Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование тест-систем для дифференциальной диагностики герпесвирусных инфекций на основе ПЦР

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование тест-систем для дифференциальной диагностики герпесвирусных инфекций на основе ПЦР"

о и идя

т

На правах рукописи

КЛИНЧЕВА Светлана Анатольевна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕСВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ НА ОСНОВЕ ПЦР.

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1996 год

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики Института молекулярной генетики РАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук доктор медицинских наук, профессор

В.3.Тарантул И.Ф.Баринский

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук

М.М.Гараев Н.П.Косякова

БУДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалея.

Защита диссертации состоится

"/ НСМ[)&М 1997 г. в "Ж?

часов

на заседании специализированного совета Д 001.20.01 при Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН по адресу 123098, Москва, ул.Гамалеи, д. 16.

Автореферат разослан

алр!&

1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Н.П.Косякова

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Герпесвирусные инфекции человека - широко распространенные вирусные инфекции, длительно персистирующие в организме преимущественно в латентной форме, которые вызывают разнообразные заболевания, в ряде случаев весьма опасные для жизни.

Диагностика герпетических инфекций представляет собой достаточно сложную задачу, что объясняется как широким спектром клинических проявлений, так и недостатками традиционно используемых диагностических методов. Перспективным неинвазивным подходом для выявления этих инфекций является ДНК-диагностика патогена при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время ПЦР является чувствительнейшим способом идентификации микроорганизмов, потенциально способным обнаруживать единичные вирусные частицы. Выявление антигенов микроорганизмов при помощи иммуноферментного анализа, серологической диагностики или классической изоляции вируса в культуре клеток не обеспечивают такую высокую чувствительность. В последние годы множество работ посвящено поиску возможностей применения ПЦР-метода в диагностических целях, в том числе и при вирусных инфекциях.

Предпосылками данной разработки послужили отсутствие как у нас в стране, так и за рубежом коммерческих ПЦР-диагностических наборов и острая потребность практической медицины в высокочувствительных, специфичных экспресс-методах диагностики герпесвирусных инфекций.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основной целью настоящей работы являлось конструирование тест-систем, основанных на методе полимеразной цепной реакции амплификации ДНК, способных обеспечивать раннюю дифференциальную диагностику инфекций человека, обусловленных такими герпесвирусами, как цитомегаловирус (ЦМВ), вирус простого герпеса (ВПГ) типов 1 и 2.

В связи с этим в задачи исследования входило:

1. Подбор специфических и чувствительных пар праймеров для определения ДНК ЦМВ.

2. Клонирование выбранной области геномной ДНК ЦМВ, для получения положительного контроля.

3. Разработка внутреннего стандарта для проведения ПЦР-исследования: получение контрольной матрицы с ампликоном измененной длины (внутреннего стандарта, рВС) и использование конкурентной ПЦР для полуколичественной оценки результатов.

4. Подбор специфических и чувствительных пар праймеров для выявления и типирования ВПГ типа 1 и 2.

5. Оценка специфичности и чувствительности сконструированных ПЦР тест-систем.

6. Адаптация разработанных тест-систем для клинических исследований.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

В результате проведенной работы созданы высокочувствительные тест-системы для выявления ДНК ЦМВ, ВПГ типа 1 и 2. Изучены чувствительность и специфичность подобранных тест-систем. Получены плазмиды: рМ1Е4, содержащая экзон 4 MIE гена ДНК ЦМВ, которая может служить положительным контролем при проведении ПЦР-анализа, и рВС, содержащая специфический фрагмент, измененной длины. Показана возможность использования конкурентной ПЦР с использованием рВС для полуколичественного определения содержания ДНК ЦМВ в клиническом образце. Оптимизированы условия проведения ПЦР-анализа, ориентированного на выявление минимальных количеств вирусной ДНК. Проведена апробация сконструированных тест-систем на клиническом материале и показаны их преимущества для ранней диагностики герпесвирусных инфекций.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Практическое значение работы заключается в разработке пригодных для использования в практической медицине лабораторных вариантов ПЦР тест-систем для определения ДНК ЦМВ, а также ВПГ 1 и 2 типов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Разработка диагностической nested ПЦР тест-системы для полуколичественной оценки содержания ДНК ЦМВ.

2. Разработка диагностической ПЦР тест-системы для дифференциальной диагностики ВПГ 1 и ВПГ 2 типов.

3. Адаптация метода ПЦР для исследований клинических образцов, ориентированная на выявление минимальных количеств вирусной ДНК в сложных биологических субстратах.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты работы были доложены на V Международной конференции по проблемам цитомегаловирусных инфекций (Стокгольм, 1995г), на I Всероссийской научно-практической конференции: "Применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний" (Сочи, 1996г), на отчетной конференции Института молекулярной генетики РАН (Москва, 1996г).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов и выводов. Объем работы составляет 113 страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированны 5 таблицами и 26 рисунками. Список литературы состоит из 118 наименований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штаммы вирусов: AD-169 (ЦМВ), Л2 (ВПГ-1), ВН (ВПГ-2), линия P3HR1 (вирус Эпштейна-Барра), полученные в лаборатории сравнительной вирусологии НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Выделение вирусов в культуре клеток проводила ст. научный сотрудник лаборатории сравнительной вирусологии НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Посевая Т.А. Выделение ЦМВ осуществляли на культуре фибробластов эмбриона человека, ВПГ 1 и 2 типа выделяли на клетках линии VERO. Клетки выращивали на среде MEM с 10% телячьей эмбриональной сыворотки. Инфицированные культуры наблюдали в течение 2-3 недель. Выделяемые вирусы идентифицировали в реакции нейтрализации с гипериммунными кроличьими сыворотками, полученными к штаммам АД-169 (ЦМВ), Л2 (ВПГ-1) и ВН (ВПГ-2). Определение раннего антигена ЦМВ проводила ст.научный сотрудник лаборатории типирования и селекции органов НИИ трансплантации и искусственных органов МЗ РФ Войлокова Р.Я. с помощью иммуно-кондуктометрического метода. Клинические образцы собирали в течение двух лет тесного сотрудничества с отделением трансплантации костного мозга Института детской гематологии. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе фирмы PERKIN ELMER CETUS (США). Реакционная смесь объемом 30 мкл включала 67 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 16 мМ сульфата аммония, 0.01% Твин 20, 2.5 мМ хлорида магния, 0.2 мМ каждого dNTP, 0.3- 0.5 мкМ каждого из праймеров и Змкл тестируемого образца. При постановке nested ПЦР реакцию проводили в два этапа. Первый - амплификация с парой внешних праймеров - 30 циклов: 1 мин. 95 °С, 1 мин. 50 °С, 1 мин, 72 °С. Затем 2 мкл амплификата переносили в другую реакционную смесь, содержавшую пару внутренних праймеров. Реакцию проводили в аналогичном режиме, но при повышенной до 60 °С температуре отжига. Для стандартной реакции амплификации в один этап использовали внутреннюю пару праймеров и проводили 35 циклов амплификации. Детекцию продуктов амплификации проводили в 1.5% агарозном геле с 0.001% бромидом этидия. В качестве маркера молекулярного веса ДНК использовали плазмиду pUCl В, рестрицированную Hinf I.

Описание ряда методов и условий постановки экспериментов приводится при изложении полученных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

/. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ

ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ЦМВ.

1.1. Выбор ДНК-мишени и дизайн праймеров.

Для детекции ДНК ЦМВ в качестве ДНК-мишени использовали экзон 4 гена MIE (Major Immediate Early protein), как наиболее консервативный участок геномной ДНК различных штаммов ЦМВ. С помощью программы OLIGO к стабильным участкам экзона были подобраны несколько пар праймеров (рис. 1).

Для эффективной амплификации малых количеств вирусной ДНК ПЦР была оптимизирована для каждой пары праймеров. Условия проведения ПЦР были подобраны по следующим параметрам, оказывающим влияние на специфичность и количество получаемого продукта: концентрация Mg2+, концентрация праймеров, количество фермента, температура отжига и число циклов амплификации.

1.2. Определе}ше специфичности и чувствительности подобранных пар праймеров.

Специфичность подобранных пар праймеров проверяли, проводя ПЦР, в которых в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из культур клеток, зараженных другими герпесвирусами (вирусы простого герпеса 1 и 2 типов, вирус Эпштейна-Барра), и геномную ДНК человека. Никаких неспецифических продуктов амплификации, как для праймеров СО и С2, так и для праймеров С1 и С4 выявлено не было. Специфичность ПЦР неоднократно подтверждалась с помощью расщепления полученного продукта (222 п.н.) эндонуклеазой Taq 1 на фрагменты размером 132 и 90 пар нуклеотидов.

Для того, чтобы оценить чувствительность ПЦР, были приготовлены десятикратные разведения культуры фибробластов, инфицированных штаммом AD-169 ЦМВ с инфекционным титром 104 ТЦД5о/0.2мл. Проведение реакции с любой парой праймеров позволяло получить положительный результат при тестировании 1:1 ООО разведения данной исходной культуры.

Одним из способов повышения чувствительности ПЦР-системы является использование nested варианта ПЦР, который состоит в проведении двух последовательных реакций, когда амплимер, образующийся в ходе первой реакции с использованием пары внешних

CI 5' GCAACGAGAACCCCGAGAAAG 3' C2 5' CAAGCCATCCACATCTCCCGC 3' CO 5' GCGGCATAGAATCAAGGAGCACATG 3' C4 5' AAGCCATAATCTCATCAGGG 3'

CHU HIE gene

,<2O50-г0?4> <2251-2271)1

i 222 п.н. i

ПЦР2

Рис. 1. Последовательность и локализация олигонуклеотидных праймеров, выбранных для определения ДНК ЦМВ.

праймеров (С1 и С4), служит матрицей для второй ПЦР с внутренними праймерами (СО и С2). При постановке nested реакции амплификации положительный сигнал получали при разведении вируссодержащей культуры в 106 раз. Таким образом, чувствительность предлагаемого метода в 1000 раз выше, чем традиционного одностадийного варианта. При постановке ПЦР-анализа по методу nested ПЦР не только значительно возрастает чувствительность системы, но и частично снимается проблема появления неспецифических продуктов реакции (рис. 2).

Абсолютную чувствительность ПЦР тест-системы, т.е. минимальное количество копий MIE гена, выявляемое nested ПЦР, определили, используя полученную нами плазмиду pSMIE4, содержавшую часть MIE гена ДНК ЦМВ. Для клонирования экзона 4 гена MIE были сконструированы праймеры R1, содержащий сайт узнавания для эндонуклеазы EcoRI на 5' конце (негомологичный конец) 5' GTACCGAATTCTCATGTGTTTAGGCCCG 3' и праймер HI 5' GTGACGTGGGATCCATAACAG 3', гомологичный участку гена MIE с сайтом узнавания для эндонуклеазы BaraHI. Фрагмент, получаемый в результате амплификации ДНК ЦМВ с этими праймерами, был клонирован в плазмиду pUC18 по EcoRI/BamHI сайтам, в результате чего была получена плазмида pSMIE4, содержащая вставку геномной ДНК ЦМВ. Определенное количество плазмидной ДНК амплифици-

К- К+ 1 2 3 4

- 222 п.н.

Рис. 2 . Выявление ДНК ЦМВ методами одноэтапной и nested ПЦР. Результаты ПЦР 103 разведения ЦМВ инфицированной культуры ФЭЧ : 1- с праймерами СО и С2, 2 - методом nested ПЦР; результаты выявления ДНК ЦМВ в лейкоцитах периферической крови (ЛПК) больного: 3-е праймерами СО и С2,4 - методом nested ПЦР.

ровали в присутствии 1 мкг геномной ДНК человека. Минимальное количество выявляемой плазмидной ДНК в такой постановке реакции было 20 fg, что соответствует 3-4 фрагментам проклонированной MIE области.

1.3. Подбор адекватных способов обработки клинического

материала для проведения ПЦР-анализа.

Подготовка клинических образцов для ПЦР требует компромисса между качеством получаемой ДНК-матрицы и технической сложностью процедуры ее приготовления. Так как исследуемый материал представляет собой сложную биологическую смесь, часто содержащую хозяйскую ДНК и/или ДНК других микроорганизмов, а также может содержать в своем составе ингибиторы ДНК-полимеразы, требуется предварительная очистка ДНК. С другой стороны, приготовление высокоочищенной матрицы с применением сложных длительных процедур может приводить контаминации тестируемого образца и приводит к увеличению времени проведения анализа и его стоимости.

Рис.3. Результаты ПЦР анализа клинических образцов, обработанных различными, методами: стандартная обработка с помощью протеиназы К (1, 4), преципитация вируса ПЭГ (2,5), экстракция вирусной ДНК с помощью сорбента (3,6). Дорожки: 1,2, 3 - моча больного новорожденного, 4,5,6 - грудное молоко матери.

Часто для проведения ПЦР-анализа достаточно грубого лизиса исследуемого материала и последующей обработки протеиназой К, например, при исследовании плазмы, ликвора, слезной жидкости, суспензии клеток. Сложные биологические жидкости, такие как моча, слюна, грудное молоко содержат ингибиторы, которые мешают проведению ПЦР-анализа. Для устранения ингибирования мы использовали два метода: метод предварительной преципитации вирионов с помощью ПЭГ (6000) и метод экстракции вирусной ДНК с помощью сорбента Силипор. Экстракция вирусной ДНК при помощи сорбента из мочи больных и преципитация вирионов при помощи ПЭГ приводят к более выраженному положительному результату вследствие удаления ингибиторов из исследуемого образца (рис. 3, дорожки 1,2,3). При выявлении ЦМВ в таких образцах, как грудное молоко, которое полностью ингибирует ДНК-полимеразу, методы экстракции ДНК и предварительной преципитации вируса являются незаменимыми (рис.З, дорожки 4,5,6).

//. ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦМВ В ЛЕЙКОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КОСТНОГО МОЗГА.

II. 1 .Выявление ДНК ЦМВ в клинических образцах методом nested ПНР.

Разработанный метод применяли для быстрого выявления ДНК ЦМВ в лейкоцитах периферической крови (ЛПК). В работе были проанализированы 113 образцов крови от 9 пациентов после трансплантации костного мозга (ТКМ). Пациентами являлись дети в возрасте от 2 до 14 лет с различными формами лейкозов. Наблюдение проводили от 1 до 12 месяцев. Кровь с добавлением ЕДТА в качестве антикоагулянта брали 1 -2 раза до пересади КМ и затем еженедельно после ТКМ. Лейкоцитарную фракцию из цельной крови получали путем центрифугирования в градиенте плотности Histopaque-119 (Sigma). Присутствие цитомегаловируса в лейкоцитах устанавливали при помощи nested ПЦР.

Пробы, взятые перед трансплантацией, дали негативный результат во всех 9 случаях. ДНК ЦМВ не была выявлена в лейкоцитах здоровых сероположительных доноров. Ни у кого из 9 пациентов не возникло ЦМВ-ассоциированного заболевания. Однако у 6 из них (66.6%) результат ПЦР-анализа в то или иное время после трансплантации был положителен. Лечение противовирусным препаратом ганцикловиром начинали в том случае, когда последовательно две пробы были ПЦР-положительны. Контроль за эффективностью антивирусной терапии также проводили при помощи nested ПЦР. После лечения ганцикловиром 5 из 6 ПЦР-положительных пациентов стали ПЦР-отрицательными. Например, в случае пациентки N7 (12 лет) ДНК ЦМВ была обнаружена на +83 день после аллогенной трансплантации. Раннее лечение ганцикловиром (5 мг/кг два раза в день в течение 14 дней) было начато после двух последовательных обнаружений вирусной ДНК в пробах. Однако, ДНК ЦМВ определялась с помощью ПЦР еще через 10 дней после начала антивирусной терапии (рис. 4).

Интересным результатом исследования было выявление корреляции ЦМВ вирусемии с развитием реакции трансплантант против хозяина (РТПХ). У 4 пациентов из 8 после аллогенной ТКМ развивалась реакция РТПХ различной степени и во всех 4 случаях пациенты становились ПЦР-положительными, в то время как среди пациентов без РТПХ ЦМВ вирусемия была обнаружена только в одном случае.

МК-К+ 123 4567

mm-

Дни послеТКМ: -10 61 83 90 104 111 125

Рис.4. Динамика выявления ДНК ЦМВ методом nested ПЦР у пациента №7 после аллогенной ТКМ.

II.2. Сравнение разработанного ПЦР-метода выявления ДНК

IJMВ с другими методами лабораторной диагностики.

В 48 случаях образцы крови пациентов после ТКМ исследовали параллельно другими методами лабораторной диагностики: методом изоляции вируса в культуре клеток (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН), иммунокондуктометрическим методом выявления раннего антигена (Институт трансплантации органов) и серологическими методами определения антивирусных IgG и IgM антител (наборы ИФА фирмы Зббот).

Результаты ПЦР-анализа и изоляции вируса в культуре совпали в 37 случаях из 48 , что составляет - 78%. Оба метода дали отрицательный результат в 33 случаях и одновременный положительный результат в 4 случаях. Расхождение результатов было отмечено в 11 образцах, которые были положительными в ПЦР-анализе и отрицательными при вирусологическом исследовании.

Метод ПЦР и метод выявления раннего антигена дали идентичные результаты в 40 случаях из 48 , что составляет 85% . Оба метода в 31 случае дали отрицательный результат и в 9 случаях одинаково положительный результат. Расхождения наблюдали только в 8 случаях: результаты ПЦР-анализа были положительны, а тестирование на ранний антиген отрицательно в б случаях. И наоборот, ПЦР отрицательный, а ранний антиген положительный в 2 случаях. В основном, расхождение в полученных результатах можно объяснить более высокой чувствительностью ПЦР метода выявления вирусной ДНК.

Полученные нами результаты по выявлению ЦМВ в динамике посттрансплантационного курса говорят о том, что при помощи ПЦР- анализа ЦМВ в ЛПК обнаруживается в среднем на две недели раньше, чем при использовании методов изоляции вируса в культуре и определения раннего антигена (табл. 1). Первое обнаружение ДНК ЦМВ в крови с помощью методов ПЦР, выявления раннего антигена иммунокондуктометрическим методом и обнаружение ЦМВ вирусологическим методом было получено в среднем на 32, 39 и 47 день, соответственно. У б пациентов, получавших ганцикловир, вирусная ДНК определялась ПЦР-методом еще в среднем через 15 дней после начала антивирусной терапии, в то время как ранний антиген выявляли в среднем еще 8 дней, а вирусологическим методом -4 дня. Можно говорить о том, что ПЦР-метод является более чувствительным индикатором наличия вируса в крови.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что предложенный метод является эффективным и наиболее надежным средством ранней диагностики ЦМВ виремии. Детекция вируса в лейкоцитах с помощью nested ПЦР является также надежным средством контроля за течением инфекции и эффективностью применяемой антивирусной терапии.

Таблица 1. Выявление ЦМВ у пациента №8 во время постгранспланта-ционного курса различными диагностическими методами.

Нед.после ТКМ ПЦР рАГ вирусол. ганцикловир мг/кг степень РТПХ

0 - - -

1 + - ND

2 + -ь ND 5

3 + - - 10 II степень

4-8 — — —

9 + - ND Шстепень

10 + + + 5

11 + + - 10

12 + - - 10

13 - - -

14-20 - - -

21 + - - I степень

22 + ND - 10

23 + ND 10

24 + + + 10

25 - - -

III. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ С ВНУТРЕННИМ СТАНДАРТОМ.

Отсутствие количественной оценки положительного результата является одним из существенных недостатков ПЦР тест-систем, предназаначенных для диагностики заболеваний, вызываемых вирусами с возможной латентной формой инфекции, и снижает их диагностическую значимость. Одним из подходов к решению данной проблемы может быть применение конкурентной ПЦР с использованием внутреннего стандарта (рВС) для полуколичественного определения уровня вирусемии в образце. Метод заключается в том, что наряду с нативной матрицей (вирусной ДНК) в одной пробирке амплифицируется "стандартный" ДНК фрагмент, который идентичен матричной ДНК, но содержит вставку или .делецию. В результате такой реакции с одними и теми же праймерами получаются специфические фрагменты ДНК различной длины, что позволяет их легко разделять в агарозном геле.

III. 1. Получение внутреннего стандарта.

Для получения плазмиды, содержащей специфический фрагмент измененной длины использовали ПЦР технологию "gene splicing by overlap extention", которая позволяет создать рекомбинантную ДНК-конструкцию без использования рестриктаз (рис.6). Были проведены четыре последовательные амплификации с использованием подобранных нами 3 пар праймеров: С1 и С2 для амплификации специфического фрагмента ДНК ЦМВ, Р1 и Р2 для получения фрагмента гетерогенной ДНК фага X и частично перекрывающихся праймеров OLI 5' ТС A GA GGCCGCTTGGGCAAACATCCTCCCA и OL2 5'AGGAGGA TGGTGCTGTIGGGCTAACTATGC. Одна часть последовательности праймеров гомологична ДНК фага А, (выделена курсивом), другая - гомологична ДНК ЦМВ (выделена жирным шрифтом). ПЦР1. Амплификация фрагмента А (рис.6, ПЦР1а): специфический ампликон размером 461 п.н. получали, используя ДНК ЦМВ-матрицу и С1 и С2 праймеры. Амплификация фрагмента В (рис.6, ПЦР 16): фрагмент X ДНК размером 435 п.н. получали, используя специфические праймеры Р1 и Р2.

ПЦР2. В двух независимых реакциях получены два ЦМВ-А. перекрывающихся фрагмента, используя фрагмент А в качестве матрицы и праймеры OLI и OL2. Фрагмент С размером 87 п.н., амплифицированный с помощью праймеров С2 и OL2 (рис.6, ПЦР 26), состоит из 72 п.н., принадлежащих ЦМВ последовательности и 15 п.н., принадлежащих X ДНК (рис. 7, дор. 1).

C1 v ген MIE ЦМВ

P1 ^ ДНК

W

4 C2

Фрагментй

фрагмент В

Р2

КЛОНМРОВЛНИЕ

фага х

Рис.6. Схема получения внутреннего стандарта.

Фрагмент D, полученный в результате амплификации фрагмента А с праймерами С1 и OLI (рис.6, ПЦР 2а), имеет размер 346п.н. и представляет собой рекомбинантный ампликон, который состоит из 331 п.н., принадлежащих к ЦМВ и 15 п.н., принадлежащих к X ДНК (рис. 7, дор.2).

ПЦРЗ. Получение фрагмента Е: фрагмент "Х.-ЦМВ", размером 507 п.н., получен при помощи сплайсинга перекрывающегося фрагмента С и фрагмента В размером 435 п.н. (рис. 6, ПЦРЗ; рис. 7, дор.З) с помощью праймеров С2 и Р1.

ПЦР4. Получение конечного фрагмента F "ЦМВ-л-ЦМВ" (рис. 6, ПЦР4). Ампликон размером 838 п.н. получается в результате сплайсинга второго перекрывающегося фрагмента D и фрагмента Е, с помощью праймеров С1 и С2.

В результате фрагмент ДНК фага Я длиной 435 п.н. был вставлен в определенное место последовательности MIE гена ДНК ЦМВ. Полученная удлиненная конструкция была проклонирована в плазмиду pUC18. Результатом амплификации этой плазмиды с праймерами С1 и С2 было появление специфического продукта большей длины (853 п.н.), чем при амплификации нативной вирусной ДНК-мишени (461 п.н.).

Для подтверждения специфичности полученного внутреннего стандарта (рВС) провели амплификацию с различным набором специфичных к нему праймеров. Наличие продуктов амплификации прогнозируемой длины: 598 п.н. для праймеров СО и С2, 853 п.н. для праймеров С1 и С2 подтвердило правильность полученной конструкции (рис. 7, дор. 5,6).

MI 1 2 3 4 5 6 М2

Рис. 7. Этапы получения ВС и контрольная амплификация рВС с различными парами праймеров. Дорожки: 1 - фрагмент С , 97 п.н.

2 - фрагмент О, 346 п.н.

3 - фрагмент Е, 507 п.н.

4 - фрагмент Р, 838 п.н.

5 - результат амплификации рВС с праймерами СО и С2 (598 п.н.)

6 - результат амплификации рВС с праймерами С1 и С2 (838 п.н.).

III.2. Применение конкурентной ПЦР с использованием внутреннего стандарта для полуколичественной оиенки содержания ДНК ЦМВ в клинических образцах.

Проведение ПЦР-анализа в присутствии рВС позволяет решать две проблемы: контролировать условия реакции, в т.ч. отсутствие компонентов, ингибирующих полимеразу в клиническом материале и производить полуколичественную оценку выхода ПЦР продукта, а следовательно, косвенно оценивать уровень вирусемии образца. Количество ложноотрицательных результатов из-за присутствия в образцах ингибиторов Taq полимеразы варьирует в зависимости от способа обработки материала от 5 до 7% (данные фирмы "Хоффман-Ля Рошш"). Использование рВС позволяет однозначно выявлять такие образцы (рис. 8). Если после амплификации в агарозном геле отсутствует фрагмент, соответствующий по длине вставке рВС, то образец содержит ингибитор Taq полимеразы и мы можем иметь ложноотрицательный результат (рис. 8, дор.1). Образец, содержащий специфический фрагмент рВС длиной 598 п.н. (для внутренней пары праймеров СО и С2) и не содержащий специфического фрагмента нативной ДНК , есть истинно отрицательный (рис. 8, дор.2,3,6). И, наконец, образец, в котором присутствуют ампликоны длиной 598 п.н. и 222 п.н. , является положительным (рис. 8, дор.4,5).

К-К+ 1 2 3 4 5 6

Рис. 8. Результаты амплификации клинических образцов в присутствии рВС с праймерами СО и С2.

М К- 1 2

степень разведения

-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7

- 598 п.н.

- 222 п.н.

Рис.9. Результаты конкурентной nested ПЦР десятикратных разведений ЦМВ-инфицированной культуры ФЭЧ в присутствии рВС.

Использование рВС является более чувствительным индикатором наличия ингибиторов, чем общепринятый метод коамплификации образца с праймерами к человеческому (3-глобиновому гену. Значительное ингибирование амплификации 100 копий рВС, наблюдаемое в ряде случаев, еще может давать удовлетворительные результаты при амплификации тысяч копий геномной человеческой ДНК.

С целью убедиться в том, что добавление рВС в реакцию не снижает эффективность амплификации небольших количеств нативной матричной ДНК, фиксированное число копий стандарта (100 копий плазмидной ДНК) амплифицировали в присутствии различных количеств матрицы ЦМВ (десятикратные разведения инфекционного ЦМВ штамма AD 169). Проведение амплификации в присутствии 100 копий рВС не снизило чувствительности ПЦР тест-системы - положительный сигнал получали при разведении вируссодержащей культуры в 106 раз. Видно, что добавление 100 копий рВС не влияет на амплификацию небольших количеств нативной ДНК (рис.9).

По результатам амплификации клинического образца в присутствии определенного числа копий внутреннего стандарта можно судить о том, больше или меньше внесенного числа копий стандартной ДНК содержится вирусных геномов в тестируемом образце (рис. 10).

К- K1К2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Рис.10. Результаты конкурентной nested ПЦР с использованием ВС. Дорожки: К1 - положительный контроль без ВС; К2 - положительный контроль с добавлением 100 копий рВС;с 1 по 10 - клинические образцы с добавлением 100 копий рВС.

Превышение уровня 100 копий/104 лейкоцитов говорит о высоком риске (86%) развития генерализованной формы ЦМВ инфекции (Rawal et al, 1994). Такая полуколичественная оценка содержания вируса в крови пациента повышает клиническую значимость положительных результатов. Предлагаемый быстрый метод оценки уровня вирусемии проще и дешевле обычно используемых методов амплификации лимитирующих разведений клинического образца, или гибридизации продукта амплификации с меченным зондом.

IV. РАЗРАБОТКА ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСАМИ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 1И2 ТИПОВ.

Выделение ВПГ вирусологическим методом при заражении чувствительных клеточных культур является надежным диагностическим приемом. Однако, ввиду его длительности и определенных трудностей, возникающих при типировании и обусловленных наличием большого количества общих антигенов у ВПГ 1 и 2 типа, существует потребность в разработке экспресс-диагностикумов, позволяющих быстро выявлять и типировать ВПГ.

IV.1. Подбор спеиифичных отгонукпеотидных праймеров для определения и типировангия ДНК ВПГ1 и 2 типов.

На первоначальном этапе работы для выявления и прямого типирования вируса простого герпеса мы использовали предложенную японскими исследователями (Kimura, 1990) трехпрай-мерную систему. В качестве ДНК-мишени для амплификации был выбран ген ДНК полимеразы ВПГ, который кодирует 136К белок, играющий ключевую роль в репликации вируса. Данная система состоит из трех праймеров, один из которых общий (Р5), а два других РЗ-1 и РЗ-2 типоспецифические к гену ДНК-полимеразы ВПГ 1 и 2 типа соответственно (рис. 11). Проверка данной системы праймеров на специфичность показала, что для типирования этот выбор праймеров не является оптимальным. Несмотря на высокую температуру отжига (65 °С), использование трехпраймерной системы в одной пробирке, приводило к появлению полосы в 469 п.н., характерной для ВПГ 1 типа, в реакции с ДНК ВПГ 2 типа (рис. 12). Эта перекрестная реакция является следствием высокого уровня гомологии генов ДНК-полимеразы ВПГ1 и 2 типов.

Для идентификации ДНК ВПГ 1 типа нами была подобрана другая пара праймеров. В качестве ДНК-мишени был выбран ген тимидинкиназы, имеющий более низкий процент гомологии для ДНК ВПГ 1 и 2 типов.

В этой работе также исследовали возможность использования предложенных Roger et al. (1991) универсальных праймеров для проведения рутинных клинических ПЦР-анализов. Праймеры были гомологичны участкам гена ДНК-полимеразы обоих типов ВПГ.

Для подтверждения специфичности выбранных пар праймеров с каждой парой олигонуклеотидов была поставлена ПЦР, в которой в качестве матричной ДНК использовали как ДНК ВПГ типа 1 и 2, так и ДНК других герпесвирусов (цнтомегаловирус, вирус Эпштейна-Барра), а также геномную ДНК человека. Результатом ПЦР реакции с универсальными праймерами является специфический для обоих штаммов фрагмент длиной 476 п.н. При проведении ПЦР реакции со специфическими праймерами к ВПГ типа 1 специфический фрагмент длиной 295 п.н образуется только с ДНК матрицей ВПГ типа 1 (штамм Л2). Никаких неспецифических продуктов ПЦР реакции с ДНК других герпесвирусов и геномной ДНК человека не было выявлено.

Учитывая наличие перекрестных реакций в трехпраймерной системе, в дальнейшем при работе с клиническим материалом использовали праймеры Р5 и РЗ-2, как типоспецифические для ВПГ типа 2. Для выявления ДНК ВПГ типа 1 использовали оригинальные праймеры PR 1-1 5' CACCCCAGGCTCCATACCGAC 3' и PR2-1 5' GTG GGGAAAAGGAAGAAACG 3'.

Р5- 5' АТСОТСААСАТСОАСАТОТЛССО 3' РЗ-1 5' ССТСССОТТСОТССТСОТССТСС 3' РЗ-2 5' ССТССТГСТСОАСОССССОАААС 3'

Рис. 11. Локализация и последовательность олигонуклеотидных праймеров, выбранных для выявления и типирования ДНК ВПГ типа1 и 2 (трехпраймерная система).

1 2 3 4 5 М

1419

517 396

214

Рис.12. Специфичность трехпраймерной тест-системы.

Дорожки: 1 - ДНК ВПГ 1 типа (штамм Л2);

2 - ДНК ВПГ 2 типа (штамм ВН);

3 - ДНК ЦМВ (штамм АО-169);

4 - ДНК вируса Эпштейна-Барр (линия РЗНЯ1);

5 - геномная ДНК человека.

Десятикратные разведения клеток Vero, инфицированных ВПГ типа 1 , были использованы для изучения чувствительности реакции с универсальными и типоспецифическими праймерами. Было показано, что сконструированные нами специфические праймеры к ВПГ-1 образовывали видимый ампликон при разведении исходной культуры в 107 раз, тогда как универсальные праймеры (Roger, 1991) только в разведении 104 раз. Аналогичным образом было установлено, что праймеры Р5 и РЗ-2 образуют видимый продукт амплификации при разведении исходной культуры клеток Vero, инфицированных ВПГ-2 (штамм ВН) в 10б раз, в то время как универсальные праймеры дают положительный результат при 104 разведении исходной культуры.

IV.2. Применение ПЦР тест-системы для определения ДНК ВПГ

в клинических образцах.

Клиническим материалом для исследования диагностических возможностей испытуемых ПЦР тест-систем служили урогенитальные соскобы от больных (п=242). На основе выбранных пар праймеров для выявления ДНК ВПГ в клинических образцах применяли две различные системы: детекцию с помощью универсальных праймеров и дифференциальную диагностику ВПГ 1 и 2 типа с использованием типоспецифических праймеров.

В случае проведения ПЦР-анализа с использованием универсальных праймеров положительный результат был получен в 28 образцах. С помощью типоспецифических праймеров ДНК ВПГ 1 типа была выявлена в 18 образцах, ДНК ВПГ 2 типа в 81 пробе. Таким образом, применение более чувствительных типоспецифических пар праймеров для дифференциальной диагностики ВПГ привело к обнаружению ДНК ВПГ в 40.9% тестируемых образцов. В то время как положительный результат при использовании универсальных праймеров был лишь 11.6%.

На рис. 13 представлены результаты ПЦР тестирования 12 клинических образцов на наличие ВПГ с помощью универсальных и типоспецифических праймеров. При использовании типоспецифических пар праймеров ДНК ВПГ-1 выявлена в 2 образцах (рис. 13-б, дор. 1,3), ДНК ВПГ-2 обнаружена в 5 пробах (рис.13-в, дор.4,7,8,10,11). Положительный результат при использовании универсальных праймеров получен в 3 случаях (рис. 13-а, дор.3,7,8). Следовательно, в 4 пробах (рис.13-а, дор.1,4,10,11) получен ложноотрицательный результат вследствие более низкой чувствительности универсальных праймеров.

Типоспецифические праймеры были успешно применены для определения ДНК ВПГ в других клинических материалах, например, в слезной жидкости больных с диагнозом хориоретинит, ликворс больных после трансплантации костного мозга.

Рис. 13. Результаты выявления ДНК ВПГ в клинических образцах с использованием различных ПЦР тест-систем:

К+ К- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А - Универсальные праймеры

К+ К- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Б - праймеры, специфичные к ВПГ типа 1

К+К- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

НИ

В - праймеры, специфичные к ВПГ типа 2

ВЫВОДЫ.

1. Разработана nested ПЦР тест-система для определения ДНК ЦМВ. Подобраны две пары специфических праймеров, позволяющие выявлять 3-4 копии ДНК ЦМВ. Чувствительность разработанной тест-системы выше таковой метода изоляции вируса в культуре ФЭЧ, и позволяет определять ДНК ЦМВ в 106 разведении исходной вирусосодержащей культуры фибробластов, с инфекционным титром 104 ТЦДм/О.2мл (штамм AD-169 ЦМВ).

2. Показаны преимущества применения разработанной тест-системы для раннего выявления ДНК ЦМВ в лейкоцитах периферической крови пациентов, перенесших трансплантацию костного мозга. Разработанная nested ПЦР тест-система позволяет выявлять ДНК ЦМВ на 1 -2 недели раньше, чем метод выделения вируса в культуре ФЭЧ и иммунокондуктометрический метод выявления раннего антигена. При этом получение результата ПЦР-анализа возможно в течение В -10 часов.

3. Разработана методика использования конкурентной ПЦР с внутренним стандартом (рВС) для полуколичественной оценки содержания вирусной ДНК в клиническом образце. Одновременная амплификация тестируемого образца и стандартной плазмиды с одной и той же парой праймеров позволяет однозначно выявлять образцы, содержащие ингибиторы Taq-полимеразы и позволяет избегать ложноотрицательных результатов.

4. Разработан лабораторный вариант ПЦР тест-системы для рутинных исследований клинических образцов, обеспечивающий выявление минимальных количеств вирусной ДНК ЦМВ в сложных биологических субстратах. Применение разработанной тест-системы для детекции ДНК ЦМВ в образцах крови ( п=113) больных после трансплантации костного мозга (9 пациентов) показало, что предлагаемая nested ПЦР тест-система является надежным средством контроля за течением ЦМВ инфекции и эффективностью применяемой антивирусной терапии.

5. Подобраны высокоспецифичные и чувствительные праймеры для дифференциальной ПЦР детекции ВПГ 1 и 2 типов, позволяющие определять ДНК ВПГ 1 и 2 типов в 10б и 107 разведениях клеток Vero, инфицированных эталонным штаммами Л2 (ВПГ-1) и ВН (ВПГ-2), инфекционный титр которых достигал соответственно 105>5 и 10 65 ТЦДзо/0,2 мл.

6. Применение разработанных нами тииоспецифических пар праймеров для детекции ДНК ВПГ типов 1 и 2 в урогенитальных соскобах больных (п= 242) позволило обнаружить ДНК ВПГ в 40.9% случаев, в то время как использование ранее опубликованных универсальных праймеров позволило выявить ДНК ВПГ только у 1 ] .6% больных. При этом ДНК ВПГ типа 1 была выявлена в 7.4% образцов, ДНК ВПГ типа 2 в 33.5% проб.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Баринский И.Ф., Бакаев В.В., Посевая Т.А., Клинчева С.А., Николаева Н.П., Длинн В.В., Шебалина Н.В. Разработка метода диагностики инфекций, вызываемых вирусами простого герпеса и цитомегаловирусом с использованием полимеразной цепной реакции и с применением высокочувствительных праймеров. Вопросы вирусологии, 1994, №6, с. 245-247.

2. Bakaev В.В., Dzantiev L.B., Klincheva S.A., Nikolaeva N.P., Zavina G. V., Kryzhanovski O.I., Maschan A.A., Scorobogatova E.V. Monitoring of CM V infection after bone marrow transplantation in children by PCR in periferal blood (PB) leukocytes. Materials of V International Cytomegalovirus Conference, Stogholm, 21-24 May, 1995, p.170.

3. Booran N.K., Klincheva S.A., Bakaev V.V. Detection of human cytomegalovirus in clinical specimens by a tow-round polymerase chaun reaction with nested primer oligonucleotides. Ir. J. of Medical Sciences, 1995, 20 (3,4), p. 159-164.

4. Клинчева C.A., Николаева Н.П., Бакаев В.В., Гнедой С.Н. Мониторинг цитомегаловирусной инфекции после трансплантации костного мозга методом полимеразной цепной реакции. Материалы I Всероссийской конференции "Применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний", 8-10 апреля 1996 г-., Сочи, с. 85-89.

5. Клинчева С.А., Бакаев В.В., Баринский И.Ф., Гнедой С.Н., Николаева Н.П. Использование метода nested-полимеразной цепной реакции для быстрого выявления цитомегаловируса в лейкоцитах периферической крови пациентов после трансплантации костного мозга. Вопросы вирусологии, 1996, №4, с. 147- 149.