Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиоценоз кишечника человека при бластоцистной инвазии и воздействие Blastocystis hominis на макроорганизм

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиоценоз кишечника человека при бластоцистной инвазии и воздействие Blastocystis hominis на макроорганизм"

На правах рукописи

ИЛЬИНА НАТАЛЬЯ АНАТОЛЬЕВНА

Микробиоценоз кишечника человека при бластоцистной инвазии и воздействие Blastocystis hominis на макроорганизм

03.00.07 - микробиология 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов - 2006

Работа выполнена на естественно-географическом факультете в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова» и медицинском факультете Института Медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Щербаков Анатолий Анисимович доктор биологических наук, доцент Корженевич Вячеслав Исаевич доктор медицинских наук, профессор Куяров Александр Васильевич

Ведущая организация: Самарский государственный медицинский

университет

Защита диссертации состоится « » 2006 г. в ¿^часов

на заседании диссертационного совета Д220.061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335. Тел./факс: (8452) 69-25-32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005 г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат разослан « » 2006 г.

/

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук лг? л ---Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальность проблемы

Широко распространенное состояние дисбиоза кишечника свидетельствует о наметившемся сдвиге в микробном ценозе человека, и является отражением экологического неблагополучия внешней среды (Красноголовед, 1989; Куваева, Ладодо, 1991; Воробьев с соавт., 1996).

Учитывая значительную роль кишечной микрофлоры в защитных функциях макроорганизма, актуальным представляется изучение нарушения стабильности микробиоценоза кишечника при различных патологиях желудочно-кишечного тракта. Дисбиоз кишечникавыявляется у 70 % больных с патологией гастродуоденалышй зоны и гепатобилиарной системы, в 100 % случаях при заболеваниях кишечника (Дорофеев, Несвижский, 1997; Комаров, Рапопорт, 2000; Walker, 2005).

Дисбиотические расстройства характеризуются, как правило, снижением количественного содержания индигенных облигатно-анаэробных бактерий (бифидобактерий, лактобацилл, бактероидов и т.д.) и изменением количества других условно-патогенных микроорганизмов (стафилококков, синегнойной палочки, грибов рода Candida и др.). Среди условно-патогенных микроорганизмов, способствующих возникновению и поддержанию дисбиотического процесса, помимо бактерий и грибов, значительное место занимают кишечные простейшие, которые в небольшом количестве встречаются в кишечнике практически всех здоровых лиц (Воробьев с соавт., 1996; Бондаренко, 1999; Бухарин, 2000).

Известно, что кишечные паразитозы представляют актуальную эколого-медико-социальную проблему. По данным ВОЗ в России ежегодно регистрируется около 2 млн больных паразитарными болезнями (Сергиев, Лебедева, 1997; Онищенко, 2002).

Наиболее известными возбудителями кишечных расстройств протозойной природы являются' Entamoeba hystolitica, Giardia lamblia и Criptosporidium (Генис, 1979; Крылов, 2004). Менее известна протозойная

инфекция — бластоцистоз, обусловленная паразитированием преимущественно в толстой кишке простейших Blastocystis hominis (Reinthaler et al., 1988; Ziertd et al„ 1988; Чайка, 1992).

Дисбиозы кишечника, обусловленные инвазией Blastocystis hominis, характеризуются длительным течением, особенно на фоне снижения резистентности макроорганизма (Потатуркина-Нестерова с соавт., 2001). С биологических позиций это одна из распространенных форм функционирования биологической системы «паразит — хозяин», которая представляет собой эволюционно прогрессивную форму симбиоза, определяющее развитие и взаимоадаптацию микроорганизма и макроорганизма (Одум, 1986; Нетрусов с соавт., 2004). При этом данная система с медицинской точки зрения проявляется в виде носительства — одна их форм инфекционного процесса, при которой наступает динамическое равновесие между микроорганизмами и макроорганизмом с развитием иммуноморфологических реакций и антительного ответа (Беляков с соавт., 1987; Бондаренко, Горская, 1992).

В связи с этим, актуальным представляется рассмотрение взаимной адаптации Blastocystis hominis и макроорганизма, а именно инвазии и персистенции патогеном экологической ниши и механизмов защиты макроорганизма. В этом плане особого внимания заслуживает изучение преодоления Blastocystis hominis «экологического барьера» - противодействия со стороны представителей индигенной микрофлоры и формирования устойчивого биоценоза кишечника (Бухарин, 1990; Соколов, 1990; Леванова, Алешкин, 2002).

В ряде работ (Валышсв, Зыкова, Коннова, 1994; Зыкова, Челпаненко, 1994) при расшифровке взаимодействия патогенов и макроорганизма, в частности для выявления причинно-следственных связей дисбиозов, активно обсуждаются факторы персистенции, обеспечивающие длительное выживание возбудителя в организме хозяина. Естественно, в зависимости от вида патогена, механизмы его персистирования и патогенности различны. Однако

подавляющее большинство микроорганизмов продуцируют секретируемые факторы деградации защиты хозяина уклоняясь от нее, обеспечивая себе персистирование в организме (Сомов, Литвин, 1988; Бухарин, 1994; Прозоровский с соавт, 1994).

Одновременно важным является рассмотрение адаптаций организма хозяина при инвазии Blastocystis hominis. Одними из наиболее чувствительных к действию инфекционных агентов защитных систем организма являются системы крови и иммунитета. Существует достаточное количество сообщений (Борисов, Смирнов, 1994; Рязанцева, Новицкий, Степовая, 2003; Новицкий, Уразова, 2004; Рязанцева, Новицкий, 2004) о ключевой роли данных систем в обеспечении противоинфекционной защиты, однако значение их при бластоцистозе до сих пор не изучено.

Расшифровка механизмов реагирования и ответа (в том числе иммунного) со стороны макроорганизма на внедрение и персистирование Blastocystis hominis открывает перспективы решения фундаментальных проблем биологии - понимание природы носительства микроорганизмов, выявления причинно-следственных связей дисбиозов; совершенствования оценки микробного состава кишечника, наконец, создание основ микроэкологического мониторинга микробных сообществ макроорганизма.

Цель работы — теоретическое обоснование и разработка оценки микробиоценоза кишечника как «экологического барьера» при бластоцистозе и изучение взаимоадаптаций системы Blastocystis hominis — макроорганизм.

Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Разработать систему мониторинга микробного состава кишечника гастроэнтерологических больных при бластоцистозе и практически здоровых людей.

2. Охарактеризовать структуру микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных и практически здоровых людей при инвазии Blastocystis hominis для анализа противодействия нормальной микрофлоры патогенам.

3. Произвести морфофизиологическую оценку выделенных штаммов Blastocysts hominis с целью определения биологически активной морфологической формы, способствующей длительной инвазии микроорганизма в кишечнике.

4. Определить степень вирулентности Blastocysts hominis путем выявления антиинтерфероновой, энтеротоксической активности и чувствительности к антипротозойным препаратам как механизмов реализации экологической ниши.

5. Выявить морфофункциональные свойства эритроцитов и количественные изменения лейкоцитов периферической крови при бластоцистозе на модели экспериментальных животных (кроликах, крысах) с целью расшифровки механизмов реагирования макроорганизма на внедрение и персистирование Blastocysts hominis.

6. Исследовать показатели клеточного и гуморального иммунитета на модели экспериментальных животных при инвазии Blastocysts hominis для объяснения адаптаций макроорганизма к патогену.

Научная новизна

Впервые разработана система мониторинга микробиоценоза кишечника, включающая комплексную оценку протоценоза и микрофлоры кишечника гастроэнтерологических больных, 'позволяющая повысить степень выявления дисбиозов, и получения унифицированных данных инвазивности Blastocysts hominis (Рационализаторское предложение №1 от 05.10.2005). Установлена высокая инвазивность кишечными паразитами - 89,43 %, что сопровождалось снижением обсемененности представителей индигенной микрофлоры и повышенным содержанием транзиторных микроорганизмов.

Впервые установлено нарушение состава микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных при инвазии Blastocysts hominis, которое характеризовалось структурной перестройкой ценотипа, сопровождающейся сменой абсолютных доминант (бифидобактерий, лактобактерий, бактероидов) и появлением среди них грибов рода Candida. Одинаково высокий индекс

постоянства эшсрихий (С-100 %), выделенных у гастроэнтерологических больных и практически здоровых людей свидетельствует об активности «экологического барьера» нормальной микрофлоры кишечника.

Впервые установлено, что степень выраженности дисбиотических изменений микрофлоры кишечника зависит от периода (обострение, ремиссия), продолжительности гастроэнтерологического заболевания и морфологических форм Blastocystis hominis, вегетирующих в кишечнике организма человека.

Впервые описаны безъядерные морфологические формы Blastocystis hominis в фекалиях гастроэнтерологических больных, инвазивность которых в кишечнике сопровождалась диарейным синдромом.

Впервые показана выраженность вирулентных свойств, таких как антиинтерфероновая, энтеротоксическая активности и степень чувствительности к антипротозойным препаратам клинических изолятов Blastocystis hominis, определяющая возможность колонизации экологической ниши и персистенции микроорганизма.

Впервые установлены фазные изменения морфофункциональных свойств эритроцитов и количественного содержания лейкоцитов при экспериментальном бластоцистозе, свидетельствующие о специфичности адаптации макроорганизма к данному патогену.

Впервые установлено, что при экспериментальном бластоцистозе снижение показателей Т-клеточного иммунитета обусловлено преимущественно угнетением Т-хелперного звена, в основе же гуморального иммунитета лежит угнетение генеза IgG, что можно расценивать как форму иммунодефицита.

Практическая значимость

Полученные в работе данные расширяют и углубляют теоретические представления взаимоадаптации Blastocystis hominis и макроорганизма, в частности расшифровывают механизмы выживания патогена в условиях экологического барьера нормальной флоры кишечника.

Разработанная система мониторинга микробиоценоза кишечника:

БИ+КТ-ФЭО-ЦН-М рекомендована и внедрена в практику клинических и бактериологических лабораторий (Акт о внедрении в клиническую и бактериологическую лаборатории Городской больницы №1 г.Ульяновска от 10.10.2005).

Создана твердая питательная среда для культивирования Blastocystis hominis, позволившая выявить основные типичные (вакуолярная, гранулярная и амебоидная) и атипичные (безъядерная) морфологические формы простейших (Патентная справка на изобретение РФ № 2003135444 от 09.12.2003).

Выраженность вирулентных свойств: антиинтерфероновой, энтеротоксической активности и степени чувствительности к антилротозойным препаратам клинических изолятов Blastocystis hominis свидетельствует о реализации экологической ниши данных микроорганизмов, что сопровождается различной степенью дисбиоза кишечника гастроэнтерологических больных.

Разработана экспериментальная модель бластоцистоза с целью рассмотрение адаптации организма хозяина при инвазии Blastocystis hominis (Патент на изобретение РФ № 2224465 от 05.06.2002).

Определение изменений в системе крови (морфофункциональных особенностей эритроцитов и количественных показателей лейкоцитов) в макроорганизме можно рекомендовать при проведении комплексного диагностического обследования гастроэнтерологических больных на бластоцистоз.

По материалам диссертационной работы написаны монография «Бластоцистная инвазия и дисбактериз кишечника». Ульяновск, 2003, 155 с. (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Красноперова Ю.Ю., Нестеров A.C.), практические рекомендации: «Микрофлора кишечника при бластоцистной инвазии» Ульяновск, 2003, 23 с. (соавт. Красноперова Ю.Ю., Потатуркина-Нестерова Н.И, Исаева И.Н., Нестеров А.С, Бурганова Р.Ф.); «Экологическая характеристика микробиоценоза кишечника». Ульяновск, 2004, 23 с. (соавт. Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Потатуркина-Нсстерова Н.И., Бугеро Н.В., Немова И.С., Фалова O.E., Кулагина Г.М., Богомолова JI.K.); «Методы

выявления патогенных простейших кишечника человека». Ульяновск, 2004, 22 с. (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Валкина О.Н.).

Результаты исследования используются в процессе преподавания микробиологии, общей экологии и экологии микроорганизмов на сстсствснно-географическом факультете ГОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.П. Ульянова» (Акт о внедрении от 15.09.2005, утвержденный ректором ГОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова) и на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета (Акт о внедрении от 21.10.2005, утвержденный директором Института Медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработана система мониторинга микробного состава кишечника гастроэнтерологических больных, позволяющая выявлять весь спектр микроорганизмов, в том числе единичные клетки Blastocysts hominis.

2. На основании коэффициентов постоянства определена структура микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных при инвазии Blastocystis hominis, в которой доминирующее положение занимали бифидобактерии, бактероиды и эшерихии, наряду с ними в группу постоянных микроорганизмов входили энтерококки, грибы рода Candida, тогда как у практически здоровых данные микроорганизмы являлись представителями транзиторной флоры.

3. В фекалиях и при культивировании В. hominis выявлены цисты, основные морфологические формы бластоцист: вакуолярные, реже гранулярные, амебоидные клетки обнаружены только в культуре и атипичные безъядерные клетки. Отмечен высокий уровень антиинтерфероновой активности среди штаммов гранулярной и амебоидной форм, что обеспечивает длительную персистенцию данных микроорганизмов.

4. Длительное персистирование в кишечнике макроорганизма Blastocystis hominis обусловлено выраженной степенью вирулентных свойств, таких как антиинтерфероновая, энтеротоксическая активность и степень чувствительности к антипротозойным препаратам.

5. При экспериментальном бластоцистозе показаны изменения морфофункциональных свойств эритроцитов и количественных показателей лейкоцитов, что свидетельствовало о специфическом реагировании макроорганизма на внедрение и персистирование Blastocystis hominis.

6. Персистенция Blastocystis hominis в организме экспериментальных животных сопровождается депрессией клеточного и гуморального звеньев иммунитета.

Апробация работы

Результаты работы доложены и обсуждены на XVIII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова РФ (Казань, 2001), XVIII Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и патология пищеварения» (Геленджик, Краснодар, 2002), VIII Российской гастроэнтерологической неделе (Санкт-Петербург, 2002, 2003), Всероссийской научной конференции «Клещевые и паразитарные болезни» (Санкт-Петербург, 2002), Всероссийской научной конференции «Проблема инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002), Международном Фальк-симпозиуме «Gl Inflammation and Disturbtd Gut Function: The Challenge of New Concepts» (Германия, Фрайбург, 2002), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы мониторинга экосистем антропогенно — нарушенных территорий» (Ульяновск, 2003), II Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2003), IV Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2003), V Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург — Гастро - 2003» (Санкт-Петербург, 2003), Всероссийской научно-

практической конференции «Роль социальных, гигиенических и биологических факторов в становлении возрастных особенностей здоровья населения» (Пенза, 2003), IV Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая природная среда и экологическое образование и воспитание» (Пенза, 2004), Сибирской зоологической конференции (Новосибирск, 2004), региональной конференции «Экологические и фаунистические исследования в Поволжье» (Ульяновск, 2004), Выездном пленуме «Новые горизонты гастроэнтерологии» (Новосибирск, Москва, 2004), II Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и охраны природы. Пути их решения» (Ульяновск, 2004), Заседании областного отделения Всероссийского общества эпидемиологов и микробиологов (Ульяновск, 2005).

Публикации

По теме диссертации получены: 1 патент на изобретение Российской Федерации, 1 приоритетная справка на изобретение Российской Федерации, 1 удостоверение на рационализаторское предложение, опубликовано 53 работы, в том числе 1 монография, 3 практические рекомендации и 27 статей (в том числе 11 в центральных журналах и 1 в зарубежной печати) и 22 тезиса (Российские и международные конференции, симпозиумы и съезды).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 263 источника и приложений. Диссертация изложена на 307 страницах машинописного текста, иллюстрирована 53 таблицами и 49 рисунками.

Собственные исследования

Материалы и методы

Исследование микробного пейзажа кишечника проводили в период с 1998 по 2004 года на базах клинико-диагностических лабораторий городской больницы №1 и больницы скорой медицинской помощи г.Ульяновска.

При выполнении работы было обследовано 460 человек, из них 350 - с заболеваниями органов пищеварения, находившихся на стационарном лечении с диагнозами: язвенная болезнь (20,57 %), хронический гастрит (17,43 %), хронический холецистит (6,0 %), цирроз печени (1,71 %), желчно-каменная болезнь (9,43 %), опухоль ободочной кишки (0,57 %), синдром раздраженной кишки (11,71 %), неспецифический язвенный колит (15,43 %), хронические гепатиты (В, С) (16,57 %) и синдром оперированного желудка (0,57 %). Контрольную группу составили 110 практически здоровых лиц. Изучение микробного состава кишечника проводили согласно Приказу № 535 от 22.04.1985 МЗ РСФСР «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях и лсчсбно-профилактических учреждениях». При этом определяли качественный и количественный состав микрофлоры кишечника в пересчете на 1 г фекалий. Посев фекалий ■ осуществляли на дифференциально-диагностические и элективные среды: Эндо, Плоскирева, Сабуро, Блаурокка. При этом учитывали общее количество бактерий семейства Еп1егоЬас1еНасеае, лактобацилл, бифидобактерий, стафилококков, стрептококков и дрожжеподобных грибов. Таксономическую принадлежность изолированных микроорганизмов оценивали на основании изучения их морфологических, тинкториальных свойств, способности к росту в аэробных и/или анаэробных условиях, характеру роста на селективных средах, а также по биохимическим и антигенным свойствам.

Количество микроорганизмов (КОЕ/г) каждого рода подсчитывали по формуле:

для плотных сред: X = 20 • х • п • к, для жидких сред X = 2 • х • к где X — количество микроорганизмов каждого рода (КОЕ/г), п - количество выросших колоний, к — разведение, из которого произведен посев с обратным знаком степени.

Для оценки микробиоценоза использовали метод количественного выделения видов и вариантов' микроорганизмов, входящих в состав

микробиоценоза (Тец, 1997). При определении доли участия разных групп микроорганизмов в структуре микробиоценоза использовали показатель постоянства (Уиттекер, 1980).

Диагноз кишечного дисбактериоза устанавливали только в случае резкого снижения в испражнениях популяции бифидобактерий до 101 КОЕ/г и меньше, лактобацилл до 105 КОЕ/г и меньше, эшерихий до 106 и меньше при одновременном увеличении численности популяции одного и более условно-патогенных микробов: стафилококков, протей, клебсиелл и др. до 104 КОЕ/г и больше, дрожжеподобных грибов до 104 КОЕ/г и больше, а также по появлению гемолитических форм эшерихий до 10 % и более.

При диагностике кишечных простейших и гельминтов использовали систему «Консервант Турдыева — формалин эфирное осаждение — центрифугирование (КТ-ФЭО-МЦН)» (Сергиев, Гордеева, Рагимов, 1994) в собственной модификации, позволяющей выявлять даже единичные клетки микроорганизмов (Рационализаторское предложение №1 от 05.10.2005).

Исследования по выделению и первичной идентификации бластоцист из фекалий проводили на базе клинической лаборатории городской больницы №1 г.Ульяновска. Выявление Blastocysts hominis в препаратах проводили путем микроскопии нативных и окрашенных мазков (х10х40). При необходимости проводили дополнительное окрашивание препаратов по методу Романовского-Гимзе и.железным гематоксилином по Гейденгайну (Аврех с соавт., 1973; Мае Pherson, Mac Queen, 1994). Размеры простейших определяли при помощи окуляр микрометра. Для получения культур простейших В. hominis использовали среды Павловой (Генис, 1979), Zierdt (Белова, 1992), Johnson (Белова, 1992) и Suresh (Suresh, 1994).

Микрофотографии сделаны с использованием микроскопа «Биолам I», масляная иммерсия х 1000.

Эксперименты по изучению взаимоадаптаций биологической системы «Blastocysts hominis — макроорганизм» проводили на нелинейных мышах (23,1+2,2 г), крысах-самцах (220,3±24,9 г) и кроликах породы шиншилла

(3,4+1,3 кг).

Степень выраженности инвазивных свойств В. hominis определяли путем внутрибрюшинного введения белым мышам (массой 23,1±2,2 г) 0,5 мл взвеси культуры простейших, выращенной на среде Suresh СЕМ (Surcsh, 1994). Через сутки у каждого штамма определяли величину LD50. Для оценки вирулентности использовали критерии Ю.В. Резцовой, в соответствии с которыми к высоковирулентным относили штаммы с LD50 от 101 до 103 КОЕ/мл, к умеренновирулентным - от 103 до 106 КОЕ/мл, а штаммы с LD50 свыше Ю6 КОЕ/мл считали слабовирулентными (Костюкова, 1996).

Наличие энтеротоксической активности простейших В. hominis устанавливали в изолированных сегментах топкой кишки кроликов (Авраменко, 1972).

Для обнаружения способности инактивировать бактерицидную основу препарата человеческого лейкоцитарного интерферона -«антиинтерфероновой» активности (АИА) — использовали методику О.В. Бухарина, В.Ю. Соколова (1989). При определении АИА использовали чистые суточные агаровые культуры В. hominis (Приоритетная справка на изобретение РФ № 2003135444 от 09.12.2003). О присутствии «антиинтерферонового» признака у культур В. hominis, судили по наличию роста индикаторной культуры Corynebacterium xerosis № 181 (ГИСК им. JI.A. Тарассвича) на поверхности и вокруг колоний исследуемых культур, свидетельствующем о нейтрализации бактерицидного компонента препарата интерферона в среде.

Для выявления степени антипротозойной активности определяли ингибирующую концентрацию химиопрепарата (метронидазол, тинидазол, орнидазол), вызывающего задержку роста В. hominis. В работе использовали 6-суточную культуру В. hominis, так как в эти сроки отмечался их максимальный рост, концентрация простейших в среде составляла 1 -2 млрд/мл.

Кишечный бластоцистоз воспроизводили по методике К.Т. Мое (1997) в собственной модификации (Патент на изобретение РФ № 2224465 от

05.06.2002) на крысах-самцах массой 220,3124,9 г. Для этого животным вводили 106 — 107 кл/мл вакуолярной формы В. hominis per os с помощью градуированной пипетки, снабженной капиллярным наконечником. Затем у животных определяли:

- морфофункциональные свойства эритроцитов периферической крови: морфометрические показатели (количество, объем, размеры) при помощи счетчика микрочастиц «Pikoskal PS-4», средний размер эритроцитов рассчитывали методом линейной интерполяции (Ламинадзе с соавт., 1990), проточного цитометра «Epies-C» (Кисляков с соавг., 1990); осмотическую резистентность эритроцитов (Меньшиков, 1987); содержание в них гемоглобина гемоглобинцианидным методом (Меньшиков, 1987); активность глутатионредуктазы эритроцитов методом спектрофотометрии по G. Carlberg (1975) в модификации Е.М. Сорокина (1980); активность К+, Na+ - АТФ-азы эритроцитов (Кузенков с соавт., 1984);

- морфофункциональные свойства лейкоцитов: общее количество, соотношение форменных элементов счетчиком микрочастиц «Pikoskal PS-4»; осмотическую резистентность (Меньшиков, 1987); в миелограммс определяли созревание нейтрофилов (Гаврилов, Козинец, Черняк, 1985);

иммунологические исследования: подсчет основных классов лимфоцитов и их субпопуляций производили реакцией спонтанного розеткообразования (Брондз, 1987; Купер, Керни, Шер, 1987), Т-супрессоров-реакцией бластной трансформации (РБТЛ), цитопатогенное действие лимфоцитов — тестом деструкции монослоя аллогенных фибробластов (Трунова с соавт., 1966), концентрацию циркулирующих иммунных комплексов (Digeoni et al., 1977), количественное определение сывороточных иммуноглобулинов классов М, G, А (Меньшиков, Делекторская, Золотницкая, 1987).

Для гистологических исследований из образцов толстой кишки готовили срезы согласно общепринятым методикам (Комарова, Цизерлинг, 1999) и окрашивали гематоксилином и эозином, в ряде случаев использовали

окрашивание пикрофуксином по методу Ван-Гизона, Суданом, проводили Шик-реакцию (Волкова, Елецкий, 1982).

Полученные данные всех экспериментов подвергали статистической обработке по общепринятым методам с использованием t-критерия Стыодента. Для статистической обработки экспериментальных данных также использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2000.

Результаты исследований и их обсуждение

Нами была разработана система мониторинга микробного пейзажа кишечника включающая бактериологическое исследование и изучение протоценоза по схеме «КТ-ФЭО-ЦН-М» (Рационализаторское предложение №1 от 05.10.2005), которая позволила дать подробный сравнительный анализ микробиоценоза кишечиика гастроэнтерологических больных и практически здоровых лиц.

Мониторинг паразитофауны кишечника гастроэнтерологических больных показал высокую зараженность кишечными паразитами 89,43 %, в том числе простейшими - 83,72 %, гельминтами - 9,14 %. Получены данные о видовом составе паразитофауны и ассоциациях паразитов кишечника у гастроэнтерологических больных. Выявлены 14 видов кишечных паразитов: 9 видов простейших (5 видов саркодовых, 2 вида жгутиковых, 1 вид инфузорий и 1 вид кокцидий) и 4 вида гельминтов (1 вид трематод, 1 вид цестод, 2 вида нематод). Определены доминирующие виды паразитов: простейшие -Blastocystis hominis, Lamblla intestinalis, гельминты - Enterobius vermicularis, причем В. hominis преобладали из всех выявленных видов (77,71 %), что возможно объяснить отнесением некоторых авторов В. hominis в группу условно-патогенных микроорганизмов, которые могут заселять в малых количествах кишечник человека и не вызывать дисбиотических изменений, однако при снижении иммунологического статуса организма человека (например, при наличии патологии желудочно-кишечного тракта) бластоцисты активно занимают свободные сайты прикрепления, подавляя, по-видимому,

нормальную флору (рис. 1).

■ Пациенты, инфицированные бластоцистами □ Пациенты, не инфицированные бластоцистами

Рис. 1. Встречаемость Blastocystis hominh среди обследованных

Установлен достаточно высокий удельный вес (28,75 %) монониппазий простейшими В. hominis в структуре пораженное™ кишечными паразитами гастроэнтерологических больных, хотя доминировали двухчленные ассоциации (протозойно - грибковые, протозойно - гельминтные, протозойно -протозойные, гельминто - грибковые, гельминто - гельминтные) (63,9 %), тогда как трехчленные ассоциации (бластоцисты - лямблии - грибы, Entamoeba coli -бластоцисты - Ent его bins vermicidaris) и четырехчленные ассоциации встречались крайне редко (0,6 %). Среди диинвазий доминировали протозойно-грибковые ассоциации (48,56 %). Большое видовое разнообразие выянленных паразитов, с одной стороны, и преобладание в паразитофауне ассоциаций паразитов, с другой, определяют необходимость наиболее полного обследования больных с патологией органов пищеварения па кишечные паразиты. Особенно это касается простейших Blastocystis hominis, которые являлись постоянными членами протоценоза кишечника больных. По-

видимому, они являются ко-фактором в развитии заболеваний органов пищеварения.

Инфицированность простейшими В. hominis среди лиц, страдающих заболеваниями органов пищеварения составила 77,71 %. Говоря о нозологической структуре обследованных больных, следует отметить, что при всех хронических заболеваниях органов пищеварения бластоцисты обнаруживаются значительно чаще, чем у практически здоровых лиц (6,3 %). Причем наиболее высокие показатели инфицированности данными простейшими установлены при язвенной болезни - 72,22 %, хроническом гастрите - 67,21 % и хроническом холецистите - 71,42 %.

Для анализа функции «экологического барьера» - противодействия нормальной микрофлоры патох-енам предстояло охарактеризовать структуру микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных и практически здоровых людей при инвазии Blastocystis hominis. Для решения поставленных задач было проведено клинико-лабораторное обследование больных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта. При выполнении работы было обследовано 382 человека: из них 272 - с патологией органов пищеварения, инвазированных Blastocystis hominis и 110 практически здоровых людей.

Наиболее выраженные изменения зафиксированы со стороны анаэробной флоры. Из представителей облигатно-анаэробной флоры кишечника обследованных больных отмечается снижение бифидобактерий (61,76 %) до значения lg 7,7+0,03 КОЕ/г (в контрольной группе lg 9,1 ±0,3 КОЕ/г у 100 % обследованных). Количественное содержание лактобактерий и бактероидов также претерпевало значительные изменения, данные бактерии выявлены в 36,4 % и 65,07 % (в контроле 100 % и 73,64 %) случаев соответственно. Показатели уровня содержания данных микроорганизмов составили lg 7,3 + 0,04 КОЕ/г и lg 8,5 ±0,04 КОЕ/г (в контроле - lg 8,4 ±0,2 КОЕ/г и lg 10,8 ±0,3 КОЕ/г), соответственно. Дефицит эшерихий был зарегистрирован только у 2 обследованных (0,74 %). По сравнению с другими представителями эндогенной флоры эшерихии были выявлены почти у всех

обследованных - 99,26 % (в контроле - 100 %), при этом обсемепенность их снизилась до lg 5,2±0,2 КОЕ/г, тогда как в контрольной группе содержание данных бактерий составляло lg 7,7±0,3 КОЕ/г. Наряду с этим, характерным микроорганизмом для микробного пейзажа кишечника гастроэнтерологических больных, иивазированных Blastocystis hominis являлась кишечная палочка с гемолитическими свойствами. Частота обнаружения данных бактерии составила 44,12 %, со средним значением lg 5,7 + 0,2 КОЕ/г (в контроле не обнаружены).

Для других представителей микробиоценоза кишечника больных, иивазированных Blastocystis hominis, таких как клебсиелл, стафилококков характерно повышенное содержание в 43,38 % и 45,59 % случаев (в контроле данные микроорганизмы выявлялись в 8,18 % и 18,18 % случаев). Уровень их содержания составил lg 5,1 ±0,2 КОЕ/г и lg 6,0±0,05 КОЕ/г соответственно (в контрольной группе lg 3,3 ±0,1 КОЕ/г и lg 4,0 + 0,4 КОЕ/г). Входя в состав факультативной микрофлоры кишечника и превышая количество 105 КОЕ/г -для клебсиелл и 103"4 КОЕ/г - для стафилококков, а также при снижении резистентности организма человека, данные микроорганизмы способны вызывать дисбактериозы кишечника (Покровский, Поздеев, 1999).

Помимо этих представителей условно-патогенной флоры, также высевали в значительных количествах бактерии рода Proteus и Enterococcus, которые были выявлены у 55,88 % и 72,06 % больных, тогда как в контрольной группе они обнаружены у 10,9 % и 25,45 % людей. Количественное содержание данных микроорганизмов составляло lg 5,4±0,3 КОЕ/г и lg 7,6± 0,1 КОЕ/г, что превышало данные показатели в контрольной группе - lg 3,6±0,1 КОЕ/г и lg 4,8 ± 0,4 КОЕ/г, соответственно.

Дрожжеподобные грибы рода Candida в норме редко обнаруживались у здоровых (10,0 % обследованных), при этом средняя арифметическая величина обсемененности была весьма незначительной lg 3,1 ±0,5 КОЕ/г. Однако при микробиологическом обследовании людей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта, иивазированных В. hominis, они были выявлены в

количествах, превышающих 104 КОЕ/г в 67,28 % случаев (lg 5,9± 0,06 КОЕ/г).

Представители рода Clostridium обнаруживались у 23,9 % (65 человек) обследованных больных, тогда как у здоровых этот показатель составил -7,7 % (8 человек), однако уровень содержания данных микроорганизмов был относительно одинаков (lg 6,3 ±0,1 КОЕ/г и lg 6,6 ± 0,2 КОЕ/г, соответственно).

Таким образом, сравнительный анализ микробиоценозов кишечника здоровых людей и гастроэнтерологических больных при инвазии Blastocystis homirtis показал значительное сокращение частоты встречаемости анаэробов рода Bifidobacterium до 61,76 %, Lactobacillus до 36,4 %, Bacteroides до 65,07 %, тогда как у практически здоровых людей эти показатели в основном составляли 100 %, для бактероидов - 73,64 %. Среди всех эндогенных бактерий кишечника только эшерихии обладали высокой частотой обнаружения как у практически здоровых людей (100 %), так и у гастроэнтерологических больных при инвазии В. hominis (99,26 %). Обращает на себя внимание появление в группе больных гемолитической кишечной палочки у 44,12 % обследованных (lg 5,7±0,2 КОЕ/г). При этом в данной группе больных выявлено возрастание высеваемости и частоты обнаружения следующих микроорганизмов: бактерий родов Enterococcus, Proteus, Klebsiella, Staphylococcus и грибов рода Candida, что свидетельствует о дисбиотическом нарушении микробиоценоза кишечника.

В микроэкологических исследованиях для оценки качественных и количественных параметров микробиоценоза использовали показатели, принятые в теоретической экологии (Шендеров, 1991). Для выяснения структуры симбиотических взаимоотношений были изучены индексы постоянства различных таксонов, формирующих микрофлору кишечника больных при инвазии В. hominis и практически здоровых людей. В зависимости от полученных значений все таксоны подразделили на постоянные (С>50 %), добавочные (25 %<С>50 %) и случайные (С<25 %) (Домбровский, Бодягина, 1986).

На основании коэффициентов постоянства определили структуру микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных при инвазии

простейших В. hominis и практически здоровых людей (табл. 1).

Таблица 1

Структура кишечного микробиоценоза обследованных

№ Гастроэнтерологические больные, инвазированные Blastocystis hominis Практически здоровые люди (контроль)

Представители микробиоценоза Показатель постоянства (С)% Представители микробиоценоза Показатель постоянства (С)%

Доминирующая группа

1. Escherichia 99,26 Bifidobacterium 100,0

2. Enterococcus 72,06 Lactobacillus 100,0

3. Candida 67,28 Escherichia 100,0

4. Bacteroides 65,07 Bacteroides 73,64

5. Bifidobacterium 61,76

6. Proteus 55,88

Добавочная группа

1. Staphylococcus 45,59 Enterococcus 25,45

2. Гемолитическая кишечная палочка 44,12

3. Klebsiella 43,38

4. Lactobacillus 36,40

Транзиторная группа

1. Clostridium 23,90 Staphylococcus 18,18

2. Proteus 10,90

3. Candida 10,0

4. Klebsiella 8,18

5. Clostridium 7,27

Полученные данные позволили считать, что доминирующими видами в кишечной микрофлоре практически здоровых людей являлись бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии с индексом постоянства 100 %, также в данную

группу входили бактероиды (С= 73,64 %). Группа добавочных сочленов микробиоценоза была представлена одним родом — Enterococcus (С=25,45 %). Большое разнообразие наблюдалось в транзиторной группе, в которую входили следующие микроорганизмы родов Staphylococcus (С=18,18 %), Proteus (С=10,9 %), Candida (С=10,0 %), Klebsiella (С=8,18 %) и Clostridium (С=7,27 %).

Анализ ценотипа кишечника больных, инвазированных В. hominis показал смену доминирующих и добавочных микроорганизмов. В состав доминирующей группы на фоне снижения показателей постоянства индигенной флоры (бифидобактерий до С=61,7б %, бактероидов до С=65,07 %) вошли представители микробиоценоза кишечника, индекс постоянства которых по сравнению с контролем значительно возрос: энтерококки (С=72,06 %), грибы рода Candida (С=67,28 %) и протеи (С=55,88 %). Отмечали высокий показатель постоянства, как и в контрольной группе обследованных, так и в группе больных для эшерихий с нормальной ферментативной активностью (С=99,26 %). Изменение иерархии отмечали также в структуре добавочных видов. Так, показатель постоянства для рода стафилококков и клебсиелл возрос - от 18,18 % до 45, 59 % и от 8,18 % до 43,38 %, соответственно, в связи с этим для них характерен переход с транзиторной группы в добавочную. В данной группе появляются новые члены микробиоценоза — лактобактерии (С=36,4 %), которые в контрольной группе были доминирующими и гемолитическая кишечная палочка,(С=44,12 %). Транзиторная группа была представлена только клостридиями, индекс постоянства которых по сравнению с контрольной группой также повысился (С=23,9 %), для остальных микроорганизмов характерен переход в доминирующую и добавочную группы. Таким образом, проведенные исследования показали, что ценотип кишечника гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии характеризовался снижением доминирования основных симбионтов, таких как Bifidobacterium (до С=61,76 %), Lactobacillus (до С=36,4 %) и Bacteroides (до С=65,07 %) и увеличением индекса постоянства транзиторной микрофлоры грибов рода Candida (до С=67,28 %), Enterococcus (до С=72,06 %) и Proteus (до С=55,88 %),

при этом функция «экологического барьера» микрофлоры поддерживалась бактериями рода Escherichia (С=99,26 %). Однако, появление среди резидентных видов у больных, инфицированных бластоцистами энтерококков, грибов Candida и протей в ассоциации с представителями облигатной флоры (бифидобактерии, эшерихии и бактероиды) свидетельствовали о развитии дисбиоза кишечника.

Изучение морфологических особенностей бластоцист выявило наличие в фекалиях вакуолярной и гранулярной форм, а так же цист этих простейших. Так, в фекалиях и культуре преобладали вакуолярные формы. На их долю приходилось 73,16 % в препаратах, приготовленных из фекалий больных и 57,35 % в препаратах из культуры. Гранулярная форма встречается в препаратах из кала реже (22,06 %), чем в препаратах из культуры (32,72 %). Амебоидная форма обнаруживалась только в культуре (4,78 %). Впервые при культивировании Blastocysts hominis на твердой питательной среде и в фекалиях гастроэнтерологических больных обнаружена нетипичная безъядерная морфологическая форма клеток, которая по сравнению с другими морфологическими формами имела более крупные размеры (до 35 мкм).

Для успешного внедрения • и более длительного персистировапия в организме хозяина микроорганизмам необходимы определенные биологические свойства, направленные на подавление механизмов резистентности хозяина (Бухарин, 1994). К таким механизмам относятся энтеротоксическая, антиинтерфероновая активность и чувствительность к аитипротозойным препаратам и др., характерные для патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, меняющих свою экологическую нишу и создающих предпосылки ' как для формирования, так и для хронизации инфекционного процесса (Бухарин, 1992).

С целью изучения воздействия бластоцист на макроорганизм было проведено изучение энтеротоксигенных, антиинтерфероновых свойств и чувствительности к аитипротозойным препаратам простейших Blastocysts hominis с их количественной характеристикой.

Исследования по определению степени вирулентности бластоцист показали, что из 174 клинических изолятов В. hominis, только 102 (58,62 %) обладали патогенностью, причем показатель LD50 в lg этих культур варьировал от 2,7±0,2 до 5,2±0,1. Наибольшее количество культур (92,16 %) обладало выраженными патогенными свойствами, тогда как всего 8 культур имели слабо выраженную патогенность (2,7±0,1 - 3,2±0,3). Таким образом, клинические изоляты В. hominis, выделенные у гастроэнтерологических больных, обладают различной степенью вирулентности, что, на наш взгляд, является одним из механизмов воздействия на макроорганизм.

С целью выявления способности В. hominis и их фильтратов вызывать воспалительную реакцию тонкой кишки был использован метод заражения изолированных лигатурами сегментов тонкой кишки кроликов. При изучении влияния взвеси бластоцист, изолированных из организма здоровых людей и их фильтратов установлена отрицательная реакция во всех изолированных сегментах тонкой кишки кроликов. Лишь два штамма вызывали легкую гиперемию сегментов и выпот в их просвет 0,3 - 0,4 мл экссудата. Однако индекс дилатации и в этих случаях был меньше единицы, что расценивается как отрицательная реакция.

При введении в просвет изолированных сегментов бластоцист, выделенных у людей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта и их фильтратов установлено, что из 49 штаммов - 18 вызывали резко выраженную реакцию (ИД>2,0), 14- выраженную реакцию (ИД>1,0), 7— отрицательную реакцию (ИД<1,0). Таким образом, бластоцисты выделенные у больных обладают более активной способностью вызывать выраженные воспалительные реакции в тонкой кишке, чем штаммы, изолированные у здоровых (рис. 2).

Рис. 2. Положительная реакция изолированных сегментов тонкой кишки кроликов

Микроорганизмы в силу своей высокой биологической пластичности и тесной интегрированное™ в процессы эволюции, одними из первых реагируют на изменение качества среды обитания (Бухарин, 1992). Приспособляемость простейших В. hominis к различным экологическим нишам, с учетом закона конкурентного исключения Вольтера Гаузе предполагает преимущества тех организмов, которые обладают определенными биологическими свойствами, обеспечивающими устойчивое существование микроорганизмов в соответствующей экологической нише. Исходя из вышеизложенного, перспективным представляется изучение факторов псрсистснции бластоцист, поскольку именно эти свойства сообщают простейшим устойчивость к защитным механизмам хозяина, обеспечивают стабильность

антагонистических отношений в биоценозах. Изучение свойства бактерий инактивировать систему человеческого лейкоцитарного интерферона определено как антиинтерфероновая активность микроорганизмов (Бухарин, Соколов, 1988; Усвяцов, 1994). Однако, до настоящего времени изучение этого признака было проведено только среди представителей бактериальной флоры, в то время как данное свойство у возбудителей протозоозов, в частности,

бластоцистоза, остается практически не изученным. Антиинтерфероновая активность (АИА) широко представлена у простейших В. hominis, изолированных у людей с патологией пищеварительного тракта с инвазией бластоцист (73,33 %). Уровень АИА у бластоцист был неодинаков. Доля штаммов с низкими значениями АИА составила 53,53 % (53 штамма), со средним и высоким уровнями — 27,27 % (27 штаммов) и 19,19 % (19 штаммов) соответственно. Отмечено, что АИА бластоцист зависела от определенной морфологической формы. Высоким уровнем АИА обладали штаммы 1ранулярной и амебоидной форм. Уровень антиинтерферонового признака коррелировал с показателями патогенности бластоцист (рис. 3).

Рис. 3. Антиинтерфероновая активность бластоцист

Антибиотикорезистентность является одной из важнейших характеристик патогенности микроорганизмов (Чахава с соавт., 1982, 1987; Смирнова, Сиченко, Романова, 1989; Машковский, 2000). В связи с этим, следующим этапом нашей работы явилось изучение чувствительности к антипротозойным препаратам бластоцист, выделенных у больных с разной продолжительностью заболеваний, а также в зависимости от их стадии — обострение или ремиссия. Все выделенные штаммы бластоцист обладали различной чувствительностью к антипротозойным препаратам. Наибольшее количество изолятов было чувствительно к тинидазолу (52,4 %) и метронидазолу (47,8 %), менее

выражено данное свойство было по отношению к орнидазолу (21,6 %). Это подтвердилось результатами определения минимальной ингибирующей концентрации, для тинидазола она составила 10'3 мг/мл, метронидазола -10"4 мг/мл и орнидазола 10"3 мг/мл. Однако, значительная часть изолятов обладала выраженной резистентностью к антипротозойным препаратам: к тинидазолу и метронидазолу - 20,7 %, к орнидазолу - 45,0 %. Определение антибиотикорезистентности бластоцист к изученным препаратам показало некоторые различия в периоды обострения и ремиссии заболеваний желудочно-кишечного тракта. Так, при обострении наибольшее количество чувствительных штаммов обнаружено к тинидазолу и метронидазолу 52,4 % и 47,8 % соответственно. В период ремиссии количество штаммов, проявивших чувствительность, увеличилось до 56,7 % к тинидазолу и 54 % к метронидазолу. Отмечена зависимость изученных свойств от вирулентности изолятов, проявивших умеренную устойчивость к антипротозойным препаратам (г = 0,62).

Одними из наиболее чувствительных к действию инфекционных агентов защитных систем организма является система крови и иммунитета. Известно, что различные по своей природе болезнетворные и условно-патогенные микроорганизмы могут оказывать структурно-функциональную дезорганизацию клеток крови. В связи с этим, следующим этапом нашей работы явилось изучение морфофункциональных и морфометрических характеристик клеток крови (Новицкий, Уразова, 2004). Установлено, что эритроциты обладают большой чувствительностью к воздействию токсических веществ (Калинина, Чещевик, 1990). Следовательно, возможно было предположить, что бластоцисты могут оказывать на эритроциты токсическое воздействие. Изучение влияния простейших В. hominis на количество эритроцитов крови кроликов проводили в различные сроки от начала вскармливания животных: через 10, 20, 30, 40 и 75 суток. Исследования показали значительное изменение количества, объема эритроцитов, содержания гемоглобина, их осмотической, резистентности, а также активности

глутактионредуктазы и Na+, К+- зависимой АТФ-азы эритроцитов иод действием простейших В. hominis. Обращает на себя цикличность изменения этих показателей. Уже на 10 сутки от начала эксперимента у животных опытной группы наблюдалось увеличение количества эритроцитов-5,14±0,83-109/л. Па 20 сутки от начала эксперимента количество эритроцитов снизилось до 4,38+0,2Ы09/л (в контрольной группе - 4,23±0,2-109/л). Снижение количества эритроцитов у животных продолжало и на 40 сутки -3,56±0,08-109/л (у контрольных кроликов - 4,07+0,07- 109/л.). На 75 сутки от начала исследования количество эритроцитов у опытных животных составляло лишь 2,79±0,16-10ч/л (у кроликов контрольной группы оставалось в прежних пределах). Полученные данные свидетельствуют о резких изменениях количественных показателей популяции эритроцитов при длительном вегетировании бластоцист в толстой кишке животных. Параллельно с изучением динамики количества эритроцитов, в те же сроки, было проведено изучение объема эритроцитов кроликов, то есть их качественной характеристики, установлено, что через 20 суток от начала эксперимента наблюдалось увеличение объема эритроцитов животных опытной группы до 9,3±0,09 мкм3, а через 30 суток - снижение до 7,4±0,14 мкм3. В последующие сроки наблюдалось дальнейшее уменьшение объема эритроцитов: через 40 суток - до 6,7±0,13 мкм3 и через 75- до 5,7±0,22 мкм3. Таким образом, впервые было установлено, что при экспериментальном бластоцистозе происходит циклическое изменение морфометрических показателей эритроцитов. В доступной литературе аналогичных исследований пс обнаружено, но известно, что эритроциты участвуют в нейтрализации токсических веществ, так как их оболочка играет роль универсального адсорбента (Владимиров, 1989, Рязанцева, Новицкий, Степовая, 2003, Рязанцева, Новицкий, 2004). Длительное вегетирование простейших В. hominis в организме кроликов вызывало изменение количества гемоглобина в эритроцитах этих животных. Данные свидетельствуют о снижении гемоглобина на 10 сутки от начала эксперимента у опытных животных по сравнению с

контрольными (11,60+0,05 г/% и 13,32±0,05 г/% соответственно). Затем количество гемоглобина у кроликов опытной группы резко увеличивалось и на 20 сутки достигало максимума (15,80±0,68 г/%), в то время как количество гемоглобина у контрольных животных не изменялось (13,30X0,36 г/%). Через 75 суток от начала эксперимента количество гемоглобина у опытных животных снижалось почти в 2 раза (5,81±1,09 г/%), как по сравнению с началом эксперимента, так и в отношении к показателям контрольной группы 13,33±0,28 г/%). Таким образом, в первые 20 суток наблюдалось увеличение количества, размеров, объема эритроцитов и содержания в пих гемоглобина, что, по-видимому, возможно объяснить компенсаторными реакциями, проявляющимися, в частности, в усилении гемопоэза.

В основе снижения вышеперечисленных параметров, наступающего через 30 суток и продолжающегося до конца эксперимента, лежат, видимо, изменения биохимических процессов в мембранах эритроцитов, а также снижение их резистентности. Известно, что за осмотическую устойчивость эритроцитов принимают то значение осмомолярности среды, при котором степень гемолиза достигает 50 % (Петренко, Владимиров, 1987). Результаты проведенных исследований выявили снижение осмотической резистентности эритроцитов у животных опытной группы в первые 10 суток. Затем, наступало резкое увеличение показателей осмотической резистентности, и через 20 суток от начала эксперимента они достигали максимума. С 30 суток и до конца эксперимента наблюдалось снижение осмотической резистентности, тогда как у контрольных животных она на протяжении всего опыта не изменялась. Однако, одна лишь резистентность не является в полной мере показателем свойств структуры мембраны без параллельных биохимических измерений. Для понимания физиологических процессов, протекающих в эритроцитах, несомненную важность имеет изучение активности К+-АТФ-азы и

глутатионредуктазы. С ферментом Ка+,К^-АТФ-азы связана скорость гликолиза, а именно обеспечение активного обмена через мембрану ионов и К+. В течение всего периода наблюдения активность Ыа+,К+-ЛТФ-азы

падала и на 75 сутки достигала 0,022±0,002 нмоль, что почти в 3 раза меньше по сравнению с началом опыта и почти в 4 раза меньше по сравнению с контролем (0,089+0,001 нмоль), что, по-видимому, объясняется нарушением работы «натриевого насоса». В результате снижения активности К'а+,К+-АТФ-азы уменьшается скорость гликолиза, нарушается энергетический обмен клеток. Следствием этого является раннее старение эритроцитов, что приводит к увеличению их объема. В реакциях гликолиза участвует и глутатионредуктаза, являющаяся ферментом антиокислительной защиты. Известно, что при ее недостаточности уменьшается продолжительность жизни эритроцитов, поэтому в собственных исследованиях мы определяли активность глутатионредуктазы эритроцитов кроликов при экспериментальном бластоцистозе. Изменение активности данного фермента отличалось от динамики активности На+,К+-АТФ-азы тем, что не носило циклический характер. Уменьшение активности глутатионредуктазы отмечалось уже на 10 сутки. На 75 сутки активность глутатионредуктазы эритроцитов животных опытной группы резко снижалась и достигала 1,63±0,20 нмоль, что почти в 5 раз меньше по сравнению с началом эксперимента и почти в 8 раз меньше по сравнению с контролем (12,98±0,35 нмоль). Поскольку в системе крови высоко чувствительны к персистированию простейших не только эритроциты, но и лейкоциты, в следующей главе было изучено воздействие бластоцист на эти форменные элементы.

В процессе исследований установлено наличие трехфазного изменения динамики количественного содержания лейкоцитов у экспериментальных животных. В течение первой недели от начала введения простейших В. hominis наблюдали формирование абсолютной лейкопении. С четвертой по двенадцатую недели отмечался период абсолютного лейкоцитоза, который, по-видимому, объясняется мобилизацией компенсаторных механизмов организма животных. К четырнадцатой неделе формируется повторный период лейкопении у животных опытной группы, который можно объяснить истощением механизмов компенсации. Учитывая важную роль лимфоцитов,

как клеток эффекторов иммунологического ответа, определяли их содержание в периферической крови опытных животных. В ходе эксперимента выяснилось, что динамика абсолютного и относительного количества лимфоцитов в целом повторяет колебания количественных значений лейкоцитов.

В связи с тем, что важную роль в механизмах реализации неспецифической резистентности организма играют нсйтрофильные гранулоциты, была изучена динамика их количества в периферической крови. Установлено, что, начиная с 1 недели и до конца эксперимента, у животных формировалась стойкая нсйтропения, подтвержденная показателями лимфоцитарно-нейтрофильного индекса. Результаты исследования костного мозга показали ингибирующее действие бластоцист на процессы миелопоэза, особенно его нейтрофильного ростка, что и явилось причиной развивающейся нейтропении. О степени влияния бластоцист на макроорганизм судили по степени устойчивости лейкоцитов в физиологическом растворе. Подсчет коэффициента распада лейкоцитов животных при экспериментальном бластоцистозе, свидетельствовал об ускорении разрушения лейкоцитов под действием бластоцист. При этом, как показали исследования, значения распада лейкоцитов более информативны, чем простой подсчет лейкоцитов, так как он соответствует тяжести состояния экспериментальных животных. По-видимому, при экспериментальном бластоцистозе значительно увеличивается количество поврежденных лейкоцитов со сниженной устойчивостью мембран. Известно, что клетками эффекторами и регуляторами иммунного ответа являются Т-лимфоциты. В связи с этим было изучено абсолютное и относительное содержание данных клеток в периферической крови животных при бластоцистозе. Уже ко второй неделе эксперимента у животных отмечалась тенденция к абсолютному Т-лимфоцитозу. Увеличение количества Т-лимфоцитов наблюдалось до конца двенадцатой недели. К четырнадцатой неделе, напротив, у животных опытной группы сформировалась абсолютная Т-лимфопения, причем содержание у них Т-лимфоцитов составило 1759,2±78,1 кл/мкл, что было в 1,4 раза меньше, чем у контрольных кроликов (Р<0,001).

Изучение динамики изменений относительного содержания Т-лимфоцитов показало наличие обратной закономерности.

С целью углубления понимания механизмов формирования у экспериментальных животных вторичного иммунодефицита были изучены в динамике показатели иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов. Исследования показали, что к четвертой неделе у экспериментальных животных формировался относительный дефицит теофиллинрезистентных Т-лимфоцитов, то есть клеток с хелперной функцией. В дальнейшем эта тенденция усугублялась, и на 14 неделе показатели относительного содержания теофиллинрезистентных клеток у животных опытной группы были меньше, чем у здоровых контрольных кроликов в 2,2 раза. Количественное содержание теофиллинчувствительных клеток, являющихся преимущественно Т-супрессорами, достоверно не изменялось. В связи с этим происходило постепенное снижение хелперно-супрессорного индекса, что являлось показателем формирования иммунодефицитного состояния.

Наибольшая степень В-лимфоцитоза отмечалась на втором, третьем месяцах, начиная с момента инфицирования бластоцист в толстой кишке животных. Вероятно, формирование В-лимфоцитоза следует объяснить компенсаторной реакцией, интенсивность которой постепенно истощалась.

Для рассмотрения иммунологического ответа макроорганизма были изучены следующие показатели: частота перехода лимфоцитов в бластную форму (РБТЛ-%), уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), цитотоксический индекс (ЦИ). Результаты исследований бластной трансформации лимфоцитов периферической крови в присутствии лимфоцитарного митогена у кроликов, инфицированных простейшими В. hominis, указывало на выраженные отклонения этого показателя по сравнению с контрольной группой. Уже через две недели от начала эксперимента уровень бластной трансформации у животных резко снижался (25,3±1,28). Следовательно, простейшие В. hominis достоверно снижают функциональную способность лимфоцитов периферической крови к

трансформации в бласты под воздействием лимфоцитарного митогсна. Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) также выявил его изменение под действием простейших В. hominis. Однако, эго изменение заключалось в значительном повышении значений ЦИК в течение продолжительного времени. В общей характеристике эффекторных реакций клеточного иммунитета особое место занимают лимфоциты, обладающие повреждающим действием в культуре ткани. Установлено, что цитотоксический эффект проявлялся у большинства кроликов, инфицированных простейшими В. hominis. Однако, показатели его, в сравнении с контролем, были значительно снижены, особенно на 2 неделе эксперимента (0,252±0,040 и 0,924±0,014 соответственно).

Изучение аффинности Е-рецепторов Т-лимфоцитов опытных кроликов, показало равномерное снижение всех фракций Е-РОК, однако статистически достоверным было снижение средне- и высокоаффинных Е-РОК (р<0,05).

С целью изучения функционального состояния B-системы иммунитета определяли уровень иммуноглобулинов А, М, G. Уровень IgA и IgM через три недели от начала эксперимента значительно повысился по сравнению с контролем (318,4±4,7; 174,6±3,4 и 205,6±4,2; 181,1±3,8, соответственно), однако, на 8 неделе упал до 121,3±2,3 и до 136,2±2,9 (р<0,01). Повышение уровня IgG не отмечали на протяжении всего эксперимента.

Полученные результаты свидетельствуют о формировании выраженного иммунодефицитного состояния экспериментальных животных при действии бластоцист. Таким образом, результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что течение инфекционного процесса — бластоцистоза сопровождается многоуровневой дезорганизацией пищеварительной, кроветворной и иммунной систем, патогенетической основой которой служат стимулированная бластоцистами дизрегуляция процессов гемо- и иммунопоэза, цитогенетическая нестабильность и структурно-функциональный дисбаланс иммунокомпетентных клеток крови.

Таким образом, с экологической точки зрения функционирование биологической системы В. hominis — макроорганизм обеспечивается сменой фаз паразитизма и сапрофитизма, а именно механизмами взаимоадаптации паразита и хозяина, факторами которых являются:

- для В. hominis-. степень инвазивности, где в основе лежит преодоление «экологического барьера» - противодействия со стороны нормальной флоры кишечника; персистенция (антиинтерфероновая активность, чувствительность к аптипротозойным препаратам); патогенность.

- для макроорганизма: нарушения в иммунном статусе, формирование иммунодефицитного состояния и, возможно, в дальнейшем иммунологическая толерантность к патогену.

ВЫВОДЫ

1. Разработана система мониторинга микробного состава кишечника, включающая бактериальное исследование с последующей схемой выявления протоценоза: КТ-ФЭО-ЦН-М (Рационализаторское предложение №1 от 05.10.2005), которая позволяет выявлять даже единичные клетки Blastocysts hominis в фекалиях гастроэнтерологических больных.

2. Структура микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных при инвазии Blastocysts hominis по сравнению с практически здоровыми людьми характеризовалась снижением доминирования основных симбионтов, таких как Bifidobacterium (до С=61,76 %), Lactobacillus (до С=36,4 %) и Bacteroides (до С=65,67 %) и увеличением индекса постоянства транзиторной микрофлоры (грибов рода Candida (до С=67,28 %), Enterococcus (до С=72,06) и Proteus (до С=55,8 %), при этом функция «экологического барьера» микрофлоры поддерживалась бактериями рода Escherichia (С=99,26 %).

3. Микроскопические исследования фекалий выявили цисты и разнообразные по морфометрическим и тинкториальным свойствам морфологические формы бластоцист: вакуолярные (в испражнениях

(73,16 % и в культуре 57,35 %), гранулярные (в испражнениях 22,06 % и в культуре 32,72 %) и амебоидные (только в культуре 4,78 %), причем высокой степенью антиинтерфероновой активностью обладали гранулярные и амебоидные клетки. При культивировании Blastocystis hominis на твердой питательной среде (Патентная справка на изобретение РФ № 2003135444 от 09.12.2003) и в фекалиях гастроэнтерологических больных обнаружена нетипичная безъядерная морфологическая форма клеток.

4. Реализация экологической ниши Blastocystis hominis за счет длительного персистирования обусловлена выраженной степенью вирулентных свойств, таких как антиинтерфероновая, энтеротоксическая активность и степень чувствительности к антипротозойным препаратам.

5. На модели экспериментальных животных показаны фазные изменения морфофункционалыюго состояния эритроцитов, что свидетельствовало об адаптивном процессе, сопровождающемся усилением компенсаторных реакций в первые 20 суток с последующим постепенным их истощением.

6. Кишечный бластоцистоз, 'воспроизводимый у экспериментальных животных (Патент на изобретение РФ № 2224465 от 05.06.2002) сопровождался снижением количества всех форм лейкоцитов в первые сутки инфекционного процесса, затем наступал значительный подъем данных показателей, что свидетельствовало об активации защитных механизмов макроорганизма.

7. Blastocystis hominis, паразитируя в кишечнике макроорганизма, вызывали динамично развивающиеся изменения количественных показателей клеточного и гуморального иммунитета, а также функциональной активности эффекторных и регуляторных механизмов иммунного ответа, свидетельствующих о формировании вторичного иммунодефицита.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Квасова H.A., Красноперова Ю.Ю., Евдокимова В.М., Исаева И.Н., Потатуркина-Нестерова Н.И., Бурганова Р.Ф. Выделение клинических изолятов Blastocystis hominis у больных с различной патологией //Сборник материалов I Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине. — Тула, 2002. - С.95-96.

2. Ильина H.A., Краснопсрова Ю.Ю., Евдокимова В.М., Исаева И.Н., Потатуркина-Нестерова Н.И., Волгина Т.И. Влияние простейших Blastocystis hominis на формирование язвы желудка //Сборник материалов I Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине. - Тула, 2002. — С. 106-107.

3. Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Евдокимова В.М, Комстова О.Н. Территориальное и гостальное распространение бластоцистоза //Ученые записки Ульяновского государственного университета. Серия биологическая. Вып. 1 (6). — Ульяновск, 2002. -С.76-79.

4. Потатуркина-Нестерова Н.И., Столбовская О.В., Квасова H.A., Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Евдокимова В.М, Кометова О.Н. Зависимость тяжести течения язвы желудка от цитохимического статуса нейтрафильных гранулоцитов на фоне экспериментального бластоцистоза //Ученые записки Ульяновского государственного университета. Серия биологическая. Вып. 1 (6). — Ульяновск, 2002. — С.80-82.

5. Потатуркина-Нестерова Н.И., Бурганова Р.Ф., Квасова H.A., Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю. Влияние простейших Blastocystis hominis на микробиоту толстой кишки мышей //Физиология и патология пищеварения: Материалы XVIII Всероссийской научной конференции с международным участием, 4-6 сентября 2002. — Краснодар, 2002. — С.203-204.

6. Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Кометова О.Н. Выявление клинических изолятов простейших Blastocystis hominis у гастроэнтерологических больных //Санкт-Петербург

— Гастро-2002: Материалы IV Российского научного форума с международным участием, 17-20 сентября 2002. — Санкт-Петербург, 2002. -№2-3.-С. 104.

7. Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Кометова О.Н. Энтеротоксигенная активность простейших Blastocystis hominis у гастроэнтерологических больных //Санкт-Петербург

— Гастро-2002: Материалы IV Российского научного форума с международным участием, 17-20 сентября 2002. - Санкт-Петербург, 2002.-№2-3.-С. 104.

8. Исаева И.Н., Квасова H.A., Красноперова Ю.Ю., Кометова О.Н., Евдокимова В.М., Потатуркина-Нестерова Н.И., Винокурова Е.В. Изменения микробиоценоза толстой кишки при инвазии бластоцистами //

Здоровье в XXI веке - 2002: Материалы докладов Международной научно-практической конференции, 25 - 28 сентября 2002. - Москва, Тула, 2002.-С. 127-128.

9. Potaturkina-Nesterova N.I., Kvasova N.A., Isaeva I.N., Krasnoperova Y.Y., Pravednikov P.A., Kometova O.N. Prevalcnce of Blastocystis hominis in Patients with Gastrointestinal Diseases //Gl Inflammation and Disturbed Gut Function: The Challenge of New Concepts. — Falk Simposium №130. -Gastroenterology Week. Freiburg, 4-6 October, 2002. - P.A. №30.

10. Потатуркина-Нестерова Н.И., Исаева И.Н., Ильина H.A., Красноперова Ю.Ю., Кометова O.H. Характеристика кишечного микробиоценоза людей, инвазированных бластоцистами //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 2002. — Приложение 17. - Т. 12, №5. — С.60.

11. Потатуркина-Нестерова Н.И, Исаева И.Н., Ильина H.A., Красноперова Ю.Ю. Оценка желчевыделительной функции печени при экспериментальном бластоцистозе //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2002. — Приложение 17. - Т.12, №5. — С.127.

12. Квасова H.A., Потатуркина-Нестерова Н.И., Красноперова Ю.Ю., Исаева И.Н. Бластоцистоз - новая протозойная инфекция //Природа Симбирского Поволжья: Сборник научных трудов, ноябрь 2002. -Ульяновск, 2002. - С.214-217.

13. Потатуркина-Нестерова Н.И., Богомолова Л.К., Квасова H.A., Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Бурганова Р.Ф., Кометова О.Н., Нестеров A.C., Евдокимова В.М. Значение простейших Blastocystis hominis в патологии человека //Проблема инфекции в клинической медицине: Материалы секции в рамках Всероссийской научной конференции и VIII съезда Итало-Российского общества по инфекционным болезням, 5—6 декабря 2002. - Санкт-Петербург, 2002. - С.23-31.

14. Красноперова Ю.Ю., Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Исаева И.Н., Нестеров A.C., Бурганова Р.Ф. Микрофлора кишечника при бластоцистной инвазии //Практические рекомендации. — Ульяновск, 2003. -23 с.

15.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Бугеро Н.В., Богомолова Л.К. Кишечный бластоцистоз у рабочих вредного производства //Санкт-Петербург - Гастро-2003: Материалы 5 Славяно-Балтийского научного форума. - 2003. - №2-3. - С.136.

1 б.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Бугеро Н.В., Волгина Т.И. Состояние микрофлоры кишечника у рабочих вредного производства // Санкт-Петербург - Гастро-2003: Материалы 5 Славяно-Балтийского научного форума. - 2003. - №2-3. - С.136.

17.Потатуркина-Нестерова Н.И., Фалова O.E., Квасова H.A., Бугеро Н.В., Фалова О.Н., Немова И.С., Бурганова Р.Ф., Струнаева В.Е. Реализация потенциала патогенности простейших Blastocystis hominis в условиях пониженной резистентности макроорганизма //Актуальные проблемы

современного здравоохранения и экологии: Сборник материалов региональной научно-практической конференции молодых ученых, Ульяновск, 2003. - С.64-65.

18.Потатуркина-Нестерова Н.И., Исаева И.Н., Квасова H.A., Бугеро Н.В., Красноперова Ю.Ю. Ферментативная активность печени при инвазии бластоцист //Гастроэнтерология, гепатология, колопроктология. - 2003. -Приложение 18. - Т.13.-С.50.

19.Потатуркина-Нестерова H.H., Квасова H.A., Бугеро Н.В., Фалова О.Н., Нестеров A.C., Исаева И.Н. Роль бластоцист в изменении микробиоценоза кишечника //Медицинская экология: Сборник статей II Международной научно-практической конференции, 15 — 16 мая 2003. — Пенза, 2003.-С.81-84.

20.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Бугеро Н.В., Фалова О.Н., Немова И.С., Бурганова Р.Ф. Протозойно-бактериальные ассоциации кишечника в условиях бластоцистоза //Здоровье и Образование в XXI веке: Научные труды 4 Международной научно-практической конференции, 23 -25 мая 2003. - Москва, 2003. - С.508-509.

21 .Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Нестеров A.C., Бугеро Н.В., Красноперова Ю.Ю, Микроэкология кишечника как показатель здоровья населения Ульяновской области //Роль социальных, гигиенических и биологических факторов в становлении возрастных особенностей здоровья населения: Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции, сентябрь 2003. — Пенза, 2003. - С.68-70.

22.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Нестеров A.C., Бугеро Н.В., Красноперова Ю.Ю., Исаева И.Н., Немова И.В. Ассоциации бластоцистоза с другими паразитами //Тезисы IV Российского съезда врачей-инфекционистов, 29-31 октября 2003. - Санкт-Петербург, 2003. -С.309-310.

23 .Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Красноперова Ю.Ю. Антиинтерфероновая активность простейших Blastocystis hominis //Актуальные вопросы инфекционных болезней: Сборник трудов научно-практической конференции, ноябрь 2003. — Москва, 2003. — С.72-74.

24.Потатуркина-Нестерова Н.И., Бугеро Н.В., Квасова H.A., Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Бурганова Р.Ф., Бугеро Н.В., Фалова О.В., Струнаева В.Е., Нестеров A.C. Бластоцистная инвазия у гастроэнтерологических больных //Медлайн Экспресс. — 2003. - №12 (169). — С.3-5.

25.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Красноперова Ю.Ю., Нестеров A.C. Бластоцистная инвазия и дисбактериоз кишечника, Ульяновск, 2003. - 155 с.

26.Потатуркина-Нестерова НИ., Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Квасова H.A., Кометова О.Н. Влияние простейших Blastocystis hominis на функциональные особенности печени //Медицинская паразитология и паразитарные болезни. —2004. - №4 - С. 16-18.

27.Квасова H.A., Бугеро Н.В., Красноперова Ю.Ю. Биологическое значение антиинтерфероновой активности простейших Blastocystis hominis //Науки о человеке: Сборник статей. — Томск, 2004. — С.134-135.

28. Квасова H.A., Бугеро Н.В., Красноперова Ю.Ю., Кудрова В.М., Бурганова Р.Ф. Влияние микробиоценоза кишечника на формирование и тяжесть течения экспериментальной язвы желудка ассоциированной с бластоцистозом //Науки о человеке: Сборник статей. - Томск, 2004. -С.147-148.

29.Потатуркина-Нестерова Н.И., Бугеро Н.В., Квасова H.A., Немова И.С. Бластоцистная инвазия у рабочих вредного производства //Социально-гигиенические и эпидемиологические проблемы сохранения здоровья военнослужащих и населения: Научные труды Федерального научного центра гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана. - Нижний Новгород, 2004. - Вып. 11, - С.364-365.

30.Потатуркина-Нестерова Н.И., Бугеро Н.В., Квасова H.A., Немова И.С. Комплексная оценка микроэкологии кишечника у рабочих литейного производства //Окружающая природная среда и экологическое образование и воспитание: Сборник материалов IV Всероссийской научно-практической конференции. - Пенза, 2004. — С.306-309.

31 .Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Бурганова Р.Ф., Чебан Н.М., Богомолова Л.К. Бластоцистоз -протозооз человека //Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2004. - №4. - С.58-61.

32.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Немова И.С., Бугеро Н.В. Экологическая характеристика микробиоценоза кишечника рабочих вредного производства //Вестник БГТУ им. В.Г. Шухова. - 2004. - №8, 4.II. — С.149-151.

33.Немова И.С., Бугеро Н.В., Квасова H.A., Красноперова Ю.Ю. Микологическое исследование кожи у рабочих мукомольного производства //Труды молодых ученых: Сборник докладов и тезисов студентов и аспирантов на XIV ежегодной научно-практической конференции, 21 мая 2004. - Ульяновск, 2004. - Вып.13. - С.40-41.

34.Квасова H.A. Некоторые биологические свойства простейших Blastocystis hominis //Сибирская зоологическая конференция: Тезисы докладов Всероссийской конференции с участием зарубежных ученых, 15-22 сентября 2004. - Новосибирск, 2004. - С.381.

35.Потатуркина-Нестерова" Н.И., Квасова H.A., Немова И.С., Бугеро Н.В., Красноперова Ю.Ю., Кулагина Г.М., Богомолова Л.К. Экологическая характеристика микробиоценоза кишечника //Практические рекомендации. - Ульяновск, 2004. - 23 с.

36.Квасова H.A. Воздействие простейших Blastocystis hominis на количество и резистентность лейкоцитов периферической крови //Экологические и фаунистические исследования в Поволжье: Сборник материалов конференции, 16-18 ноября 2004. - Ульяновск, 2004. - С.49-56.

37.Квасова H.A., Потатуркина-Нестерова Н.И., Бугеро Н.В., Красноперова Ю.Ю. Антиинтерфероновая активность простейших Blastocystis hominis //Экологические и фаунистические исследования в Поволжье: Сборник материалов конференции, 16—18 ноября 2004. - Ульяновск, 2004. - С.56-60.

38.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Немова И.С., Бугеро Н.В., Красноперова Ю.Ю., Нестеров С.А. Активность нейтрафильных гранулоцитов при экспериментальной язве желудка на фоне инвазии Blastocystis hominis //Новые горизонты гастроэнтерологии: Тезисы Выездного пленума, 23 - 24 ноября 2004. - Москва, 2004. - С.63-64.

39.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Немова И.С., Бугеро Н.В., Красноперова Ю.Ю., Нестеров С.А. Влияние микробиоценоза кишечника на формирование и тяжесть течения экспериментальной язвы желудка, ассоциированной с бластоцистозом //Новые горизонты гастроэнтерологии: Тезисы Выездного пленума, 23 - 24 ноября 2004. -Москва, 2004. - С.65-66.

40.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Немова И.С., Бугеро Н.В., Красноперова Ю.Ю., Бурганова Р.Ф. Некоторые показатели микробиоценоза кишечника при бластоцистозной инвазии //Новые горизонты гастроэнтерологии: Тезисы Выездного пленума, 23 — 24 ноября 2004,- Москва, 2004. - С.142-143.

41.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Немова И.С., Бугеро Н.В., Крсаноперова Ю.Ю., Нестеров С.А., Бурганова Р.Ф. Изучение энтеротоксигенной активности бластоцист //Новые горизонты гастроэнтерологии: Тезисы Выездного пленума, 23 - 24 ноября 2004. -Москва, 2004. - С. 148-149.

42.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Немова И.С., Бугеро Н.В., Крсаноперова Ю.Ю. Патогенные свойства штаммов Blastocystis hominis //Новые горизонты гастроэнтерологии: Тезисы Выездного пленума, 23 -24 ноября 2004. - Москва, 2004. - С.303-304.

43.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Немова И.С., Бугеро Н.В., Крсаноперова Ю.Ю., Нестеров A.C. Распространенность простейших Blastocystis hominis у гастроэнтерологических больных //Новые горизонты гастроэнтерологии: Тезисы Выездного пленума, 23 — 24 ноября 2004. - Москва, 2004. - С.318-319.

44.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Немова И.С., Бугеро Н.В., Крсаноперова Ю.Ю., Нестеров С.А. Паразитарные инвазии у рабочих, контактирующих с вредными факторами производства //Новые горизонты гастроэнтерологии: Тезисы Выездного пленума, 23 — 24 ноября 2004. - Москва, 2004. - С.319-320.

45.Потатуркина-Нестерова Н.И., Квасова H.A., Немова И.С., Бугеро Н.В. Изменение микрофлоры кожи у рабочих в условиях вредных факторов мукомольного производства //Проблемы экологии и охраны природы. Пути их решения: Материалы II Всероссийской научно-практической конференции, ноябрь 2004. — Ульяновск, 2004. - С. 153-154.

46.Квасова H.A. Паразитоценоз кишечника гастроэнтерологических больных //Природа Симбирского Поволжья: Сборник научных трудов. — Ульяновск, 2004. - Вып. 5. - С.55-58.

47.Квасова H.A., Потатуркина-Нестерова H.H., Валкина О.Н. Методы выявления патогенных простейших кишечника человека //Практические рекомендации. - Ульяновск, 2004. - 22 с.

48.Ильина H.A. Морфометрические показатели эритроцитов периферической крови при экспериментальном бластоцистозе //Естествознание и гуманизм: Сборник научных работ. - Томск, 2005. — Т.2, №3. - С.96.

49.Квасова H.A., Бугеро Н.В. Паразитофауна кишечника гастроэнтерологических больных //Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. — 2005. - №1. - С.11-12.

50.Квасова H.A., Бугеро Н.В., Потатуркина-Нестерова Н.И., Красноперова Ю.Ю. Антиинтерфероновая активность простейших Blastocystis hominis //Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2005. -№2. - С.7-8.

51.Ильина H.A. Изменение морфофункциональных свойств эритроцитов периферической крови при экспериментальном бластоцистозе //Вестник Ульяновского госпедуниверситета им. И.Н. Ульянова. - 2005. - Вып. 1. -С.56-59.

52.Потатуркина-Нестерова Н.И., Красноперова Ю.Ю., Нестеров A.C., Квасова ILA. Биологические формы простейших Blastocystis hominis //Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. — 2005. -№2. — С.21-23.

53.Ильина H.A. Фазное изменение количества и резистентности лейкоцитов при инвазии простейших Blastocystis hominis //Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. — 2005. - №5. — С.12-14.

54.Патент РФ №2224465 Способ заражения экспериментальных животных бластоцистами /Потатуркина-Нестерова Н.И,, Квасова H.A., Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Бурганова Р.Ф., Чебан Н.М., Кометова О.Н. - Бюл. №6, 2004.

55.Приоритетная справка на патент РФ №2003135444 Способ получения чистой культуры Blastocystis hominis на питательной среде /Потатуркина-Нестерова Н.И., Бугеро Н.В., Квасова H.A., Фалова O.E., Немова Ю.Ю., Красноперова Ю.Ю., Нестеров A.C. - 2004.

56.Рационализаторское ' предложение №1 Система мониторинга микропейзажа кишечника «БИ+КТ-ФЭО-ЦН-М» /Ильина H.A. - 2005.

Подписано в печать 3.03.06. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ

Отпечатано с оригинал-макета в типографии Издательского центра Ульяновского государственного университета 432970, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ильина, Наталья Анатольевна

• УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Характеристика микробиоценоза кишечника в норме и при патологиях пищеварительного тракта.

ГЛАВА 2. Влияние Blastocystis hominis на морфофункциональное состояние макроорганизма.

• ГЛАВА 3. Ареал распространения бластоцистоза.>

ГЛАВА 4. Морфофизиологические свойства Blastocystis hominis.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 5. Материалы и методы исследований.

ГЛАВА 6. Экологическая характеристика микропейзажа кишечника при бластоцистной инвазии.

6.1. Паразитоценоз кишечника.

6.2. Характеристика выделенных штаммов Blastocystis hominis.

6.2.1. Частота встречаемости Blastocystis hominis.

6.2.2. Структурные особенности Blastocystis hominis.

• 6.3. Микробная флора кишечника.

6.3.1. Сравнительная оценка микробиоценоза кишечника практически здоровых людей и гастроэнтерологических больных при инвазии Blastocystis hominis.

6.3.2. Особенности бактериальной флоры в зависимости от вида заболевания.

• 6.3.3. Оценка дисбиоза кишечника у гастроэнтерологических больных в зависимости от стадии заболевания.

6.3.4. Кишечный микробиоценоз в зависимости от продолжительности заболевания.

6.3.5. Микробный пейзаж кишечника при различных формах заболевания.

6.4. Микопейзаж кишечника.

ГЛАВА 7. Механизм воздействия Blastocystis hominis на макроорганизм.

7.1. Вирулентность Blastocystis hominis.

7.2. Энтеротоксигенность Blastocystis hominis.

7.3. Антиинтерфероновая активность Blastocystis hominis.

7.3.1. Распространенность и уровень антиинтерфероновой активности Blastocystis hominis.

7.3.2. Зависимость антиинтерфероновой активности Blastocystis hominis от заболевания.

7.3.3. Корреляция антиинтерфероновой активности с показателями потагенности Blastocystis hominis.

7.4. Чувствительность Blastocystis hominis к антипротозойным препаратам.

7.5. Изменение микрофлоры кишечника при экспериментальном бластоцистозе.

7.6. Морфологические изменения кишечника при бластоцистной инвазии.

ГЛАВА 8. Морфофункциональные особенности эритроцитов периферической крови при экспериментальном бластоцистозе.

8.1. Изменение морфометрических показателей эритроцитов.

8.2. Действие Blastocystis hominis на активность ферментов эритроцитов.

ГЛАВА 9. Количественные показатели лейкоцитов при экспериментальном бластоцистозе.

9.1. Количество лейкоцитов периферической крови.

9.2. Количественные показатели нейтрофилов.

9.3. Изменение количества лимфоцитов периферической крови.

ГЛАВА 10. Характеристика иммунной функции лимфоцитов при экспериментальном бластоцистозе.

10.1. Показатели (Т-лимфоцитов) клеточного иммунитета.

10.2. Показатели (В-лимфоцитов) гуморального иммунитета.

10.3. Характер изменений функциональной активности эффекторных механизмов иммунного ответа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробиоценоз кишечника человека при бластоцистной инвазии и воздействие Blastocystis hominis на макроорганизм"

Актуальность проблемы

Широко распространенное состояние дисбиоза кишечника свидетельствует о наметившемся сдвиге в микробном ценозе человека, и является отражением экологического неблагополучия внешней среды (Красноголовец, 1989; Куваева, Ладодо, 1991; Воробьев с соавт., 1996).

Учитывая значительную роль кишечной микрофлоры в защитных функциях макроорганизма, актуальным представляется изучение нарушения стабильности микробиоценоза кишечника при различных патологиях желудочно-кишечного тракта. Дисбиоз кишечника выявляется у 70 % больных с патологией гастродуоденальной зоны и гепатобилиарной системы, в 100 % случаях при заболеваниях кишечника (Дорофеев, Несвижский, 1997; Комаров, Рапопорт, 2000; Walker, 2005).

Дисбиотические расстройства характеризуются, как правило, снижением количественного содержания индигенных облигатно-анаэробных бактерий (бифидобактерий, лактобацилл, бактероидов и т.д.) и изменением количества других условно-патогенных микроорганизмов (стафилококков, синегнойной палочки, грибов рода Candida и др.). Среди условно-патогенных микроорганизмов, способствующих возникновению и поддержанию дисбиотического процесса, помимо бактерий и грибов, значительное место занимают кишечные простейшие, которые в небольшом количестве встречаются в кишечнике практически всех здоровых лиц (Воробьев с соавт., 1996; Бондаренко, 1999; Бухарин, 2000).

Известно, что кишечные паразитозы представляют актуальную эколого-медико-социальную проблему. По данным ВОЗ в России ежегодно регистрируется около 2 млн больных паразитарными болезнями (Сергиев, Лебедева, 1997; Онищенко, 2002).

Наиболее известными возбудителями кишечных расстройств протозойной природы являются Entamoeba hystolitica, Giardia lamblia и

Criptosporidium (Генис, 1979; Крылов, 2004). Менее известна протозойная инфекция - бластоцистоз, обусловленная паразитированием преимущественно в толстой кишке простейших Blastocystis hominis (Reinthaler et al., 1988; Ziertd et al., 1988; Чайка, 1992).

Дисбиозы кишечника, обусловленные инвазией Blastocystis hominis, характеризуются длительным течением, особенно на фоне снижения резистентности макроорганизма (Потатуркина-Нестерова с соавт., 2001). С биологических позиций это одна из распространенных форм функционирования биологической системы «паразит - хозяин», которая представляет собой эволюционно прогрессивную форму симбиоза, определяющее развитие и взаимоадаптацию микроорганизма и макроорганизма (Одум, 1986; Нетрусов с соавт., 2004). При этом данная система с медицинской точки зрения проявляется в виде носительства - одна их форм инфекционного процесса, при которой наступает динамическое равновесие между микроорганизмами и макроорганизмом с развитием иммуноморфологических реакций и антительного ответа (Беляков с соавт., 1987; Бондаренко, Горская, 1992).

В связи с этим, актуальным представляется рассмотрение взаимной адаптации Blastocystis hominis и макроорганизма, а именно инвазии и персистенции патогеном экологической ниши и механизмов защиты макроорганизма. В этом плане особого внимания заслуживает изучение преодоления Blastocystis hominis «экологического барьера» противодействия со стороны представителей индигенной микрофлоры и формирования устойчивого биоценоза кишечника (Бухарин, 1990; Соколов, 1990; Леванова, Алешкин, 2002).

В ряде работ (Валышев, Зыкова, Коннова, 1994; Зыкова, Челпаненко, 1994) при расшифровке взаимодействия патогенов и макроорганизма, в частности для выявления причинно-следственных связей дисбиозов, активно обсуждаются факторы персистенции, обеспечивающие длительное выживание возбудителя в организме хозяина. Естественно, в зависимости от вида патогена, механизмы его персистирования и патогенности различны. Однако подавляющее большинство микроорганизмов продуцируют секретируемые факторы деградации защиты хозяина уклоняясь от нее, обеспечивая себе персистирование в организме (Сомов, Литвин, 1988; Бухарин, 1994; Прозоровский с соавт, 1994).

Одновременно важным является рассмотрение адаптаций организма хозяина при инвазии Blastocystis hominis. Одними из наиболее чувствительных к действию инфекционных агентов защитных систем организма являются системы крови и иммунитета. Существует достаточное количество сообщений (Борисов, Смирнов, 1994; Рязанцева, Новицкий, Степовая, 2003; Новицкий, Уразова, 2004; Рязанцева, Новицкий, 2004) о ключевой роли данных систем в обеспечении противоинфекционной защиты, однако значение их при бластоцистозе до сих пор не изучено.

Расшифровка механизмов реагирования и ответа (в том числе иммунного) со стороны макроорганизма на внедрение и персистирование Blastocystis hominis открывает перспективы решения фундаментальных проблем биологии - понимание природы носительства микроорганизмов, выявления причинно-следственных связей дисбиозов, совершенствования оценки микробного состава кишечника, наконец, создание основ микроэкологического мониторинга микробных сообществ макроорганизма.

Цель работы - теоретическое обоснование и разработка оценки микробиоценоза кишечника как «экологического барьера» при бластоцистозе и изучение взаимоадаптаций системы Blastocystis hominis -макроорганизм.

Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Разработать систему мониторинга микробного состава кишечника гастроэнтерологических больных при бластоцистозе и практически здоровых людей.

2. Охарактеризовать ' структуру микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных и практически здоровых людей при инвазии Blastocystis hominis для анализа противодействия нормальной микрофлоры патогенам.

3. Произвести морфофизиологическую оценку выделенных штаммов Blastocystis hominis с целью определения биологически активной морфологической формы, способствующей длительной инвазии микроорганизма в кишечнике.

4. Определить степень вирулентности Blastocystis hominis путем выявления антиинтерфероновой, энтеротоксической активности и чувствительности к антипротозойным препаратам как механизмов реализации экологической ниши.

5. Выявить морфофункциональные свойства эритроцитов и количественные изменения лейкоцитов периферической крови при бластоцистозе на модели экспериментальных животных (кроликах, крысах) с целью расшифровки механизмов реагирования макроорганизма на внедрение и персистирование Blastocystis hominis.

6. Исследовать показатели клеточного и гуморального иммунитета на модели экспериментальных Животных при инвазии Blastocystis hominis для объяснения адаптаций макроорганизма к патогену.

Научная новизна

Впервые разработана система мониторинга микробиоценоза кишечника, включающая комплексную оценку протоценоза и микрофлоры кишечника гастроэнтерологических больных, позволяющая повысить степень выявления дисбиозов, и получения унифицированных данных инвазивности Blastocystis hominis (Рационализаторское предложение №1 от

05.10.2005). Установлена высокая инвазивность кишечными паразитами -89,43 %, что сопровождалось снижением обсемененности представителей индигенной микрофлоры и повышенным содержанием транзиторных микроорганизмов.

Впервые установлено нарушение состава микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных при инвазии Blastocystis hominis, которое характеризовалось структурной перестройкой ценотипа, сопровождающейся сменой абсолютных доминант (бифидобактерий, лактобактерий, бактероидов) и появлением среди них грибов рода Candida. Одинаково высокий индекс постоянства эшерихий (С=100 %), выделенных у гастроэнтерологических больных и практически здоровых людей свидетельствует об активности «экологического барьера» нормальной микрофлоры кишечника.

Впервые установлено, что степень выраженности дисбиотических изменений микрофлоры кишечника зависит от периода (обострение, ремиссия), продолжительности гастроэнтерологического заболевания и морфологических форм Blastocystis hominis, вегетирующих в кишечнике организма человека.

Впервые описаны безъядерные морфологические формы Blastocystis hominis в фекалиях гастроэнтерологических больных, инвазивность которых в кишечнике сопровождалась диарейным синдромом.

Впервые показана выраженность вирулентных свойств, таких как антиинтерфероновая, энтеротоксическая активности и степень чувствительности к антипротозойным препаратам клинических изолятов Blastocystis hominis, определяющая возможность колонизации экологической ниши и персистенции микроорганизма.

Впервые установлены фазные изменения морфофункциональных свойств эритроцитов и количественного содержания лейкоцитов при и экспериментальном бластоцистозе, свидетельствующие о специфичности адаптации макроорганизма к данному патогену.

Впервые установлено, что при экспериментальном бластоцистозе снижение показателей Т-клеточного иммунитета обусловлено преимущественно угнетением Т-хелперного звена, в основе же гуморального иммунитета лежит угнетение генеза IgG, что можно расценивать как форму иммунодефицита.

Практическая значимость

Полученные в работе данные расширяют и углубляют теоретические представления взаимоадаптации Blastocystis hominis и макроорганизма, в частности расшифровывают механизмы выживания патогена в условиях экологического барьера нормальной флоры кишечника.

Разработанная система мониторинга микробиоценоза кишечника: БИ+КТ-ФЭО-ЦН-М рекомендована и внедрена в практику клинических и бактериологических лабораторий (Акт о внедрении в клиническую и бактериологическую лаборатории Городской больницы №1 г.Ульяновска от 10.10.2005).

Создана твердая питательная среда для культивирования Blastocystis hominis, позволившая выявить основные типичные (вакуолярная, гранулярная и амебоидная) и атипичные (безъядерная) морфологические формы простейших (Патентная справка на изобретение РФ № 2003135444 от 09.12.2003).

Выраженность вирулентных свойств: антиинтерфероновой, энтеротоксической активности и степени чувствительности к антипротозойным препаратам клинических изолятов Blastocystis hominis свидетельствует о реализации экологической ниши данных микроорганизмов, что сопровождается различной степенью дисбиоза кишечника гастроэнтерологических больных.

Разработана экспериментальная модель бластоцистоза с целью рассмотрение адаптаций организма хозяина при инвазии Blastocystis hominis (Патент на изобретение РФ № 2224465 от 05.06.2002).

Определение изменений в системе крови (морфофункциональных особенностей эритроцитов и количественных показателей лейкоцитов) в макроорганизме можно рекомендовать при проведении комплексного диагностического обследования гастроэнтерологических больных на бластоцистоз.

По материалам диссертационной работы написаны монография «Бластоцистная инвазия и дисбактериз кишечника». Ульяновск, 2003, 155 с. (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Красноперова Ю.Ю., Нестеров А.С.), практические рекомендации: «Микрофлора кишечника при бластоцистной инвазии» Ульяновск, 2003, 23 с. (соавт. Красноперова Ю.Ю., Потатуркина-Нестерова Н.И, Исаева И.Н., Нестеров А.С, Бурганова Р.Ф.); «Экологическая характеристика микробиоценоза кишечника». Ульяновск, 2004, 23 с. (соавт. Исаева И.Н., Красноперова Ю.Ю., Потатуркина-Нестерова Н.И., Бугеро Н.В., Немова И.С., Фалова О.Е., Кулагина Г.М., Богомолова Л.К.); «Методы выявления патогенных простейших кишечника человека». Ульяновск, 2004, 22 с. (соавт. Потатуркина-Нестерова Н.И., Валкина О.Н.).

Результаты исследования используются в процессе преподавания микробиологии, общей экологии и экологии микроорганизмов на естественно-географическом факультете ГОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова» (Акт о внедрении от 15.09.2005, утвержденный ректором ГОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова) и на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета (Акт о внедрении от 21.10.2005, утвержденный директором

Института Медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработана система мониторинга микробного состава кишечника гастроэнтерологических больных, позволяющая выявлять весь спектр микроорганизмов, в том числе единичные клетки Blastocystis hominis.

2. На основании коэффициентов постоянства определена структура микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных при инвазии Blastocystis hominis, в которой доминирующее положение занимали бифидобактерии, бактероиды и эшерихии, наряду с ними в группу постоянных микроорганизмов входили энтерококки, грибы рода Candida, тогда как у практически здоровых данные микроорганизмы являлись представителями транзиторной флоры.

3. В фекалиях и при культивировании В. hominis выявлены цисты, основные морфологические формы бластоцист: вакуолярные, реже гранулярные, амебоидные клетки обнаружены только в культуре и атипичные безъядерные клетки. Отмечен высокий уровень антиинтерфероновой активности среди штаммов гранулярной и амебоидной форм, что обеспечивает длительную персистенцию данных микроорганизмов.

4. Длительное персистирование в кишечнике макроорганизма Blastocystis hominis обусловлено выраженной степенью вирулентных свойств, таких как антиинтерфероновая, энтеротоксическая активность и степень чувствительности к антипротозойным препаратам.

5. При экспериментальном бластоцистозе показаны изменения морфофункциональных свойств эритроцитов и количественных показателей лейкоцитов, что свидетельствовало о специфическом реагировании макроорганизма на внедрение и персистирование Blastocystis hominis.

6. Персистенция Blastocystis hominis в организме экспериментальных животных сопровождается депрессией клеточного и гуморального звеньев иммунитета.

Апробация работы

Результаты работы доложены и обсуждены на XVIII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова РФ (Казань, 2001), XVIII Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и патология пищеварения» (Геленджик, Краснодар, 2002), VIII Российской гастроэнтерологической неделе (Санкт-Петербург, 2002, 2003), Всероссийской научной конференции «Клещевые и паразитарные болезни» (Санкт-Петербург, 2002), Всероссийской научной конференции «Проблема инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002), Международном Фальк-симпозиуме «GI Inflammation and Disturbtd Gut Function: The Challenge of New Concepts» (Германия, Фрайбург, 2002), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы мониторинга экосистем антропогенно - нарушенных территорий» (Ульяновск, 2003), II Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2003), IV Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2003), V Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро -2003» (Санкт-Петербург, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Роль социальных, гигиенических и биологических факторов в становлении возрастных особенностей здоровья населения» (Пенза, 2003), IV Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая природная среда и экологическое образование и воспитание» (Пенза, 2004), Сибирской зоологической конференции (Новосибирск, 2004), региональной конференции «Экологические и фаунистические исследования в Поволжье»

Ульяновск, 2004), Выездном пленуме «Новые горизонты гастроэнтерологии» (Новосибирск, Москва, 2004), II Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и охраны природы. Пути их решения» (Ульяновск, 2004), Заседании областного отделения Всероссийского общества эпидемиологов и микробиологов (Ульяновск, 2005).

Публикации

По теме диссертации получены 1 патент на изобретение Российской Федерации, 1 приоритетная справка на изобретение Российской Федерации, 1 удостоверение на рационализаторское предложение, опубликовано 53 работы, в том числе 1 монография, 3 практические рекомендации и 27 статей (в том числе 10 в центральных журналах и 1 в зарубежной печати) и 22 тезиса (Российские и международные конференции, симпозиумы и съезды).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 263 источника и приложений. Диссертация изложена на 307 страницах машинописного текста, иллюстрирована 53 таблицами и 49 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ильина, Наталья Анатольевна

ВЫВОДЫ

Разработана система мониторинга микробного состава кишечника, включающая бактериальное исследование с последующей схемой выявления протоценоза: КТ-ФЭО-ЦН-М (Рационализаторское предложение №1 от 05.10.2005), которая позволяет выявлять даже единичные клетки Blastocystis hominis в фекалиях гастроэнтерологических больных.

Структура микробиоценоза кишечника гастроэнтерологических больных при инвазии Blastocystis hominis по сравнению с практически здоровыми людьми характеризовалась снижением доминирования основных симбионтов, таких как Bifidobacterium (до С=61,76 %), Lactobacillus (до С=36,4 %) и Bacteroides (до С=65,67 %) и увеличением индекса постоянства транзиторной микрофлоры (грибов рода Candida (до С=67,28 %), Enterococcus (до С=72,06) и Proteus (до С=55,8 %), при этом функция «экологического барьера» микрофлоры поддерживалась бактериями рода Escherichia (С=99,26 %). Микроскопические исследования фекалий выявили цисты и разнообразные по морфометрическим и тинкториальным свойствам морфологические формы бластоцист: вакуолярные (в испражнениях (73,16 % и в культуре 57,35 %), гранулярные (в испражнениях 22,06 % и в культуре 32,72 %) и амебоидные (только в культуре 4,78 %), причем высокой степенью антииитерфероновой активностью обладали гранулярные и амебоидные клетки. При культивировании Blastocystis hominis на твердой питательной среде (Патентная справка на изобретение РФ № 2003135444 от 09.12.2003) и в фекалиях гастроэнтерологических больных обнаружена нетипичная безъядерная морфологическая форма клеток.

Реализация экологической ниши Blastocystis hominis за счет длительного персистирования обусловлено выраженной степенью вирулентных свойств, таких как антиинтерфероновая, энтеротоксическая активность и степень чувствительности к антипротозойным препаратам.

На модели экспериментальных животных показаны фазные изменения морфофункционального состояния эритроцитов, что свидетельствовало об адаптивном процессе, сопровождающемся усилением компенсаторных реакций (10, 20 сутки) с постепенным их истощением (40 и 75 сутки).

Кишечный бластоцистоз, воспроизводимый у экспериментальных животных (Патент на изобретение РФ № 2224465 от 05.06.2002) сопровождался снижением количества всех форм лейкоцитов в первые сутки инфекционного процесса, затем наступал значительный подъем данных показателей, что свидетельствовало об активации защитных механизмов макроорганизма.

Blastocystis hominis, паразитируя в кишечнике макроорганизма, вызывали динамично развивающиеся изменения количественных показателей клеточного и гуморального иммунитета, а также функциональной активности эффекторных и регуляторных механизмов иммунного ответа, свидетельствующих о формировании вторичного иммунодефицита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Организм человека - это экологическая ниша для множества разнообразных микроорганизмов, заселяющих его биотопы. Они составляют микробиоценозы, представляющие собой сложные системы, которые отличаются не только чрезвычайной многокомпонентностью, но и количественным разнообразием входящих в них представителей микрофлоры. При этом человек представляется открытой системой, в которую постоянно извне поступают разнообразные микроорганизмы, в то же время, он сам служит источником их поступления в Ькружающую среду (Несвижский с соавт., 2002).

При физиологической норме организм человека содержит сотни видов бактерий, а также вирусы и простейшие, составляющие в сумме нормальный микробиоценоз (Завгородняя, Зубова, Медведева, 1983; Бондаренко, 1997; Костюк с соавт., 1998; Воробьев с соавт., 1999). Основным общепринятым индикаторным микробиоценозом организма человека является нормальная микрофлора кишечника (Горская с соавт., 1995; Шептулин, 1999; Григорьев, Яковенко, 2000).

В настоящее время с нарастающим неблагополучием экологической ситуации в России обострились многие аспекты здравоохранения, в частности, проблема кишечных паразитозов. Регионы с населением, значительно пораженным паразитами приравниваются к зонам экологического бедствия. Ивестно, что кишечные паразиты оказывают выраженное действие на макроогрганизм, в частности снижают и угнетают формирование и сохранение иммунитета.

Литературные данные и результаты собственных исследований свидетельствуют, что паразитарная колонизация представляет собой сложное многофакторное явление (Коршунов, 1995; Корнева, 1999). Мониторинг паразитофауны кишечника гастроэнтерологических больных, с применением диагностической системы КТ-ФЭО-ЦН-М показал высокую зараженность кишечными паразитами 89,43 %, в том числе простейшими - 83,72 %, гельминтами - 9,14 %.

Получены данные о видовом составе паразитофауны и ассоциациях паразитов кишечника у обследованных. Выявлены 14 видов кишечных паразитов: 9 видов простейших (5 видов саркодовых, 2 вида жгутиковых, 1 вид инфузорий и 1 вид кокцидий) и 4 вида гельминтов (1 вид трематод, 1 вид цестод, 2 вида нематод). Определены доминирующие в структуре пораженности больных виды паразитов: из простейших: Blastocystis hominis, Lamblia intestinalis, из гельминтов - Enterobius vermicularis, причем бластоцисты явились абсолютным преобладающим из всех выявленных видом.

Установлен высокий удельный вес (28,75 %) моноиинвазий в структуре пораженности кишечными паразитами гастроэнтерологических больных, на двухчленные ассоциации приходится 63,9 %, тогда как четырехчленные ассоциации встречаются крайне редко (0,6 %). Среди диинвазий доминируют протозойно-грибковые ассоциации (48,56 %), наиболее редки гельминто-гельминтные ассоциации (0,31 %).

Инфицированность простейшими В. hominis среди лиц, страдающих заболеваниями органов пищеварения составила 77,71 %. При этом существенных различий в обнаружении бластоцист у мужчин и женщин нами обнаружено не было. Вместе с тем прослеживается четкая тенденция роста инфицированности этими простейшими у лиц старших возрастных групп, что, вероятно, связано с инволюционными изменениями организма и снижением иммунорезистентности.

Говоря о нозологической структуре обследованных больных, следует отметить, что при всех хронических заболеваниях органов пищеварения бластоцисты обнаруживаются значительно чаще, чем у лиц контрольной группы. Причем наиболее высокие показатели инфицированности данными простейшими установлены при язвенной болезни - 72,22 %, хроническом гастрите - 67,21 % и хроническом холецистите - 71,42 %. Достаточно высоким остается процент выделения бластоцист и у лиц с другими заболеваниями пищеварительной и гепатобилиарной систем, так, при циррозе печени он составляет 66,66 %, при желчнокаменной болезни - 42,42 %. Вместе с тем лица контрольной группы инвазированы В. hominis лишь в 6,3 % случаев.

Изучение морфологических особенностей бластоцист выявило наличие в клиническом материале вакуолярной и гранулярной форм, а так же цист этих простейших, что согласуется с данными С.Н. Zierdta et al. (1967), Т.В. Сахаровой (1997). Так, в клиническом материале и культуре преобладали вакуолярные формы. На их долю приходилось 73,16 % в препаратах, приготовленных из фекалий больных и 57,35 % в препаратах из культуры. Аналогичные результаты были получены A. Escobedo et al. (1997). Гранулярная форма встречается в препаратах из кала реже (4,4 %), чем в препаратах из культуры (17 %). Она имеет сферическую форму, превалируют клетки размером 5-10 мкм (68 % - в препаратах из кала и 79 % - из культуры). Амебоидная форма обнаруживается преимущественно в культуре (5,5 %). Наряду с типичными морфологическими формами В. hominis при выделении чистой культуры нами обнаружены атипичные клетки - безъядерные формы В. hominis.

В последние годы эпидемиологическая обстановка по паразитарным болезням в России стала особенно напряженной. В стране ежегодно официально регистрируется более 1,3 миллионов больных различными паразитозами, среди которых отмечается рост заболеваемости кишечными протозоозами (Романенко, 2001).

В связи с этим особую актуальность приобретает широко распространенная «новая» протозойная инвазия - бластоцистоз, обусловленная паразитированием преимущественно в толстой кишке простейших Blastocystis hominis (Чайка, 1992; Reinthaler et al., 1988; Zierdt et al., 1988).

Исследованиями С. Zierdt et al. (1967, 1978, 1988, 1991) была впервые установлена протозойная природа B.hominis, определено таксономическое положение и получены первые указания на их возможную этиологическую роль в возникновении кишечной инвазии - бластоцистоза у лиц с иммунной недостаточностью.

До недавнего времени этот возбудитель не рассматривался как этиологический фактор патологических состояний человека. Более того, некоторые исследователи вообще сомневались в патогенных потенциях В. hominis и считали бластоцистоз не заболеванием, а безвредным транзиторным носительством, непатогенных микроорганизмов (Johnson et al., 1989; Zierdt, 1991).

В настоящее время имеется достаточное количество эпидемиологических и клинических материалов, а также лабораторных данных, подтверждающих как потенциальную, так и реальную этиологическую роль В. hominis в патологии человека, развивающейся на фоне снижения резистентности макроорганизма (Garavelli et al., 1991; Cirioni et al., 1999).

Приведенные литературные данные о бластоцистах и их значении в патологии человека свидетельствуют о том, что, несмотря на, многочисленные исследования, проводимые ,в последние годы, многие аспекты данной проблемы до сих пор не известны. Так, например, остаются не изученными их распространенность в популяции гастроэнтерологических больных, роль в формировании микробиоценоза человека, а также биологические свойства, определяющие участие бластоцист в патологическом процессе, что вообщем, может конкретизировать проблему взаимоадаптации микроорганизма, в частности, В. hominis и макроорганизма.

Анализ литературных данных и собственных исследований свидетельствуют о том, что микрофлора кишечника является индикатором состояния макроорганизма и при снижении защитных сил, наблюдаются изменения микробиоценоза (Гаврилова, 1987; Крамарь с соавт., 1993, 1994, 1998; Бондаренко с соавт., 1995; Бондаренко с соавт., 1998; Бухарина, 2002).

Нарушения микробиоценоза кишечника протекает по общим закономерностям: в результате снижения индигенной анаэробной флоры бифидо-, лактобактерии), участвующей в обеспечении колонизационной резистентности кишечника, нарушается контроль за количественным и качественным составом всей микрофлоры, что проявляется в повышении содержания гемолитических кишечных палочек, доминировании патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, а также стафилококков и грибов (Билибин, 1961; Kleessen et al., 1981; Красноголовец, 1989; Крылов, 1994; Федянин, 1997; Багрянцева, 1999; Барановский, Кондрашин, 2000). Последние, при снижении резистентности макроорганизма могут проявлять свою патогенность. Это создает предрасположенность для развития как инфекционных, так и соматических заболеваний (Геллер, 1988; Веселова, 1988; Ван-дер-Ваай, 1992; Шендеров, 1994; Вертиев, 1996; Красноперова с соавт., 2002). В связи с этим, для расшифровки функции «экологического барьера» нормальной микрофлоры кишечника был проведен сравнительный анализ микробиоценоза практически здоровых людей и гастроэнтерологических больных при инвазии В. hominis.

Наиболее выраженные изменения зафиксированы со стороны анаэробной флоры. Из представителей облигатно-анаэробной флоры кишечника обследованных больных отмечается снижение бифидобактерий (61,76 %) до значения lg 7,7±0,03 КОЕ/г (в контрольной группе lg 9,1 ±0,3 КОЕ/г у 100 % обследованных), лактобактерий (36,4 %) и бактероидов (65,07 %) до lg 7,3 + 0,04 КОЕ/г и lg 8,5 ±0,04 КОЕ/г (в контроле - lg 8,4+0,2 КОЕ/г у 100 % и lg 10,8± 0,3 КОЕ/г у 73,64 %), соответственно. По сравнению с другими представителями эндогенной флоры эшерихии были выявлены почти у всех обследованных - 99,26 % (в контроле - 100 %), при этом обсемененность их снизилась до lg 5,2 ±0,2 КОЕ/г, тогда как в контрольной группе содержание данных бактерий составляло lg 7,7 ±0,3 КОЕ/г. Наряду с этим, характерным микроорганизмом для микробного пейзажа кишечника гастроэнтерологических больных, инвазированных Blastocysts hominis являлась кишечная палочка с гемолитическими свойствами (44,12 % - lg 5,7±0,2 КОЕ/г (в контроле не обнаружена).

Для других представителей микробиоценоза кишечника больных, инвазированных Blastocystis hominis, таких как клебсиелл, стафилококков характерно повышенное содержание в 43,38 % и 45,59 % случаев (в контроле данные микроорганизмы выявлялись в 8,18 % и 18,18 % случаев). Уровень их содержания составил lg 5,1 ±0,2 КОЕ/г и lg 6,0 ±0,05 КОЕ/г соответственно (в контрольной группе lg 3,3 ± 0,1 КОЕ/г и lg 4,0± 0,4 КОЕ/г). Также, высевались в значительных количествах бактерии рода Proteus и Enterococcus, которые были выявлены у 55,88 % и 72,06 % больных, тогда как в контрольной группе они высевались у 10,9 % и 25,45 % людей (lg 5,4 ± 0,3 КОЕ/г и lg 7,6 ± 0,1 КОЕ/г, что превышало данные показатели в контрольной группе - lg 3,6±0,1 КОЕ/г и lg 4,8 ±0,4 КОЕ/г, соответственно). Дрожжеподобные грибы рода Candida в норме редко обнаруживались у здоровых (10,0 % обследованных) с низким уровнем содержания. Однако ,у людей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта, инвазированных В. hominis, они были выявлены в количествах, превышающих 104 КОЕ/г в 67,28 % случаев (lg 5,9± 0,06 КОЕ/г). Представители рода Clostridium обнаруживались у 23,9 % (65 человек) обследованных больных, тогда как у здоровых этот показатель составил 7,7 % (8 человек), однако уровень содержания данных микроорганизмов был относительно одинаков (lg 6,3 ± 0,1 КОЕ/г и lg 6,6 ± 0,2 КОЕ/г, соответственно).

Таким образом, сравнительный анализ микробиоценозов кишечника здоровых людей и гастроэнтерологических больных при инвазии Blastocystis hominis показал значительное сокращение частоты встречаемости анаэробов рода Bifidobacterium до 61,76 %, Lactobacillus до 36,4 %, Bacteroides до 65,07 %, тогда как у практически здоровых людей эти показатели в основном составляли 100 %, для бактероидов - 73,64 %. Среди всех эндогенных бактерий кишечника только эшерии обладали высокой частотой обнаружения как у практически здоровых людей (100 %), так и у гастроэнтерологических больных при инвазии В. hominis (99,26 %).Обращает на себя внимание появление в группе больных гемолитической кишечной палочки у 44,12 % обследованных (lg 5,7±0,2 КОЕ/г). При этом в данной группе больных выявлено возрастание высеваемости и частоты обнаружения следующих микроорганизмов: бактерий родов Enterococcus, Proteus, Klebsiella, Staphylococcus и грибов рода Candida, что свидетельствует о дисбиотическом нарушении микробиоценоза кишечника.

Таким образом, был проведен анализ микробного пейзажа кишечника с помощью разработанной нами системы мониторинга микробного состава кишечника, включающая бактериальное исследование с последующей схемой выявления протоценоза: КТ-ФЭО-ЦН-М (Рационализаторское предложение №1 от 05.10.2005 г.), которая позволяет выявлять даже единичные клетки Blastocystis hominis в фекалиях гастроэнтерологических больных.

Для выяснения структуры симбиотических взаимоотношений были изучены индексы постоянства различных таксонов, формирующих микрофлору кишечника больных при инвазии В. hominis и практически здоровых людей. В зависимости от полученных значений все таксоны подразделили на постоянные (050 %), добавочные (25 %<С>50 %) и случайные (С<25 %) (Домбровский, Бодягина, 1986). Полученные данные позволили считать, что доминирующими видами в кишечной микрофлоре практически здоровых людей являлись бифидобактерии, лактобатерии и эшериихии с индексом постоянства 100 %, также в данную группу входили бактероиды (С= 73,64 %). Группа добавочных сочленов микробиоценоза была представлена одним родом - Enterococcus (С=25,45 %). Большое разнообразие микроорганизмов наблюдалось в транзиторной группе, в которую входили следующие рода микробов Staphylococcus (С=18,18 %), Proteus (С=10,9 %), Candida (С=10,0 %), Klebsiella (С=8,18 %) и Clostridium (С=7,27 %).

Анализ ценотипа кишечника больных, инвазированных В. hominis показал смену доминирующих и добавочных микроорганизмов. В состав доминирующей группы на фоне снижения показателей постоянства индигенной флоры (бифидобактерий до С=61,76 %, бактероидов до С=65,07 %) вошли представители микробиоценоза кишечника, индекс постоянства которых по сравнению с контролем значительно возрос: энтерококки (С=72,06 %), грибы рода Candida (С=67,28 %) и протеи (С=55,88 %). Отмечался высокий показатель постоянства, как и в контрольной группе обследованных, так и в группе больных для эшерихий с нормальной ферментативной активностью (С=99,26 %), по видимому, за счет которых поддерживается функция «экологического барьера» микрофлоры при внедрении и персистировании В. hominis. Появление среди резидентных видов у больных, инфицированных бластоцистами энтерококков, грибов Candida и протей в ассоциации с представителями облигатной флоры (бифидо-, эшерихии и бактероиды) свидетельствуют о развитии дисбиоза кишечника.

Изменение иерархии отмечали также в структуре добавочных видов. Так, показатель постоянства для рода стафилококков и клебсиелл возрос - от 18,18 % до 45, 59 % и от 8,18 % до 43,38 %, соответственно, в связи с этим для них характерен переход с транзиторной группы в добавочную. В данной группе появляются новые члены микробиоценоза - лактобактерии (С=36,4 %), которые в контрольной группе были доминирующими и гемолитическая кишечная палочка (С=44,12 %).

Транзиторная группа была представлена только клостридиями, индекс постоянства которых по сравнению с контрольной группой также повысился (С=23,9 %), для остальных микроорганизмов характерен переход в доминирующую и добавочную группы.

Таким образом, проведенные исследования показали, что ценотип кишечника гастроэнтерологических больных при бластоцистной инвазии характеризовался снижением доминирования основных симбионтов, таких как Bifidobacterium (до С=61,76 %), Lactobacillus (до С=36,4 %) и Bacteroides (до С=65,07 %) и увеличением индекса постоянства транзиторной микрофлоры грибов рода Candida (до С=67,28 %), Enterococcus (до С=72,06 %) и Proteus (до С=55,88 %), при этом функция «экологического барьера» микрофлоры поддерживалась бактериями рода Escherichia (С=99,26 %).

По данным Российской академии медицинских наук, дисбиотические изменения в организме людей имеются у более 60 % населения России и в экологически неблагоприятных районах могут достигать 90 %. Основное местообитание микроорганизмов - желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), поэтому с нарушениями в нормофлоре ЖКТ связаны многочисленные заболевания человека (Сытник, 1989; Артемова, Яковлев, Кравец, 1999; Шендеров, 2001; Ардатская, Дубинин, Минушкин, 2001).

Нарушения микробиоценоза толстой кишки были выявлены при всех заболеваниях желудочно-кишечного тракта, однако, характер данных изменений варьировал в зависимости от диагноза заболевания. Наиболее выраженные дисбиотические сдвиги были характерны для лиц с язвенной болезнью, а также при неспецифическом язвенном колите и хроническом гепатите (В,С). В то время как у больных с опухолью ободочной кишки, ЖКБ, СОЖ и СРК дисбактериоз менее выражен. При этом анализ микрофлоры кишечника больных с патологией пищеварительного тракта при различной продолжительности заболевания не показал существенных различий ни в частоте, ни в степени выраженности дисбиотических сдвигов.

Для персистирования в организме хозяина микроорганизмам необходимы определенные биологические свойства, направленные на деградацию механизмов резистентности хозяина (Бухарин, 1994). К таким механизмам относятся энтеротоксическая, антиинтерфероновая активность и чувствительность к антипротозойным препаратам, характерные для большой группы патогенных и условно-патогенных бактерий, меняющих свою экологическую нишу и создающих предпосылки как для формирования, так и для хронизации инфекционного процесса (Бухарин, 1992).

С целью изучения механизмов воздействия Blastocystis hominis на макроорганизм, в частности, для выявления патогенности клинических изолятов вводили стандартную петлю взвеси бластоцист под нижнее веко морским свинкам. Если культура простейших была патогенна, то у животных развивался кератоконюнктивит. Патогенные свойства бластоцист определяли также путем внутрибрюшинного введения белым мышам. Из 174 клинических изолятов бластоцист, 102 (58,62 %) обладали патогенностью, причем показатель LD50 в lg этих культур варьировал от 2,7±0,2 до 5,2±0,1. Наибольшее количество культур обладало выраженными патогенными свойствами, тогда как всего 8 культур имели слабо выраженную патогенность.

Таким образом, показано, что клинические изоляты бластоцист, выделенные у гастроэнтерологических больных обладают различной степенью выраженности патогенности, что, на наш взгляд, является одним из механизмов инвазивности, что определяет воздействие на макроорганизм.

В следующей серии опытов была изучена энтеротоксическая активность Blastocysts hominis. В первой серии опытов изучали влияние на тонкую кишку взвеси бластоцист, изолированных из организма здоровых людей. Во всех случаях заражения изолированных участков реакция была отрицательной. В следующей серии экспериментов в просвет изолированных сегментов вводили бластоцисты, выделенные у людей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Из 49 штаммов, изолированных у больных, 18 вызывали резко выраженную реакцию (ИД>2,0), 14- выраженную реакцию (ИД>1,0), 7-отрицательную реакцию (ИД<1,0).

Таким образом, бластоцисты обладают энтеротоксигенной активностью, причем эта активность у штаммов, выделенных у больных, выражена сильнее, чем у штаммов, изолированных у здоровых, что определяет, длительное персистирование В. hominis в кишечнике больных и объясняет механизм воздействия на макроорганизм.

Микроорганизмы в силу своей высокой биологической пластичности и тесной интегрированное™ в процессы эволюции, одними из первых реагируют на изменение качества среды обитания (Бухарин, 1992). Приспособляемость простейших В. hominis к различным экологическим нишам, с учетом закона конкурентного исключения Вольтера-Гаузе (1926 - 1935) предполагает преимущества тех организмов, которые обладают определенными биологическими свойствами, обеспечивающими устойчивое существование микроорганизмов в соответствующей экологической нише. I

Исходя из вышеизложенного, перспективным представляется изучение факторов персистенции бластоцист, поскольку именно эти свойства сообщают простейшим устойчивость к защитным механизмам хозяина, обеспечивают стабильность антагонистических отношений в биоценозах.

Принимая во внимание многообразие механизмов персистенции (Бухарин, 1990, 1992; Обгольц, 1992), остановимся на изучении секретируемого фактора бактериальной природы. Этот выбор был обусловлен работами исследователей школы О.В. Бухарина (с 1982 по настоящее время), в которых показано, что АИА встречается у широкого ряда микроорганизмов.

Одним из наиболее важных биологических свойств микроорганизмов, определяющих их способность выживать в условиях антимикробного прессинга макроорганизма и участвовать в патологическом процессе, является персистенция.

Проблема персистирования бактерий, как ключевое звено инфекционной патологии, представляет собой явление общебиологического характера (Бухарин, 1992) и имеет фундаментальное значение как одно из звеньев сложного процесса саморегуляции паразитарных систем (Беляков с соавт., 1987; Дерябин 1996, 1997).

Согласно классификации О.В. Бухарина (1990), в основу которой положен принцип структурно-функциональной адаптации бактерий, различают следующие механизмы персистенции: а) факторы, «экранирующие» клеточную стенку бактерий; б) наличие общих гетерогенных антигенов («антигенная мимикрия») в системе « паразит-хозяин»; в) секретируемые факторы бактериальной природы, инактивирующие защитные механизмы хозяина;' г) образование форм с отсутствием (дефектом) клеточной стенки бактерий.

В целях защиты возбудителя, находящегося в макроорганизме, от бактерицидных факторов сыворотки или фагоцитов микробная клетка располагает набором секретируемых бактериями субстанций, направленных на инактивацию механизмов иммунного гомеостаза организма (Бондаренко, Яблочков, 1987). К секретируемым началам, обеспечивающим персистирование микробной клетки, следует отнести антиинтерфероновый признак, выявленный в лаборатории О.В. Бухарина в 1988 г.

Изучение свойства бактерий инактивировать систему человеческого лейкоцитарного интерферона определено как антиинтерфероновая активность микроорганизмов (Бухарин, Соколов, 1988; Усвяцов, 1994). Литературные данные свидетельствуют, что частота встречаемости антиинтерферонового признака бактерий находится в тесной зависимости от источника выделения микроорганизмов и мало коррелирует с его видовой принадлежностью (Сурикова, 1990).

Выявление АИА свидетельствует о таком варианте микроорганизма, для которого экологической ниШей является больной организм. Однако, до настоящего времени изучение этого признака было проведено только среди представителей бактериальной флоры, в то время как данное свойство у возбудителей протозоозов, в частности, бластоцистоза, остается не изученным. Антиинтерфероновая активность широко представлена у простейших В. hominis, изолированных у людей с патологией пищеварительного тракта с инвазией бластоцист (73,33 %). Уровень АИА у бластоцист был неодинаков. Доля штаммов с низкими значениями АИА составила 53,53 % (53 штамма), со средним и высоким уровнями - 27,27 % (27 штаммов) и 19,19 % (19 штаммов) соответственно. Отмечено, 4to АИА бластоцист зависела от определенной морфологической формы. Высоким уровнем АИА обладали штаммы гранулярной и амебоидной форм. Уровень антиинтерферонового признака коррелировал с показателями патогенности бластоцист. Таким образом, экспериментально-клинические материалы демонстрируют о том, что антиинтерфероновая активность является определяющим признаком вирулентных и иммуно-супрессивных свойств микроорганизмов, обусловливающим более длительное и тяжелое течение заболеваний с возможным развитием осложнений (Бондаренко с соавт., 2002). Поэтому, антиинтерфероновую активность рассматривают как маркер персистенции, позволяющий использовать этот признак с целью оценки возможного участия возбудителя в развитии патологического процесса.

Антибиотикорезистентность является одной из важнейших характеристик патогенности микроорганизмов (Чахава с соавт., 1982, 1987; Смирнова, Сиченко, Романова, 1989; Машковский, 2000). В связи с этим, следующим этапом нашей работы явилось изучение чувствительности к антипротозойным препаратам бластоцист, выделенных у больных с разной продолжительностью заболеваний, а также в зависимости от их стадии - обострение или ремиссия.

Все выделенные штаммы бластоцист обладали различной чувствительностью к антипротозойным препаратам. Наибольшее количество изолятов было чувствительно к тинидазолу (52,4 %) и метронидазолу (47,8 %), менее выражено данное свойство было по отношению к орнидазолу (21,6 %). Это подтвердилось результатами определения минимальной ингибирующей концентрации, для тинидазола она составила 10"3 мг/мл, метронидазола - 10'4 мг/мл и орнидазола 10" мг/мл. Однако, значительная часть изолятов обладала выраженной резистентностью к антипротозойным препаратам: к тинидазолу и метронидазолу - 20,7 %, к орнидазолу - 45,0 %.

Определение чувствительности бластоцист к изученным препаратам показало некоторые различия в периоды обострения и ремиссии заболеваний желудочно-кишечного тракта. Так, при обострении наибольшее количество чувствительных штаммов обнаружено к тинидазолу и метронидазолу 52,4 % и 47,8 % соответственно. В период ремиссии количество штаммов, проявивших чувствительность, увеличилось до 56,7 % к тинидазолу и 54 % к метронидазолу. Отмечена зависимость изученных свойств от вирулентности изолятов, проявивших умеренную устойчивость к антипротозойным препаратам (г = 0,62).

Одними из наиболее чувствительных к действию инфекционных агентов защитных систем организма является система крови и иммунитета. Известно, что различные по своей природе болезнетворные и условно-патогенные микроорганизмы могут оказывать структурно-функциональную дезорганизацию клеток крови. В связи с этим, следующим этапом нашей работы явилось изучение морфофункциональных и морфометрических характеристик клеток крови (Новицкий, Уразова, 2004).

Установлено, что эритроциты обладают большой чувствительностью к воздействию токсических веществ (Калинина, Чещевик, 1990). Следовательно, возможно было предположить, что бластоцисты могут оказывать на эритроциты значительное воздействие.

Изучение влияния простейших В. hominis на количество эритроцитов крови кроликов проводили в различные сроки от начала вскармливания животных: через 10, 20, 30, 40 и 75 суток. Проведенные исследования показали значительное изменение количества, объема эритроцитов, содержания гемоглобина, их осмотической резистентности, а также активности глутактионредуктазы и Na+, К+- зависимой АТФ-азы эритроцитов под действием простейших В. hominis. Обращает на себя цикличность изменения этих показателей. Уже на 10 сутки от начала эксперимента у животных опытной группы наблюдалось увеличение количества эритроцитов -5,14±0,83-109/л. На 20 сутки от начала эксперимента количество эритроцитов снизилось до 4,38±0,2М09/л (в контрольной группе - 4,23±0,2-109/л). Снижение количества эритроцитов у животных продолжало и на 40 сутки

3,56+0,08-10% (у контрольных кроликов - 4,07±0,07-10%.). На 75 сутки от начала исследования количество эритроцитов у опытных животных составляло лишь 2,79+0,16-10% (у кроликов контрольной группы оставалось в прежних пределах). Полученные данные свидетельствуют о резких изменениях количественных показателей популяции эритроцитов при длительном вегетировании бластоцист в толстой кишке животных.

Параллельно с изучением динамики количества эритроцитов, в те же сроки, было проведено изучение объема эритроцитов кроликов, то есть их качественной характеристики. Собственные исследования показали, что через

20 суток от начала эксперимента наблюдалось увеличение объема эритроцитов животных опытной группы до 9,3+0,09 мкм3, а через 30 суток - снижение до 1

7,4+0,14 мкм . В последующие сроки наблюдалось дальнейшее уменьшение объема эритроцитов: через 40 суток - до 6,7±0,13 мкм и через 75 - до 5,7±0,22 мкм3. Таким образом, вперавые было установлено, что при экспериментальном бластоцистозе происходит циклическое изменение морфометрических показателей эритроцитов. В доступной литературе аналогичных исследований не обнаружено, но известно, что эритроциты участвуют в нейтрализации токсических веществ, так как их оболочка играет роль универсального адсорбента (Владимиров, 1989; Рязанцева, Новицкий, Степовая, 2003; Рязанцева, Новицкий, 2004).

Длительное вегетирование простейших Blastocystis hominis в организме кроликов вызывало изменение количества гемоглобина в эритроцитах этих животных. Данные свидетельствуют о снижении гемоглобина на 10 сутки от начала эксперимента у опытных животных по сравнению с контрольными (11,60±0,05 г/% и 13,32±0,05 г/% соответственно). Затем количество I гемоглобина у кроликов опытной группы резко увеличивалось и на 20 сутки достигало максимума (15,80±0,68 г/%), в то время как количество гемоглобина у контрольных животных не изменялось (13,30±0,36 г/%). Через 75 суток от начала эксперимента количество гемоглобина у опытных животных снижалось почти в 2 раза (5,81±1,09 г/%), как по сравнению с началом эксперимента, так и в отношении к показателям контрольной группы 13,33±0,28 г/%).

Таким образом, в первые 20 суток наблюдалось увеличение количества, I размеров, объема эритроцитов и содержания в них гемоглобина, что, по-видимому, возможно объяснить компенсаторными реакциями, проявляющимися, в частности, в усилении гемопоэза.

В основе снижения вышеперечисленных параметров, наступающего через 30 суток и продолжающегося до конца эксперимента, лежат, видимо, изменения биохимических процессов в мембранах эритроцитов, а также снижение их резистентности.

Известно, что за осмотическую устойчивость эритроцитов принимают то значение осмомолярности среды, при котором степень гемолиза достигает 50 % (Петренко, Владимиров, 1987). Результаты проведенных исследований выявили снижение осмотической резистентности эритроцитов у животных опытной группы в первые 10 суток. Затем, наступало резкое увеличение показателей осмотической резистентности, и через 20 суток от начала эксперимента они достигали максимума. С 30 суток и до конца эксперимента наблюдалось снижение осмотической резистентности, тогда как у контрольных животных она на протяжении всего опыта не изменялась. Однако, одна лишь резистентность не является в полной мере показателем свойств структуры мембраны без параллельных биохимических измерений.

Для понимания физиологических процессов, протекающих в эритроцитах, несомненную важность имеет изучение активности Na+, К+-АТФ-азы и глутатионредуктазы. С ферментом Ыа+,К+-АТФ-азы связана скорость гликолиза, а именно обеспечение активного обмена через мембрану ионов Na+ и К+. В течение всего периода наблюдения активность Ыа+,К+-АТФ-азы падала и на 75 сутки достигала 0,022±0,002 нмоль, что почти в 3 раза меньше по сравнению с началом опыта и почти в 4 раза меньше по сравнению с контролем

0,089±0,001 нмоль), что, по-видимому, объясняется нарушением работы «натриевого насоса». В результате снижения активности Na+,K+-ATO-a3bi уменьшается скорость гликолиза, нарушается энергетический обмен клеток. Следствием этого является раннее старение эритроцитов, что приводит к увеличению их объема.

В реакциях гликолиза участвует и глутатионредуктаза, являющаяся ферментом антиокислительной защиты, при ее недостаточности также уменьшается продолжительность жизни эритроцитов. Поэтому в собственных исследованиях определяли активность глутатионредуктазы эритроцитов кроликов при экспериментальном бластоцистозе. Изменение активности данного фермента отличалось от динамики предыдущих показателей тем, что не носило циклический характер. Уменьшение активности глутатионредуктазы отмечалось уже на 10 сутки. На 75 сутки активность глутатионредуктазы эритроцитов животных опытной группы резко снижалась и достигала 1,63±0,20 нмоль, что почти в 5 раз меньше по сравнению с началом эксперимента и почти в 8 раз меньше по сравнению с контролем (12,98±0,35 нмоль).

Поскольку в системе крови высоко чувствительны к персистированию простейших не только эритроциты, но и лейкоциты, в следующей главе было изучено воздействие бластоцист на эти форменные элементы. В результате исследований установлено наличие трехфазного изменения динамики количественного содержания лейкоцитов у экспериментальных животных. В течение первой недели от начала введения простейших В. hominis наблюдалось формирование абсолютной лейкопении. С четвертой по двенадцатую недели отмечался период абсолютного лейкоцитоза, который, по-видимому, объясняется мобилизацией компенсаторных механизмов организма животных. К четырнадцатой неделе формируется повторный период лейкопении у животных опытной группы, который можно объяснить истощением механизмов компенсации.

Учитывая важную роль лимфоцитов, как клеток эффекторов иммунологического ответа определяли их содержание в периферической крови опытных животных. В ходе эксперимента выяснилось, что динамика абсолютного и относительного количества лимфоцитов в целом повторяет колебания количественных значений лейкоцитов.

В связи с тем, что важную роль в механизмах реализации неспецифической резистентности организма играют нейтрофильные гранулоциты, была изучена динамика их количества в периферической крови. Установлено, что, начиная с 1 недели и до конца эксперимента, у животных формировалась стойкая нейтропения, подтвержденная показателями лимфоцитарно-нейтрофильного индекса.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ильина, Наталья Анатольевна, Ульяновск

1. Аврех В.В., Биргер М.О., Ведьмина Е.А., Влодавец В.В. Спавочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / под общ. ред. М.О. Биргера; Изд. 2 перераб. и доп. - М.: Медицина, 1973. - 455 с.

2. Ардатская Н.Д., Дубинин А.В., Минушкин О.Н. Дисбактериоз кишечника: современные аспекты изучения проблемы, принципы диагностики и лечения // Тер. архив. 2001. - №2. - С. 67-72.

3. Артемова Т.М., Яковлев А. А., Кравец П. Л. Дисбактериоз: патогенетический признак или заболевание? // Вопр. охраны материнства и детства.- 1999. Т.36, №9. - С.64-66.

4. Багрянцева О.В. Дисбактериоз у детей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта // Педиатрия. 1999. - №9. - С.73-77.

5. Барановский А.Ю., Кондрашин Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. Санкт-Петербург: Питер, 2000. 209 с.

6. Белова Л.М. Мировая фауна и морфофункциональная организация бластоцист // Труды ЗИН РАН. 1992. - Т.224. - 53 с.

7. Бельмер С.В., Гасилина Т.В. Рациональная терапия дисбактериоза кишечника у детей // Клинич. мед. 1998. - №10. - С.35-39.

8. Беляков В. Д., Голубев Д.Б., Каминский Г.Д., Тец В.В. Саморегуляция паразитарных систем молекулярно-генетические механизмы. Л., -1987.-240 с.

9. Билибин А.Ф. Дисбактериозы кищечника. В кн.: Болезни желудка и кишечника: Справочное пособие.- М.: Высш. шк. -1961. С.99-109.

10. Билимова С.И. Характеристика факторов персистенции энтерококков // ЖМЭИ. 2000. - №4. - С.104-105.

11. Бондаренко В.М., Яблочков A.JI. Антилизоцимная активность как генетически контролируемый фактор патогенности энтеробактерий. // Персистенция микроорганизмов. Куйбышев, 1987. - С. 85-89.

12. Бондаренко В.М., Горская Е.М. Медицинские аспекты микробной экологии. М., 1992. - Вып.6. - С.23-26.

13. Бондаренко В.М., Боев Б.В., Лыкова Е.А., Воробьев А. А. Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта // Рос. жур. гастроэнтер., гепатол., колопракт. 1998. - № 1. - С. 66-70.

14. Бондаренко В.М., Учайкин В.Ф., Мурашева А.О., Абрамов Н.А. Дисбиоз.-М., 1995.-20 с.

15. Бондаренко В.М., Учайкин В.Ф., Мурашева А.О., Шахмарданов М.З., Лучшеев В.М., Исаева Н.П. Дисбактериоз. М., 1997. - 22 с.

16. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых. М.: КМК, 2003. 224 с.

17. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. М.: Медицина, 1993. - С. 88-90.

18. Борисов Л.Б., Смирнов A.M. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицина, 1994. 528 с.

19. Брондз Б.Д. Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом распознавании. М.: Наука, 1987. - 470 с.

20. Буторова Л.И., Калинин А.В. Возможности коррекции нарушения кишечного микробиоценоза лактулозой. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2001. - №1. - С. 79-83.

21. Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий. // Журн. микробиол. 1994. - Приложение. С. 4-13.

22. Бухарина С.П. Дисбактериоз кишечника // Мед помощь. 2002. - №2. -С.58-60.

23. Бухарин О.В. Механизмы бактериальной персистенции. // Персистенция бактерий. Куйбышев, 1990. С. 5-14.

24. Бухарин О.В. Персистенция бактерий. Оренбург, 1992. 32 с.

25. Бухарин О.В., Валышев А.В., Челпаченко О.Е., Елагина Н.Н., Перунова Н.Б. Колиценогенная активность кишечной микрофлоры как показатель дисбиотического состояния желудочно-кишечного тракта. // Журн. микробиол. 2002. - № 4. - С.55-57.

26. Бухарин О.В., Соколов В.Ю. Способ определения антиинтерфероновой активности микроорганизмов. // А.с. СССР. № 1564191,1993.

27. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Антилизоцимный тест как маркер персистенции микроорганизмов // Теоретическая и прикладная иммунология: Тезисы докладов I Всесоюзной конференции. М., 1982. - С. 87-88.

28. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Унифицированные схемы методов лабораторных исследований при выделении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: Метод, рекомендации М.З. СССР. Оренбург, 1988.-46 с.

29. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я, Чернова O.JI. Патогенетические особенности формирования бактерионасительства // Микробиология, эпидемиология и иммунология. 1996. - №2. - С.98-101.

30. Ван-дер-Ваай Д. Пищеварительный тракт как главный эндогенный источник бактериальных и грибковых инфекций. Важность поддержания колонизационной резистентности // Антибиотики и химиотерапия. 1992. - Т. 37, №6. - С.36-41.

31. Вертиев Н.Д. Дисбактериоз кишечника в клинике соматических заболеваний // Врач. 1996. - №11. - С. 18-19.

32. Веселова Ю.Н. Клиника и лечение дисбактериоза кишечника // Клинич. медицина. 1988. - Т.75, №7. - С.47-49.

33. Владимиров Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитие патологических процессов // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1989. - №4. - С.7-19.

34. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой: Учебник для фельдш.-лоборант. отдел, мед. уч-щ. 2-е изд. перераб. и доп. М.: Медицина, 1982. - 304 с.

35. Воробьев А.А. Формирование микробиоценоза кишечника у новорожденных в норме и при антибиотикотерапии // Журн. микробиологии. 1997. - №10. - С. 48-53.

36. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Буданова Е.В., Иноземцева JT.O. Популяционно-генетические аспекты микробиологического фенотипа кишечника здорового человека // ЖМЭИ. 1995. - №4. - С.30-35.

37. Воробьев А.А., Иноземцева Л.О., Несвижский Ю.В., Белокриницкая О.А., Таранова М.В., Мухин Н.А. Особенности микрофлоры толстого кишечника при инфекционном эндокардите // Микробиология, эпидемиология и иммунология. 1996. - №1. - С.70-74.

38. Воробьев А. А., Пак С.Г., Савицкая К.И., Горбунова Ю.П. Дисбактериозы у детей: Учебное пособие для врачей и студентов. М., 1999.-64 с.

39. Гаврилов O.K., Козинец Г.И., Черняк Н.Б. Клетки костного мозга и периферической крови. -М.: Медицина. 1985. - С. 80-81.

40. Гаврилова А.Ю. Лактофлора и колонизационная резистентность // Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. - Т.32, №3. - С.173-179.

41. Генис Д.Е. Медицинская паразитология. М.: Медицина. - 1979. - 344 с.

42. Горская Е.М., Лизько Н.Н., Ленцнер А.А., Трофомиов К.Г., Плющева П.С. Биологическая характеристика штаммов лактобацилл, перспективных в качестве эубиотиков // ЖМЭИ. 1995. - №3. - С.17-20.

43. Григорьев П.Я., Яковенко Э.П. Нарушение нормального состава кишечной микрофлоры, клиническое значение и вопросы терапии.-Москва. 2000. - 16 с.

44. Дельфин М., Санхурхо Э. Cryptosporidium sp. у детей, больных диареей, на Кубе // Медицинская паразитология. 1989. - № 4. - С.36-39.

45. Денисов Г.И., Алешин А.И. Получение клебсиеллезных эритроцитарных диагностикумов // Матер. V объед. съезда гигиенистов, эпидемиол., паразитол., и инфекцион. Казахстана, Алма-Ата, 1991. -Т.5.-С.34-35.

46. Денисов Г.И., Каральник Б.В. Клебсиеллезные эритроцитарные реагенты // Микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1997. - №3. - С. 104105.

47. Дерябин Д.Г. Способность к инактивации факторов естественной резистентности в биологии и экологии стафилококков. Автореф. дис. д.м.н. Челябинск, 1997.

48. Дерябин Д.Г., Курлаев П.П., Брудастов Ю.А. Роль персистентных характеристик возбудителя в определении затяжного течения гнойно-воспалительного процесса. // Журн. микробиол. 1996. - №3. - С.74-77.

49. Дорофеев А.Э., Несвижский Ю.В. Микробиоценоз толстой кишки у больных неспецифическим язвенным колитом // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1997.- №2. - С.26-29.

50. Завгородняя Е.Ф., Зубова В.В., Медведева Л.И. Итоги и перспективы изучения микрофлоры кишечника детей и взрослых в норме и патологии // Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике. -М., 1983. С.181-182.

51. Калинина J1.M., Чещевик А.Б., Метод определения проницаемости мембран эритроцитов для моновалентных ионов // Лаб. дело. 1990. -№10.-С.53-55.

52. Кисляков Ю.А., Копыльцов А.В. Математическая модель движения несимметричного эритроцита по капилляру // Биофизика. 1990. -Т.35, Вып. 3.-С. 473-477.

53. Комаров Ф., Раппорт С. Возвращаясь к язвенной болезни // Врач. -2000.-№3. С. 9-11.

54. Корнева Т.К. Дисбактериоз кишечника у проктологических больных: микробиологические аспекты // Рос. Журн. Гастроэнтерол., гепатол., колопроктол.- 1999. №3. - С.12.

55. Коршунов В. Дисбактериоз сопутствующее заболевание // Мед. газета.- 1995.-№ 89.-С.9.

56. Костюк B.C., Меронов Т.М., Самсонова К.Е., Апрекова В.В., Крисько О.Р. Бактериальная колонизация и сукцессия у новорожденных детей в аспекте проблемы госпитальных инфекций // ЖМЭИ. 1998. - №10. -С. 19-22.

57. Крамарь B.C., Перов Ю.А., Крамарь О.Г., Клемашева Р.И., Стрельников П.П. Дисбактериоз. Причины возникновения. Лечение и профилактика. Ростов-на-Дону, 1988. - 25 с.

58. Крамарь О.Г., Крамарь B.C., Клемашева Р.И., Тютиков А.С. Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта. Волгоград, 1994. - 28 с.

59. Ю. Крамарь О.Г., Крамарь B.C., Крамарь Л.В., Чижикова Т.С., Трошникова К.Т. Колонизационная резистентность пищеварительного тракта. -Волгоград, 1993. 18 с.

60. Красноголовец В.Н. Дисбактериоз кишечника. Москва, 1989. - 208 с.

61. Красноперова Ю.Ю., Потатуркина-Нестерова Н.И., Ильина Н.А., Исаева И.Н., Кометова О.Н. Характеристика кишечного микробиоценоза людей, инвазированных бластоцистами // Материалы

62. Восьмой Российской Гастроэнтерологической Недели, 18-21 ноября 2002. Москва, 2002. - Т. XII, № 5. - С.216.

63. Краткий определитель бактерий Берги: Пер. с англ. / Под ред. Дж.Хоулта. М.: Мир. - 1980. - 495 с.

64. Крылов А.А., Козлович И.В., Решетнева Е.М. Дисбактериоз кишечника (пособие для врачей). С.-Пб.: Изд-во С.-Пб. Мед. академии. - 1994. -24 с.

65. Крылов А.А. // Определитель паразитических простейших. М. - 2004. -150 с.

66. Куваева И.Б. Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей. М.: Медицина.-1991.

67. Куваева И.Б. Обмен веществ организма и кишечная микрофлора. М.: Медицина, 1976.- 248 с.

68. Кузенков A.M., Маслова М.Н., Шалабазов А.Д. Исследование активности Na, К-АТФ-азы в эритроцитах млекопитающих // Биохимия. 1984. - Т.49, Вып.7. - С. 1089-1094.

69. Кулинич Д.Г., Абатуров А.Е., Герасименко О.Н., Верник А.Н. Взаимосвязь состояния иммунитета и микробиоценоза кишечника у детей раннего возраста, больных острыми заболеваниями органов дыхания // Микробиология. 1992. - №5. - С.27-29.

70. Купер М.Д., Керни Д., Шер И. В-лимфоциты // Иммунология. Пер. с англ. М.: Мир, 1987. - Т1. - С. 74-92.

71. Лабораторные методы исследования патогенных простейших / сост. Е.И.Горден / под ред. Д.Н.Засухина. М.: Медгиз, 1987. - 264 с.

72. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. - 58 с.

73. Ленцнер А.А. Микроэкология и некоторые актуальные направления исследований, диктуемые запросами практического здравоохранения // Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты. М.: Медицина, 1964. - 4.1. - С.14-15.

74. Ломинадзе Д.Г., Шинкаренко B.C., Мамисашвили В.А. Изучение траекторий движения эритроцитов в микрососудах с помощью метода автоматического анализа изображений // Бюлл. экспер. биол. и мед. -1990. Т. 109, №4. - С.343-344.

75. Малов В.А. Дисбактериозы кишечника // Мед. помощь. 2000. - № 5. -С.13-14.

76. Машковский М.Д. Лекарственные средства: Пособие для врачей. 14-е изд., перераб. и доп. - М.: Новая волна, 2000. Т. 1,2. - 608 с.

77. Мельникова В.Н. Проблемы химиопрофилактики, химиотерапии эндогенной инфекции и дисбактериоз // Вестн. РАМН. 1997. - №3. -С.26-30.

78. Меньшиков Л.Д., Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М., Артемьев С.В. Дисбиозы кишечника. М.: Медицина. - 1987. - 322 с.

79. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.Г. Лабороторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. - С.119-120.

80. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М, 1982.-495 с.

81. Ненашев А.А., Тищенко И.М. Исследование структуры популяции эритроцитов кондуктометрическим методом с использованием счетчика микрочастиц «Picostal PS - 4» // Лаб. дело. - 1987. - №9. - С. 648-653.

82. Ненашев А.А., Тищенко И.М. Определение функциональной активности популяции эритроцитов при различных гипоксических состояниях// Лаб. дело, 1986. -№3.-С.134-135.

83. Несвижский Ю.В., Воробьев А.А., Белоносов С.С., Лобанов В.Е., Иноземцева Л.О., Гаспарян С.А. Аналих простых межмикробных взаимоотношений в микробиоценозе толстой кишки человека // Вестн. РАМН. 2002. - № 3. - С.23-25.

84. Новицкий В.В., Уразова О.И. Дизрегуляционная патология кроветворной и иммунной систем // Успехи физиол. наук. 2004. - №1. - С.44-52.

85. Обгольц А.А. Механизмы персистирования бактерий. // Журн. микробиол., эпид. и иммун. 1992. - № 4. - С.70-72.

86. Одум Ю. Экология. М.', 1986. - Т.2. - С.98.

87. Онищенко Г.Г., Самошкин В.П. И Социально-гигиенический мониторинг практика применения и научное обеспечение: Сб. науч тр. - М., 2000.-4.1.-СЛ3-21.

88. Пальцев А. Микробная экология кишечника и ее и нарушения (конспекты врача) // Мед. газета. 2002. - № 69. - С.7-10.

89. Парфенов А.И., Богомолов П.О., Луфт В.М., Тимофеева Н.М., Морозов И.А., Денисов Н.Л. Морфофункциональные изменения и микробиоценоз тонкой кишки у больных язвенным колитом // Рос. жур. гастроэнтер., гепатол., колопр. 2000. - Т.10, № 1. - С.55-61.

90. Петренко Ю.М., Владимиров Ю.А. Изменения размеров эритроцитов при набухании в гипоосмотических средах // Биофизика. T.XXXIII, Вып.2. - 1987. - С.448-451.

91. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. -Москва, 1999. 1184 с.

92. Потатуркина-Нестерова Н.И., Арбузова Ю.Ю., Чебан Н.М., Ильина Н.А., Богомолова Л.К. Изучение этиопатогенетической роли Blastocystis hominis в патологии желудочно-кишечного тракта // Санкт

93. Петербург Гастро-2000: Материалы 2 Объединенной Всеармейской научной конференции, 20-22 сентября 2000. - Санкт-Петербург, 2000. -№ 1-2.-С.294.

94. Романенко Н.А. Современные задачи санитарной паразитологии // Мед. паразитология и паразитарные болезни. 2001. - №4. - С.25-29.

95. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Типовые нарушения молекулярной организации мембраны эритроцитов при соматической и психической патологии // Успехи физиолог, наук. 2004. - №1. - С.43-53.

96. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Степовая Е.А. Типовые изменения обратимой агрегации эритроцитов при патологических процессах разного генеза // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2003. - №1. - С.33-36.1.>.

97. Сахарова Т.В., Гордеева JT.M., Сергиев В.П. Изучение морфологии бластоцист низших обезьян с помощью световой микроскопии // Медицинская паразитология. 1997. - № 2. - С.24-27.

98. Сергиев В.П., Лебедева М.Н., Фролова А.А., Романенко Н.А. Паразитарные болезни человека, их профилактика и лечение // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1997. - С.8-11.

99. Сергиев В.П., Лебедева М.Н. Распространение паразитарных болезней и их профилактика в России // Мед. паразитол. 1997. - №3. - С.5-9.

100. Сизова Н.А., Шпагина Л.А., Каменская В.В. Динамика гемолитическойгрезистентности эритроцитов, фракционированных в температурном градиенте//Лаб. дело. 1986. -№1.-С.10-11.

101. Смирнова О.В., Сиченко И.Б., Романова С.В. Использование нового метода оценки антибиотикочувствительности микрофлоры кожи // Микрофлора кожи клинико-диагностическое значение: Матер, науч.-практ. конф., М, 1989. - С.43-49.

102. Соколов В.Ю. // Персистенция бактерий. Куйбышев, 1990. - С.83-93.

103. Сомов Г.П., Литвин В.Ю. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий: экологические аспекты. Новосибирск, 1988. - С.11-14.

104. Сорокин Е.М. Содержание восстановленного глутатиона эритроцитов у больных идиопатическим миелофиброзом и хроническим миелолейкозм // Лаб дело. 1980. - №2. - С.112-114.

105. Сорокин А.А., Федорова Е.Р. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника. Казань.: Казан, гос. ун-т усовершенств. врачей им. В.И. Ленина, 1990.-37 с.

106. Сурикова Е.В. Факторы персистенции клебсиелл // Микробиология. Приложение. 1994. - С.104-106.

107. Сытник И.А. Заселение тонкой и толстой кишок детей раннего возраста стафилококками в условиях стационара В кн.: Кишечные инфекции. -Киев. Вып.2. - 1989. - С.97-101.

108. Тец В.Н., Норман Л.Л. Изменеие вирулентности энтеробактерий в присутствии субингибирующих концентраций антибиотиков. // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - Т.36, № 4. - С.20-22.

109. Уиттекер Р. Сообщества и экосистемы. М, 1980. - 217 с.

110. Усвяцов Б.Я., Чернова О.Л., Гербич И.Н. и др. Особенности формирования стафилококкового пейзажа слизистой носа убактерионосителей разных типов // Журн. микробиол. 1994. -Приложение. - С.48-51.

111. Федянин Ю.П. Микрофлора кишечника при неспецифическом язвенном колите // Казан, мед. журнал. 1997. - № 3. - С.202-204.

112. Чайка Н.А. Бластоцистоз и СПИД // Медицинская паразитология. -1992. -№ 4.- С.48-51.

113. Чахава О.В. Гнотобиология о микрофлоре организма хозяина и антибиотикотерапии // Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. - Т. 32,№3.-С.170-173.

114. Чахава О.В., Горская Е.М., Рубак С.З. Микробиологические и иммунологические основы гнотобиологии. М., 1982. 160 с.

115. Шевчено Т.Ф., Крикунова Н.А. Способ определения хронической интоксикации организма. Авт. свидетельство № 1717101.

116. Шендеров Б.А. Некоторые первоочередные задачи отечественной микроэкологии // Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты. М., 1994. - 4.1.- С.7-9.

117. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол.- 1998. Т.7, №1. - С.61-65.

118. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. -М.: ГРАНТЪ, 1998-2001. 1-3. - 128 с.

119. Шептулин А.А. Синдром избыточного роста бактерий и «дисбактериоз кишечника»: их место в современной гастроэнтерологии // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1999. - №3. - С.24-30.

120. Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов / под ред. Нетрусова А.И. М.: Академия, 2004. - 272 с.

121. Akao N., Ohyama Т., Ohkawa Т., Kondo K., Hirokawa Y., Ito S., Takeguchi A., Matsuzaki M. A survey of intestinal parasites of the foreign laborers (Indonesians and Filipinos) in Ishikawa Prefecture // Kansenshogaku Zasshi. -1992.- V.66, P.1256-1261.

122. Albrecht H., Stellbrink H.J., Koperski K., Greten H. Blastocystis hominis in human immunodeficiency virus related diarrhea // Scand. J. Gastroenterol. - 1995. - V.30, № 9. -P.909-914.

123. Amin A.M. B.hominis among apparently healthy food handlers in Jeddan // J. Egypt.Soc.Parasitol. 1997. - V.27. - P.817-823.

124. Arienti H. Prevalence of enteroparasites in a residence for children in the Cordoba Province, Argentina // Eur. J. Epidemiol. 2000. - V.16. - P.287-293.

125. Aucott J.N., Ravdin J.I., Omobing N., Moore M., Eotu H., Ettari G. Amebiasis and "nonpathogenic" intestinal protozoa // Infect Dis Clin North Am. 1993. -V.7, №3. -P.467-485.

126. Babcock D., Houston R., Kumaki D., Shlim D., Borras R. Blastocystis hominis in Kathmandu, Nepal // N. Engl. J. Med. 1985. - V.28. - P.1419.

127. Bassily S. Potential clinical significance of Blastocystis hominis in Egypt // Soc. Trop. Med. Hyg. 1990. - V.84. - P.695.

128. Boreham P., Stenzel D. Blastocystis in human and animals: morphology, biology and epizootiology // Adv. Parasitol. 1993. - V.32. - P.61-70.

129. Boreham P.F., Dunn L.A., Upcroft S.A., Carbajal J.A., Villar J., Borras R.

130. Protein and DNA evidence for two demes of B. hominis from humans // Int.

131. J. Parasitol. 1992. - V.22, № 1. - P.49-53.

132. Brites C., Barberino M.G., Bastos M.A. ^Blastocystis hominis as a potential cause of diarrhea in AIDS patients // Braz. J. Infect. Dis. -1997. V.l, № 2. -P.91-94.

133. Brumpt E. B. hominis, sp. et formes voisines // Bull. Soc. Pathol. Exot. -1912. V.5. - P.725-730.

134. Camli C., Blum J. Hymenolepis nana. 45-year-old refugee from the Kosovo region with epigastric pain and detection of Hymenolepis nana and Blastocystis hominis in the stool //J. STD AIDS. 1999. -V.10. - P.780-784.

135. Carbajal J.A., del-Castillo L., Lanusa M.D., Villar J., Borras R. Karyotypic diversity among B. hominis isolates // Int. J. Parasitol. 1997. - V.27, № 8. -P.941-945.

136. Cassidy M., Stenzel D., Boreham P., Villar J., Lanuza M. D. Electron microspory of surface structures of B. sp. from different hosts // Parasitology.- 1994. V.80.-P.505-511.

137. Church D.L., Sutherland L.R., Gill M.J., Visser N.D., Kelly J.K. Absence of an association between enteric parasites in the manifestations and pathogenesis of HIV enteropathy in gay man // Scand. J. Infect. Dis. 1992.- V.24, № 5. P.567-575.

138. Cimerman S., Cimerman В., Lewi D.S. Prevalence of intestinal parasitic infections in patients with acquired immunodeficiency syndrome in Brazil // Int. J. Infect. Dis. 1999. - V.3, № 4. - P.203-206.

139. Cirioni O., Giacometti A., Drenaggi D., Ancarani F., Scalise G. Prevalence and clinical relevance of Blastocystis hominis in diverse patient cohorts // Eur. J. Epidemiol. 1999. - V.15. - P.389-393.

140. Clark C.G. Extensive genetic diversity in Blastocystis hominis II Mol. Biochem. Parasitol. 1997. - V.87. - P.79-83.

141. Cotte С., Blum J. Hymenolepis nana. 45-year-old refugee from the Kosovo region with epigastric pain and detection of Hymenolepis nana and Blastocystis hominis in the stool // J. STD AIDS. 1993. - V.10. - P.780-784.

142. Debat Zoguereh. Postcystis development of Blastocystis hominis II Parasitoses. 1995. - V.85. - P.437-440.

143. Devera R.A., Punos G.N. Prevalence of Я hominis infection from Bolivar City I I Bol Chin Parasitol. 1997. - V.52. - P.77-81.

144. Devera R., Azacon В., Jimenez M., Punos G.N., Velasquez V.J., Catenese J.A., Meneses R.G. Blastocystis hominis in patients at the Ruiz у Paez University Hospital from Bolivar City, Venezuela // Bol. Chil. Parasitol. -1998. V.53. - P.65-70.

145. Doyle P.W., Helgason M.M., Russo A.R., Stoun S.L., Taplin M.E. Epidemiolodgy and pathogenicity of Blastocystis hominis II J. Clin. Microbiol. 1990. - V.28. - P. 115-121.

146. Duda A., Stenzel D.J., Boreham P.F., Shiotani A., Graham D.Y. Detection of Blastocystis sp. in domestic dogs and cats // Vet. Parasitol.-1998.-V.31-P.9-17.

147. Dunn L.A., Boreham P.E., Stenzel D.S., Albrecht H., Stellbrink H.J., Koperski K. Ultrastrutural variation of B. hominis stocks in culture // Int. J. Parasitol. 1989. - V.19. -P.43-56.

148. Epelde Gonzalo F. Chronic diarrheic syndrom from Blastocystis hominis II Med Interna. 1996. V.13. - P.407-408.

149. Escobedo A., Nunez F.A., Mercado R., Otto J., Perez M. Blastocystis hominis infection in Cuban AIDS patientis // Med. Inst. Oswaldo Cruz. -1997. V.92, № 3. - P.321-322.

150. Fleta-Zaragozano J. The clinical manifestations profiices by B. hominis in childhood //Med. Clin. Bare.- 1998.- V.l 10, №12. P.478-479.

151. Garavelli P. Blastocystis: a new disease in the acquired immundeficiency syndrom // Int. S. STD. AIDS. 1990. -P.l34-135.

152. Garavelli P., Scaglione L., Bicocchir R., Libanere M. Genomic polymorphism among B. hominis strains and development of subtype-specific diagnostic primers // Mol. Cell. Prob. 1998. - V. 12, № 3. - P. 153159.

153. Garavelli P., Scaglione L., Rossi M., Bicocchir R., Libanere M. Blastocystis: a new disease in patients with leikemia // Haematologica.-1991.-V.76-P.76-80.

154. Garavelli P., Scaglione L., Rossi M., Bicocchir R., Libanere M. Blastocystis in Italy // Ann. Parasit. hum. сотр. 1989. - V.64. - P.391-395.

155. Garavelly P., Scaglione L., Furlani M., Caselli M., Gullini S. Blastocystis hominis and blastocystosis // Ital. J.Gastroenterol. 1993. - V.25. - P.33-36.

156. Ghosh K., Agyaril M. VHD involving the gastrointestinal tract and intestation with B. hominis in a patient with chronic myeloid leukaemia folloing allogenic bone marrow transplantation // Bone Marrow Transplant. -1998.-V.22,№ 11.-Р.Ш5-1117.

157. Gibson T.M., Klary E.H., Norton B.B., Temros J.H., Cassidy G.R., Praston V.D. The microbiota of the gastroitestinal tract // Gastroenterology. 1994. - V.51, №5. -P.808-815.

158. Guignard S., Arienti H., Freyre L., Lujan H., Rubinstein H. Prevalence of enteroparasites in a residence for children in the Cordoba Province, Argentina // Eur. J. Epidemiol.- 2000. V. 16. - P.287-293.

159. Ho L.C., Singh M., Suresh K., Ng G.C., Yap E.H., Hogg G.G., Fairley C.K. Prevalence of enteric pathogens among community based asymptomatic individuals // J. Gastroenterol. Hepatol. 1995 - V.15 - P.290-304.

160. Horiki N., Maruyama T. Intestinal blockage by carcinoma and Blastocystis hominis infection // J. Med. Hyg -1999. V.60, №3. - P.400-402.

161. Hussain B.L., de Arroyave K.R., Drlmont J., Faugere В., Bourgeade A. Multiyear prospective study of intestinal parasitism in a cohort of Peace Corps volunteers in Guatemala // J. Clin. Microbiol. -1997.-V.39 P.34-42.

162. Jeddy T.A., Farrington G.H. Blastocystis hominis complicating ulcerative colitis // J. Soc. Med. 1991. - V.84. - P.623.

163. Jelinek Т., Peyerl G., Loscher Т., von Sonnenburg F., Nothdurft H.D. The role of Blastocystis hominis as a possible intestinal pathogen in travelers // J. Infect. 1997.-V.35.-P.63-66.

164. Johnson A.M., Thanou A.A., Boreham P.F., Baverstock P.R. Blastocystis hominis: phylogenetic affinities determined by rRNA sequence comparison // Exp. Parasitol.- 1989.- V.68.- P.283-289;

165. Kain K.C., Noble M.A., Freeman H.J., Barteluk R.L. Epidemiology and clinical features associates with B. hominis II Diagn. Microbiol. Infect. Dis-1987. V.8. - P.234-244.

166. Kaneda S.W., Ng G.C., Howe J., Ramachandran N.P., Yap E.H., Singh M. Blastocystis hominis: A simplified, high-efficiency method for clonal growth on solid agar // Exp. Parasitol. 2000. - V.96, №1.- P.9-15.

167. Keenan Т., Cleghorn R., Zierdt C.H., Huang C.M., Glaziou P., Hocquet D. B. hominis is a new desease // Biochem. J 1992. - V.289. - P.l-7.

168. Keenan T.W. DNA polymorphism reveales by arbitrary primers polymerase chain reaction among Blastocystis strains isolated from humans, achicken and a reptile//J. Eukaryot. Microbiol.- 1996,- V.43, №2.-P. 127-130.

169. Kleessen F.M., Gorden T.V., Cantonelly G.I., Faycii D.S., Spriden H.K., Tortiny D.J., Cowart A.O. Human normal and abnormal gastrointestinal flora // Am J Clin Nutr.- 1995. V.23, №11.- P.1433-1439.

170. Kobayashi J., Hasegawa H., Forli A.A., Nishimura N.F., Yamanaka A., Shimabukuro Т., Sato Y. Prevalence of intestinal parasitic infection in five farms in Holambra, San-Paulo, Brazil//Rev. Inst. Med. Trop.-1995.-V.37-P.13-18. ' .

171. Koperski К., Greten H. В. hominis immunodeficiency virus-related diarrhea. // Scand. J. Gastroenterol.- 1995. V.30. - P.909-914.

172. Konig G. B. hominis in animals: incidence of four serogroups // Zentral. Bacteriol. 1997. - V.286, № 3. - P.435-440.

173. Kruger K., Kamilli I. B: hominis als seltener arthritogener Erreger // Z. Rheumatol. -1994. V.53, № 2. - P.83-85.

174. Landry P., Van Saanen M. Routine cases in intestinal parasitology // Schweiz Med. Wochenschr. 1997. - V.29. - P.535-540.

175. Lanusa M.D. Description of an improved metod for B. hominis culture and axenization // Parasitol. Res. 1997. - V.83, №1. - P.60-63.

176. Lanusa M.D., Carbajal J.A., Borras R., Boccardo G., De Prisco 0., Ettari G. Identification of surface coat carbohydates in Blastocystis hominis by lectin probes // Int J Parasitol. 1996. - V.26, №5. - P.527-32.

177. Lee M.G., Rawlins S.C., Jensen В., Kepley W., Guarner J. Infective arthritis due to B. hominis II Rheum. Dis. 1990. - Vol.49. - P. 192-193.

178. Libre J.M., Tor J., Manterola J.M., Cabonell C., Faz M. B. hominis chronic diarrhea in AIDS patients II Lancet. 1989. - № 1. - P.221.

179. Mac Cleur H.M., Strobert E.A., Healy G.R., Anderson K., Clairmont J. The B. hominis.- New York. 1998. - V.36, №21. - P. 236-241.

180. Mac Pherson D. W., Mac Gueen W.M. Morphological diversity of B. hominis in sodium acetate-acetic acid-formalin-preserved stool samples stained with iron hematoxylin II J. Clin. Microbiol. 1994. - V.32, № 1. - P.267-268.

181. Maggi P., Brandonisio 0. Intestinal protozoa in HIV-infected patients in Apulia, South Italy // Epidemiol Infect. 1999. - V.123. - P.457-462.

182. Markell E.K., Udkow M.P. B.hominis Pathogen or fellow traveller? IIAm. J. Trop. Med. Hyg. 1986. - V.35. - P.1023-1026.

183. Martinez E.A., Garsia Del Castillo G., Ruiz Gomez F.A., De Laune W., Masozera N. Cytomegalovirus in upper gastrointestinal ulcers // Gastroenterol Hepatol. 2001. - V. 25, № 6. - P.383-386.

184. Mathewson I.I., Salameh B.M., DuPont G.L., Jaing Z.D., Nelson A.S., Arduino R. Variation in the cysts morphology of B. hominis II Parasitol. Res. 1998. - V.83. - P.306-308.

185. Matsumoto I., Iamada M., Ioshida I., MacDuodall R.J., Tandy M.W. Light microscopical appearance and ultrastructure of B. hominis, an intestinal parasite of man // Zentral. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1987. - V.264. -P.379-385.

186. Mendes U. // Klinische Pathophysiologie.-Stuttgert-New York. 1994-P.864-900.

187. Mercado R., Arias B. Blastocystis hominis: frequency of infection in ambulatory patients from the northern section of Santiago, Chile // Bol. Chil. Parasitol. 1991. - V.46. - P.30-32.

188. Mercado R., Otto J., Perez M., Jimenes M. Seasonal variation of intestinal protozoa infections in outpatients of the north section of Santiago, Chile // Bol. Chil. Parasitol. 1999. - V.54. -P.41-47.

189. Miller R.A., Minshew B.H. B. hominis an organism in search of a disease // Rev. Infect. Dis.- 1988.-, V. 10.-P.930-938.

190. Мое K.T. Development of Blastocystis hominis cysts into vacuolar forms in vitro // Parasitol Res. 1997. - V.85, №2. - P. 103-108.

191. Мое K.T., Singh M„ Howe J., Ho L.C., Tan S.W., Hg G.C., Chen X.Q., lap E.H. Observations on the ultrastructure and viability of the cystic stage of B. hominis from human feces // Parasitol. Res. 1996. - V.82, №5. - P.439-444.

192. Мое K.T., Singh M., Howe J., Ho L.C., Tan S.W., Chen X.Q., Hg G.C., Yap E.H. Experimental Blastocystis hominis infection in laboratory mice // Parasitol. Res. 1998. - V.83. - P.319-325.

193. Muller H.E. Four serologically different groups within the species Blastocystis hominis II Zentralbl. Bakteriol. 1994. - V.280. - P.403-408.

194. Myjak M. Scanning electron microscopy of Blastocystis hominis cysts // Parasitol.Res. 1997. - V:84. - P.476-477.

195. Nagler J., Brown M. Blastocystis hominis in inflammatory bowel disease // J. Clin. Gastroenterol. 1993. - V. 16, № 2. - P. 109-112.

196. Nelson J.D. Etiology and epidemiology of diarrheal diseases in the United States // Am. J. Med. 1985. - V.28. - P.76-80.

197. Ng G.C., Ho L.C., Singh M., lap A.L., Мое K.T. Axenic culture of Blastocystis isolates in monophasic medium and speciation by karyotypic typing // Parasitol. Res. 1996. - V.82, № 2. - P. 165-169.

198. Nimri L., Batchoun R. Intestinal colonization of symptomatic and asymptomatic schoolchildren with Blastocystis hominis II J. Clin. Microbiol. 1994. - V.32. - P.2865-2876.

199. Pakand M. Occurrence of Blastocystis sp. in pigs // Parasitol. Res. 1991. -V.38, № 4. -P.297-301.

200. Pakianathan M.R., Millan A. Intestinal protozoa in homosexual men in Edinburgh // Schweiz Rundsch Med Prax. 1999. - V.88. - P.877-879.

201. Perez de Suarez E., Guzman de Rondon C. Morphology of B. hominis in feces and evaluation of parasitological methods // GEN.-1994.-V.48, № 4 P.226-231.

202. Philips B.P., Zierdt C.H. B. hominis: pathogenic potential in human patients and in gnotobiotes // Exp. Parasitol. 1976 - Vol.39. - P.358-364.

203. Pikula Z.P. B. hominis and human disease (letter) // J. Clin. Microbiol. -1987.-V.25.-P.1581.

204. Prasad K.N., Nag V.L., Dhole T.N., Ayyagari A. Identification of enteric pathogens in HIV-positive patients with diarrhoea in northern India // J. Health. Popul. Nutr. 2000. - V. 18, № 1. - P.23-26.

205. Qadri S.M., Al-Okaili G.A., Al-Dayel F.C. Clinical significance of B. hominis /I J. Clin. Microbiol. 1989. - V.27. - P.2407-2409.

206. Rajah S.H., Suresh K.G., Vellayan S., Мак J.W., Khairul Anuar A., Init I., Vennila G.D., Saminathan R., Ramakrishnan K. Blastocystis in animal handlers // Parasitol. Res. 1999. - V.85. - P.l 032-1033.

207. Reinthaler F.F., Mascher F., Math E., Tandy M., Finlay C. Blastocystis hominis intestinal parasit or commensal // Wien. Med. Wochenschr. -1988. - V15. -P.545-552.

208. Rengpien S., Bailey G. Differetiation of Entamoeba', a new medium and optimal conditions of axegenic encystations of E. invadens II J. Parasitol. -1975. V.6. - P.24 - 30.

209. Ricci N., Toma P., Furlani M., Caselli M., Gullini S. Blastocystis hominis: a neglected cause of diarrhoea // Lancet. 1984. - V.28. - P.966.

210. Rivero-Rodriguez Z., Chourio-Lozano G., Diaz I., Cheng R., Rucson G. Enteroparasitos en escolares de una institucion publica del municipio Maracaibo, Venezuela // Ihvest. Clin. 2000. - V.41. P.37-57.

211. Russo A.R., Stoun S.L., Taplin M. E. Presumptive evidence for B. hominis as a cause of colitis // Arch. Inter. Med. 1988. - V. 148. - P. 1064.

212. Sheehan D.J., Raucher B.G., McKitrick J.C. Association of Blastocystis hominis with signs and symptoms of human disease // J. Clin. Microbiol. -1986. V.24. - P.548-550.

213. Sherchand J.B., Larsson S., Shrestha M.P. Intestinal parasites in children and adults with and without abdominal discomfort from the Kathmandu area of Nepal // Trop. Gastroenterol. 1996. - V.17. - P. 15-22.

214. Shlim D. Blastocystis hofninis in Kathmandu, Nepal // N. Engl. J. Med. -1995.-V.28.-P.1419.

215. Silberman J.D., Sogin M.L., Leipe D.D., Clark C.G., Muller J. Human parasite finds taxonomic home //Nature. 1996. - V.380, №6. - P.398.

216. Sinclar E.B., Dommett L.S., Healey A., Uperoft P., Uperoft J.A. Polymicrobial etiology of travellers' diarrhoea // Lancet. 1995. - V.16. -P.381-385.

217. Singh M. Ultrastructural changes during in vitro encystment of Blastocystis hominis II Parasitol. Res. 1994. - V.80, № 4. - P.327-335.

218. Singh M., Suresh К., Ho L.C., Yap A.L. Elucidation of the life intestinal protozoan Blastocystis hominis II Parasitol. Res. 1995. - Vol.81. - P.446-450.

219. Soledad Gomez M., Gracenea M., Montoliu I., Feliu C., Monleon A., Fernandez J., Ensenat C. Intestinal parasitism protozoa and helminthes - in primates at the Barcelona Zoo // J. Med. Primatol. - 1996. - V.25. - P.419-423.

220. Steinmann E., di-Gallo A., Dubach V.C. Atiology of diarrheal diseases in immunocompetent and HIV-positive Patients // Schweiz. Med. Wochenschr.- 1990.-Vol.120.-P.1253-1256.

221. Stenzel D.J., Boreham P.F. A cyst-like of Blastocystis hominis I I Int. J. Parasitol. 1991. - V.21, № 5. p.613-615.

222. Stenzel D.J., Boreham P.F. B. hominis revisited // Clin. Microbiol. Rev. -1996. V.9, № 4. - P.563-584.

223. Stenzel D.J., Dunn L.A. Endocystosis in cultures of Blastocystis hominis II Int. J. Parasitol. 1989. - V.19, № 7. - P.787-791.

224. Storgaard J.D., Sogin M.L., Leipe D.D., Clark C.G. Human parasite finds taxonomic home // Nature. 1996. - V.380. - P.398.

225. Suresh K., Chong S.I., Howe J. Tubulovesicular elements in B. hominis from the caecum of experimentally infected rats // Int. J. Parasitol. 1995. - V.25, № 1.-P. 123-126.

226. Suresh K., Howe J., Ng G.C. A multiple fission-like mode of asexual reproduction in B. hominis II Parasitol. Res. 1994. - V.80, № 6. - P.523-527.

227. Suresh K., Ng G.C., Ramachandran N.P. In vitro encystment and experimental infections of B. hominis II Parasitol. Res. 1993. - V.19, № 6.- P.456-460.

228. Taamasri P., Mungthin M., Rangsin R., Tongupprakarn В., Areekul W., Leelayoova S. Transmission of intestinal blastocystosis related to the quality of drinking water // J. Trop. Med. 2000. - V.31. - P.l 12-117.

229. Tan H.K., Zierdt C.H. Ultrastructure of Blastocystis hominis II Z. Parasitenkd. 1973. - V.23. - P.315-324.

230. Tan S.W., Singh M. Clonal growth of B. hominis in soft agar with sodium thiogly collate // Parasitol. Res. 1996. - V.82, № 8. - P.737-739.

231. Taylor D.N., Echeverria P., Blaser M.J., Pitarangsi C., Blacklow N., Cross J., Weniger B.G. Polymicrobial aetiology of travellers' diarrhoea // Lancet. -1995. V.16. - P.381—385.

232. Taylor D.N., Houston R., Shlim D.R., Bhaibulaya M., Ungar B.L., Echeverria P. Etiology of diarrhea among travelers and foreign residents in Nepal // JAMA. 1988. - V.260. - P. 1245-1248.

233. Thepsuparungsikul V., Seng L., Baily G.B. Differential of Entamoeba: encystation of E. invadens in monoxenic and and axenic cultures // J. Protozool.,- 1971.-V.57.-P.1288-1292.

234. Tsang Т.К., Levin B.S., Morse S.R. Terminal ileitis associased with B. hominis infections // Am. J. Gastroenterol.- 1989.- V.85. P.795-799.

235. Upcroft J.A., Dunn L.S. et al. Chromosomes of Blastocystis hominis II Int J Parasitol. 1989. -V. 19.- P. 879-883.

236. Van Saanen-Ciurea M., El-Achachi H. Blastocystis hominis: morphological study using optical and electron microscopy // Bull Soc Pathol Exot Filiales. 1983. - V.76. - P.766-776.

237. Vdovenko A.A. Blastocystis hominis: origin and significance of vacuolar and granular forms // Parasitol. Res. 2000. - V.86. - P.8-10.

238. Villar D.J., Boreham P.F., McDoygall R. Ultrastructure of B. hominis in human stool samples // Int. J. Parasitol. 1998. - V.21, № 7. - P.807-812.

239. Walker W.A. Роль микрофлоры в развитии защитных функций кишечника // Педиатрия. 2005, №1. - С.85-91.

240. Wilairatana P., Radomyos P., Radomyos В., Phraevanich R., Plooksawasdi W., Chanthavanich P., Viravan C., Looareesuwan S. Intestinal sarcocystosis in Thai laborers // J. Trop. Med. 1996. - V.27. - P.43-46.

241. Yoshikawa H. Freeze-fracture study of Blastocystis hominis II J. Protozool. -1988. V.35. - P.522-528.

242. Yoshikawa H., Abe N., Iwasawa M., Kitano S., Nagano I., Wu Z., Takahashi Y. Genomic analysis of Blastocystis hominis strains isolated from two long-term health care facilities // J. Clin. Microbiol. 2000. - V.38. - P.l 3241330.

243. Yoshikawa H., Hayakawa A. Freeze-frature cytochemistry of membrane cholesterol in B. hominis II Int. J. Parasitol. 1996. - V.26. - P.l 111-1114.

244. Yoshikawa H., Nagano I., Wu Z., Yap E.H., Singh M., Takahashi Y. Genomic polymorphism among of Blastocystis hominis strains and develpment of subtype-specific diagnostic primers // Mol. Cel. Probes-1998. -V.12, №3. P.l 53-159.

245. Yoshikawa H., Yamada M., Yoshida Y. Freeze-fracture study of Blastocystis hominis II J. Protozool. 1995. - V.35. - P.522-528.

246. Zaki M., Manzoor M., Howe J., Ng M. Postcystis development of Blastocystis hominis // Parasitoses. 1994. - V.85. - P.437-440.

247. Zaman V., Howe J., Hg M. A comparative morphology of Blastocystis hominis cysts with and without the "fibrillar layer" // Southeast Asian J. Trop Med. 1996. - V.26. - P.801-802.

248. Zaman V., Howe J., Hg M. Observation on the surface coat of B. hominis II Parasitol. Res. 1997. - V.83, № 7. - P.731-733.

249. Zaman V., Howe J., Hg M. Scanning electron microscopy of Blastocystis hominis cysts // Parasitol. Res. 1998. - V.84. - P.476-477.

250. Zaman V., Howe J., Hg M. Ultrastructure of B. hominis cysts // Parasitol. Res. 1995. - V.81, № 6. - P.465-469.

251. Zdero M. Parasitosisen una peblacion adulta con trastornos gastrointestinales cronicos // Acta Gastoenterol. Latinoam. 1997. - V.27. - P.67-73.

252. Zierdt C. Studies ofB. hominis II J. Protozool. 1983. - V.20. - P.l 14-121.

253. Zierdt C.H. B. hominis Past and future // Clin. Microbiol. Rev- 1991.-V.4. -P.61-79.

254. Zierdt C.H. Blastcystis hominis an intestinal protozoa parasite of man // Publ. Hlth. Lab. 1978. - V.36. -P.147-161.

255. Zierdt C.H. Blastocystis hominis, a longmisunderstood intestinal pathogen // Parasitol. Taday. 1988. - V.4. - P. 15-19.

256. Zierdt C.H. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of serum antibody to B. hominis in symptomatic infections // J. Parasitol. 1996-V.81- P.l 27—129.

257. Zierdt C.H. Ultrastructure and light microscope appearance of B. hominis in a patient with enteric // Z. Parasitenk. 1976. - V.50. - P.277-283.

258. Zierdt C.H., Мое K.T., Singh M., Ho L.C., Tan S.W. Atiologie von Durchfallserkrankungen bei immunkompetenten und HIV-positiven Patienten. //Schweiz. Med. Wochenschr.- 1988. V.4. - P. 15-19.

259. Zierdt C.H., Rude W.S., Bull B.S., Echeverria P., Blaser M.J., Pitarangsi C., Blacklow N., Cross J. Protozoan characteristics of B. hominis.// Am.J. Clin. Pathol. 1967. - V.48. - P.495-501.

260. Zuckerman M.J., Ho H., Hooper L. Frequency of recovery of B. hominis in clinical practice // J. Clin. Gastroenterol. -1990. V.12. - № 5. - P.525-532.1. PD0.Cemi ФЖ:2 2 21. SS SS BS SSмщ1. Г?Гя1. Hip) л1. НА ИЗОБРЕТЕНИЕ2224465

261. СПОСОБ ЗАРАЖЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ БЛАСТОЦИСТАМИ

262. Патентооб;1адатель(ли): Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна, Чебан Наталья Масхудовна, Квасова Наталья Анатольевна, Исаева Ирина Николаевна, Красноперова Юлия Юрьевна, Кометова Ольга Николаевна, Бурганова Рамиля Фаридовна

263. Аитор(ы): Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна, Чебан Наталья Масхудовна, Квасова Наталья Анатольевна, Исаева Ирина Николаевна, Красноперова Юлия Юрьевна, Кометова Ольга Николаевна, Бурганова Рамиля ФаридовК'а•К'

264. Заявка №2002114890 Приоритет изобретения 05 июня 2002 г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27февраля 2004 г.

265. Срок действия патента истекает 05 июня 2022 г.

266. Генеральный директор Российского агентства по патентам и товарным знакамs 2 £2 £ 2 2 2 22 2 2 2 21. К 2 2 2 2 2