Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка метода верификации диагноза бластоцистоза при диарее неясной этиологии

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Разработка метода верификации диагноза бластоцистоза при диарее неясной этиологии"

005060782

ТИХОНОВА Дина Валерьевна

На правах рукописи

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЕРИФИКАЦИИ ДИАГНОЗА БЛАСТОЦИСТОЗА ПРИ ДИАРЕЕ НЕЯСНОЙ ЭТИОЛОГИИ

03.02.11 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 0 МАЯ 2013

Москва-2013

005060782

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент Морозов Евгений Николаевич Официальные оппоненты:

Тумольская Нелли Игнатьевна доктор медицинских наук, профессор

Научно-исследовательский Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая лабораторией разработки методов лечения паразитарных болезней

Козлов Сергей Сергеевич доктор медицинских наук, профессор

ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, профессор кафедры инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и тропических заболеваний)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки Российской Федерации

диссертационного совета Д208.040.12 ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (119991, г. Москва, ул. Трубецкая д. 8, стр. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в ГНЦМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (117997, г. Москва, Нахимовский пр-т, д. 49)

Автореферат разослан « ¡/-^^-Р 2013 года

Защита состоится

июня 2013 года в

¡асов на заседании

Ученый секретарь - л

Диссертационного совета лСа^у Фролова Александра Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Blastocystis hominis — полиморфный паразит кишечника человека и животных. Он вызывает интерес не только с точки зрения дифференциальной диагностики простейших кишечника, но и с точки зрения недостаточно установленной патогенной роли [Сергиев В.П. и др., 2008; Cekin А.Н. et al. 2012]. Длительное время считалось, что бластоцисты принадлежат к дрожжам, в дальнейшем на основании данных электронной микроскопии в 1967 году С.Н. Zierdt отнес их к типу Protozoa и получил первые указания на возможную этиологическую роль этих простейших в возникновении кишечной патологии у лиц с иммунной недостаточностью [Garavelli P.L., 1996].

В последние годы выявлены высокие показатели зараженности В. hominis у различных групп населения [Державина Т.Ю. и др., 2011]. На протяжении нескольких лет ведется изучение биологии паразита [Garavelli P.L. et al., 1996; Tan K.S.W, et al., 2002]. В настоящее время имеется достаточное число эпидемиологических и клинических материалов, а также лабораторных данных, подтверждающих как потенциальную, так и реальную этиологическую роль В. hominis в патологии человека, развивающейся на фоне снижения резистентности макроорганизма [de Silva et al. 1997; Dagci H. et al. 2002; Ласкин A.B. 2006]. По мнению Г.Г. Онищенко в группе «другие протозойные болезни» наиболее часто встречаемым паразитозом является бластоцистоз. На большинстве территорий Российской Федерации не проводится расшифровка острых кишечных инфекций неясной этиологии, которые могут быть вызваны инвазией бластоцист [Онищенко Г.Г., 2006].

В литературе имеются данные о наличии кожных высыпаний у больных при выявлении у них кишечных паразитов [Hameed D.M et al., 2011]. R. Gupta и К. Parsi [2006] рекомендуют всем больным хронической идиопатической крапивницей, имеющим в анамнезе эпизоды диареи, проводить культуральное или микроскопическое исследования кала с целью возможного выявления бластоцист, как фактора, утяжеляющего течение основного заболевания.

Существуют работы, подтверждающие возможную роль В. hominis в этиологии синдрома раздраженного кишечника (СРК). Однако только присутствие В. hominis в кишечнике у лиц с СРК не ассоциируется с его повреждением, что подтверждено эндоскопическим обследованием этих пациентов. Поэтому все большее внимание исследователей привлекает определение факторов, которые могут быть связаны с клиническим проявлением болезни у носителей бластоцист [Yakoob J. et al. 2004; 2010]. По данным разных источников при исследовании фекалий больных ВИЧ/СПИДом микроскопическим методом в 45,6% обнаруживаются кишечные паразиты, в том числе В. hominis - от 2,2% до 2,5%, что указывает на необходимость паразитологического исследования фекалий у больных СПИД-ом и наблюдения за консистенцией стула [Kumiawan А. et al. 2009; Saksirisampant W. et al. 2009].

В постановке диагноза бластоцистоза ведущую роль играет обнаружение бластоцист в кале микроскопическим и культуральным методом. Однако диагностика бластоцистоза затруднена обилием различных морфологических форм бластоцист [Stensvold R. et al. 2006; Смирнова М.О. и др. 2010]. В качестве альтернативных и наиболее перспективных методов обнаружения В. hominis рассматриваются амплификационные методы, в частности, полимеразная цепная реакция [Stensvold R. et al. 2006; Parkar U. et al. 2007].

Для детекции возбудителей таких паразитарных болезней как малярия, лейшманиозы, токсоплазмоз, дирофиляриоз активно применяют ПЦР, однако, для определения бластоцист в клиническом материале (фекалии) на территории РФ не существует отечественных тест-систем. Приведенные литературные данные свидетельствуют о том, что изучение проблемы бластоцистоза и разработки методов лечения этой инвазии в значительной степени сдерживается отсутствием эффективных стандартизованных методов лабораторной диагностики этой нозоформы.

Цель исследования. Разработка оригинальных праймеров для верификации Blastocystis spp. в клиническом материале на основе метода ПЦР и их апробация, а

также изучение клинических особенностей диарейного синдрома у лиц с бластоцистной инвазией.

Задачи исследования.

1) Провести анализ данных международного интернет-банка генов, подобрать и синтезировать праймеры, оценить их лабораторную перспективность для использования при детекции В1а81осу$и$ .чрр. методом классической ПЦР.

2) Определить оптимальный для проведения ПЦР метод выделения ДНК из биологического материала (кал), апробировать работу выбранных праймеров и оптимизировать временные и температурные режимы реакции.

3) Провести сравнение эффективности идентификации бластоцист в клиническом материале (кал) микроскопическим методом и методом ПЦР.

4) Определить частоту встречаемости бластоцист у больных с диарейным синдромом и клинически здоровых жителей Москвы, а также выявить особенности клинического течения диарейного синдрома, ассоциированного с В1а.чЮсу,^1'1х хрр.

Научная новизна исследования. Впервые в России разработаны и апробированы праймеры, перспективные для разработки отечественной тест-системы с целью идентификации ДНК бластоцист в клиническом материале (фекалии), в том числе оптимизированы температурные режимы амплификации, определены параметры применения метода ПЦР, подобрана методика выделения ДНК бластоцист.

Уточнена частота встречаемости бластоцист у больных с диарейным синдромом и у лиц из группы «декретированные контингенты», жителей Москвы и Московской области, определен симптомокомплекс для проведения целенаправленного паразитологического обследования больных с диарейным синдромом.

Установлено, что обнаружение генома бластоцист молекулярно-биологическим методом в испражнениях больных с диарейным синдромом не уступает микроскопическим методам исследования. В случаях низкой

численности бластоцист в исследуемом материале, он может служить дополнительным методом исследования.

Практическая значимость. Оптимизированный молекулярно-биологический метод подтверждения бластоцистной инвазии кишечника больных с диарейным синдромом рекомендуется для практического использования при популяционных обследованиях организованных мигрантов из эндемичных стран, при расследовании вспышек ОКИ на предприятиях общественного питания, благодаря высокой чувствительности, специфичности и быстроте получения результата.

Личное участие автора в получении результатов. Автор принимал непосредственное участие в клиническом обследовании 414 пациентов, лично проводил лабораторную подготовку 231 пробы и исследовал их методом ПЦР, организовал проведение лабораторных и инструментальных исследований. Диссертантом выполнена статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1) Амплификационный метод для идентификации генома бластоцист, сконструированный на основе специфических праймеров ЮШ и гВЬ2 для выявления рода ШазЮсуяШ хрр. обладает чувствительностью 94,4 % при анализе клинического материала. Экстракция ДНК бластоцист сорбентным методом является наиболее эффективным способом подготовки проб при исследовании клинического материала методом ПЦР.

2) Повышение эффективности лабораторной диагностики бластоцистной инвазии при использовании комплексного подхода диктует необходимость применения как амплификационного, так и микроскопического методов, что наиболее целесообразно при проведении обследования больших групп населения, в том числе профилактических осмотрах декретированных лиц.

Внедрение результатов исследования в практику. Полученные результаты внедрены в диагностических целях при консультации пациентов в отделении медицинской паразитологии КДЦ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.

Сеченова; используются в научно-педагогической работе на кафедре тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова для подготовки студентов лечебного и медико-профилактического факультетов; в работе специализированной клинико-диагностической лаборатории по паразитарным болезням КЦ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Инфекция и иммунитет» (Москва, апрель 2012 г.) и на заседании кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Диссертация была представлена и обсуждена на заседании специализированной комиссии в Научно-исследовательском Институте медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е.И. Марциновского Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (протокол № 2 от 19 марта 2013).

По результатам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Последний содержит 167 публикаций, из которых 94 отечественных и 73 зарубежных. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 15 таблицами, приведено 2 клинических примера.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Сбор клинического материала производился на базе отделения медицинской паразитологии и тропической медицины КДЦ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова. Поскольку сходная клиническая картина с диарейным синдромом может быть вызвана различными гельминтозами и протозоозами, сбор клинического материала (кал) был проведен у всех пациентов, обратившихся в отделение медицинской

паразитологии и тропической медицины КДЦ ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова.

Для апробации праймеров, идентифицирующих В1а51осуя!1.ч ярр. методом классической ПЦР, было исследовано 77 проб клинического материала больных, страдающих диареей на момент обращения или имеющих эпизоды диареи в анамнезе. Для выяснения клинических особенностей течения бластоцистной инвазии было проведено клинико-лабораторное обследование 414 человек: 337 сотрудников клиники акушерства и гинекологии им. В.Ф.Снегирева Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, проходивших диспансеризацию и не предъявляющих жалоб, и 77 больных, обратившихся в отделение медицинской паразитологии и тропической медицины с жалобами на неустойчивый стул, боли в животе различной локализации, появление полиморфных высыпаний на коже туловища и конечностей и/или кожный зуд в местах высыпаний.

Для определения особенностей клинического течения диарейного синдрома, ассоциированного с В1ахЮсуяИх яр р., были сформированы 3 группы наблюдения. В первую группу вошли 45 больных с диарейным синдромом, у которых при лабораторном обследовании, в том числе методом ПЦР, в испражнениях выявляли бластоцисты. Вторую группу составили больные с диарейным синдромом, у которых при лабораторном обследовании не обнаружена паразитарная инвазия (32 человека). Третью группу (31 человек) составили пациенты, носители бластоцист, не предъявлявшие жалоб (контрольная группа).

Всем пациентам проводили клинические исследования, включавшие оценку выраженности основных проявлений болезни, характера стула и наличия в нем патологических примесей, клинический и биохимический анализы крови. Микроскопическое исследование кала на наличие яиц гельминтов, личинок, простейших, в том числе бластоцист проводили методом эфир-формалинового обогащения по стандартной методике [МУК 4.2.735-99].

Клинический материал от пациентов, обратившихся в отделение медицинской паразитологии и тропической медицины (пробы фекалий) отбирали для исследования в стерильные пластиковые контейнеры. Клинический материал

доставляли в КДЛ не позднее 6 часов после дефекации. До проведения исследования ПЦР пробы хранили при температуре -20°С не более 30 дней.

Для проведения ПЦР в качестве метода предобработки клинического материала готовили фекальную суспензию (при водянистой консистенции кала суспензию не готовили). ДНК Blastocystis spp. выделяли из 100 мкл пробы. Для составления реакционной смеси для ПЦР использовали набор реагентов Gen Pak PCR — Core, произведенный компанией «Биоком», Россия (состав: PCR Master Mix, PCR Diluent, PCR Oil). Регистрация результатов полимеразной цепной реакции осуществлялась разделением продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле с добавлением бромистого эдития 0,5 мкг/мл.

Статистическая обработка результатов исследования были выполнены по программе Statistica Miicrosoft Wordfor Windows, Excel-2000, BioStatc использованием методов вычисления среднеарифметических показателей, стандартной ошибки средней и интервала доверительных границ (95%). Достоверность различий непараметрических показателей определяли по х2 [Кучеренко В.З., 2007].

Результаты исследования и их обсуждение

Подбор праймеров и оптимизация параметров реакции амплификации

Успех разработки ПЦР во многом зависит от правильного подбора праймеров. На основании литературных данных о нуклеотидной последовательности Blastocystis spp. и наших исследований были подобраны праймеры для диагностики ДНК бластоцист. Сравнение нуклеотидных последовательностей, анализ молекулярной структуры праймеров проводили с использованием компьютерной программы DNASIS, а выбор праймеров производился с помощью программы «OLIGO» (проверяли на образование димеров, шпилек и других вторичных структур). С помощью данных генетической информации, представленных в Gen Bank NCBI (National Centerfor

Biotechnology Information), выбранные праймеры проверялись на гомологичность

и отсутствие перекрестных реакций.

Определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей

проводили в доступных базах данных в режиме on-line с использованием Basic

Local Alignment Search Tool (BLASTn) на web-сервере Национального Центра

Биотехнологической Информации (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

Нуклеотидная последовательность прямых и обратных праймеров, подобранных

для детекции бластоцист методом ПЦР, представлена в таблице 1.

Таблица 1. Нуклеотидная последовательность прямых и обратных праймеров для детекции Blastocystis spp.

Условное наименование праймера Олигонуклеотидная последовательность праймера Размер амплифици-рованного фрагмента

fBh 1 5'- GGAATCCTCTTAGAGGGACACTATACAT -3' 310

г Bh 1 5'- TTACTAAAATCCAAAGTGTTCATCGGAC - 3' 310

fBh 2 5'- GGAGGTAGTGACAATAAATC - 3' 585

г Bh 2 5' -TAAGACTACGAGGGTATCTA -3' 585

По данным Национального Центра Биотехнологической Информации отобранные нами праймеры ВЫ и ВЬ2 являются комплементарными разным участкам 18 8 гена рибосомального кластера, который кодирует малую субъединицу рРНК у бластоцист. Условия и режимы проведения реакции были отработаны экспериментально.

Одним из критериев подбора праймеров являлась температура отжига с соответствующими матрицами. При определении оптимальной температуры отжига было апробировано несколько температурных режимов для исследуемых праймеров в диапазоне 53 - 60°С с интервалом 1°С для праймеров системы ВЫ, а для ВЬ 2 от 56°С до 70°С, а также с интервалом 1°С. Понижение температуры

отжига приводило к наработке неспецифичных продуктов, а её повышение

сопровождалось изменением чувствительности реакции. В результате опытов

была установлена оптимальная температура отжига праймеров, которая

обеспечивала синтез специфичных фрагментов. Наибольший выход продукта

амплификации наблюдали при 60°С для праймеров ВЫ. Для праймеров ВЬ2

температура отжига составила 64°С. Разработанные режимы амплификации для

праймеров систем ВЫ и ВЬ2 представлены в таблице 2.

Таблица 2. Оптимизированные режимы амплификации для праймеров систем ВЫ и ВИ2.

Стадия Режим для праймеров гВЫ и ты Режим для праймеров гВЬ2 и ть2 Количество циклов амплификации

Начальная денатурация 95°С - 5 мин 95 °С - 7 мин 1

Денатурация 94°С - 1 мин 94°С - 1 мин 35

Отжиг праймеров 60°С - 1 мин 64°С - 45 сек

Элонгация 72°С - 1 мин 72°С - 45 сек

Финальная элонгация 72°С - 5 мин 72°С - 7 мин 1

В оптимальных условиях проведения ПЦР на чистых препаратах ДНК четкий положительный результат с формированием одиночных специфичных ампликонов размером 310 п.н. получен в реакции амплификации с праймерами ВЫ. При использовании праймеров ВЬ2 размер синтезируемых ампликонов составлял 585 п. н. Результаты анализа продуктов амплификации представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Электрофореграмма продуктов амплификации, полученных с использованием праймеров Bhln Bh2 при выделении Blastocystis spp. из чистой культуры.

дорожки М, 7 - маркеры молекулярных размеров (Gene Ruler 100 п.н.);

1 - 4 - изученные образцы ДНК, полученные с применением праймеров Bh2;

5 -отрицательный контроль; 6 - изученные образцы ДНК, полученные с применением праймеров Bhl

Эти результаты соответствовали расчетным данным, которые были получены с помощью компьютерного анализа и свидетельствовали о потенциальной пригодности выбранных нами праймеров для конструирования амплификационной тест-системы с целью идентификации генома Blastocystis spp. Выделенные сорбционным методом пробы ДНК чистой культуры бластоцист позднее использовались в качестве положительного контроля реакции аплификации (ПК) при проведении апробации праймеров на клиническом материале. Таким образом, в ходе проведенных исследований нами были подобраны специфические праймеры и определены оптимальные режимы проведения ПЦР, что позволяет в перспективе создать отечественную диагностическую тест-систему для выявления генома бластоцист.

Использование ПЦР для обнаружения бластоцист в клиническом материале

В качестве клинического материала были исследованы фекалии пациентов. Следующим этапом исследований явилась разработка оптимального способа

выделения ДНК, который обеспечивал бы эффективный лизис клеток возбудителя, качественную очистку нуклеиновых кислот от компонентов, ингибирующих реакцию амплификации, а также концентрирование препарата при проведении ПЦР. Была проведена сравнительная оценка различных способов выделения ДНК В1а$1осу$й$ зрр. при исследовании чистых культур. Использовались: метод аффинной сорбции на силикагеле с предшествующим лизированием пробы в гуанидинтиоционате, лизирующий метод с реагентом для преципитации и метод нуклеосорбции на носителе (стеклянные шарики) с разрушением клеточной стенки гуанидинтиоцианатом. Основным критерием служило наличие специфической амплификации в исследуемых пробах. Результат сравнительного применения трех наборов для выделения ДНК представлен на рисунке 2.

Рисунок 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР при различных способах экстракции ДНК В1аз1осу8ив spp. Праймеры ВЫ.

А -пробы, подготовленные лизирующим методом с реагентом для преципитации;

Б - пробы, подготовленные методом нуклеосорбции на носителе с гуанидиитиоционатом;

В - пробы, подготовленные методом аффинной сорбции на силикагеле с предшествующим лизированием в гуанидинтиоционате

По данным литературы известно, что длительное замораживание образцов не влияет на результат ПЦР, однако размораживание материала может снижать эффективность ПЦР. В этой связи, для изучения воздействия многократного размораживания и замораживания проб на результаты ПЦР нами было проведено несколько экспериментов. После первого размораживания фекалий из проб с помощью сорбентного метода выделяли ДНК Шая/осуяНя зрр. Затем проводили

ПЦР с использованием праймеров ВЬ2. Из 34 микроскопически положительных проб, реакция ПЦР была положительной 94,4% (32 пробы). Исследованные пробы вновь замораживались и выдерживались при температуре -20°С в течение суток.

После повторного размораживания проб положительный результат ПЦР наблюдался уже в 29,4% (10 проб). После третьего цикла заморозки-разморозки, положительная ПЦР была только в 2 пробах (5,8%). Таким образом, проведенные нами исследования показали, что повторное размораживание клинического материала существенно снижает эффективность ПЦР, что проявляется значительным снижением частоты получения позитивных результатов в заведомо положительных пробах. Исходя из этого, при транспортировке и хранении замороженных образцов следует строго соблюдать температурный режим и не допускать случаев размораживания клинического материала. Несоблюдение этих правил негативно отражается на результатах ПЦР диагностики бластоцистной инвазии.

На следующем этапе работы была изучена диагностическая информативность метода ПЦР с данными праймерами при исследовании клинического материала. Для оценки эффективности разработанной методики с целью верификации бластоцист подобранный метод выделения ДНК из клинического материала и модифицированные условия амплификации ДНК были применены для анализа клинических образцов (фекалии) 77 пациентов. Исследование клинических проб проводили параллельно микроскопическим и молекулярно-биологическим (ПЦР) методами.

При электрофорезе в УФ с длиной волны излучения 312/254 нм размеры анализируемых фрагментов ДНК определяли относительно маркера молекулярного веса, что составляло для праймеров ВЫ - 310 п.н., а для ВЬ2 - 585 п.н. Частота выявления ДНК конкретного возбудителя в значительной мере зависит как от условий проводимой реакции, чувствительности метода, так и от количества детектируемых ДНК в исследуемом клиническом материале. Данное утверждение в определенной мере может быть обосновано тем, что наряду с отрицательными и положительными результатами определения ДНК, мы часто

наблюдали слабоположительную реакцию. Слабоположительная реакция была при анализе проб, содержащих бластоцисты в количестве до 10 в поле зрения, выявленных микроскопически. При малых количествах ДНК В1а.иосузИ.ч хрр. отмечалось снижение интенсивности соответствующих полос на геле -слабоположительная реакция.

На основании проведенных исследований был сделан вывод о принципиальной возможности использования праймеров ВЬ 1 и ВЬ 2 для идентификации бластоцист в клиническом материале. Однако чувствительность этих праймеров при постановке ПЦР отличалась. Исследования при проведении амплификационного метода с чистыми культурами бластоцист показали, что более высокий процент выявления положительных результатов был получен с помощью праймеров ВЬ2, по сравнению с праймерами ВЫ. Следует также отметить, что при постановке ПЦР с пробами кала, в которых микроскопически не определялись бластоцисты, положительные либо слабоположительные результаты регистрировались при применении праймеров ВЬ2. В то же время, при использовании праймеров ВЫ на электрофореграммах часто выявлялись дополнительные полосы так называемые «шмеры ДНК», что затрудняло интерпритацию результатов реакции.

При микроскопии фекалий в 36 из 77 пробах (46,8%) были выявлены бластоцисты, которые определялись в количестве от единичных до нескольких десятков в поле зрения, у 41 пациента — микроскопические исследования были отрицательными. Все эти пробы были проверены методом ПЦР с помощью праймеров ВЫ и ВЬ2. С помощью праймеров В112 мы определили ДНК .5рр. в клиническом материале у 43 из 77 пациентов, что составило 55,8%, при использовании праймеров ВЫ - в 34 пробах (44,2%).

Отрицательные результаты ПЦР регистрировались в клиническом материале, в котором было низкое содержание В1а.Иосух!1х ¿рр., менее 10 в поле зрения. Получение этих отрицательных результатов по всей вероятности, было связано с не соблюдением температурных условий транспортировки материала, в результате чего, в ряде случаев, проходило его частичное размораживание.

Слабоположительную реакцию наиболее часто наблюдали при анализе проб кала, в которых содержались единичные бластоцисты, выявленные методом микроскопии.

При сравнении способов детекции бластоцист в кале микроскопическим методом и ПЦР при использовании праймеров ВЫ совпадение положительных результатов отмечено в 88,8% (32 положительные пробы при ПЦР с ВЫ из 36 положительных проб, подтвержденных микроскопически) и 94,4% при использовании праймеров ВЬ2 (34 положительные пробы при ПЦР с ВЬ2 из 36 положительных проб, подтвержденных микроскопически) (таблица 3).

Таблица 3. Сравнительная эффективность методов детекции бластоцист в клиническом материале.

Результаты обследования 77 пациентов микроскопическим методом Результаты ПЦР, применение праймеров ВЫ Результаты ПЦР, применение праймеров ВЬ2

положительные отрицательные положительные отрицатель-ные

Положительные, п=36 (100%) 32 88,8% 4 11,2% 34 94,4% 2 5,6%

Отрицательные, п=41 (100%) 3 7,3% 38 92,7% 9 21,9% 32 78,1%

Из таблицы видно, что при исследовании микроскопически отрицательных проб методом ПЦР с использованием праймеров ВЫ у 3 пациентов (7,3%) был получен положительный результат. При использовании праймеров ВЬ2 в группе пациентов с микроскопически отрицательными результатами, амплификационный метод позволил обнаружить нуклеотидные последовательности ДНК бластоцист в 21,9% случаев (9 пациентов). При этом следует заметить, что все положительные результаты, полученные с использованием праймеров ВЫ при исследовании микроскопически отрицательных проб, были также положительными при проведении ПЦР с праймерами ВЬ2. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о высокой чувствительности метода ПЦР с использованием праймеров ВЫ и ВЬ2, позволяющих идентифицировать ДНК бластоцист в пробах, которые по данным микроскопического метода были отнесены в группу отрицательных. С помощью

амплификационного метода удалось установить наличие бластоцистной инвазии у пациентов, у которых интенсивность инвазии была минимальна и микроскопически не определялась.

Отрицательные результаты ПЦР в пробах с заведомым содержанием бластоцист, полученные в 4 пробах (11,2%) при использовании праймеров Bhl и в 2 пробах (5,6%) при использовании праймеров Bh2, возможно обусловлено техническими ошибками в методике постановки реакции, результатом чего, вероятнее всего, явилось попадание в рабочий раствор ингибирующих примесей. Не смотря на это, результаты проведенных исследований наглядно демонстрируют, что эти два метода - микроскопический и молекулярно-биологический, имея каждый свои недостатки и достоинства, при их комплексном использовании способны увеличить выявляемость бластоцист, а значит улучшить диагностику этого протозооза.

Высокая технологичность и большая «пропускная» способность метода ПЦР делает его незаменимым при проведении обследования различных людских контингентов с большой численностью и может служить дополнительным методом, позволяющим улучшить качество лабораторной диагностики при обследовании пациентов с патологией желудочно-кишечного тракта.

Особенности клинического течения бластоцистной инвазии

Для определения частоты встречаемости бластоцист в кишечнике у больных с диарейным синдромом были изучены особенности клинического течения болезни у 77 пациентов. Из 77 человек в клиническом материале (кал) у 45 больных (58,4%) были выявлены бластоцисты в количестве от 1 - 10 до нескольких десятков в одном поле зрения. Существенно реже встречались другие простейшие: Entamoeba coli - у 5 человек (6,5%), Dientamoeba fragilis - у 2 пациентов (2,6%). У всех больных бактериальная этиология диареи была исключена терапевтом или врачом гастроэнтерологом при предварительном обследовании в поликлинике по месту жительства.

Во второй группе преобладали лица женского пола - 62,5±8,6%. В первой группе больных, выделяющих бластоцисты, также встречалось больше женщин

17

(68,9±6,9%). Этот факт можно объяснить тем, что женщины в силу особенностей сферы деятельности чаще имеют контакт с фактором передачи инвазии (приготовление пищи). Равное число инвазированных мальчиков и девочек (по 6 человек) - еще одно свидетельство в пользу таких выводов. В зависимости от возраста больных наблюдается увеличение инвазированности этими возбудителями детей до 17 лет, что должно быть связано с еще неразвитой санитарной культурой, и больных в возрасте 50-59 лет, что можно объяснить снижением иммунорезистентности организма.

Основными жалобами, послужившими причинами обращения пациентов в поликлинику, были боли в животе различной локализации (55,5±7,8%), появление полиморфной сыпи, сопровождающейся кожным зудом (51,1±7,5%). Наличие слизи в кале отмечали 21 человек. Пациенты обеих групп жаловались на водянистый стул на момент обращения или эпизоды диареи в анамнезе.

Таким образом, ведущими в обеих группах являлись диспепсические явления: тошнота, метеоризм (60% в первой группе и 75% во второй группе). Аллергические проявления: наличие высыпаний на коже туловища и конечностей, сопровождающихся общим зудом, аллергический ринит у пациентов с диарейным синдромом, ассоциированным с В. hominis выявляли достоверно чаще (51,1±7,5%) в сравнении с группой пациентов, у которых бластоцисты в кале не определяли (28,1 ±7,9%) (р<0,05), при этом астено-невротические явления в целом менее выражены.

У большинства обследованных пациентов обеих групп, на момент обращения в отделение КДЦ стул был кашицеобразный, что свидетельствовало о неспецифичности данного синдрома и не могло помочь в дифференциальной диагностике бластоцистоза и других болезней сопровождающихся диарейным синдромом. Неустойчивый стул (чередование запоров с поносами) беспокоил пациентов в 28,9±6,8% в первой группе и 25±7,7% во второй. Только 5 пациентов в каждой из обеих групп предъявляли жалобы на жидкий стул до нескольких раз в день в течение длительного срока от нескольких дней до нескольких недель.

Слизь в кале отмечали 12 человек в первой группе (26,7±6,6%) и 9 человек во второй (28,1±7,9%).

При объективном осмотре больных наряду с наличием чувствительности живота при пальпации, обложенного белым налетом языка, достоверно чаще (р<0,05) было отмечено наличие полиморфных высыпаний на коже туловища, лица или конечностей - 48,9±7,6 % в первой группе и 18,8±6,9% во второй.

Нарушение состава периферической крови больных обеих групп носили слабовыраженный и разнонаправленный характер: увеличение числа эозинофилов больше 5% было выявлено у 24,4±6,4% больных первой группы и 15,6±6,4% - во второй, увеличение уровня билирубина - 11,1±4,7% и 6,3±4,2% соответственно, СОЭ выше 15 мм/ч было отмечено только у 4 больных первой группы. Существенных отклонений других показателей выявлено не было.

У большинства лиц с бластоцистной инвазией достоверно чаще (р<0,05) в анамнезе имелись сведения о сопутствующей патологии, а именно: у 32 человек -различные заболевания желудочно-кишечного тракта (71,1±6,8%), у 22 (48,9±7,6%) — различные аллергозы. У 4 человек сопутствующей патологии заболеваний не отмечалось. Безусловно, выявленные у наблюдавшихся больных клинические и лабораторные изменения не всегда являются проявлениями именно бластоцистоза. Возможно, выявляемая клиническая симптоматика отчасти была связана с сопутствующей патологией. Возможно иммунологические изменения, возникающие при аллергии, патология гепатобилиарной системы могут приводить к хроническому воспалению в слизистой ЖКТ и снижению иммунного ответа, что может способствовать клиническому проявлению бластоцистоза и отягощать течение аллергии.

Проанализировав данные по больным с диарейным синдромом, у которых при лабораторном обследовании, в том числе ПЦР, в испражнениях выявляли бластоцисты и пациентов, у которых не обнаружена паразитарная инвазия, были установлены некоторые особенности. Установлено, что жалобы на неустойчивый стул со слизью, метеоризм, боли в животе различной локализации, наличие полиморфных высыпаний на коже туловища и конечностей делают возможным

19

определить симптомокомплекс, который позволяет отобрать целевую группу для обследования на наличие бластоцист. В клиническом анализе крови у больных с диарейным синдромом, ассоциированным с В. hominis в два раза чаще выявляли эозинофилию более 6%, что может быть связано с большей встречаемостью аллергического синдрома на фоне бластоцистной инвазии.

Из литературных источников известно, что бластоцисты могут определяться и в кале «практически здоровых» людей, в связи с чем, представлял несомненный интерес вопрос о частоте присутствия этих простейших у пациентов, не предъявляющих жалоб, и условно отнесенных нами в группу практически здоровых лиц. С этой целью были исследованы пробы кала 337 человек, входивших в группу «декретированные контингенты».

При микроскопическом исследовании кала у 31 -ого (9,2 %) обследованного в клиническом материале были выявлены бластоцисты в количестве от 10 до нескольких десятков в одном поле зрения (3-я группа). Существенно реже встречались другие простейшие: Е. coli - 6 человек (1,5%), D.fragilis — 4 человека (1,2%). Патогенная бактериальная флора кишечника у пациентов диспансерной группы была исключена врачом-инфекционистом при посеве кала на кишечные инфекции в клинико-диагностической лаборатории КДЦ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Среди 31 выделителя бластоцист лица женского пола составили 93% (28 человек). Эту особенность можно объяснить спецификой работы пациентов (обследованные являлись сотрудниками клиники акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева Первый МГМУ им. И.М. Сеченова). Возраст носителей бластоцист варьировал от 18 до 63 лет. Возрастная структура характеризовалась преобладанием лиц от 50 до 59 лет, что может быть связано с увеличением числа хронических заболеваний в этом возрасте.

В результате обследования из числа 337 пациентов группы «декретированные контингенты» 240 (71,2%) человек расценены как «практически здоровые», а у 97 человек (28,8%) выявлены те или иные хронические заболевания (таблица 4).

Таблица 4. Распределение пациентов из группы «декретированные лица» по наличию сопутствующих заболеваний.

Сопутствующие заболевания Общее число обследованных, п=337 Число лиц, носителей бластоцист, п=31

Абсолютное число % Абсолютное число %

Лица, не имеющие сопутствующих заболеваний 240 71,2±2,5 10 32,3±8,4

Лица с сопутствующими заболеваниями 97 28,8±2,5 21 67,7±8,4

Всего 337 100 31 100

У большинства лиц (67,7±8,4%), носителей бластоцист, была выявлена сопутствующая патология (21 человек), а именно: у 9 человек (29,1±8,2%) -различные заболевания желудочно-кишечного тракта, у 7 человек (22,6±7,5%) — аллергозы, у 2 человек (6,5±4,4%) - сахарный диабет, что может указывать на проявление патогенных свойств бластоцист лишь при определенных условиях состояния макроорганизма, или наличие патологии непаразитарной природы создает условия для более частого инвазирования кишечника В^ШсузИя хрр. У остальных 10 человек (32,3±8,4%) сопутствующих заболеваний выявлено не было. Таким образом, показано, что при хронических заболеваниях органов пищеварения бластоцисты обнаруживаются значительно чаще. Следует отметить, что наиболее высокие показатели инфицированности данными простейшими установлены при хроническом холецистите - 16,1 ±6,6%, при бронхиальной астме - 12,9±6%, что может косвенно указывать на влияние патологии гепатобилиарной системы на развитие бластоцистной инвазии и позволяет рассматривать данных простейших как этиопатогенетический ко-фактор развития этих заболеваний.

В результате опроса этой группы пациентов жалобы на периодически возникающую тошноту преимущественно по утрам, боли в животе различной локализации, метеоризм предъявляли 17 человек (54,8±8,9%). Два человека (6,5±4,4%) жаловались на общую слабость, головокружение, утомляемость. При клиническом осмотре полиморфные высыпания на коже туловища и конечностей, трещины, сухость кожи, кожный зуд были отмечены у 9 человек (29,1±8,2%).

Нередко регистрировалось несколько синдромов у одного и того же пациента. У 3 пациентов (9,7±5,3%), инвазированных бластоцистами, жалоб выявлено не было.

Из всех пациентов, выделителей бластоцист, 19 человек (61,3±8,7%) отмечали склонность к частому кашицеобразному (2-3 раза в день) или неустойчивому (чередование запоров с поносами) стулу. Жалоб на жидкий стул ни у одного пациента зафиксировано не было.

Таким образом, в результате обследования пациентов, проходящих профилактический осмотр и не предъявляющих жалобы на жидкий частый стул, нам удалось выявить бластоцисты в кале в 9,2% случаев, что несколько превышает данные полученные из литературных источников [Державина Т.Ю. и др., 2011; Сигитаев A.C. и др., 2011]. Это можно объяснить применением более информативных лабораторных методов (комплексный метод эфир-формалинового обогащения), при использовании которого простейшие сохраняются неизменными длительное время и без труда поддаются микроскопированию.

Представленные в настоящей работе данные свидетельствуют о вкладе бластоцист в формирование заболеваемости диареей неустановленной этиологии. Полученные результаты показывают обоснованность совершенствования лабораторной диагностики и целесообразность использования методов выявления ДНК простейших в клиническом материале у больных с синдромом диареи неясной этиологии.

ВЫВОДЫ

1. Подобранные и сконструированные праймеры Bhl и Bh2 перспективны при использовании в отечественных тест-системах на основе метода ПЦР для идентификации Blastocystis spp. в клиническом материале (кал).

2. Оптимизированные параметры временных и температурных режимов амплификации при проведении ПЦР с оригинальными праймерами обеспечивают синтез специфичных фрагментов и позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью верифицировать бластоцисты в клиническом материале.

3. Доказана более высокая чувствительность разработанного амплификационного метода при исследовании клинического материала на основе праймеров Bh2 (94,4%) по сравнению с праймерами Bhl (88,8%) и показана возможность выявления ДНК Blastocystis spp. в микроскопически отрицательных пробах при использовании праймеров Bh2 (21,9%), что является детекцией субмикроскопического присутствия бластоцист.

4. Применение ПЦР для верификации Blastocystis spp. с использованием сконструированных праймеров Bhl и Bh2, позволяющих выявлять возбудителя на субмикроскопическом уровне, расширяет диагностические возможности для обследования больных с диарейным синдромом.

5. Использование микроскопического и молекулярно-биологического методов обследования позволило установить, что у больных с диарейным синдромом Blastocystis spp. обнаруживались у каждого второго (58,4%), в группе здоровых лиц бластоцисты встречались только в 9,2% случаев, что указывает на возможную этиологическую роль бластоцист в развитии диарейного синдрома при отсутствии других инфекционных и паразитарных факторов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для повышения качества лабораторной идентификации бластоцист в клиническом материале целесообразна разработка отечественной тест-системы на основе полимеразной цепной реакции с использованием сконструированых праймеров ffih2 (5-GGAGGTAGTGACAATAAATC-3') и rBh2 (5'-TAAGACTACGAGGGTATCTA-3'), комплементарных к участку гена 18S рРНК.

2. При верификации бластоцист методом ПЦР для выделения ДНК бластоцист в клиническом материале рекомендуется использовать метод аффинной сорбции на силикагеле с предшествующим лизированием пробы в гуанидинтиоционате.

3. Больных с диарейным синдромом, эозинофилией, наличием полиморфных высыпаний на коже туловища и конечностей необходимо

обследовать паразитологическими методами с целью поиска кишечных простейших, в том числе - Blastocystis spp.

4. С целью увеличения диагностической эффективности в комплексном обследовании больных с диарейным синдромом при анализе фекалий рекомендуется сочетать микроскопический метод с молекулярно-биологическим (ПЦР), что наиболее целесообразно при массовых профилактических осмотрах декретированных лиц, детей в организованных коллективах, при расследовании вспышек ОКИ на предприятиях общественного питания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тихонова Д.В. Алгоритмический подход в дифференциальной диагностике кишечных протозоозов // Профилактическая медицина -практическому здравоохранению: Сборник научных статей медико-профилактического факультета ППО ММА им. И.М. Сеченова Выпуск 3. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. - с. 357360.

2. Тихонова Д.В. Проблема дифференциальной диагностики бластоцистоза на современном этапе // Тезисы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 1213 апреля 2012, Инфекция и иммунитет. - 2012. - Т. 2, №1-2. - С. 384.

3. Тихонова Д.В. Проблема бластоцистоза в мире // Сеченовский вестник. - 2012. - № 1. — с.54-58.

4. Тихонова Д.В., Федянина J1.B., Плющева Г.Л. Особенности клиники и лабораторных методов диагностики бластоцистоза // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2012. - №3. - С. 44.

5. Тихонова Д.В., Волкова И.В., Морозов E.H., Федянина Л.В. ДНК-диагностика бластоцистоза с помощью метода ПЦР // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2012. - №4. - с. 27-29.

Подписано в печать. 13.05.2013. Формат А4/2 Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ №0117-1 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Тихонова, Дина Валерьевна, Москва

Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственное Бюджетное Учреждение Высшего Профессионального Образования ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

04201357290 Тихонова Дина Валерьевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЕРИФИКАЦИИ ДИАГНОЗА БЛАСТОЦИСТОЗА ПРИ ДИАРЕЕ НЕЯСНОЙ ЭТИОЛОГИИ

03.02.11. - паразитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: Е.Н. Морозов доцент, кандидат медицинских наук

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................... 4

ВВЕДЕНИЕ........................................................................... 5

Глава 1. АНАЛИЗ ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ...................................... 11

1.1. Проблема бластоцитоза в мире............................................. 11

1.2. Молекулярно-биологические основы и методологические принципы полимеразной цепной реакции.................................... 25

1.3. Преимущества метода ПЦР в диагностике паразитозов............... 28

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................. 32

2.1. Общая характеристика обследованных пациентов..................... 32

2.2.Микроскопическое исследование клинического материала.......... 35

2.3. Метод полимеразной цепной реакции.................................... 37

2.4. Статистические методы исследования..................................... 42

Глава 3. ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ.................................................. 43

3.1. Анализ нуклеотидных последовательностей и конструирование видоспецифических праймеров.................................................. 43

3.2. Экспериментальное определение оптимальных условий проведения полимеразной цепной реакции для детекции нуклеиновых

кислот В1азШсузШ Брр............................................................. 45

Глава 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ БЛАСТОЦИСТ В КЛИНИЧЕСКОМ

МАТЕРИАЛЕ........................................................................ 50

4.1. Выбор оптимального метода выделения ДНК Ыаз^суБйх Брр.

для проведения ПЦ Р из клинических образцов.................................... 50

4.2. Сравнительная характеристика микроскопического и молекулярно-биологического методов детекции бластоцист

в клиническом материале .................................................. 53

Глава 5. ОСОБЕННОСТИ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ БЛАСТОЦИСТНОЙ ИНВАЗИИ............................................. 60

5.1. Результаты клинического обследования пациентов с диарейным синдромом..........................................................60

5.2. Результаты клинического обследования носителей бластоцист,

у которых отсутствовал диарейный синдром..............................74

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................79

ВЫВОДЫ..........................................................................84

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ......................................85

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................86

ПРИЛОЖЕНИЕ..................................................................106

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AJIAT - аланинаминотрансфераза

АСАТ - аспартатаминотрансфераза

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

СРК - синдром раздраженного кишечника

spp. - species

ВВЕДЕНИЕ

Большинство паразитозов выявляется и учитывается значительно хуже, чем острые инфекционные болезни [74]. Известно, что кишечные паразиты оказывают выраженное действие на макроорганизм, в частности снижают и угнетают формирование и сохранение иммунитета [31, 73]. Доказана роль некоторых простейших (лямблий, криптоспоридий) в развитии нарушений биоценотических взаимоотношений между патогенными бактериями и нормальной кишечной микрофлорой, что влияет на развитие многих заболеваний, особенно, имеющих хроническое течение.

В последние годы выявлены высокие показатели зараженности Blastocystis hominis у различных групп населения [6]. На протяжении последних лет ведется изучение биологии паразита [125, 160, 167]. Показано, что В. hominis обладают способностью продуцировать токсические продукты метаболизма, которые всасываются в кишечнике, поступают в кровоток и способны оказывать цитотоксический эффект [110]. Установлено, что бластоцистная инвазия на фоне иммунодефицита сопровождается нарушениями микробиоценоза кишечника. Это проявляется увеличением частоты встречаемости транзиторной микрофлоры на фоне снижения доминирования основных симбионтов, повышением показателей плотности колонизации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, повышением их вирулентности [38].

В связи с этим, актуальной является проблема диагностики широко распространенной протозойной инвазии, обусловленной паразитированием в толстом кишечнике простейших В. hominis. Получены эпидемиологические, клинические и лабораторные данные, подтверждающие этиологическую роль В. hominis в патологии, развивающейся на фоне снижения резистентности организма [31]. Бластоцисты существенно чаще, чем у практически здоровых людей обнаруживаются при хронических дерматозах [52], гастроэнтерологической патологии, диарейном синдроме [99]. Особенно

актуальной проблема бластоцистоза становится в связи с резким увеличением ВИЧ-инфицированных, т.к. у иммунокомпрометированных лиц В. hominis могут вызывать хронические поражения пищеварительной системы [135].

В постановке диагноза бластоцистоза ведущую роль играет обнаружение бластоцист в кале микроскопическим и культуральным методом. Однако диагностика бластоцистоза затруднена обилием различных морфологических форм бластоцист [32, 96]. В качестве альтернативных и наиболее перспективных методов обнаружения В. hominis рассматриваются амплификационные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ПТ TP) [112, 115].

Развитие большинства современных научных дисциплин напрямую связано с развитием применяемых исследователями методов. Это особенно актуально в области медицины, где правильная диагностика играет ключевую роль в выборе стратегии и тактики лечения, а впоследствии определяет его успешность. В последние десятилетия именно новые методические подходы определяли прорыв в области биохимии и молекулярной генетики [66]. Одним из таких способов стала ПЦР, являющаяся высокочувствительным диагностическим методом, позволяющим обнаружить ДНК паразита даже при ее очень низком содержании в данном материале [26, 47, 119, 158]. Это достигается подбором праймеров, комплементарных специфическому участку ДНК возбудителя [47, 91].

Для детекции возбудителей таких паразитарных болезней как малярия, лейшманиозы, токсоплазмоз, дирофиляриоз активно применяют ПЦР, однако, для определения бластоцист в клиническом материале (фекалии) отечественных тест-систем на территории РФ не существует.

Приведенные литературные данные свидетельствуют о том, что изучение проблемы бластоцистоза и разработки методов лечения этой инвазии в значительной степени сдерживается отсутствием эффективных стандартизованных методов лабораторной диагностики этой нозоформы [53].

Цель нашей работы - разработка оригинальных праймеров для верификации ШаяЮсуяНя Брр. в клиническом материале на основе метода ПНР и их апробация, а также изучение клинических особенностей диарейного синдрома у лиц с бластоцистной инвазией.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) провести анализ данных международного интернет-банка генов, подобрать и синтезировать праймеры, оценить их лабораторную перспективность для использования при детекции ярр. методом классической ПЦР;

2) определить оптимальный для проведения ПЦР метод выделения ДНК из биологического материала (кал), апробировать работу выбранных праймеров и оптимизировать временные и температурные режимы реакции;

3) провести сравнение эффективности идентификации бластоцист в клиническом материале (кал) микроскопическим методом и методом ПЦР;

4) определить частоту встречаемости бластоцист у больных с диарейным синдромом и клинически здоровых, жителей Москвы, а также выявить особенности клинического течения диарейного синдрома, ассоциированного с В^^суБШ ярр.

Научная новизна результатов исследования:

Впервые в России разработаны и апробированы праймеры, перспективные для разработки отечественной тест-системы с целью идентификации ДНК бластоцист в клиническом материале (фекалии), в том числе оптимизированы температурные режимы амплификации, определены параметры применения метода ПЦР, подобрана методика выделения ДНК бластоцист.

Уточнена частота встречаемости бластоцист у больных с диарейным синдромом и у лиц из группы «декретированные контингенты», жителей Москвы и Московской области, определен симптомокомплекс для проведения

целенаправленного паразитологического обследования больных с диарейным синдромом.

Установлено, что обнаружение генома бластоцист молекулярно-биологическим методом в испражнениях больных с диарейным синдромом не уступает микроскопическим методам исследования. В случаях низкой численности бластоцист в исследуемом материале, он может служить дополнительным методом исследования.

Практическая значимость:

Впервые в России разработаны и апробированы праймеры, перспективные для разработки отечественной тест-системы для идентификации ДНК бластоцист в клиническом материале (фекалии).

Подобрана и оптимизирована методика выделения ДНК бластоцист как из культурального материала, так и из фекалий человека.

Показано, что молекулярно-биологический метод подтверждения бластоцистной инвазии может быть рекомендован при популяционных обследованиях, в том числе при обследовании групп организованных мигрантов, при расследовании вспышек ОКИ на предприятиях общественного питания, благодаря высокой чувствительности, специфичности и быстроте получения результата.

Личное участие автора в получении результатов. Автор принимал непосредственное участие в клиническом обследовании 414 пациентов, лично проводил лабораторную подготовку 231 пробы и исследовал их методом ПЦР, организовал проведение лабораторных и инструментальных исследований. Диссертантом выполнена статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1) Амплификационный метод для идентификации генома бластоцист, сконструированный на основе специфических праймеров №Ь2 и гВЬ2 для выявления рода ЫаБЮсузНз ярр. обладает чувствительностью 94,4 % при

анализе клинического материала. Экстракция ДНК бластоцист сорбентным методом является наиболее эффективным способом подготовки проб при исследовании клинического материала методом ПЦР.

2) Повышение эффективности лабораторной диагностики бластоцистной инвазии при использовании комплексного подхода диктует необходимость применения как амплификационного, так и микроскопического методов, что наиболее целесообразно при проведении обследования больших групп населения, в том числе профилактических осмотрах декретированных лиц.

Внедрение результатов исследования в практику.

Полученные результаты внедрены в диагностических целях при консультации пациентов в отделении медицинской паразитологии КДЦ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова; используются в научно-педагогической работе на кафедре тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова для подготовки студентов лечебного и медико-профилактического факультетов; в работе специализированной клинико-диагностической лаборатории по паразитарным болезням КЦ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Апробация работы.

Работа выполнена на базе Научно-исследовательского Института медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е.И. Марциновского Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Тема диссертационной работы является частью комплексной темы кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова «Совершенствование образовательных технологий додипломного и постдипломного медицинского и фармацевтического образования» 01201168237.

Основные положения диссертации опубликованы в 5 научных работах в журналах, 2 из них включены в перечень ВАК.

Материалы диссертационной работы были доложены на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Инфекция и иммунитет» (Москва, апрель 2012 г.) и на заседании кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им И.М. Сеченова.

Диссертация была представлена и обсуждена на заседании апробационного совета по экспертизе кандидатских и докторских диссертаций в Научно-исследовательском Институте медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е.И. Марциновского Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (протокол № 2 от 19 марта 2013).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Последний содержит 167 публикаций, из которых 94 отечественных и 73 зарубежных. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 15 таблицами, приведено 2 клинических примера.

Глава 1. АНАЛИЗ ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Проблема бластоцистоза в мире

Кишечные паразитозы представляют актуальную медико-социальную проблему. Заболеваемость паразитарными болезнями в РФ остается значительной на протяжении 90-х годов XX века и в начале XXI века. Паразитарные болезни сохраняют лидирующее положение в структуре заболеваемости населения РФ среди всего комплекса инфекционных и паразитарных болезней (за исключением гриппа и ОРВИ). В стране ежегодно официально регистрируется около 1 миллиона больных различными паразитозами, среди которых отмечается рост заболеваемости кишечными протозоозами [74].

Микробиоценозы представляют сложные системы, которые отличаются не только многокомпонентностью, но и количественным разнообразием входящих в них представителей микрофлоры [7]. При этом человек является открытой системой, в которую постоянно извне поступают разнообразные микроорганизмы, в то же время, он сам служит источником их поступления в окружающую среду [1].

При физиологической норме организм человека содержит сотни видов бактерий, а также вирусы и простейшие, составляющие в сумме нормальный микробиоценоз [3, 22, 23].

Наиболее известными возбудителями острых кишечных инфекций протозойной природы являются: Entamoeba hystolitica, Lamblia (Giardia) intestinalis и Criptosporidium parvum [39]. Особую актуальность приобрела широко распространенная «новая» протозойная инвазия - бластоцистоз, обусловленная паразитированием преимущественно в толстой кишке простейших В. hominis [53, 90, 166].

Простейшие В. hominis выявляются в фекалиях у людей во всем мире, на разных континентах земли, особенно в тропических странах, где ими инвазировано до 40% населения [58]. Так, например, при скрининговом

исследовании населения юга Италии микроскопическим методом В. hominis выявляли в кале чаще (в 52,7% случаев), чем другие кишечные простейшие: Е. histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii (11,9%), L. (Giardia) intestinalis (4,5%) [137]. По-видимому, широкое распространение бластоцист среди разных групп населения в мире не ограничивается климатическими условиями, географическими зонами и социоэкономическими контингентами, но также зависит от возрастных особенностей организма человека, гигиенических навыков, иммунного статуса [86].

В. hominis - полиморфный паразит кишечника человека и животных. Он вызывает интерес не только с точки зрения дифференциальной диагностики простейших кишечника, но и с точки зрения недостаточно установленной патогенной роли [58, 97, 157].

Бластоцисты были впервые описаны более 100 лет назад. Первооткрывателями были Loesh (1849) и Britten (1849), описавшие микроорганизмы под названием «аннулярные тельца». Позднее Brumpt (1912) предложил назвать этого возбудителя, выделенного из фекалий человека «Blastocysts hominis» [160]. Длительное время бластоцисты относили к бластомицетам. Считалось, что бластоцисты принадлежат к непатогенным грибкам, дрожжам, которые достаточно часто выявляются при рутинном исследовании анализа кала и длительное время они не привлекали внимания специалистов как энтеропатогены.

В дальнейшем на основании данных электронной микроскопии в 1967 году С.Н. Zierdt [163] отнес их к типу Protozoa. Исследованиями С. Н. Zierdt [165, 166, 167] было определено не только таксономическое положение В.hominis, но и получены первые указания на возможную этиологическую роль этих простейших в возникновении кишечной патологии у лиц с иммунной недостаточностью, назвав ее болезнью Зиердта-Гаравелли [125].

С тех пор достаточно часто стали появляться работы, в которых сообщается о важной роли В. hominis в этиологии кишечных расстройств,

сопровождающихся диареей [153]. Современные методы исследования, а именно изучение нуклеотидных последовательностей гена фактора элонгации трансляцииЕР-1 а, подтвердили, что бластоцисты не относятся к грибам [149]. На основании изучения жи