Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биопрепарата и бактериологической тест-системы для типирования Bordetella Bronchiseptica

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка биопрепарата и бактериологической тест-системы для типирования Bordetella Bronchiseptica"

005004784

Г

СВЕРКАЛОВ А ДАРЬЯ ГЕННАДЬЕВНА

РАЗРАБОТКА БИОПРЕПАРАТА И БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ВОКОЕТЕЫА ВЯОМаШЕРПСА

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология,

ЭПИЗООТОЛОГИЯ, МИКОЛОГИЯ С М ИХ ОТО К С И К' О Л ОПI с й и

иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой стеиени кандидата биологических наук

-8 ДЕК 2011

Ульяновск-2011

005004784

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовагельного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия».

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор ВАСИЛЬЕВ ДМИТРИЙ АРКАДЬЕВИЧ

кандидат ветеринарных наук, доцент ВАСИЛЬЕВА ЮЛИЯ БОРИСОВНА

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, СЕМЕНОВ АЛЕКСАНДР МИХАЙЛОВИЧ доктор ветеринарных наук, профессор РАХМАТУЛЛИН ЭМИЛЬ КАСЫМОВИЧ

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»

Защита диссертации состоится «2011 года в часов на заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 432063, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел. 8(8422) 44-30-58 факс 44-30-72, е-таП: kormlen@vandex.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия», а с авторефератом в сети интернет на официальном сайте Министерства образования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru и на сайте академии www.ugsha.ru

Автореферат разослан <«¿4» 2011 года

Ученый секретарь диссер- ,—/—> _ _ . . .

/_ «о. г—? Пыхтина Лидия Андреевна тационного совета ¿у '

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Bordetella bronchiseptica - инфекционный агент, вызывающий бордетеллез домашних животных.

Бордетеллез - высококонтагиозное, инфекционное заболевание мелких домашних животных, характеризующееся общим недомоганием, развитием острого воспалительного процесса слизистой оболочки респираторного, тракта, сухим, болезненным кашлем, рвотой, прогрессирующим исхуданием и гибелью животных СLapez, 1952; Pittman, 1984; Deeb et al, 1990; Dugal et al, 1991). Первые сообщения об ассоциации бордетеллеза с другими болезнями собак были сделаны в начале XX века, значительный процесс в понимании болезни наблюдается в последние десятилетия (Molina Gonzalez, 2006).

В нашей стране указанная болезнь не изучена, диагностируется как патология невыясненной этиологии, и методы лабораторной диагностики бордетеллеза домашних животных не разработаны.

Для разработки бактериологических схем и методов идентификации возбудителя возникает необходимость создания селективно-диагностической среды, тест-системы, конструирование антигенного биопрепарата для антигенного тонирования бактерий вида В. bronchiseptica. Создание системы бактериологической диагностики бордетеллеза, включающей комплекс бактериологических и антигенных тестов, позволит своевременно и качественно выявлять и идентифицировать микробный агент и, следовательно, эффективно назначать лечебно-профилактические мероприятия.

Работа является частью комплексных исследований кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (номер Государственной регистрации 0120.01157936).

Цель и задач» исследования. Цель - разработка антигенного биопрепарата и тест-системы для бактериологической идентификации бактерий вида В.bronchiseptica выделенных у домашних животных.

Исходя из цели исследования, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать биологические свойства характерные для В. bronchiseptica, и на основе полученных результатов предложить для решения поставленной цели микробиологические тесты.

2. Создать антигенный биопрепарат для типирования бактерий вида В.bronchiseptica по антигенному составу.

3. Сконструировать селективно-диагностическую среду для выделения и первоначального типирования бактерий В. bronchiseptica по культуральным и биохимическим свойствам.

4. Разработать схему выделения и идентификации указанной бактерии от домашних животных.

5. Разработать нормативно-техническую документацию:

- на схему выделения, дифференциации и идентификации В. bronchiseptica;

- на изготовление антигенного биопрепарата.

Научная новизна. Впервые создан биопрепарат для антигенного типирования микроорганизма В. bronchiseptica. Впервые разработана схема ь;лделения и

тест-система идентификации бактерий В. ЪгопсЬшрйса от домашних животных.

Практическая значимость работы. Изучены биологические свойства (ферментативная активность, восприимчивость к красителям, культуральные свойства, устойчивость к химическим и физическим свойствам), на основании которых предложены для ветеринарной практики микробиологические тесть; для типирования бактерий вида В. ЬгопсЫзерИса. Разработан биопрепарат для антигенного типирования и идентификации бактерии вида В. ЬгопсЫьерНса.

Созданы и апробированы селективно-диагностическая среда УГСХА ВВП 57 и оптимальная схема выделения бактерий вида В. ЬгопскгзерНса, позволяющие выделить и идентифицировать данные бактерии из клинического материала.

Материалы диссертации включены в разработанную и утверждённую научно-техническую документацию:

- «Методические рекомендации по выделению и идентификации В.ЬгопсЫзерйса»(Ульяновск, 2011);

- «Методические рекомендации по изготовлению биопрепарата для идентификации В. ЬгопсЫяерИса» (Ульяновск, 2011);

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по дисциплинам "Биотехнология", "Частная микробиология", "Болезни мелких домашних животных", для студентов факультета ветеринарной медицины, биотехнологического факультета Ульяновской ГСХА, а также при выполнении тем научно-исследовательских работ на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологические свойства В. ЪгопсЫзгрйса: ферментативная активность, восприимчивость к красителям, культуральные свойства, устойчивость к химическим и физическим воздействиям, положены в основу микробиологических тест для типирования бактерий вида В. ЬгопсЬ'шрйса.

2. Разработанный биопрепарат, позволяет типировать по комплексному антигенному составу бактерии вида В. ЬгопсЫхерИса,

3. Селективно-диагностическая среда УГСХА ВВЯ 57, предназначенная для выделения и первоначального типирования бактерий вида В.ЬгопсКиерИса по культуральньш и биохимическим свойствам.

4. Оптимальная схема выделения бактерий вида В. ЬгопсМ.мрИса от животных, позволяющая выделить и типировать бактерии данного вида за 120 часов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и опубликованы на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2003); на научно-практической конференции молодых ученых Приволжского федерального округа «Роль молодых ученых в реализации национ&аьного проекта «Развитие АПК» (Саратов, 2007); на Международной научно-практической конференции «Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Москва, 2007), Международной научно-практической конференции по-

священной пятидесятилетию ФГУ ВНИИЗЖ «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Владимир, 2008г); на Международной научно-практической конференции «Акту альные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008); конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-коррсспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения «Актуальные проблемы инфекционной патологам ветеринарной медицины (Покров, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная дкапюстика-2010». (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, 3 из которых - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 176 страницах печатного текста, содержит 12 таблиц, 77 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и практических предложений. Список использованной литературы включает 247 источников из них 233 иностранных. В приложениях представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» в период с 2006 по 2010 год.

Материалы. Коллекции штаммов музея кафедры МВЭиВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА»: B.bronchiseptica №8344, B.kronchiseptica Nsl, B.bronchiseptica №7, B.bronchiseptica Л's 214, B.bronchiseptica Na22-067, Aeromo-nas hydrophila, Pseudomonas putida ATCC 12633, Pseudomonas putida № 901, Pseudomonas aeruginosa 128, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Slaphylococ-eus aureus ATCC 25923, Yersinia pseudiuberculosis ВИЭВ-3, Escherichia coli 4, Escherichia coli ATCC 25922, Brucella canis 82.

Животные - кролики породы "Шиншилла", 15 голов.

Для оценки культуральных свойств бордетелл на различных средах использовали бульон СПБ (Махачкала), мясо-пептонный (Оболенск) и триптиказ-но-соевый {Merck) бульон, мясо-пептонный агар (Оболенск), агар СПА (Махачкала), ГРМ - агар (Оболенск), бордетелагар (Оболенск), бордетелагар (Hi Media), казеиново-угольный агар (Оболенск), среда Эндо-ГРМ (Оболенск), среда для иерсиний и псевдотуберкулеза (ИПС) ВФС 42-2948-97 (Оболенск), ста-филококкагар (Оболенск), менингококкагар (Оболенск), агар Симмонса ВФС 42-3344-99 (Оболенск), энтерококкагар (Оболенск), среда Сабуро (Углич), среда Пизу (Оболенск), дифтерийная среда (Оболенск), триптиказно-соевый агар . (Merck), и ВАСТО PPLO агар (Diffco).

Для ускоренного определения биохимических свойств B.bronchiseptica использовали тестовые диски фирмы HiMedia, набор для ускоренного определения биохимических свойств НИИЭМ им Пастера, Возможность ферментации

Сахаров и многоатомных спиртов определяли с помощью сред Гисса с лактозой, глюкозой, мальтозой, сахарозой, маннитом, дульцитоа, сорбитом.

Способность бордетелл утилизировать аминокислоту с образованием сероводорода устанавливали с помощью среды Пизу.

Стандарт мутности ОСО 42-28-86-08 П (5 ME),

Методы. Морфологические свойства оценивали в фиксированных мазках, окрашенных по Грамму и по Ольту (A.C. Лабинская,, 1978).

Электронную микроскопию проводили методом негативного контрастирования 1,5% фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК). Просматривали препараты на электронном микроскопе HV-12A (фирмы Hitachi) при ускоряющем напряжении 75 кВ и увеличении З5*103. Фиксировали культуру 2%-ным раствором 0s04.

Изучение биохимических свойств. Определение чувствительности культур B.bronchiseptica к химиотерапевтическим препаратам при подборе селективного компонента к среде проводили диско-диффузионным методом и методом серийных разведений согласно МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам".

Для изучения антигенного состава бордетеллезного антигена использовали реакцию иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони (Остерман, 1981).

Содержание белка в антигене определяли методом с пирогаллол-красным, предложенным Fujita Y. (1983 г) в модификации Watanade N. с соавторами.

Оценку роста бактерий вида B.bronchiseptica на питательных средах и оценку качества разработанной селективно-диагностической среды УГСХА BBR 57 проводили в соответствии с требованиями с МУК 4.2.2316-08.

Статистическую обработку результатов исследований проводили в программе SPSS Statistics 17 общепринятыми методами (Ашмарин, 1962; Гланц, 1999) применяли точные критерии Фишера.

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Изучение биологических свойств бордетелл

Проведённая электронная микроскопия подтвердила, что бордетеллы имеют коккобацилярную форму, спор и капсул не образуют, имеются жгутики. Подвижность бордетелл определяли методом "Висячей капли" и посевом "уколом" в 0,7% агар. Все исследуемые культуры бордетелл - подвижны. В мазке, окрашенном по Граму, бактерии грамотрицательны. располагались бордетеллы одиночно, парами, редко короткими цепочками. Оптимальная температура для роста бордетелл составила 35-37°С. Гемолиз бордетелл определяли двумя методами. Каждую исследуемую культуру высевали "штрихом" на поверхность 10% кровяного агара из дефибринированной крови человека, термостатировали при 37°С. Через 24 часа наблюдали рост культур, а гемолиз ярко проявлялся только через 48 часов инкубации. Второй метод, разработанный нами, более быстрый и экономичный и заключается в том, что гемолитическую активность штаммов наблюдали в поле зрения микроскопа в течение 20 - 30 минут. Для микроскопии готовили препарат следующим образом. Готовилось разведение крови или эритроцитарной массы в стерильном физиологическом растворе, с таким расче-

том, чтобы полученный раствор содержал в 1 мл не более 2*104 эритроцитов. Эритроцитарную взвесь в физиологическом растворе наносили пипеткой на предварительно обезжиренное чистое покровное стекло, затем, бактериологической петлей вносили 1-2 суточную агаровую культуру одного из штаммов В.Ьгопс1терИса ^в каплю физиологического раствора с эритроцитами.

Далее готовили препарат по типу "висячая капля", используя предметное стекло с лункой. Наблюдали под увеличением х 100x5 5, в течение 20-30 .минут адсорбцию клеток бордетелл на поверхности эритроцитов и обесцвечивание последних, что свидетельствует о гемолизе. Гемолиз, установленный вторым методом проявлялся у тех же штаммов, у которых наблюдали картину гемолиза стандартным методом на кровяном агаре.

В целях определения возможности роста бордетелл при различных показателях рН среды проводили посев референс-штаммов на среды с диапазоном рН от 1 до 10.

Культуры В. Ъгопс)терйса хорошо культивировалась на питательных и диагностических средах, таких, как мясопелтонный бульон и агар, ГРМ - агар, среде Пизу, ацетатный агар, менингококкагаре, казеиново-угольный агар, среда для иерсиний и псевдотуберкулеза, кровяной агар, бордетелл - агар, Эндо, среда Сабуро, дифтерийной среде. Данные по изучению культивирования В.ЪгопсЬкарИса на 18 агаровых средах представленные в таблице 1, свидетельствуют, что В.ЬгопсЫзерИса хорошо растет на всех предложенных средах, кроме стафилококкагара. Наши исследования показали, что бордетеллы не ферментируют углеводы: сахарозу, лактозу, мальтозу; многоатомные спирты дульцит, сорбит, манит, что согласуется с данными литературы.

Нами установлено, что в реакции с глюкозой в некоторых случаях образуется небольшое количество кислоты (референс-штамм В.ЬгопсЫхерНса 22-067). Бактерии В.ЪгопсЫхерИса (референс-штаммы штаммы № 1, 7, 214, 22-067, 8344) растут в диапазоне рН среды от четырех до восьми с оптимумом роста в пределах рН 5 - 8. Рост всех исследуемых штаммов бордетелл отсутствовал при рН от 1 до 3-х и при рН от 9 и выше.

Анализ полученных результатов показал, что бордетеллы хорошо растут на обычных и селективных средах, но лучше на средах, содержащих аминокислоты цистеин, метиониы, никотиновую кислоту, или дрожжевой экстракт.

2.2.2. Подбор селективного компонента для В.Ьгопс1шерйса.

Для определения чувствительности референс-штаммов В. Ьгопс/терИса к химиотерапевтическим препаратам использовали дисковый метод. Результаты наших исследований показали, чго бордетеллы высокочувствительны (зона задержки роста более 25 мм) к препаратам группы аминогликозидов - мономи-цину и колистину; к препарату группы хинолов - оксалиновой кислоте; к препаратам группы макролидов - азитромицину и рокситромицину; к препарату группы тетрациклинов - доксициклину; к препаратам группы левомицетина -левомицетину и хлорамфеникоду. Они чувствительны (зона задержки роста от 15 до 25 мм) к препаратам группы аминогликозидов - амикацину, неомицину, канамицину, гентамицину, сизомицину; к препарату группы шпрофуранов -фурадонину; к препаратам группы цефалоспоринов - цефоперазону; к препара-

ту группы фторхинолов - ципрофлоксацину; к препаратам группы тетрациклина - тетрациклину. Малочувствительны (зона задержки роста 11-15 мм) к препарату группы полипептидов - бацитрацину; к препарату группы цефалоспо-риноз - цефепину. Нами зарегистрирован высокий уровень устойчивости бор-детелл (зона задержки роста 10 мм) к препаратам группы пенициллина - бен-зилпенициллнну, ампициллину, карбенициллину. амоксиклаву; к препарату группы аминогликозидов - стрептомицину; к препарату группы гликопептидов - ванкомицину; к препаратам группы цефалоспоринов - цефазолину, цефтази-диму, цефотаксиму, цефалотину; к препаратам группы макролидов - эритромицину, олеандомицияу; к препаратам группы фузидинов - фузидину, фурадипа-ну; к противогрибковым препаратам - нистатину, клотримазолу, флукоиазолу, амфотернну В; к противотуберкулезному препарату - рифампицину; к препаратам группы линкомицина - линкомицину и клиндамицину. Следовательно, данные препараты могут быть использованы в качестве компонентов при разработке селективной среды.

Мы установили, что при формировании селективной среды, необходимо опираться на антибиотики цефалоспоринового ряда, действующие на грампо-ложительную и отрицательную флору и не оказывающим влияния на жизнеспособность бордетелл. Поэтому, следующим этапом в подборе селективного компонента было проведено количественного определения максимальной подавляющей концентрации цефазолина в среде для В. ЪгопсЫаерйса. Для чего использовали метод серийных разведений в бульоне (макрометод) руководствуясь МУК 4.2.1890-04. Результаты количественного определения максимальной подавляющей концентрации цефазолина в среде МПБ для В.ЬгопсЫверНса 214 представлены в таблице 2.

Из полученных данных, очевидно, что концентрации цефазолина натриевой соли в субстрате не должна превышать 0,004 г/дм3.

2.2.3. Определение предельных концентраций мочевины, хлорида бария, индикаторов и красителей в субстрате для В. Ьгопс1терйса с целью установления их возможного использования в качестве селективных

компонентов

При формировании селективной среды мы определяли предельную подавляющую концентрацию мочевины, хлорида бария, фенолового красного, бромтимолового синего, метилового оранжевого, метилового красного, фукси-нового кислого, водного голубого, бриллиантового зеленого, конго красного, мурексида, сафранина, генцианвиолета для бактерий вида В.ЬгопсЫхерИса методом серийных десятикратных разведений в бульоне. Результаты определения предельных концентраций перечисленных веществ в субстрате для В.ЬгопсЫьгрИса приведены в таблице 3.

Анализ полученных результатов показывает, что штаммы Р,.Ъгспс1терИса выдерживают высокие концентрации хлорида бария и мочевины, которые можно использовать в качестве селективных компонентов. Так на качество роста изучаемых штаммов бордетелл не влияют концентрации мочевины в субстрате в количестве 10 г/дм3 и хлорида бария - 10 г/дм3. Мочевина, как и хлорид бария полностью подавляет рост бордетелл в количестве 100 г/дм3 бульона.

Таблица 1 - Оценка культивирования В. bronchiseptica на различных средах

Агаровая среда рН среды B. bronchiseptica

Скорость jlocra. ч Диаметр колоний, см Характеристика роста колоний и изменение цвета сред

МПА 7,2 24-48 0,2-0,3 мелкие, блестящие, серые колонии

Кровяной агар 10% 7,2 24-48 0,2-0,4 мелкие россинчагые белые колонии, слабый /?-гемслиз заметен через 48 часов

ГРМ - агар 7,3±0,2 24-48 0,3-0,5 мелкие, блестящие, серые колонки

Триптиказо-соевый агар 7,2 24-48 0,2-0,3 гладкие, полупрозрачные, блестящие, серовато-белые колонии

ВАСТО PPLO агар 7,0 24-48 0,2-0,4 гладкие, полупрозрачные, блестящие, серовато-белые колонии

Бордетелагар 7,2±0,2 2448 0,2-0,4 выпуклые, с ровными краями, полупрозрачные, блестящие колонии

Дифтерийная среда 7,2 24-48 0:3-0,S выпуклые, с ровными краями, полупрозрачные, блестящие колонии

Пизу 7,7±0,2 24-48 0,2-0,3 слегка выпуклые, с розными краями, полупрозрачные, блестящие с темным центром, среда вокруг колоний - коричневая

Ацетатный агар 6,6±0,2 2448 0,2-0,3 выпуклые, с ровными краями, полупрозрачные, блестящие колонии

Эндо 7,4-t0,2 24-48 0,2-0,3 слегка выпуклые, с ровными краями, полупрозрачные, блестящие

Среда для иерсипий и псевдотуберкудеза 7,7*0,2 24-48 0,2-0,3 слегка выпуклые, с ровными краями, беловатые колонии, среда во всей чашке Петри меняет цвет с зеленого на синий, при открывании - запах аммиака

Сабуро 5,7±0,2 24-48 0,1-0.2 выпуклые, с ровными краями, полупрозрачные, блестящие колонии

Стафилококк агар 7,0 - 7,4 24-48 - роста нет

МПА с 0,03% цетри-мвдом 7,2 ±0,2 24-48 - роста нет

Менингококкагар 7,0x0,2 24-48 0,3-0,6 выпуклые, с ровными краями, полупрозрачные, блестящие колонии

Агар Симмонса 7,0 ¿0,2 24 48 0,1-0,2 выну кльк, с ровными краями, ржавые илн белые колони«, цвет среды меняется с зеленого на синий

КУА 7,2 - 7,3 48 0,2-0,4 выпуклые, с ровными краями, полупрозрачные, блестящие колонии

бордетелагар (Hi Media), 7,2±0,2 24-48 0,1-0,2 гладкие, полупрозрачные, блестящие, серовато-белые колонии

Таблица 2 - Количественного определения максимальной подавляющей

концентрации цефазолнна в среде МПБ для В ЬгопсЫхерНса 214

№ разведения грамм цефазолина / дм3 среды Суспензия В. ЪгопсЫзерИса 214, 106 КОН/мл Визуальный рост в МПБ Рост на МПБ после 48 ч инкубации

1 0,5 Бактериологическая петля 0 2 мм - отсутствует

2 0,25 Бактериологическая петля 0 2 мм - отсутствует

3 0,125 Бактериологическая петля 0 2 мм - отсутствует

4 0,063 Бактериологическая петля 0 2 мм - отсутствует

5 0,031 Бактериологическая петля 0 2 мм - отсутствует

6 0,017 Бактериологическая петля 0 2 мм - отсутствует

7 0,008 Бактериологическая петля 0 2 мм н- слабый рост в начале штриха

8 : 0,004 Бактериологическая петля 0 2 мм ++ обильный рост . по всему штриху

9 0,002 Бактериологическая петля 0 2 мм ++ обильный рост по всему штриху

10 0,001 Бактериологическая петля 0 2 мм ++ обильный рост повсемушт£иху_

контроль 0 - - отсутствует

контроль 0 Бактериологическая петля 0 2 мм ++ обильный рост по всему штриху

При изучении влияния на рост бактерий В.ЬгопсЫверйса предельных концентраций индикаторов и красителей установлено, что штаммы В.ЬгопсЫхерНса выдерживают высокие концентрации индикаторов и красителей, которые можно использовать в качестве селективных компонентов и индикаторов рН сред.

Так феноловый красный в количестве не более 1 г/дм3; бромтимоловый синий в количестве не более 10 г/дм3; метиловый оранжевый 0,1 г/дм3, фуксин кислый не более 0,1 г/дм3; водный голубой не более 10 г/дм3; бриллиантовый зеленый не более 0,1 г/'дм3; конго красный - 100 г/дм3; сафранина не более 0,1 г/дм3; генциан виолет не более 1 г/дм3; мурексид не более 10 г/дм3.

2.2.4. Конструирование селективно-диагностической среды В.ЬгопсМзерйса

В результате серии экспериментов по выбору наиболее оптимального состава селективно-диагностической среды, мы остановились на следующей прописи. В качестве питательной основы, был выбран пептон ферментативный в количестве 20,0 г/дм3; из аминокислот необходимых для роста борде-телл -- метионин в количестве 0,3 г/дм3 л цистеин 0,3 г/дм3; никотиновая кислота 0,1 г/дм3. Селективность среды обеспечивает присутствие цефазолина натриевой соли в количестве 0,004 г/дм3 и солей хлорида бария в количестве 0,4 г/дм3. Концентрация данных компонентов была подобрана опытным путем и описана выше. В качестве диагностического теста решили использовать неспособность бордетелл утилизировать сахара и многоатомные спирты, поэтому в состав среды были введены глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит, по 0,7 г/дм каждого компонента. Бактерии В. ЬгопсЫзерНса во время

роста защелачнвают субстрат вследствие чего, при добавлении соответствующих индикаторов, происходит изменение цвета среды с зеленого на синий и окрашивание вершины колоний бсрдетелл иа вторые сутки в темно-синий цвет, тогда как бактерии, ферментирующие указанные сахара и многоатомные спирты закисляют среду, вследствие чего происходит изменение цвета среды с зеленого на желтый. В качестве индикатора был выбран бром-тимоловый синий в количестве 0,2 г/дм3. Показатель рН среды определен 7,2 - оптимальный для роста бордетелл.

Таблица 3 - Предельные концентрации возможных селективных ____компонентов для В. bronchiseptica_______

Селективные вещества Действие концетраций веществ, г/т'

100 10 1,0 0,1

мочевина полностью подавляет не влияет не влияет не влияет

хлорид бария полностью нодавяяег не влияет не влияет не влияет

феноловый красный полностью подавляет полностью подавляет не влияет не влияет

бромтимоловый синий угнетает не влияет не влияет не влияет

метиловый оранжевый ушетает угнетает не влияет не влияет

метиловый красный полностью подавляет полностью подавляет угнетает не влияет

фуксин кислый полностью подавляет полностью подавляет угнетает не влияет

водный голубой угнетает не влияет не влияет не влияет

бриллиантовый зеленый полностью подавляет полностью подавляет угнетает не влияет

конго красный не влияет не влияет не влияет не влияет

сафранин полностью подавляй' полностью подавляет ушетает не влияет

генциан в полет полностью подавляет полностью подавляет не влияет не влияет

мурексид полностью подавляет не влияет не влияет не влияет

мочевина полностью подавляет не влияет не влияет не влияет

хлорид бария полностью подавляет угнетает не влияет не влияет

Приготовление среды: в дистиллированную воду добавляли все компоненты по предложенной нрописи, кроме цефазолина натриевой соли, так как она разрушаются при температуре 110-112°С в автоклаве. Компоненты растворяли и доводили на водяной бане до кипения. Доводили рН среды 0,1 N раствором КаОН до 7,2 Среду автоклавировали при темпера!уре 110-112°С 15 минут.

После автоклавирования вносили цефазолина натриевую соль, измеряли рН среды (он изменялся не значительно в кислую сторону на 0,05 ед) и разливали по чашкам Петри. Готовая среда зеленого цвета.

2.2.5. Определение продуктивности среды

Для определения продуктивности селективно-диагностической среды УГСХА ВВП 57 данная среда была приготовлена описанным выше способом.

Также были приготовлены согласно инструкции стандартные среды бордете-лагар (Оболенск) и мясопептонный агар (Оболенск). Результаты сравнения продуктивности использованных сред представлены в таблице 4.

В результате сравнительного изучения продуктивности среды УГСХА ВВЯ 57 и стандартных средах МПА (Оболенск), бордетелагар (Оболенск) при высеве на их поверхность 1 см3 взвеси бактерий референс-штаммов В.ЬгопсЫзерггса № 1, № 7, № 214, № 22-068 11*Ю3 составило в среднем соответственно 2,60* 109±2,7х 109,2,59* 109±4,79х Ю9, и 2,61 х 109±3,60х 109 КОЕ.

Таблица 4 - Сравнение продуктивности сред

Испытуемые среды Исследуемые штаммы

BBRM1 BBR №7 BBR № 14 BBR N° 22-067

Среда УГСХА BBR 57 ЧП №1 2,55x10" 2,55 xl0v 2,58x10' 2,67x10'

ЧП№2 2,60x10" 2,53x10' 2,67x10' 2,63x 10"

ЧП,Ч«3 2,64x10' 2.61x10' 2,53*10" 2,61x10'

Среднее по виду 2,60x10V ±2,60x10"' 2,56x10' ±2,40x10°" 2,59x10' ±4,10x10'" 2,64x10' ±l,76xl09*

Среднее по видам 1 2,60хЮ'±2,7хЮ'"

Бордетелагар (Оболенск) ЧП№1 2,57xl0'J 2,67x10' 2,62x10' 2,71x10"

ЧП №2 2,68x10' 2,59x10' 2,56*10' 2,55x10'

ЧП№3 2,59x10" 2,64xio'J 2,49x10' 2.68x10"

Среднее по виду 2,61x10' ±33,38xio9' 2,63x10' ±2,33x10'" 2,55x]0' ±3,76x10'* 2,65x10' ±4,91x10'*

Среднее по видам 2,61x10^.3,60x10''

Мясопептонный агар (Оболенск) ЧП №1 2,57x10' 2,51x10" 2,53x10' 2,58x10'

ЧП №2 2,64x10' 2,58x10' 2,68x10' 2,67'-¡0"

ЧП№3 2,55x10' 2,70x10' 2,57x10'' 2.45x10'

Среднее по виду 2,59x10' ±2,73 x] о'* 2,60*10' ±5,55x10''* 2,598x10' ±4,48xio'' 2,57x10' ±6,39x10'"

Среднее по видам 2.59x10'±4,79хЮ'"

примечаниеГ*5"- Р < 0,05

Скорость появления колоний штаммов В. bronchiseptica на всех сравниваемых средах показали идентичный результат - 24 часа, размер колоний до 0,1-0,3 мм. При длительном инкубировании на предложенной нами селективно-диагностической среде УГСХА BBR 57 (312 часов) при 37°С колонии В.bronchiseptica достигают в диаметре 2,3-3 мм, приобретают темно сине-зеленую окраску.

2.2.6. Эффективность экспериментальной селективно-диагностической среды УГСХА BBR 57

Для проверки эффективности на поверхность среды УГСХА BBR 57 "штрихом" по секторам были высеяны суточные культуры референс-штаммов B.bronchiseptica и суточные культуры часто встречающихся и возможных ассоциантов ротовой полости собак - S. aureus АТСС 25923, Y.pseudtuberculosis ВИЭВ-3, Е. coli 4, S. pneumoniae, S. bongori, P. putida АТСС 12633, P. aerugenosa 138. Среды инкубировались в термостате при 37°С в течении 3-х суток с ежедневным просмотром и учетом результатов. В

л

результате исследования было подтвержден ожидаемый результат - рост всех исследуемых штаммов B.bronchiseptic (№1, 7, 214, 22-067) на среде УГСХА BBR 57 с характерным видом колоний - синий цвет среды вокруг колонии и тёмносиний цвет колоний., и отсутствие роста культур P. putida АТСС 12633, P. putida 901, P. aeruginosa 128, S. aureus АТСС 25923, S. pneumoniae, E.coli 4, У pseudtuberculosis ВИЭВ-3. Исключением являлись бактерии A.hydrophila рост которых сопровождался изменением цвета среды с зеленого на желтый вследствие изменения рН среды в кислую сторону продуктами жизнедеятельности данных бактерии. 5. bongori может показать незначительный рост единичных колоний в начале штриха, цвет среды при этом также изменится с зеленого на желтый.

В результате наших исследований установлено, что среда УГСХА BBR 57 эффективна в качестве селективно-диагностической.

2.2.7. Разработка схемы выделения В. bronchisepiica

Исходя из полученных нами данных по изучению биологических свойств пяти референс-штаммов В. bronchisepiica, для типирования бактерий данного вида были выбраны следующие свойства - тесты:

• сроки появления россинчатых синих колоний на селективно-диагностической среде УГСХА BBR 57- через 24-48 часов;

■ • окраска по Граму - грамотрицательны;

• лигменгообразование - отсутствует;

« цитохромоксидаза - присутствует;

• ферментация углеводов и многоатомных спиртов (сахарозы, лактозы, глюкозы, маннита и мальтозы) - отсутствует;

• подвижность - подвижны;

• отношение к кислороду - строгий аэроб;

• уреазная активность - положительная;

• каталазкая активность - положительная;

• редукция нитратов - положительная;

• утилизация цитрата - положительная;

• желатиназа - отрицательная;

Нами установлено, что В.bronchisepiica нужно дифференцировать от бактерий рода Alcaligenes по уреазной активности. От бактерий рода Haemophilus - по ферментации углеводов (Haemophilus ферментирующие микроорганизмы), подвижности (Haemophilus неподвижны), по отношению к кислороду (.Haemophilus факультативные анаэробы). От бруцелл и в частности B.canis 82, В.bronchisepiica можно отличить по способности ферментировать глюкозу и подвижности. От энтеробактерий В.bronchisepiica отличает - наличие цитохромоксидазы, отсутствие способности ферментировать сахара и многоатомные спирты, отношение к кислороду.

Наглядно предлагаемая схема типирования, идентификации В.bronchisepiica от домашних животных представлена на рисунке 1.

2.2.8, Разработка методики выделения и отбора проб li.brопсЫзерйса от животных

Успех выделения любого микроорганизма зависит от того как, откуда и при каких условиях был взят материал для исследования, то есть от методики отбора проб. Перед нами бьша поставлена задача, разработать методику выделения и отбора проб В.ЬгопсМзерИса животных.

ÄR i

" ""Очраска rroJpaMyv

Окраска по Ольгу

Исследуемый материал

Селективная среда (УГСХА BSK 57! Инкубирование при П "С 48 часов

. -гид»-"

ш 1')

■ 4

Щ Ш

. , , , Реакцияаплюгеноцйи(«-)

(+) (+) (-) (+) Сч4 '

Рисунок i. Предлагаемая схема типирования и идентификации Bordetella bronchiseptica от животных (схема № 3}

Способ забора материала для исследования заключается в предварительной фиксации животного. Затем, используя зевник или шпатель для обеспечения доступа к задней стенке глотки, осуществляют непосредственный забор проб стерильным ватно-марлевым тампоном с тонзиллитной и околофаренгиальной областей или из нозальной впадины (как показал опыт, лучше проводить глубокий забор материала с тонзиллитной и околофаренгиальной областей). После того, как произведен забор материала, с задней стенки глотки, тампон осторожно вынимают из пасти, не касаясь языка и щек, и проворачивая тампон вокруг своей оси, круговыми движениями втирают материал вначале по периферии агаровой среды в виде 4-5 площадок, а затем Z-образным штрихом в центре чашки. Далее стерильным шпателем растирают центральные части посева.

В целях разработки методики выделения и отбора проб нами было сконструировано несколько схем для последующего сравнительного анализа. Методики варьировали в зависимости от места забора пробы у животных (носовая полость, глотка) и от среды, в которую помещали мазок. Одна из

схем включала нашу селективно-диагностическую сред)' для выделения и типирования В. ЪгопсУтерйса.

Схема № I. Материал из глотки клинически больных животных наносится на поверхность бордетелагара. Спустя 48 часов инкубации при 37С'С отбирается не менее 5 - б-ти характерных колоний в мясопептонный бульон и культивируется в течении 24 часов при ЪТ'С. Приготовление мазков и окрашивание по Граму и по Ольту. Посев на скошенный мясопептонный агар штрихом для наращивания бактериальной массы, используемой в дальнейшем для проведения биохимических тестов. Предполагаемое время типирования и идентификации В. Ьгопски;сраса.]44 часа.

Схема № 2. Материал из носовых впадин клинически больных животных вносится в МПБ. Спустя 24 часа инкубации при 37°С посев на бордете-лагар "штрихом", культивирование при 37°С 48 часов. Отбор не менее 5-6-ти характерных колоний в мясопептонный бульон и культивирование в течение 24 часов при 37°С. Приготовление мазков и окрашивание по Граму и по Ольту. Посев на скошенный мясопептонный агар штрихом для наращивания бактериальной массы, используемой в дальнейшем для проведения биохимических тестов. Общее время типирования и идентификации составляло 168 часов.

Схема № 3. Материал наносится на поверхность селективно-диагностической среды УГСХА ВВЯ 57. Спустя 48 часов инкубации при 37°С отбор не менее 3-х характерных колоний в мясопептонный бульон и культивирование в течении 24 часов при 37°С. Приготовление мазков и окрашивание по Граму и по Ольту. Посев на скошенный мясопептонный агар штрихом для наращивания бактериальной массы, используемой в дальнейшем для проведения биохимических тестов и постановки реакции агглютинации с разработанным биопрепаратом. Предполагаемое время типирования и идентификации 120 часов.

Опытная проверка и определение наиболее эффективной методики проводились в ходе мониторинга заболеваемости бордетеллезом собак и кошек в городе Ульяновске. Так было выделено и дифференцированно 43 штамма В. ЪгопсЫьер^са по схемам .N2 3 и № 1. По схеме № 2 выделено 34 культуры от тех же животных.

2.2.9. Разработка биопрепарата для антигенной идентификации В. Ьгопскксрйса

Получение четырех антигенных препаратов В.ЬгопсЫверйса для проведения гипериммунизации. Из бактериальной массы В.ЬгопсЬ/зерИса получили четыре вида антигенного препарата.

Первой группе кроликов (3 головы) вводили антигенный препарат, представляющий собой бактериальную массу культивированную 48 часов при 37°С трехкратно центрифугируют 15 минут при 3000 об/мин., для освобождения от питательной среды и ресуспендируют физиологическим раствором содержащим ингибитор бактерий - мертиолят в разведении 1:10000 (М-антиген), второй группе кроликов (3 головы) антигенный препарат, анало-

гично наработанный, инактивированный кипячением (Т-аитигеи), третьей группе кроликов (3 головы) - антиген, содержащий SDS в концентрации 0,25% (SDS - антиген), четвертой группе кроликов (3 головы) - дезинтеграт, полученный путем УЗ-разрушения, аналогично произведенной бактериальной суспензии B.bronchiseplica с аналогичным раствором мертиолята, при режиме дезинтеграции: 5 микрон - 1 минута - на 1 мл бактериальной взвеси. Пятую группу кроликов использовали для получения интактной сыворотки. Антигенные препараты стандартизировали по оптической плотности с помощью микропланшетного фотометра Anlhos Labtec Instruments (Австрия) приведя их к единым цифрам - 0,1 оптической плотности с длинной волны 0,620-0,650 нм.

Получение гипериммуниых сывороток на четыре антигена B.bronchiseptica. В опыте были задействованы 15 кроликов со средним весом 2,5 кг разбитых на пять групп г.о три кролика в группе. Для повышения иммунного ответа, первоначально внутримышечно, в область бедра вводили 0,5 см3 антигенного препарата с разными титрами антигенов с добавлением 0,5 см^ полного адьюванта Фрейда. Следующие введения делали внутримышечно, через каждые 3 дня по 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 и 1,5 мл антигенного препарата. Спустя 10,15, 20 дней после начала инъекций взяли кровь по 5 см3 от каждого кролика, приготовили сыворотку и ставили объемную реакцию агглютинации.

Результаты гипериммунизации представлены на рисунке 2 (А, Б, В).

Как показано на схемах, максимальная величина титра антител наблюдается в ответ на введение ультразвукового дезинтеграта и составляет к 10-му дню гипериммунизации 1:80. К 20 дню титр антител вырос до 1:320. данную схему гипериммунизации и иммунный препарат мы выбрали для получения гипериммунной сыворотки в предлагаемом наборе.

Получение антигена для биопрепарата. При получении УЗ-антигена были использованы различные режимы дезинтеграции. Оптимальным оказался режим: 5 микрон - 1 минута - на 1 мл бактериальной взвеси. Контроль антигена проводили с помощью световой микроскопии (контроль полного разрушения клеток) и количественным определением белка. Результат выбора оптимального режима дезинтеграции представлен в таблице 5.

При охлаждении дезинтеграта в ёмкости спирта со льдом. После выбора оптимального режима дезинтеграции микробных клеток, была получена бактериальная масса в количестве 50 мл дополнительно инактивированных мертиолята 1:10000. Количество белка после дезинтеграции составило 0,006 г/см?. Для стандартизации схемы иммунизации количество белка было доведено до 5,0 мг/см3 путем разведения исходного состава дезинтеграта стерильным физиологическим раствором (0,9 % NaCl). Антиген стандартизиро-вати также по оптической плотности, которая составила 0,1 единиц.

Максимальный титр ан-титател на 10 день

контроль

А. Образование агглютининов при гипериммунизации кроликов, изучаемыми препаратами на 10 день

Максимальный титр антител на 15 день гипериммунизации

Контроль

К. Образование агглютининов при шпериммунизации кроликов, изучаемыми препаратами на 15 день

320

Максимальный титр антител на 20 день ги-периммукизации

Контроль

В. Образование агглютининов при шпериммунизации кроликов, изучаемыми препаратами на 20 день

Рис. 2. Образование агглютининов при гипериммунизадии кроликов, изучаемыми препаратами

Для подтверждения оптимального выбора антигена с целью дальнейшего его использования нами для создания антигенного препарата были определено антигенных комплексов В ЬгопсЫзерИса во всех четырех антигенах методом РИД по Оухтерлонн. Реакцию проводили в двух модификациях: макропреципитация в агаровом геле в чашках Петри и микропреципитация в агаровом геле на предметных стеклах рис 3. Для четкого очерчивания полос

преципитации, препараты окрашивали по описанию Л.А. Остермана, кумас-си-синим (1981). Результаты реакции иммунодиффузии представлены в таблице б.

Таблица 5 - Опытные режимы дезинтеграции бактериальной взвеси

В. bronchiseptica

— Объем бакте- Режимы дезинтеграции Контроль дезинтеграции

риальной взвеси (мл) Амплитуда (микрон) Время (минут) Разрушение клеток Рост на МПА Содержание белка мг/мл

Г 1 1 1 Не полное Рост отсутствовал 6,6

1 2 1 Не полное Рост отсутствовал 6,6

1 3 1 Не полное Рост отсутствовал 6,6

1 4 1 Не полное Рост отсутствовал 6,5

1 5 1 Не полное Рост отсутствовал 6,4

1 6 1 Не полное Рост отсутствовал 6,3

1 7 1 Полное Рост отсутствовал 6,2

1 8 1 Полное Рост отсутствовал 6,0

1 9 1 Полное Рост отсутствовал 5,9

1 10 1 Полное Рост отсутствовал 5,6

Благодаря проведенным исследованиям доказали, что бордетеллы содержат максимально специфические антигены в УЗ-дезинтеграте, В силу высокой чувствительности и строгой специфичности, из исследуемых компонентов можно конструировать биопрепарат для антигенной идентификации выделенных бактерий. Наличие антигенных комплексов (детерминант) - 3 полосы преципитации приходятся на УЗ-антиген. Данный антигенный препарат мы выбрали для нашего диагностического антигенного набора.

Таблица б - Результаты реакции иммунодиффузии

Исследуемые сыворотки Исследуемые антигенные препараты |

Т М БОЗ УЗ

1 1 полоса преципитации 1 полоса преципитации 1 полоса преципитации 2 полосы прецп- ! питации

2 1 полоса преципитации 1 полоса преципитации I полоса преципитации 2 полосы преципитации

3 1 полоса преципитации 1 полоса преципитации 2 полосы преципитации 3 полосы преципитации

4 1 полоса преципитации 2 полосы преципитации 2 полосы преципитации 3 полосы преципитации

5 нет полос преципитации нет полос преципитации пет полос преципитации нет полос преципитации

Примечание: Т - антигенный препарат подвергшийся кипячению; М -антигенный препарат с добавленным мертиолятом; SDS - антигенный препарат содержащий SDS, УЗ -антигенный препарат - бактериальная суспензия, разрушенная на ультразвуковом дезинтеграторе. ] - сыворотка, полученная после гипериммунизации кроликов Т-антнгеном; 2 -сыворотка, полученная после гипериммунизации кроликов М-антитеном; 3 -сыворотка, полученная после гипериммунизации кроликов SDS-гнтигеном; 4 - сыворотка, полученная после гипериммунизации кроликов УЗ-антигеном. 5 - контрольная интакгная сыворотка.

- ЩЙУЗ' <И8у УЧ ЩШ |ЯУ ШШузШ

■ с ; ■

ШУЗНЖв ННГ , ' В щШ

Рис. 3 Реакция иммукодиффузии (РИД) по Оухтерлони мнкропрецииитация в ага-

ровом геле на предаетных стеклах УЗ - антигенный препарат, обработанный на ультразвуковом дезинтеграторе, С - сыворотка гиппериммунизированного животного па УЗ-

антиген

Постановка серологической реакции агглютинации (РА) для антигенной идентификации В. Ьгопскшрйса

Для постановки реакции пластинчатой агглютинации на поверхность хорошо обезжиренного предметного стекла пастеровской пипеткой нанесли две капли сыворотки и одну каплю физиологического раствора, Затем в каплю физиологического раствора и в одну из капель сыворотки внесли петлей каплю антигенного УЗ - препарата концентрацией 5,0 мг/см3 и тщательно растерли, чтобы эти две капли жидкости сделалась равномерно мутными. В капле, где соединены положительная сыворотка и антиген через 1-2 минуты отмечалась агглютинация в виде мелкозернистых пластинок и крупинок, с одновременным просветлением суспензии. Жидкость (физиологический раствор) в контроле антигена оставалась равномерно-мутной, значит у антигена нет самоагглютинации, а в контроле сыворотки - прозрачной. Из бактериальной колонии исследуемого штамма бактериальной петлей забрав часть бакмассы, вносили ее в первую свободную каплю, сыворотки и тщательно растирали. Если через 1-2 минуты отмечается реакция агглютинации (как в контроле), то бактериальная масса относится к бактериям вида В.ЬгопсМэгрИса. Для проверки разработанного нами биопрепарата исследовали выделенные полевые штаммы в реакции пластинчатой агглютинации. Все 43 выделенные нами штамма В.ЬгопсШерйса дали положительную реакцию.

В результате проведенных исследований доказано, что предлагаемый нами диагностикум по антигенной идентификации В.ЬгопсЬлзерГлса состоящий из УЗ антител и гипериммунной сыворотки, полученной по специально разработанной схеме, можно использовать для антигенной идентификации зыделенньсх В. ЪгопсЫьгрИса.

2.2.10. Мониторинг заболеваемости бордетеллезом собак и кошек в

городе Ульяновске и апробация схем выделения и селективно-диагностической среды для выделения и тииировяния В.ЪгопсЫяерйса

Следующим этапом нашей работы было проведение мониторинга заболеваемости бордетеллезом собак и кошек в городе Ульяновске.

В период с сентября 2009 по сентябрь 2010 на базе клиники УГСХА "Друг" все поступившие животные были исследованы на носительство В.ЬгопсЫзерггса.

У собак и кошек, поступающих в клинику, брали клинический материал по трем схемам, описанным в разделе 2.2.8.

Предполагаемые сроки выделения полностью подтвердились. Наиболее удобной, эффективной и сравнительно малозатратной оказалась схема выделения №3.

В результате проведенных исследований, от животных, поступивших в клинику "Друг", по предлагаемой схеме с использованием разработанной селективно-диагностической среды и РА было выделено 43 штамма В. ЪгопсЫзерИса (по схеме № 3) такое же количество штаммов было выделено по схеме № 1, но за более длительное время 144 часов. По схеме № 2 выделено 34 культуры от тех же животных за 168 часа.

ВЫВОДЫ

1. Изученные биологические свойства бактерий В.Ьгопс1и.черйса выделенных от больных собак в г. Ульяновске свидетельствуют о том, что это подвижные, овоидные, грамотрицательные палочки. Хороню культивируется на обычных питательных средах, и на селективных. Сахара не ферментирует, образует оксидазу, уреазу, фермент нитритредуктазу, продуцирует индол (реакция положительна с 48-ми часовой культурой), продуцирует сероводород, не разжижает желатин, утилизирует цитрата, ацетат натрия, не обладает ДНКазной активностью, треть штаммов обладает /^-гемолизом, четверть полученных штаммов обладают дермонекротическим токсином. Не нуждается в факторах роста V и X, Культивируется при температуре 35-37°С, диапазон роста в рН-3 - 8.

2. Предложен микрометод определения гемолитической активности бактерий, повышающий точность определения /? - гемолиза и заключающийся в приготовлении разведения свежей крови или эритроцитарной массы в стерильном физиологическом растворе, с таким расчетом, чтобы полученный раствор содержал в 1 мл не более 2x104 эритроцитов, нанесении пинеткой данной эритоцитарной взвеси на предварительно обезжиренное чистое покровное стекло, внесении бактериологической петлей 1-2 суточную агаровую культуру штаммов В.ЬгопсЫзерИса в каплю эритроцитарной взвеси, приготовлении препарата по типу «висячая капля» с дальнейшим просмотром под увеличением х 100x15 не менее 5-ти полей зрения в течение 20-30 минут и учета результатов. Положительным результатом на наличие гемолитической активности считать адгезию бактериальных клеток на поверхности эритроцитов и обесцвечивание последках в сравнении с контролем.

3. Сконструирована селективно-диагностическая среда для В.Ъгопскшрйса УГСХА ВВП 57, упрощающая выделение и идентификацию бактерий данного вида включающая: пептон ферментативный в количестве 20,0 г/дм3; метионин в количестве 0,3 г/дм3; и цистеин 0,3 г/дм3; никотиновая кислота ОД г/дм3; цефазолина натриевая соль в количестве 0,004 г/дм3; хло-

рид бария в количестве 0,4 г/дм3; глюкоза - 0,7 г/дм3; лактоза - 0,7 r/,HMJ; сахароза - 0,7 г/дм3; мальтоза - 0,7 г/дм3; маннит - 0,7 г/дм3; бромтимоловый синий в количестве 0,2 г/дм3, на которой к 48 часам вырастают только штаммы В. bronchiseptica с ожидаемым видом колоний (синие, цвета измененной среды, при длительным культивировании с темным центром), рост же культур других видов отсутствует или сопровождается окрашиванием среды в жел тый цвет.

4. Разработана схема выделения бактерий вида В. bronchiseptica состоящая в посеве материала на поверхность селективно-диагностической среды УГСХА BBR 57, оценки роста и изменения цвета среды и колоний спустя 48 часов инкубации при 37°С, отбора не менее 3-х характерных колоний в мясопептонный бульон и культивирование в течении 24 часов при 37°С. Приготовление мазков и окрашивание по Граму и по Ольту. Посев на скошенный мясопептонный агар штрихом для наращивания бактериальной массы, используемой в дальнейшем для проведения биохимических тестов на наличие ферментов оксидазы, каталазы, нитритредуктазы, определения способности утилизировать цитрат. Предполагаемое время выделения 120 часов.

5. Создан биопрепарат для антигенной идентификации B.bronchiscptica на основе УЗ-антигенного препарата и гипериммунной сыворотки необходимой для идентификации бактерий вида В.bronchiseptica методом пластинчатой реакции агглютинации.

6. Проведен мониторинг заболеваемости домашних животных в городе Ульяновске при помощи тест-системы лабораторной диагностики бордетел-лёза домашних животных включающей взятие глубоких мазков из глотки на селективно-диагностическую среду УГСХА BBR 57, выделение чистой культуры и оценку их культуральных, морфологических, тинктсриалышх, биохимических антигенных свойств. Доказано наличие циркуляции данной инфекции на территории г. Ульяновска и как следствие выделено и идентифицировано 43 штамма В. bronchiseptica.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомендуем для диагностики бордетеллеза домашних животных использовать разработанную нами лабораторную тест-систему, включающую бактериологическую схему выделения и диагностический набор, состоящий из УЗ-антигена и гипериммунной сыворотки, позволяющий в достаточно короткие сроки выявлять и типировать возбудителя В.bronchiseptica.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Сверкалова Д.Г. Бордетеллез кошек и собак / Сверкалова Д.Г. Степанова I.A. Василева Ю.Б. Казакова A.C. Никулина E.H. // Материалы Н-й Открытой Всероссийской конференции молодых ученых / Молодежь и наука XXI века. - Ульяновск, 2007. - Ч. 1. - С. 222-225.

2. Сверкалова Д.Г. Технология конструирования селективной среды для В. bronchiseptica / Сверкалова Д.Г., Никулышша ГО .Б., Хлынов Д.Н., Никулина E.H. // Материалы il-й Открытой Всероссийской конференции моло-

дых ученых / Молодежь и наука XXI века. - Ульяновск, 2007, - Ч. ]. - С. 222225.

3. Сверкалова Д.Г. Разработка методов индикации и идентификации Bordetella bronckiseptica выделенных у домашних животных / Никульшина Ю.Б., Сверкалова Д.Г., Никулина E.H. // Международный научно-практический журнал по фундаментальным и прикладным вопросам ветеринарии. --2007. - № 4. (23). - С. 103-106.

4. Сверкалова Д.Г. Изучение антимикробной чувствительности Bordetella bronchiseptica in vitro. // Никульшина Ю.Б., Васильев Д.А., Сверкалова Д.Г. / Материалы Международной научно-практической конференции. / Роль молодых ученых в реализации национального проекта. Развитие АПК-Саратов. - СГАУ. - 2007. - С. 144-147.

5. Сверкалова Д.Г. Выделение бактерий рода Bordetella bronchiseptica от домашних животных. // Никульшина Ю.Б., Сверкалова Д.Г., Васильев Д.А., Хлынов Д.А. / Роль молодых ученых в развитии национального проекта «Развитие АПК». Москва. МГАУ. - 2007. - Ч 1. с. 281-284.

6. Сверкалова Д.Г. Разработка методов индикации и идентификации Bordetella bronchiseptica , выделенных от домашних животных // Никульшина Ю.Б., Сверкалова Д.Г., Никулина E.H., // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГУ "ВНИИЗЖ". /Ветеринарная патология/ Международный научно-практический журнал по фундаментальным и прикладным вопросам ветеринарии №4. (23). - 2007. -С. 103-106.

7. Сверкалова Д.Г. Технология конструирования селективной, транспортной, накопительной сред для Bordetella bronchiseptica. // Васильев Д.А., Никульшийа Ю.Б., Сверкалова Д.Г., Мастиленко A.B., Семанин Е.Г., Хлынов Д.Н. / 'Груды Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных. - Покров. - 2008. - С. 13-14.

8. Сверкалова Д.Г. Культивирование Bordetella bronchiseptica на различных селективных средах. // Никульшина Ю.Б., Сверкалова Д.Г., Васильев Д.А., Мастиленко A.B., Хлынов Д.Н. / Материалы Международной научно-практической конференции / Актуальные вопросы аграрной науки и образования. - Ульяновск. - Т. IV. - 1008. - С. 57-59.

9. Сверкалова Д.Г. Создание транспортной и накопительной сред для Bordetella bronchiseptica. И Сверкалова Д.Г., Мастиленко A.B., Хлынов Д.А., Никульшина Ю.Б., Васильев Д.А. / Материалы Международной научно-практической конференции / Актуальные вопросы аграрной науки и образования. - Ульяновск. - Т. IV. - 1008. - С. 134-136.

10. Сверкалова Д.Г. Изучение антигенной структуры Bordetella bronchiseptica // Букин E.H., Дмитриева Е.А., Семанина E.H., Васильева Ю.Б., Васильев Д.А., Сверкалова Д.Г. II Ветеринарная медицина домашних животных. Сборник статей. - Выпуск 5. - Казань. - Печатный двор. - 2008. — С. 5153.

11. Сверкалова Д.Г. Разработка методики выявления специфического участка ДНК Bordetella bronchiseptica с помощью ПЦ? в режиме ((реального времени». // Васильев Д.А., Мастиленко A.B., Сверкалова Д.Г., Никульшина Ю.Б. / Сборник научных трудов. Современный мир, природа и человек.-Томск,-2009.-С. 115-117.

12. Сверкалова Д.Г. Получение антигенного препарата путем ультразвуковой дезинтеграции клеток Bordetella bronchiseptica. // Семанина E.H., Сверкалова Д.Г., Васильева Ю.Б. / Материалы конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летшо со дня рождения /' Актуальные вопросы инфекционной патологии ветеринарной медицины. - Покров. - ГНУ ВНИИВВиМ. - 2009. - С. 226-229.

13 Сверкалова Д.Г. Применение полимеразной цепной реакции при идентификации возбудителя бордетеллеза животных. // Васильев Д.А., Мастиленко A.B., Сверкалова Д.Г., Васильева Ю.Б. / Естественные и технические науки. - 2010. - № 5 - С. 230-232.

14. Сверкалова Д.Г. Выделение и идентификация Bordetella bronchiseptica от животных // Васильев Д.А., Мастиленко A.B., Сверкалова Д.Г., Васильева Ю.Б. / Естественные и технические науки. - 2010. - № 5 -С. 233-235.

15. Сверкалова Д.Г. Разработка методики серологической идентификации Bordetella bronchiseptica с помощью электрофореза. // Мастиленко A.B., Сверкалова Д.Г.. Семанин Е.Г., Васильева Ю.Б. / Материалы 111-й Международной научно-практической конференции молодых ученых / Молодежь и наука XXI века / Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии. - Ульяновск.- 2010. - Т. 1. - С 47-49.

16. Сверкалова Д.Г. Разработка методики антигенной идентификации Bordetella bronchiseptica с помощью иммунозлектрофореза. // Васильев Д.А., Васильева Ю.Б., Мастиленко A.B., Сверкалова Д.Г., Семанин Е.Г., / Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых / Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерация». - ГНУ ВНИИВВиМ. - Покров. - 2011. -С. 185-188.

Отпечатано в типографии ООО «КОПИРИНГ» Г. Ульяновск, ул. К. Маркса 26, (8422) 42-07-81 Подписано в печать У. . Формат 60x841/16.

Заказце?/? Тираж 100 экз. Бумага офисная

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сверкалова, Дарья Геннадьевна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Распространение бордетеллёза.

1.2. Эпизоотологическая характеристика.

1.3. Характеристика возбудителя Bordetella bronchiseptica.

1.4. Патогенез бордетеллеза домашних животных.

1.5. Клиническая картина и патологоанатомические изменения.

1.6. Диагностика.

1.7. Лечебно-профилактические мероприятия при бордетеллёзе.

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Материалы.

2.1.2. Методы.

2.2 Результаты собственных исследований и их обсуждение.

2.2.1 Изучение биологических свойств бордетелл.

2.2.1.1. Морфология В. bronchiseptica.

2.2.1.2. Изучение культуральных свойств бордетелл.

2.2.1.3. Изучение биохимических свойств Bordetella bronchiseptica.

2.2.1.4. Гемолитические свойства В. bronchiseptica.

2.2.1.5. Изучение предела возможности роста бордетелл при разных показателях pH среды.

2.3. Конструирование селективно-диагностической среды для Bordetella bronchiseptica.

2.3.1. Подбор питательной основы для культивирования Bordetella bronchiseptica.

2.3.2. Подбор селективного компонента для В. bronchiseptica.

2.3.2.1.Изучение чувствительности В. bronchiseptica к химиотерапевтическим препаратам.

2.3.2.2. Определение предельных концентраций мочевины и хлорида бария в субстрате для В. bronchiseptica.

2.3.2.3. Определение предельных концентраций индикаторов в субстрате для В. bronchiseptica для определнния возможности их использования в качестве селективных компонентов.

2.4. Конструирование селективно-диагностической среды Bordetella bronchiseptica.

2.5. Определения качества экспериментальной дифференциально-диагностической среды УГСХА BBR 57.

2.5.1. Определение продуктивности среды.

2.5.2. Эффективность экспериментальной дифференциально-диагностической среды УГСХА BBR 57.112,

2.6. Разработка бактериальных методов индикации и идентификации бактерий рода Bordetella bronchiseptica от домашних животных.

2.6.1. Разработка схемы выделения Bordetella bronchiseptica.

2.6.2. Разработка методики выделения Bordetella bronchiseptica от животных

2.6.3. Конструирование биопрепарата для антигенной идентификации бактерий

Bordetella bronchiseptica.

2.6.3.1. Получение гипериммунной сыворотки.

2.6.4. Постановка серологической реакции агглютинации (РА) для антигенной идентификации Bordetella bronchiseptica.

2.7. Мониторинг заболеваемости бордетеллезом собак и кошек в городе Ульяновске и апробация схем выделения и селективно-диагностической среды для выделения и типирования Bordetella bronchiseptica.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биопрепарата и бактериологической тест-системы для типирования Bordetella Bronchiseptica"

Актуальность темы. Bordetella bronchiseptica - инфекционный агент, вызывающий бордетеллез домашних животных.

Бордетеллез - высококонтагиозное, инфекционное заболевание мелких домашних животных, характеризующееся общим недомоганием, развитием острого воспалительного процесса слизистой оболочки респираторного тракта, сухим, болезненным кашлем, рвотой, прогрессирующим исхуданием и гибелью животных СLopez, 1952; Pittman, 1984; Deeb et al., 1990; Dugal et al, 1991). Первые сообщения об ассоциации бордетеллеза с другими болезнями собак были сделаны в начале XX века, значительный процесс в понимании болезни наблюдается в последние десятилетия {Molina Gonzalez, 2006).

В нашей стране указанная болезнь не изучена, диагностируется как патология невыясненной этиологии, и методы лабораторной диагностики бордетеллеза домашних животных не разработаны.

Для разработки бактериологических схем и методов идентификации возбудителя возникает необходимость создания селективно-диагностической среды, тест-системы, конструирование антигенного биопрепарата для антигенного типирования бактерий вида В. bronchiseptica. Создание системы бактериологической диагностики бордетеллёза, включающей комплекс бактериологических и антигенных тестов, позволит своевременно и качественно выявлять и идентифицировать микробный агент и, следовательно, эффективно назначать лечебно-профилактические мероприятия.

Работа является частью комплексных исследований кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (номер Государственной регистрации 0120.01157936).

Цель и задачи исследования. Цель - разработка антигенного биопрепарата и тест-системы для бактериологической идентификации бактерий вида В.ЪгопсЫьерйса выделенных у домашних животных.

Исходя из цели исследования, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать биологические свойства характерные для В. ЬгопсЫяериса, и на основе полученных результатов предложить для решения поставленной цели микробиологические тесты.

2. Создать антигенный биопрепарат для типирования бактерий вида В. ЪгопсЫяерНса по антигенному составу.

3. Сконструировать селективно-диагностическую среду для выделения и первоначального типирования бактерий В. ЬгопсЫзерИса по культуральным и биохимическим свойствам.

4. Разработать схему выделения и идентификации указанной бактерии от домашних животных.

5. Разработать нормативно-техническую документацию:

- на схему выделения, дифференциации и идентификации В. ЬгопсМяер11са;

- на изготовление антигенного биопрепарата.

Научная новизна. Впервые создан биопрепарат для антигенного типирования микроорганизма В. ЪгопсЫзерйса. Впервые разработана схема выделения и тест-система идентификации бактерий В. ЬгопсЫБерИса от домашних животных.

Практическая значимость работы. Изучены биологические свойства (ферментативная активность, восприимчивость к красителям, культуральные свойства, устойчивость к химическим и физическим свойствам), на основании которых предложены для ветеринарной практики микробиологические тесты для типирования бактерий вида В. ЬгопсМзерНса. Разработан биопрепарат для антигенного типирования и идентификации бактерии вида В. ЪгопсЫзерйса.

Созданы и апробированы селективно-диагностическая среда УГСХА ВВЯ 57 и оптимальная схема выделения бактерий вида В. ЬгопсМБерНса, позволяющие выделить и идентифицировать данные бактерии из клинического материала.

Материалы диссертации включены в разработанную и утверждённую научно-техническую документацию:

- «Методические рекомендации по выделению и идентификации В.ЪгопсЫБерйсаъ (Ульяновск, 2011);

- «Методические рекомендации по изготовлению биопрепарата для идентификации В. ЬгопсЫяерНса» (Ульяновск, 2011);

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по дисциплинам "Биотехнология", "Частная микробиология", "Болезни мелких домашних животных", для студентов факультета ветеринарной медицины, биотехнологического факультета Ульяновской ГСХА, а также при выполнении тем научно-исследовательских работ на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологические свойства В. ЬгопсЫзерНса: ферментативная активность, восприимчивость к красителям, культуральные свойства, устойчивость к химическим и физическим воздействиям, положены в основу микробиологических тестов для типирования бактерий вида В. ЪгопсЫзерИса.

2. Разработанный биопрепарат, позволяет типировать по комплексному антигенному составу бактерии вида В. ЬгопсЫхерНса.

3. Селективно-диагностическая среда УГСХА ВВЯ 57, предназначенная для выделения и первоначального типирования бактерий вида В.ЪгопсЫзерИса по культуральным и биохимическим свойствам.

4. Оптимальная схема выделения бактерий вида В. ЬгопсЫзерйса от животных, позволяющая выделить и типировать бактерии данного вида за 120 часов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и опубликованы на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», посвященной 60-летию 7 факультета ветеринарной медицины Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2003); на научно-практической конференции молодых ученых Приволжского федерального округа «Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Саратов, 2007); на Международной научно-практической конференции «Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Москва, 2007), Международной научно-практической конференции посвященной пятидесятилетию ФГУ ВНИИЗЖ «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Владимир, 2008г); на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008); конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины (Покров, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, 3 из которых - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 176 страницах печатного текста, содержит 12 таблиц, 77 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и практических предложений. Список использованной литературы включает 247 источников из них 233 иностранных. В приложениях представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.