Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка идентификации Bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка идентификации Bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов"

IIa правах рукописи

Ж

Мастиленко Андрей Владимирович

РАЗРАБОТКА ИДЕНТИФИКАЦИИ BORDETELLA BRONCH1SEPTICA НА ОСНОВЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в то.м числе бнонанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 МАЙ 2011

Саратов - 2011

4847917

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич кандидат ветеринарных наук, доцент Васильева Юлия Борисовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Тихомирова Елена Ивановна

доктор биологических наук

Заднова Светлана Петровна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», г. Москва.

Защита диссертации состоится « » ¿У/¿УЛ/ 2011 года в {9__ часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан <>У^ » 2011 г. и размещен на сайте:

www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время бордетеллез является широко распространенным заболеванием животных во многих странах мира (Baker, 2003). Однако в Российской Федерации до настоящего времени исследования в этой области не проводились.

Bordetella bronchiseptica является возбудителем хронических и, довольно часто, асимптоматических инфекций респираторного тракта (трахеобронхита) животных. Возбудитель поражает животных всех возрастных групп, но наиболее тяжелые последствия развиваются у молодых особей. Тяжесть заболевания связана с присутствием у В. bronchiseptica факторов патогенностн: адгезинов (филаментозного гемагглютинина, пертактина и фимбрий) и токсинов (дермонекротического, аденилатциклазы-гемолизина и липополисахарида) (Wooifrey et al., 1991; Gueirard et a!., 1995).

Инфекционный агент долго сохраняется в окружающей среде, поэтому чаще всего его обнаруживают в местах скученности животных (питомники, фермы, частные хозяйства) (Bemis, 1977). Возможность трансмиссии возбудителя из природных эпизоотических очагов к животным, содержащимся в фермерских хозяйствах, и, как следствие, значительных экономических потерь в малом и среднем сельскохозяйственном бизнесе вследствие гибели или снижения продуктивности животных, обусловливают необходимость выявления В. bronchiseptica и проведение противоэпидемических мероприятий. В связи с этим актуальным является разработка методов индикации и идентификации В. bronchiseptica.

Цель работы - разработка методических приемов индикации и идентификации В. bronchiseptica, основанных на и.ммунохимических и молеку-лярно-генетических методах. Задачи работы:

1. Провести сравнительный анализ иммунохимических методов изучения антигенного состава В. bronchiseptica с целью идентификации.

2. Адаптировать метод полимеразной цепной реакции для молекулярно-генетической идентификации В. bronchiseptica,

3. Подобрать праймеры для выявления специфических участков ДНК В. bronchiseptica, а также идентификации участка генома представителей рода Bordetella.

4. Определить специфичность полимеразной цепной реакции при индикации В. bronchiseptica.

5. Разработать схему мультиплексной ПЦР для одновременного обнаружения нескольких специфичных участков ДНК В. bronchiseptica.

6. Определить чувствительность ПЦР при выявлении возбудителя бордетеллеза.

7. Разработать схему проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для количественной оценки ДНК В. bronchiseptica.

Научная новизна. Впервые в Российской Федерации проведен сравнительный анализ антигенного состава В. bronchiseptica с

ротками в реакциях радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony (1948), встречного электрофореза по G. Bedarida et al. (1969) и иммуноэлектрофореза по Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979). Показана высокая чувствительность метода иммуноэлектрофореза для изучения антигенной структуры В. bronchiseptica при использовании иммунной сыворотки с низким титром. На примере использования разработанных систем праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ доказана высокая специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции при идентификации В. bronchiseptica. Подобраны и оптимизированы соотношения систем праймеров для одновременного выявления 3 специфичных участков генома В. bronchiseptica в мультиплексном формате ПЦР. Предложена схема проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для количественной оценки содержания ДНК В. bronchiseptica в биоматериале.

Практическая значимость работы. Метод иммуноэлектрофореза при проведении антигенной идентификации В. bronchiseptica позволяет использовать его для контроля состава и специфичности антигенов при разработке и производстве биопрепаратов, а подобранные и оптимизированные системы праймеров - в производстве ПЦР-систем, основанных на амплификации специфических участков генома В. bronchiseptica для диагностики бордетеллеза.

Разработаны «Методические рекомендации по выявлению Bordetella bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции», утвержденные ректором УГСХА от 10 ноября 2010 г. и подтвержденные актом комиссионных испытаний, проведенных на базе ООО «Медицинский Центр «Академия» (г. Ульяновск). Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии и биотехнологии, а также при проведении практических занятий для студентов и аспирантов в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммуноэлектрофорез по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979), позволяет идентифицировать 8 антигенов В. bronchiseptica, 5 из которых являются видоспецифичными.

2. При использовании праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ может быть проведена индикация В. bronchiseptica в биологическом материале.

3. Чувствительность метода ПЦР с праймерными системами к участкам генов BfrA, BfrZ и Cytochrom-C-oxidase генома В. bronchiseptica составляет 5,5х103, а участка гена 16S rRNA - 5,5х102 бактериальных клеток/мл.

4. Мультиплексный формат ПЦР с системами праймеров к участкам BfrA, BfrZ и Cytochrom-C-oxidase дает возможность одновременно идентифицировать 3 гена: BfrA и BfrZ - специфичных для В. bronchiseptica, а также Cytochrom-C-oxidase - специфичного для В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertxissis.

5. Применение метода ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I позволяет проводить количественную оценку содержания ДНК В. bronchiseptica в биологическом материале.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы и в Научно-исследовательском центре микробиологии и биотехнологии ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия».

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008; 2009), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патология ветеринарной медицины» (Покров, 2009), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ,

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 144 страницах, содержит 15 таблиц и 28 рисунков. Список использованных литературных источников включает 207 наименований, в том числе 190 зарубежный.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект, материалы и методы исследований

Штаммы: в работе были использованы 5 референс-штаммов В. bronchiseptica из коллекции музея Научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (№ 1, 7, 214, 22067, 8344) и штамм В. parapertussis (№ 119), которые в соответствии с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этих видов морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами. Также были использованы 37 штаммов В. bronchiseptica, выделенные из клинических образцов биоматериала от собак и кошек в ветеринарных клиниках Ульяновской области.

Для определения специфичности иммунохимических методов и ПЦР использовали 13 бактериальных культур: P. aeruginosa, P. putida, A. hydrophila, Е. coli, Y. enterocolytica, Y. pseudotuberculosis, О. rhinotracheale, S. pyogenes, S. epidermidis, L. acidophilus, S. aureus, B. subtilis из музея Научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами.

Мигательные среды и реактивы: для проведения иммунохимических исследований были использованы: агароза «Biotechnology Grade АМ-0710-0,1»

(Helicon, г. Москва), буфер трис-бораг для электрофореза (ДНК-Технология, г. Москва), краситель Amido Black 10В (Diffco), 10% лимонная кислота, стандартный раствор альбумина с молекулярной массой 65 кДа (Serva Feinbiochemica, Германия). Для проведения иммунизации кроликов был использован полный адъювант Фрейнда.

При выполнении этапа выделения бакгериальной ДНК были использованы наборы: «Проба-ГС» (сорбентная методика очистки ДНК), «Проба-НК» (фенольно-хлороформная преципитирующая методика выдеделения ДНК), «Проба-Рапид» (термический лизис с использованием бычьего альбумина для удаления ионов) (НПФ «ДНК-Технология», г. Москва), «ДНК-экспресс» (термический лизис с использованием бычьего альбумина для удаления ионов), «Выделение ДНК из биопроб» (сорбентная методика очистки ДНК) (НПФ «Литех», г. Москва), «Пробоподготовка универсальная» (сорбентаная методика) (ООО «ИзоГен», г. Москва), «ДНК-сорб-А-М -вариант 100» (сорбентная методика) («ИнтеЛабСервис», г. Москва). Для проведения амплификации были использованы наборы «GenPak® PCR Core» (ТУ 9398-001-73867468-2005, ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва), «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ с Taq-ДНК-полимеразой в присутствии красителя SYBR Green I» (ООО «Синтол», г. Москва). Для проведения электрофоретической детекции продуктов амплификации ПЦР были использованы готовые 2,3% агарозные гели с навеской трис-боратной буферной смеси (НПФ «ДНК-Технология», г. Москва), минеральное масло для ПЦР, Праймеры были синтезированы в НПФ «Литех» и ООО «Синтол» (г. Москва),

Методы: в работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения, идентификации и индикации бактерий (Васильев и др., 2004; Лабинская, 2004) и соответствующие им среды и реагенты. Основные биохимические свойства штаммов В. bronchiseptica исследовали с использованием тест-системы, разработанной в НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург. Режимы инкубирования посевов составляли 24-72 часа при 37°С. Исследования с использованием бактериальных штаммов проводили согласно ГОСТ Р 51446-99, ГОСТ Р 51426-99, ГОСТ Р 26670-9. Морфологические свойства определяли при помощи световой микроскопии окрашенных по Граму мазков, которые готовили из 24-72 часовых бульонных и агаровых культур В. bronchiseptica. Иммунологические методы исследования включали в себя гипериммунизацию лабораторных животных для получения иммунных сывороток. Иммунохимические методы включали: получение антигенов В. bronchiseptica с помощью ультразвукового дезинтегратора и их электрофорез, который проводили по методике, описанной Л.А. Остерманом с модификацией применяемого буфера; встречный электрофорез по схеме, описанной G. Bedarida et al. (1969), реакцию иммуноэлектрофореза по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979). Иммунодиффузию для выявления особенностей антигенов посредством реакции преципитации в геле проводили по методу О. Ouchterlony (1948). Молекулярио-генетические методы исследования включали в себя выделение нуклеиновых кислот (ДНК) из культур, проведение полимеразной цепной реакции с системами праймеров детекцию с помощью

горизонтального электрофореза и в режиме «реального времени» (Real Time PCR) с интсркалирующим красителем SYBR Green I. Статистические методы включали расчет чувствительности и специфичности ПЦР в сравнении с микробиологическим методом по методу А. Петри и К. Сэбин (2002). Расчеты произведены с помощь программного обеспечения Microsoft Exell 2002 (10.2701.2625).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ иммунохимичсских методов для изучения антигенного состава Bordetella bronchiseptica

При решении одной из задач данной работы были получены комплексные антигены разрушенных с помощью ультразвука бактериальных клеток. Затем была проведена иммунизация кроликов и получена гипериммунная сыворотка. После этого был проведен сравнительный анализ иммунохимических методов для изучения антигенного состава В. bronchiseptica.

Получение антигенов Bordetella bronchiseptica

Антигены В. bronchiseptica изолировали экстракцией микробных клеток в стерильном 0,9 % NaCl с последующей ультразвуковой дезинтеграцией. При их получении были использованы различные режимы дезинтеграции. Оптимальным оказался режим: частота 23 кГц, амплитуда колебаний 5 микрон, в течение 1 минуты на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом. Контроль полного разрушения бактериальных клеток при выборе режима дезинтеграции был проведен с помощью окрашенных по Граму препаратов дезинтеграта, а наличие антигенов контролировалось электрофоретическим разделением белков в агарозном геле. В качестве контроля при электрофорезе был использован стандартный раствор сывороточного альбумина с молекулярной массой 65 кДа.

Электрофорез антигенов В. bronchiseptica после ультразвуковой дезинтеграции проводили в 2,0 % агарозном геле в трис-боратном буфере (рН-8,3) с режимом 25 В/см в течение 30 минут. После электрофореза гель окрашивали красителем 1% Amido Black 10В в течение 60 минут. После этого пластину геля помещали в промывающий раствор, содержащий 10 % лимонную кислоту на 24 часа для просветления фона. Затем гель документировали и анализировали количество полученных полос аитигена (рис. 1).

В результате экспериментов был подобран оптимальный режим дезинтеграции бактериальных клеток, позволяющий полностью разрушить бактериальные клетки и максимально сохранить антигены В. bronchiseptica. При этом режиме дезинтеграции (частота 23 кГц, амплитуда колебаний 5 микрон, в течение 1 минуты на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом) при электрофорезе в 2 % агарозном геле

и использовании трис-боратного буфера было определено 7 антигенов. Также был определен диапазон расположения антигенов в агарозном геле с соответствующим режимом электрофореза, что необходимо для проведения реакции имму ноэлектрофореза.

Рис. 1, Электрофореграммаантигенов В. ЪгопсЫверйса'. 1-12-штаммы А ЬгопсЫ$ерйса\ 13-15 - альбумин (65 кДа)

Получение гипериммунной сыворотки

После выбора оптимального режима дезинтеграции микробных клеток, была получена бактериальная масса в количестве 50 мл. Затем была проведена ее ультразвуковая дезинтеграция для последующей иммунизации кроликов. Для стандартизации схемы иммунизации в дезинтеграте было определено количество белка, которое после дезинтеграции составило 6,2 мг/мл. Для удобства расчетов вводимого кроликам препарата количество белка было доведено до 5,0 мг/мл путем разведения исходного состава дезинтеграта стерильным 0,9 % р-ром ЫаС1. Иммунизацию кроликов проводили в/в по схеме, представленной в таблице 1.

Таблица ! - Схема гипериммунизации кроликов

№ Интервал (дни) Кол-во антигена Кол-во антигена Кол-во полного 1

(мг белка/мл) (мл) адъювшгга | Фрейнда (мл)

1 - 5,0 1,0 1,0

5 10,0 2.0 1,0

3 5 15,0 3,0 1,0

4 5 20,0 4,0 -

Кровь получали через 10 дней после последней иммунизации из ушной краевой вены.

Определение титра гипериммунной сыворотки

После проведения иммунизации кроликов и получения сыворотки в реакции диффузной преципитации был определен титр антител. Условия проведения реакции: 2 % агарозный гель, время диффузии - 24 часа при

комнатной температуре во влажной камере.

В результате исследования был определен исходный титр антител сыворотки, полученной при иммунизации животных комплексными антигенами В. ЬгопсМверйса составил 1:8 (рис. 2).

Рис. 2. Титр антител иммунной сыворотки. Лунки: I - раствор антигенов В. ЬгопсШзгрйса 22067\ 2-7 - последовательные двукратные разведения иммунной сыворотки, начиная с разведения 1:2

Двойная радиальная иммунодиффузия антигенов В. ЬгопсМэерИса по методу О. ОисШеНопу (1948)

Для двойной радиальной иммунодиффузии был использован 2% агарозный гель на трнс-боратном буфере (рН-8,3). Гель такой концентрации обладает достаточно хорошей разрешающей способностью для качественного выявления образующихся преципитатов. Результаты представлены на рисунке

3.

Рис. 3. Двойная радиальная иммунодиффузия по О. ОисМег1опу. Лунки: 1- В. ЬгопскЫерйса 36; 2- В. ЪгопсЫзгрйса 37; 3- В. ЬготЫэерйса 45; 4- В. ЪгопсЫ.черИса 48; 5- В. ЪгопсЫ$ерйса 59; 6-9 - иммунная сыворотка

В результате проведенных экспериментов мы определили количество образуемых преципитатов в ходе реакции двойной радиальной иммунодиффузии по О. Оис1«ег1опу (1948) с комплексными антигенами В. ЬгопсЫзерйса и преципитирующей иммунной кроличьей сыворотки. Было получено 5 линий преципитации с комплексными антигенами различных штаммов В.

bronchiseptica; также обнаружено 3 линии преципитации с комплексными антигенами В. parapertussis, т.е. лишь 2 антигена В. bronchiseptica, выявляемых при использовании данного иммунохимического метода, являются видоспецифичными.

Встречный электрофорез по методу G. Bedarida et at (1969)

Электрофорез проводился в трис-боратном буфере (рН-8,3). В качестве поддерживающей среды в данной работе был использован 1,5% агарозный гель. В геле были вырезаны 2 ряда лунок: верхний - для антигена, нижний - для иммунной сыворотки. Ряды лунок располагались на расстоянии 1 см друг от друга. В первый ряд лунок были внесены антигены (дезинтегрированные суспензии клеток В. bronchiseptica), во второй ряд, расположенный под первым -иммунная сыворотка, полученная при гипериммунизации кроликов. Затем проводился электрофорез с режимом 25 В/см, 100 шА, в течение 20 минут. После этого гель вынимали из электрофоретической камеры, промывали в 0,9% NaCl в течение 30 минут для отмывки несвязавшихся антигенов и антител. После этого наблюдали преципитаты в проходящем свете (рис. 4). При слабых преципитатах пластину геля оставляли в растворе 0,9%NaCl на 24-48 часов.

Рис. 4. Встречный электрофорез. Лунки: 1- В. bronchiseptica 1; 2- В. bronchiseptica 7; 3-Я bronchiseptica 214; 4— В. bronchiseptica 59; 5 —В. bronchiseptica 22067; 6-В. parapertussis 119; 7-P. aeruginosa; 8-A. hydrophila', 9- E. coir, 10- Y. enterocolytica; 11- Y. pseudotuberculosis', 12-5. aureus', 13-24 — иммунная сыворотка В результате использования метода встречного электрофореза по G. Bedarida et al. (1969) были получены четкие преципитаты, образованные с антигенами дезинтегрированных культур Bordetella bronchiseptica, а также с антигенами В. parapertussis. С антигенами культур грамотрицательных (Р. aeruginosa, A. hydrophila, Е. coli, Y. enterocolytica, Y. pseudotuberculosis} и грамположительных (S. aureus) бактерий преципитации не наблюдалось. Таким образом, было показано, что данный метод с применением иммунной сыворотки к комплексным антигенам В. bronchiseptica не позволяет провести видовую идентификацию антигенов возбудителя бордетеллеза.

Иммуноэлектрофорез по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X Фримель (1979)

Сначала был проведен собственно электрофорез антигенов в агарозном геле в течение 30 минут. Толщина геля составляла 3-4 мм. Затем в канавку, параллельную миграции антигенов, была помещена гипериммунная сыворотка. Для равномерной диффузии пластина с гелем находилась во влажной камере в течение 24-48 часов. После этого линии преципитации наблюдали в боковом освещении на темном фоне (рис. 5). Гели документировали и проводили анализ.

В результате данного эксперимента было идентифицировано 8 антигенов В. bronchiseptica, полученных с помощью ультразвуковой дезшггеграции бактериальной массы. Стоит заметить, что антигены различных штаммов возбудителя имели значительное сходство, что подтверждается количеством и расположением линий преципитации. В опытах с комплексными антигенами В. parapertussis было определено 3 идентичных линии преципитации, что подтверждает наличие общих антигенов с В. bronchiseptica.

В рамках решения задачи сравнения иммунохимических методов при анализе антигенного состава возбудителя бордегеллеза были проведены эксперименты иммуноэлектрофореза комплексных антигенов гра.мотрицательных и грамположительных бактерий с гипериммунной сывороткой.

Антигены культур грамотринательных (P. aeruginosa, Р. pulida, Е. coli, О. rhinotracheale, У. enterocolytica, Y. pseudotuberculosis) и грамположительных (S. pyogenes, S. epidermidis, L. acidophilus, B. subtilis) бактерий были получены путем ультразвуковой дезинтеграции с режимом, описанном в разделе «Получение гипериммунной сыворотки». Электрофорез антигенов всех культур вышеуказанных бактерий и последующую иммунодиффузию проводили по методике, описанной в данном разделе.

В результате данных исследований было определено, что иммунная сыворотка к антигенам В. bronchiseptica образует с комплексными антигенами гра-мотрицательных бактерий 3 линии преципитации, тогда как при иммуноэлек-трофорезе с антигенами В. bronchiseptica было образовано 8 четких линий преципитации. Также следует отметить, что титр иммунной сыворотки, использованной для иммуноэлектрофореза, составил 1:8, что доказывает высокую чувствительность этого метода при анализе антигенной структуры В. bronchiseptica.

Таким образом, мы провели сравнительный анализ трех иммунохимических метода для выбора оптимальной схемы при изучения антигенного состава В. bronchiseptica. Мы установили, что иммунохимические методы являются достаточно эффективными и позволяют в короткие сроки провести анализ антигенного состава В. bronchiseptica.

Рис. 5. Иммуноэлектрофореграмма. Лунки: 1-Я bronchiseptica 169; 2-Я bronchiseptica 101; 3-Я bronchiseptica 71

Использование двойной радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony (1948) позволяет обнаружить 5 антигенов В. bronchiseptica, однако 3 идентичных линии преципитации были образованы и с антигенами В. papa-pertussis, т.е. только 2 выявляемых в этой реакции антигена являются видоспеци-фичными для возбудителя бордетеллеза.

Использование встречного электрофореза по методу G. Bedarida et al. (1969) с применением полученной ранее кроличьей иммунной сыворотки не позволяет провести видовую идентификацию антигенов В. bronchiseptica.

В опытах иммуноэлектрофореза мы обнаружили 8 антигенных комплекса инфекционного агента, взаимодействующих с кроличьей иммунной сывороткой, причем 3 идентичных линии преципитации были образованны и с антигенами других грамотрицательных бактерий (P. aeruginosa, P. putida, Е. coli, О. rhinotrache ale, У. enterocolytica, Y. pseudotuberculosis), т.е. 5 линий преципитации являются видоспецифичными для В. bronchiseptica.

В результате сравнительного анализа трех иммунохимических метода (двойной радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony (1948), встречного электрофореза по методу G. Bedarida et al. (1969) и иммуноэлектрофореза по методу P. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979)) мы показали, что наиболее эффективным является иммуноэлектрофорез. При использовании преципитирующей кроличьей сыворотки, полученной при иммунизации комплексными антигенами В. bronchiseptica, метод иммуноэлектрофореза позволяет выявить 8 антигенов, 3 из которых являются общими для

бактерий других видов, а 5 - являются видоспецифичными для возбудителя бордетеллеза.

Предлагаемая нами схема анализа антигенной структуры В. bronchiseptica включает: 1) получение антигенов с помощью ультразвука с режимом дезинтеграции - частота 23 кГц, амплитуда колебаний 5 микрон, в течение 1 минугы на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом; 2) гипериммунизацию лабораторных животных для получения иммунных сывороток по схеме, отображенной в табл. 1; 3) реакцию иммуноэлектро-фореза по метод}' Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель ( 1979).

Помимо иммунохимических методов анализа антигенного состава В. bronchiseptica существуют молекулярно-генетические методы, позволяющие выявлять специфические фрагменты ДНК инфекционных агентов. Наиболее широко в настоящее время используется полимеразная цепная реакция.

Разработка методики молекулярно-генетической идентификации Bordetella bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции

Идентификация участков генов Bf г А и BfrZ генома Bordetella bronchiseptica

В библиотеке баз данных GeneBank (США), EMBL (Европейская молеку-лярно-биологическая библиотека), DDBJ (Японская база данных нуклеотидных последовательностей) были найдены два уникальных гена BfrA и BfrZ системы ТопВ-комплекса наружных мембранных протеинов-рецепторов железа В. bronchiseptica. Затем выбранные мишени-гены были проверены системой BLAST на предмет совпадения с ДНК известных микроорганизмов и оказалось, что аналогичных нуклеотидных последовательностей другие виды микроорганизмов не имеют. На наиболее консервативные участки выбранных мишеней, с использованием приложения Primer BLAST были положены праймеры, отвечающие общепринятым требованиям. В итоге праймеры, теоретическая специфичность и фрагменты амплифицируемых участков представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Характеристика праймеров

Анализируемый Праймеры 5'-3' Размер ам-

ген пликона

BfrA (f) CCTTCCAGCACCTGGCGGTACGAGTTGCTCC 528 п.о.

(r)CCCCGTGCCGGGGTGCCTGGACCTGGGCG

BfrZ (f) GGACGACCAGGATCACATCTTCC 298 п.о.

(r) GCTTTCCTGGTAGTTGGCGTAGG

Cytochrom-C-- ( f) GCATTGCTCCATCCTGTTGTGCG 168 п.о.

oxidase (r) GATGGGTTATCTGAGCGCGC

16S rRNA (f) CTACGGGGGAAAGCGGGGGA 711 п.о.

(r) GACCGTACTCCCCAGGCGGT

Проверка работоспособности и специфичности праймеров, а также оптимизация режима проведения ПЦР были проведены на 5 музейных штаммах

В. ЬгопсМчерИса и штамме В. рагарегЬшчэ, а также на 37 клинических образцах. Была определена универсальная программа амплификации (табл. 3) и концентрация праймеров - 10 рто! на реакцию объемом 25 мкл.

Таблица 3 - Программа для амплификации ДНК

№ цикла Шаг Температура Длительность Количество повторов

1 1 95'С 5 мин 1

2 X 95"С 10 сек

2 вО'С 20 сек 35

3 ITC 20 сек

3 1 ITC 2 мин 1

На рисунке 6 представлены окончательные результаты этих экспериментов.

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов амплификации участка генаВй-А. 1-16, 19-34- штаммы ß. bronchiseptica-, полученные из клинического материала; 17, 35 - отрицательный контроль;

18, 36 - маркер молекулярного веса

Идентификация участка гена Cytochrom-C-oxidase, общего для генома В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis, а также участка гена J6S rRNA, общего для рода Bordetella

Одним из наиболее важных моментов при бордетеллезной инфекции является невозможность быстрого выявления возбудителя микробиологическими методами. Сложность биохимической и серологической идентификации В. bronchiseptica подтолкнула нас к разработке систем праймеров, которые могли бы с высокой точностью идентифицировать бактерию, относящуюся к роду Bordetella. Мы разработали систему, которая выявляет специфичный для В. bronchiseptica, В. parapertussis и В. pertussis ген, кодирующий фермент цитохром-С-оксидазу (Cytochrom-C-oxidase). Так как В. parapertussis и В. pertussis вызывают заболевания у человека, то вероятность их обнаружения в биологическом материале, полученном от животных сводится к минимуму. Уникальность же гена Cytochrom-C-oxidase

по сравнению с известными последовательностями ДНК других видов микроорганизмов позволяет использовать его в качестве мишени при проведении мультиплексной ПЦР для индикации В. bronchiseptica. Также, была создана система праймеров, позволяющая идентифицировать общий для рода Bordetella ген, кодирующий 16S субъединицу бактериальных рибосом (16S rRNA). Его выявление при проведении ПЦР открывает перспективы индикации представителей рода Bordetella, а также, при возможных мутационных изменениях ранее исследованных генов BfrA и BfrZ, позволяет обнаружить соответствующие штаммы В. bronchiseptica в биологическом материале, полученном от животных.

Были определены праймеры, теоретическая специфичность и фрагменты амплифицируемых участков которых представлены ранее в таблице 2. Затем была проведена полимеразная цепная реакция (рис. 7).

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов амплификации участка гена 16S rRNA. 1-16,19-34-штаммыВ. bronchiseptica, полученные из клинического материала; 17, 35 - отрицательный контроль;

18, 36 - маркер молекулярного веса

Использование ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для индикации и количественного определения содержания ДНК В. bronchiseptica

Нами были проведены эксперименты с применением современной технологии - ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» (Real Time) с интеркалируютцим красителем SYBR Green I на термоциклере «ДТ-322» по программе амплификации (табл. 4), позволяющей одновременно совмещать амплификацию и детекцию (по каналу Fam/SYBR Green I: max поглощения-494 нм, max испускания-521 нм).

Таблица 4 - Программа для амплификации ДНК

j\s> цикла Шаг Температура Длительность Детекция Количество повторов

1 1 95'С 5 мин 1

2 1 95'С 10 сек

2 60'С 40 сек * 35

Технология ПЦР в «реальном времени» позволяет при наличии стандартных образцов определить концентрацию бактериальных клеток. В качестве стандартов ДНК были использованы 24-часовые культуры В. ЪгопсЫзерйса 22067 с определенным значением КОЕ/мл.

Результаты количественной ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Количественный ПЦР-анализ с системой праймеров к участку гена BfrZ

Номер лунки Идентификатор пробы et, Fam Cp, Hex Концентрация, копий ДНК/мл

Ai Стандарт 1 18,2 - 5,5*l(f

A3 Стандарт 2 21,9 1 5,5* 10?

AS Стандарт 3 28,4 - 5,5*10

Al Р.aeruginosa - - -

AS B.parapertussis 119 - - -

B1 E.coli - - -

ВЗ В. bronchiseptical 13,4 - l,4*l(f

В4 B.bronchiseptica 7 14,0 - 9,1*10'

В6 В. bronchiseptica 22067 20,9 - 9,1*10'

В7 В. bronchiseptica S344 17.8 7,4*10"

В8 B.bronchiseptica 10608 19,8 - 2,0*10"

D5 B.bronchiseptica 83449 12,2 - 6,8*ltf

D6 B. bronchiseptica 8344bj 28,7 - 2.3*10"

Использование мультиплексного формата ПЦР для идентификации В. bronchisepüca

Для многокомпонентного формата ПЦР было решено использовать 3 системы праймеров (к участкам генов BfrA, BfrZ и Cytochrom-C-oxidase) (рис. 8). Количество и соотношение праймеров были подобраны экспериментальным путем: по 10 pmol праймеров системы для участков генов BfrA и BfrZ и по 30 pinol для участка гена Cytochrom-C-oxidase. Также следует отметить, что была использована универсальная программа амплификации, представленная ранее в таблице 3.

В результате были подобраны условия проведения ПЦР в мультиплексном формате, что позволяет в одной пробирке идентифицировать наличие ДНК В. bronchisepüca по трем различным критериям: видовых генов (BfrA и BfrZ) а также наличие участка гена, являющегося общим для В.

bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis. Такая комбинация праймерных систем значительно повышает специфичность идентификационного тсста.

Рис. 8. Электрофореграмма мультиплексной ПЦР к участкам генов ВйА, ВЁй и Су1осЬгот-С-ох!ёа$е. 1-13 - штаммы В. ЬгопсЫяерИса, выделенные из клинического материала; 14-отрицательный контроль; 15- маркер молекулярного веса

Определение чувствите.1ьности ПЦР для идентификации Bordetella bronchiseptica с разработанными системами праймеров

При определении аналитической чувствительности нами были приготовлены последовательные 10-ти кратные разведения из исходной бактериальной взвеси В. bronchiseptica, содержащей 5,5* 109 клеток/мл. Исходная концентрация была определена по стандарту мутности и подсчету КОЕ.

Результаты определения чувствительности представлены на рисунке 9. Были определены пределы чувствительности для всех систем праймеров, использованных в данной работе: для участка гена В fr А генома В. bronchiseptica - 5,5*103 бактериальных клеток/мл; для участка гена BfrZ генома В. bronchiseptica - 5,5хЮ3 бактериальных клеток/мл; для участка гена 16S rRNA генома Bordetella spp. - 5,5*102 бактериальных клеток/мл; для участка гена Cytochrom-C-oxidase генома Bordetella complex

(bronchiseptica+pertussis^parapertussis)- 5,5* 103 бактериальных клегок/мл.

При выполнении данной работы были использованы как штаммы В. bronchiseptica, так и штаммы других бактерий. Была оценена надежность метода ПЦР по сравнению с классическим микробиологическим методом -«золотым стандартом». Один штамм В. bronchiseptica, идентифицированный микробиологическим методом (бактериологическим посевом), в ПЦР был отрицательным.

1 2 3 4 5 6 7 8 ;

- - - ■ - ; ; -

m -щ

Рис. 9. Электрофореграмма определения чувствительности ПЦР с праймерами к участку гена В 1хЪ (бактериальных клеток/мл): I- 5,5*106; 2— 5,5х105; 3- 5,5x104; 4-5,5хЮ3; 5- 5,5хЮ2; 6-5,5x10'; 7- 5,5x10°; 8-отридательный контроль; 9- маркер молекулярного веса

В соответствии с методом, рекомендованным А.Петри и К.Сэбин (2003) были построены таблицы данных качественных признаков: положительный тест «+» и отрицательный тест «-» (табл. 6).

Таблица 6 - Оценка чувствительности и специфичности ПЦР

В. bronchiseptica обнаружена (кол-во штаммов) В. bronchiseptica не обнаружена (кол-во штаммов)

ПЦР-иссяедование (участки генов BfrA. BfrZ, Cytochrom-C-oxidase и 16S rRNA) 37 13

Микробиологический метод 38 12

Оценка чувствительности: доля «+» штаммов, точно идентифицированных микробиологическим методом = 37/38 = 0,97 (= 97%). Оценка специфичности: доля «-» штаммов, точно идентифицированных микробиологическим методом = 12/13 = 0,92 (= 92%).

Таким образом, мы получили результаты ПЦР-исследования с высокой степенью чувствительности и специфичности.

Разработанные методические подходы с применением иммуноэлектрофореза по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979) позволяют проводить анализ антигенной структуры В. bronchiseptica, а использование полимеразной цепной реакции -идентификацию инфекционного агента в биологическом материале.

ВЫВОДЫ

1. Анализ антигенного состава В. bronchiseptica по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979) выявляет 8 линий преципитации, 3 из которых также обнаруживаются у грамотрицательных бактерий других

видов (P. aeruginosa, P. puiida, E. coli, О. rhinotracheale, Y. enterocolylica, Y. pseudotuberculosis), a 5 выявляются только у возбудителя бордетеллеза.

2. Использование праймерных систем: Prl-1 (5' ccttccagcacctggcggtacgagttgctcc 3') и Prl-2 (5' ccccgtgccggggtgcctggacctgggcg 3') для гена BfrA ДНК В. bronchiseptica, Pr3-1 (5'ggacgaccaggatcacatcttcc 3') и РгЗ-2 (5' gctttcctggtagttgg-cgtagg 3') для гена BfrZ ДНК В. bronchiseptica позволяет проводить индикацию возбудителя в биоматериале.

3. Доказана высокая специфичность ПЦР с указанными парами праймеров при идентификации В. bronchiseptica - во всех исследуемых штаммах В. bronchiseptica (5 референс-штаммов и 37, выделенных из клинического материала) обнаружено наличие специфических участков генов BfrA и BfrZ. Штаммы В. parapertussis и других грамотрнцателышх бактерий в реакциях ПЦР с этими системами праймеров дали отрицательный результат.

4. Показана возможность одновременного выявления 3-х участков генов: BfrA и BfrZ - специфичных для В. bronchiseptica и Cytochrom-C-oxidase -специфичного для В. bronchiseptica, В. pertussis, В. parapertussis. Определены соотношения этих праймерных систем в реакции -1:1:3 соответственно.

5. Определена чувствительность ПЦР-исследования с подобранными системами праймеров: для участка гена BfrA генома В. bronchiseptica -5,5х103 бактериальных клеток/мл; для участка гена BfrZ генома В. bronchiseptica - 5,5x10' бактериальных клеток/мл; для участка гена 16S rRNA генома Bordetella spp. - 5,5х102 бактериальных клеток/мл; для участка гена Cytochrom-C-oxidase генома Bordetella complex (В. bronchiseptica, В. pertussis, В. parapertussis) - 5,5x103 бактериальных клеток/мл.

6. Использование метода ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I позволило провести количественную оценку содержания ДНК В. bronchiseptica в биоматериале. В экспериментах данной работы они составили от 2,3><103 до 6,8* 108 копий ДНК/мл для участка гена BfrZ.

Практические предложения

1. Предложено использование иммуноэлеюгрофореза по методу P. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979) для изучения антигенного состава В. bronchiseptica. Предлагаемая нами схема анализа антигенной структуры В. bronchiseptica включает: а) получение антигенов с помощью ультразвука с режимом дезинтеграции - частота 23 кГц, амплитуда колебаний 5 микрон, в течение 1 минуты на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом, б) гипериммунизацию лабораторных животных для получения иммунных сывороток, в) реакцию иммуноэлектрофореза по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979). Этот метод позволяет выявить 8 антигенов, причем 3 из них являются общими для грамотрицательных бактерий других видов, а 5 являются видоспецифичными для возбудителя бордетеллеза.

2. Предложено использование полимеразной цепной реакции с подобранными

системами праймерами к фрагментам генов BfrA и BfrZ генома В. bronchiseptica с аналитической чувствительностью 5,5х103 бактериальных клеток/мл в качестве молекулярно-генетического метода индикации и идентификации возбудителя. ПЦР рекомендовано проводить согласно «Методическим рекомендациям для выявления Bordetella bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции».

3. Предложена методика проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I для количественного определения содержания ДНК В. bronchiseptica в биологическом материале.

4. Предложена методика проведения ПЦР в мультиплексном формате для одновремнного выявления 3 специфических фрагмента 'ДНК В. bronchiseptica, один из которых является общим для представителей рода Bordetella. Эта методика позволяет повысить специфичность метода при выявлении возбудителя.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Никульшина Ю.Б. Культивирование Bordetella bronchiseptica на различных селективных средах / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Д.А. Васильев, A.B. Мастиленко, Д.Н. Хлынов // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, 20-22 мая, 2008. -Ульяновск, 2008. - С. 57-59.

2. Васильев Д.А. К вопросу о бактериологической диагностике бордетеллеза / Д.А. Васильев, Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Никульшина, A.B. Мастиленко // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, 20-22 мая, 2008. -Ульяновск, 2008. - С. 92-94.

3. Сверкачова Д.Г. Создание транспортной и накопительной сред для Bordetella bronchiseptica / Д.Г. Сверкалова, A.B. Мастиленко, Д.Н Хлынов, Ю.Б. Никульшина, Д.А. Васильев // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, 20-22 мая, 2008. -Ульяновск, 2008. - С. 134-136.

4. Васильев Д.А. Разработка методики выявления специфического участка ДНК Bordetella bronchiseptica с помощью ПЦР в режиме «реального времени» / Д.А. Васильев, A.B. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Никульшина // Современный мир, природа и человек: Сборник научных трудов.-Томск, 2009.-С. 115-117.

5. Васильев Д.А. Разработка методики идентификации Bordetella bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» / Д.А. Васильев, A.B. Мастиленко, Ю.Б. Васильева, Д.Г. Сверкалова // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Материалы конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента. РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения, 3-4 декабря, 2009. - Покров, 2009. - С. 78-80.

6. Васильев Д.А. Использование количественной ПЦР для идентификации Bordetella bronchiseptica / Д.А. Васильев, A.B. Мастиленко, Ю.Б. Васильева, Д.Г. Сверкалова // Молекулярная диагностика - 2010: Сборник трудов VII Вссросиийской научно-практической конференции с международным участием, 24-26 ноября, 2010. - Москва, 2010. - С.68-70.

7. Васильев Д.А. Выделение и идентификация Bordetella bronchiseptica от животных / Д.А. Васильев, A.B. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Васильева // Естественные и технические науки. - 2010. - №5(49). - С. 233-235.

8. Васильев Д.А. Применение полимеразной цепной реакции при идентификации возбудителя бордетеллеза животных / Д.А Васильев, A.B. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Васильева // Естественные и технические науки. - 2010. - №5(49). - С. 230-232.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мастиленко, Андрей Владимирович

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологические свойства Bordetella bronchiseptica и характеристика заболевания.

1.1.1. Таксономия.

1.1.2. Эпизоотология.

1.1.3. Морфология и тинкториальные свойства.

1.1.4. Биохимические свойства

1.1.5. Геном.

1.1.6. Культивирование.

1.1.7. Антигенная характеристика

1.1.8. Патогенез

1.1.9. Инфекционный цикл

1.2. Лабораторные методы диагностики бордетеллеза

1.2.1. Иммунохимические методы

1.2.2. Молекулярно-генетические методы

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект, материалы и методы исследований.

2.1.1. Штаммы.

2.1.2. Питательные среды и реактивы.

2.1.3. Оборудование.

2.1.4. Животные.

2.1.5. Методы.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1. Сравнительный анализ иммунохимических методов для изучения антигенного состава В. bronchiseptica.

2.2.1.1. Получение антигенов В. bronchiseptica.

2.2.1.2. Получение гипериммунной сыворотки.

2.2.1.3. Определение титра гипериммунной сыворотки.

2.2.1.4. Двойная радиальная иммунодиффузия антигенов В. bronchiseptica по методу О. Ouchterlony (1948).

2.2.1.5. Встречный электрофорез по методу G. Bedarida et al. (1969).

2.2.1.6. Иммуноэлектрофорез антигенов В. bronchiseptica по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979).

2.2.2. Разработка методики молекулярно-генетической идентификации В. bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции.

2.2.2.1. Идентификация участков генов BfrA и BfrZ генома

В. bronchiseptica.

2.2.2.2. Идентификация участков генов Cytochrom-C-oxidase и 16S rRNA, специфичных для представителей рода Bordetella.

2.2.2.3. Использование ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для индикации и количественного определения содержания ДНК В. bronchiseptica в биологическом материале с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I.

2.2.2.4. Использование мультиплексного формата ПЦР для идентификации В. bronchiseptica.

2.2.2.5. Определение чувствительности ПЦР для идентификации В. bronchiseptica с разработанными системами праймеров.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка идентификации Bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов"

Актуальность темы

В настоящее время бордетеллез широко распространенное заболевание животных во многих странах мира. Проблему заболеваний, вызванных Bordetella bronchiseptica, стали рассматривать уже в начале XX века в странах Европы и США [29, 32, 87]. Однако в Российской Федерации до настоящего времени исследования в этой области не проводились.

Bordetella bronchiseptica является возбудителем хронических и, довольно часто, асимптоматических инфекций респираторного тракта (трахе-обронхита) животных. Возбудитель поражает животных всех возрастных групп, но наиболее тяжелые последствия развиваются у молодых особей. Тяжесть заболевания связана с присутствием у В. bronchiseptica факторов патогенности: адгезинов (филаментозного гемагглютинина, пертактина и фимбрий) и токсинов (дермонекротического, аденилатциклазы-гемолизина и липополисахарида) [89, 207].

Инфекционный агент долго сохраняется в окружающей среде, поэтому чаще всего его обнаруживают в местах скученности животных (питомники, фермы, частные хозяйства) [32]. Возможность трансмиссии возбудителя из природных эпизоотических очагов к животным, содержащимся в фермерских хозяйствах, и, как следствие, значительных экономических потерь в малом и среднем сельскохозяйственном бизнесе вследствие гибели или снижения продуктивности животных, обусловливают необходимость выявления В. bronchiseptica и проведение противоэпидемических мероприятий. В связи с этим актуальным является разработка методов индикации и идентификации В. bronchiseptica.

Цель работы

Разработка методических подходов индикации и идентификации Bordetella bronchiseptica, основанных на иммунохимических и молекулярно-генетических методах.

Задачи работы:

1. Провести сравнительный анализ иммунохимических методов изучения антигенного состава В. bronchiseptica с целью идентификации.

2. Адаптировать метод полимеразной цепной реакции для молекулярно-генетической идентификации В. bronchiseptica.

3. Подобрать праймеры для выявлнения специфических участков ДНК В. bronchiseptica, а также идентификации участка генома представителей рода Bordetella.

4. Определить специфичность полимеразной цепной реакции при индикации В. bronchiseptica.

5. Разработать схему мультиплексной ПЦР для одновременного обнаружения нескольких специфичных участков ДНК В. bronchiseptica.

6. Определить чувствительность ПЦР при-выявлении возбудителя бордетел-леза.

7. Разработать схему проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для количественной оценки содержания ДНК В. bronchiseptica.

Научная новизна

Впервые в Российской Федерации проведены nccneflOBàmiJi, связанные с возбудителем бордетеллезной инфекции у кошек и собак. Проведен сравнительный анализ антигенного состава В. bronchiseptica с гипериммунными сыворотками в реакциях радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony (1948), встречного электрофореза по методу G. Bedarida et al. (1969) и имму-ноэлектрофореза по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979) с гипериммунными сыворотками. Показана высокая чувствительность метода иммуноэлектрофореза для изучения антигенной структуры В. bronchiseptica при использовании иммунной сыворотки с низким титром. На примере использования разработанных систем праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ доказана высокая специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции при идентификации В. bronchiseptica. Подобраны и оптимизированы соотношения систем праймеров для одновременного выявления 3-х специфичных участков генома В. bronchiseptica в мультиплексном формате ПЦР. Предложена схема проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I для количественной оценки содержания ДНК В. bronchiseptica. Практическая значимость работы

Метод иммуноэлектрофореза при проведении антигенной идентификации В. bronchiseptica позволяет использовать его для контроля состава и специфичности антигенов при разработке и производстве биопрепаратов, а подобранные и оптимизированные системы праймеров - в производстве ПЦР-систем, основанных на амплификации специфических участков генома В. bronchiseptica для диагностики бордетеллеза.

Разработаны «Методические рекомендации по выявлению Bordetella bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции», утвержденные ректором УГСХА от 10 ноября 2010 г. и подтвержденные актом комиссионных испытаний, проведенных на базе ООО «Медицинский Центр «Академия» (г. Ульяновск). Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии и биотехнологии, а также при проведении практических занятий для студентов и аспирантов в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммуноэлектрофорез по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979) позволяет идентифицировать 8 антигенов В. bronchiseptica, причем 5 из них являются видоспецифичными.

2. При использовании праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ может быть проведена прямая идентификация В. bronchiseptica в биологическом материале.

3. Чувствительность метода ПЦР с праймерными системами к участкам генов BfrA, BfrZ и Cytochrom-C-oxidase генома В. bronchiseptica составляет 5,5x103, а участка гена 16S rRNA - 5,5x102 бактериальных клеток/мл.

4. Мультиплексный формат ПЦР с системами праймеров к участкам BfrA, BfrZ и Cytochrom-C-oxidase дает возможность одновременно идентифицировать 3 гена: BfrA и BfrZ - специфичных для В. bron-chiseptica, а также Cytochrom-C-oxidase - специфичного для В. bron-chiseptica, В. pertussis и В. parapertussis.

5. Применение метода ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I позволяет проводить количественную оценку содержания ДНК В. bronchiseptica в биологическом материале.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы и ъ Научно-исследовательском центре микробиологии и биотехнологии ФГОУ высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия». Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008; 2009), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010). Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 144 страницах, содержит 15 таблиц и 28 рисунков. Список использован

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мастиленко, Андрей Владимирович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В 1910 году В. bronchiseptica была признана патогенном, вызывающим заболевания респираторного тракта [207]. В последствии стали появляться публикации, касающиеся исследований токсинов, антигенной структуры и серологических характеристик В. bronchiseptica, а также публикации, касающиеся сравнительной характеристики В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis [67].

Фактически все теплокровные животные восприимчивы к инфицированию В. bronchiseptica. Есть сообщения об инфицировании большого количества домашних и диких животных, а также людей [87, 89, 207].

В зарубежной научной литературе появляется все больше сообщений о распространении бордетеллезной инфекции среди животных в Западной Европе, Нидерландах, Великобритании, США. Ученые этих стран внимательно следят за распространением инфекции, разрабатывают диагностикумы, методы лечения и специфической профилактики [89, 95, 130].

Следует отметить, что возбудитель бордетеллеза в нашей стране недостаточно изучен. Поэтому особого внимания заслуживает вопрос определения эффективных иммунохимических методов анализа антигенной структуры В. bronchiseptica, а также разработки своевременных, быстрых и точных методов выделения и идентификации инфекционного агента.

Большинство исследователей описывают эксперименты, касающиеся антигенных различий трех представителей рода Bordetella: В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica. Е.К. Andersen [25] и, позднее, G. Eldering et al. [65] описали конкретные видо- и родоспецифичные термолабильные и термостабильные антигены, выявляемые в реакциях агглютинации.

В исследованиях H. Billaudelle et al. [189], связанных с изолированием гистамин-чувствительного фактора (HSF) возбудителя бордетеллеза и определением его иммуногенности, было показано, что при проведении радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony выделенной фракции разрушенных с помощью ультразвука бактериальных клеток, было идентифицировано до 12 антигенных комплексов.

В реакциях агглютинации и преципитации были исследованы термолабильные токсины [72], капсульные агглютиногены [82], эндотоксины [194], гемагглютинин [81], гистамин-чувствительный фактор [154] и авторами были идентифицированы, по меньшей мере, 14 различных антигенов представителей рода Bordetella [67].

В исследованиях J. Munoz at al. [144, 145], показано, что в реакции двойной радиальной иммунодиффузии по Ouchterlony сыворотка, полученная при гипериммунизации цельными клетками бордетелл, образовывала четкие зоны преципитации с компонетами клеток, разрушенных с помощью химического лизиса. При этом наблюдалось образование до 3 линий преципитации.

В работах S.C. Redd et al. [101] описана технология проведения имму-ноблотинга с антигенами бордетелл. После разделения в ПААГ лизата трех штаммов В. pertussis авторами были получены сходные электрофореграммы белковых компонентов до 30 идентичных белковых компонентов.

R. Ross et al. в 1969 году исследовал антигенный состав В. pertussis, В. bronchiseptica и В. parapertussis с помощью методов диффузной преципитации в агаровом геле и иммуноэлектрофореза в барбитуратовом буфере. При сравнении результатов полученных оказалось, что как минимум три антигена являются общими [175].

N. Holby et al. [97] продемонстрировали в своих исследованиях с помощью количественных методов иммуноэлектрофореза перекрестные реакции между антигенами В. pertussis и 28 другими видами бактерий. Только два антигена В. pertussis из 44 выделенных давали перекрестную реакцию с представителями других видов, в основном грамотрицательными бактериями. Однако оказалось, что антигены В. parapertussis и В. bronchiseptica перекрестно реагируют с антигенами В. pertussis в широком диапазоне, и только 4 антигена являются видоспецифичными для этого возбудителя.

В своих экспериментах А.Р. MacLennan обнаружил, что липополисаха-рид, являющийся протективным антигеном, в реакциях микроагглютинации и радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony был идентичен таковым, выделенным из грамотрицательных бактерий кишечной группы [124].

Несогласованность данных различных авторов и отсутствие стандартных методик изучения антигенного состава В. bronchiseptica подтолкнуло нас к проведению исследований по определению наиболее эффективного имму-нохимического метода, позволяющего выявлять наибольшее количество специфичных для возбудителя антигенов.

Вследствие этого мы провели сравнительный анализ использования трех различных иммунохимических метода, отличающихся друг от друга технологическими приемами: двойной радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony (1948), встречного электрофореза, по G. Bedarida et al. (1969) и иммуноэлектрофореза по методу Р. Grabar и С. Williams, описанного X. Фри-мель (1979). Так, в результате экспериментов, было доказано, что наиболее эффективным является метод иммуноэлектрофореза по Р. Grabar и С. Williams, описанный X. Фримель (1979), позволяющий выявлять 5 видоспецифических антигена В. bronchiseptica.

Главная задача молекулярно-генетических методов исследований состоит в том, чтобы по возможности точно установить причины заболевания и механизмы его развития [11]. Появление этих методов позволило, прежде всего, проводить анализ наследственной информации (ДНК или РНК) инфекционных агентов.

Молекулярно-генетические методы позволяют осуществлять раннюю и более полную диагностику различных заболеваний, своевременно проводить дифференциальную диагностику и осуществлять контроль эффективности терапии [9].

Метод ПЦР, применительно к бордетеллам был впервые описан в 1990 году в исследованиях Е.М. Glare et al. Авторами были изучены тандемные повторы хромосомной ДНК В. pertussis в качестве исходной мишени при проведении ПЦР. Такой областью оказался участок ДНК длиной 1046 п.о., присутствующий в количестве 50-100/бактериальную хромосому, а продукт разработанной системы праймеров для ПНР - 153 п.о. [22].

Относительно выбора мишеней для амплификации участка генома необходимо отметить, что различные исследователи чаще всего используют консервативные участки генов, отвественных за экспрессию факторов пато-генности бордетелл. Так N.H. Birkebaek et al. [33], Е. Grimprel et al. [49], E. Reizenstein et al. [59] использовали в качестве мишени для ПЦР В. pertussis промоторную область коклюшного токсина; Z.M. Li. et al. [100], N. Schnitzler et al. [182] были использованы участки ДНК гена порина; Е. Douglas et al. [62] использовали консервативные области гена аденилатциклазы-гемолизина. Тест-системы, созданные на основе этих исследований оказались высокочувствительными (80-100%), хотя в некоторых случаях ДНК В. pertussis не удалось различить с ДНК В. parapertussis и В. bronchiseptica, имеющих высокую степень гомологии исходных мишеней [140].

Е. Reizensten et al. [60] по результатам своих исследований дали диагностическую оценку одновременного выявления и идентификации В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica. В качестве мишени ими был выбран консервативный регион промоторной области коклюшного токсина размером 239 п.о. Эта последовательность, по данным авторов, имеет мутации в геномах В. parapertussis и В. bronchiseptica, и видовая дифференцировка основана на последующем рестрикционном анализе полученных ампликонов. Порог чувствительности этой методики составил 0,1 пг ДНК (около 30 бактерий/реакцию).

Рядом ученых был применен несколько другой подход к видовой диф-ференцировке трех представителей рода Bordetella. В их исследованиях использованы две системы праймеров BSPP и ВВ, мишенью одной из которых служила последовательность гена флагеллина, отличающегося по нуклео-тидному составу у этих возбудителей, а другая система содержала праймеры к консервативному участку генома В. bronchiseptica. В результате амплифи-цированный продукт размером 237 п.о. был обнаружен только в пробах с ДНК В. bronchiseptica, а в пробах с экстрагированной ДНК В. pertussis обнаруживался продукт амплификации размером 195 п.о. Амплификат размером 164 п.о. был одновременно обнаружен в пробах, содержащих ДНК возбудителя паракоклюша и пробах с экстрагированной ДНК возбудителя бронхи-септикоза [96].

В 2004 году S.K. Poddar использовал интеркалирующий краситель SYBR Green I для детекции ДНК возбудителя бордетеллеза при проведении полимеразной цепной реакции с регистрацией в режиме «реального времени» на LightCycler. В его исследованиях был реализован уникальный подход детекции - сравнение флуоресценции по кривой плавления образованных в ходе реакции ампликонов. Экспериментатор указывал на высокую стабильность этого параметра во всех положительных пробах: Тш = 86 ± 0,5 °С. Параллельно автором была проведена подтверждающая детекция с помощью электрофореза в агарозном геле с применением бромистого этидия в качестве интеркалирующего красителя. В результате было обнаружено, что предел детекции в агарозном геле в 10 раз уступал методу кривых плавления в присутствии SYBR Green I [160].

Идея проведения мультиплексной ПЦР «в одной пробирке» была описана в работах Y. Xu, Q. Нои в 2010 году. Авторы применили технологию, основанную на одновременной идентификации двух регионов генома В. pertussis и В. parapertussis. В качестве мишеней были использованы промотер коклюшного токсина и вставочный элемент IS481 генома В. pertussis, а таюке вставочный элемент IS 1001 ДНК В. parapertussis. Данным методом были исследованы клинические образцы биоматериала и определена чувствительность реакции - 5 КОЕ/реакцию для возбудителя коклюша и 1 КОЕ/реакцию для паракоклюша. Коэффициент вариации результатов составил 7%, время исполнения исследования около 4 часов при одновремнном выявлении этих инфекционных агентов [198].

Голландскими учеными были усовершенствованы системы праймеров для обнаружения ДНК представителей рода Bordetella на основе вставочных элементов (IS). В ходе исследований различных штаммов представителей 4 видов бордетелл (В. pertussis, В. parapertussi, В. holmesii и В. bronchiseptica) было обнаружено, что IS481, общепринятые для обнаружения возбудителя i коклюша, также встречаются в составе геномной ДНК В. holmesii и В. bronchiseptica', IS 1001, применяемые для выявления ДНК возбудителя паракок-1 люша, также входит в состав ДНК некоторых штаммов В. bronchiseptica. Исследователи разработали новую систему праймеров для мишени IS 1002, которую предложено использовать для повышения специфичности тестов совместно с системами для IS481 и IS 1001 [18]. ' Исходя из этого, нами были сделаны выводы, что у исследователей разных стран, относительно возбудителя бордетеллеза нет стандартизированных праймерных систем, способных однозначно идентифицировать виды j внутри рода Bordetella, так как мобилен не только их генетический материал, но и различные варианты вставочных элементов, например IS481 или IS 1001. Разногласия связаны, прежде всего, с выбором участка генома возбудителя в качестве мишени, методики выделения нуклеиновой кислоты, а также методологии системы детекции амплифицированного фрагмента. Поэтому нашей задачей был подобр праймерных систем для специфической идентификации возбудителя бронхисептикоза, а также адаптация их для проведения мульти-. плексной ПЦР с одновременным выявлением фрагментов ДНК и фрагмента специфичного для представителей рода.

Важной особенностью наших исследований было то, что адаптированная ПЦР для выявления В. bronchiseptica по чувствительности не должна ус' тупать диагностическим системам, разработанным зарубежными исследователями для идентификации В. perussis и В. parapertussis.

Определив все этапы проведения полимеразной цепной реакции, методы и характеристики последующей детекции, на основании данных баз.нук-леотидных последовательностей были подобраны потенциальные гены- мишени (BfrA и BfrZ) для выявления В. bronchiseptica. Для них были определены праймеры и оптимизирован протокол исследования.

Проанализировав литературные данные, основанные на исследованиях генома рода Bordetella, видов В. pertussis и В. parapertussis, которые являются ответвлениями от В. bronchiseptica, мы поставили задачу разработать систему, основанную на полимеразной цепной реакции, которая могла бы выявить участок гена, общего для этих трех представителей рода. Таким общим геном, не встречающимся у других видов Bordetella, является ген, кодирующий фермент цитохром-С-оксидазу (Cytochrom-C-oxidase). Аналогично, был выбран общий для рода Bordetella ген. Нами была оптимизирована методика проведения полимеразной цепной реакции с системами праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ В. bronchiseptica, гену Cytochrom-C-oxidase трех представителей рода Bordetella (В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis) и общеродовому гену 16S rRNA для Bordetella spp.

После подбора и синтеза праймеров были подобраны условия и оптимизирован протокол проведения полимеразной реакции аналогично уже описанной технологии. Концентрация праймеров была подобрана опытным путем — она составила 10 pmol на реакционную смесь объемом 25 мкл.

Нами создана универсальная программа амплификации для проведения ПЦР-исследования с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Полученные данные свидетельствуют о высокой степени чувствительности полимеразной цепной реакции для выявления В. bronchiseptica по сравнению с другими методами, что позволяет рекомендовать ее в качестве точного диагностического метода исследования.

После оптимизации условий и режима проведения полимеразной цепной реакции с каждой из пар праймеров, были проведены эксперименты с применением современной технологии — ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени». Нами была предложена схема проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для количественной оценки содержания ДНК В. bronchiseptica. Определены абсолютные концентраций ДНК В. bronchiseptica на примере участка гена BfrZ с применением инте?ркали-рующего красителя SYBR Green I и стандартных образцов ДНК кулЕ»тур В. bronchiseptica с известными значениями КОЕ/мл. В экспериментах ^данной работы они составили от 2,3x103 до 6,8x108 копий ДНК/мл для участка гена BfrZ.

Основные требования современной лабораторной диагностики основываются на чувствительности и специфичности ПЦР-системы. Поэтому для повышения специфичности мы разработали мультиплексную ПЦР-систему, которая позволяет одновремнно выявлять несколько фрагментов ДНК В. bronchiseptica.

В результате данного эксперимента были подобраны условия проведения полимеразной цепной реакции в мультиплексном формате, что позволяет в одной пробирке идентифицировать наличие ДНК В. bronchiseptica по двум или трем различным критериям: видовых генов (BfrA и BfrZ) а также наличие участка гена, являющегося общим для В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis. Такая комбинация праймерных систем значительно повышает специфичность идентификационного теста.

Исходя из задач данной работы были подобраны праймеры к специфическим фрагментам ДНК В. bronchiseptica - Prl-1 (5' ccttccacacctggcggtacga-gttgctcc 3') и Prl-2 (5' ccccgtgccggggtgcctggacctgggcg 3') для гена BfrA, Pr3-1 (5'ggacgaccaggatcacatcttcc 3') и Pr3-2 (5'gctttcctggtagttggcgtagg 3') для гена BfrZ; также были определены праймеры, позволяющие выявлять специфические фрагменты ДНК представителей рода Bordetella - Рг2-1 (5' gcattgctccat-cctgttgtgcg 3') и Рг2-2 (5' gatgggttatctgagcgcgc 3') для гена Cytochrom-C-oxidase ДНК В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis, Pr 16mg-f (5' ctacgggggaaagcggggga 3') и Pr 16mg-r (5' gaccgtactccccaggcggt 3') для гена 16S рРНК Bordetella spp.

В исследованиях доказана высокая специфичность выявления В. bronchiseptica при проведении ПЦР с системами праймеров для фрагментов BfrA и BfrZ: из 42 штаммов В. bronchiseptica (5 референс-штаммов и 37, выделенных из клинического материала) 42 обнаружили наличие специфических участков генов BfrA и BfrZ. Штаммы В. parapertussis и других грамот-рицательных бактерий в реакциях ПЦР с этими системами праймеров дали отрицательный результат.

Опытным путем была подобрана совокупность систем праймеров и условия для одновремнного выявления 3 участков ДНК В. bronchiseptica в формате мультиплексной ПЦР: участка гена BfrA и участка гена BfrZ генома В. bronchiseptica, а также участка гена Cytochrom-C-oxidase, специфичного для В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis. Определены соотношения этих систем в реакции — 1:1:3 соответственно.

Для количественной оценки содержания ДНК В. bronchiseptica была определена схема проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени». Определены абсолютные концентрации ДНК В. bronchiseptica на примере участка гена BfrZ с применением интеркалирующего красителя SYBR Green I и стандартных образцов ДНК культур В. bronchiseptica с из5 вестными значениями КОЕ/мл. В экспериментах данной работы они состави

5 о ли от 2,3x10 до 6,8x10 геномов-эквивалентов/мл для участка гена BfrZ.

При статистических расчетах была определена чувствительность и специфичность метода ПЦР при идентификации В. bronchiseptica в сравнении с микробиологическим методом. Так чувствительность оказалась 97%, а специфичность 92%.

В результате проведенных экспериментов была доказана высокая эффективность метода полимеразной цепной реакции при идентификации В. bronchiseptica.

Разработанные методические подходы с применением иммуноэлектро-фореза по методу P. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979) позволяют проводить анализ антигенной структуры В. bronchiseptica, а использование полимеразной цепной реакции - идентификацию инфекционного агента в биологическом материале.