Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Bordetella bronchiseptica и разработка на их основе биопрепарата для индикации и идентификации

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Bordetella bronchiseptica и разработка на их основе биопрепарата для индикации и идентификации"

На правах рукописи

ß.f&ur-

Семанина Екатерина Николаевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA И РАЗРАБОТКА НА ИХ ОСНОВЕ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 мд? 2012

Саратов-2012

005012190

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич кандидат ветеринарных наук, доцент Васильева Юлия Борисовна

Официальные оппоненты:

Щербаков Анатолий Анисимович

доктор биологических наук, профессор

ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н И Вавилова»,

заведующий лабораторией микробиологии, вирусологии и иммунологии

Гильмутдинов Рустам Якубович

доктор биологических наук, профессор

ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им.

H.Э. Баумана»,

заведующий кафедрой патологической физиологии

Ведущая организация: ФГБУ Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, г. Москва

Защита диссертации состоится » марта 2012 года ъ/у 00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» (410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан <<^/» февраля 2012 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл.,

I, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время особое внимание уделяют диагностике малоизученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относится бордегеллёзная инфекция, возбудитель которой у животных обычно не идентифицируется (Gueirard, 1995; Mattoo, 2005; Мастиленко, 2011). Без сомнения Bordetella bronchiseptica играет одну из основных ролей в появлении вторичных инфекций, но анализ литературных данных последних лет показал, что у животных она может выступать как возбудитель самостоятельного заболевания (Jacobs et al., 1993; Coutts et al., 1996; Parton, 2005).

Бордетеллёзом болеют собаки, лошади, свиньи, обезьяны, козы, лисы, кролики, кошки, хорьки, хомяки, крысы, морские свинки, птицы и др. (Goodnow, 1980; Yuk et al., 2000).

Данный микроорганизм является инфекционным агентом, индикации и идентификации которого в нашей стране в настоящее время уделяется все большее внимание. За последние годы разработана полимеразно-цепная реакция для идентификации возбудителя бордетеллёза (Васильев, Мастиленко, Васильева, 2010), а также бактериологическая схема с применением селективно -диагностической питательной среды УГСХА BBR 57, позволяющая поставить диагноз в течение 96 часов (Васильев, Сверкалова, Васильева, 2010).

В настоящее время установлено, что В. bronchiseptica может вызывать патологию дыхательных путей человека (Woolfrey, 1991; Bauwens, 1992; Gueirard, 1995; Bjomstad, 2005; Mattoo, 2005).

В исследованиях C.R. Helps (2005) было показано, что при исследовании сывороток 126 кошек у 70 % были обнаружены антитела к В. bronchiseptica, а возбудитель был выделен у 5 % из числа исследуемых животных. Эта инфекция чаще всего встречается в многочисленных сообществах кошек домашнего содержания, где в анамнезе животных уже присутствовали респираторные заболевания (Goodnow, 1980; Widney, 2005; Egberink, 2009).

Многие аспекты бордетеллёзной инфекции до сих пор остаются неясными. В значительной степени это обусловлено отсутствием недорогих высокоточных методов диагностики бордетеллёза, что затрудняет получение исчерпывающей эпизоотологической и эпидемиологической информации. В отечественной ветеринарной практике вопрос выделения фагов В. ЬюпсЫзерИса и их применение с диагностической целью не изучался. Решение этих вопросов представляет научный и практический интерес.

Цель работы - выделить фаги В. ЪгопсЫъерИса, изучить основные биологические свойства, разработать технологические параметры и создать биопрепарат для индикации и идентификации В. ЬгопсЫзерПса.

Задачи работы:

1. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении В. ЪгопсЫверйса.

2. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и её спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу) выделенных бактериофагов.

3. Подобрать оптимальный набор бактериофагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат для диагностики бордетеллёза.

4. Разработать схему идентификации В. ЬгопсЫверйса с помощью бактериофагов.

5. Разработать биотехнологические параметры изготовления диагностического биопрепарата.

6. Разработать схему ускоренной индикации В. ЬгопсЫ$ерйса в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

Научная новизна. Впервые выделены штаммы фагов, активные в отношении В. ЪгопсЫжрйса. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов: морфология негативных колоний, лигическая активность, спектр лигического действия, специфичность действия, температурная устойчивость, устойчивость к действию хлороформа, изменение литической активности при хранении.

Впервые для целей идентификации бактерий В. bronchiseptica разработан биопрепарат B.br. - 11 УГСХА на основе отобранных фагов.

Впервые разработана и апробирована на объектах внешней среды, патологическом материале, больных животных схема реакции нарастания тигра фага для индикации бактерий В. bronchiseptica за 26 часов с использованием биопрепарата бактериофага B.br. - 11 УГСХА Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата бактериофага B.br. - 11 УГСХА для индикации и идентификации бактерий В. bronchiseptica.

Практическая значимость работы. Выделены и селекционированы бактериофаги, активные в отношении В. bronchiseptica. Сконструирован диагностический биопрепарат на основе бактериофагов и усовершенствована схема индикации В. bronchiseptica с применением РНФ в течение 26 часов. Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Bordetella bronchiseptica B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА», утвержденная ректором ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (24 октября 2011г).

Результаты исследований биологических свойств бактериофагов B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА, а также возможность использования бактериофагов B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА в схеме реакции нарастания титра фага подтверждены актами комиссионных испытаний в ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (12 октября 2011 г).

По материалам диссертационной работы разработаны: «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий Bordetella bronchiseptica методом реакции нарастания тигра фага в объектах санитарного надзора» (в соавторстве с Васильевым Д.А., Васильевой Ю.Б.), «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофагов B.br. - 7 УГСХА и B.br. - 1 УГСХА» (в соавторстве с Васильевым Д.А., Васильевой Ю.Б.) для студентов старших курсов факультета ветеринарной медицины и биотехнологического факультета ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА», а также сотрудников медико-биологических научных учреждений и врачей бактериологов, утвержденные ректором ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (24 октября 2011 г). Материалы диссертационной

работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА».

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Воздействие на бактерии В. ЬгопсЫъерИса ультрафиолетовым излучением по разработанной схеме способствует выходу профага.

2. Данные о биологических свойствах фагов В. ЪгопсЫъерйса. позволяют отобрать изоляты для изготовления биопрепарата и использовать его в схеме идентификации возбудителя бордетеллеза за 66 часов.

3. Разработанная схема индикации В. ЬгопсЫзерНса в объектах ветеринарного надзора при помощи РНФ с использованием диагностического биопрепарата В.Ьг. - 11 УГСХА ускоряет определение данного возбудителя до 26 часов.

4. Разработаны технологические параметры изготовления активного и специфического биопрепарата на основе бордетеллёзных фагов В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА.

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены: Всероссийской научно-практической конференции «Молодёжь и наука XXI века» (Ульяновск, 2007); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009); Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010).

По теме диссертационной работы в 2011 году получен грант Министерства образования и науки Российской Федерации Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса».

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (№ гос. регистр. 01201161409).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура в объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы, собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников и приложений. Материалы диссертации изложены на 147 страницах, иллюстрированы 32 таблицами и 14 рисунками. Список использованных литературных источников содержит 109 отечественных и 92 зарубежных автора.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект, материалы и методы исследований

Объекты исследований: референс-штаммы В. bronchiseptica в количестве 5 (№ 1, № 7, № 214, № 22067, № 8344) и 1 штамм Bordetella parapertussis (№ 119); референс-штаммы бактерий других родов, в количестве 24 (Yersinia pseudotuberculosis Ns 0630, Morganella morganii, Staphylococcus aureus Ns ATCC 25923, Escherichia coli Ns 4, Ns ATCC 25922, Proteus mirabilis Nsl,Ns 523, Ns 491 Salmonella typhimurium Ns 82, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis Ns 189, Providencia rettgeri Ns 104a, Ns 102d, Ns 175, Aeromonas hydrophila Ns 01, Ns 02, Pseudomonas putida Ns 12633, Ns 901, Enterobacter cloacae Ns 1487, Ns 10005, Bacillus cereus Ns 2527, Bacillus subtillis Ns 6633), полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы при ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА», которые, в соответствии с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этих видов морфологическими, кулыуральными и биохимическими свойствами; 48 штаммов В. bronchiseptica, выделенных от собак и кошек (с клиническими проявлениями респираторных заболеваний); 8 штаммов фагов В. bronchiseptica.

Объекты внешней среды: сточные воды, смывы с глотки больных животных, патологический материал от больных и павших животных.

Питательные среды и реактивы: мясопепгонный бульон, мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), среда Эндо, казеиново-угольный агар, бордегелл-агар, кровяной агар и среда Борде-Жангу, среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннигом (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург), агар-агар, натрий хлорид, мочевина, перекись водорода, желатин, среда УГСХА BBR 57.

Методы: в работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения и идентификации бактерий (Васильев и др., 2004; Лабинская, 2008; 2010). Основные биохимические свойства пггаммов В. bronchiseptica исследовали с использованием тест-системы, разработанной в НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург. Оксид аз ный тест проводили с применением 1 % раствора N, N-диметил-фенилендиамина (Лабинская, 2010). Тест на каталазную активность проводили с применением 3 % раствора перекиси водорода (Скородумов и др., 2005).

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов проводили с помощью методов, предложенных М. Адамсом (1961), ДМ. Гольдфарбом (1961), С. Лурия, Д. Дарнелл (1970), И.П. Ревенко (1978), ИМ. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (2006). Постановку РНФ для индикации В. bronchiseptica в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаховым, Д.М. Гольдфарбом (1961).

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы SPSS statistics 17.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение в идентификация В. bronchiseptica

Исследованы морфологические свойства 5 референс-иггаммов В. bronchiseptica. Все референс-штаммы В. bronchiseptica были представлены коккобациллярными палочками, окрашивались по Граму отрицательно. В мазках располагаются одиночно, парами, редко короткими цепочками. При посеве в толщу агара, а также методом висячей капли определяется подвижность бордетелл. Все референс-штаммы являлись подвижными при постановке тестов.

При исследовании культуральных свойств показано, что на МПА после 24 часов инкубирования посевов референс-штаммы В. bronchiseptica образуют выпуклые, гладкие, полупрозрачные мелкие колонии жемчужного цвета При открытии чашки Петри с засеянными бордетеллами чувствуется специфический заплесневелый запах. При снятии колоний с поверхности агара определяется их слизистая консистенция. Из 5 референс-штаммов В. bronchiseptica № 1, № 7, № 22067, № 214 и № 8344, последний образует самые мелкие колонии диаметром 0,2-0,4 мм.

На мясопепгонном бульоне в первые 24 часа культивирования референс-штаммы В. bronchiseptica вызывают равномерное помутнение среды с последующим образованием осадка и пристеночного кольца.

На бордетелл-агаре (производство Hi Media) при температуре 37 "С в течение 18-24 ч исследуемые референс-штаммы формируют мелкие, блестящие, прозрачные с ртутным или жемчужным отливом, куполообразные колонии, которые имеют гладкую поверхность.

Результат изучения ферментативных свойств для референс-штаммов В. bronchiseptica: не гидролизуют желатин, не продуцируют индол, продуцируют оксвдазу, каталазу, уреазу. Референс-штаммы не ферментируют углеводы. Восстанавливают нитраты до нитритов.

Нами проведены исследования по выделению бордетелл от домашних животных и из внешней среды. Для этого брали мазки с задней стенки глотки собак и кошек ватными палочками и делали посев на бордетелл-агар с

0,04 % цефазолином или на МПА, с добавлением 0,04 % спиртового раствора генцианвиолета (0,1 мл на каждые 100 мл МПА), методом штриха. Дня типирования бордетелл использовали микроскопию с окраской по Граму выросших колоний, культивирование на обычных и селективных средах, тесты на подвижность, оксидазу, индол, ферментацию углеводов. Было исследовано 157 проб, выделено 11 полевых штаммов В. ЪгопсЫьерНса.

Выделение бактериофагов В. ЪгопсЫьерИса

Исследование культур В. ЬгопсЫъерИса на наличие бактериофагов без воздействия индуцирующего фактора. Результаты исследований штаммов В. ЬгопскЫерНса на наличие профага свидетельствуют, что культуры В. ЪгопсЫьериса без воздействия на них индуцирующего фактора не проявили лизогенных свойств. Проведено 17 опытов, положительных результатов не было.

Выделение фагов В. ЬгопсЫяерНса из объектов внешней среды и от животных. Вторым этапом наших исследований стало выделение бактериофагов В. ЪгопсЫъерйса из объектов внешней среды и от животных. Всего нами исследовано 104 пробы, бактериофаги среди них не обнаружены.

Выделение фагов В. ЬгопсМ.крИса из бактерий при помощи индуиируюгиего фактора. В третьей серии опытов на культуры В. ЬюпсЫяерПса воздействовали индуцирующим фактором. В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовыми лучами.

Схема выделения фагов В. Ьгопскяерйса воздействием на бактерии ультрафиолетовым излучением

Опыты по облучению бактерий УФЛ проводились со всевозможными временными интервалами, а также с различного расстояния от объекта до лампы. Результаты представлены в таблице 1.

1 день: посев газоном суточной культуры В. ЬюпсЫяерНса на мясопептонный агар, подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 5-7 мин. Далее инкубирование чашек Петри с обработанными бактериями в термостате при 37 °С в течение суток.

2 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37 °С) на сутки.

3 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 0,5 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37 °С) на сутки.

4 день: смыв выросших колоний мясопептонным бульоном с чашек Петри, помещение в пробирку со штаммами бордетелл. Культивирование в термостате в течение суток.

5 день: обработка хлороформом 1 часть хлороформа и 10 частей фаголизата в течение 15 минут, центрифугирование при 3000 об/мин - 15 мин. Снятие надосадочной жидкости в стерильную пробирку.

6 день: учет результатов. Присутствие бактериофага определяли по наличию зон лизиса.

После выделения бактериофаги пассировали для повышения их лигической активности и в дальнейшем проводили селекцию по морфологическим признакам.

Селекционированные бактериофаги имели прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром 0,5-4,0 мм. Литическая активность составила более 10'6 по Аппельману, и 5,3 х 107 по Грациа корпускул в 1 мл фаголизапга.

Данные нашего эксперимента показывают, что облучение бактерий УФЛ по предложенной схеме способствует выходу профага из клеток В. ЪгопсЫзерйса.

В процессе работы по выделению бактериофагов с применением УФЛ в общей сложности нами было проведено 29 экспериментов. Описанным выше методом нам удалось выделить 8 фагов В. ЪгопсЫкерйса из 14 штаммов бактерий. Выяснилось, что 6 штаммов бактерий В. ЬгопсЫзерНса не проявили лизогенных свойств.

Характеристика биологических свойств выделенных бактериофагов Морфология негативных колоний Негативные колонии, образуемые бактериофагами, по наличию зоны неполного лизиса, вторичного роста и величине колоний можно разделить на два типа (Борисов, 1976). К первому типу относятся негативные колонии круглые, прозрачные, диаметром более 3 мм, с зоной неполного лизиса по периферии шириной 0,5 - 4 мм или без неё: В.Ьг. - 7 УГСХА, В.Ьг. -22067 УГСХА, В.Ьг. - 214 УГСХА.

Колонии второго типа круглые, прозрачные или полупрозрачные, с ровными краями, диаметром до 2 мм: В.Ьг. - 1 УГСХА, В.Ьг. - 10 УГСХА, В.Ьг. - 11 УГСХА, В.Ьг. -13 УГСХА и В.Ьг. - 8344 УГСХА.

Литическая активность бактериофагов В. Ьтопскиерйса Литическую активность селекционированных фагов определяли по методам Аппельмана и Грациа (Гольдфарб, 1961).

Активность исследуемых бактериофагов варьировала от 5,3 х 107 до 4,3 х 109. По исследованным параметрам для конструирования диагностического набора фагов отобраны наиболее активные их них: В. ЬгопсШзерНса • 1 УГСХА по Аппельману 10'7, по Грациа 3,1 х 108 и В. ЬгопсЫяерПса - 7 УГСХА по Аппельману 10"8, по Грациа 4,3 х 109.

Спектр литического действия бактериофагов В. ЬгопсЫьерйса Для изучения спектра литического действия выделенных фагов мы использовали 53 культуры бактерий В. ЪгопсЫзерйса.

По результатам исследований наибольшим совместным спектром литического действия обладали бактериофаги В. ЪгопсЫьерИса - 1 УГСХА и В. ЬгопсЫверИса - 7 УГСХА. Они лизировали 92,5 % имеющихся штаммов.

Учитывая литическую активность и спектр литического действия бактериофагов В. ЪгопсНтрйса для дальнейших исследований нами было отобрано 2 фага - В. ЬгопсЫзерИса - 1 УГСХА и В. ЪгопсЫьерйса - 7 УГСХА.

Специфичность действия исследуемых фагов В. Ьгопсккерйса В качестве гетерологичных культур использовали микроорганизмы указанные в материалах и методах.

Бактериофаги В. Ьг. -1 УГСХА и В. Ьг. - 7 УГСХА не вызывали лизис ни одной из испытуемых культур других видов бактерий.

Температурная устойчивость фагов В. Ьг.-1 УГСХА и В. Ьг.- 7 УГСХА В результате исследований было установлено, что прогревание фагов В. Ьг. - 1 УГСХА и В. Ьг. - 7 УГСХА при температуре 60 °С в течении 30 минут не оказало влияния на активность фагов, бактерии погибали при данной температуре. Нагревание бактериофагов свыше 65 °С приводило к потере их активности.

Устойчивость бактериофагов к воздействию хлороформом В результате проведенных исследований установлено, что бактерии инактивируются при действии хлороформа при 10 минутной обработке. Бактериофаги В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьт. - 7 УГСХА проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 30 минут. Наблюдалось снижение активности фагов при обработке хлороформом свыше 30 минут с 2,2 х

10* до 3,2 х 107 у В.Ьг. - 1 УГСХА и с 2,1 х Ю* до 5,3 х 10? у В.Ьг. - 7 УГСХА по методу Грациа. Активность бактериофагов В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА восстанавливалась после одного пассажа.

Разработка параметров ускоренной идентификации В. ЬгопсЫ$ерНса с помощью бактериофагов Используя строгую специфичность селекционированных бактериофагов по отношению к штаммам В. ЪгопсЫъерйса, мы разработали схему ускоренной идентификации этих микроорганизмов (рис. 1).

При наличии в мазках грамотрицательных палочек, располагающихся одиночно или короткими цепочками, проводили типирование бактерий бактериологическим методом и с помощью бактериофагов В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА.

Результаты проведенных опытов демонстрируют возможность идентификации В. ЬгопсЫверНса с помощью фагов В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА, срок исследования по сравнению с бактериологическим методом при этом сокращается со 96 до 66 часов при меньшем расходе лабораторной посуды, питательных сред, реактивов.

Рис. 1. Выделение бактерий В. ЬгопсЫхерйса и ускоренная идентификация с помощью бактериофагов в сравнении со схемой бактериологического исследования

Разработка технологических параметров изготовления и контроля диагностического фагового биопрепарата

Характеристика индикаторных культур Бордетеллезные индикаторные бактериофаги получали путем культивирования в мясопептонном бульоне с В. ЬгопсЫзерйса. В качестве индикаторной культурой для фагов В.Ьг. - 7 УГСХА и В.Ьг. - 1 УГСХА использовали штамм В. ЬюпсЫзерИса № 8344, обладающий характерными для своего вида морфологическими, биохимическими и культуральными свойствами.

Штаммы фагов поддерживали на индикаторной культуре В. ЬгопсЫзерИса № 8344 в мясопептонном бульоне. Для повышения активности бактериофагов проводили пассажи. Опытным путем определяли оптимальное соотношение времени пассажа по логической активности фагов.

Установлено, что оптимальное время контакта культуры с фагами В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА составляет 7 часов. Этот режим мы использовали в дальнейших исследованиях.

Определение оптимальных количественных параметров соотношения фаговых корпускул и клеток бактерий В. ЪгопсЫъерНса Результаты проведенных исследований показали, что литическая активность бордетеллёзных фагов при разных соотношениях индикаторной культуры и фага была одинаково высокая и соответствовала 1,3 х 107- 3,1 х 108 фаговых корпускул в 1,0 см3.

Оптимальное соотношение количества фагов В.Ьг. - 7 УГСХА, В.Ьг. - 1 УГСХА и культуры составляет 1:2, литическая активность фагов при этом составляет 2,1 х 108,4,3 х 109 активных корпускул в 1 мл соответственно.

Определение оптимального температурного режима культивирования бактериофагов В. ЬгопсЫяерНса Литическая активность фага В.Ьг. - 1 УГСХА по методу Аппельмана при температуре 25 °С, 37 °С и42°С составила 10"6,10"7 и 10"6; по методу Грациа -1,3 х 107,3,1 х 108 и 1,1 х 107, соответственно. Титр фага В.Ьг. - 7 УГСХА составил по методу Аппельмана 10'7, 10 "8 и 10"7- при 25 °С, 37 "С и 42 °С; по методу Грациа 1,4 х 108,4,3 х 109и 2,6 х 108 активных корпускул в 1 мл соответственно.

На основании полученных данных можно сделать вывод: оптимальным для культивирования фагов В. ЪгопсЫьерИса является температура 37 °С.

Хранение бактериофагов Изучение изменения логической активности бактериофагов с истечением времени связано с изысканием оптимальных условий хранения и кратности пересева производственных штаммов, а также со сроком годности фаговых препаратов. Селекционированные бактериофаги В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА хранились во флаконах, при температуре 4 °С в виде лизатов бульонных культур, без консерванта Лигическую активность определяли по истечении 3, 6, 9 и 12 месяцев. Анализируя результаты проведенных исследований, можно сделать вывод, что по истечении 12 месяцев бактериофаги

В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА не изменили своей литической активности и они могут использоваться в качестве диагностического биопрепарата

Контроль бактериофагов Из полученного объема отбирали пробу каждого фага по 50 мл для определения чистоты физических свойств, титра фага по отношению к индикаторной культуре, спектра литической активности и специфичности.

Индикаторные фаги В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА не содержали посторонних примесей, фаголгоаты были прозрачными, светло-желтого цвета, на питательных средах с посевами рост бактериальной микрофлоры и грибов отсутствовал, литическую активность индикаторных бактериофагов В.Ьг. - 7 УГСХА и В.Ьг. - 1 УГСХА определяли методами Аппельмана и Грациа (литическая активность индикаторных фагов составила от 10'7 по методу Аппельмана и от 3,1 х 108 до 4,3 х 109 по Грациа), спектр логического действия фага В.Ьг. - 7 УГСХА составил 81,1 %, фага В.Ьг. - 1 УГСХА - 47,2 % из числа изучаемых штаммов, совместный спектр лизиса гомологичных бактерий составил 92,5 %. По результатам изучения специфичности установлено, что индикаторные бордетеллёзные фаги являются неактивными в отношении штаммов других видов, родов.

Получив положительные результаты контроля, фаголизаты В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА разлили по 5,0 мл в стерильные флаконы и герметично закрыли. На флаконы наклеили этикетки с указанием наименования фага, литической активности бактериофагов, даты упаковки.

Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага

Определение количественного показателя РНФ Установлено, что результат реакции является положительным (увеличение количества корпускул фагов В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. 7 УГСХА более чем в 5 раз) в пробах при контаминации мясопепгонного бульона бактериями В. ЬгопсЫзерИса в концентрации 103 микробных клеток в 1 мл.

Определение оптимального времени постановки РНФ

В исследованиях использовали воду, смывы с глотки, фекалии, контаминированные бактериями Я ЪгопсЫ$ерйса в концентрации 105, 104,103, 102, 101 м.к. в 1 мл.

Опыты по изучению чувствительности реакции в зависимости от времени контакта исследуемого материала с фагом показали, что РНФ с 7-часовой экспозицией материала с фагами В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА позволяет провести индикацию бактерий вида В. ЬгопсЫзерИса в концентрации 104 м.к./мл за 19 часов.

В результате исследований установлено, что метод РНФ с предварительным подращиванием исследуемого материала в течение 7 часов позволяет обнаружить бактерии В. ЬгопсЫэерНса в количестве 103 м.к./мл, время проведения исследований составляет 26 часов.

Использование РНФ для выявления В. ЬгопсН15ср1и:а у домашних животных и в объектах внешней среды

Исследование с помощью РНФ проб физиологического раствора, искусственно контаминированного В. ЬгопсЫзерИса

Пробы физиологического раствора в объеме 5 мл вносили в колбы, содержащие по 50 мл МПБ, и контаминировали В. ЪгопсЫ$ерИса в концентрации от 101 до 105 м.к./мл. Индикаторной культурой для фагов В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. -7 УГСХА является В. ЬюпсЫяерйса № 8344.

По результатам проведенных исследований нами установлено, что увеличение титра фагов В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 103 микробных клеток бордетелл в 1 мл физиологического раствора. Время исследований составило 26 часов.

Исследование с помощью РНФ смывов, с глотки собак и кошек, искусственно контамшированныхВ. ЬгопсШхерНса У собак и кошек брали смыв физиологическим раствором с глотки, в объеме 5 мл. Вносили в колбы, содержащие по 50 мл МПБ и контаминировали В. ЪгопсЫаерйса в концентрации от 101 до 105 м.к./мл. По результатам

проведенных исследований установлено, что увеличение титра фагов B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 103 микробных клеток бордетелл в 1 мл исследуемых смывов с глотки собак и кошек. Исследование составило 26 часов.

Исследование с помощью РНФ фекалий, искусственно контаминированных

В. bronchiseptica

Пробы фекалий весом 5 г вносили в стерильные колбы, содержащие по 50 мл МПБ и конгаминировали В. bronchiseptica в концентрации от 101 до 105 м.к./мл.

По результатам проведенных исследований установлено, что увеличение тигра фагов B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 104 микробных клеток бордетелл в 1 г фекалий. Чувствительность реакции снизилась до этого уровня из-за обильного обсеменения фекалий посторонней микрофлорой, что повлияло на условия оптимального взаимодействия фагов B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА с В. bronchiseptica.

Мы провели повторное исследование исходных проб фекалий с увеличением времени экспозиции материала с фагом до 16 часов, это позволило повысить чувствительность РНФ до 103 м.к./мл, без выделения чистой культуры, при наличии посторонней микрофлоры.

Выводы

1. Многократным воздействием ультрафиолетовыми лучами на бактериальную клетку В. bronchiseptica по предложенной схеме (1 день: t = 5-7 мин; 1 = 1м. 2 день: t = 7-10 мин; / = 1м. 3 день: t = 7-10 мин; I = 0,5м), выделено 8 штаммов бактериофагов.

2. Установлены биологические свойства выделенных фагов В. bronchiseptica. Литическая активность их варьировала от 10"* до 10"9 по методу Аппельмана и от 5,3 х 107 до 4,3 х 109 по методу Грациа, а спектр лигического действия составил от 20,8 % до 81,1 %. Выделенные бактериофаги строго специфичны по отношению к В. bronchiseptica и не лизируют бактерии других видов и родов; проявляют устойчивость при обработке хлороформом (1:10) в течение 30 минут и выдерживают 30 минутное нагревание при 60 °С.

3. Отобранные бактериофаги B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА лизировали 92,5 % изученных культур В. bronchiseptica, обладали высокой логической активностью по Аппельману 10"7 - 10"8, по Грациа 3,1 х 108- 4,3 х 109 активных корпускул в 1 мл и имели оптимальные для изготовления биопрепарата свойства.

4. Фагоидентификация В. bronchiseptica с помощью индикаторных бактериофагов B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА позволяет идентифицировать гомологичные бактерии за 66 часов, бактериологический метод выделения В. bronchiseptica составляет 96 часов.

5. Разработанны технологические параметры изготовления и контроля диагностического биопрепарата «B.br. - 11 УГСХА» на основе выделенных и изученных фагов B.br. -1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА

6. Разработаны параметры постановки реакции нарастания титра фага для ускоренной индикации В. bronchiseptica в объектах внешней среды. Метод РНФ с использованием биопрепарата «B.br. - 11 УГСХА» на основе фагов B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА позволяет обнаружить указанные бактерии в концентрации от 103 м.к. в 1 мл исследуемого материала за 26 часов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Никулыпина Ю.Б., Сверкалова Д.Г., Никулина (Семанина) E.H. Разработка методов индикации и идентификации Bordetella bronchiseptica, выделенных у домашних животных // Ветеринарная патология. 2007. № 2. С. 156-159.

2. Выделение бактерий рода Bordetella bronchiseptica от домашних животных / Ю.Б. Никулыпина, Д.Г. Сверкалова, E.H. Никулина (Семанина) [и др.] // Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК»: материалы междунар. науч. пракг. конф. Москва: МГАУ, 2007. С. 281-284.

3. Технология конструирования селективной среды для Bordetella bronchiseptica. / Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Никулыпина, Д.Н. Хлынов, E.H. Никулина (Семанина) // Молодёжь и наука XXI века: материалы П-й Открытой Всероссийской конф. молодых ученых. Ульяновск, 2007.4.1. С. 219-222.

4. Бордетеллёз кошек и собак / Ю.Б. Никулыпина, Д.Г. Сверкалова, ТА Степанова, Е.Г. Семанин, A.C. Казакова, E.H. Никулина (Семанина) // Молодёжь

и наука XXI века: материалы П-й Открытой Всероссийской конф. молодых ученых. Ульяновск, 2007.4.1. С. 222-225.

5. Поиск селективных компонентов для выделения Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Никулынина, ДГ. Сверкалова, И.Н Головин, А.П. Казакова, Т.А. Степанова, Д.Н. Хлынов, E.H. Никулина (Семанина), Е.Г. Семанин // материалы 60-ой науч. студ. конф. Ульяновск, 2007. С. 97-100.

6. Изучение морфологических, тинкгориальных, культуральных и биохимических свойств бордетелл / Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Никулышша, Т.А. Степанова, E.H. Никулина (Семанина) // материалы 60-ой науч. студ. конф. Ульяновск, 2007. С. 94-97.

7. Изучение возможности зооангропонозной передачи бордетеллёза / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Д.Н. Хлынов, E.H. Никулина (Семанина) [и др.] // тр. Всероссийского совета молодых ученых аграрных образовательных и науч. учреждений. М.: Академия кадрового обеспечения АПК, 2008. Т.1. С. 152-155.

8. Разработка лабораторных методов диагностики бордетеллёза / E.H. Семанина, Е.Г. Семанин, ДА. Васильев [и др.] // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения: материалы междунар. науч. пракг. конф. Ульяновск, 2009. Т.4. С.132-134.

9. Семанина E.H. Разработка биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов для диагностики, лечения и профилактики бордетеллёзной инфекции животных и людей // Актуальные проблемы физической и функциональной электроники: материалы 12-й региональной научн. школы-семинара. Ульяновск, 2009. Т.2. С. 140-141.

10. Метод выделения фагов Bordetella bronchiseptica при помощи ультрафиолетового облучения / E.H. Семанина, Ю.Б. Васильева, ДА. Васильев [и др.] // Ветеринарная медицина домашних животных: сб. статей. Казань, 2010. Вып. 7. С. 244-246.

11. Семанина E.H., Васильева Ю.Б., Васильев Д.А. Выделение фагов Bordetella bronchiseptica // Молодежь и наука XXI века: материалы междунар. науч. практ. конф. молодых ученых. Ульяновск, 2010. Т.З. С. 60-62.

12. Семанина E.H., Васильева Ю.Б., Васильев Д.А. Выделение бактериофагов Bordetella bronchiseptica // Биологически активные вещества микроорганизмов: Всероссийский симпозиум с междунар. участием. Москва. МГУ имени М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 27-29 января 2011. М.: МАКС Пресс, 2011. С. 25.

13. Изучение основных биологических свойств бактериофагов Bordetella bronchiseptica, выделенных методом индукции / Д.А. Васильев, E.H. Семанина, С.Н. Золотухин [и др.] I Вестник Ульяновской государственное сельскохозяйственной академии. 2011. №1 (13). С. 59-62.

Подписано в печатьio.ol.lo fH Формат 60х 84 1/16 Бумага офсетная Гарнитура Танмс Печать офсетная, Усл.печ.л.Тираж эю. /ор Заказ9о(, Адрес издателя:

432980 г. Ульяновск, бульвар ! !онын Вснсц, 1

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семанина, Екатерина Николаевна, Ульяновск

61 12-3/731

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ ФГБОУ ВПО «УЛЬЯНОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ»

Семанина Екатерина Николаевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA И РАЗРАБОТКА НА ИХ ОСНОВЕ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И

ИДЕНТИФИКАЦИИ

03.02.03 -микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Васильев Д.А. кандидат ветеринарных наук, доцент Васильева Ю.Б.

Ульяновск - 2012

На правах рукописи

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Таксономическая характеристика бактерий рода Bordetella..............11

1.2. Распространение, источники заражения, факторы передачи

В. bronchiseptica............................................................................13

1.3. Биологические свойства возбудителя..........................................15

1.4. Патогенез и патологоанатомическая картина................................24

1.5. Идентификация В. bronchiseptica...............................................26

1.5.3. Бактериологические методы идентификации 2?. bronchiseptica.........26

1.5.2. Иммунологические методы идентификации В. bronchiseptica............28

1.5.3. Генетические методы идентификации В. bronchiseptica...................28

1.6. Бактериофаги и их применение в диагностической практике, выделение бактериофагов, биологические свойства бактериофагов............29

1.7. Фагоидентификация и фаготипирование бактерий.........................35

1.8. Реакция нарастания титра фага..................................................39

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект, материалы и методы исследований...................................44

2.1.1. Материалы............................... ............................................44

2.1.2. Методы................................................................................45

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.....................................53

2.2.1. Выделение и идентификация В. bronchiseptica...............................53

2.2.2. Выделение бактериофагов В. bronchiseptica.................................59

2.2.2.1. Характеристика биологических свойств выделенных бактериофагов..............................................................................68

2.2.3. Разработка параметров ускоренной идентификации

В. bronchiseptica с помощью бактериофагов........................................85

2.2.4. Разработка оптимальных условий постановки РНФ.......................88

2.2.4.1. Использование РНФ для выявления В. ЬгопсЫзерНса

у домашних животных и в объектах внешней среды..............................96

2.2.4.2. Исследование с помощью РНФ проб физиологического раствора, искусственно контаминированного В. ЪгопсЫБерйса.............................97

2.2.4.3. Исследование с помощью РНФ смывов, с глотки собак

и кошек, искусственно контаминированных В. ЬгопсЫзериса..................99

2.2.4.4. Исследование с помощью РНФ фекалий,

искусственно контаминированных В. ЪгопсЫзерНса............................101

2.2.5. Разработка технологических параметров изготовления

и контроля диагностического фагового биопрепарата..........................103

2.2.5.1. Изучение эффективности сконструированного

биопрепарата бордетеллезных фагов «В.Ьг. - 11 УГСХА......................112

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................114

ВЫВОДЫ.................................................................................120

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ......121

ПРИЛОЖЕНИЯ.........................................................................142

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КОЕ - колониеобразующие единицы

м.к./мл - количество микробных клеток в 1 мл

м.к./мл - количество микробных клеток в 1 мл

МПА - мясопептонный агар

МПБ - мясопептонный бульон

ПЦР - полимеразно-цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РДП - реакция диффузной преципитации

РИФ - реакция иммунофлюоресценции

РНФ - реакция нарастания титра фага

УФЛ - ультрафиолетовые лучи

ЦНС - центральная нервная система

I - время облучения бактерий УФЛ, минуты

/ - расстояние, метры

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

В настоящее время особое внимание уделяют диагностике малоизученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относится бордетеллёзная инфекция, возбудитель которой у животных обычно не идентифицируется (Human Bordetella bronchiseptica..., 1995; Mattoo, 2005; Мастиленко, 2011). Без сомнения Bordetella bronchiseptica играет одну из основных ролей в появлении вторичных инфекций, но анализ литературных данных последних лет показал, что у животных она может выступать как возбудитель самостоятельного заболевания (Feline bordetellosis: challenge..., 1993; Studies on natural..., 1996; Bordetella..., 2005).

Бордетеллёзом болеют собаки, лошади, свиньи, обезьяны, козы, лисы, кролики, кошки, хорьки, хомяки, крысы, морские свинки, птицы и др. (Goodnow, 1980; Modulation ofhost..., 2000).

Данный микроорганизм является инфекционным агентом, индикации и идентификации которого в нашей стране в настоящее время уделяется все большее внимание. За последние годы разработана полимеразно-цепная реакция для идентификации возбудителя бордетеллёза (Васильев, Мастиленко, Васильева, 2010), а также бактериологическая схема с применением селективно — диагностической питательной среды УГСХА BBR 57, позволяющая поставить диагноз в течение 96 часов (Васильев, Сверкалова, Васильева, 2010).

В настоящее время установлено, что В. bronchiseptica может вызывать патологию дыхательных путей человека (Woolfrey, 1991; Bordetella bronchiseptica pneumonia..., 1992; Human Bordetella bronchiseptica..., 1995; Mattoo, 2005; Bjornstad, 2005).

В исследованиях C.R. Helps (2005) было показано, что при исследовании сывороток 126 кошек у 70 % были обнаружены антитела к В. bronchiseptica, а возбудитель был выделен у 5 % из числа исследуемых животных. Эта инфекция чаще всего встречается в многочисленных сообществах кошек домашнего содержания, где в анамнезе животных уже присутствовали респираторные заболевания (Goodnow, 1980; CXCR3 and its..., 2005; Bordetella bronchiseptica infection..., 2009).

Многие аспекты бордетеллёзной инфекции до сих пор остаются неясными. В значительной степени это обусловлено отсутствием недорогих высокоточных методов диагностики бордетеллёза, что затрудняет получение исчерпывающей эпизоотологической и эпидемиологической информации. В отечественной ветеринарной практике вопрос выделения фагов В. bronchiseptica и их применение с диагностической целью не изучался. Решение этих вопросов представляет научный и практический интерес.

Цель работы

Выделить фаги В. bronchiseptica, изучить основные биологические свойства, разработать технологические параметры и создать биопрепарат для индикации и идентификации В. bronchiseptica.

Задачи работы

1. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении В. bronchiseptica.

2. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и её спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу) выделенных бактериофагов.

3. Подобрать оптимальный набор бактериофагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат для диагностики бордетеллёза.

4. Разработать схему идентификации В. bronchiseptica с помощью бактериофагов.

5. Разработать биотехнологические параметры изготовления диагностического биопрепарата.

6. Разработать схему ускоренной индикации В. bronchiseptica в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

Научная новизна

Впервые выделены штаммы фагов, активные в отношении В. bronchiseptica. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов: морфология негативных колоний, литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, температурная устойчивость, устойчивость к действию хлороформа, изменение литической активности при хранении.

Впервые для целей идентификации бактерий В. bronchiseptica разработан биопрепарат B.br. - 11 УГСХА на основе отобранных фагов.

Впервые разработана и апробирована на объектах внешней среды, патологическом материале, больных животных схема реакции нарастания титра фага для индикации бактерий В. bronchiseptica за 26 часов с использованием биопрепарата бактериофага B.br. - 11 УГСХА. Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата бактериофага B.br. - 11 УГСХА для индикации и идентификации бактерий В. bronchiseptica.

Практическая значимость работы

Выделены и селекционированы бактериофаги, активные в отношении В. bronchiseptica. Сконструирован диагностический биопрепарат на основе бактериофагов и усовершенствована схема индикации В. bronchiseptica с применением РНФ в течение 26 часов. Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Bordetella

hronchiseptica B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА», утвержденная ректором ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (24 октября 2011г).

Результаты исследований биологических свойств бактериофагов B.br. -1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА, а также возможность использования бактериофагов B.br. - 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА в схеме реакции нарастания титра фага подтверждены актами комиссионных испытаний в ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (12 октября 2011 г).

По материалам диссертационной работы разработаны: «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий Bordetella hronchiseptica методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора» (в соавторстве с Васильевым Д.А., Васильевой Ю.Б.), «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофагов B.br. - 7 УГСХА и B.br. - 1 УГСХА» (в соавторстве с Васильевым Д.А., Васильевой Ю.Б.) для студентов старших курсов факультета ветеринарной медицины и биотехнологического факультета ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА», а также сотрудников медико-биологических научных учреждений и врачей бактериологов, утвержденные ректором ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (24 октября 2011 г). Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА».

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Воздействие на бактерии В. hronchiseptica ультрафиолетовым излучением по разработанной схеме способствует выходу профага.

2. Данные о биологических свойствах фагов В. hronchiseptica позволяют отобрать изоляты для изготовления биопрепарата и использовать его в схеме идентификации возбудителя бордетеллёза за 66 часов.

3. Разработанная схема индикации В. hronchiseptica в объектах ветеринарного надзора при помощи РНФ с использованием

диагностического биопрепарата В.Ьг. - 11 УГСХА ускоряет определение данного возбудителя до 26 часов.

4. Разработаны технологические параметры изготовления активного и специфического биопрепарата на основе бордетеллёзных фагов В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены: Всероссийской научно-практической конференции «Молодёжь и наука XXI века» (Ульяновск, 2007); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009); Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010).

По теме диссертационной работы в 2011 году получен грант Министерства образования и науки Российской Федерации Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса».

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (№ гос. регистр. 01201161409).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы, собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников и приложения. Материалы диссертации изложены на 147 страницах, иллюстрированы 32 таблицами и 14 рисунками. Список использованных литературных источников содержит 109 отечественных и 92 зарубежных автора.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Таксономическая характеристика бактерий рода Bordetella

Род Bordetella назван в честь ученых J. Bordet и О. Gengou, которые впервые выделили микроорганизм у больного коклюшем человека (Коклюш..., 1964).

В. bronchiseptica первоначально назвали Bacillus bronchicanis, поскольку её изолировали из бронхов собаки (McGowan, 1911). Почти одновременно ту же бактерию выделили от собаки больной чумой, что послужило ложным основанием для рассматривания её в качестве этиологического агента последней. Но уже спустя год, когда тот же микроорганизм удалось выделить от свиньи, кролика и крысы, он был переименован в Bacillus bronchisepticus (Ferry, 1912; Torrey, 1912).

В последующем агенту присваивали разные названия, в т.ч. Alcaligenes bronchiseptica, Alcaligenes bronchicanis, Alcaligenes bronchisepticus, Bacterium bronchisepticus, Bacterium bronchicanis, Bacterium bronchisepticus, Brucella bronchispetica, Haemophilus bronchisepticus (Dorset, 1922; Pickett, 1970). В 1952 году M. M. Lopez (1952) предложил поместить бактерию в род Bordetella и в седьмом издании систематического справочника Берджи по бактериологии микроорганизм назван Bordetella bronchiseptica (Breed, 1957). Однако до изучений R. Johnson и Р. Н. Sneath (1973) и D. А. Bemis (1977) микроорганизм плохо дифференцировали от некоторых членов родов Acinobacter, Achromobacter, Alcaligenes, Pseudomonas и Brucella.

Рис.1. Виды бордетелл

Таксономическое положение бактерий рода Bordetella

В настоящее время данный микроорганизм входит в состав рода Bordetella, относящегося к семейству Alcaligenaceae [З-Протеобактерий (Characterization of Unusual..., 2002). Этот род объединяет 8 видов бордетелл: В. avium, В. bronchiseptica, В. parapertussis, В. pertussis, В. hinzii, В. holmesii, В. trematum (Goodnow, 1980; Comparative analysis of..., 2003) и В. ansorpii (New species of..., 2005).

У собак инфекцию вызывает только В. bronchiseptica, находящаяся в тесном родстве с В. pertussis и В. parapertussis (Datz, 2003). Анализ генома показал, что 2 последних вида являются ветвями В. bronchiseptica (Molecular evolution and..., 1997; Comparative analysis of..., 2003; Bordetella pertussis, the..., 2005), приспособивши-мися к паразитированию в организме человека. Большая часть бордетелл проявляет тропизм к респираторному тракту: В. pertussis и В. parapertussis вызывают коклюш у человека (Bordetella pertussis, the..., 2005), В. bronchiseptica - трахеоброхит у собаки и изредка человека, В. avium и В. hinzii - сходное заболевание у птиц и в редких случаях человека, а В. ansorpii была выделена из гнойного экссудата эпидермальной кисты полости носа (New species of..., 2005). Остальные виды лишены такого тропизма и способны вызвать инфекцию других органов и тканей: В. holmesii - бактеримию, В. trematum - отит и раневую инфекцию человека (Bordetella avium sp..., 1984; Pittman, 1984; Bordetella hinzii sp..., 1995; Bordetella holmesii sp..., 1995; New species of..., 2005).

1.2. Распространение, источники заражения, факторы передачи

В. bronchiseptica

Н. Elliott (1991) описал первый случай острой респираторной болезни, связанной с бордетеллёзной инфекцией, произошедший в Великобритании в колониях уличных кошек.

Затем бордетелла была выделена у породистых кошек во время вспышки острых респираторных болезней (Seroprevalence and isolation..., 1994; Isolation and characterization..., 1998). Клинические обследования породистых кошек в Великобритании и США показали, что инфекция, вызванная бордетеллой, широко распространена. При лабораторном исследовании домашних кошек бордетелла была выделена у 26 из 527 котов (4,9 %), в Великобритании и 19 из 614 котов (6,1 %) в США (Seroprevalence and isolation..., 1994; Isolation and characterization..., 1998). Серологические исследования показали, что 91 из 126 котов (72 %) в Великобритании и 148 из 614 котов (24,1 %) в США имели антитела к В. bronchiseptica (Seroprevalence and isolation..., 1994; Characterization of antibiotic..., 1997). Инфицирование котят происходит в 7-10 недельном возрасте. После выздоровления кошки являются носителями еще 19 недель. При исследовании кошек в Великобритании авторами установлено бордетеллоносительство у 3-11 % исследуемых животных. Прослежена передача инфекции от кошек другим животным, в частности собакам (Seroprevalence and isolation..., 1994; Characterization of antibiotic..., 1997; Feline bordetellosis: prevalence..., 1999).

У собак бордетеллёз регистрируется с рождения и до годовалого возраста. Заболеваемость в этой группе может достигнуть 100 % (Bemis, 1977). В случаях смешенной инфекции возбудитель может наблюдаться более чем у 75 % животных (McGowan, 1911; Ferry, 1912; Winsser, 1960).

Много инфицированных животных болеют асимптомно. H.D. Snow (1969) выделял бордетеллу из носовых ходов 10 из 80 собак с бессимптомным течением болезни и у 9 из 25 собак с поражениями респираторного тракта.

1.3. Биологические свойства возбудителя Тинкториалъные свойства

Возбудитель - В. bronchiseptica -овоидная, коккобациллярная палочка, размером 0,2-0,3 х 0,5-1,0 мкм, спор не образует. Располагаются одиночно, парами, редко короткими цепочками. В. bronchiscptica подвижна за счет перитрихиально расположенных жгутиков, которые перестают образовываться при переходе бактерии в вирулентную фазу {Bordetella..., 2005; Bordetella., 2007).

Из-за невозможности выявить капсулу В. bronchiseptica обычно применяемыми для этого методами окраски в течение 80 лет эту бактерию считали безкапсульной. С помощью элект