Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПЦР-диагностика криптоспоридиоза кур

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "ПЦР-диагностика криптоспоридиоза кур"

На правах рукописи

Уездина Анастасия Викторовна

ПЦР - ДИАГНОСТИКА КРИПТОСПОРИДИОЗА КУР 03.00.19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□03166036

Москва - 2008

Работа выполнена в лаборатории протозоологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я. Р Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук и лаборатории молекулярной диагностики Института молекулярной генетики Российской академии наук

Научный руководитель:

- доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РСФСР, Заблоцкий Вячеслав Титович

Официальные оппоненты:

- лауреат премии Совета Министров СССР, заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент Академии естествознания, доктор биологических наук, профессор Дьяконов Л П (ВИЭВ)

- доктор биологических наук, профессор Бенедиктов И И

Ведущая организация ФГОУ ВПО «Московская Государственная Академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина»

Защита диссертации состоится « & » 2008 г

в час на заседании диссертационного совета Д 006 011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при ГНУ Всероссийском институте гельминтологии им К И Скрябина (117218, Москва, Б Черемушкинская, 28)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан « (р » çSfCifîrtf 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

В К Бережно

1. Общая характеристика работы.

1.1. Актуальность темы. Птицеводство занимает важное место в сельскохозяйственном производстве В условиях интенсивных технологий ведения птицеводства цыплята с первых дней жизни подвергаются воздействию факторов как инфекционной, так и неинфекционной природы, что приводит к снижению общей неспецифической резистентности организма и вызывает резкие морфо-функциональные изменения в желудочно-кишечном тракте, которые влияют на работу пищеварительного тракта, рост и продуктивность птиц Серьезную проблему в промышленном птицеводстве представляет криптоспоридиоз

Криптоспоридии известны как паразиты преимущественно кишечного тракта, хотя они были установлены и в других органах и тканях животных (Fayer R, Ungar В L, 1986)

В соответствии с определением ВОЗ криптоспоридиоз отнесен к числу типичных зоонозов, возбудители которых трансмиссируются с позвоночными животными, птицами и человеком

Несмотря на некоторые успехи в изучении криптоспоридиоза во многих странах мира, в том числе и в нашей стране, он продолжает оставаться актуальной проблемой ветеринарии и медицины При этом следует отметить, что наиболее сложной стороной в решении данной проблемы является диагностика криптоспоридиоза

В настоящее время криптоспоридиоз широко распространен на животноводческих и птицеводческих фермах, особенно в странах европейского континента, где заболеваемость телят этой инвазией колеблется от 22 до 40% от числа заболевших с признаками диареи Наряду с телятами высокую чувствительность к возбудителю проявляют ягнята и козлята Мыши, крысы и морские свинки также заражаются ооцистами криптоспородий, но без проявления клиники болезни, будучи при этом "резервуаром" для инфицирования домашних животных У птиц криптоспоридиоз чаще имеет респираторную форму, реже - кишечную

1

Частота поражения респираторного тракта у млекопитающих окончательно не изучена Ооцисты криптоспоридий обладают чрезвычайной устойчивостью к разным лечебным антимикробным и антипаразитарным веществам, а также дезинфицирующим средствам Заражение животных и птиц происходит алиментарно и аэрогенно (МшгЬеас! Б, 1986, Раукшек 1,2001)

В своих исследованиях мы исходили из интереса к изучению опасного антропозооноза - криптоспоридиоза птиц

Актуальность проблемы криптоспоридиоза птиц обусловлена отсутствием надежных экспресс-методов диагностики, что и определило цель и задачи наших исследований

1.2. Цель и задачи работы. Изучить распространенность криптоспоридиоза кур в Саратовской и Московской областях, разработать диагностическую тест-систему на основе ПЦР для выявления возбудителя криптоспоридиоза кур

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- Подобрать специфические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК Сг)фо8ропс1шт Ьау1е1,

- Отработать условия проведения полимеразной цепной реакции с использованием полевого штамма идентифицируемого возбудителя, включая подбор методики выделения ДНК,

- Определить оптимальную концентрацию компонентов реакционной смеси, температурный режим, условия регистрации результатов анализа,

- Апробировать разработанную ПЦР тест-систему в экспериментальных условиях на таксономическую специфичность, включая использование клинического и патологического материала от естественно зараженной птицы и лабораторных животных

- Провести эпизоотологическое обследование птицеводческих хозяйств и исследовать клинический материал от больной птицы на наличие Cryptosporidium baylei,

1.3. Научная новизна.

Подобрана методика выделения ДНК из культур клеток простейших организмов, клинического и патологического материала,

Разработана экспериментальная диагностическая тест-система на основе ПЦР для диагностики криптоспоридиоза кур подобраны специфические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК, определены оптимальные условия проведения ПЦР

Проведено эпизоотологическое обследование специализированных хозяйств Московской и Саратовской областей,

1.4. Практическая значимость. Разработаны методические указания по применению экспериментальной тест-системы ПЦР для выявления ДНК Cryptosporidium baylei, которые рассмотрены и одобрены Ученым советом ВИЭВ 2006 года

Представленные результаты наших исследований могут быть использованы в практической ветеринарии для прижизненной и посмертной диагностики криптоспоридиоза птиц

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

оптимизация условий и конструирование праймеров для выявления и идентификации криптоспоридий,

разработка и апробация тест-системы на основе ПЦР для диагностики криптоспоридиоза кур

эпизоотологическое обследование специализированных хозяйств -субъектов РФ

1.6. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на научно-производственных конференциях, Ученом совете ВИЭВ (2007), межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (2007)

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научных работы, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ

1.8. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на /страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы Материалы диссертации иллюстрированы ^ таблицами, рисунками Список литературы включает

источников, из них зарубежных

2. Собственные исследования. 2.1. Материалы и методы.

Работа выполнена в период с 2002 по 2005 г г в лаборатории протозоологии ГНУ Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им ЯР Коваленко и в лаборатории молекулярной диагностики Института молекулярной генетики Российской академии медицинских наук.

С целью выявления возбудителя криптоспоридиоза птиц и определения степени инвазированности цыплят нами было проведено обследование на четырех птицефабриках и одном племрепродукторе Iт порядка

- Московская область, Нарофоминский район, ЗАО птицефабрика «Элинар Бройлер »,

- Московская область, г Люберцы, ЗАО птицефабрика «Мирная»,

- Московская область, Конобеевский р-н, п/ф «Барановское», -Саратовская область, Татищевский р-н, ФГУП «Племрепродуктор

Зоринский»

Специализированные предприятия имели аналогичный тип технологии содержания, кормления, породы, возраста

Для разработки экспериментальной тест-системы ПЦР для обнаружения и идентификации возбудителя криптоспоридиоза кур мы использовали полевой штамм Cryptosporidium baylei Данный штамм был получен от птиц из хозяйств Московской и Саратовской областей

Ооцисты возбудителя имеют овальную форму и тонкую стенку, размер в среднем составляет 5,0 - 4,6 мкм В препаратах, приготовленных из свежего материала и окрашенных методом Циля-Нильсена, ооцисты имеют вид овальных образований ярко-красного цвета

Для проверки таксономической специфичности разрабатываемой экспериментальной тест-системы нами была использована ДНК различных близкородственных видов организмов (токсоплазмы, эймерии) Культура клеток эймерий (Eimena tenella) в концентрации 1млн клеток в 1мл, представленная лабораторией протозоологии ВНИВИП г Санкт-Петербург, Toxoplasma gondii предоставлен заведующим лабораторией протозойных инфекций НИИЭиМ им Н Ф Гамалеи к м н ДБ Гончаровым, полевой штамм Cryptosporidium baylei и Cr parvum в концентрации 10 ООО м кл /мл Лабораторные животные

В качестве лабораторной модели для поддержания выделенного нами экспериментального штамма криптоспоридий использовали беспородных белых мышей и крыс в возрасте 1-20 дней Клинический и патологический материал

Материалом для исследования служили фекалии, смывы с носоглотки, прямой кишки, слюна, ткани кишечника

Всего исследовано 2021 проба клинического материала от кур и 30 проб патологического материала от цыплят-бройлеров

В работе использовано следующее лабораторное оборудование ламинар бокс JI-5B, центрифуга Mikro 120, Hettich Eppendorf centrifugo 5415, термостат Termo 24-15 Biokom, вортекс Fuge-vortex, LABOTER ПЦР бокс

ДНК-Технология; амплификатор Вюкош, трансиллюминатор, микроскоп ЛОМО - МББ-1А

Химические реактивы.

1 Транспортная среда (10 mM Tns HCl, 1 тМ EDTA pH 8,0, 2% DDT),

2 Лизирующий раствор,

3 Отмывочный раствор,

4 ТЕ-буфер для элюции ДНК,

5 Раствор фермента протеиназы К,

6 5хТВЕ (трис; борная кислота, 0,5 m EDTA),

7 Красители 1% раствор бромистого этидия, бромфенол синий,

8 Хлорид магния (MgCl2),

9 Фермент Taq-полимераза,

10 Водонасыщенный хлороформ,

11 Реакционная смесь (Н2О, dntp, BxlO, Mg2+).

Материал, используемый нами для экспериментальной работы, получали от спонтанно и экспериментально зараженных цыплят-бройлеров и лабораторных животных (мыши, крысы)

Материалом для исследований служили пробы фекалий и смывы с прямой кишки, носоглотки от птицы из специализированных хозяйств, лабораторных животных (мыши, крысы)

Выделяли и накапливали биомассу возбудителя (ооцисты Cryptospondium baylei) при помощи нескольких методов обогащения, использовали флотационные растворы В качестве флотационных растворов применяли насыщенные растворы различных веществ (соли (NaCl), сахарозу, растворы сульфата цинка, среду Бреза, сульфата магния, тисульфата натрия), а вспомогательным средством в достижении поставленной перед нами цели (накопление ооцист криптоспоридий) служило центрифугирование

Для длительного хранения выделенную культуру ооцист хранили в растворе бихромата калия 2,5% концентрации при температуре 7°С

Определение наличия ооцист в мазках проводили под имерсионной системой микроскопа при увеличении 10X90

Интенсивность инвазии у птицы определяли методом подсчета (В Ф Никитин) в 20 полях зрения микроскопа при увеличении в 600 раз слабая инвазия или + -от 1 до 3 ооцист во всех полях зрения, средняя или ++ до 4 ооцист, сильная или +++ - от 5 и более ооцист

Моделью для воспроизведения криптоспоридиозной инвазии и поддержания штамма Cryptosporidium baylei, Cryptosporidium parvum в лабораторных условиях служили новорожденные белые мыши и крысы

Для экспериментальных исследований использовали 4 группы новорожденных лабораторных животных в возрасте 2 дней по 10 животных в каждой Заражение нами проводилось с целью получения биомассы Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium baylei Животным инокулировали суспензию возбудетеля per os Суспензия ооцист двух видов Cryptosporidium была получена методом флотации с центрифугированием из фекалий больных криптоспоридиозом птиц и телят Инокулят, вводимый мышам и крысам, содержал 10 тыс ооцист Ооцисты вводили при помощи автоматического микродозатора, используя индивидуальные наконечники для каждого животного

За экспериментальными животными вели ежедневное наблюдение, а исследование фекалий начинали с 2-х суток и продолжали по 20-ые сутки после заражения Материал, получаемый от экспериментально зараженных животных, исследовали методом световой микроскопии и ПЦР Для подтверждения диагноза использовали патологоанатомическое вскрытие с последующим приготовлением гистологических препаратов

Лабораторных животных заражали с целью получения экспериментального материала, для чего использовали материал, полученный от больных криптоспоридиозом птиц и телят путем смыва с носоглотки и прямой кишки

Образцы клинического материала, используемые нами для выделения ДНК Cryptosporidium bayilei, С parvum хранили в морозильной камере при минус 20°С до начала исследований Не допускали повторного замораживания/оттаивания Клинический материал помещали в пробирку, содержащую 0,5 мл транспортной среды (10 mM Tris HCL, 1 тМ EDTA рН 8,0,2% DDT) при помощи одноразового стерильного шпателя

При первичной подготовке клинического материала с целью увеличения концентрации ооцист в исследуемом материале использовали несколько модификаций обогащения проб (флотацию, седиментацию, центрифугирование) В качестве флотационной жидкости использовали среду Бреза, которая представляет собой смесь гипертонических растворов тиосульфата натрия, сульфата магния, дистиллированной воды в соотношении, равном 3 3 1, 60% раствор сахарозы

Выделение ДНК осуществляли несколькими методами сорбентным, лизирующим с протеиназой К

Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили, как правило, в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей ферментов Потерю или появление рестрикционного сайта определяли соответственно по наличию или отсутствию рестрицированного ПЦР-продукта

Амплифицированную ДНК осаждали с применением колонок для гель-фильтрации NAP 10

Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле

Результаты реакции учитывали с использованием трансэллюминатора Фрагменты анализируемой ДНК проявлялись в виде красно-фиолетовых полос при облучении УФ излучением с длиной волны 310 нм

Положительный контроль для Cryptosporidium baylei выявлялась полоса размером 612 н п

Отрицательный контроль полоса на уровне положительного контроля должна отсутствовать Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации компонентов набора для реакции

Если в анализируемых пробах отмечалось отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля, это свидетельствовало об отсутствии данного возбудителя в пробе Наличие полосы на уровне положительного контроля сообщало о наличии данного возбудителя в клинической пробе

2.2. Результаты исследований.

Изучая распространенность паразитоценозов птиц в специализированных птицефабриках двух регионов (Московской и Саратовской областей), мы провели широкое обследование на наличие в них возбудителя криптоспоридиоза

Применение диагностически точных и ускоренных методов детекции кокцидий рода СгургоэропЛит во многом определяет эффективность противоэпизоотических мероприятий и сокращает экономические потери Однако сложность индикации криптоспоридий в объектах, обильно контаминированных посторонней микрофлорой, может существенно затруднять выделение и идентификацию этого паразита Поэтому остается актуальной разработка и внедрение новых эффективных методов обнаружения и идентификации криптоспоридий Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция Анализ проб с использованием ПЦР проводится в течение 2-2,5 часов и позволяет обнаружить от 10 ооцист в 1 мл исследуемого клинического материала

Успех разработки ПЦР-теста во многом зависит от правильного подбора праймеров на основе сравнения нуклеотидных последовательностей геномов Сгур1тропс1шпп

При сравнении нуклеотидных последовательностей использовали программу «ОЬЮО»

Праймеры подбирали таким образом, чтобы они имели равные или близкие температуры отжига с соответствующими матрицами. В процессе работы соблюдали данные условия как для пар наружных, так и внутренних праймеров.

Также нами были подобраны праймеры и отработана новая диагностическая тест-система, основанная на амплификации участка гена 188 г!ША, Н8Р70.

На следующем этапе работы мы подбирали оптимальный метод выделения ДНК из клинических образцов. За основу был взят выше описанный метод, разработанный в Институте молекулярной генетики РАН.

Этот метод отличается простотой, дает высокий выход ДНК и удобен для массовых исследований.

1 2 3 4 5 6

Рис. 1: Определение чувствительности метода ПЦР. Ампликоны, полученные при nested ПЦР: 1 трек - рестрицированная проба, полученная путем рестрикции с ферментом Taq-полимераза; 2 трек - рестрицированная ДНК, прошедшая очистку через колонку NAP 10; 3,4,5,6 - клинические пробы.

Реакцию проводили в присутствии наружных и внутренних праймеров Результаты оценивали по наличию в геле и, соответственно, на фотографии специфических фрагментов ДНК, рассчитанный размер которых соответствует размеру синтезируемого ампликона Cryptosporidium baylei

По данным тестирования faeces, смывов обследуемой птицы на содержание возбудителя, наблюдалось заметное совпадение данных как по положительным, так и по отрицательным результатам

Таблица 1

Сравнительные результаты определения Cryptosporidium bailey и С. parvum в faeces больной птицы и экспериментально зараженных животных (белые мыши).

Вид животного и возраст (дни) Количество обследованных животных (голов) Совпадение результатов при обследовании разными методами

Микроскопия мазка окрашенного по Циль-Нильсену полимеразно-цепная реакция

+ - + -

Мыши 7-10 дн 18 15 3 17 1

Цыплята-бройлеры 3140 дн (ЗАО «Барановское») 235 190 45 206 29

Цыплята-бройлеры 3140 дн (ЗАО «Мирная») 220 173 47 202 18

Подтверждение эффективности разработанной нами тест-системы проводили на экспериментально зараженных белых мышах и больных цыплятах От цыплят 31-40-дневного возраста брали клинический метериал (фекалии) Мышей 1-2-дневного возраста заражали суспензией ооцист СгурговрогнЗшт ратин, предоставленной лабораторией протозойных инфекций Института эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи На 7-10 день после заражения от мышей брали образцы фекалий Параллельно с ПЦР полученные образцы исследовали методом микроскопии мазков, окрашенных по методу Циль-Нильсена

При микроскопическом исследовании положительные результаты были зарегистрированы у лабораторных животных в 80% случаев, у цыплят бройлеров при аналогичном исследовании - в 79% В тест-системе ПЦР у мышей положительный результат - в 94 %, у цыплят - в 89% случаев

Специфичность амплификации фрагмента нуклеотидной последовательности в присутствии подобранных праймеров определяли с помощью рестрикционного анализа соответствующих ампликонов Амплификацию проводили на ДНК, СгурЮБропскит Ьау1е1 и ратцп, выделенных из клинических образцов и полученных от лабораторных экспериментально зараженных животных

Рестрикты фрагмента области генома Сг Ьау1ег были позднее применены для конструирования образца внутреннего контроля (ОВК) Результаты рестрикционного анализа продуктов амплификации представлены на рисунке

Рис. 2.1 трек - рестрицированная ДНК Cryptosporidium baylei, выделенная из клинической пробы; 2 трек - рестрицированная ДНК Cryptosporidium baylei, выделенная из клинической пробы и очищенная переосаждением спиртом.

Условия и режимы проведения реакции были отработаны в предварительных экспериментах. Для оценки чувствительности и

специфичности ПЦР использовали полевые штаммы: Cryptosporidium baylei и parvum, эмерий; эталонные штаммы: Toxoplasma gondii.

Одним из наиболее важных параметров, определяющих специфичность и чувствительность реакции, является отжиг праймеров. Температура проведения отжига праймеров зависит от его длины и содержания в нем пар нуклеотидных оснований.

Температуру плавления и отжига для каждого праймера в отдельности рассчитывали по формуле:

Тотжига~ 2 х (Т+А) + 3 х (C+G) - 5 [°С], где

А, Т, С, О - число соответствующих нуклеотидов в составе праймера Рассчитанная по приведенной выше формуле температура была для нас лишь ориентиром при выборе температурного показателя Эту величину наиболее точно мы определили в серии экспериментов

Отклонение от оптимальной температуры отжига в сторону понижения приводило к образованию неспецифических продуктов реакции при исследовании полевых штаммов, выделенных от больной птицы, а при повышении более чем на 2°С - чувствительность реакции снижалась

Параметры реакции зависели от типа термоциклера, объема реакционной смеси, количества циклов Увеличение числа циклов более 45 приводило к образованию неспецифических ампликонов, а при снижении числа циклов отмечалось заметное уменьшение выхода специфического реакционного продукта

В ходе серии опытов установлено, что чувствительность данной реакции, с выбранными праймерами и определенными нами условиями проведения ПЦР, составляет от 10 до 10 тыс мк/мл В процессе экспериментов по проверке специфичности реакции с данной парой праймеров тестировали 5 штаммов криптоспоридий, специфичных для птицы, и 2 штамма возбудителя криптоспоридиоза млекопитающих, 1 штамм возбудителя эймериоза (Е 1епе11а)

Со всеми представителями вида СгурШвропсЬит были получены положительные результаты, но с другими видами кокцидий положительного ответа не было ни в одном случае

Нами были обследованы 5 птицефабрик в Московской и Саратовской областях Обследование проводилось в птичниках 2 раза в год в зимне-весенний и осенне-зимний периоды Данные периоды года выбраны не случайно, т к именно в эти сезоны года, по нашим наблюдениям, преобладает иммунодефицитное состояние птицы, повышенная влажность

14

воздуха, что способствует сохранению инвазионных свойств ооцист возбудителя во внешней среде.

Всего было подвергнуто исследованию 2021 проба

В период проведения работы нами был выявлен криптоспоридиоз в 4-х из 5 обследованных хозяйств

Возраст обследованной птицы составлял 10-60 дней Материал получали с птицефабрик как с напольным так и с клеточным типом содержания Выделение ооцист отмечалось у птицы в возрастной категории от 30 до 45 дней Экстенсивность инвазии достигала наиболее высоких показателей на 39-41 день ЭИ в возрасте 10 дней и 30-40 дней

Интенсивность выделения ооцист с фекалиями в инфицированных хозяйствах изменялась в зависимости от сезона года и возраста, но преобладала средняя или сильная Преобладание средней и сильной степени инвазии зависело от того, что забор фекалий проводили от птицы, находящейся на разных стадиях заболевания

В осенне-зимний период экстенсивность инвазии на разных птицефабриках находилась в пределах от 89 до 92%, но в целом по Московской области она составляла 90%

Зимне-весенний период

Очень высокая степень зараженности кур в зимне-весенний период связана с ослабленным иммунитетом у птицы в это время года

2.2.1. Спонтанная криптоспоридиозная инвазия у кур.

Основным клиническим признаком криптоспоридиоза цыплят является диарея

Заболевшая птица находится в угнетенном состоянии Температура тела в период заболевания часто бывает снижена При исследовании фекалий от больной птицы единичные ооцисты обнаруживаются в фекалиях на 7-12 дни после заражения В нативных мазках, приготовленных из фекалий больных цыплят, регистрировали от 7 до 20 и более ооцист в поле зрения микроскопа

Для изучения криптоспоридиоза в лабораторных условиях использовали новорожденных белых мышей и крысят в возрасте 1-20 дней Лабораторные животные такого возраста наиболее восприимчивы к заражению Лабораторных животных заражали полевыми штаммами, полученными от больной птицы и телят из хозяйств Московской и Саратовской областей

Взвесь ооцист криптоспоридий получали вышеописанным флотационным методом Доза заражения - 10 -15 тыс. ооцист в 1 мл Животных обследовали, начиная со 2 дня после заражения В течение периода наблюдений у мышей и крыс, зараженных Сгур1озропЛиш Ьау1е1, выделение ооцист и клинических признаков не наблюдалось, из чего можно сделать вывод, что данный вид ооцист принадлежит птице А в опытах с исследованием материала, полученного от больных телят, в фекалиях обнаруживались ооцисты криптоспоридий и характерные изменения в тканях тонкого отдела кишечника

Таблица 2

Сравнительные результаты определения количества ооцист в носоглоточной слизи и фекалиях птицы, больной криптоспоридиозом -методом ПЦР

Количество обследованных Результаты обнаружения ооцист криптоспоридий в фекалиях и носоглоточной слизи

Положительные Отрицательные

фекалии носоглоточная слизь фекалии носоглоточная слизь

856 759 672 97 184

1203 1195 907 8 296

Из таблицы видно, что ооцисты криптоспоридий обнаруживаются в фекалиях в 95% случаев, а в носоглоточной слизи - в 76%

Проведенные исследования показали высокую информативность ПЦР при исследовании носоглоточной слизи и фекалий как биосубстрата для обнаружения ооцист

Результаты выявления возбудителя в носоглоточной слизи позволяют рассматривать ее как удобный биосубстрат при обследовании больной птицы на инфицированность криптоспоридиозом

Данные, полученные в наших исследованиях, и мнения других авторов указывают на эпизоотологическую значимость хронически больных животных как возможный источник заражения контактирующих с ними других животных и обслуживающий персонал 2.2.2. Патологоанатомические изменения.

Проводя патологоанатомическое исследование трупов, экспериментально зараженных лабораторных животных, было отмечено, что у мышат и крысят, зараженных суспензией ооцист Сгуршвропскит Ъау1е1, гистоморфологические изменения отсутствовали, тем самым подтверждая принадлежность возбудителя к данному виду и его видоспецифичность Патологоанатомические изменения присутствовали в желудочно-кишечном тракте мышей и крыс, зараженных возбудителем криптоспоридиоза телят -СгурЮвропёпип раггат Наблюдали гиперемию слизистой оболочки и катаральное воспаление тонкого отдела кишечника, набухание и увеличение ворсинок

При внешнем осмотре трупы цыплят истощены, перьевой покров вокруг клоаки загрязнен испражениями с примесью крови и слизи, конъюнктива глаз и слизистая оболочка ротовой полости анемичны

Макроскопические изменения сопровождались присутствием большого количества серозного экссудата в конъюнктивальных мешках, носовых ходах, просвете трахеи Наблюдалась гиперемия и набухание синусов, серокрасная пятнистость легких и печени

При патологоанатомическом вскрытии трупов павших цыплят, у которых болезнь проявлялась ярко выраженной клинической картиной, основные

изменения обнаруживались в желудочно-кишечном тракте: слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки набухшая, покрыта слоем слизи. Стенки двенадцатиперстной кишки утолщены, ворсинки сглажены, отмечаются точечные кровоизлияния.

При криптоспоридиозной инвазии бронхолегочной системы отмечали очаги пневмонии, скопление казеозного экссудата. В последующих исследованиях биоптата методом ПЦР удалось идентифицировать ДНК Cryptosporidium baylei.

При микроскопии гистопрепаратов было отмечено, что эндогенные стадии возбудителя локализовались главным образом в подвздошной и 12-перстной кишке.

Рис.3 Эндогенные стадии Cryptosporidium baylei в ткани подвздошной кишки больной птицы.

выводы.

1 Отработаны и модифицированы методы получения биомассы возбудителя

2 Отработан метод выделения специфической ДНК из биологического материала (faeces, носоглоточной слизи)

3 Подобраны и сконструированы праймеры (CPB-DIAGF, СРВ-DIAGR, Cyr 558U21, N-DiagRml) на основе консервативной нуклеотидной последовательности гена для разработки ПНР по выявлению и идентификации криптоспоридий

4 Разработаны оптимальные параметры экспериментальной полимеразной цепной реакции с данными праймерами, которые позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью (95%) детектировать Cryptosporidium baylei рода Cryptosporidium

5 В сравнительных исследованиях установлено, что тест-система на основе ПЦР является более эфективной для диагностики спонтанного криптоспоридиоза у кур в сравнении с флотационными методами и микроскопией

6 Показано, что экспериментальная тест-система на основе ПЦР позволяет выявлять возбудителя криптоспоридиоза кур в смывах с носоглотки и фекалиях больной птицы

7 Получены новые статистические данные по эпизоотологии криптоспоридиоза птиц в 2-х областях

Практические предложения.

Методические рекомендации по ПНР-диагностике криптоспоридиоза кур Авторы А В Уездина, В В Демкин, В Т Заблоцкий

Методические рекомендации рассмотрены и одобрены Ученым советом ВИЭВ 2006 года и на секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 25 мая 2007 г протокол №2

7. Список опубликованных работ по теме диссертации:

Уездина А В Эпизоотология и лабораторная диагностика криптоспоридиоза кур / Уездина А В, Демкин В В // Объединенный научный журнал - 2006 - №27 - С 72-74.

Уездина А В Применение молекулярно-биологических методов в диагностике криптоспоридиоза кур / Уездина А В // Вестник Саратовского госагроуниверситета им Н И Вавилова - 2007 - Вып 2 -С 70-71

Уездина А В ПЦР-диагностика криптоспоридиоза кур / Уездина А В , Заблоцкий ВТ //VI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» Сб материалов В 3 т - Москва, 2007 - Т 2 - С 63-65

Подписано в печать 04 03 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 140 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Уездина, Анастасия Викторовна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Историческая справка

2.2. Таксономия возбудителя

2.2.1. Биология возбудителя

2.3. Эпизоотология криптоспоридиоза

2.4. Симптомокомплекс

2.5. Патогенез

2.6. Иммунитет

2.7. Диагностика

2.8. Молекулярные методы в диагностике протозойных инфекций

2.8.1. Методы и условия повышения эффективности реакции амплификации ДНК

2.9. Лечение, профилактика, меры борьбы с криптоспоридиозом

3.Собственные исследования

3.1. Материалы и методы

3.1.1. Штаммы и ДНК микроорганизмов использованные при разработке экспериментальной тест-системы ПЦР для выявления и идентификации Cryptosporidium baylei

3.1.2. Химические реактивы

3.1.3. Общая характеристика специализированных хозяйств

3.1.4. Заражение лабораторных животных ооцистами Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium parvum

4. Диагностика криптоспоридиоза в ПЦР лаборатории

4.1. Условия проведения полимеразной цепной реакции

4.2. Сбор клинического материала для выделения ДНК возбудителя

4.2.1. Первичная подготовка клинического материала для выделения ДНК сорбентным методом

4.2.2. Подготовка клинического материала для постановки ПЦР реакции лизирующим методом с протеиназой К

4.3. Рестрикция ДНК и электрофорез в агарозном геле

4.4. Ферментативная обработка препаратов ДНК

4.5. Техника приготовления 5х ТБЭ

4.6. Приготовление 1,5% агарозного геля

4.7. Очистка и концентрация ДНК

4.7.1. Переосаждение ДНК спиртом

4.8. Регистрация результатов полимеразной цепной реакции

5. Результаты исследований

5.1 .Тест-система ПЦР для идентификации Cryptosporidium baylei

5.2. Выбор праймеров и определение чувствительности метода анализа

5.3. Обоснование специфичности амплификации выбранной для экспериментальной диагностики нуклеотидных последовательностей с использованием полевых штаммов Cryptosporidium baylei и parvum, эмерий; и эталонных штаммов Toxoplasma gondii

5.3.1. Экспериментальное определение оптимальных условий проведения ПЦР реакции

6. Динамика выделения ооцист криптоспоридий лабораторными животными в период наблюдения

7. Патологоанатомические изменения

8. Определение степени зараженности криптспоридиозом птицы разной возрастной категории

9. Обсуждение результатов

Введение Диссертация по биологии, на тему "ПЦР-диагностика криптоспоридиоза кур"

Актуальность темы. Птицеводство занимает важное место в сельскохозяйственном производстве. В условиях интенсивных технологий ведения птицеводства цыплята с первых дней жизни подвергаются воздействию факторов как инфекционной, так и неинфекционной природы, что приводит к снижению общей неспецифической резистентности организма и вызывает резкие морфо-функциональные изменения в желудочно-кишечном тракте, которые влияют на работу пищеварительного тракта, рост и продуктивность птиц. Серьезную проблему в промышленном птицеводстве представляет криптоспоридиоз.

Криптоспоридии известны как паразиты преимущественно кишечного тракта, хотя они были установлены и в других органах и тканях животных (Fayer R., Ungar.B.L., 1986).

В соответствии с определением ВОЗ криптоспоридиоз отнесен к числу типичных зоонозов, возбудители которых трансмиссируются с позвоночными животными, птицами и человеком.

Несмотря на некоторые успехи в изучении криптоспоридиоза во многих странах мира, в том числе и в нашей стране, он продолжает оставаться актуальной проблемой ветеринарии и медицины. При этом следует отметить, что наиболее сложной стороной в решении данной проблемы является диагностика криптоспоридиоза.

В настоящее время криптоспоридиоз широко распространен на животноводческих и птицеводческих фермах, особенно в странах европейского континента, где заболеваемость телят этой инвазией колеблется от 22 до 40% от числа заболевших с признаками диареи. Наряду с телятами высокую чувствительность к возбудителю проявляют ягнята и козлята. Мыши, крысы и морские свинки также заражаются ооцистами криптоспородий, но без проявления клиники болезни, будучи при этом "резервуаром" для инфицирования домашних животных. У птиц криптоспоридиоз чаще имеет респираторную форму, реже - кишечную.

Частота поражения респираторного тракта у млекопитающих окончательно не изучена. Ооцисты криптоспоридий обладают чрезвычайной устойчивостью к разным лечебным антимикробным и антипаразитарным веществам, а также дезинфицирующим средствам. Заражение животных и птиц происходит алиментарно и аэрогенно (Muirhead S., 1986; PavlasekL, 2001).

В своих исследованиях мы исходили из интереса к изучению опасного антропозооноза - криптоспоридиоза птиц.

Актуальность проблемы криптоспоридиоза птиц обусловлена отсутствием надежных экспресс-методов диагностики, что и определило цель и задачи наших исследований.

Цель и задачи работы. Изучить распространенность криптоспоридиоза кур в Саратовской и Московской областях; разработать диагностическую тест-систему на основе ПЦР для выявления возбудителя криптоспоридиоза кур.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Подобрать специфические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК Cryptosporidium baylei;

- Отработать условия проведения полимеразной цепной реакции с использованием полевого штамма идентифицируемого возбудителя, включая подбор методики выделения ДНК;

- Определить оптимальную концентрацию компонентов реакционной смеси, температурный режим, условия регистрации результатов анализа;

- Апробировать разработанную ПЦР тест-систему в экспериментальных условиях на таксономическую специфичность, включая использование клинического и патологического материала от естественно зараженной птицы и лабораторных животных.

- Провести эпизоотологическое обследование птицеводческих хозяйств и исследовать клинический материал от больной птицы на наличие Cryptosporidium baylei.

Научная новизна.

Подобрана методика выделения ДНК из культур клеток простейших организмов, клинического и патологического материала;

Разработана экспериментальная диагностическая тест-система на основе ПЦР для диагностики криптоспоридиоза кур: подобраны специфические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК, определены оптимальные условия проведения ПЦР.

Проведено эпизоотологическое обследование специализированных хозяйств Московской и Саратовской областей;

Практическая значимость. Разработаны методические указания по применению экспериментальной тест-системы ПЦР для выявления ДНК Cryptosporidium baylei, которые рассмотрены и одобрены Ученым советом ВИЭВ.2006 года.

Представленные результаты наших исследований могут быть использованы в практической ветеринарии для прижизненной и посмертной диагностики криптоспоридиоза птиц.

Основные положения, выносимые на защиту: оптимизация условий и конструирование праймеров для. выявления и идентификации криптоспоридий; разработка и апробация тест-системы на основе ПЦР для диагностики криптоспоридиоза кур. эпизоотологическое обследование специализированных хозяйств -субъектов РФ.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на научно-производственных конференциях, Ученом совете ВИЭВ (2007), межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научных работы, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 106 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 7 таблицами, 7 рисунками. Список литературы включает 158 источников, из них 97 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Уездина, Анастасия Викторовна

11. Выводы.

1. Отработаны и модифицированы методы получения биомассы возбудителя.

2. Отработан метод выделения специфической ДНК из биологического материала (faeces, носоглоточной слизи).

3. Подобраны и сконструированы праймеры (CPB-DIAGF, CPB-DIAGR, Cyr 558U21, N-DiagRml) на основе консервативной нуклеотидной последовательности гена, для разработки ПЦР по выявлению и идентификации криптоспоридий.

4. Разработаны оптимальные параметры экспериментальной полимеразной цепной реакции с данными праймерами, которые позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью (95%) детектировать Cryptosporidium baylei рода Cryptosporidium. V

5. В сравнительных исследованиях установлено, что тест-система на основе ПЦР является более эффективной для диагностики спонтанного криптоспоридиоза у кур в сравнении с флотационными методами и микроскопией.

6. Показано, что экспериментальная тест-система на основе ПЦР позволяет выявлять возбудителя криптоспоридиоза кур в слюне и фекалиях больной птицы.

7. Получены новые статистические данные по эпизоотологии криптоспоридиоза птиц в 2-х областях.

10. Заключение.

В период нашей работы над разработкой ПЦР тест-системы в экспериментальных условиях не было найдено сведений о подобных разработках в нашей стране.

В своей работе мы использовали четыре универсальных праймера с заранее известной нуклеотидной последовательностью, размером нуклеотидов способных гибридизоваться со всеми гомологичными сайтами в исследуемой геномной ДНК.,

Также в своих исследованиях мы проводили подбор параметров, которые

9+ могли влиять на эффективность ПЦР: концентрация Mg , праймеров, исследовали влияние различных концентраций Taq-полимеразы на профили ампликонов.

На следующем' этапе нашей работы, после определения оптимальных условий проведения полимеразной цепной реакции, для каждого ^ из использованных праймеров мы получили ряд ампликонов с молекулярной массой 428 н.о. и 612 и.о., при этом получаемые ампликоны были характерны для возбудителя:

Анализируя полученные продукты амплификации геномных ДНК близкородственных простейших (Cryptosporidium baylei, parvum; Toxoplasma, gondii; Eimeria4 tenella); в' ПЦР, удалось получить ампликоны только со-специфическими праймерами, что, в свою очередь, говорит о различиях в геноме близкородственных возбудителей. Данными результатами была подтверждена специфичность разработанной тест-системы ПЦР для дифференциальной диагностики криптоспоридиоза птиц, вызываемого Cryptosporidium baylei.

Разработка ПЦР тест-системы для идентификации указанного возбудителя осуществлялась с использованием в качестве модели культуру Cryptosporidium baylei выделенную из клинического материала полученного от больной птицы. При разработке были использованы специфические олигонуклеотидные праймеры, представляющие собой участок гена Cryptosporidium baylei, что позволяет амплифицировать часть цепи ДНК искомого простейшего размером 612 н.о. Олигонуклеотидные последовательности специфических праймеров для выявления Cryptosporidium baylei были заимствованы из работ зарубежных авторов и синтезированы в лаборатории молекулярной диагностики ИМГ РАН.

Базовой составляющей наших исследований была отработка оптимального температурного и временного режима программы амплификации, что обеспечивает высокую чувствительность (от 10 до 10 ООО клеток в одной пробе), специфичность (отсутствие перекрестных реакций) в нашей ПЦР тест-системе.

В начале наших исследований мы провели работу по подбору наиболее оптимального метода подготовки проб и выделения ДНК Cryptosporidium baylei из клинического и патологического материала. Свой выбор мы остановили на лизирующем методе с протеиназой К. В том числе нами модифицирован флотационный метод выделения ооцист Cryptosporidium baylei из клинического материала (фекалии, смывы с носоглотки). Используемый нами метод позволяет легко провести концентрирование ооцист из малого объема клинического материала. После того как мы отработали все необходимые- условияj перед нами стояла задача по проверке таксономической специфичности ПЦР тест-системы для диагностики Cryptosporidium baylei. Для этого мы использовали ДНК 4 видов простейших: Cryptosporidium baylei, parvum; Toxoplasma gondii; Eimeria tenella.

При проведении анализа продуктов амплификации методом электрофореза был отмечен синтез ампликона 628 н.о. в присутствии ДНК Cryptosporidium baylei. Получив такие результаты, далее мы отрабатывали условия чувствительности, т.е. минимальной концентрации ДНК или минимального количества клеток возбудителя в анализируемой пробе, которые данная тест-система позволяет идентифицировать. Чувствительность составила от 10 ооцист в одной клинической пробе.

Для контроля прохождения полимеразной цепной реакции мы использовали контрольный позитивный образец ДНК, который представляет собой полный геном идентифицируемого возбудителя.

Следующим этапом было апробирование разработанной экспериментальной ПЦР тест-системы на клиническом и патологическом материале от больной криптоспоридиозом птицы и лабораторных животных (мыши, крысы).

Разработанная нами ПЦР тест-система в серии экспериментов показала высокую чувствительность и эффективность по сравнению с ранее применяемой микроскопией и флотацией.

Таким образом, разработанная нами экспериментальная ПЦР тест-система для идентификации Cryptosporidium baylei позволит проводить традиционную диагностику более точным, быстрым и недорогим методом, который позволит в короткие сроки осуществлять дифференциальную диагностику заболеваний птиц.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Уездина, Анастасия Викторовна, Москва

1. Аксенов М.Ю., Гинцбург A.JI. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода ПЦР // Мол. ген., микробиология и вирусология. 1993. - №4. - с.3-8.

2. Алиев А.А. Криптоспоридиоз (диагностика, культивирование С. parvum в клетках культуры тканей, экспресс-оценка препаратов) // Автореферат на соискание уч. степени канд. вет. наук,- СПб., 1993. -с. 18

3. Алиев А.А., Шибалова Т.А., Зацепин А.Э., Розанова Ю.Ю., Cryptosporidium у кроликов // Цитология. 1992. - Т. 34: - №4. - С. 106

4. Ананьев О.В. Респираторная болезнь птиц, вызванная криптоспоридиями // Труды СПб. ГАВМ. 2000.- Т. 132. - С. 11.

5. Бейер Т.В. Криптоспоридиоз животных (биология возбудителя)// Ветеринария. 1986. - №10. - С. 42-45.

6. Бейер Т.В. Клеточная биология споровиков возбудителей протозойных болезней животных и человека // JL, - 1988.-С. 130-141.

7. Бейер Т.В., Сидоренко Н.В., Свежова Н.В. Клеточные взаимодействия при внутриклеточном паразитировании криптоспоридий//Цитология Т.37, -№8, -1995.

8. Бейер Т.В., Сидоренко Н.В. Электронно-микроскопические исследования криптоспоридий // Стадии гаметогенеза и спорогонии криптоспоридий Cryptosporidium parvum // Цитология. 1990. - Т.32 -№6.- С. 592-598.

9. Бейер Т.В., Сидоренко Н.В. Цитологическое исследование криптоспоридий (Apicomplexa, Sporozoa, Coccidia, Cryptosporidiidae). Паразито-хозяинные отношения // Цитология. 1991.- Т. 33, -№1. -С. 1823.

10. Бейер Т.В., Сидоренко Н.В. Об еще одной биологической особенности кокцидий рода Cryptosporidium (Sporozoa, Apicomplexa) // Паразитология.- 1993. 27.-№4.-С. 309-316.

11. Бейер Т.В., Пашкин П.И., Рахманова А.Г. и др. Диагностика, клиника, лечение и профилактика криптоспоридиоза. Методические рекомендации. Л.: НИИЭМ им. Пастера, 1987.

12. Бейер Т.В., Шибалова Т.А., Костенко Л.А. Цитология кокцидий. Л.: Наука. 1978.-37 с.

13. Бородина О.Н., Жукова Э.А., Кравец З.Ф. Обнаружение возбудителя криптоспоридиоза у человека и животных в Туркменистане // Мед. паразит, и паразитарные болезни. 1994.- №1. - С.8-11.

14. Бочкарев И.И., Шибалова Т.А. Взаимоотношения в системе паразит-хозяин при криптоспоридиозе // Тез. докл. III конгресса международной ассоциации морфологов: Морфология. СПб., - 1996. -№2. - С.38-39.

15. Васильева В.А., Небайкина Л.А. Криптоспоридиоз животных // Ветеринария. 1995. - №10. - С.31-32.

16. Васильева В.А., Небайкина Л.А. Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике криптоспоридиоза новорожденных животных //Саранск, 2001.-С.25.

17. Горбов Ю.К., Цыряпкин Б.С. Криптоспоридиоз животных // Тезисы доклада научно-производственной конференции по актуальным вопросам ветеринарии. 1984.-С. 88-90.

18. Гусев В.Ф., Крылов М.В., Крылов В.Ф. Кокцидиостатическая активность некоторых химиотерапевтических препаратов. //Ветеринария.- 1966.-№8.-с.69-70.

19. Гусев В.Ф., Крылов М.В., Крылов В.Ф. Изучение кокцидиостатической активности различных препаратов //Ветеринария. 1969.-№8. - с.52-53

20. Дехнич А.В. Клинические и микробиологические аспекты криптоспоридиоза// Болезни и возбудители, КМАХ,- 2000.- том 2, -№3

21. Доклад комитета экспертов ВОЗ Профилактика кишечных паразитарных инвазий и борьба с ними // Всемирная организация здравоохранения, Женева, -1988.- С.5.

22. Долгунц Г.Б. Результаты испытаний некоторых лекарственных препаратов с целью профилактики и лечения кокцидиозов кур //Известия.с/х наук МСХ АССР.-Ереван.-1974.-№7.- с.70-74

23. Дубровский Ю.А., Емельянова Л.П., Мосина С.В. Зараженность диких млекопитающих криптоспоридиями // Бюлл. Московского об-ва испыт. Природн. Отд. Биолог. 1994.-Т.99.-№5. - С.27-32.

24. Зароза В.Г., Николаев А.С. Криптоспоридиоз животных и птиц // Агропромышленное производство: опыт, проблемы и тенденции развития. 3. - 1988.-№4.-С. 19.

25. Иванов В.И. «А-ДНК»/ Соровский Образовательный Журнал, 1998.-№1,- С. 2-7.

26. Каримова М.Т., Насруллаев A.M., Хикматова З.С., Акрамов И.Т. Криптоспоридиоз в структуре диарейных заболеваний// Вестник врача общей практики, 2001г.,- №1

27. Кашина В.В., Ни Г.В. Криптоспоридиоз,— протозойное заболевание теплокровных животных // Сборник научных трудов МГАВМ и Б М.В. 1993 г.,-С. 112

28. Кисилев JI.JL, Фаворова О.О., Лаврик О.И. Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил тРНК. М.: Наука, -1984. - С.407.

29. Костюнина В.Ф.; Туманова Е.И. Зоогигиена с основами ветеринарии и санитарии: учебное пособие для учащихся средних специальных учебных заведений. -1991.- С.136-150.

30. Крылов М.В., Зайонц В.И. Препараты при кокцидиозе птиц // Ветеринария.- 1972.-№8.-19с.

31. Крылов М.В. Возбудитель, протозойных болезней домашних животных и человека. СПб. - 1994. - Т.1.- С.114 - 118.

32. Кожоков М.К. Криптоспоридиоз кур в Кабардино-Балкарии// Бюллетень Всесоюзного ордена трудового Красного Знамени института гельминтологии К.И. Скрябина, -1991.-М.: вып. 55.

33. Колосова Д.М., Ларионов С.В. Лабораторная диагностика криптоспоридиоза// Ветеринария № 7, -1999. С. 23-26.

34. Криптоспоридиоз животных (рекомендации по диагностике, терапии и профилактики) // Министерство с/х и продовольствия Республики Беларусь Витебская государственная академия ветеринарной медицины, -Витебск, -2000.-С. 1-15.

35. Лавдовская М.В., Лысенко А .Я. Современные представления об эпидемиологии криптоспоридиоза // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1993. - № 8. - С.49-53.

36. Лысенко А.Я., Лавдовская М.В. Криптоспоридиоз // СПИД-ассоциируемые инфекции и инвазии. М. - 1992. - С. 63-75.

37. Маклаклин Д. Идентификация и типирование криптосопридий:молекулярно-биологические подходы// Центральная лаборатория общественного здравоохранения, . Лондон, Великобритания. «Болезни и возбудители» КМАХ-2000, - том 2,-№3.-С.1-3

38. Мозжерин В.И.; Кузнецов А.Ф. Гигиена животных: учебное пособие для студентов вузов, -1997.-С. 56.

39. Небайкина Л.А., Дьяконов Л.П., Мачинский А.Л. Распространение криптоспоридиоза телят в Мордовской ССР // Возрастная морфофизиология и профилактика болезней в с.-х. предприятиях различного типа // Ивановский с.-х. ин-т. М. - 1994.- С. 137-139.

40. Небайкина Л.А. Клинико-эпизоотоогические особенности криптоспоридиоза телят в условиях Мордовского региона//

41. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветернарных наук.-Саранск, 1995. -С.26.

42. Никитин В.Ф., Павласек И. Криптоспоридиоз кур // Птицеводство.-1989.-№1.-С. 35-36.

43. Окосов И.В. Уровень организации системы паразит хозяин // Паразитология. -1991.- С.25.

44. Орлов С.А. Новейшие препараты для борьбыс эймериозами кур: аватек, цигро, цикостат// Ветинформ, -2002.- №4.

45. Прокопич Я. Криптоспоридиоз новый зооноз// Мед. паразитол. И паразитарные болезни. - 1983. - №5. — С. 50-52.

46. Прокопич Я., Павласек И. Криптоспоридиоз и его распространение в Чехословакии // IV научная конференция по паразитологии. Варна. -1983. — С.82-83.

47. Рагимов А.А. Оппортунистическая инфекция криптоспоридиями и разработка регламента лабораторной диагностики // Автореферат диссертации- на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.-М.-1992.-19 с.

48. Розовенко JI.A. «Актуальные вопросы ветеринарии». Оренбург, -1997.- С.13-17.

49. Свежова Н.В. Взаимоотношения кокцидий Cryptosporidium parvum (Apicomplexa: Sporozoa) с клетками иммунной системы хозяина -млекопитающего // Паразитология. 1997. - 31. - №4. - С.328 - 333.

50. Сидоренко Н.В. Электронно-микроскопическое изучение развития бесполых стадий Cryptosporidium parvum в кишечникеэкспериментально зараженных крысят // Цитология. 1992. - Т.34. -№4.-С. 139.

51. Спирин А.С. Молекулярная биология: Структура рибосомы и биосинтез белка. М.: Высш. шк., -1986. С. 303.

52. Старчиков Н.И. Технология содержания племеных кур в клеточных батареях, -1989.-С.206.

53. Чайка Н.А., Бейер Т.В. Криптоспоридиоз и СПИД. Л. - 1990.

54. Чан Т.В.Т. Гибридизация нуклеиновых кислот //Молекулярная клиническая диагностика. Методы. // М., 1998. с.374-394.

55. Чистенко Г.Н., Якубовский М.В., Мясцова* Т.Я., Мойсюк В.Т. Вопросы лечения криптоспоридиоза // Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии: Тез. докл. междунар. научн. конф. Витебск. - 1993. - С. 100.

56. Шаблий В .Я., Оксамитный Н.К., Хоменко В.И., Колос Ю.А., Микитюк П.В., Яблочкин В.Д., Гаврилюк Н.Д., Романенко А.В. Дезинфекция, дезинвазия, дератизация, дезакаризация //Справочник по ветеринарной санитарии. Киев.: Урожай. - 1986. - С. 199-205.

57. Шибалова Т.А. Развитие криптоспоридий в клетках культуры тканей и эмбрионах птиц // Современные проблемы протозоологии: Тез. IV съезда ВО протозоологов. Л., «Наука», 1987.-c.54.

58. Шибалова Т.А. Новые данные по криптоспоридиозу // Сб. научн. тр. ЛВИ. Л. - 1987. - №91. - С. 66-71.

59. Шибалова Т.А., Павласек И., Касаткина Н.В., Алиев А.А. Возможные компоненты паразитоценоза // Тез. III всесоюзного съезда паразитологов. Киев. - 1991. - С. 183.

60. Шибалова Т.А., Ямпольский М.В. К проблеме криптоспоридиоза птиц // Труды СПбГАВМ. 1997. - Т. 127. - С. 76-77.

61. Abe N., Iseki М. Identification of Cryptosporidium isolates from cocatiels by direct sequencing of the PCR amplified small subunit ribosomal RNA gene //Parasitology Research, -2004, -№92 ,-P. 523-526.

62. Albert J., Fenyo E.M., Simple, sensitive, and specific detection of human immunodeficiency vims type I in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers // J. Clin. Microbiol. 1990. - V.28. -P.1560-1564.

63. Alves M., Xiao L., Shulaiman I., Lai A. A., Matos O., Antunes F. Subgenotype analysis of Cryptosporidium isolates from humans, cattle, and zoo ruminats in Portugal // J. Clin. Microbiologia, 2003,- No. 6,- P. 27442747.

64. Anderson В., Donnedelinger Т., Wilkins R., Smith J. Criptosporidiosis in a veterinary student // J. Amer. Vet. Med. Ass. 1982. - V. 180: - P. 408409.

65. Angus K.W. Cryptosporidiosis in man comestic animals and birds: a review // J. Roy. Soc. Med. 1983. - Vol. 76. - P. 62-70.

66. Arrand J. Preparation of nucleic acid probes: Nucleic acid hybridization: a practical1 approach // E.D: By BDHames, IRL Rpess, -1986,- p.40

67. Ashall F., Milless M. Diagnosis of parasitic diseases using DNA to DNA hybridization //Trans Roy Soc trop. Med. Hyg, -1988,- №2, -p. 235-236.

68. Baxby D., Hart C., Blundell N. Shedding of oocysts by immunocompetent individuals with cryptosporidiosis // J. Hyg. 1985. - V. 95. -№3. - P. 703-709.

69. Bird R.G., Smith M.D. Cryptosporidiosis in man: parasits life cycle and fine structural pathology // J. Pathol. 1980. - Vol. 132. - P. 217-233.

70. Boothroyd J.C., Burg J.L., Kasper L.H. The Board of Trustees of the Leeland Stanford Junior University. Diagnostic genes for toxoplasmosis // J. Pathol. 1994. - Vol. 182. - P. 322

71. Braiken F.A., Amin A., Beeching N.J., Hommel M., Hart C.A. Detection of Cryptosporidium amongst diarrhoeic and asymptomatic children in Jeddah, Saudi //Seinee, -1986, -v. 161, -P. 542-547.

72. Breza M., Niekol'ko prakticrych poznatrov a nametov к helminto -koprologicrej diagnostikel. Helmintologia (sammelband der Arbeiten). Sav. Bratislava. 1957. - P. 57-63.

73. Britten R.J., Kobe D.E. Repeated sequencesin DNA //Scince, -1986, -v.l61,-P. 529-540.

74. Campbell J., Tzipory S., Hutchinson G., Angus K. Effect of fectants on survival of Cryptosporidium oocyst II Vet. Res. 1982. - Vol. 111. - P. 414415.

75. Casemore D.P., Sanders R.L., Curry A. Cryptosporidium species a "new" humen pathologen // J. Clein. Pathol. - 1985. - Vol. 38/ - P. 13211336.

76. Cone R.W., Hobson A.C., Hwang M.W. Coamlified positive control detects inhibition of polymerase chain, reaction // J. Clin. Microbiol.- 1992. -Vol. 30.-P.3185-3189.

77. Chernesky M.A. et al. Diagnosis of Chlamydia trachomatis infections in men and women by testing first-void urine by ligase chain reaction. // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 321 - P: 2682-2685.

78. Chesnot Т., Schwartzbrod" J. Quantitative and qualitative comparison of density-based purification method for detections of Cryptosporidium oocysts in turbid environmental matrices // Appl Environ Microbiol, 2004, -v. 70 (11),-P. 3456-3462.

79. Chu B.C.F.,Wahl G.M., Orget L.E. Derivalization of unprotected polynucleotides//Nucl. Acid. Res., -1983,- v.l 1, -P.6513-6529.

80. Church R.B. Method for study of hybridization and reassotiation of nucleic acids axtracted from cells of higher animals // In: Molecular techques and approach in developmental biology,- 1973, P.223-301.

81. Current W.L. Cryptosporidiosis // J. Amer. Vet. Med. Ass. 1985. - V. 187.-№12.-P. 1334-1338.

82. Current W.L., Haynes T.B., Complete development of Cryptosporidium in all culture // Scince. 1984. - Vol. 224. - №4649. -P.603-605.

83. Current W.L., Reese N.C. A comparsion of endogenous development of three isolates of Cryptosporidium in suckling mice // J. Protozool. -1986.-Vol. 33.-P. 98-108.

84. Current W.L., Upton S., Haynes T. The cycle of Cryptosporidium baileyi (Apicomplexa, Cryptospordiidae) infecting chickens // J. Protozool. 1986. - V. 33. - №2. - P. 289-296.

85. Cvetkovis L., Dimitrisevis S. Kriptosporidioza zivotinisa icoveka // Veter. Glasnik. 1988, 42, 617: P. 381-388.

86. Darban Hamid, Wang Y., Shahbazian M., Alak J., Crawford G., Watson R.R. Thymosin modulation of the persistence of Cryptosporidium in mice with murine ALDS // Adv. Biosciences. 1993.- 86. - P. 341 - 346.

87. David S. Lindsay, Byron L. Blagburn, Chrictine A. Sundermann, Frederic J. Hoerr, James A. Ernest.Experimental Cryptosporidium infections in chickens: oocyst structure end tissue specificity// Avian Diseases, vol. 30,-No.2, - 2003,-p. 157-171.

88. De Medici Dario, Di Pasquale Simona, Delibato Elisabetta Application of quatitative PCR to food borne pathogenic microorganisms to evaluate preventive measures applied in food safety // Alimentaria, -2002.- №336,-P.ll-16.

89. Denhardt D.T. A membrane filter technique for the detection of complementer DNA //Biochem, Biophys. Res. Commun., 1966.- v.23, -P.641-646.

90. Don R.H., Сох P.T., Wainwright B.J. et al. Touch down PCR to circumvent spurious priming during gene amplication // Nucl. Acids Res. -1991.-Vol. 19-P.4008.

91. Exner M., Gornik V. Cryptosporidium charakterisierung einer neuen infection mit besonderer Beriiksichtigung des wassers als infektion guelle // Zentralbl. Hyg. Und Ummeltmed. 1990. - 190. - №1. - P. 13-125.

92. Fahy E., Davis G.R., DiMichele L.J., Ghosh S.S. Design and synthesis of polyacrylamide based oligonucleotide supports for use in nucleic acid diagnostics //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 1819-1826

93. Fayer R., Lewis E.J., Trout J.M., Graczyk M.C., Higgins J.; Xiao L., Lai A.A. Cryptosporidium parvum in oysters from commercial harvesting sites in the Chesapeake Bay. Emerg Infect Dis, 1999.- P.706-10.

94. Fayer R. New method using sedimentation and immunomagnetic separation for 1 enumeration of Cryptosporidium parvum oocysts and Giardia , lamblia cyst // J. Microbiol. Methods,- 2004 Sep., 58(3), P. 37586.

95. Fontaine Mi, Guillot E. An immunomagnetic separation real-time PCR method for quantificat Cryptosporidium parvum in water samples. J. Microbiol. Methods, -2003 Jun., 54, P.29-36.

96. Glisson J.R., Brown T.P., Brugh M., Kleven S.H., Davis R.T. Sinusitis in turkeys associated with respiratory cryptosporidiosis //Avian Diseasses. -1984. №28-p. 783-790.

97. Gobel E., Brandler U. infrastructure of microgametogenesis, microgametes and gametogony of Cryptosporidium sp. in the small intestine of mice //Protistologica. 1982. T.18. P. 331-344

98. Goodwin M.A., Latimer K.S., Broun J., Steffens W.L., Martin P.W., Reserreccion R.S., Smeltzen M.A., Dickson T.G. Respiratory cryptosporidiosis in chickens // Poultry Sciense. 1988. - № 67. - p. 12684 - 1693.

99. He Hong-Huan, Zhang Xi-chen, Ouyang Hong-Sheng, Yin Ji-gang, Li Jian-hua, Yng Ju. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена gpl5 криптоспоридий Cryptosporidium parvum // J. Vet. Sci., 2003,-No. 4, - P. 234-240.

100. Hoerr F.J1, Ranck F.M., Hastings T.F. Respiratory cryptosporidiosis in turkeys // J. Amer. Veter. Medical. 1978. - Vol. 173. - P. 1591-1593.

101. Hoerr F.J., William L. Current, Haynes T.B. Fatal Cryptosporidiosis in Quail//Veterinary Parasitology, 1992.-vol. 80, - P. 179-185.

102. Hoerr F.J., Current W.L., Haynes T.V. Fatal cryptosporidiosis in quail. Avian Disease., 1986, 30.2, p. 421-425.

103. Hoonan K.E., Beck C., Holzmayer T.A. Quantitative analysis of MDR I (multidrug resistance) gene expression in human tumor by polymerase chain reactions//Proc.Nat. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol.87. - P.1 71607164.

104. Horton R.M., Hobbe B.L., Conte-Tronconi B.M. Ampligrease: "hot start" PCR using petroleum jelly // Biotechniques. 1994. - Vol. 16. - P. 42-43.

105. Huetink R.E.C., Giessen J.W.B., Noordhuizen J.P.T.M., Ploeger H.W. Epidemiology of Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis on a dairy farm//Veterinary parasitology -2001,- P. 53-67.

106. Jervis H.R., Merriel T.G., Sprinz H. Coccidiosis in the guinea pig small intestine due to a Cryptosporidium // Am. J.Vet. Res. 1966. - Vol. 27.-P. 408.

107. Itakura С., Garyo M., Umemura Т. Cryptosporidial infection in chickens // Avian Pathol. 1984. - Vol. 13. - P. 487-499.

108. Itakura C. Cryptosporidiosis in calves. A literature review and first incidend in Japan // J. Japan Vet. Med. Assoc. 1985.-Vol. 38. - №12. -P.796-801.

109. Kassa H., Harrington B.J., Bisesi M.S. Cryptosporidiosis: a brief literature review and update regarding Cryptosporidium in feces of Canada geese (Branta canadensis) // J. Environ Health. 2004, - №7. - P. 34-40.

110. Katie-Radivojevi e Sofija, Kulisie Z. Cryptosporidium infection in weaners, bull calves and postparturient cows in the Belgrade area Misic Zorana // Acta vet., 2002, - No.ly P. 37-41.

111. Kato S., Lindergard G., Mohammed H. O. Utility of the Cryptosporidium oocyst wall protein (COWP) gene in a nested PCR approach for detection infection in cattle //Veterinary parasitology- 2003, -P.153-159.

112. Kellogg D.E., Snineky J:J. Quantitation of HIV I proviral DNA relative to cellular DNA by the polimerase chain reaction // Anal. Biochem. 1990.-Vol. 189. -P.202-208.

113. Kellogg D.E., Rabalkin A., Chen S. et al. Taq Start antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralising monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase // BioTechniques.-1994. Vol. 16. - P. 1134 - 1137.

114. Kim Y., Howerth E.W., Shin N.S., Know S.W., Terrell S.P., Kim D.Y. Disseminated visceral coccidiosis and cloacal cryptosporidiosis in a Japanese white-naped crane (Grus vipio) // J. Parasitol. 2005. - Vol. 1. -P.199-201.

115. Kramer R.A., Cameron J.F., Davis R.W. //Cell. 1976.- Vol. 8.- P. 227.

116. Kulski J., Norval M. Nucleic acid probes in diagnosis of viral deseases of man //Arch. Virol.- 1985.-P. 222-300.

117. Ley D.H. Interaction of reovirus and Cryptosporidium in the production of enteritis in chickens//Amer.Vet.Med. Assoc., Chicago. — 1987.- p.128.

118. Lindsey D.S., Blagburn B.L., Sundermann C.A. Host specifity of crptosporidium sp. isolated from chickens // Journal of Parasitology.-1986-Vol. 72.-P. 565-568.

119. Lukesova D. Moznosti prakticke diagnostiky kryptosporidiozy // Veterinarstvi. 1988. - №3. - P. 113-115.

120. Luna L.G. Manual of histologic staining methods // New York: McGraw-Hill. -1968.

121. Mansfield E.S., Worley J.M., McKenzic S.E. ucleic acid detection using non radioactive labelling methods // Molecular and cellular Probes. -1995.-Vol.9-P. 145-156.

122. Marcial M.A., Madara J.L. Cryptosporidium: Cellular localization, structural analiises of absorptive cell parasite membrane interaction m guinea chich and suggestion of protozoan transport by cells // Gastroenterology. - 1986. - Vol. 90. - P. 598-600.

123. Mason R. Conjunctival cryptosporidiosis in ducks // Avian diseases, 1986,- Vol. 3.-P. 590-600.

124. McLauchlin J., Pedraza-Diaz S., Amar-Haetzeneder C., Nichols G.L. Genetic characterization of Cryptosporidium strains from 218 patients with diarrhoea diagnosed as having sporadic cryptosporidiosis // J Clin. Microbiol.- 1999.- Vol.37- P.3153-8.

125. Meinkoth J., Wahi G. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports // Anal. Biochem. 1984. V. 138. P. 267-284.

126. Morgan U.M., Xiaol L., Fayer R., Lai A.A., Thompson R.C. Variation» in Cryptosporidium: towards a taxonomic revisionof the genus, bit J Parasitol 1999; № 29. P. 1733-51.

127. Pentith M.L., Burger W.P. Milwaukee 10 years later// Health stream - 1993,-№30 .-P.- 2-3.

128. Patel S., Pedraza-Diaz S., McLauchlin J. The molecular characterization of Cryptosporidium parvum from two large suspected waterborne outbreaks. Commun Dis Public Health 1998; 1:231-3.

129. Pavlasek L Nalezy kryptosporidii ve zlaznatem zaludku u slepic a u volne zijicich a exotickych ptaku odchycenych z volne prirody // Veterinarstvy, 2001, -№3, - P. 1-5.

130. Pereira H.G. Non-radioactive nucleic acid probes for the diagnosis of virus infections // Bioessays. 1986. V. 4. P. 110-113.

131. Peng M.M., Xiaol L. Genetic polymorphisms among Cryptosporidium parvum isolates: Evidence of two distinct human transmission cycles. Emerg Infect Dis 1997.- P.567-73.

132. Petithory L.C., Junod C., Ardon F., Jousserand P. Cyclospora sp.: une nouveile coccidie parasite de l'homme // Rev. fr. lab.- 1994.- 23, № 271. -P. 11-14.

133. Pieniazek N.J., Bornay-Llinares F.J., Slemenda S.B., da Silva A.J., Moura I.N.S., Arrowood M.J., Ditrich D., Addiss D.G. New Cryptosporidium genotypes in HIV-infected persons. Emerg Infect Dis 1999.- P. 444-9.

134. Raikhowa S., Coudhury H., Buiarbaruah K.M. and Dutta M. Prevalence of gastrointestinal nematodes in indigenous pigs of Nagaland// Indian J. Vet. Med., 2003.- vol. 23.- № 1 p.i-3.

135. Rolfs A., Schuller S., Finckh U., Weber-Rolfs I. PCR: clinical diagnostics and research // N.Y.: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, -1992.-P.268.

136. Rosenfeld M.A., Yoshimura K., Trapnell B.C. In vivo transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene to the airway epithelium// Cell. 1992. - Vol.68. - P.143-155.

137. Rychlic W., Spenser W.J., Rhoads R.E. Optimization of the annealing temperature in vitro // Nucl. Acids Res. 1990. - Vol.18. - P.6409-6411.

138. Ryley J.F. Cytochemistry, physiology and biochemistry // The Coccidia: Eimeria, Isospora, Toxoplasma, and related genera. Baltimore etc.: Univ. Park Press, 1973. P. 145-182.

139. Sayler G.S., Layton A.G. Environmental application of nucleic acid hybridization // Annu. Rev. Microbiol. 19901 V. 44. P. 625-648.

140. Saulnier P., Andromont A. Detection of genes in feces by booster polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992.-Vol.30.-p.2080-2083.

141. Sterba F., Suleova I.K. Laboratoani diagnostice kriptosporidiozy telat // Veterinarstvi. 1988.-38, №3.- p. 110-112.

142. Shuder D.B., Current W.L., Russek-Cehen E., Goochran S.L., Mallinson E.T., Marguardt W.W., Savage P.K. Serological incidence of Cryptosporidium in Delmarva broiler flocks //Poultry Science. 1988.-№67.-p.730-735.

143. Tzipori S., Smith M., Halpin C., Angus K.W., Sherwood D., Campbell I. Experimental cryptosporidiosis in calves: clinical manifestation and pathological findings // Vet. Rec. 1983. Vol. 112. P. 116-120.

144. Tzipory S. Cryptosporidiosis in animals and humans// Microbiol. Rev.- 1983. №47. - P.84-96.

145. Uni S., Iseki M., Maskawa Т., Moriya K., Takada S. Ultrastructure of Cryptosporidium muris (strain RN 66) parasitizing the murine stomach // Parasitol. Res. 1987. Vol.74. P. 123-132.

146. Urdea M.S., Warner B.D., Running J.A., Horn T.F., Clyne J.T., Ku I., Warner B.D. A novel method for the rapid detection of specific nucleotide sequences in crude biological samples without blotting or radioactivity. // Gene. 1987, V.61.P. 253 -264.

147. Vetterling J.M., Jerris H.R., Meril T.G., Sprinz H. Cryptosporidium wrairi sp. from the quinea pig Cavia porcellus with an emendation of the genus //Journal of Protozoology.-1971. -Vol.l8.-p.243-247.

148. Walker M., Redelman D. Detection of Cryptosporidium parvum in soil extracts // Appl. and Environ. Microbiol1, 2004, No. 3, - P. 112-119.

149. Zha H., Jiang J. Xiumu Shouyi xnebao // Acta vet. et zootechn. Sin.-1994. 25.-№3.-P. 273.

150. Zhou L., Fayer R., Trout J. M., Ryan U. M., Schaefer F. W., and L.Xiao Genotypes of Cryptosporidium Species Infecting Fur-Bearing Mammals Differ from those of species infecting humans // Appl Environ Microbiol, -2003, -vol. 69(11), -P. 6758-6761.114