болезнями тринуклеотидных повторов - ТНП) (Горбунова В.Н., 1997; Иллариошкин С.Н., 1995). Однако, известно несколько неврологических болезней при которых экспансии подвергаются другие типы повторов, например, додекамерный повтор при прогрессивной миоклонической эпилепсии.(ЬаНой M.D., 1998) Одним из наиболее ярких примеров заболеваний ТНП является миотоническая дистрофия (МД). МД - это аутосомно-доминантное заболевание, обусловленное увеличением числа CTG-повторов в 3'-нетранслируемой области гена миотонин-протеинкиназы (МПК). В семьях здоровых индивидуумов число повторов варьирует от 3-5 до 37 и стабильно предается из поколения в поколение - тогда как у больных число повторов превышает 50 и может достигать нескольких тысяч. Механизм вызывающий подобное превращение стабильных ТНП в нестабильные в настоящее время не известен (Wieringa В., 1994).

В связи с вышесказанным целью настоящей работы было:

- Изучение нормального полиморфизма подверженного экспансии при миотонической дистрофии триплетного повтора типа (СТО)п в популяциях России и оценка возможностей использования этого маркера для изучения генетики популяций и происхождения динамической мутации в гене миотонин протеин киназы ;

- Разработка методов ПНР диагностики миотонической дистрофии и анализ больных с клиническим фенотипом миотонической дистрофии из Башкирии.

Выявление молекулярных причин развития ДОФА-зависимой торионной дистрофии при семейной и спорадической формах заболевания у больных из России;

В соответствие с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Исследование гена ГЦГ-1 (хромосомная локализация 14я22) с целью выявления мутаций у больных различными фрмами

ДЗД;

2. Исследование аллельного полиморфизма в гене МПК среди здоровых индивидуумов различных популяций с целью изучения механизма реализации динамической мутации.

3. Анализ степени экспансии триплетных повторов в гене миотонин протеин киназы у больных миотонической дистрофией из Башкирии.

Научная новизна.

Впервые в России проведен анализ вызывающих ДОФА-зависимую торсионную дистонию мутаций в гене ГТФ

циклогидролазы I и обнаружены три ранее не описанные миссенс мутации, косегрегирующие с развитием заболевания - Цис141Трп, Сер176Тре, Мет102Лиз. Подтверждена выраженная микрогетерогенность этой формы торсионной дистонии и отсутствие мажорной мутации в гене ГТФ циклогидролазы I.

Разработан метод молекулярной диагностики миотонической дистрофии Россолимо-Куршмана-Штейнерта-Баттена, основанный на полимеразной цепной реакции и гибридизации продуктов амплификации с зондом (CTG)9 и позволяющий проводить клиническую и доклиническую диагностику миотонической дистэофии на уровне первичного генетического дефекта. Он может быт: использован для дифференциальной диагностики мио онической дистрофии Россолимо-Куршмана-Штейнерта-Баттена и клинически близких форм миодистрофий у больных с семейными и спорадическими формами заболевания.

Показана возможность использования полиморфного

триплетного повтора типа (CTG)n в гене миотонин протеин киназы в качестве ДНК-маркера как для изучения процессов этногенеза в географически и этнически отдаленных популяциях, так и для анализа внутриэтнического генетического разнообразия.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Микросателлитные и минисателлитные повторы в геноме человека: распространенность и нормальный полиморфизм

Явление генетического полиморфизма, то есть устойчивого существования различных форм одного признака, широко используется в анализе закономерностей наследственности и изменчивости. Одна из форм полиморфизма генома человека связана с повторяющимися последовательностями. Повторы разных типов распространены в геноме человека очень широко и встречаются как в кодирующих областях генома (например, гены рРНК представляют собой высококопийный повтор), так и в некодирующих прицентромерных районах хромосом (например, сателлитные повторы и альфоидная ДНК) (Richards R.L, 1994; Cooper D.N., 1990). Наиболее представленны в геноме простые тандемно повторяющиеся последовательности, мономер которых состоит из одной или нескольких пар оснований. По размеру повтора их подразделяют на микросателлиты (размер мономера от 1 до 10 п.н.) и минисателлиты (размер мономера в этом случае может достигать 30-50 п.н.) (Jeffreys A.J, 1985b). Вследствие особенностей организации эти последовательности способны к уникальной форме мутагенеза -изменению числа копий (Jeffreys A.J., 1988b). В результате многие простые тандемные повторы являются полиморфными по числу копий в популяциях человека (Jeffreys A.J., 1985а,с; Gill, 1985; Ryskov, 1996). Подобная форма изменчивости генома человека была использована для создания высокоинформативных ДНК-маркеров (с уровнем гетерозиготности более 50%) (Takai S., 1986).

Генетические маркеры в настоящее время нашли широкое применение в медико-биологических исследованиях. ДНК-маркеры на

основе микросателлитов все более активно используются в картировании генома. С их помощью построены генетические карты всех хромосом человека с разрешением 2-4 сМ, а наиболее изученные хромосомы (такие как X хромосомы) картированы с точностью до 0,1 сМ (Sheffield V.S., 1995; Gastier J.M., 1995; Dib С., 1996). На основании такого тонкого генетического картирования с использованием коротких минисателлитных и микросателлитных повторов возможно картирование и позиционное клонирование генов-кандидатов наследственных заболеваний (Stallings R.L., 1994).

Минисателлитные повторы - короткие тандемные повторы с размером мономера около 11-60 п.н. Встречаются различные варианты семейств минисателлитов, при этом для каждого семейства характерно наличие уникальной «кор»-последовательности, содержащей от 15 до 20 п.н. За пределами этой последовательности повторяющиеся единицы не всегда гомологичны. Высказывается предположение, что каждое из семейств минисателлитов возникло в результате дивергентной эволюции. (Jeffreys Ä.J., 1985а) Вследствие исключительно высокой степени полиморфизма, характерной для минисателлитных повторов, они нашли широкое применение при проведении популяционных исследований (Барышева Е.В., 1991; Kalrrin V.V., 1995; Ryskov А.Р., 1996), а также в криминалистике для идентификации личности и установления родства. (Репа S.D J.,1994)

Микросателлитные повторы (называемые также SSR от simple sequence repeat или STR от simple tandem repeat) - самые короткие повторы в геноме человека с размером мономера от 1 п.н. до примерно 7-8 п.н (Hearne С.М., 1992). В норме последовательности микросателлитных повторов содержат до нескольких десятков копий повторяющихся единиц, при этом общая длина фрагмента может достигать сотен пар нуклеотидов. При развитии некоторых заболеваний показано увеличение длины участка повторов до сотен и

тысяч пар нуклеотидов.(Humphries Р., 1986; Weber J.L.,1990;1993) Частота встречаемости микросателлитных повторов в геноме человека выше по сравнению с миниеателлитными повторами. Наиболее распространенным микросателлитным повтором является динуклеотидный (CA) повтор, который встречается в среднем каждые 30 т.п.н. Обычно они расположены в 3' и 5'-нетранслируемых областях и интронах генов. Полиморфным считается (СА)-повтор, который может иметь более 10 аллельных вариантов (Hearne С.М., 1992). По-видимому, локусы, содержащие (СА)-повторы принимают участие в регуляции генетической рекомбинации и транскрипционной активности. (Dutrex М.,1997) Тринуклеотидные микросателлитные повторы встречаются в геноме человека с меньшей частотой. Наиболее широко из тринуклеотидных повторов представлен (ААТ) повтор (1 повтор на 500 т.п.н.) В отличие от динуклеотидных микросателлитов тринуклеотидные повторы (ТНП) обычно содержат меньшее число повторяющихся единиц. (Gastier J.M., 1995)

2.2 Нестабильные повторы в геноме человека и динамические

мутации

Как уже говорилось выше, характерной чертой мини- и микросателлитных повторов является их полиморфизм. Обычно степень полиморфизма является ограниченной, и число копий повторяющихся единиц не превышает 40-50. Однако, при воздействии некоторых внешних или внутренних факторов, может происходить резкое, часто необратимое, увеличение числа копий повтора. Этот феномен получил название экспансии и впервые был описан в 1991 году при наследственных нейромышечных заболеваниях как динамическая мутация (Иллариошкин С.Н., 1995; La Spada A.R., 1991). Нормальный полиморфизм повтора не связан с какой-либо

патологией, но увеличение числа повторов выше какого-то порогового значения, что наблюдается при динамической мутации, приводит к развитию патологического процесса. В настоящий момент установлена ассоциация экспансии - то есть резкого увеличения протяженности тринуклеотидного повтора - с рядом заболеваний, преимущественно нейродегенеративных, а также несколькими сайтами ломкости хромосом (табл. 1) (Vernerk A.J.M.H., 1991; La Spada A.R., 1991; Brook U., 1991; Fu Y-H., 1992; The Huntington's Disease Collaborative Research Group, 1993; Orr H.T., 1993; Knight S., 1993; Koide R., 1994; Nancarrow J.K., 1994; Kawaguchi Y., 1994; Parrish J.E., 1994; Paulson H.L., 1996; В rais В., 1998).

Главная особенность динамических мутаций состоит в том, что после увеличения числа копий повтора выше порогового уровня темп мутирования резко возрастает. При этом скорость мутирования корреллирует с числом копий и, вследствие этого, способность продукта динамической мутации подвергаться дальнейшим изменениям отличается от таковой для исходной последовательности ДНК. Таким образом, динамическая природа этих мутаций проявляется в том, что, однажды достигнув критической длины, число повторов продолжает увеличиваться при передаче из поколения в поколение. В настоящее время такой тип и мутагенеза описан только у человека и не обнаружен ни у одного из млекопитающих или у других хорошо изученных организмов (дрозофила, нематоды).

Динамические мутации ответственны за развитие ряда наследственных заболеваний, называемых также синдромами тринуклеотидных повторов (Горбуно