Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностика протозойных заболеваний животных с помощью полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецова, Эльвира Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Полимеразная цепная реакция как один из методов генодиагностики

1.1.1. Принцип метода.

1.1.2. Преимущества полимеразной цепной реакции как метода диагностики инфекционных, инвазионных заболеваний животных и человека.

1.1.3. Задачи в современной инфекционной и инвазионной патологии, которые можно решать с помощью полимеразной цепной реакции.

1.1.4. Практические требования к подбору условий проведения полимеразной цепной реакции.

1.1.4.1. Основные требования к компонентам полимеразной цепной реакции.

1.1.4.1.1. Фермент Taq-пoлимepaзa.

1.1.4.1.2. ДНК.

1.1.4.1.3. Олигонуклеотидные праймеры.

1.1.4.1.4. Концентрация ионов

1.1.4.1.5. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ).

1.1.4.2. Выбор режима проведения полимеразной цепной реакции

1.1.5. Регистрация результатов полимеразной цепной реакции.

1.1.6. Предупреждение ложноположительных и ложноотрицательных результатов полимеразной цепной реакции.

1.2. Современные модификации полимеразной цепной реакции.

1.3. Альтернативные ПЦР-методы амплификации нуклеиновых кислот.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Материалы.

2.1.1.1. Штаммы и ДНК микроорганизмов, эукариотичексие ДНК, использованные при разработке ПЦР тест-систем для идентификации Toxoplasma gondii, Neospora caninum.

2.1.1.2. Лабораторные животные.

2.1.1.3. Клинический и патологический материал.

2.1.1.4. Оборудование и химические реактивы.

2.1.2. Методы.:.

2.1.2.1. Полимеразная цепная реакция.

2.1.2.1.1. Выделение хромосомной ДНК из культур клеток Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Sarcocystis sp.; сыворотки крови, образцов тканей глаз, головного и спинного мозга, сердца, легких, печени, селезенки, почек, мышечной ткани.

2.1.2.1.2. Определение концентрации ДНК.

2.1.2.1.3. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПНР).

2.1.2.1.4. Условия проведения полимеразной цепной реакции.

2.1.2.1.5. Регистрация результатов полимеразной цепной реакции.

2.1.2.1.6. Предупреждение ложноположительных и ложноотрицательных результатов полимеразной цепной реакции

2.1.2.2. Определение чувствительности разработанных ПЦР тест-систем для диагностики протозойных заболеваний животных.

2.1.2.3. Разработка контрольных ПЦР-позитивных образцов ДНК нового типа.

2.1.2.4. Моделирование острой токсоплазмозной инвазии на лабораторных животных.

2.1.2.5. Проведение иммунологических методов диагностики.

2.1.2.5.1. Иммуноферментный анализ (ИФА).

2.1.2.5.2. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1. Генетическое типирование близкородственных паразитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp. методом полимеразной цепной реакции с помощью универсальных праймеров

2.2.2. Разработка ПНР тест-системы для диагностики токсоплазмоза животных.

2.2.2.1. Подбор оптимальной методики выделения ДНК из культур клеток Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Sarcocystis sp.

2.2.2.2. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции

2.2.2.3. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР-анализа.

2.2.2.4. Проверка таксономической специфичности ПЦР тест-системы для идентификации Toxoplasma gondii.

2.2.2.5. Определение чувствительности ПЦР тест-системы для идентификации Toxoplasma gondii.

2.2.2.6. Разработка программы постановки полимеразной цепной реакции для данной тест-системы в быстром режиме амплификации.

2.2.3. Разработка ПЦР тест-системы для диагностики неоспороза животных.

2.2.3.1. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции.

2.2.3.2. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР-анализа.

2.2.3.3. Проверка таксономической специфичности ПЦР тест-систем 1 и 2 для идентификации Neospora caninum.

2.2.3.4. Определение чувствительности ПЦР тест-систем 1 и 2 для идентификации Neospora caninum.

2.2.4. Разработка контрольных ПЦР позитивных образцов ДНК нового типа в ПЦР тест-системах "Токсоплазма ампли-тест", "Неоспора ампли-тест".

2.2.5. Апробирование ПЦР тест-системы "Токсоплазма ампли-тест" на клиническом и патологическом материале.

2.2.5.1. Подбор оптимальной методики выделения ДНК из сыворотки крови, образцов тканей глаз, головного и спинного мозга, сердца, легких, селезенки, почек, мышечной ткани.

2.2.5.2. Выявление возбудителя токсоплазмоза методом полимеразной цепной реакции при моделировании острой инвазии на лабораторных животных.

2.2.5.3. Выявление возбудителя токсоплазмоза методом полимеразной цепной реакции в клиническом и патологическом материале от естественно инвазированных животных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Диагностика протозойных заболеваний животных с помощью полимеразной цепной реакции"

Актуальность проблемы. Конец 90-х годов ознаменовался широким использованием новых методических подходов в диагностике заболеваний человека и животных. Среди них ведущее место заняли молекулярно-генетические методы исследования. Они позволили по новому подойти к решению ряда основных вопросов инфекционной и инвазионной патологии, и даже предложить новые подходы для контроля лечения заболеваний. Принципиальный шаг в диагностике, который уже сделан и который получает свое дальнейшее развитие как в прикладном, так и в фундаментальном аспекте связан с амплификационными методами выявления генетического материала инфекционных и инвазионных агентов, а именно методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод полимеразной цепной реакции позволяет с помощью определенной ферментативной реакции in vitro за два-три часа в миллион раз размножить специфический фрагмент ДНК любого возбудителя и на основании этого сделать заключение о возможности его нахождения в исследуемом образце.

Токсоплазмоз и неоспороз - это паразитарные заболевания животных, вызываемые близкородственными облигатными внутриклеточными простейшими Toxoplasma gondii и Neospora caninum (семейство Sarcocystidae, тип Apicomplexa), характеризующиеся повсеместным распространением, сходными клиническими признаками, общим широким кругом инвазированных животных.

Токсоплазмоз как тяжелое паразитарное заболевание животных и человека был описан в 1908 г. французскими исследователями Ch. Nicolle и L. Manceaux и в дальнейшем достаточно хорошо изучен. Неоспороз - это относительно недавно идентифицированное протозойное заболевание, которое до 1988 г. ошибочно диагностировалось как токсоплазмоз. Только в 1988 г. американские исследователи J.P. Dubey, J.L. Carpenter,

C.A. Speer et al. впервые выделили Neospora caninum из тканей собаки, инвазированной в естественных условиях, описали данное простейшее и доказали его отличие от Toxoplasma gondii.

Статистические данные показывают, что суммарный ущерб наносимый данными протозойными заболеваниями значителен (Вершинин И.И., 1996; Dubey J.P., 1999). Однако, точная оценка наносимого ущерба каждым из этих заболеваний возможна только при наличии высоко специфичных диагностических подходов. Кроме того, необходимость разработки современных методов диагностики обусловлена также значительным полиморфизмом и одновременно сходностью неспецифических клинических проявлений при токсоплазмозе и неоспорозе животных. Разнообразный характер течения болезни практически исключает возможность постановки диагноза только на основании клинической картины, в связи с чем возрастает роль лабораторных исследований, включающих паразитологические и иммунологические методы. Применяющиеся в настоящее время традиционные методы диагностики характеризуются значительной продолжительностью, трудоемкостью, большой себестоимостью, не всегда надежны и, в большинстве случаев, не позволяют провести в короткие сроки скрининговые обследования животных. В связи с этим важной задачей является разработка нового ускоренного, высокочувствительного и специфического молекулярно-генетического метода диагностики, основанного на возможности выявления в исследуемом материале специфических фрагментов нуклеиновых кислот диагностируемых организмов.

Разработка ПЦР тест-систем для диагностики токсоплазмоза и неоспороза животных является актуальной задачей, призванной дополнить традиционную диагностику точным, быстрым, недорогим методом, позволяющим в короткий срок осуществлять дифференциальную диагностику заболеваний и проводить скрининговые обследования животных.

Цель и задачи исследований. Основной целью нашего исследования было разработать диагностические ПЦР тест-системы для выявления возбудителей токсоплазмоза и неоспороза животных.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести исследование по сравнению структуры геномов близкородственных паразитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp.

2. Подобрать специфические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК Toxoplasma gondii и Neospora caninum.

3. Отработать условия проведения полимеразной цепной реакции на чистых культурах идентифицируемых возбудителей, включающие подбор методики выделения ДНК, концентраций компонентов реакционной смеси, выбор температурного режима, схемы постановки и условий регистрации результатов анализа.

4. Проверить таксономическую специфичность разработанных ПЦР тест-систем.

5. Определить чувствительность последних.

6. Апробировать диагностические ПЦР тест-системы на клиническом и патологическом материале от лабораторных животных при моделировании острой инвазии.

7. Апробировать диагностические ПЦР тест-системы на клиническом и патологическом материале от естественно зараженных животных.

Научная новизна

• Разработаны ПЦР тест-системы для диагностики токсоплазмоза и неоспороза животных.

• Подобраны методики выделения ДНК из культур клеток простейших организмов, различного клинического материала.

• Модифицирована методика выделения ДНК из различного патологического материала.

• Разработанные ПЦР тест-системы могут быть использованы для дифференциации чистых культур близкородственных простейших -возбудителей токсоплазмоза, неоспороза и саркоцистоза животных.

• Разработанная ПЦР тест-система для выявления ДНК Toxoplasma gondii "Токсоплазма ампли-тест" позволяет идентифицировать возбудителя заболевания на различных стадиях развития инвазионного процесса.

• Проведено генетическое типирование близкородственных празитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp. методом полимеразной цепной реакции с помощью универсальных праймеров с наибольшей наглядностью подтверждающее близкое родство, но не полную идентичность их геномов.

Практическая значимость

• По материалам диссертационной работы разработаны: "Инструкция по применению тест-системы для выявления ДНК Toxoplasma gondii методом полимеразной цепной реакции ("Токсоплазма ампли-тест")", "Наставление по применению тест-системы для выявления ДНК Neospora caninum методом полимеразной цепной реакции ("Неоспора ампли-тест")".

• Результаты исследований могут быть использованы в ветеринарной практике для прижизненной и посмертной диагностики токсоплазмоза и неоспороза животных.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на:

1.3-й Всероссийской научно -практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 25 -27 января 2000 г.).

2. XXVII межвузовской научно-практической конференции, посвященной дню рождения академика E.H. Павловского (Санкт-Петербург, 23-25 января 2000 г.).

3. Всероссийской междисциплинарной научно -практической конференции "Внутриутробные инфекции плода и новорожденного" (Саратов, 29-31 мая 2000 г.).

4. П-ой международной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 18-19 октября 2000 г.).

5. Сессии Российской ассоциации медицинской лабораторной диагностики (РАМЛД) и учебного центра "Ниармедик -Плюс" при НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи "Генодиагностика в инфектологии. Место ПЦР-анализа в комплексе лабораторных диагностических тестов" (Москва, 23-25 января 2001 г.).

6. Объединенных сессиях Координационного совещания по ветеринарной паразитологии центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции "Инвазионные болезни животных" РАСХН, проводившихся 26.05.00, 01.06.00,20-22.02.01 (Москва).

7. Заседаниях Ученого Совета ВИГИС (1998-2001 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ и

4 работы приняты к публикации.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Высокая специфичность, чувствительность и быстрота получения результатов разработанных ПЦР тест-систем для идентификации Toxoplasma gondii, Neospora caninum позволяют и использовать их в скрининговых обследованиях хозяйств и комплексной диагностике протозойных заболеваний животных.

• Испытания разработанной ПЦР тест-системы "Токсоплазма ампли-тест" для диагностики токсоплазмоза животных показали ее большую чувствительность и эффективность по сравнению с иммунологическими тестами.

• Разработанная ПЦР тест-система "Токсоплазма ампли-тест" позволяет установить локализацию Toxoplasma gondii в сыворотке крови и органах животных на различных стадиях развития инвазионного процесса.

• Генотипирование близкородственных паразитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp. выявило близкое родство, но не полную идентичность анализируемых геномов.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 150 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы включает 130 источников, в том числе 66 отечественных и 64 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами, 3 диаграммами и 19 рису нками.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Кузнецова, Эльвира Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Разработаны ПЦР тест-системы для выявления ДНК возбудителей токсоплазмоза и неоспороза животных, обладающие высокой специфичностью и позволяющие выявлять от 1-10 клеток в анализируемом образце.

2. Проведено генотипирование близкородственных паразитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp., показавшее близкое родство, но не полную идентичность анализируемых геномов.

3. Апробирование ПЦР тест-системы для идентификации Toxoplasma gondii на модели острого токсоплазмоза лабораторных животных показало возможность прижизненной диагностики в сыворотке крови в 68,2% случаев, при посмертной диагностике при исследовании тканей сердца - в 77,3%, легких - 72,7%, печени - 68,2%, почек - 59%, селезенки - 50%, головного мозга - 45,5%, глаз - 40,9%. Параллельно проводимые сравнительные иммунологические тесты (ИФА) не позволяли диагностировать заболевание на данных стадиях развития инвазионного процесса.

4. Апробирование ПЦР тест-системы для идентификации Toxoplasma gondii при хроническом токсоплазмозе на клиническом и патологическом материале от естественно инвазированных животных показало возможность прижизненной диагностики при исследовании сыворотки крови в 16,7% случаев, при посмертной - при исследовании тканей сердца - 77,8%, легких - 57,4%, печени - 83,3%, почек - 22,2%, селезенки - 37%, головного мозга - 88,8%, глаз - 66,7%.

5. Эффективность диагностики токсоплазмоза с помощью разработанной ПЦР тест-системы была выше в 1-2 раза, чем при применении широко используемого иммунологического метода -реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Сравнительное выявление Toxoplasma gondii в сыворотке крови, органах и тканях естественно инвазированных животных составило: 12,5% методом ПЦР (0% РНИФ) у крупного рогатого скота, 17,2% (11,4%) -абортированных плодов крупного рогатого скота, 38,6% (30%) -абортированных плодов свиней, 40% (20%) - трупов новорожденных поросят, 60,9% (52,2%) - кроликов.

6. Высокая специфичность, чувствительность и быстрота получения результатов разработанных ПЦР тест-систем позволяют использовать их в скрининговых обследованиях хозяйств и комплексной диагностике протозойных заболеваний животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

По материалам диссертационной работы разработаны:

• "Инструкция по применению тест-системы для выявления ДНК Toxoplasma gondii методом полимеразной цепной реакции ("Токсоплазма ампли-тест")". Одобрена Бюро Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 28 сентября 2000 г., протокол №4.

• "Наставление по применению тест-системы для выявления ДНК Neospora caninum методом полимеразной цепной реакции ("Неоспора ампли-тест")". Одобрено Бюро Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 26 января 2001 г., протокол №1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диагностические специфические ПЦР тест-системы для выявления возбудителей инфекционных и инвазионных заболеваний уже широко используются в медицинской практике. Однако в ветеринарной медицине молекулярно-генетические методы еще не заняли соответствующего места в комплексной диагностике заболеваний животных. Целью наших исследований явилась разработка ПЦР тест-систем для диагностики токсоплазмоза и неоспороза животных, вызываемых близкородственными паразитическими простейшими.

К моменту начала наших исследований не было единого мнения о существовании Neospora caninum как самостоятельного вида. Поэтому, для получения полной информации о степени филогенетического родства близкородственных паразитических простейших Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp. мы предприняли попытку изучить их геномный полиморфизм с помощью генетического типирования методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами. Исследование геномного полиморфизма этим способом основано на амплификации полиморфных ДНК-фрагментов благодаря специфической селекции сайтов отжига праймеров на нуклеотидной последовательности исследуемого объекта. Даже небольшие отличия в распределении

W U 1 сайтов связывания позволяют выявить геномный полиморфизм.

В своей работе мы использовали четыре универсальных праймера с произвольной нуклеотидной последовательностью размером 10-21 пары нуклеотидов способных гибридизоваться со всеми гомологичными сайтами в исследуемой геномной ДНК.

Для выявления геномного полиморфизма данных близкородственных паразитических простейших проводили подбор параметров, которые могли влиять на эффективность ПЦР-дактилоскопии: концентрацию Mg2+, ДНК-мишени и праймеров, изучали влияние различных концентраций Taq-полимеразы на профили ампликонов. После определения оптимальных параметров постановки полимеразной цепной реакции для каждого из использованных праймеров мы получили ряд ампликонов различной длины с молекулярными массами от 200 до 1500 пар нуклеотидов, при этом спектр ампликонов менялся для каждой комбинации праймер-ДНК, но был характерен для каждого возбудителя.

В результате при анализе продуктов амплификации геномных ДНК трех близкородственных простейших, полученных в ПЦР с универсальным праймером Short 1 (размером 10 пар нуклеотидов), удалось получить спектры ампликонов, с наибольшей наглядностью подтверждающие близкое родство, но не полную идентичность сравниваемых геномов. В связи с этим, обнаружение генотипических различий между Toxoplasma gondii и Neospora caninum, послужило обоснованием для разработки самостоятельных, то есть отдельных для каждого вида, ПЦР тест-систем для дифференциальной диагностики заболеваний животных, вызываемых указанными возбудителями.

Разработка ПЦР тест-системы "Токсоплазма ампли-тест" для идентификации возбудителя токсоплазмоза проводилась с использованием в качестве модели культуры Toxoplasma gondii штамм RH. При разработке были использованы специфические олигонуклеотидные праймеры, являющиеся участками гена поверхностного антигена Р30 Toxoplasma gondii, позволяющие амплифицировать фрагмент ДНК данного простейшего размером 276 пар нуклеотидов. Олигонуклеотидные последовательности специфических праймеров для идентификации Toxoplasma gondii заимствованы из работы С. Aznar, L. Mousson (1993). Выбранные нами праймеры были проанализированы на наличие гомологии с полностью секвенированными геномами 71 вида микроорганизмов и частично секвенированными фрагментами генома Neospora caninum. Гомологии не обнаружено.

Основная работа состояла в отработке условий проведения полимеразной цепной реакции, которая включала подбор оптимальных концентраций компонентов реакционной смеси, а также разработку оптимальной структуры программы амплификации, обеспечивающих высокую (от 10-100 клеток в анализируемом образце) чувствительность и специфичность (отсутствие перекрестных реакций) разрабатываемых ПЦР тест-систем.

На первом этапе для последующего анализа в полимеразной цепной реакции мы проводили подбор оптимальных условий выделения ДНК из культуры клеток Toxoplasma gondii, Neospora caninum и Sarcocystis sp., различного клинического и патологического материала. Выбор был остановлен на нескольких методиках подготовки образцов. В том числе нами модифицирован метод выделения ДНК из различного патологического материала, позволяющий достаточно легко провести концентрирование в малом объеме исследуемой ДНК-матрицы в количестве, необходимом для проведения полимеразной цепной реакции, и удаления ингибиторов Taq-полимеразы.

После проведения трудоемкой работы по оптимизации условий постановки полимеразной цепной реакции, включающей подбор методики выделения ДНК, концентраций компонентов реакционной смеси, выбор температурного режима, схемы постановки и условий регистрации результатов анализа, мы провели проверку таксономической специфичности разработанной ПЦР тест-системы для диагностики токсоплазмоза животных. Для этого использовали ДНК

18 различных видов организмов (в том числе ДНК трех близкородственных простейших организмов), а также эукариотические ДНК человека и 10 видов животных. В результате проведения полимеразной цепной реакции и последующего электрофореза был зафиксирован синтез ампликона размером 276 пар нуклеотидов только в присутствии ДНК Toxoplasma gondii.

Следующим этапом нашей работы было определение в отработанных условиях порога чувствительности, то есть минимальной концентрации ДНК или минимального количества клеток возбудителя в анализируемой пробе, которые данная тест-система позволяет идентифицировать. Чувствительность ПЦР тест-системы "Токсоплазма ампли-тест" составила от 10 фг ДНК или от 10 клеток Toxoplasma gondii в анализируемом образце.

Для удобства использования данной тест-системы, а именно для быстроты получения результатов исследований (особенно это актуально при большом количестве анализируемых проб), нами была разработана программы постановки ПЦР в быстром режиме амплификации (65 мин, в обычном режиме 130 мин).

Разработку ПЦР тест-системы для диагностики неоспороза животных мы проводили по тому же принципу, как описано выше для тест-системы "Токсоплазма ампли-тест". При разработке ПЦР тест-системы 1 с использованием в качестве модели культуры Neospora caninum, штамм NC-1 мы столкнулись с рядом трудностей. При разработке были использованы специфические олигонуклеотидные праймеры, являющиеся участками ДНК внутренней транскрибируемой спейсерной области 1 Neospora caninum, размером 279 пар нуклеотидов (Holmdahl O.J.M., Mattsson J.G., 1996). При проведении проверки специфичности разработанной тест-системы были отмечены ложноположительные результаты с ДНК других видов, а именно ДНК кошки, собаки, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Proteus vulgaris и Staphylococcus aureus. Чувствительность при этом составила от 1 нг ДНК или от 1000000 клеток Neospora caninum в анализируемом образце.

В связи с этим, разработанную ПЦР тест-систему 1 из-за возможных ложноположительных результатов реакции с ДНК кошки, собаки, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Proteus vulgaris и Staphylococcus aureus, а также низкой чувствительности (1000000 клеток в анализируемом образце) нельзя рекомендовать для диагностики неоспороза животных. Однако ее можно использовать для дифференциации чистых культур близкородственных простейших -возбудителей неоспороза, токсоплазмоза и саркоцистоза животных.

В последствии для диагностики неоспороза на основе праймеров, позволяющих амплифицировать только фрагмент ДНК Neospora caninum области Nc5, размером 337 пар нуклеотидов (Muller N. et al., 1996) мы разработали ПЦР тест-систему "Неоспора ампли-тест". ПЦР тест-система "Неоспора амплитест" обладает высокой специфичностью и чувствительностью (от 1 фг ДНК или 1 клетки Neospora caninum в анализируемом образце), и поэтому ее можно рекомендовать для практического использования в целях диагностики неоспороза.

При использовании разработанных диагностических тест-систем для диагностики заболеваний для контроля прохождения полимеразной цепной реакции предложено использовать контрольный ПЦР-позитивный образец ДНК нового типа. Ранее используемый контрольный ПЦР-позитивный образец - полный геном идентифицируемого возбудителя, мог подвергнуться деградации под воздействием каких либо факторов (например: при неправильном хранении), что может приводить к ложноотрицательным результатам реакции. Контрольный ПЦР-позитивный образец ДНК нового типа представляет собой клонированный в плазмиде фрагмент ДНК идентифицируемого возбудителя, который должен быть выявлен при постановке диагностического теста. Он более устойчив к воздействию каких либо деградирующих факторов, а так же его гораздо легче наработать в достаточном количестве для разработанной тест-системы. При этом отрицательный результат полимеразной цепной реакции, полученный при использовании такого контрольного образца, точно указывает на ингибирование реакции за счет каких либо компонентов, либо нарушения условий постановки реакции, а не на отсутствие возбудителя в исследуемом материале.

Следующим этапом после проведения разработки ПНР тест-системы на чистой культуре идентифицируемого возбудителя заболевания перед внедрением диагностического теста в ветеринарную практику необходимо апробировать данную тест-систему на клиническом и патологическом материале. Для выполнения данной задачи проведено апробирование ПЦР тест-системы "Токсоплазма ампли-тест" в различном клиническом и патологическом материале на модели острого токсоплазмоза лабораторных животных. Моделирование токсоплазмоза проводили по стандартной методике. Испытания разработанной ПЦР тест-системы показали ее большую чувствительность и эффективность по сравнению с иммунологическими тестами (выявление специфических антител классов IgG и IgM к антигенам Toxoplasma gondii с помощью иммуноферментного анализа). При прижизненной диагностике острого токсоплазмоза методом ПЦР исследования сыворотки крови дают положительные результаты в 68,2% случаев, при посмертной положительные результаты получены при исследовании тканей сердца - 77,3%, легких -12,1%, печени - 68,2%), почек - 59%, селезенки - 50%, головного мозга - 45,5%, глаз - 40,9%.

При апробировании данной диагностической ПЦР тест-системы "Токсоплазма ампли-тест" при хроническом токсоплазмозе на клиническом и патологическом материале от естественно инвазированных животных показало, что эффективность ее в 1-2 раза выше, чем у широко применяемого иммунологического метода -реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Выявление Toxoplasma gondii в сыворотке крови, органах и тканях естественно инвазированных животных составило: 12,5% методом ПЦР (0% РНИФ) у крупного рогатого скота, 17,2% (11,4%) - абортированных плодов крупного рогатого скота, 38,6% (30%) - абортированных плодов свиней, 40% (20%) - трупов новорожденных поросят, 60,9% (52,2%) -кроликов.

При прижизненной диагностике хронического токсоплазмоза методом ПЦР исследования сыворотки крови показали положительные результаты в 16,7% случаев, при посмертной - при исследовании тканей сердца - 77,8%, легких - 57,4%, печени - 83,3%, почек - 22,2%, селезенки - 37%, головного мозга - 88,8%), глаз - 66,7%.

Таким образом, нами разработаны ПЦР тест-системы для диагностики токсоплазмоза и неоспороза животных, призванные дополнить традиционную диагностику точным, быстрым, недорогим методом, позволяющим в короткий срок осуществлять дифференциальную диагностику заболеваний и проводить скрининговые обследования животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецова, Эльвира Алексеевна, Москва

1. Агол В.И., Богданов A.A., Гвоздев В.А., Грагеров А.И., Колчинский A.M., Мирзабеков А.Д., Никифоров В.Г. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот. Учеб. для биол. спец. вузов /Под ред. A.C. Спирина. М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

2. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний методом ПЦР //Молекулярная генетика. 1993. - №4. -С.3-8.

3. Астафьев Б.А., Яроцкий Л.С., Лебедева М.Н. Экспериментальные модели паразитозов в биологии и медицине. М.: Наука. - 1989. -С. 162-166.

4. Бадакшеева А.Г., Кнорре Д.Г. Олиго- и полинуклеотидные зонды. Метод молекулярной гибридизации //Молекулярная биология. 1991. -№2. - С.309-324.

5. Бейер Т.В., Лысенко А .Я. Токсоплазмоз: факты и домыслы. Сообщение 1: биология и жизненный цикл возбудителя //Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1984. - №2. - С. 57-63.

6. Безруков В.М., Шипулин Г.А., Федоров H.A., Шобухова Т.С., Филимонова И.И., Постникова Т.М., Блоха В.В., Эльберт Е.В. Полимеразная цепная реакция в диагностике бактериальных инфекций //Клиническая лабораторная диагностика. 1996. - №1. - С. 20-23.

7. Белохвостов A.C. Полимеразная цепная реакция, принципы, традиционные методики и нововведения //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1995. - №2. - С. 21-26.

8. Булат С.А., Кобаев O.K., Мироненко Н.В., Ибатуллин Ф.М., Лучкина Л.А., Суслов A.B. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов //Генетика. 1992. - том 28. - №5. - С. 19-28.

9. Бусол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. Тест-система для выявления ВЛКРС полимеразной цепной реакцией //Ветеринария. 1999. - №6. - С. 27-30.

10. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция //Молекулярная биология. 1991. - том 25.- №4. - С. 926-936.

11. Вершинин И.И. Кокцидиозы животных и их дифференциальная диагностика. Учебное пособие. Екатеринбург, Уральская ГСХА. -1996.-264 с.

12. Галузо И.Г. Токсоплазмоз животных. Доклад научно-техническому совету МСХ СССР. Алма-Ата, 1965.- С. 3-35.

13. Галузо И.Г., Коновалова С.И. Жизненный цикл токсоплазм. Алма-Ата: Наука. 1974.- С. 3-35.

14. Гинцбург A.JL, Романова Ю.М. Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний //Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - №2. - С. 35-39.

15. Градковская Н.В., Грачева Л.И., Захарова H.A. Использование иммуноферментного анализа в диагностике токсоплазмоза //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1985. - №4. -С. 69-72.

16. Грачева Л.И., Захарова H.A., Шаханина К.Л. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1980. - №6. -С. 69-72.

17. Грачева Л.И., Мороз Б.В., Градковская Н.В., Трякина И.П., Михеева М.Н. Современные методы серологической диагностики токсоплазмоза //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. - №5. - С. 58-61.

18. Гребенникова Т.В., Грабовецкий В.В., Кальнов С.Л., Непоклонов Е.А. Дифференциальная диагностика микобактерий методом полимеразной цепной реакции //Ветеринария. 1999. - №3. -С. 17-20.

19. Гущин А.Е., Халилов Э.М. Диагностика вирусных гепатитов В и С //Сборник тезисов докладов 1-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" /Под ред. Акад. РАМН Ю.М. Лопухина. Сочи, 1996. - С. 60-66.

20. Дубинина И.Г., Щербо С.Н., Макаров В.Б. Метод полимеразной цепной реакции в лабораторной практике //Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - №7. - С. 4-6.

21. Евстигнеева Н.К., Марке лова М.Л. Цепная полимеразная реакция //Вопросы вирусологии. 1991. - том 36. - №2. - С. 175-176.

22. Клинчева С.Х. Конструирование тест-систем для дифференциальной диагностики герпесвирусной инфекции на основе полимеразной цепной реакции: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1987. - 25 с.

23. Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н., Шипулин Г.А. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных //Ветеринария. 2000. - №3. - С. 59-63.

24. Крылов М.В. Возбудители протозойных болезней домашних животных и человека (в двух томах). Санкт-Петербург, Зоологический институт РАН. - 1994. - 662 с.

25. Крылов М.В. Определитель паразитических простейших (человека, домашних животных и сельскохозяйственных растений). -Санкт-Петербург, Зоологический институт РАН. 1996. - 605 с.

26. Лю Чжун-Фу Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для диагностики лептоспирозов в очагах тропического пояса: Дис. . канд. мед. наук. М., 1996.- 105 с.

27. Методические рекомендациям по изучению и разработке мер борьбы с протозойными болезнями животных /Утверждены Академиком-секретарем Отделения ветеринарии академиком ВАСХНИЛ В.П. Шишковым. М., 1984. - 30 с.

28. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции /Под ред. Покровского В.В., Федорова Н.А., Шипулина Г.А. и др. ГКСЭНРФ. М., 1995. - 7 с.

29. Михайлов М.И., Попова О.В. Метод полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике гепатитов В и С //Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - №7. - С. 9-12.

30. Морозов Е.Н. Генодиагностика малярии: роль препарата крови "толстая капля": Автореф. дис. . канд. мед. наук. -М., 1999.- 25 с.

31. Нестеренко Л.Н., Шагинян И.А., Гришина Т.Д., Голышевская

32. Обухов И.Л. Методы прямого обнаружения хламидий при орнитозе //Ветеринария. 1998. - №9.- С. 22-24.

33. Обухов И.Л., Яковенко М.В. Разработка праймеров для детекции хламидий //Ветеринария. 2000. - №5. - С. 22-23.

34. Панин А.Н., Обухов И.Л., Шипулин Г.А., Груздев К.Н. Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции //Ветеринария. 1997. - №7. -С. 19-21.

35. Победимская Д.Д. Применение полимеразной цепной реакции для молекулярной диагностики гемоглобиннопатий: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1994. - 20 с.

36. Проблема токсоплазмоза /Под ред. Д.Н. Засухина; АМН СССР. -М.: Медицина, 1980. 312 с.

37. Прохватилова Л.Б., Ломакин А.И., Колосов С.Н., Дрыгин В.В., Рыбаков С.С., Гусев А.А. Диагностика лейкоза КРС методом полимеразной цепной реакции //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 1998.- №5.- С. 65-68.

38. Романова Е.А., Семенова С.К., Бенедиктов И.И., Рысков А.П. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации ДНК гельминтов из родов Trichinella, Fasciola, Echinococcus, Nematodirus, Taenia //Паразитология. 1997. - том 31. - №1. - С.53-65.

39. Рыбалкин И.Н., Мухамедова Н.М., Власик Т.Н., Ченчик A.A. Новая технология горячего старта в полимеразной цепной реакции //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1996. - №2. -С. 238-240.

40. Сайки Р., Гиленстен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция //Анализ генома. Методы. М.: Мир. - 1990. - С. 176-190.

41. Самсонова А.П. Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для изучения гостальной персистенции лептоспир и диагностики лептоспирозов: Автореф. дис. . канд. мед. наук.-М., 1994.-20 с.

42. Соловьева C.B. Разработка и использование амплификационных тест-систем для выявления возбудителей урогенитальных микоплазмозов: Дис. . канд. биол. наук. -М., 1997. 167 с.

43. Токсоплазмоз человека /Под ред. А.Г. Пап, Д.Н. Засухина. -М.: Медицина, 1974. 192 с.

44. Третяк А.П., Рысков А.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б., Струнников В.А. Геномная дактилоскопия Bombyx mori L.: выявление генотипической изменчивости партеногенетических клонов //Генетика. 1992. - том 28. - №5. - С.171-174.

45. Третяк А.П., Рысков А.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б., Струнников В.А. Геномная дактилоскопия Bombyx morí L.: проблема идентификации особей, семей и пород //Генетика. 1992.- том 28. - №2. - С. 52-62.

46. Федоров H.A., Суханов Ю.С., Асади Мобархан А.Х., Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Методическое пособие для начинающих /Принципы и практические рекомендации для ее постановки с целью детекции микроорганизмов. - 1996. - 33с.

47. Чураков A.A. Обнаружение трихомонад и хламидий в клинических образцах при помощи полимеразной цепной реакции: Дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1996. - 101 с.

48. Шаров А.Н., Седов В.А. Тест-системы ПЦР при туберкулезе //Ветеринария. 1998. - №3. - С. 20-22.

49. Шагинян И.А. Генный полиморфизм в эпидемиологическом анализе бактериальных инфекций: Автореф. дис. . доктора мед. наук. -М., 1995.-48 с.

50. Шагинян И.А., Гинцбург A.JL ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов //Генетика. 1995. - 31. - №5-С. 600-610.

51. Шаталин К.Ю., Звонарев А.Ю. Биотехнология в разработке методов и средств диагностики вирусных инфекций //Вопросы вирусологии. 1995. - том 40.- №3. - С. 98-100.

52. Щербо С.Н., Макаров В.Б. ПЦР-диагностика заболеваний, передаваемых половым путем //Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - №2. - С. 21-24.

53. Aznar С., Mousson L. Diagnostic rapide de la toxoplasmose par PCR HU Eurobiologiste.- 1993. Tome XXVII. - №204. - P. 105-109.

54. Barnes W.M. PCR amplification of up 35-kb DNA with high fidelity and high yield from bacteriaphage templates //Proc. Natl. Acad. Sei.- 1994. -Vol. 91.-P. 2216-2220.

55. Bell J. The polymerase chain reaction //J. Immunology.- 1989. -Vol. 10.-№10.-P. 351-355.

56. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids //J. Clin. Microbiology- 1989. -Vol. 28. P. 495-503.

57. Boothroyd J.C., Burg J.L., Kasper L.H. The Board of Trustees of the Leeland Stanford Junior Univrrsity. Diagnostic genes for toxoplasmosis /Пат. 5629414 США, МПК6 C07H 21/00, C12N 1/20, 14.01.94. -№ 182673.-1994.

58. Bootman J.S., Kitchin P.A. An international collaborative study to assess a set of reference reagents for HIV-l PCR //J. Virol. Methods.- 1992. -Vol. 37.-P. 23-42.

59. Brown D.M., Schell P. The reaction of hydroxylamine with cytosine and related compounds //J. Med. Biol.- 1961. Vol. 3. - P. 709-710.

60. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers //Biotechnology.- 1991. Vol. 9. - P. 553-557.

61. Chien A., Edgar D.B., Trela J.M. Deoxyribonucleic Acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus //J. Bact.- 1976. -Vol. 127.-№3. P. 1550-1557.

62. Cimino G.D., Metchette K.C., Isaacs S.T. et al. More false-positive problems //J. Nature.- 1990. Vol. 347. - P. 340-341.

63. Cimino G.D., Metchette K.C., Tessman J.W. et al. Post-PCR sterilization a method to control carryover contamination for the polymerase chain reaction //Nucleic Acids Res.- 1991. Vol.19. - P. 99-107.

64. Derouin F., Garin Y.J.F. Toxoplasma gondii: blood and tissue kinetics during acute and chronic infections in mice //Exp. Parasitology.- 1991. -Vol. 73.-№4.-P. 460-468.

65. Dubey J.P., Hattel A.L., Lindsay D.S., Tropper M.J. Neonatal Neospora caninum infection in dogs: Isolation of the causative agent and experimental transmission //J. Am. Vet. Med. Assoc.- 1988. Vol. 193. -P. 1259-1263.

66. Dubey J.P., Carpenter J.L., Speer C.A., Topper M.J., Uggla A. Newly recognized fatal protozoan disease of dogs //J. Am. Vet. Med. Assoc.- 1988. -Vol. 192.-P. 1269-1285.

67. Dubey J.P. Strategies to reduce transmission of Toxoplasma gondii to animals and humans //Vet. Parasitology.- 1996. Vol. 64. - P. 65-70.

68. Dubey J.P. Recent advances in Neospora and neosporosis //Vet. Parasitology.- 1999. Vol. 84. - P. 349-367.

69. Duck P., Alvarado-Urbina G., Burdick B., Collier B. Probe amplifier system based on chimeric cyclic oligonucleotides //Biotechniques.- 1990. -Vol.9. №2. -P. 142-147.

70. Dwyer D.E., Saksena N. Failure of ultra-violet irradiation and autoclaving to eliminate PCR contamination //J. Mol. Cell. Probes.- 1991. -Vol. 6.-P. 87-88.

71. Erlich H.A. PCR technology: Principles and Applications for Amplification. New York: Stockton Press. - 1989. - 30 p.

72. Fox J.C., Ait-Khalid M., Webster A. et al. Eleminating PCR contamination: is UV irradiation the answer? //J. Virol. Methods.- 1991. -Vol. 33.-P. 375-383.

73. Freundt E.A., Whitcomb R.F. Cultivation and indentification of mycoplasmas //Yale J. Biol. Med.- 1983. Vol. 56. - № 5. - P. 819-823.

74. Goelz S.E., Hemilton S.R., Uogelstein B. Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue //Biochem. Biophys. Res. Comm.- 1985.-Vol. 130. -№1.- P. 118-126.

75. Griffin A.M., Griffin H.G. PCR Technology. Current Innovations. -Boca Ration.- 1994.- P. 140.

76. Holmdahl O.J.M., Mattsson J.G. Rapid and sensitive indentification of Neospora caninum by vitro amplification of the internal transcribed spacer 1 //J. Parasitology.- 1996. Vol. 112. - P. 117-182.

77. Integrated DNA technology. In: Product insert. Integrated DNA technology. - Coralville, Iowa. - 1992.

78. Isaacs S.T., Tessman J.W., Metchette K.C. et al. Post-PCR sterilization: development and application to an HIV-1 diagnostic assay //J. Nucleic Acids Res.- 1991. Vol. 19.-P. 109-116.

79. Itakura K., Rossi J.J., Wallace R.B. Methods of oligonucleotide hybridization //Ann. Rev. Biochem.- 1984. Vol. 53. - P. 323-356.

80. Ivinson A.J., Taylor G.R. PCR in genetic diagnosis. A Practical Approach (ed. M.J. Mcpherson). Oxford University Press. - Oxford. -N.Y. -Tokyo.-1991.-P. 15-27.

81. Jamra Ligia M. Ferreira, Vieira Monica de Paula L. Isolation of Toxoplasma gondii from perineal exudates and organs of mice with experimental infection //Rev. Inst. med. trop. Sao Paulo.- 1991. Vol. 33. -№6.-P. 435-441.

82. Kitchin P.A., Szotyori Z., Fromholc C. et al. Avoidance of false positives //Nature.- 1990. Vol. 344. - P. 201.

83. Kitvits Т., Van Gemen В., Van Strijpetal D. NASBA TM isothermal enzymatic in vitro nucleic acids amplification optimized for diagnosis of HIV-l infection //J. Virol Methods- 1991. Vol. 35. - P. 273-286.

84. Kogan S., Doherty M., Gitschier J. An improved method for prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNA sequences //New Engl. Med. J.- 1987. Vol. 316. - P. 985-990.

85. Kwok S., Higuchi R. Avoiding false positices with PCR //Nature.-1989. Vol. 339. -№6221.-P. 237-238.

86. Landergren U., Kaiser R., Caskey C.F., Hood L. DNA diagnostics-molecular techniques and automation //Science.- 1988. Vol. 242. -№4876. - P. 229-237.

87. Lankester, 1882 /В книге: Крылов M.B. Определитель паразитических простейших (человека, домашних животных и сельскохозяйственных растений). Санкт-Петербург, Зоологический институт РАН. - 1996. - 605 с.

88. Lee H. Infection disease testing by ligase chain reaction //Clin. Chem.- 1993. Vol. 30. - P. 729-730.

89. Lindsay D.S., Upton S.J., Dubey J.P. A structural study of Neospora caninum oocyst //Int. J. Parasitology.- 1999. Vol. 29. - №10. - P. 15211523.

90. Lizardi P.M., Kramer F.R. Exponential amplification of nucleic acids: new diagnostics using DNA polymerase and RNA replicases //Trends in Biotechnol.- 1991. -Vol. 9. P. 53-59.

91. Lo Y.W., Mehael Z., Fleming K.A. False positive results and the polymerase chain reaction //Lancet.- 1990. Vol. 1. - P. 679.

92. Longo M.C., Berninger M.S., Hartley J.L. Use of uracil DNA Glycosylase to control-over contamination in polymerase chain reaction //J. Gene.- 1990. Vol. 93. - P. 125-128.

93. Maniatis T., Fritsch E.E., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory Manual //Cold Spring Harbor Laboratory 1982. - 480p.

94. McManus D.P., Thompsom R.C.A., Lymbery A.J. Comment on the Status of Echinococcus granulosus in UK //Parasitology Today.- 1989. -Vol. 5.-№11.-P. 365-367.

95. Mullis K.B., Faloona F.A., Scharf S. et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro the polymerase chain reaction //J. Mol. Biol.- 1986. Vol. 51. - P. 263-273.

96. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction //Methods Enzymol.- 1987. Vol. 155.- part F. P. 335-350.

97. Muller N., Zimmermann V., Hentrich B., Gottstein B. Diagnosis of Neospora caninum and Toxoplasma gondii infection by PCR and DNA hybridization immunoassay //J. of Clin. Microbiology.- 1996. Vol. 34. -№11.-P. 2850-2852.

98. Nicolle C., Manceaux L. Sur une infection a corp de Leishman (ou organisms voisins) du gondii //C. R. Acad. Sei.- 1908. №147. - P. 763-766.

99. Pingoud A. Molecular diagnostics of cancer /Eds C. Weagener, S. Neumann. Berlin, 1993.-P. 1-16.

100. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F. et al. Enzymatic amplification of B-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickel cell anemia //Science.- 1985.- Vol. 230. №4732. - P. 1350-1354.

101. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase //Science.-1988. Vol. 239. - №4839. - P. 487-491.

102. Sarkar G., Sommer S.S. Shedding light on PCR contamination //J. Nature.- 1990. Vol. 343. - P. 27.

103. Sarkar G., Sommer S.S. More light on PCR contamination //J. Nature.- 1990. Vol. 347. - P. 340-341.

104. Sarkar G., Sommer S.S. Parameters affecting susceptibility of PCR contamination to UV inactivation //J. Bio. Techniques.- 1991. Vol. 10. -P. 590-594.

105. Schochetman G., Ou C.Y., Jones W.K. Polymerase chain reaction //J. Infect. Dis. 1988. - Vol. 158. - P. 1154-1157.

106. Speer C.A., Dubey J.P., McAllister M.M., Blixt J.A. Comparative ultrastructure of tachyzoites, bradyzoites, and tissue cysts of Neospora caninum and Toxoplasma gondii //Int. J. Parasitology.- 1999. Vol. 29. -№10.-P. 1509-1519.

107. Taylor G.R. Polymerase chain reaction: basic principles and automation //PCR. A Practical Approach (ed. M.J. Mcpherson, P. Quirke, G.R. Taylor). Oxford University Press. Oxford. N.Y. - Tokyo.- 1991. -P. 1-14.

108. Tindall K.R., Kunkel T.A. Fidelity of DNA synthesis by Thermus aquaticus DNA polymerase //Biochemistry- 1988. Vol. 27. - №16. -P. 6008-6013.

109. Turcekova L., Snabel V., Dubinsky P. Genetic variants of Echinococcus granulosus in Slovakia recorded by random amplification of polymorphic DNA //Helminthologia.- 1998. Vol. 35. - №4. - P. 179-183.

110. Warner J.M., Oliver J.D. Randomly amplified polymorphic DNA analysis of starved and viable but nonculturable vibrio vulnificus cells. //Applied and Environmenntal Microbiology- 1998. Vol. 64. - №8. -P. 3025-3028.