Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка универсальной системы ДНК-диагностики, основанной на ПЦР, и её использование для обнаружения мутации LEIDEN у больных венозными тромбозами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка универсальной системы ДНК-диагностики, основанной на ПЦР, и её использование для обнаружения мутации LEIDEN у больных венозными тромбозами"

"."ü ОД

На правах рукописи

ЗЫКОВА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА УНИВЕРСАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ДНК - ДИАГНОСТИКИ, ОСНОВАННОЙ НА ПЦР, И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ МУТАЦИИ LEIDEN У БОЛЬНЫХ ВЕНОЗНЫМИ

ТРОМБОЗАМИ.

03,00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена на кафедре биохимии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова и в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук

Научные руководители:

чл.-корр. РАН, профессор, доктор химических наук Северин Е.С.,

кандидат биологических наук Патрушев Л.И.

Научный консультант

доктор медицинских наук, профессор Бокарев И.Н.

Официальные оппоненты:

д.б.н. Силаева СЛ. к.б.н. Глухов А.И.

Ведущая организация:

Институт Молекулярной генетики РАН

Защита состоится «/£ 998 года на заседании Диссертационного

совета Д.171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан «_»_1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

В.В. Отраднова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Точковые мутации - это изменения первичной структуры генома на уровне отдельных составляющих его нуклеотидов. Фенотипические проявления точковых мутаций могут быть весьма разнообразными. Наиболее значительны из них с практической точки зрения различные патологические состояния организма человека, животных и растений [МсКшйс, 1991]. В том случае, если точковая мутация возникает в геноме клеток зародышевой линии, все клетки развившегося из них организма-потомка будут содержать эту мутацию, которая в данном случае может быть причиной наследственного заболевания. Даже гетерозиготное состояние доминантной мутации сопровождается формированием мутантного фенотипа. В отличие от этого рецессивные мутации проявляются фенотипически лишь в гомозиготном состоянии. В связи с наследственными заболеваниями человека гетерозиготное состояние рецессивных мутаций рассматривается как носительство, и их присутствие в геноме является серьезным фактором риска в отношении развития соответствующего заболевания. Для организмов-носителей характерна высокая вероятность возникновения мутантного фенотипа вследствие независимого появления аналогичной мутации в гомологичных хромосомах соматических клеток в онтогенезе или в результате участия в акте размножения двух мутант-ных особей, геном которых содержит одинаковые рецессивные мутации. С учетом сказанного особую важность приобретает разработка эффективных методов молекулярной диагностики у человека точковых мутаций, ассоциированных с наследственными или приобретенными заболеваниями, которые бы позволяли дифференцировать гомозиготное и гетерозиготное состояние этих мутаций.

Венозные тромбозы, которые являются причиной смерти 1 из 1000 людей ежегодно, нередко бывают семейными. Недавно было установлено, что наиболее распространенным генетическим дефектом, ассоциированным с венозными тромбозами у больных европейской популяции, является точковая мутация в

гене фактора V (мутация Leiden), которая сопровождается появлением устойчи вости фактора V к активированному белку С и резко снижает эффективност функционирования антикоагулянтной системы [Bertina, 1994]. К началу работ! единственный метод обнаружения этой мутации предполагал использовани дорогостоящей рестриктазы Mnll, что делало его многоэтапным и ограничивал широкое клиническое использование. В этой связи представлялась весьм актуальной разработка нового эффективного метода обнаружения этой мутащц Одновременно предполагалось, что разработка нового эффективного метол обнаружения точковых мутаций может иметь большое фундаментальнс значение для популяционной генетики в целом и для клинической практики.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание i основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) универсальной системы поио точковых мутаций в геномной ДНК человека и ее использование для обнаруж ния мутации Leiden у больных тромбофилиями.

Задачами исследования являлись:

1. Разработка и создание принципиально новых аллель-специфических прайм ров, пригодных для обнаружения точковых мутаций в геномной ДНК, позв ляющих дифференцировать гомозиготное к гетерозиготное состояние му) ций.

2. Использование разработанных праймеров для идентификации мутации Leia в геномной ДНК больных тромбофилиями.

Научная новизна и практическая значимость исследования. Разра( тана новая, универсальная тест-система, позволяющая обнаруживать и дифс ренцировать известные гомозиготные и гетерозиготные точковые мутации также проводить поиск новых точковых мутаций в гомозиготном состоян: Система успешно апробирована на клиническом материале, полученном больных с венозными тромбозами, и может быть рекомендована для широк использования в клиниках с целью диагностики мутации Leiden. Приш

предложенного метода может быть использован для поиска других точковых мутаций, представляющих клинический интерес, а также для анализа неизвестных точковых мутаций у гаплоидных организмов (например, бактерий и вирусов) в фундаментальных и прикладных исследованиях.

Апробация работы. Научные результаты, представленные в диссертации были доложены на II научной конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром: современное состояние проблемы» (Москва, 1995), на I Всероссийской научно-практической конференции «Применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний. Методы лечения» (Сочи, 1996), на 10 Международной конференции Дунайской лиги против тромбозов и геморрагических заболеваний (Познань, Польша, 1996), на Ш Всероссийской конференции «Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения» (Москва, 1997), на XVI Международном конгрессе Международного общества по изучению тромбозов и гемостаза (Флоренция, Италия, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, а также выводов. Диссертация изложена на стр., содержит рис., и таблиц. Список литературы состоит из названий, в том числе русских и иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение клинического материала.

Образцы периферической крови взрослых здоровых доноров, образцы беременных женщин, при гемостазиологическом обследовании которых выявлена выраженная гиперкоагуляция, а также образцы больных с венозными тромбозами различной локализации и тяжестью протекания тромбоза помещали в

пластиковые пробирки, содержащие цитрат натрия. Предварительный скрининг на резистентность к АРС не проводился.

Выделение ДНК из периферической крови. ДНК выделяли по .метод} Линдблома и Холмлунда (1988) с незначительными модификациями. Поел« лизиса клеток тритоном Х-100 интакгные ядра осаждали центрифугированием ДНК экстрагировали стандартным фенольным методом и переосаждал! спиртом. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически при 260 нм.

Синтез олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды синтезировали традицион ным фосфороамидитным методом на синтезаторе ASM-102U (Новосибирск Россия).

Полимеразная цепная реакция. Термостабильную Taq-полимеразу вы деляли из рекомбинантного штамма E.coli PVG-A1 по методу Патрушева и д£ (1993) с незначительными модификациями. Стандартная реакционная смесь (2 мкл) содержала: 67 мМ Трис-HCl pH 8,8, 16, 6 мМ (NH,)S04, 0,01% Твин 20, 1, мМ MgClj, по 0,2 мМ каждого из 4-х дезоксирибонуклеозидгрифосфатов, 100 и геномной ДНК человека, по 10 пмолей каждого из праймеров, 1-2 ед. Ta¿ полимеразы.

Анализ продуктов ПЦР. Продукты ПЦР анализировали элекгрофорезо в 3% агарозном геле. Рестрикцию продуктов ПЦР с помощью рестриктазы Мп (Ферментас, Вильнюс) проводили по методике фирмы с использованием < реагентов. В качестве молекулярных маркеров использовали продукты рестри ции плазмид pBR322 или pGEM рестриктазой НаеШ. Анализ конформационно] полиморфизма одноцепочечных продуктов ПЦР осуществляли по стандарта« методике (Oto, 1993) с использованием электрофореза в 10% полиакриламидне геле. После электрофореза гель окрашивали нитратом серебра.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Тромбофилии (группа патологических состояний организма человека, для которых характерна повышенная свертываемость крови, приводящая к развитию тромбозов и расстройству кровообращения в тканях) чаще всего являются следствием изменения определенных генов системы свертывания крови под действием мутаций. Повышению избыточной свертываемости крови в организме человека препятствует комплекс антикоагулянтов, одним из основных компонентов которого является активированный протеин С (АРС) (Dahlback, 1994). Тромбин при взаимодействии с тромбомодулином, ассоциированным с клетками эндотелия, посредством протеолитического воздействия активирует протеин С, который, в свою очередь, взаимодействуя с протеином S, путем ограниченного протеолиза инакгивирует связанные с мембранами белковые факторы Va и VHIa, необходимые для свертывания крови, что ограничивает процесс образования фибрина и препятствует формированию тромбов.

Фактор V человека кодируется геном, занимающим около 80 тысяч пар оснований (т.п.о.) геномной ДНК, в котором имеется 25 экзонов длиной от 72 до 2820 п.о. (рис. 1).

Недавно было установлено, что наследственная устойчивость фактора Va к АРС - очень часто ассоциирована с тромбофшшями у человека. При этом у большого числа больных с синдромом устойчивости к АРС была обнаружена единственная точковая мутация (замена G-1691 на А в экзоне 10 гена фактора V), приводящая к замене Arg505—»Gin в полипептидной цепи фактора V. Эта мутация получила название лейденской (Leiden). Указанная мутация нарушает сайт для рестриктазы МпИ, которая утрачивает способность расщеплять ДНК в данном месте (Bertina, 1993).

3 -»-<-10

q23

p32

Хромосома 1

19 21 2J 25

интрон 10

Mnl 1

III

IV

Рис 1 Хромосомная локализация и структура гена фактора V, положение праимеров, использован» в работе а также схема синтеза искусственных матричных ДНК, содержащих мутацию Leiden. Вверху схематически изображена хромосома I человека, на которой отмечено положение гена факт V Приведена интрон-экзонная структура гена фактора V и микросателлитного локуса использованного для получения внутреннего контроля. Обозначены номера экзонов. Шоке предел лена часть гена фактора V, содержащего мутацию Leiden (обозначена точкой), горизонталью стрелками показано положение праймеров, примененных для синтеза искусственных ДHKji та. аллель-специфических и некоторых других праймеров, обсуждаемых в работе. В экзоне 10 изображ часть последовательности нуклеотидов, содержащей мутацию Leiden (положение 1691), в кото подчеркнут сайт рестрикции Ш11. Сплошными линиями внизу обозначены два. промежуток продукта ПЦРI и И, которые были использованы в качестве матриц для синтеза конечного фрагме III в присутствии праймеров 5 и 1. Фрагмент IV синтезировали с помощью тех же праимеров на I человека, не содержащей мутации Leiden.

1. Оценка частоты встречаемости мутации Leiden у больных тромбофил!

ми

московской популяции с использованием ПЦР и рестриктазы МпП

Чтобы подтвердить актуальность указанной медицинской проблемы населения России, мы начали свою работу с оценки частоты встречаемо мутации Leiden у больных московской популяции с тромбозами глубоких

бедра и легочными тромбоэмболиями, используя для этой цели ПНР и рестрик-тазу Mnll (Бертина и др. 1993). Все обследуемые больные не отбирались предварительно по фенотипу устойчивости к активированному протеину С, что потенциально давало более широкие возможности изучения фенотипического проявления мутации Leiden при тромбофилиях. ДНК больных выделяли из клеток периферической крови и использовали в качестве матрицы во время ПЦР в присутствии праймеров 1 и 4 (рис. 1, таблица 1). Образовавшиеся продукты ПЦР инкубировали с рестриктазой МпП и анализировали электрофорезом в агарозном геле.

Таблица 1. Первичная структура праймеров, использованных в первой части работы и их положение в гене фактора V._

№

Первичная структура

5'-TCTCTTGAAGGAAATGCCCCATTA

5'-ACAAAATACCTGTATTCCTTGCCTG

5'-TAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCA

5'-GGGCTAATAGGACTACTTCTAATC

S'-GGAACAACACCATGATCAGAGCA

5'-TAAGAGCAGATCCCTGGACACGCA

S'-TAAGAGCAGATCCCTGGACAGCCA

5'-TAAGXGCAGATCCCTGGACAGCCG

Положение

интрон 10 1686-1710 1668-1691 1641-1665 1490-1512 1668-1691 1668-1691 1668-1691

На рис. 2 представлены результаты одного из таких опытов. Видно, что в присутствии праймеров 1 и 4 в результате ПЦР в соответствии с данными литературы происходит образование гомогенного продукта длиной приблизительно в 160 п.о. (рис. 2, дорожка 2). Обработка рестриктазой Мпй продуктов ПЦР, образовавшихся после амплификации соответствующих участков ДНК ряда обследованных больных с помощью тех же праймеров, в основном, приводила к их расщеплению по сайту рестрикции, что сопровождалось увеличением электрофоретической подвижности образующихся в результате рестрикции более коротких олигонуклеотидов (рис. 2, дорожки 3-6, 8-10). Это указывало на отсутствие в геноме соответствующих больных искомой мутации.

У одного больного в этом опыте было обнаружено изменение сайта рестрикций Мпй (рис. 2, дорожка 7), что свидетельствует о наличии в его геноме мутацш Leiden. Поскольку в этом случае происходит лишь частичное расщеплешк продукта ПЦР рестриктазой Mnll на фоне полного гидролиза продуктов ПЩ другого происхождения, можно сделать вывод о том, что исследуемый аллел1 присутствует в геноме этого больного в гетерозиготном состоянии.

Рис. 2. Обнаружение мутации Leiden в геномной ДНК больных тромбофи-лиями с использованием ПЦР и рестрикгазы Mnll. Электрофорез продуктов ПЦР в 3% агарозном геле:

1- молекулярные маркеры; 2- продук ПЦР без инкубации с рестриктазо Mnll; 3-10 - продукты ПЦР пос.т рестрикции

В ходе проведения такого рода экспериментов в группе из 33 больных венозными тромбозами у 5 была обнаружена мутация Leiden в гетерозиготно состоянии (данные не представлены), что подтвердило высокую медицинску: значимость мутации для населения нашей страны. Эти же исследован* продемонстрировали трудоемкость стандартного двухэтапного метода обнар; жения мутации, ограничивающую его широкое применение в клиниках. К ton же метод поиска точковых мутаций с использованием ферментов рестрикции i может претендовать на универсальность, поскольку количество сайтов рестри ции в природных ДНК ограниченно, и они не всегда присутствуют в исследу мых участках генов. В связи с этим возникала важная задача разработки ново

универсального метода поиска точковых мутаций в геномной ДНК, который был бы лишен вышеупомянутых недостатков.

При проведении ДНК-диагностики большое значение для прогноза и про-i *

ведения адекватного лечения имеет оценка аллельного состояния исследуемых мутаций, поскольку присутствие в геноме больных гомозиготных мутаций, как правило, сопровождается повышенной тяжестью протекания заболеваний. Так как ни один из обследованных нами больных не содержал гомозиготной мутации Leiden, было принято решение продолжить дальнейшую разработку системы ДНК-диагностики на искусственных матричных ДНК, которые бы имитировали гомозиготное и гетерозиготное состояние мутации.

2. Синтез фрагментов ДНК, содержащих мутацию Leiden, и их использование в качестве матриц при разработке новых аллель-специфических праймеров.

Для синтеза фрагментов ДНК, содержащих мутацию Leiden, были использованы перекрывающиеся встречные праймеры, содержащие требуемую мутацию (Но et а!., 1989). Схема синтеза представлена в нижней части рисунка 1. Синтез осуществляли в две стадии. На первом этапе с помощью пар праймеров 1 и 3, а также 5 и 2 на матрице ДНК больного с гетерозиготной мутацией брли синтезированы промежуточные фрагменты I и II, содержащие мутацию Leiden в своих перекрывающихся частях (рис. 3, дорожки 2 и 3, соответственно).

-"'Jii f

587-» 458-* 298-* 2S4-» 174-»

T^JSäi

■¡¡Ш

Я"

; ч _

ЪЩШШШГ^

и

iiaJiilP

1 2 3 4 5

Рис. 3. Электрофоретический анализ неочищенных промежуточных и конечных продуктов синтеза

искусственных матричных ДНК. Дорожки 2, 3, 4 и 5 -соответственно фрагменты I, II, III и IV (рис. 1), образующиеся в присутствии пар праймеров 1 и 3; 5 и 2; 5 и 1; 5 и 1; 1 - молекулярные маркеры

Поскольку последовательности нуклеотидов перерывающихся частей эти? фрагментов целиком определяются первичной структурой праймеров 2 и 3, дш этой цели можно использовать в качестве матрицы и ДНК дикого типа.

Фрагменты переносили на мембранные фильтры NA-45 (Schleicher&Schuel

и элюировали повышением ионной силы. После осаждения спиртом и перерас

S

творения фрагменты I и П далее в присутствии праймеров 5 и 1 использовал для синтеза конечного фрагмента Ш, содержащего мутацию Leiden. По оконча нии ПЦР в пробе доминировал фрагмент Ш (рис. 3, дорожка 4), размер котороп соответствовал таковому фрагмента IV, образующемуся на ДНК дикого типа i присутствии тех же праймеров (дорожка 5). После очистки на ДЭАЭ-мембран фрагменты Ш и IV, различающиеся только наличием или отсутствием мутантнс го аллеля, были использованы в качестве матриц в дальнейшей работе. При это! гетерозиготное состояние мутации имитировалось эквимолярной смесы фрагментов Ш и IV.

Наличре мутации в синтезированном фрагменте ДНК подтвердили, аналв зируя его первичную структуру по методу Бертины и др. (1993). Как уж упоминалось выше, мутация Leiden нарушает сайт рестрикции Мл Л, поэтом фрагменты ДНК, содержащие мутацию, становятся устойчивыми к действм этой рестрикгазы.

Рис. 4. Доказательство наличия мут , ции Leiden в синтезированном фрагмен ДНК с помощью ПЦР и рестрикгазы Мп

I)

Продукты ПЦР, образовавшиеся i

матричной ДНК, не содержащей мутащ

(дорожки 1, 2), а также содержащей ее

«гетерозиготном» (3, 4) или «гомозиготно!

(5, 6) состоянии, инкубировали с рестртл

зой Mnll (2,4, 6) и разделяли электрофорез!

в 3% агарозном геле. Образцы 1,3 и 5 не

подвергали рестрикции. 7 - молекулярн маркеры.

Действительно, при использовании в ПНР в качестве матрицы синтезированного нами фрагмента IV, не содержащего мутации, образовавшийся продукт полностью расщеплялся рестриктазой МпИ (рис. 4, дорожки 1 и 2), он расщеплялся лишь частично, если мутация Leiden присутствовала в искусственной матрице (эквимолярная смесь фрагментов 1П и IV) в «гетерозиготном» состоянии (рис. 3, дорожки 3 и 4) и не расщеплялся вообще при наличии «гомозиготной» (фрагмент Ш) мутации Leiden (рис. 3, дорожки 5 и 6). Подтвердив, таким образом, полноценность искусственных матриц в отношении анализируемой мутации, мы перешли к разработке системы ДНК-диагностики мутации Leiden с использованием аллель-специфических праймеров.

В аллель-специфической ПЦР, как правило, применяют один обычный олигонуклеотидный праймер, полностью комплементарный исследуемой матричной ДНК, и встречный праймер, у которого З'-концевой нуклеотид комплементарен соответствующему нуклеотиду ДНК мугштного аллеля, но не аллеля дикого типа. Следовательно, теоретически, в системе с такими прайме-рами образование продукта аллель-специфической ПЦР указывает на наличие мутации в соответствующем локусе исследуемой ДНК. Именно с испытания такого стандартного аллель-специфического праймера 3 мы продолжили работу. К сожалению, результаты, полученные с этим праймером, показали, что продукт ПЦР образуется как в присутствии искусственной ДНК дикого типа, так и мутантной ДНК (данные не представлены). Следовательно, простая одиночная замена нуклеотида на 3'-конце праймера, нарушающая его полную комплемен-тйрность с ДНК дикого типа, в этих условиях еще не обеспечивает достаточной специфичности системы. Аллель-специфический характер амплификации исследуемого участка искусственной матрицы удавалось усилить путем тщательного подбора температуры отжига праймеров, уменьшения концентрации матричной ДНК и использования минимального количества циклов амплификации. Однако на всех этапах оптимизации системы с этим праймером различия в эффективности амплификации мутантного и нормального аллелея

носили количественный характер. Поэтому мы отказались от дальнейше использования праймера 3 и продолжили разработку системы.

Для усиления специфичности мы использовали известный подход с вве/ нием в аляель-спецйфические праймеры нескольких некомплементарш матрице нуклеотидов (Newton et al., 1989). Были синтезированы дополнительн: праймеры 6 и 7 (рис. 1, табл. 1), у которых были замещены соответственно 3 или 4-й нуклеотиды от 3'-конца праймера 3 на некомплементарные как мута! ной ДНК, так и ДНК дикого типа. При этом предполагалось, что введен дополнительного мутантного нуклеотида в большей степени ослабит взаимоде ствие 3'-концевых нуклеотидов таких праймеров с аллелем дикого типа, чеь мутантным аллелем и затруднит их элонгацию Taq-полимеразой, так как первом случае в гибриде будут присутствовать два ошибочно спаренн; нуклеотида, один из которых З'-концевой, а во втором случае - только од (рис. 5а).

. . Праймер7 Праймерв

(а) -.«/^л-о ттггсс"сЦзХ>

■G'C'C-G с=0

Leiden j

Дикий тип

(б) »58-» 298«» 2S4-» 174»»

Рис. 5. Предполагаемый механизм действия аллель-специфических праймеров и их функционирова в присутствии различных матричных ДНК, содержащих и не содержащих мутацию Leiden.

(а): изображены последовательности нуклеотидов 3'-концевых частей аллель-специфичес праймеров, а также участка ДНК, непосредственно примыкающего к нуклеотиду, изменяем мутацией Leiden. Элонгация" праймеров или ее ингибирование показаны стрелками, не перечеркн) ми или перечеркнутыми, соответственно.

(б): электрофорез продуктов ПЦР в 3% агарозном геле, образующихся в присутствии праймерс (дорожки 2-5) или 8 (дорожки 6-9) и встречного праймера 1 на искусственных матричных fl содержащих мутацию Leiden в гомозиготном (дорожки 2, 6, 7) или гетерозиготном (дорожки i состоянии, а также без мутации (дорожки 3, 4, 8). В контрольных пробах 4 и 7 было проведен! дополнительных циклов ПЦР.

В том случае, если в аллель-специфическом праймере 3'-концевой нук-леотид будет комплементарен нуклеотиду аллеля дикого типа (в нашем случае праймер 8), то он будет предпочтительно элонгироваться на матрице ДНК дикого типа и гетерозиготной мутантной ДНК и не будет эффективно функционировать при наличии в исследуемой ДНК гомозиготной мутации. Таким образом, с помощью двух вышеупомянутых аллель-специфических праймеров можно было бы легко дифференцировать гомозиготное и гетерозиготное состояние мутации Leiden.

Результаты, полученные при использовании аллель-специфических праймеров 7, 8 и синтезированной нами искусственной матричной ДНК, полностью подтвердили эти предположения (рис. 56). Действительно, праймер 7 эффективно элонгировался лишь на матрицах, содержащих гомозиготные и гетерозиготные мутации Leiden (рис. 5, дорожки 2 и 5) и был мало эффективен в присутствии ДНК дикого типа (рис. 56, дорожка 3). В последнем случае увеличение числа циклов ПЦР сверх оптимального приводило к образованию продукта, видимого на электрофореграмме (рис. 56, дорожка 4), что может служить дополнительным внутренним контролем на эффективность функционирования всех компонентов системы ПЦР. В отличие от этого, праймер 8 с 3'-концевым нуклеотидом, комплементарным соответствующему нуклеотиду аллеля дикого типа, который должен работать по тому же самому принципу, эффективно элонгировался Taq-полимеразой при наличии в системе ДНК дикого типа или ДНК, содержащей гетерозиготную мутацию Leiden (рис. 56, дорожки 8 и 9 соответственно). Следовательно, в соответствии с выдвинутыми нами предположениями, с помощью двух аллель-специфических праймеров и одного встречного можно легко обнаруживать точковую мутацию в пробах с искусственной матричной ДНК и дифференцировать гомо- или гетерозиготное состояние ее аллелей. Этот вывод получил подтверждение и при исследовании с помощью этйх праймеров природных ДНК, полученных от больных тромбофи-лиями (см. ниже, раздел 4).

2. Разработка универсальных праймеров для обнаружения любых гомоз] готных точковых мутаций.

Несмотря на высокую эффективность разработанной нами системы ДН1 диагностики мутации Leiden с помощью описанных выше аллел: специфических праймеров, все они предназначены для скрининга лишь koi кретно этой мутации. Без изменения 3'-концевого нуклеотида аллел специфических праймеров, функционирующих по такому принципу, невозмо) но обнаруживать другие близко расположенные точковые мутации, хотя так; задача часто возникает в прикладных и фундаментальных исследованш генома. Для частичного решения этой проблемы нами были разработан универсальные праймеры, каждый из которых позволяет находить люб! гомозиготные точковые мутации, расположенные на участке ДНК длиной в 1 15 п.о. Структура всех универсальных праймеров, разработанных нами для эп целей, обладает двумя характерными особенностями: 1) 3'-концевые нуклеот ды праймеров всегда некомплементарны соответствующим нуклеотидг матричной ДНК; 2) последовательность их нуклеотидов подбирается таю образом, чтобы мутантные нуклеотиды анализируемой ДНК образовыва некомплементарные пары с нуклеотидами внутренних частей праймеров. Таю образом, при наличии в анализируемой ДНК гомозиготной точковой мутацв положение которой совпадает с внутренней частью универсального прайме! гибрид праймер-матрица будет содержать два ошибочно спаренных нуклеоти; и элонгация праймера Taq-полимеразой в адекватных условиях будет подавле! В отсутствие мутации праймер будет включаться в продукт ПЦР, поскольку этом случае матрице некомплементарен только его 3'-концевой нуклеотид, этого в большинстве случаев недостаточно для полного ингибирования ПЕ Очевидно, что при такой структуре универсальных праймеров их функционщ вание должно мало зависеть от природы и положения (в определенных вьи пределах) мутантных нуклеотидов анализируемой ДНК относительно нуклеот дов праймера.

Мы исследовали влияние структуры универсальных праймеров на их активность в системе с искусственной матричной ДНК, содержащей мутацию Leiden. Последовательности нуклеотидов использованных универсальных праймеров и их положение относительно мутантных нуклеотидов матрицы представлены на рис. 6а, а результаты испытаний на рис. 6(6) и (в). Оказалось, что все универсальные праймеры достаточно эффективно элонгируются Taq-полимеразой в присутствии ДНК дикого типа, несмотря на некомплементар-ность матрице их З'-концевых нуклеотидов (рис. 6(6), дорожки 3, 5, 7,9; (в): 1, 3, 5, 7, 9). В отличие от этого, образование пары некомплементарных нуклеотидов в гибриде универсальный праймер-матрица, удаленной на три (праймер 11) или даже восемь (праймер 12) нуклеотидов от 3'-концов праймеров приводило к резкому ингибированию ПЦР (рис. 66, дорожки 2 и 4). Смещение З'-конца универсального праймера на 15 и 18 нуклеотидов относительно мутантного нуклеотида матрицы (при общей его длине - 24 нт) еще сопровождается видимым подавлением его элонгации (рис. 6(6), дорожки 6 и 8), однако в этом случае эффект переходит в разряд количественных и в таком виде не может быть использован для ДНК-диагностики.

Принципиально те же результаты были получены и с универсальными праймерами, комплементарными другой цепи мутантной ДНК, которые элонгируются в противоположную сторону (праймеры 15-19, рис. 6(в)).

В этой серии опытов было показано, что на эффективность подавления элонгации универсальных праймеров в присутствии мутантной ДНК не оказывает существенного влияния природа 3'-концевого нуклеотида (праймеры 15, 18 и 19 - дорожки 1, 7, 9 соответственно), а также удаленность мутантного нуклеотида г. гибриде праймер-матрица на 5 или 10 нуклеотидов от З'-конца праймера (рис. 6(в), дорожки 3 и 5).

В таблице 3 суммированы результаты, полученные в ходе экспериментов по разработке универсальных праймеров для обнаружения гомозиготных точковых мутаций.

1691

4-

5'-TGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGC G AGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG-3' З'-АСАТТС TCGTCTAGGGACCTGTCCG С TCCTT ATGTCCATAAAACAGGAAC-5'

3'<- TCG С TCCTT ATGTCCATAAAACAG-5' праймер 11

З'ч- TCTGTCCG С TCCTT ATGTCCATAA-5' праймер 12

3'*- TTAGGGACCTGTCCG С TCCTT ATG-5' праймер 13

З'ч- TGTCTAGGGACCTGTCCG С TCCTT-5' праймер 14

5'-> GAGCAGATCCCTGGACAGGC G АА-3' праймер 15

5'-> TCCCTGGACAGGC G AGGAATACAA-3' праймер 16

5'-> GCAGATCCCTGGACAGGC G AGGAG-3' праймер 17

5'-» GAGCAGATCCCTGGACAGGC G АС-3' праймер 18

5'-* GAGCAGATCCCTGGACAGGC G АТ-3' праймер 19

1 23456789 123456789 10 11

Рис. 6. Структура универсальных праймеров и их функционирование в присутствии искусствен! ДНК, содержащей гомозиготную мутацию Leiden.

(а) - структура универсальных праймеров. Вверху изображена первичная структура обеих цепей Д ч4сти экзона 10 гена фактора V человека, содержащей мутацию Leiden в положении 1691, них последовательности нуклеотидов праймеров (11)-{19). Отражено их положение относится нуклеотида 1691. В структуре праймеров жирным шрифтом выделены некомплсментарные матр нуклеотиды. (б, в) - электрофоретическое разделение продуктов ПЦР, образующихся на искусств ных ДНК, не содержащих (-) или содержащих (+) гомозиготную мутацию Leider), в присутст] праймеров (11)-(19). В качестве встречных использовали праймеры (5) (б) или (1) (в) (рис. 1).

Следует еще раз подчеркнуть, что на функционирование универсальн праймеров в наших условиях не оказывает существенного влияния природа концевых нуклеотидов, некомплементарных матрице, а также положи внутренней некомплементарной пары нуклеотидов в гибриде праймер-матриц пределах, по крайней мере, десяти 3'-концевых нуклеотидов универсальнс праймера.

Таким образом, в ходе проведенных исследований с использованием иск; ственной матричной ДНК, имитирующей гомозиготное и гетерозигоп состояние мутации Leiden, была разработана высокоэффективная систе

скрининга этой мутацйи, которая позволяла дифференцировать гомозиготное и гетерозиготное состояние мутантного аллеля.

Таблица 3. Эффективность элонгации разных универсальных праймеров в присутствии

искусственной ДНК, содержащей гомозиготную мутацию Leiden.

3'-концевая пара нуклеотидов (праймер-матрица) СмещениеЗ '-конца относительно мутантного иухлеогида (нт) Эффективность элонгации праймеров на матрице* № праймера

Муг. Leiden Дик Тип.

T:G 3 - +++ 11

T:G 8 - ++ 12

T:G 15 + +++ 13 •

T.G 18 ++ -Н-+ 14

А: С 2 +/- +++ 15 -

А: С 10 +/- +++ 16

G:T 5 - ++ 17

С:С 2 . - +++ 18

Т:С 2 - +++ 19

' - эффективность элонгации оценивалась визуально, по образованию продукта ПЦР, видимого на элекрофореграммах: (-) - отсутствие видимого продукта; (±) - небольшое количество продукта, обнаруживаемого в отдельных опытах; (+++) - количество продукта, образующегося на матрице дикого типа

В заключительной части работы эта система была апробирована на природных ДНК из клинических образцов, полученных от больных тромбофилия-ми.

Использование разработанных аллель-специфических и универсальных праймеров для анализа ДНК больных тромбофилиями.

При апробации разработанной системы ДНК-диагностики на клинических образцах были использованы препараты ДНК больных тромбофилиями, которые уже были предварительно исследованы нами на присутствие мутации Leiden с помощью стандартной методики, включающей инкубацию продуктов ПЦР с рестриктазой МпИ (см. главу 1). ДНК-диагностика с разработанными праймера-ми проводилась в два этапа. На первой стадии ПЦР осуществляли в присутствии модифицированных аллель-специфических праймеров, 3'-концевые нуклеотиды которых комплементарны соответствующему нуклеотиду мутантного аллеля. На втором этапе в обнаруженных мутантных ДНК было определено аллельное

состояние анализируемого гена с помощью аллель-специфических прайме] соответствующих аллелю дикого типа или универсальных праймеров. , исключения ложноотрицательных результатов во всех пробах присутство! пара праймеров, амплифицирующих микросателлитный локус, локализован] на коротком плече хромосомы 1 человека. Результаты одного из таких опыти представлены на рисунке 7. В этом опыте продукт ПЦР, образующийся амплификации микросателлитного локуса, присутствует во всех пробах которых имеются соответствующие праймеры (дорожки 1-5).

Рис. 7. Обнаружение мутации Leiden в , клинических образцов с помощью разрабс ных аллель-специфических праймеров. Электрофорез продуктов ПЦР в 3% агаро:

геле. Дорожки 1, 3 и 5 - продукты I

содержащие мутацию Leiden, 2,4 и 7 - прод;

ПНР без мутации. Все образцы, за исключа

7, содержали микросателлитные праймеры

10, а также прайх'ср 1 (рис. 1, Табл. 1). Пра]

б (дорожки 1-5) или праймер 4 (дорожка 7) (

использованы в качестве встречных.

Это указывает на то, что все пробы содержат матричную ДНК одинако!

«

качества, что обеспечивает исключение ложноотрицательных результатов. I же время продукт ПЦР, соответствующий мутантному аллелю (отме стрелкой), синтезировался только в пробах 1, 3 и 5, содержащих ДНК с мук ей Leiden. С помощью разработанной нами системы ДНК-диагностики б; проанализированы образцы крови 33 больных с диагнозом тромбоз глубоких конечностей, таза и нижней полой вены, у части из которых течение тром( осложнилось тромбоэмболией легочных артерий, 15 беременных женщи которых при гемостазиологическом обследовании выявлена гиперкоагуляци

также 12 здоровых доноров. В 5 случаях из 33 обследованный больных с венозными тромбозами была обнаружена мутация Leiden. Анализ аллельногэ состояния исследуемого гена в мутантных ДНК показал, что все они содержат мутантный аллель в гетерозиготном состоянии, что подтвердило результаты, полученные нами ранее, с использованием ПЦР и рестриктазы Mnll, которые были описаны в главе 1, а также путем оценки конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP). У здоровых доноров мутация не найдена. Таким образом, все полученные данные позволяют сделать вывод о том, что разработанная нами система ДНК-диагностики мутации Leiden на основе ПЦР с использованием аллель-специфических и универсальных прайме-ров пригодна для широкого применения в клинической практике. Общие принципы, положенные нами в основу разработанной системы; могут быть использованы для изучения любых известных точковых мутаций, а также для поиска новых мутаций в гомозиготном состоянии или у гаплоидных организмов. В последнем случае -использование этих принципов может быть особенно плодотворным при генетическом типировании патогенных микроорганизмов л исследовании особенностей их метаболизма, например, механизмов лекарствек-ной устойчигости.

ВЫВОДЫ

1. Разработана новая универсальная тест-система ДНК-диагностики, позволяющая обнаруживать точковые мутации в геноме человека и дифференцировать их гомозиготное и гетерозиготное состояние.

2. На основе ПЦР разработан новый принцип поиска неизвестных гомозиготных точковых мутаций, который использован при получении универсальных праймеров,'пригодных для выявления мутации Leiden.

3. С помощью разработанной тест-системы среди 33 обследованных больнь

венозными тромбозами выявлено пять больных - носителей мутации Leide

*

имеющих в анамнезе рецидивирующие венозные тромбозы.

4. Принципы, положенные в основу разработанной тест-системы ДН1 диагностики, могут быть использованы при создании тест-систем, пригоднь для обнаружения любых известных точковых мутаций, а также новых ней вестных мутаций в гомозиготном состоянии.

5. Впервые продемонстрирована высокая частота встречаемости мутации Leid< среди больных с рецидивирующими венозными тромбозами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

I

1. Л.И. Патрушев, М.В. Грамадский, Е.С. Зыкова, С.Г. Леонтьев, И.Н. Бокаре А.И. Мирошников, В.М. Кошкин, Е.С. Северин. Молекулярно-генетическ подходы к диагостике тромбофилий. Патология гемокоагуляции ч 1995,с.122-123.

2. Зыкова Е.С., Громадский М.В., Патрушев Л.И., Северин Е.С., Леонтьев CJ Бокарев И.Н., Мирошников А.И., Кошкин В.М. Использование полимеразн цепной реакции для молекулярной диагностики тромбофилий. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Применение полимер; ной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний. Мето, лечения». Сочи, 1996, с.71-73.

3. L.I. Patrushev, E.S. Zykova, A.L. Kayushin, A.I. Miroshnikov, I.N. Bokarev, S. Leontjev, V.M. Koshkin, E.S. Severin. Detection of the factor V gene mutations thrombosis patients by improved allele-specific PCR. 10th Internal Meeting of i Danubian League against Thrombosis and Haemorrhagic Disorders, 1996 p.57.

4. I.N. Bokarev, E.S. Zykova, L.I. Patrushev, A.L. Kayushin, M.D. Korosteleva, / Miroshnikov, S.G. Leontjev, E.S. Severin. New DNA diagnostic system for det tion of the mutation Leiden in patients with thrombophilia. Thrombosis and H mostasis, 1997, suppl., p.19-20.

5. Е.С. Зыкова, JI И Патрушев, A.JI. Каюшин, М.Д. Коростелева, А.И. Мирош-ников, И.Н.Бокарев, С.Г. Леонтьев, В.М. Кошкин, Е.С.Северин. Новые аллель-специфические праймеры для обнаружения мутации Leiden в экзоне 10 гена фактора V при тромбофилиях. Биоорганическая химия, 1997, том 23, №3, с.205-210.

5. Е.С. Зыкова, Л.И. Патрушев, А. Л. Каюшин, М.Д. Коростелева, А.И. Мирои-ников, И.Н. Бокарев, С.Г. Леонтьев, В.М. Кошкин, Е.С.Северин, Г.Т. Сухи?:, А.В.Квасов, В.Г. Серебряков. Мшекулярно-дцагноспмеские исследования мутации Leiden в гене фактора V, ассоциированной с венозными тромбофи-лиями. Материалы 1П Всероссийской конференции: "Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения". М., 1997, с.61-62. 7. Л.И. Патрушев, Е.С. Зыкова, А.Л. Каюшин, М.Д. Коростелева, А.И. Мирош-, гаков. Основанная на ПЦР универсальная тест-система, позволяющая идентифицировать гомозиготные и гетерозиготные точковые мутации. Биоорганическая химия, 1998, том 24, № 3 (в печати).