Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление геномов возбудителей аденоматоза и висна-маеди овец с помощью полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Выявление геномов возбудителей аденоматоза и висна-маеди овец с помощью полимеразной цепной реакции"

УДК 619:616-076:616.98:578.828.61

На правах рукописи

Бурдннский Владимир Геннадьевич

Выявление геномов возбудителей аденоматоза и висна-маеди овец с помощью полимеразной цепной реакции

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 [ЮЯ 2ЙЗ

Покров-2009

003483216

Работа выполнена в Государственном научном учрежденш Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарно? вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственны; наук (ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Цыбаиов Содиом Жамьяновпч

профессор

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, Балышев Владимир Михайлович

профессор

кандидат биологических наук Андрейчук Дмитрии Борисович

старший научный сотрудник

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (г. Москва)

Защита состоится 18 декабря 2009г в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 601120, г. Покров, Владимирская область, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел/факс: (49243)62125. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «Ц^ » октября 2009 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета, доктор ветеринарных наук,

профессор

1. Общая характеристика работы

1.1 Актуальность избранной темы работы

Приоритетность разработки новых эффективных диагностических препаратов для обнаружения медленных инфекций животных обусловлена тем, что при возросших торгово-экономических связях резко увеличивается вероятность заноса в страну их возбудителей племенными животными.

В группе медленных инфекций животных аденоматоз лёгких и висна-маеди овец по степени распространённости и уровню экономического ущерба занимают одно из главных мест [Н.И. Архипов, И.А.Бакулов, Л.И.Соковых, 1987].

Аденоматоз легких овец (АЛО) - контагиозная трансмиссивная метастазирующая опухоль легких овец, реже коз, возникающая в терминальных бронхиолах из пневмоцитов типа II (типа В) и клеток Клара и неизбежно ведущая к гибели животного [В.Н. Сюрин и др., 1998; Дж. К. ДеМартини, 2005]. Заболевание схоже с бронхоальвеолярной карциномой человека [Н. Spencer, 1985; К. Perk, 1982; F. Clayton, 1988].

Возбудитель АЛО по современной классификации Международного комитета по таксономии вирусов (МКТВ) относится к роду Betaretrovirus подсемейству Orthoretrovirinae семейства Retroviridae [International Committee on Taxonomy of Viruses, 2006].

В настоящее время диагноз на АЛО ставится на основании комплекса эпизоотологических и клинических данных, результатов патологоанатомического вскрытия животного. Из лабораторных методов исследования применяется гистологическое исследование пораженных тканей легких овец. Прижизненная серологическая диагностика не разработана вследствие того, что данный возбудитель не вызывает образования специфических антител в организме поражённых животных [Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004].

Висна-маеди (ВМ) - термин, принятый для обозначения дву> симптомокомплексов, связанных с патолог ией центральной нервной системь и легких овец, соответственно. Маеди - медленно прогрессирующа; вирусная интерстициальная пневмония овец; висна - безлихорадочная вирусная медленная инфекция овец, которая характеризуется развитием менингита и энцефаломиелита, проявляющихся атаксией и параличами [В.Н . Сюрин и др., 1998]. Висна и маеди впервые описаны в Исландии как две самостоятельные болезни. Однако, в опытах на животных было показано, что одни и те же штаммы могут вызывать патологию, характерную и для висны, и для маеди [P. A. Palsson, 1976].

По современной классификации МКТВ возбудитель ВМ относится к роду Lentivirus подсемейству Orthoretrovirinae семейства Retroviridae [International Committee on Taxonomy of Viruses, 2006].

В Российской Федерации на настоящий момент разработан метод реакции диффузной преципитации (РДП) для диагностики ВМ, имеющий низкую чувствительность, что не позволяет диагностировать данное заболевание на ранних стадиях. За рубежом для диагностики широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА), дающий быстрые результаты при относительно невысоких затратах. Недостатком ИФА является то, что у некоторых животных антитела на вирусные белки вырабатываются в количестве не достаточном для выявления, либо отмечается позднее накопление антител в сыворотке крови, вследствие чего эти животные остаются скрытыми носителями вируса ВМ [Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004].

Метод лабораторной диагностики AJIO, основанный на гистологическом исследовании срезов легких, является длительным и трудоемким, не позволяющим проводить прижизненную диагностику болезни.

В последние годы для обнаружения вирусного генома АЛО и ВМ широко применяют метод полимеразной цепной реакции и секвенирование генома (Ра1тапш М. и др., 1996; ЕкаЫг У.М. и др., 2006).

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и их секвенирование с последующим филогенетическим анализом, дополняя серологические методы, открывают новые возможности для прижизненного выявления возбудителей инфекционных заболеваний, а также путей их заноса в хозяйства и проведение соответствующих мероприятий для предотвращения их дальнейшего распространения.

В связи с вышеизложенным, разработка чувствительных и специфических методов выявления геномов вирусов ВМ и АЛО имеет важное эпизоотологическое и диагностическое значение и является актуальной.

1.2 Цель и задачи исследований

Целью данной работы является разработка тест-систем на основе ПЦР для выявления геномов вирусов аденоматоза легких овец и висна-маеди.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- на основе анализа нуклеотидной последовательности участков геномов возбудителей аденоматоза легких овец и висна-маеди рассчитать и подобрать специфичные праймеры;

- оптимизировать условия постановки ПЦР и разработать тест-системы;

- определить специфичность и чувствительность разработанных тест-систем при идентификации геномов вирусов висна-маеди и аденоматоза легких овец;

- изучить распространение аденоматоза легких овец на территории отдельных регионов России на основе данных анализа проб крови животных из различных хозяйств РФ методом ПЦР;

- определить первичную нуклеотидную последовательности фрагментов геномов возбудителей аденоматоза легких овец и висна-маеди.

1.3 Научная новизна работы

- Разработаны тест-системы для выявления генома возбудителя аденоматоза легких овец, с праймерами комплементарными ЬТЯ-области генома, и вируса висна-маеди, с праймерами комплементарными gag-гeнy.

- Определена нуклеотидная последовательность gag-гeнa вируса висна-маеди штамма М-88.

- Определена первичная структура ЬТЯ-участка генома российского изолята возбудителя аденоматоза легких овец выделенного из проб крови овец одного из хозяйств Республики Удмуртия.

- В результате филогенетического анализа впервые определена групповая принадлежность российского изолята вируса аденоматоза легких овец, к группе европейских и североамериканских изолятов данного возбудителя, гомология с которыми составила 97%.

1.4 Практическая значимость

На основании проделанной работы в лаборатории «Биофизика» ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ разработанные тест-системы для выявления РНК вирусов висна-маеди и аденоматоза овец методом ПЦР, в настоящее время используются для обнаружения геномов этих вирусов в инфицированных культурах клеток, пробах легких, головного мозга и крови инфицированных животных.

1.5 Публикации результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 - в журнале «Ветеринария».

1.6 Апробация результатов исследований

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ, Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных» ГНУ

ВНИИВВиМ (г. Покров, 2004), Международной научно-практической конференции Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ВНИТИБП (г. Щелково, 2005), Международной научно-практической конференции: Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных ГНУ ВИЭВ (г.Москва, 2006).

1.7 Личный вклад соискателя

Экспериментальные исследования, анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. Отдельные этапы экспериментальных работ выполнены совместно с сотрудниками лабораторий «Эпизоотология» и «Иммунология».

В выполнении исследований практическую и консультативную помощь оказывала заведующая лаборатории «Биохимия», доктор биологических наук Власова H.H. по разделам 4.1, 4.3 - старший научный сотрудник лаб. «Биофизика», кандидат биологических наук Жигалева О.Н., научный сотрудник лаб. «Биофизика», кандидат биологических наук Копытов В.О., заведующий лаб. «Эпизоотология», доктор биологических наук Стрижаков A.A., научный сотрудник лаб. «Эпизоотология», кандидат ветеринарных наук Чичикин А.Ю., по разделу 4.2 - старший научный сотрудник лаб. «Иммунология», кандидат ветеринарных наук Капустина О.В., за что автор выражает им глубокую признательность.

1.8 Структура и объем работы

Диссертация изложена на 108 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения. Список литературы включает 214 источников, работа иллюстрирована 25 рисунками и 5 таблицами, дополнена приложениями.

1.9 Основные положения, выносимые на защиту

- тест-системы на основе ПЦР, позволяющие определять наличие генома возбудителей аденоматоза легких овец и висна-маеди овец в

пробах крови, органов и тканей больных животных;

- исследования проб крови овец из различных хозяйств РФ нг содержание генома возбудителя аденоматоза легких овец;

- нуклеотидные последовательности ПЦР-продуктов возбудителя| аденоматоза легких овец, циркулирующего на территории РФ и сравнение их с изолятами выделяемыми за рубежом РФ;

- нуклеотидные последовательности ПЦР-продуктов штамма вируса висна-маеди хранящегося в музее микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, позволяющими определить его генетическое родство с референтными штаммами.

2. Собственные исследования

2.1 Материалы

Вирусы. Использованы вируссодержащие материалы: вирус ВМ штамм «Маеди М-88» (инв.№572) и штамм «Висна К-796» (инв.№569) полученные из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ; пробы крови и патологического материала от овец инфицированных вирусами АЛО и ВМ, пробы крови и патологического материала от коз, инфицированных вирусом артрита-энцефалита коз, полученных из хозяйств Республики Удмуртии и Тверской области.

Ферменты. В работе использованы ферменты M-MLV обратная транскриптаза, Taq-полимераза, протеиназа К, ингибитор рибонуклеаз, рестриктазы (EcoRV, HindIII, EcoRI), Т4 ДНК-лигаза производства «Fermentas», «СибЭнзим» (Новосибирск), ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва), «Promega», «Sigma», «Serva».

Реактивы. В работе использовали реактивы отечественного производства класса ос.ч. и ч.д.а., и фирм «Serva», «Promega», «Sigma».

Культуры клеток. Почка козла (ПК), перевиваемая клеточная линия FLK (ПЭО-ЛС) контаминированная вирусом лейкоза крупного рогатого скота, почка овцы (ПО, кат №22.1).

2.2 Методы

2.2.1 Приготовление гистологических срезов. Фиксацию тканей легких проводили в 10% нейтральном формалине. Изготовление парафиновых блоков и срезов толщиной 3-5 мкм, окрашивание гематоксилин-эозином, заключение их в бальзам проводили согласно рекомендациям, изложенным Меркуловым [Меркулов Г.А., 1961]. Микрокопию образцов проводили под световым микроскопом «ОПтриБ», при увеличении в 40, 100, 250 раз.

2.2.2 Получение форменных элементов крови. Для получения форменных элементов крови использовали методы осмотического лизиса эритроцитов и центрифугирование в градиенте Ficoll-Paque. При обработке крови методом осмотического лизиса к одному объему крови добавляли 20 объемов дистиллированной воды, а затем вносили равный объем фосфатного солевого буфера (ФСБ) в двукратной концентрации. Раствор центрифугировали, садок растворяли в воде и использовали в качестве материала для выделения нуклеиновых кислот.

Второй метод заключался в том, что на раствор РшоП-Рацие наслаивали равный объем крови, разведенной в два раза ФСБ. После центрифугирования эритроциты агрегировали с фиколом и оседали на дно пробирки, при этом лейкоцитарная масса располагалась на границе раздела Рюо11-Раяие -сыворотка крови. Лейкоцитарную массу отбирали пипеткой, промывали ФСБ и использовали для выделения нуклеиновых кислот.

2.2.3 Выделение нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью фенольно-детергентного метода, с использованием гуанидинтиоцианатного лизирующего буфера, а так же методом сорбции нуклеиновых кислот на частицах диоксида кремния.

Для фенольно-детергентной экстракции использовали методику, описанную Маниатисом с соавторами [Т. Маниатис, 1984]. Метод выделения нуклеиновых кислот с использованием буфера с 4М гуанидинтиоцианата (ГТЦ), описан СЬгошсгупзк! Р. с соавторами [Р. СЬотсгупвк!, 1987]. Метод

нуклеосорбции основам на сорбировании нуклеиновых кислот из раствора с высокой концентрации хаотропной соли на частицах диоксида кремния.

2.2.4 Синтез кДНК проводили с использованием наборов для синтеза кДНК фирм: «Fermentas», ФГУ ВНИИЭ РОСПОТРЕБНАДЗОРА и «СибЭнзим», согласно рекомендациям производителя. В качестве затравок использовали олигонуклеотиды длиной 19-30 оснований, комплементарные последовательностям генов вирусов.

2.2.5 Постановка ПЦР. Раствор кДНК (5 мкл) амплифицировапи в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 10 рМ_ каждого праймера, 0,1 шМ смеси dNTP, 10х буфер (50 mM Трис НС1 рН 8,0-9,2, 50 mM KCI, 1,0 -4,0 тМ MgCl2 ), 1 ед. Taq-полимерэзы. Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» ДНК-Технология (г.Москва).

2.2.6 Анализ ПЦР продуктов. Для анализа фрагментов ДНК методом гель-электрофореза наносили по 5-10 мкл ПЦР-продуктов на 2% агарозный гель. Электрофорез проводили, используя Трис-ацетатный буфер (трис-ацетат рН7,6 - 40мМ, ЭДТА - 1мМ), содержащий бромистый этидий в концентрации 0,4-0,5 мкг/мл, в режиме 10-15 В/см в течение 30 минут [Т. Маниатис, 1984]. Учет результатов электрофореза проводили по размеру ПЦР-продуктов с маркером молекулярного веса ДНК (ЮОЬр), используя трансиллюминатор и систему гельдокументирования.

2.2.7 Компьютерный анализ. Анализ первичной структуры генома проводили с использованием пакетов прикладных программ BioEdit 6.0. Расчет вероятных схем спаривания праймеров осуществляли по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот с использованием соответствующих энергетических правил по программе, Oligo.

Для филогенетического анализа полученных первичных нуклеотидных последовательностей использовали пакет программ CLUSTALX software, и пакет программ PHYLIP, с использованием метода NEIGHBOR-JOINING [J. Felsenstein, 2004].

2.2.8 Подготовка ПЦР-фрагментов для секвенированпя методом гель-электрофореза и очистки с Nal. В лунки агарозного геля вносили ПЦР продукты. Электрофорез проводили при описанных выше условиях. Затем вырезали фрагмент агарозного геля, содержащий искомую ДНК и обрабатывали его раствором Nal. ДНК сорбировали на частицы диоксида кремния, промывали 75% этанолом и элюировали буфером ТЭ (Трис HCl pH 8,0- ЮмМ, ЭДТА - 1мМ).

2.2.9 Определение первичных нуклеотцдных последовательностей. Определение первичных нуклеотцдных последовательностей проводили с использованием автоматического секвенатора Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer и набора BigDye Terminator v3.1 согласно инструкции производителя.

2.2.10 Клонирование ПЦР фрагмента в плазмидном векторе. Клонирование ПЦР-фрагмента в вектор pBluSKM (Fermentas) производили согласно методике клонирования по тупым концам.

3. Результаты исследований

3.1 Выбор метода выделения вирусной РНК

В ходе работы было проведено сравнительное изучение нескольких методов выделения нуклеиновых кислот: метод с использованием лизирующего буфера с ГТЦ, фенольно-детергентный метод, метод сорбции нуклеиновых кислот на частицах силикагеля. Параметрами оценки являлись уровни аналитической чувствительности и воспроизводимость результатов ПЦР с использованием того или иного способа выделения нуклеиновых кислот, а также наличие или отсутствие фоновой амплификации, приводящей к появлению шмеров на электрофореграмме.

Для оценки эффективности выделения нуклеиновых кислот из проб крови было проведено их выделение с использованием всех трех методик: нуклеосорбция, лизирование клеток с помощью буфера с ГТЦ, фенольно-детергентная с использованием протеиназы К. В качестве матрицы использовали лейкоциты, выделенные из крови овцы больной AJIO. Исходную пробу разводили в 3 и 9 раз лейкоцитами, полученными от

интактной овцы. Для выделения нуклеиновых кислот АЛО использовали 100 мкл суспензии лейкоцитов. Результаты ПЦР представлены на рисунке 3.1.

Как видно из представленной электрофореграммы (рисунок 3.1). наилучший результат получен при выделении нуклеиновых кислот при помощи сорбции на сорбент (силикагель производства фирмы Sigma) (треки №1-3). При выделении нуклеиновых кислот с использованием фенол-хлороформенной экстракции, как с протеиназой К, так и с ГТЦ (треки №4-9) заметна возросшая фоновая амплификация, проявляющаяся в светимости всего трека (ярко видимое в треках №7-8).

На рисунке цифрами обозначены: 1,4,7 - исходный материал; 2,5,8 - 3-х кратное разведение; 3,6,9 -9-и кратное разведение; 1-3 - пробы, выделенные методом сорбции на сшикагеле; 4-6 - пробы, выделенные с лизирующгш буфером ГТЦ; 7-9 - пробы, выделенные с использованием протеиназы К; М - маркер молекулярного веса ДНК, 100-1000 п о.

Рисунок 3.1 - Электрофореграммы продуктов ПЦР проб РНК АЛО, выделенных разными способами.

3.2 Выявление животных, подозреваемых в инфицировании АЛО

Проявление клинических признаков заболевания находится в зависимости от продолжительности болезни, характера, локализации и размеров аденоматозного поражения легких. Животных, подозреваемых в заболевании АЛО, выявляли путем 30-ти минутного прогона отары. Выбраковывали овец

имеющих следующие клинические признаки: отставание при прогоне, отдышка, наличие характерных свистящих звуков, усиливающихся при прогоне, сильный влажный продолжительный кашель. В результате выбракованно восемь овец (1-10 -летнего возраста) с характерными для аденоматоза симптомами, у которых отбирали кровь, затем умерщвляли.

При проведении патолого-анатомического исследования у шести овец из восьми в легких были обнаружены характерные поражения легких в виде выступающих одиночных и множественных серо-белых плотных образований различной величины хаотично расположенныхпо всей паренхиме легких, у двух животных - хроническая бронхопневмония.

3.3 Проведение гистологических исследований

При проведении гистологических исследований срезов легких овец, подозреваемых в заражении АЛО, в очагах пораженных легких обнаружено перерождение выстилающего однослойного эпителия альвеол и бронхиол в пролиферирующий железистоподобный кубический и цилиндрический эпителий. Измененные клетки выстилали стенки альвеол и бронхиол хаотично, в несколько слоев, с образованием сосочковидных выростов в альвеолярные полости, заполненные слизистым эксудатом. Выявлены групповые скопления измененных не дифференцированных клеток с широкой цитоплазмой, овальным или круглым ядром, бедные хроматином.

Таким образом, при проведении экспертизы патматериала, поступившего из хозяйства Республики Удмуртии, на основании эпизоотологического обследования, клинических признаков, патоморфологического и гистологического исследований была установлена циркуляция среди поголовья овец возбудителя АЛО.

3.4 Подбор праймеров для выявления возбудителя АЛО при помощи ПЦР

Специфические праймеры были подобраны на основе опубликованных в GenBank первичных последовательностей геномов изолятов возбудителя АЛО. Праймеры Jaag-Fl и Jaag-Rl подобраны на область U3 long terminal

repeat (LTR) генома возбудителя АЛО. Область LTR выбрана исходя из того, что наибольшие отличия эндогенного и экзогенного вирусов АЛО сосредоточены в LTR области генома [Bai J et al, 1996]. Для повышения J чувствительности тест-системы была подобрана «внутренняя» пара праймеров - Jaag-F2 и Jaag-R2.

Наружные праймеры Jaag-Fl и Jaag-R I фланкировали участок размером 261 п.о., внутренние, Jaag-F2 и Jaag-R2, - 178 п.о. (рисунок 3.2).

LTR U3 region

1 раунд ПЦР 261 п.о7 V 2 раунд ПЦР 178 п.о.

Рисунок 3.2 - Схема расположения амплифицируемых участков генома возбудителя АЛО, получаемых при ПЦР с рассчитанными праймерами.

3.5 Оптимизация синтеза кДНК.

С целью оптимизации синтеза кДНК реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили при различных температурных режимах - 37, 42 и 50°С в течение 30 и 60 мин.

Результаты исследований показали, что, увеличение времени инкубации до 60 мин при синтезе кДНК приводит к появлению дополнительных шмеров и «размытию» основной полосы (треки №1-3) (рисунок 3.3). Анализ накопления продуктов амплификации, в зависимости от температурного режима синтеза кДНК, показал, что наибольшее накопление ПЦР-ампликона проходит с кДНК, синтезированной при 42°С (трек №6). Оптимальными выбраны параметры проведения реакции: 30 мин при 42°С.

В результате исследования условий постановки реакции обратной транскрипции было установлено, что оптимальным является использование специфических праймеров. фланкирующих фрагмент 261 п.о., синтез кДНК и проведение самой реакции при температуре 42°С в течение 30 мин.

............. ;

178 п.о.

■у, ...

I

I :.

• , • -

.5 V ¡, ЖШжЙШ

200 п.о

100 п.о.

На рисунке обозначено: I - синтез кДНК в течении 60 мин, 5С!'С; 2 - синтез кДНК в течении 60 мин, 37°С; 3 - синтез кДНК в течении 60 мин, 42°С; 4 -синтез кДНКв течении 30мин, 50°С; 5 синтез кДНКв течении 30мин, 37°С: б - синтез кДНКв течении 30 мин, 42"С; М - маркер молекулярного веса ДНК, 100-1 ООО п о.

Рисунок 3.3 - Электрофореграммы продуктов ПЦР полученных при оптимизации синтеза кДНК

3.6 Оптимизация условий постановки ПЦР для выявления генома возбудителя АЛО

При оптимизации реакции использованы различные температурные режимы амплификации и буферные системы. Для оптимизации ПЦР по температуре отжига праймеров проводили четыре параллельные реакции при 60, 63, 66, 69°С (рисунок 3.4)

На рис)>нке цифрами обозначены: М - маркер молекулярного веса

ДНК 100-1000 по.; 1

температура отжига бСРС; 2 -температура отжига 63°С; 3 -температура отжига 6(?С; 4 -температура отжига

■*- Рисунок 2.4 - Электрофореграмма

178 п.о. продуктов ПЦР, полученные при оптимизации температуры отжига праймеров

200п.о.

ЮОп.о

Я -

ь

■

1

м

Результаты исследований показали, что максимальное накопление ПЦР-

ампликона происходит при температуре отжига 69"С (трек №4) (рисунок. 3.4). при понижении температуры снижается накопление специфического продукта (треки №2,3). а при 60иС. четкая полоса на электрофорезе не образуется, виден лишь шмер (трек №1). Таким образом, в дальнейших исследованиях при постановке ПЦР отжиг праймеров проводили при температуре 69°С.

Для определения оптимальной концентрации в реакционном буфере ионов и значения показателя концентрации ионов водорода (рН) был использован «Набор буферов для одношаговой оптимизации ПЦР», содержащий 16 буферов, характеристика которых дана в таблице 3.1.

Таблица 3.1 - Набор буферов для одношаговой оптимизации ПЦР

рН раствора Концентрация ионов Mg"+

10 мМ 20 мМ 30 мМ 40 мМ

8,0 1 5 9 13

8,4 2 6 10 14

8,8 3 7 11 15

9,2 4 В 12 16

Примечание: на пересечении столбцов концентрации М§ и строк показателя рН, даны порядковые номера буферов, использованных для постановки реакции.

Результаты проведения реакции ПЦР с буферами для одношаговой

оптимизации представлены на рисунке 3.5.

М 1 2 3 4 5 6 78 9 10 И 12

178п.о.

178п.о.

13 14 15 16

¡Bfogffi

S, 'Xiji,

"rSSriSl

' - - - v

На рисунке цифрами обозначены: M - маркер 100 - 1000 п. о.; 1, 2, 3, 4 ~рН 8,0; 1, 5, 9, 13-ljuMMg2+

5, 6, 7, 8 -рН 8,4; 2, 6, 10 ,14 - 2мМMg2'

9, 10, 11, 12 - рН 8,8; 3, 7, 11, 15-3MMMg2~ 13, 14, 15, 16 - рН 9,2; 4, 8, 12, 16-4mMMg2 Рисунок 3.5 - ПЦР с использованием буферной системы для одношаговой оптимизации ЦЦР при выявлении генома возбудителя АЛО

Как видно из электрофореграммы (рисунок 3.5). при значении рН 8,0 (треки №1-4) и 8,4 (треки №5-8) накопление ампликона проходит не при всех значениях концентрации ионов При более высоком значении рН

8,8 (треки №9-12) и 9,2 (треки №13-16) накопление ампликона приходит при всех испытанных значениях концентрации ионов М§2+. Лучшее накопление ампликона получено при рН 8,8 и концентрации М§СЬ в 10х буфере 30 мМ.

Таким образом, в результате проведенных исследований для постановки ПЦР с целью выявления генома АЛО выбран 10х буфер с рН 8,8, содержащий 30 мМ К^СЬ, и режим амплификации с температурой отжига праймеров 69°С по программе: 98°С, 30 сек-1 цикл; 95°С 2 сек, 69°С 15 сек-42 цикла; 72°С 60 сек - 1 цикл.

3.7 Определение специфичности метода ПЦР для выявления генома АЛО

Результаты проверки специфичности тест-системы с использованием панели контрольных образцов представлены в таблице 3.2. Суммарные РНК выделены с использованием сорбента из всех образцов, представленных в данной таблице, использованы в качестве матрицы в ОТ-ПЦР.

В результате проведенных исследований показано, что подобранная система праймеров позволяет надежно и воспроизводимо дифференцировать нуклеиновые кислоты возбудителя АЛО от нуклеиновых кислот других вирусов (вируса ВМ, артрита-энцефалита коз, лейкоза крупного рогатого скота).

В результате оптимизации условий проведения ОТ-ПЦР была создана чувствительная и специфичная тест-система для выявления РНК возбудителя АЛО в крови и органном материале, полученных от больных животных. Были проведены внутриинститутские комиссионные испытания тест-системы и разработаны методические указания по выявлению вируса аденоматоза легких овец с помощью полимеразной цепной реакции, утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 17

июля 2006г. В настоящее время данная тест-система успешно применяется для проведения диагностических исследований в лаборатории «Биофизика» ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ.

Таблица 3.2 - Результаты исследований специфичности метода ПЦР

при выявлении генома возбудителя АЛО

№ п.п. Наименование образца РНК выделенного из: Результат ПЦР с кДНК:

1 2 3

1. проба крови овцы больной АЛО (Республика Удмуртия); животное № 9578 +

2. проба крови овцы больной АЛО (Республика Удмуртия); животное № 6788 +

3. проба крови овцы больной АЛО (Республика Удмуртия); животное № 6797 +

4. проба крови овцы больной АЛО (Республика Удмуртия); животное № 6794 +

5. проба крови овцы больной АЛО (Республика Удмуртия); животное № 2255 +

6. проба крови овцы больной АЛО (Республика Удмуртия); животное № 0185 +

7. пробы крови от интактной козы -

8. пробы крови от интактной овцы -

9. пробы легкого от интактной овцы -

10. перевиваемой клеточной линии почки овцы (ПО) -

11. пробы крови козы больной артритом-энцефалитом (Тверская область); животное № 14 -

12. перевиваемой клеточной линии РЬК (ПЭО-ЛС), контаминированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота -

13. лиофильно высушенного культурального вируссодержащего материала, висна К-796 (10-й пассаж на культуре клеток ПЯ) -

14. лиофильно высушенного культурального вируссодержащего материала маеди М-88 (10-й пассаж на культуре клеток ПЯ) -

Примечание: (+) - РНК возбудителя АЛО обнаружена, : (-) - РНК возбудителя АЛО необнаружена

3.8 Определение нуклеотидной последовательности возбудителя

АЛО. Для подтверждения специфичности полученного фрагмента генома вируса аденоматоза в пробах крови овец из Республики Удмуртия был

произведен секвенс ПЦР-фрагментов, полученных при их амплификации с внутренними праймерами.

Полученная первичная последовательность нуклеотидов была сравнена с известными последовательностями геномов изолятов возбудителя АЛО, представлеными в СепВапк.

На основании полученных первичных нуклеотидных последовательностях построено филогенетическое дерево для изолята АЛО, выделенного в Удмуртии (рисунок 3.6).

А27Э50 М80216 NC 001494 Х95451

Тип 1

(Африка)

10%

- OA RUSSIAN

AF105220

Z71304 ХЭ5452

Тип 2 (Европа/ С.Америка)

показатель нуклеотидных различии

Рисунок 3.6 - Дендрограмма, показывающая уровень гомологии нуклеотидных последовательностей участка генома АЛО размером 178 п.о., построенная при помощи программы CLUSTALX, используя алгоритм Neighbor-Joining. На рисунке даны номера доступа соответствующих сиквенсов в GenBank. OA RUSSIAN - изолят, полученный из Удмуртии.

Как видно из представленных в дендрограмме данных, на основании первичной нуклеотидной последовательности возбудителя АЛО изолят, циркулирующий в России, входит в кластер европейских и североамериканских изолятов данного вируса. Уровень гомологии с европейским типом 2 — LTR составляет 95,5%, с африканским - типом 1 -88%.

3.9 Проведение исследований по выявлению генома возбудителя аденоматоза легках овец в пробах крови овец

В ходе апробации тест-системы на полевых образцах проводили исследование проб крови из овцеводческих хозяйств, расположенных в Центральном и Уральском административных округах РФ. В ПЦР исследованы 1977 проб крови из 20 хозяйств различных регионов России за период 2003-2007гг.

Результаты исследования проб крови овец на наличие генома возбудителя АЛО представлены в таблице 3.3.

Таблица 3.3 - Выявление РНК вируса аденоматоза в пробах крови _методом ПЦР_

Места отбора проб 2003 г. 2004 г. 2005 г. 2006 г. Всего за период

2003-2006гг.

ю о о. с ПОЛОЖИ-УХ проб | ю о сх с положи-УХ проб ю о о. с положи-ух проб ю о п. с П0Л0ЖИ- ух проб ю о о. с положи-ух проб

и с ей £ ш X ы а: й г

ч Ц ч с ц = 5

к У ^ и И и о~- н

1. Республика Удмуртия 500 3,4 512 8 729 1,5 1741 2,4

2. Ярославская область 87 32 30 0 117 23

3. Владимирская область 10 0 15 0

4. Орловская область 10 0 10 0

5. Кабардино-Балкарская Республика 10 0 10 0

6. Республика Башкортостан 10 0 10 0

7. Липецкая область 79 0 79 0

В ходе исследований, результаты которых представленных в табл. 3.3, установлена циркуляция возбудителя АЛО среди овец хозяйств Удмуртии и Ярославской области, геном возбудителя выявлен в 2,4% и 23% проб соответственно. В пробах крови из хозяйств Орловской области, КБР, Башкирии, Липецкой области геном возбудителя АЛО не выявлен.

3.10 Подбор праймеров для выявления генома вируса ВМ

Специфические праймеры были подобраны на основе опубликованных в GenBank первичных последовательностей геномов различных штаммов вируса ВМ. Подбор праймеров базировался на анализе последовательностей гена gag, являющегося консервативным для вируса ВМ. Праймеры VVM-F и VVM-R фланкировали фрагмент размером 500 п.о. (рисунок 3.7).

Env Rev-2

Tat Rev-1

LTR

ПЦР фрагмент 500 п.о.

Рисунок 3.7 Схема расположения амплифицируемого участка генома вируса ВМ, получаемого при ПЦР с рассчитанными праймерами.

3.11 Оптимизация условий постановки ОТ-ПЦР для выявления генома вируса ВМ

Так же как и в случае АЛО, реакцию синтеза кДНК проводили при температурном режиме 42°С в течение 30 мин.

При оптимизации ПЦР испытаны различные температурные режимы амплификации - 54, 56, 58, 60°С, что показано на рисунок 3.8.

В результате проведённых исследований выбран режим амплификации с температурой отжига праймеров 58°С (трек №3) (рисунок 3.8), обеспечивающий наибольший выход ПЦР-продукта при отсутствии

неспецифических фрагментов амплификации, образующихся при более низких температурах отжига 34'С (трек №1) и 56°С ( трек №2). При более высокой температуре отжига 60°С (трек №4) происходит снижение накопления специфического продукта реакции.

На рисунке цифрами обозначены: М - маркер молекулярного веса ДНК, 100-1000 по.; 1 температура отжига 54 С; 2 температура отжига 5б"С; 3 температура отжига 58 С; 4 -температура отжига бОаС.

Рисунок 3.8 - Электро-фореграммы продуктов ПЦР, полученные при оптимизации температуры отжига праймеров

Для определения оптимальной концентрации в реакционном буфере ионов 1У^2+ и значения рН был использован «Набор буферов для одношаговой оптимизации ПЦР», содержащий 16 буферов, характеристика которых дана в таблице 3.1.

При выборе оптимального буфера для ПЦР использованы следующие критерии: накопление максимального количества специфического ампликона, отсутствие шмеров и неспецифического синтеза. При постановке реакции с буфером, имеющим значение рН 8,0 (треки №1-4) (рисунок 3.9), отмечен очень низкий выход ПЦР-ампликона. При постановке ПЦР с буфером, имеющим показатель рН 9,2 (треки №13-16), отмечается неспецифический синтез, дающий дополнительные полосы на электрофореграмме. При использовании буферов с рН8,8 (треки №9-12) отмечено появление шмеров и неспецифических полос. Лучший выход ПЦР-продукта отмечен при использовании буфера со значением рН 8,4 (треки №5-8). Оптимальный результат получен при конечной концентрации 1У^2+ 2-3 мМ.

Таким образом, для постановки ПЦР с выбранной парой праймеров для выявления генома вируса ВМ выбран 1 Ох буфер с рН 8,4, содержащий 20 мМ

MgCl2. Режим амплификации, подобранный при приведении исследований: 98°С, 30 сек -1 цикл: 95"С 2 сек. 58°С 15 сек - 42 цикла; 72"С 60 сек - 1 цикл.

ПКО 12 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 ПКО

500п.о.

Рисунок 3.9 - ПЦР с использованием буферной системы для одношаговой оптимизации ПЦР при выявлении генома вируса ВМ

3.12 Клонирование ПЦР-фрагмента вируса висна-маеди. В качестве положительного контроля для выявления генома вируса ВМ была использована плазмида, несущая встройку фрагмента генома вируса ВМ.

В качестве вектора для клонирования была выбрана плазмида pBluSKM (Fermentas). ПЦР-продукт, обработанный фрагментом Кленова, использовали для лигирования с вектором расщепленным рестриктазой EcoRV. Отбор клонов производили селекцией на среде с IPTG и X-GAL. Были отобраны 4 клона, несущие встройку размером 500 п.о. и дающие характерную полосу амплификации с праймерами, специфичными к вирусу ВМ.

3.13 Определение специфичности и чувствительности метода ПЦР для выявления генома вируса ВМ. Для определения аналитической чувствительности метода использовали последовательные разведения препаратов, содержащих плазмиду со встройкой ПЦР-фрагмента, образующегося при ПЦР с праймерами VVM-F и VVM-R (для разведения использовали кровь овец). Пределом аналитической чувствительности

■НННШивН

(ПКО - положительный контроль ПЦР); 1,2, 3,4-pH 8,0; 1, 5, 9, 13 - 1 мМ Mg2+

5,6, 7, 8-pH 8,4; 2, 6, 10 ,14 - 2 мМ Mg2+

9, 10, 11, 12-pH 8,8; 3,7, 11, 15-3MMMg2+

13, 14, 15, 16 - pH 9,2; 4, 8, 12, 16 - 4 мМ Mg2'

метода считали наибольшее разведение, при котором регистрировали положительный результат в ПЦР. Чувствительность системы детекции плазмидной ДНК методом ПЦР составляла 100-1000 копий матрицы в I мл .

Специфичность метода проверяли, используя суммарные РНК и ДНК выделеные при помощи метода сорбции на частицах силикагеля (таблица 3.4). Данная система праймеров позволяет надежно и воспроизводимо дифференцировать нуклеиновые кислоты вируса висна-маеди от нуклеиновых кислот других вирусов семейства ИеШ)Утс1ае (вируса аденоматоза легких овец, артрита-энцефалита коз, лейкоза крупного рогатого скота).

Таблица 3.4 - Результаты проверки специфичности метода ПЦР

при выявлении генома вируса ВМ

№ п.п. Наименование образца РНК выделенного из: Результат ПЦР с кДНК:

1 2 3

1 лиофильно высушенного культурального вируссодержащего материала, висна К-796 (10-й пассаж на культуре клеток ПЯ) +

2 лиофильно высушенного культурального вируссодержащего материала маеди М-88 (10-й пассаж на культуре клеток ПЯ) +

3. пробы крови от интактной козы -

4. пробы крови от интактной овцы -

5. пробы легкого от интактной овцы -

6. перевиваемой клеточной линии почки овцы (ПО) -

7. проба крови овцы больной АЛО (Республика Удмуртия); животное № 9578 -

8. проба крови овцы больной АЛО (Республика Удмуртия); животное № 6788 -

9. пробы крови козы больной артритом-энцефалитом (Тверская область); животное № 14 -

10. перевиваемой клеточной линии Р1Ж (ПЭО-ЛС), контаминированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота -

Примечание: (+) - РНК вируса ВМ обнаружена, : (-) - РНК вируса ВМ необнаружена

Таким образом, в результате оптимизации условий проведения ОТ-ПЦР для определения РНК вируса ВМ была создана чувствительная и

специфичная тест-система для выявления РНК данного вируса в инфицированных культурах клеток и образцах крови, полученных от животных. С положительными результатами проведены внутриинститутские комиссионные испытания тест-системы, и разработаны методические указания по выявлению вируса висна-маеди овец с помощью полимеразной цепной реакции, утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 17 июля 2006г. В настоящее время данная тест-система успешно применяется для проведения диагностических исследований в лаборатории «Биофизика» ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ.

3.14 Секвенс музейного штамма вируса ВМ. Для подтверждения специфичности амплификации генома вируса ВМ был проведен секвенс ПЦР-ампликона, полученного при ПЦР кДНК синтезированной с РНК выделенной из лиофильно высушенного культурального вируссодержащего материала маеди штамм М-88.

Первичная последовательность нуклеотидов была сравнена с известными нуклеотидными последовательностями геномов изолятов вируса ВМ представлеными в GenBank.

Установлено, что штамм «М-88» вируса ВМ, хранящийся в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ, имеет высокую степень гомологии по нуклеотидной последовательности с реферетным штаммом «Icelandic 1514», составляющую 97%. Для генома штамма М-88 характерны нуклеотидные замены, не повторяющиеся ни у одного из штаммов и изолятов ВМ представленных в GenBank.

Выводы

1. На основе анализа банка нуклеотидных последовательностей подобраны уникальные праймеры комплементарные LTR-участку генома возбудителя аденоматоза легких овец. Отработаны оптимальные условия постановки ПЦР, позволяющие выявлять наличие генома возбудителя

аденоматоза легких овец в пробах крови подозреваемых в заболевании животных.

2. В результате проведенного анализа банка нуклеотидных последовательностей подобраны уникальные праймеры комплементарные gag-гeнy вируса висна-маеди. Отработаны оптимальные условия постановки ПЦР, позволяющие выявлять наличие генома вируса висна-маеди в пробах клинического и патологического материала с аналитической чувствительностью 100-1000 копий генома в 1 мл пробы.

3. На основе исследований проб крови овец методом ПЦР установлена циркуляция возбудителя аденоматоза легких овец в овцеводческих хозяйствах на территории Удмуртии и Ярославской области. Доля положительно реагировавших образцов от числа исследованных составила 2,4 % в хозяйствах Удмуртии и 23 % - Ярославской области.

4. Установлено, что циркулирующий возбудитель аденоматоза легких в овцеводческих хозяйствах Удмуртии генетически относится к Европейской и Северо-Американской группе изолятов.

5. Показано, что штамм М-88 вируса висна-маеди, хранящийся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ (инв.№572), имеет 97% степень гомологии с Европейскими штаммами, имея нуклеотидные отличая, неповторяющиеся ни у одного из проанализированных штаммов.

6. Получено 4 плазмидных клона, несущих встройку фрагмента генома вируса висна-маеди размером 500 п.о.. Полученная плазмида специфична и может быть использована в качестве положительного контроля при постановке ПЦР.

Практические предложения

1. Для практического использования предлагается тест-система для выявления РНК вируса аденоматоза легких овец с помощью полимеразной цепной реакции, которая может быть включена в схему лабораторной диагностики данного заболевания.

2. Для практического использования предлагается тест-система для выявления РНК вируса висна-маеди с помощью полимеразной цепной реакции, которая может быть применена для лабораторной диагностики заболевания.

3. Составлены методические указания выявлению генома вируса аденоматоза методом полимеразной цепной реакции, одобренные ученым советом и утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗ АКАДЕМИИ 17.07.2006г.

4. Составлены методические указания по выявлению генома вируса висна-маеди методом полимеразной цепной реакции, одобренные ученым советом и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗ АКАДЕМИИ 17.07.2006 г.

Список научных работ, опубликованных по материалам дисертации:

1. Бурдинский, В.Г. Медленные инфекции мелких жвачных / В. Г. Бурдинский // Болезни диких животных: Материалы Междунар. науч,-практ. конф., 28 - 30 сентября 2004. - Покров, 2004. - С. 248 - 251

2. Разработка метода ПЦР для идентификации вируса висна-маеди в пробах органов больных животных / О. Н. Жигалева, В. Г. Бурдинский, С. Ж. Цыбанов, А. А. Стрижаков, И. Ю. Волкова, А. Ю. Чичикин // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Материалы Междунар. науч.- практ. конф., поев. 35- летию института, 26-27 мая 2005 г. - Щелково, 2005,- С.211-216

3. Оценка возможности использования гнездовой ОТ-ПЦР для выявления генома вируса аденоматоза овец / В. Г. Бурдинский, О. Н. Жигалева, А. С. Макаримов, С. Ж. Цыбанов // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: Материалы Междунар. науч.- практ. конф., 16-17 мая 2006г. - М.: ИзографЪ, 2006. - С.167-169

4. Бурдинский, В.Г. Обнаружение генома вируса аденоматоза овец в пробах крови и органов больных животных с помощью ПЦР / В. Г. Бурдинский, А. А. Стрижаков, С. Ж. Цыбанов // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: Материалы Междунар. науч.- практ. конф., 16-17 мая 2006г. - М.: ИзографЪ, 2006. - С. 169-172

5. Нозогеография аденоматоза овец / А.В.Книзе, А.Ю.Чичикин, В.Г. Бурдинский, Д.В. Колбасов, А.А.Стрижаков, С.Ж.Цыбанов, Жигалева О.Н. // Ветеринария. - 2007. - №5. - С.21-23

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г. Покров, Владимирской области Тираж 80 экземпляров

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бурдинский, Владимир Геннадьевич

Оглавление.

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1.Актуальность избранной темы работы.

1.2. Цель и задачи исследований.

1.3. Научная новизна работы.

1.4. Практическая значимость.

1.5. Публикации результатов исследований.

1.6. Апробация материалов исследований.

1.7. Личный вклад соискателя.

1.8. Основные положения, выносимые на защиту.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Структура и организация генома вирусов аденоматоза легких овец и висна-маеди.

2.2. Филогенетический анализ возбудителей аденоматоза легких и висна-маеди овец.

2.3. Характеристика аденоматоза легких овец.

2.3.1. Распространение аденоматоза легких овец.

2.3.2. Классические методы диагностики аденоматоза легких овец.

2.3.3. Молекулярная диагностика аденоматоза лёгких овец.

2.4. Характеристика висна-маеди овец.

2.4.1. Распространение висна-маеди овец.:.

2.4.2. Классические методы диагностики висна-маэди овец.

2.4.3. Молекулярная диагностика висна-маеди.

2.5.Создание диагностических тест-систем на основе использования ПЦР

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление геномов возбудителей аденоматоза и висна-маеди овец с помощью полимеразной цепной реакции"

1.1 .Актуальность избранной темы работы

Медленные инфекции животных - традиционно сложившееся наименование группы инфекционных болезней, которые представляют собой серьёзную проблему в связи с их скрытым течением, неизбежным летальным исходом, а так же отсутствием средств лечения и профилактики [29, 150]. В основном - это болезни, поражающие только один орган или систему тканей и один вид животных или родственные виды, принадлежащие к одному систематическому рангу (семейство, отряд) [4]. К группе медленных инфекций животных относятся болезни, вызываемые такими возбудителями как прионы - губкообразная энцефалопатия КРС, скрепи, а также вирусные инфекции - алеутская болезнь норок, инфекционная анемия лошадей, артрит-энцефалит коз и другие заболевания, среди которых аденоматоз лёгких и висна-маеди овец по степени распространённости и уровню экономического ущерба занимают одно из главных мест [4].

Для медленных инфекций характерно отсутствие сезонности и периодичности эпизоотий, географической приуроченности. В то же время чётко прослеживается энзоотичность болезней [4].

Аденоматоз легких овец (АЛО) или легочная аденокарцинома, энзоотический прогрессирующий аденоматоз - контагиозная трансмиссивная метастазирующая опухоль легких овец, реже коз, возникающая в терминальных бронхиолах из пневмоцитов типа II (типа В) и клеток Клара и неизбежно ведущая к гибели животного [5]. Морфологически заболевание схоже с бронхоальвеолярной карциномой человека [184, 153].

Возбудитель АЛО по современной классификации Международного комитета по таксономии вирусов (МКТВ) относится к роду Betaretrovirus подсемейству Orthoretrovirinae семейства Retroviridae [116].

В настоящее время АЛО диагностируют на основании комплекса эпизоотологических и клинических данных, результатов патологоанатомического вскрытия животного. Из лабораторных методов исследования применяется гистологическое исследование пораженных тканей легких овец. Прижизненная серологическая диагностика не разработана вследствие того, что данный возбудитель не вызывает образования специфических антител в организме поражённых животных [139].

Таким образом, единственный метод лабораторной диагностики АЛО является длительным и трудоемким, не позволяющим проводить прижизненную диагностику болезни. В связи с вышеизложенным возникает необходимость в разработке тест-систем, позволяющих обнаруживать геном данного вируса, как при жизни животного, так и посмертно, но в более короткие сроки, по сравнению с гистологическим методом.

В последние годы для обнаружения вирусного генома АЛО широко применяют метод полимеразной цепной реакции и секвенирование генома, которые открывают новые возможности для усовершенствования диагностики АЛО [122, 123, 120, 205, 195].

Висна-маеди (ВМ) - термин, принятый для обозначения двух симптомокомплексов, связанных с патологией центральной нервной системы и легких овец. Термин имеет исландское происхождение, висна переводится как «изнурение», «истощение», маеди — как «одышка». Маеди — медленно прогрессирующая вирусная интерстициальная пневмония овец; висна — безлихорадочная вирусная медленная инфекция овец, которая характеризуется развитием менингита и энцефаломиелита, проявляющихся атаксией и параличами [5].

Висна и маеди впервые описаны в Исландии как две самостоятельные болезни [144]. Однако в опытах на животных было показано, что одни и те же штаммы могут вызывать патологию, характерную и для висны, и для маеди. Так, после интрацеребральной или интрапульмональной инокуляции штаммов вируса маеди наблюдали типичную клинику висны. С другой стороны, параллельно с развитием клиники висны поражения, типичные для маеди, развивались после интрацеребрального введения вируса висны [104].

По современной классификации МКТВ возбудитель ВМ относится к роду Ьеп1:тги5 подсемейству ОгЙюгейчтппае семейства Б1е1;гоутс1ае [116].

В Российской Федерации для установления этиологического объекта болезни на настоящий момент разработан метод РДП для диагностики ВМ, отличающийся низкой чувствительностью, что не позволяет диагностировать данное заболевание на ранних стадиях [26, 139]. За рубежом для диагностики широко применяется метод ИФА, дающий быстрые результаты при относительно невысоких затратах [139]. Недостатком ИФА является то, что не все животные дают достаточный для выявления антительный ответ на данный патоген, либо дают позднее накопление антител в сыворотке крови, вследствие чего эти животные остаются скрытыми носителями вируса ВМ [139, 42].

Приоритетность разработки новых эффективных диагностических препаратов против латентных инфекций животных обусловлена тем, что при возросших торгово-экономических связях растет вероятность заноса в страну их возбудителей племенными животными.

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции и их секвенирование с последующим филогенетическим анализом, дополняя серологические методы, открывают новые возможности для прижизненного выявления возбудителей инфекционных заболеваний, а также путей их заноса в хозяйства и проведение соответствующих мероприятий для предотвращения их дальнейшего распространения.

В связи с вышеизложенным, разработка методов выявления геномов вирусов ВМ и АЛО имеет важное эпизоотологическое и диагностическое значение для ветеринарии и является актуальной.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Бурдинский, Владимир Геннадьевич

6. ВЫВОДЫ

1. На основе анализа банка нуклеотидных последовательностей подобраны уникальные праймеры комплементарные ЬТЯ-участку генома возбудителя аденоматоза легких овец. Отработаны оптимальные условия постановки ПЦР, позволяющие выявлять наличие генома возбудителя аденоматоза легких овец в пробах крови подозреваемых в заболевании животных.

2. В результате проведенного анализа банка нуклеотидных последовательностей подобраны уникальные праймеры комплементарные §а§-гену вируса висна-маеди. Отработаны оптимальные условия постановки ПЦР, позволяющие выявлять наличие генома вируса висна-маеди в пробах клинического и патологического материала с аналитической чувствительностью 100-1000 копий генома в 1 мл пробы.

3. На основе исследований проб крови овец методом ПЦР установлена циркуляция возбудителя аденоматоза легких овец в овцеводческих хозяйствах на территории Удмуртии и Ярославской области. Доля положительно реагировавших образцов от числа исследованных составила 2,4 % в хозяйствах Удмуртии и 23 % - Ярославской области.

4. Установлено, что циркулирующий возбудитель аденоматоза легких в овцеводческих хозяйствах Удмуртии генетически относится к Европейской и Северо-Американской группе изолятов.

5. Показано, что штамм М-88 вируса висна-маеди, хранящийся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ (инв.№572), имеет 97% степень гомологии с Европейскими штаммами, имея нуклеотидные отличая, неповторяющиеся ни у одного из проанализированных штаммов.

6. Получено 4 плазмидных клона, несущих встройку фрагмента генома вируса висна-маеди размером 500 п.о. Полученная плазмида специфична и может быть использована в качестве положительного контроля при постановке ПЦР.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для практического использования предлагается тест-система для выявления РНК вируса аденоматоза легких овец с помощью полимеразной цепной реакции, которая может быть включена в схему лабораторной диагностики данного заболевания.

2. Для практического использования предлагается тест-система для выявления РНК вируса висна-маеди с помощью полимеразной цепной реакции, которая может быть применена для лабораторной диагностики заболевания.

3. Составлены методические указания выявлению генома вируса аденоматоза методом полимеразной цепной реакции, одобренные ученым советом и утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 17.07.2006г.

4. Составлены методические указания по выявлению генома вируса висна-маеди методом полимеразной цепной реакции, одобренные ученым советом и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 17.07.2006 г.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бурдинский, Владимир Геннадьевич, Покров

1. Агибалова, дис. канд. вет. наук: 06.00.03 / Агибалова Александра. — Покров, 1991.- 168 с.

2. Аксенов, М.Ю. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции / М.Ю. Аксенов, A.JL Гинцбург // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993 — №4. - С.3-7.

3. Алиев, Д.И. Патоморфология аденоматоза легких мелкого рогатого скота в Азербайджанской ССР: автореф. дис.канд. вет. наук: 00.00.00 / Алиев. Покров, 0000. -000 с.

4. Архипов, Н.И. Медленные инфекции животных / Н.И. Архипов, И.А.Бакулов, Л.И.Соковых. -М.: Агропромиздат, 1987. 191с.

5. Вирусные болезни животных / В.Н . Сюрин и др.. -М. : ВНИТИБП, 1998.-928 с.

6. Выявление ДНК вируса болезни Ауески гибридизацией с биотипированными зондами / А. Г. Глотов и др. // Ветеринария. 2001. - №2. - С.21-24.

7. Голицина, J1.H. Оценка разработанного «nested»- варианта полимеразной цепной реакции при выявлении энтеровирусов у больных / Л.Н. Голицина и др. // Вопросы вирусологии. 2002.- №5. -С. 41^43.

8. Гусева, Е. В. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний животных / Е. В. Гусева, Т. А. Сатина. Владимир, 1995. —44 с.

9. ДеМартини, Дж. К. Онкогенез ретровирусов на модели рака легких овец / Дж. К. ДеМартини // Российский ветеринарный журнал сельскохозяйственные животные. -2005. -№4. С.9-11.

10. История изучения медленных инфекций овец в нашей стране / интервью с Ю.Д.Караваевым // Российский ветеринарный журнал сельскохозяйственные животные. -2005. -№1. -С. 12-13.

11. Кадымов, P.A. Инфекционные болезни овец / P.A. Кадымов, A.A. Кунаков, В.А. Седов; Под ред. P.A. Кадымов. М.: Агропромиздат, 1987. - 303 с.

12. Коромыслов, Г.Ф. Опыт оздоровления неблагополучного по висна-маеди овцеводческого хозяйства / Г.Ф. Коромыслов, Б.Ф. Шуляк // Бюллетень ВИЭВ. — М.:ВИЭВ, 1996. -Вып. 77. -С.25-26.

13. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование/ пер. с англ. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук М.: Мир, 1984. - 480 с.

14. Меркулов, Г.А. Курс патологогистологической техники / Г.А.Меркулов. -Л.:Медгиз, 1961. -340с.

15. Митрофанов, П.М. Патолого-анатомическая диагностика малоизвестных инфекционных болезней сельскохозяйственных животных / П.М. Митрофанов. — Саранск: Изд-во Мордов. Ун-та, 1997. 108с.

16. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / С. Херрингтон, Дж. Макги; пер. с англ. A.A. Лушниковой, Л.И. Новиковой, П.А. Сломинского. М.: Мир, 1999.-558 с.

17. Мюллис, К. Необычайная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция / К. Мюллис // В мире науки .- 1990. №6 - С.26-34.

18. Наумкина, М. Разработка методов молекулярной гибридизации и ПЦР для идентификации вируса бешенства: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.06. / Наумкина Марина Алексеевна. Покров, 1999. - 24 с.

19. Обнаружение вируса болезни Ауески методом «гнездовой» полимеразной цепной реакции / А. Г. Аминев и др. // Молекулярная биология. 1997. - Т.31, №3. -С.564—567.20.