Молекулярно-биологическая характеристика Bordetella pertussis, циркулирующих в период подъема заболеваемости, и совершенствование лабораторной диагностики коклюша

Курова, Наталия Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-биологическая характеристика Bordetella pertussis, циркулирующих в период подъема заболеваемости, и совершенствование лабораторной диагностики коклюша
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая характеристика Bordetella pertussis, циркулирующих в период подъема заболеваемости, и совершенствование лабораторной диагностики коклюша"

На правах рукописи

КУРОВА Наталия Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА BORDETELLA PERTUSSIS, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ПЕРИОД ПОДЪЕМА ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ, И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КОКЛЮША

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Ценева Галина Яковлевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Савичева Алевтина Михайловна

доктор медицинских наук, профессор Бойцов Алексей Геннадьевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная

педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « » февраля 2004 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.001.022.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. И.П. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Л.А. Бурова

2004-4 26946

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

»1

Актуальность проблемы. Коклюш относят к числу управляемых инфекций. Уже в 1923 г. Madsen предпринял первую попытку вакцинации против коклюша, но достиг лишь снижения тяжести заболевания у привитых. Широкое применение противококлюшных прививок в результате создания эффективной вакцины стало возможным лишь в 50-е годы. Это позволило существенно снизить заболеваемость и предупредил, летальные исходы. Тем не менее, массовая вакцинация не решила всех проблем, связанных с данной инфекцией. В настоящее время даже в странах с высоким (95 % и более) уровнем привитости детей отмечаются вспышки заболевания, не связанные с естественным эпидемическим циклом. По данным ВОЗ в 2000 г. коклюш был зарегистрирован в 37 странах Европы из 51, в то время как в 1999 г. - в 31 стране. Наибольшее число заболеваний зарегистрировано в Нидерландах, Норвегии и Швеции. Еще раньше, в начале девяностых годов XX века, подъем заболеваемости отмечался также во Франции, Финляндии, США, Австралии (Bass J.W. et al., 1994; de Melker H.E. et al., 1997; Mooi F.R. et al., 1998; Baron S. et al., 2000). В нашей стране обязательная вакцинация детей позволила снизить заболеваемость в десятки раз. Если в 1958 г ее показатель в Ленинграде составил 710 на 100 тыс. населения, то к 1973 г. его удалось снизить до 18,8; летальность практически не регистрировалась. Однако в начале 90-х годов в результате необоснованно возросшего числа медицинских отводов детей от прививок вновь возник резкий подъем заболеваемости коклюшем; ее максимальный рост наблюдался в 1фупных городах РФ, в том числе в Санкт-Петербурге. Пик эпидемического подъема заболеваемости коклюшем отмечен в 1994 г., ее показатель составил 32,6 на 100 тыс. населения в РФ, а в Санкт-Петербурге - 143,2. В настоящее время в Санкт-Петербурге показатель привитости возрос и составил в 2002 г. 88,6 %, однако заболеваемость в 4 раза превышает среднереспубликанскую. Одной из проблем современного периода является вовлечение в эпидемический процесс привитых детей. По данным детской больницы № 5, в 2001-2002 тт. в Санкт-Петербурге среди госпитализированных больных привитые составили 38,9 %. Учитывая возрастающую тенденцию распространения коклюша среди привитых детей, встал вопрос о необходимости изучения генетических мутаций, и, как следствие, изменения биологических свойств В. pertussis, произошедших за период с начала проведения вакцинопрофилакгаки, что может являться причиной снижения эффективности вакцинации. С помощью молекулярно-генетических методов иностранными исследователями было показано, что популяция В. pertussis имеет клональную структуру, и в годы, последовавшие за введением вакцинации, происходила клональная экспансия штаммов, отличных по профилям

ДНК от довакцинальных (van Loo I.H.M. et al., 1999). Появление новых профилей ДНК в 80-е годы совпало с ростом заболеваемости в ряде стран. Выявлены также изменения в структуре генов, кодирующих синтез основных токсинов и адгезинов В. pertussis (Mooi F.R. et al., 1998, 1999; Mastrantonio P. et al., 1999; Weber C. et al., 2001). Однако аналогичные исследования по изучению возможных генетических различий у «диких» и вакцинных штаммов в России не проводились.

«Золотым стандартом» диагностики коклюшной инфекции остается бактериологическое исследование, при котором окончательный ответ выдается через 5-7 суток. Однако подтверждаемость диагноза этим методом не превышает 25 %, что обусловлено рядом причин, в том числе его недостаточной эффективностью. В этой связи актуальным представлялся поиск путей повышения эффективности существующего метода бактериологической диагностики, а также разработка экспресс-метода для ускоренного обнаружения возбудителя коклюша.

Цель исследования: Охарактеризовать геномный полиморфизм В. pertussis различного происхождения и повысить эффективность методов обнаружения возбудителя коклюша.

Задачи исследования:

1.' Повысить эффективность бактериологического исследования и разработать иммуноферментную тест-систему для ускоренного обнаружения возбудителя коклюша.

2. Изучить молекулярно-биологические свойства В. pertussis, циркулирующих в Санкт-Петербурге в условиях вакцинопрофилакгики.

3. Установить значение штаммов В. pertussis различных генотипов в увеличении числа заболеваний среди привитых.

4. Определить сходство и различия между штаммами В. pertussis, циркулирующими на территории изучения, и вакцинными.

Научная новизна работы. Впервые в России в результате применения методов электрофореза в пульсирующем поле (ЭФПП) и секвенирования выявлены мутации в геноме В. pertussis и установлен генетический полиморфизм популяции возбудителя коклюша.

Выявлены молекулярно-генетические различия «диких» и вакцинных штаммов В. pertussis.

Показано, что штаммы генотипов IVa и IVp по частоте циркуляции преобладают на территории изучения; установлена их связь с ростом заболеваний среди привитых.

Впервые установлена генетическая неоднородность популяции В. parapertussis ,

новый вариант гена пертактина В. parapertussis 1.4а/2.8е зарегистрирован в GenBank, регистрационный номер AJ542533.

Разработана иммуноферментная тест-система для выявления возбудителя коклюша с использованием IL 1(3 в качестве иммуностимулятора для получения гипериммунных сывороток с высоким содержанием специфических антител.

Практическая значимость. Штаммы В. pertussis и В. parapertussis новых генотипных вариантов предложены в качестве тест-штаммов для мониторинга за бордетеллами и технологических целей.

Штамм В. pertussis 1.0.3 № 45 принят на депонирование в коллекцию ГИСК им. JIA Тарасевича в качестве тест-штамма для определения профиля штаммов В. pertussis методом ЭФПП (группа IVa), для секвенирования гена пертактина (тип 2) и гена S 1-субъединицы коклюшного токсина (тип А). Штамму присвоен номер 272. Справка от 15.09.03 № 01-33/3.

Штамм В. parapertussis № 34 принят на депонирование в ГИСК им. Л.А. Тарасевича в качестве тест-штамма для секвенирования гена пертактина В. parapertussis, штамму присвоен номер 271. Справка от 15.09.03 № 01-33/2.

Штамм-продуцент гипериммунной антикоклюшной сыворотки В. pertussis 1.0.3 № 35 был принят на депонирование в коллекцию ГИСК им. Л.А. Тарасевича, ему присвоен номер 273. Справка о депонировании охраноспособного штамма от 15.09.03 № 01-33/4. Штамм может быть использован в производстве препаратов для диагностики коклюша.

Опыт оптимизации бактериологического исследования апробирован в ходе семинара «Эпидемиологический надзор за дифтерией и коклюшем в условиях вакцинопрофилактики», организованного Европейским региональным бюро ВОЗ 1921.11.2003 г., г. Санкт-Петербург.

Изданы Методические рекомендации «Коклюш у привитых детей (клиническая и лабораторная диагностика)», утвержденные Комитетом по здравоохранению Администрации Санкт-Петербурга 18.09.2003.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Дополнительные факторы роста в питательных средах в сочетании с цефалексином и тест-система для ИФА существенно повышают эффективность лабораторной диагностики коклюша. 2 Популяция штаммов В. pertussis, циркулирующих в условиях вакцинопрофилактики, неоднородна по ЭФПП-профилям и структуре гена пертактина.

3. Определены различия между «дикими» и вакцинными штаммами В pertussis по ЭФПП-профилям, структуре генов пертакгина и S1-субъединицы коклюшного токсина.

4. Штаммы генотипов IVa и IVß преобладают в популяции В. pertussis, циркулирующей на территории изучения; показана их связь с заболеваниями у привитых.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области в 2001, 2002 гг ; Научной конференции Итало-Российского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине» (г. Санкт-Петербург, 2002 г.); Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2003 г); научных симпозиумах международной сети институтов Пастера (Париж, Франция, 1999 г.; Хошимин, Вьетнам, 2002 г.). Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Министерства здравоохранения Российской Федерации» 24.12.2003.

По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи; аналитический обзор «Инфекционная заболеваемость в Северо-Западном Федеральном округе России Совершенствование технологий эпидемиологического надзора и профилактики», г Санкт-Петербург, 2001 г.; Методические рекомендации «Коклюш у привитых детей (клиническая и лабораторная диагностика)», г Санкт-Петербург, 2003; 8 тезисов.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы и список литературы. Список литературы включает 151 источник, в том числе 17 - отечественных авторов и 134 - зарубежных. Работа иллюстрирована 26 таблицами, 11 рисунками.

Бактериологические исследования выполнены совместно с H.H. Зверякиной (ЦГСЭН в Выборгском районе Санкт-Петербурга), молекулярно-генетичсские исследования - совместно с N. Giriso, V. Саго, С. Weber (Institut Pasteur, Paris, France), анализ эпидемиологических данных - совместно с В.Л. Семиотрочевым (Западный

межрайонный ЦГСЭН в Санкт-Петербурге), анализ историй болезни - совместно с И.В. Бабаченко (Санкт-Петербургская педиатрическая медицинская академия).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы. За период 1998-2003 гг. изучено 194 штамма1, в том числе 115 штаммов В. pertussis и 10 штаммов В. parapertussis, выделенных в Санкт-Петербурге в указанный период, 2 штамма В. pertussis и 3 штамма В. parapertussis, изолированных в России в 1960-1965 it., 1 штамм В. pertussis, выделенный в 1989 г., а также 4 штамма, используемые при производстве отечественной вакцины АКДС (штаммы получены из коллекции ГИСК им. JI.A. Тарасевича). В работе использованы: эталонный штамм ВОЗ В. pertussis № 18323 для контроля эффективности коклюшных вакцин, полученный из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича; референс штаммы В. pertussis для электрофореза в пульсирующем поле, полученные из коллекции Unite des Bordetella (Centre National de Reference des Bordetelles), Institut Pasteur, 25, rue du Dr Roux, Paris, France; эталонные штаммы В. pertussis № 39, 79, 143 для контроля качества питательных сред, полученные из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Выделение и первичная идентификация бордетелл го клинического материала проводилась в бактериологических лабораториях центров Госсанэпиднадзора, бактериологической лаборатории детской инфекционной больницы № 3 и детской городской больницы № 5, лаборатории бактериальных капельных инфекций НИИЭМ им. Пастера. В качестве сред для выделения бордетелл при сравнительном анализе использовали: казеиново-угольный агар (КУА) производства Научно-исследовательского института вакцин и сывороток (НИИВС), г. Санкт-Петербург; КУА производства научно-исследовательского технологического института антибиотиков и ферментов медицинского назначения, г. Санкт-Петербург; бордетелагар производства Государственного научного центра прикладной микробиологии, пос. Оболенск, Московская обл. В качестве дополнительных факторов роста использовали сыворотку крупного рогатого скота и питательную среду 199 производства БиолоТ, г. Санкт-Петербург, в качестве ингибитора роста сопутствующей микрофлоры - пенициллин производства ЗАО «Брынцалов А», г Москва, и Bordetella selective supplement (цефалексин), Oxoid, England. Идентификацию В. pertussis и В. parapertussis с определением кулыурально-биохимических свойств проводили на основании общепринятых морфологических и

1 Выражаем благодарность врачам-бактериологам центров Госсанэпиднадзора Выборгского. Красносельского. Кировского, Калининского. Фрунзенского районов, городского лабораторного центра ГСЭН в Санкт-Петербурге, предоставившим культуры для изучения. РГТ Чупрынииой (ГИСК им Л А Тарасевича) - за предоставление вакцинных и эталонных штаммов

биохимических тестов в соответствии с «Инструкцией по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше» (МЗ СССР, 1984 г.) Получение антигена и иммуноглобулиновых фракций проводили по методике, описанной Куляшовой Л.Б. (1989 г). Для получения гипериммунной сыворотки использовали схему иммунизации кроликов (Носков Ф.С с соавт, 1970 г.) с модификациями. Получение коньюгата производили перйодатным методом (Накане и Каваои, 1974 г.).

Реакцию агглютинации проводили макрометодом по общепринятой методике Для постановки использовали 72 - луночные планшеты производства «Медполимер», г. Санкт-Петербург. При проведении диагностических исследований использовали «Диагностикум коклюшный жидкий для РА» и «Диагностикум паракоклюшный жидкий для РА» производства АООТ «Биомед» им. И.И. Мечникова, с. Петрово-Дальнее, Московская обл.

Для проведения диагностических исследований методом ПЦР использовали коммерческую тест-систему ДиаГсн-BordeteIla pertussis производства лаборатории генно-инженерных систем «Лагис», г. Москва. Постановку осуществляли согласно инструкции производителя.

Постановку ЭФГТП проводили по методике, описанной Mooi F.R. et al. (2000) Материалом для исследования служили 2-3-суточные культуры бордетелл Бактериальную суспензию, содержащую 109 м к./мл, смешивали в равном объеме с 1 % раствором агарозы, охлажденным до 40 °С, затем смесь заливали в форму и охлаждали до застывания Полученные образцы («брикеты») обрабатывали лизирующим буфером, содержащим ЭДТА, саркозил и протеиназу К, затем отмывали ТЕ IX буфером. Для рестрикции образцы инкубировали с буферным раствором, содержащим 20 единиц рестриктазы Xbal или SpeI, реакцию останавливали добавлением ЭДТА. Для проведения ЭФГТП использовали аппарат CHEF DR ГО (BioRad, USA) Электрофорез проводили в 1 % агарозном геле, при температуре 16 °С, в качестве буфера для электрофореза использовали 0,5Х ТВЕ буфер. Режим проведения ЭФПП после обработки ДНК В. pertussis рестриктазой Xbal: 5-6 сек, 5,5 В/см, 16 часов, затем 8-35 сек, 5,5 В/см, 24 часа. Режим для SpeГ 15-45 сек, 5,5 В/см, 28 часов, затем 60-90 сек, 5,5 В/см, 12 часов. Для образцов ДНК В. parapertussis (после рестрикции как Xbal, так и SpeI) ЭФПП проводили в режиме: 8-30 сек, 6,8 В/см, 22 часа. После завершения электрофореза гель окрашивали бромидом этидия и просматривали в УФ свете. Для оценки полученных результатов в гель вносили, помимо исследуемых образцов, не менее трех референс-пггаммов и стандартный маркер для ЭФПП (лямбда-фаг, рестрицированный Hind III) на каждые 6 образцов.

Секвенирование участков гена пертактина (ргп) проводили по методике, описанной Mooi F.R. et al. (2000). Материалом для исследования служили 2-3-суточные культуры бордетелл. Готовили бактериальную суспензию, кипятили на водяной бане 15 мин, охлаждали на льду, затем супернатант разводили IX ТЕ буфером pH 8,0 и использовали для постановки ПЦР. Для амплификации участка 1 (570 п.н.) использовали праймеры AF (GCCAATGTCACGGTCCAA) и AR (GCAAGGTGATCGACAGGG), для участка 2 (534 п.н.) - праймеры BF (AGCTGGGCGGTTCAAGGT) и BR (CCGGATTCAGGCGCAACTC) Постановку ПЦР проводили на амплификаторе Omni Gege Hybaid, Middlesex, UK. Продукты ПЦР выявляли методом электрофореза в агарозном геле, затем их очищали с помощью Qiaquick PCR purification kit (Westburg Hilden, Germany). Секвенирование полученных продуктов проводили с использованием Big dye terminator cycle sequencing ready reaction kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) в 377 ABI DNA sequencer (РЕ Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с ранее опубликованными в базе данных Swiss-Prot Секвенирование гена S1 -субъединицы коклюшного токсина проводили по методике, аналогичной секвенированию гена пертактина. Амплификацию фрагмента размером 930 п.н, содержащего полный ген ptxSl, проводили с праймерами S1-F2 (CCCCCTGCCATGGTGTGATC) И S1-R2 (AGAGCGTCTTGCGGTCGATC).

Анализ полученных электрофоретических паттернов, построение дендрограмм проводили, используя neighbor-joining method (Saitou N et Nei M., 1987), включенный в пакет программ Taxotron (Institut Pasteur, Paris, France) (Grimont P., 2000), GelCompar (Applied Maths В VBA, Belgium). Статистическую обработку данных проводили в соответствии с правилами вариационной статистики (Урбах В.Ю., 1975) путем вычисления для полученных параметров средней величины (М), среднего квадратического отклонения (8) и средней ошибки средней величины (m). Оценку достоверности различий сравниваемых средних проводили с помощью критерия Стъюдента. Значения фактора достоверности определяли по таблице вероятности. Разность результатов считали статистически значимой при р<0,05. Оценку чувствительности и специфичности иммуноферментной тест-системы рассчитывали по формулам, приведенным Domeika M. (1994). Истинно положительным считали положительный результат, полученный при исследовании бактериологическим и/или двумя другими различными методами.

Чувствительность = ИП/ (ИП + ЛО) х 100 %

Специфичность = ИО/ (ИО + ЛП) х 100 %,

где: ИП - истинно положительный результат

ИО - истинно отрицательный результат ЛП - ложно полежитеданый результат ЛО - ложно отрицательный результат

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯМ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Усовершенствование методов обнаружения бордетелл. Одной из важных проблем, связанных с диагностикой коклюшной инфекции, является низкая эффективность бактериологического метода - регламентированного и широко используемого практическими лабораториями. Для повышения эффективности метода использованы ростовые добавки в питательные среды и ингибитор посторонней микрофлоры, ранее не применявшийся в отечественной практике. В предварительных опытах было установлено, что, в отличие от КУА, на бордетелагаре, предлагаемом в -настоящее время отечественной промышленностью, выросшие колонии В. pertussis имели наиболее характерную морфологию и больший размер.

Таблица 1

Чувствительность сред разного состава при посеве 50 м.к. Bordetella pertussis

Вариант Факторы роста Объем на 100 мл среды Чувствительность сред (% высева)

КУА бордетелагар

I Кровь 10мл 0 38

Ы Кровь АБ* Юил 30МЕ 0 0

Ш Кровь Среда 199 9мл 1 мл 36 50

IV Кровь Среда 199 АБ 9мл 1 мл 30 МЕ 34 46

V Кровь Среда 199 СКРС** 4 мл 1 мл 5 мл 40 60

VT Кровь Среда 199 СКРС АБ 4 мл 1 мл 5 мл 30 МЕ 38 60

АБ - пенициллин; СКРС - сыворотка крупного рогатого скота

Для повышения чувствительности питательных сред применены

различные факторы роста (табл. 1). Установлено, что добавление в среду крови человеческой дефибринированной (регламентировано «Инструкцией по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше», Москва, 1984 г.) давало низкие результаты (до 38 % выросших колоний), максимальная выееваемость В pertussis (60 %) была достигнута при добавлении к питательной среде сыворотки крупного рогатого скота и среды 199 дтя культуры клеток. Было отмечено также, что пенициллин, используемый в качестве

ингибитора посгорошгей микрофлоры при проведении бактериологического исследования, подавляет рост В. pertussis в низких концентрациях (10~5 - 10"7). Для установления возможности снижения инпибирующего влияния антибиотика на рост бордетелл были проведены эксперименты с высевом В. pertussis в разведениях 5х109-5х103 м.к./мл на среды с добавлением регламентированного (30 МЕ/10 мл среды) и уменьшенных (10 и 20 МЕ/100 мл среды) количеств пенициллина, а также цефалексшга, используемого с той же целью в мировой практике (Gilchrist M.J.R., 1991). Было показано, что пенициллин в дозе, уменьшенной в 3 раза (10 МЕ/100 мл среды), как и цефалексин в концентрации 4 мг/100 мл среды, не оказывал в эксперименте ингибирующего действия на рост В. pertussis. При сравнительных рутинных бактериологических исследованиях с добавлением в бордетелагар вышеуказанных антибиотиков было показано, что наибольшая высеваемость получена при использовании цефалексина. Применение в текущей работе одного из районных ЦГСЭН Санкт-Петербурга бордетелагара в сочетании с рекомендованными нами ростовыми факторами (вариант V, см. табл. 1) и цефалексином, позволило повысить бактериологическую подтверждаемостъ коклюша в 7 раз.

Длительность бактериологического исследования (5-7 суток) при выделении возбудителя коклюша обусловила необходимость разработки ускоренного (ИФА) метода диагностики инфекции. Для конструирования иммуноферментной тест-системы после предварительных исследований был выбран штамм В. pertussis, обладающий выраженной антигенной и иммуногенной активностью, который использовали в качестве производственного для получения гипериммунных сывороток. Для достижения максимального эффекта иммунизации было испытано несколько вариантов ведения корпускулярного антигена: 1 - в сочетании с ппштм адыоваигом Фрейнда, 2-е интерлейкином 1р, 3 - без иммуномодуляторов. Для разработки технологии приготовления тест-системы выбрана оптимальная схема иммунизации с дополнительным введением IL ip. Из сывороток был получен пул иммуноглобулинов с последующим его фракционированием. Контроль активности и специфичности полученных фракций показал, что все фракции были специфичны, но максимальной активностью обладала бессолевая фракция, содержащая Ig G, из которой был изготовлен коньюгат. Полученная тест-система обладала чувствительностью 104 м.к./мл и была строго специфична по отношению к представителям других родов бактерий, населяющих зев и носоглотку. В последующих модельных опытах установлено, что технология приготовления коньюгатов из сывороток, полученных на комплекс антигена с IL 10, может

рассматриваться как производственная и может бьггь рекомендована для внедрения в практику.

В связи с поздним установлением диагноза и госпитализацией больных коклюшем изучить диагностическую эффективность тест-системы на ранних сроках болезни в клинических условиях не представлялось возможным. Для изучения возможности применения иммуноферментной тест-системы в диагностических целях у больных в поздние сроки заболевания было проведено обследование 112 детей с клинической картиной коклюша

Рисунок 1. Эффективность различных методов диагностики коклюша при обследовании больных на поздних сроках заболевания (4 и более недели).

Параллельно материал от больных был обследован бактериологическим методом и ПЦР (рис 1). Для определения титра антикоклюшных антител были исследованы парные сыворотки в РА. По сумме методов диагноз был подтвержден у 65 детей (58 %), из них в ИФА получено 32,3 % положительных результатов - в 2 раза больше, чем бактериологическим методом (16,9 %, различия статистически значимы, р0,05). Чувствительность тест-системы составила 72,4 %, специфичность - 100 % Таким образом, разработанная тест-система является чувствительным и специфичным препаратом, предназначенным, в первую очередь, для диагностики коклюша на ранних сроках заболевания, однако, как показали наши «полевые» исследования, ее применение возможно также в период судорожного кашля Несмотря на большую результативность ПЦР, полученные характеристики тест-системы обосновывают целесообразность разработки ее промышленной технологии. На данном этапе ее

применение более экономичное, простое и доступное практическим лабораториям любой категории.

Молекулярно-эпидемиологическая характеристика штаммов В. pertussis.

Впервые в России были проведены молекулярно-генетические исследования штаммов В. pertussis Они были обусловлены необходимостью выяснения причин роста числа заболеваний коклюшем среди привитых на фоне повышения охвата детей вакцинацией. Подавляющее большинство составили штаммы, циркулировавшие в Санкт-Петербурге в период подъема заболеваемости (1998-2000 гг.), а также выделенные в России в 60-е годы, то есть в начале периода вакцинопрофилактики, и штаммы, используемые при производстве вакцины ЛКДС. При исследовании штаммов методом ЭФПП было установлено, что один вакцинный штамм В pertussis и штамм, выделенный в 1965 г., относятся ко II ЭФПП-группе, в которую относят также многие штаммы, выделенные в довакцинальную эру в ряде европейских стран. Три других вакцинных штамма, штамм № 973 60-х годов, штамм, выделенный в 1989 году, и 21 пггамм, выделенный в 1998-2000 гг, были включены в Ш группу, в которую относены также штаммы, выделенные в других странах как в довакцинальную эру, так и после начала всеобщей вакцинации. IVa, IVß и V группы составили только современные штаммы (рис. 2).

При секвенировании гена S1-субъединицы коклюшного токсина вакцинных штаммов В. pertussis, штаммов, выделенных в 60-е годы и 36 штаммов, выделенных в 1998-2000 гг. (табл. 2), было установлено, что вакцинный штамм № 475 и штамм № 400, выделенный в 60-е годы, обладают ptxSl типа D, три остальных вакцинных штамма и штамм № 973, выделенный в 60-е годы, содержат ptxS1 типа В, в то время как все 36 исследованных данным методом штаммов, выделенных в 1998-2000 гт, обладали ptxSl типа А. Эти результаты, характеризующие изменчивость гена S1-субьединицы коклюшного токсина отечественных штаммов, полностью совпадают с данными исследователей других европейских стран (Mooi F.R. et al, 1998, 1999; Mastrantonio P et al, 1999; Weber C. et al, 2001), согласно которым 90-100 % штаммов, циркулировавших в 80-90-е годы, содержат аллель ptxSl А, в то время как штаммы довакцинальиой эры и выделенные в 60-е годы содержат аллели В и D.

При секвенировании гена пертакпша (табл. 3) было установлено, что все вакцинные штаммы, штаммы 60-х годов содержат кодирующую последовательность пертакпша 1 типа. Из 67 современных штаммов аллель гена пертактина был секвенирован у 32 штаммов: ргп\ обнаружен у 13 штаммов, рт 2 - у 15 штаммов, ргп 3 - у 4 штаммов (PRN 1, PRN 2, PRN 3, см. табл. 3).

Genetic Distance PFGE group

OS 04 03 02 01 0

m v

4T~

rV0

IV P

1 illl 1 1 1

11 n 1 1

I m/ i i 1

i 11 1 1 1

ii ii 1 1 1

11 M 1 1 1

i III 1

ii a i 1

i HI i 1

i ii i 1

ii 1 > 1

ii i i 1

i JIII II 1

M ill«

i ii i 1

i SI 1 1 1

11 ii) i 11

n1 i ii m 1 1

1« i HI II

iiii 1

1 h n ii t 1

1 1 HI t 1

1 1 1 h 1 1 1

1 1 1 II 1 11

1 H B 1 1 1

1 It II 1 1

i 1 II u 1

ii h II 1

t inn ii 1

1 Kill 1 1

1 HfH 1

1 mil» 1

1 hill 1

1 1 1 11 1 1

1 l 1 m 1 1

1 1 • ii 1 1

1 1 I II i

1 1 II 1 1

1 iii ii 1

1 III 11 1 1

i 1 H M 1 1

I 1 II 11 1 1

i i "HI 1

1 < N II H 1

11 II II 1 1

1 1 II 1 1

1 Ml 1 ■ 1

1 II 1 1 1

1 1 II II B 1

1 III III

1 I 1 1 ii 1 1

1 t ill 1 1 1 1 1

mill

1 1 nil 1

1 1 11(11 I

1 1 IIII 1

1 i Illl 1

1 1 till 1 1

1 1 IIII 1 1

t 1 nil 1 1

1 11 iii 11 )

1 1 till l 1

1 1 Illl n 11 1

1 1 iiii 1

1 1 lilt 1 1

J 1 illl 1 1

1 1 illl 1 1

1 1 IIIf 1 1 ,

PncyHOK 2. iJeH^porpaMMa h 30im-npo$HJiH HccjieflOBaHHHx nrraMMOB B. pertussis.

Таблица 2

Варианты участков гена S1-субъединицы коклюшного токсина

Вариант гена Секвенированные участки гена

196-210 679-695

А GTG СТС GAC* САТ CTG D** CGC ATA GCG CCG GTG АТА I I

В ..G М

D ..А Е G G.G М V

* - нуклеотид, подвергшийся замене

** - аминокислота, кодируемая данным триплетом

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что у штаммов В. pertussis, циркулирующих в Санкт-Петербурге, отмечается в целом аналогичная тенденция изменения генетической структуры наблюдаемой в других географических регионах мира с сорокалетней историей вакцинопрофилактики против коклюша. Однако нами выявлены некоторые особенности, отличающие отечественные штаммы от зарубежных. Так, 31 % штаммов, выделенных в 1998-2000 гг., были отнесены к Ш ЭФПП-группе (во Франции -2%) Кроме того, генрт 1 типа, характерный для штаммов довакцинальной эры и 60-х годов, обнаружен у большего числа штаммов (41 %), циркулирующих в Санкт-Петербурге, в то время как аналогичный вариант гена пертактина выявлен в Нидерландах, Финляндии и Италии у 13, 7 и 6 % штаммов соответственно. Возможной причиной менее выраженной изменчивости современных штаммов в Санкт-Петербурге в сравнении с зарубежными может быть низкий уровень охвата иммунизацией детей в начале девяностых годов, что, надо полагать, способствовало более широкому распространению штаммов, совпадающих по вышеуказанным генетическим характеристикам с вакцинными. Все десять штаммов, выделенных в 1998-2000 гг., изученных методом секвенирования и отнесенных к группе IVß, содержали ген рт 2 типа (по данным французских исследователей, все штаммы IV группы также содержали рт 2 типа). Принимая во внимание данные С. Weber et al (2001) о том, что во Франции в последнее десятилетие происходит постепенное снижение доли штаммов группы IVa при одновременном нарастании числа штаммов группы IVß, а также тот факт, что в исследуемой нами группе IVa почти половина штаммов содержит ген рт 1, можно предположить, что эта группа является переходной Эти данные указывают на необходимость дальнейшего мониторинга за возбудителем коклюша.

С целью установления возможного влияния биологических свойств В pertussis. в частности, выявленных различий в генетической структуре, на развитие

инфекционного и эпидемического процессов, особенно у вакцинированных, были сопоставлены ЭФГТП-группы штаммов с основными характеристиками их источников Сопоставление клинических данных и вакцинального статуса обследованных детей с ЭФПП-профилями выделенных от них штаммов представлено на рисунке 3. Установлена взаимосвязь между принадлежностью штаммов к ЭФПП-группам и характером их взаимоотношений с макроорганизмом. Так, штаммы IV группы были изолированы в 83-85 % случаев от больных, между тем, штаммы Ш группы более чем в половине случаев выделены от контактных без клинических проявлений в очаге инфекции и лишь 47 % детей - источников этих штаммов заболели коклюшем

Рисунок 3. Сопоставление клинических данных и вакцинального статуса обследованных детей с ЭФПП-профилями выделенных штаммов.

Возможной причиной такого различия в этиологической значимости образовавших генетические группы штаммов является формирование за годы проведения вакцинопрофилактики коллективного иммунитета к штаммам, сходным по структуре с вакцинными.

При сравнении клинико-лабораторных данных между возрастными группами 46 и 7-10 лет также выявлены различия. В группе больных детей 4-6 лет чаще (в 33 % случаев) выделяли штаммы 1П группы; в целом по данной возрастной категории штаммы этой группы были изолированы от 52 % детей. В то же время в возрастной группе 7-10 лет только в 11 % случаев больные дети были источниками штаммов этой

ЭФГТП-груттпы (в делом по группе -14%) Аргументированного объяснения данному факту в настоящее время нет Однако можно предположить, что дети старшей возрастной группы оказались менее чувствительны к штаммам ГП группы. Возможно, что адаптация В. pertussis в результате длительной циркуляции в условиях прессинга вакцины сочеталась со снижением вирулентности у штаммов III группы.

Учитывая высокую степень сходства клинических проявлений коклюша и паракоклюша, а также широкую распространенность паракоклюшной инфекции в Санкт-Петербурге, регистрацию вспышечной заболеваемости этой инфекцией нам представлялось важным провести аналогичные молекулярно-генетические исследования штаммов В parapertussis. При изучении восьми штаммов, выделенных в 1998-2000 гг. и трех штаммов, выделенных в России в 60-е годы, было установлено, что популяция В. parapertussis однородна по ЭФПП-профилям. При секвенировании гена пертактина (табл. 3) установлено, что семь штаммов, выделенных в 1998-2000 г г., содержали нуклеотидную последовательность 1 4а/2.9Ь, идентичную описанной ранее зарубежными исследователями (Boursaux-Eude С. et al., 2000; Register К.В., 2001). В то же время штамм № 34 (год выделения - 1998) и все 3 штамма 60-х годов отличались по структуре последовательности, кодирующей иммунодоминантный участок 2, от описанных ранее штаммов В. parapertussis По номенклатуре этот новый вариант участка 2 был обозначен как 2.8е. Нуклеотидная последовательность гена пертактина В parapertussis 1 4а/2 8е зарегистрирована в GenBank, регистрационный номер AJ542533. На основании полученных данных можно предположить, что популяция В. parapertussis неоднородна. Вероятно, это не является следствием влияния вакцинопрофилактики, так как применение коклюшной вакцины оказалось неэфективным для защиты от В parapertussis (Khelef N. et al., 1993; Willems R.J.L. et al., 1998) Возможно, что в данном случае действуют другие факторы, которые предстоит расшифровать.

Таким образом, выявленный геномный полиморфизм штаммов В. pertussis, циркулирующих в современный период, и установленная его связь с ростом числа заболеваний может свидетельствовать об эволюционной изменчивости В. pertussis, осуществляемой под давлением вакцинопрофилактики путем накопления мутаций в геноме. Это обосновывает необходимость проводить динамическое слежение за возбудителем, в том числе в масштабах страны Практические рекомендации 1 Для повышения эффективности бактериологического метода диагностики коклюша целесообразно использовать бордетелагар в сочетании с СКРС, средой 199 и цефалексином в качестве ингибитора посторонней микрофлоры

Таблица 3

Варианты кодируемых геном пертактина аминокислотных последовательностей

Варианты участка 1

PRN1 GAVPG- - .............GAVPGGFGPGGFGPVLDGWYGVDVSGSSVELAQ

PRN2 GAVPG- - ........GFGPGGFGPGGFGPGGFGPVLDGWYGVDVSGSSVELAQ

PRN3 GAVPG-- .............GFGPGGFGPGGFGPVLDGWYGVDVSGSSVELAQ

1.3а GAVPG - - .......................GFGPLLDGWYGVDVSDSTVDLAQ

1.4а GAVPG - - ..................GAVPGGFGPLLDGWYGVDVSDSTVDLAQ

1.5а GAVPG-- .............GFDPGGFGPGGFGPVLDGWYGVDVSGSTVELAQ

1.8а GAVPGGFDPGGFGPGGFGPGGFGPGGFGPGGFGPVLDGWYGVDVSGSTVELAQ

Варианты участка 2

PRN1* POP..... ..........PQPPQP- - - QPEAP

2.6а PQPG---- .......PQPPQPPQPPQRQPEAP

2.6Ь POP..... .......PQPPQPPQPPQRQPEAP

2.8а PQPG---- PQPGPQPPQPPQPPQPPQRQPEAP

2.8е PQPG---- POP- PQPPQPPQPPQPPQRQPEAP

2.9а PQPGPQPGPQPGPQPPQPPQPPQPPQRQPEAP

2.9Ь PQPGPQP- PQP- PQPPQPPQPPQPPQRQPEAP

строение участка 2 идентично у штаммов В. pertussis с разными типами пертактина

2. Иммуноферментная тест-система для ускоренной диагностики коклюша обладает высокой чувствительностью, специфичностью и может быть использована как в ранние, так и в поздние сроки заболевания.

3. Методы ЭФПТТ и секвенирование являются наиболее информативными для типирования В. pertussis. Целесообразно включить их в систему динамического слежения за возбудителем коклюша в масштабах страны с использованием отечественных референс-штаммов.

Выводы

Повышение даашостической эффективности бактериологического метода в 7 раз достигается включением в питательную среду факторов роста: 5 % СКРС и 1 % среды J 99, и использованием цефалексина в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры.

Экспериментально обоснована и разработана оригинальная конструкция тест-системы иммуноферментной для ускоренной диагностики коклюша. Показано, что этот препарат обеспечивает чувствительность анализа при определении В. pertussis в биологическом материале на уровне 104 м.к./мл. Популяция штаммов Я pertussis, циркулирующих в Санкт-Петербурге, характеризуется молекулярно-генетической неоднородностью по ЭФПП-профилям и структуре гена пертактина.

Установлены молекулярно-генетические различия «диких» и вакцинных штаммов. Среди циркулирующих штаммов 62 % имеют ДНК-профили IVa и IVß, вакцинные штаммы - профили П и 1П.

Установлена связь циркуляции штаммов с ДНК-профилями IVa и IVß с заболеваниями коклюшем среди привитых. Они обнаруживались у больных в 85 % случаев, штаммы профиля Ш -в 47 % случаев.

Определение изменчивости бордетелл молекулярно-генетическими методами (ЭФПП и секвенирования) с использованием референс-штаммов может быть использовано для целей мониторинга за возбудителем коклюша. Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи:

К вопросу о повышении эффективности бактериологического метода диагностики коклюшной инфекции// Клиническая лабораторная диагностика.- 2002 - № 2 - С 44-45 (Соавт • Зверякина Н Н., Ценева Г Я, Лосева Л В , Курова Г А, Лямина В П ) Эпидемиологическая ситуация по коклюшу на территории Красносельского района г Санкт-Петербурга// EpiNoith.- 2003- V 4- № 1- Р 9-13 (Соавт Антипов В.Н, Семиотрочев В Л, Целикова Н Б , Ценева Г Я )

Comparison of the Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis isolates circulating in Saint Petersburg in 1998-2000 with the Russian vaccine strains// J Clin Microbiol - 2003 - V

41 - № 8 - Р 3706-3711 (Соавт Саго V, Weber С , Thiberge S , Chuprinina R, Tseneva G, Guiso N.).

4. Микробиологическая характеристика возбудителя коклюша, лабораторная диагностика коклюшной инфекции на современном этапе (литературный обзор)// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия - Т 5,-№4-С 329-341 Учебно-методические издания:

1 Аналитический обзор «Инфекционная заболеваемость в Северо-Западном Федеральном округе России. Совершенствование технологий эпидемиологического надзора и профилактики» - Санкт-Петербург, 2001,- 144 с. (Соавт. Жебрун А.Б., Мукомолов С.Л, Лялина Л.В. и др )

2. Методические рекомендации для врачей-педиатров, инфекционистов, бактериологов «Коклюш у привитых детей (клиническая и лабораторная диагностика)».- Санкт-Петербург, 2003 - 20 с. Утверждены Комитетом по здравоохранению Администрации СПб 18 09.2003 (Соавт Ценева Г.Я, Тимченко В H, Бабаченко И В , Каплина Т А., Иванькович В. А, Лосева Л В, Липатова Л.В.). Тезисы:

1 Pertussis infection in St-Petersburg Current trends// Recueil des resumes Colloque Scientifique du Reseau International des Instituts Pasteur et Instituts associes - Paris, France, 1999.- P. 21. (Соавт Tseneva G., Loseva L.)

2 Homology of arbitrarily amplified DNA as a criterion for bacterial species detection// Abstr. 10th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Stokholm, Sweden, 2000// Clin Microbiol and Infect.- 2000- V 6, suppl 1- P 187. (соавт - Mokrousov I, Narvskaya О , Otten T, Tseneva G, Vishnevsky В )

3 Epidemiology of pertussis infection in St -Petersburg and Russia// Abstr 10th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Stokholm, Sweden, 2000// Clin Microbiol and Infect.- 2000.- V 6, suppl 1.- P. 215 (Соавт - Tseneva G, Narvskaya O, Mokrousov I ).

4. Иммуноферментная тесг-сисгема для ранней диагностики коклюшной инфекции// Материалы 3-й Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тестсистем» -Махачкала, 2001 - С 77-78. (Соавт.- Ценева Г.Я, Дробченко С.Н.).

5 Caractéristique immunologique des souches vaccinales et circulantes de Bordetella pertussis et son importance pour la prophylaxie de la coqueluche// Resumes Colloque Scientifique a l'occasion de 110e anniversaire del'Institut Pasteur d'Ho Chi Minh Ville - Ho-Chi-Minh-Ville, Vietnam, 2001 - P. 191-192 (Соавт.: Tseneva G., Okuneva M.).

6 Preparation for pertussis early diagnostics; sensitivity and specificity evaluation in mode experiments// Abstr Xй International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology "The world of microbes" - Paris, France, 2002.- P 298 (Соавт. Tseneva G ).

7. Коклюшная инфекция в период вакцинопрофилакгимг микробиологические и клинические особенности// Материалы научной конференции Итало-Российского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине» -Санкт-Петербург, 2002,- С. 180-181. (Соавт' Ценева Г.Я., Бабаченко ИВ., Тимченко В H, Каплина Т А, Минченко С И.)

8 Характеристика возбудителя и клинические особенности коклюша у привитых детей в Санкт-Петербурге// Материалы Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» - Санкт-Петербург, 2003 - С 27 (Соавт. Бабаченко И.В , Семиотрочев В.Л, Тимченко В.Н, Ценева Г.Я.)

Отпечатано в ООО "АБЕВЕГА", 190031, Санкт-Петербург, Московский пр.2 лицензия ПЛД №69-454 от 22.12.99, Подписано в печать 13.01.2004 заказ N81301 от 13.01.2004, тир. 100 экз.

№.194 9

РНБ Русский фонд

2004-4 26946

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Курова, Наталия Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробиологическая характеристика рода Bordetella

1.2. Лабораторная диагностика коклюшной инфекции

1.3. Современные методы молекулярно-генетических исследований бордетелл

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы. Методы выделения и идентификации

2.2. Способы получения антигенов, гипериммунных сывороток и иммуноглобулинов

2.3. Серологические методы

2.4. Молекулярно-биологические методы

2.5. Методы статистического анализа

Глава 3. ХАРАКТЕРИСТИКА КОКЛЮШНОЙ ИНФЕКЦИИ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

Глава 4. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КОКЛЮША

4.1. Повышение эффективности бактериологического метода диагностики коклюшной инфекции

4.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для ранней диагностики коклюша

4.2.1. Получение антигенов Bordetella pertussis.

4.2.2. Получение гипериммунных сывороток.

4.2.3. Получение иммуноглобулинов.

4.2.4. Получение специфических конъюгатов.

4.2.5. Отработка условий постановки реакции.

4.2.6. Модельные опыты.

4.2.7. Апробация тест-системы при клинических исследованиях.

Глава 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ В. PERTUSSIS

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-биологическая характеристика Bordetella pertussis, циркулирующих в период подъема заболеваемости, и совершенствование лабораторной диагностики коклюша"

Актуальность проблемы

Коклюш относят к числу управляемых инфекций. Уже в 1923 г. Madsen предпринял первую попытку вакцинации против коклюша, но достиг лишь снижения тяжести заболевания у привитых. Широкое применение противококлюшных прививок в результате создания эффективной вакцины стало возможным лишь в 50-е годы [2]. Это позволило существенно снизить заболеваемость и предупредить летальные исходы от коклюша. Тем не менее, массовая вакцинация не решила всех проблем, связанных с данной инфекцией. Даже в странах с высоким (95 % и более) уровнем привитости детей отмечаются вспышки заболевания, не связанные с естественным эпидемическим циклом [22, 23, 33, 69, 105]. По данным ВОЗ, в 2000 г. коклюш был зарегистрирован в 37 странах Европы из 51, в то время как в 1999 г. - в 31 стране. Наибольшее число заболеваний зарегистрировано в Нидерландах, Норвегии и Швеции (соответственно 4837, 3417 и 2705 случаев). Еще раньше, в начале девяностых годов XX века подъем заболеваемости отмечался также во Франции, Финляндии, США, Австралии.

В нашей стране вакцинация проводится с 1956 г., в Санкт-Петербурге - с 1959 г. Обязательная вакцинация детей позволила снизить заболеваемость в десятки раз. Так, в Санкт-Петербурге в 1958 г. ее показатель составил 710 на 100 тыс. населения, а в 1973 г. - 18,8. Практически не регистрировалась летальность от этого инфекционного заболевания. Однако в начале 90-х годов в результате необоснованно возросшего числа медицинских отводов детей от прививок вновь возник резкий подъем заболеваемости коклюшем; ее максимальный рост наблюдался в крупных городах РФ, в том числе Санкт-Петербурге. Пик эпидемического подъема заболеваемости коклюшем отмечен в 1994 г., ее показатель составил 32,6 на 100 тыс. населения в РФ, а в Санкт

Петербурге - 143,2. В последующие годы были приняты меры по повышению уровня охвата прививками детей до 3 лет. Несмотря на высокий уровень привитости детей в Санкт-Петербурге в настоящее время (показатель составил 88,6 % в 2002 г.), заболеваемость в 4 раза превышает среднереспубликанскую.

Одной из проблем современного периода является вовлечение в эпидемический процесс привитых детей. По данным детской городской больницы № 5, в Санкт-Петербурге среди госпитализированных больных в 2001-2002 гг. привитые составили 38,9 %. В возрастном аспекте среди привитых детей 32,6 % составили дети 1-2 года жизни и 33 % - в возрасте 7-12 лет.

Учитывая возрастающую тенденцию распространения коклюша среди привитых детей, встал вопрос о необходимости изучения возможных генетических мутаций, и, как следствие, изменения биологических свойств В. pertussis, произошедших за период с начала проведения вакцинопрофилактики, что может являться причиной снижения эффективности вакцинации. В результате применения в последние годы молекулярно-генетических методов при исследовании В. pertussis иностранными исследователями было показано, что популяция В.pertussis имеет клональную структуру, и в годы, последовавшие за введением вакцинации, происходила клональная экспансия штаммов, отличных по профилям ДНК от довакцинальных [142]. Появление новых профилей ДНК в 80-е годы совпало с ростом заболеваемости в ряде стран [66]. Выявлены изменения в структуре генов, кодирующих синтез основных токсинов и адгезинов В. pertussis [98, 104, 105, 146]. Однако аналогичные исследования по изучению возможных генетических различий у «диких» и вакцинных штаммов в России не проводились.

Золотым стандартом» диагностики коклюшной инфекции остается бактериологическое исследование, при котором окончательный ответ выдается через 5-7 суток. Подтверждаемость диагноза этим методом не превышает 25 %, что обусловлено рядом причин, в частности, недостаточной эффективностью бактериологического метода, а также поздней обращаемостью больных за медицинской помощью. В этой связи актуальным представлялся поиск путей повышения эффективности существующего метода бактериологической диагностики, а также разработка экспресс-метода, обеспечивающего ускоренное обнаружение возбудителя коклюша.

Задачи исследования:

1. Повысить эффективность бактериологического исследования и разработать иммуноферментную тест-систему для ускоренного обнаружения возбудителя коклюша.

2. Изучить молекулярно-биологические свойства В. pertussis, циркулирующих в Санкт-Петербурге в условиях вакцинопрофилактики.

3. Установить значение штаммов В. pertussis различных генотипов в увеличении числа заболеваний среди привитых.

Научная новизна работы.

Впервые в России в результате применения методов электрофореза в пульсирующем поле (ЭФПП) и секвенирования выявлены мутации в геноме В. pertussis и установлен генетический полиморфизм популяции возбудителя коклюша.

Выявлены молекулярно-генетические различия «диких» и вакцинных штаммов В. pertussis.

Показано, что штаммы генотипов IVa и IVP по частоте циркуляции преобладают на территории изучения; установлена их связь с ростом заболеваний среди привитых.

Впервые установлена генетическая неоднородность популяции В. parapertussis, новый вариант гена пертактина В. parapertussis 1.4а/2.8е зарегистрирован в GenBank, регистрационный номер AJ542533.

Разработана иммуноферментная тест-система для выявления возбудителя коклюша с использованием IL ip в качестве иммуностимулятора для получения гипериммунных сывороток с высоким содержанием специфических антител.

Практическая значимость исследования.

Штаммы В. pertussis и В. parapertussis новых генотипных вариантов предложены в качестве тест-штаммов для мониторинга за бордетеллами и технологических целей.

Штамм В. pertussis 1.0.3 № 45 принят на депонирование в коллекцию ГИСК им. JI.A. Тарасевича в качестве тест-штамма для определения профиля штаммов В. pertussis методом ЭФПП (группа IVa), для секвенирования гена пертактина (тип 2) и гена S1-субъединицы коклюшного токсина (тип А). Штамму присвоен номер 272. Справка от 15.09.03 №01-33/3.

Штамм В. parapertussis № 34 принят на депонирование в ГИСК им. JI.A. Тарасевича в качестве тест-штамма для секвенирования гена пертактина В. parapertussis, штамму присвоен номер 271. Справка от 15.09.03 № 01-33/2.

Штамм В. pertussis 1.0.3 № 35 был принят на депонирование в коллекцию ГИСК им. JI.A. Тарасевича как перспективный для получения гипериммунной антикоклюшной сыворотки, ему присвоен номер 273. Справка от 15.09.03 № 01-33/4.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Дополнительные факторы роста в питательных средах в сочетании с цефалексином и иммуноферментная тест-система существенно повышают эффективность лабораторной диагностики коклюша.

2. Популяция штаммов В. pertussis, циркулирующих в условиях вакцинопрофилактики, неоднородна по ЭФПП-профилям и структуре гена пертактина.

3. Определены различия между «дикими» и вакцинными штаммами. В. pertussis по ЭФПП-профилям, структуре генов пертактина и S1-субъединицы коклюшного токсина.

4. Штаммы генотипов IVa и IVJ3 преобладают в популяции В. pertussis, циркулирующей на территории изучения; показана их связь с заболеваниями у привитых.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и

Ленинградской области в 2001, 2002 гг.; Научной конференции Итало-Российского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине» (г. Санкт-Петербург, 2002 г.); Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2003 г.); научных симпозиумах международной сети институтов Пастера (Париж, Франция, 1999 г.; Хошимин, Вьетнам, 2002 г.). Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Министерства здравоохранения Российской Федерации» 24.12.2003.

По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи; аналитический обзор «Инфекционная заболеваемость в Северо-Западном Федеральном округе России. Совершенствование технологий эпидемиологического надзора и профилактики», г. Санкт-Петербург, 2001 г.; Методические рекомендации «Коклюш у привитых детей (клиническая и лабораторная диагностика)», г. Санкт-Петербург, 2003; 8 тезисов.

Объем и структура диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Курова, Наталия Николаевна

119 ВЫВОДЫ

1. Повышение диагностической эффективности бактериологического метода в 7 раз достигается включением в питательную среду факторов роста: 5 % СКРС и 1 % среды 199, и использованием цефалексина в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры.

2. Экспериментально обоснована и разработана оригинальная конструкция тест-системы иммуноферментной для ускоренной диагностики коклюша. Показано, что этот препарат обеспечивает чувствительность анализа при определении В. pertussis в биологическом материале на уровне 104 м.к./мл.

3. Популяция штаммов В. pertussis, циркулирующих в Санкт-Петербурге, характеризуется молекулярно-генетической неоднородностью по ЭФПП-профилям и структуре гена пертактина.

4. Установлены молекулярно-генетические различия «диких» и вакцинных штаммов. Среди циркулирующих штаммов 62 % имеют ДНК-профили IVa и IVp, вакцинные штаммы - профили II и III.

5. Установлена связь циркуляции штаммов с ДНК-профилями IVa и IVp с заболеваниями коклюшем среди привитых. Они обнаруживались у больных в 85 % случаев, штаммы профиля III - в 47 % случаев.

6. Определение изменчивости бордетелл молекулярно-генетическими методами (ЭФПП и секвенирования) с использованием референс-штаммов может быть использовано для целей мониторинга за возбудителем коклюша.

120

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из основных проблем, связанных с коклюшной инфекцией, является низкая эффективность бактериологического метода -единственного на сегодняшний день регламентированного и широко используемого практическими лабораториями метода диагностики коклюша. Для повышения эффективности метода были проведены экспериментальные исследования, позволяющие оценить качество основных коммерческих питательных сред для выделения В. pertussis. Было установлено, что оптимальными ростовыми свойствами обладает бордетелагар производства ГНЦ прикладной микробиологии, пос. Оболенск.

Для решения вопроса о возможности повышения чувствительности питательной среды были проведены опыты с применением различных факторов роста. Показано, что добавление в среду крови человеческой дефибринированной давало низкие результаты (до 38 % высева), максимальная высеваемость В. pertussis (60 %) была достигнута при добавлении к питательной среде сыворотки крупного рогатого скота и среды 199 для культуры клеток.

Было отмечено, что пенициллин, используемый в качестве ингибитора посторонней микрофлоры при проведении бактериологического исследования, подавляет рост В. pertussis в малых концентрациях. Для установления возможности снижения ингибирующего влияния антибиотика на рост бордетелл были проведены эксперименты с высевом В. pertussis в разных количествах на среды с добавлением регламентированного и уменьшенных количеств пенициллина, а также цефалексина, используемого с той же целью в мировой практике. Было показано, что пенициллин в дозе, уменьшенной в 3 раза (10 МЕ/100 мл среды), как и цефалексин, не оказывал в эксперименте ингибирующего действия на рост В. pertussis. При сравнительных рутинных бактериологических исследованиях с добавлением в бордетелагар вышеуказанных антибиотиков было показано, что наибольшая высеваемость получена при использовании цефалексина. Применение в текущей работе районного ЦГСЭН Санкт-Петербурга бордетелагара, рекомендованных ростовых факторов и цефалексина позволило повысить бактериологическую подтверждаемость коклюша в 7 раз.

Продолжительность бактериологического исследования при выделении возбудителя коклюша (5-7 суток) обусловила необходимость разработки ускоренного метода диагностики инфекции. Была определена антигенная и иммуногенная активность штаммов В. pertussis, выбран штамм-продуцент с оптимальными характеристиками. С целью получения сывороток, содержащих максимальную концентрацию специфических антител, проведена иммунизация кроликов по различным схемам. В итоге выбрана оптимальная схема иммунизации с дополнительным введением IL 1Р в качестве иммуностимулятора. Из сывороток был получен пул иммуноглобулинов с последующим его фракционированием. Контроль чувствительности и специфичности полученных фракций показал, что все фракции были специфичны, а максимальной чувствительностью обладала бессолевая фракция, содержащая Ig G, из которой был изготовлен конъюгат. Тест-система обладала чувствительностью 104 м.к./мл. В связи с поздней госпитализацией больных коклюшем изучить диагностическую эффективность тест-системы на ранних сроках болезни в клинических условиях не представляется возможным. Для изучения возможности применения иммуноферментной тест-системы в диагностических целях у больных в поздние сроки заболевания было проведено обследование 112 детей с клинической картиной коклюша. Параллельно проведено обследование бактериологическим методом, ПЦР, а также исследование парных сывороток в РА для определения титра антикоклюшных антител.

По сумме методов диагноз был подтвержден у 65 детей (58 %), из них в ИФА получено 32,3 % положительных результатов: в 2 раза больше, чем бактериологическим методом. Разработанная тест-система является чувствительным и специфичным препаратом, предназначенным, в первую очередь, для диагностики коклюша на ранних сроках заболевания, однако, как показали наши «полевые» исследования, возможно ее применение в период судорожного кашля.

Впервые в России были проведены молекулярно-генетические исследования штаммов В. pertussis. Для выяснения причин роста числа заболеваний коклюшем среди привитых на фоне повышения охвата детей вакцинацией были изучены штаммы, циркулировавшие в Санкт-Петербурге в период подъема заболеваемости (1998-2000 гг.), штаммы, выделенные в России в 60-е годы, то есть в начале периода вакцинопрофилактики, и штаммы, используемые при производстве вакцины АКДС. При исследовании штаммов методом ЭФПП было установлено, что один из вакцинных штаммов В. pertussis и штамм, выделенный в 1965 г., относятся ко II ЭФПП-группе, к которой относят также многие штаммы, выделенные в довакцинальную эру в ряде европейских стран. Три других вакцинных штамма, штамм № 973, выделенный в 1961 г., штамм № 12, выделенный в 1989 году, и 21 штамм, выделенный в 1998-2000 гг., были включены в III группу, куда относят также штаммы, выделенные в других странах как в довакцинальную эру, так и после начала всеобщей вакцинации. IVa, IVP и V группы составили только современные штаммы.

При секвенировании гена S1-субъединицы коклюшного токсина было установлено, что вакцинный штамм № 475 и штамм № 400, выделенный в 60-е годы, обладают ptxSI типа D, три остальных вакцинных штамма и штамм № 973, выделенный в 60-е годы, содержат ptxS 1 типа В, 36 исследованных данным методом штаммов, выделенных в

1998-2000 гг., обладали ptxSI типа А. Эти результаты полностью совпадают с данными других исследователей, согласно которым 90-100 % штаммов, циркулировавших в 80-90-е годы, содержат аллель /?taSl А, в то время как штаммы довакцинальной эры и выделенные в 60-е годы содержат аллели В и D.

При секвенировании гена пертактина было установлено, что все вакцинные штаммы, штаммы 60-х годов содержат кодирующую последовательность пертактина 1 типа. Из 67 современных штаммов аллель гена пертактина был определен у 32 штаммов: ргп\ обнаружен у 13 штаммов, prn 2 - у 15 штаммов, prn 3 - у 4 штаммов.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что у штаммов В. pertussis, циркулирующих в Санкт-Петербурге, прослеживается в целом та же тенденция изменения генетической структуры, что и в других географических регионах мира с сорокалетней историей вакцинопрофилактики против коклюша. Однако нами выявлены некоторые особенности, отличающие отечественные штаммы от зарубежных. Так, 31 % штаммов, выделенных в 1998-2000 гг., были отнесены к III ЭФПП-группе (во Франции - 2 %). Кроме того, ген prn 1 типа, характерный для штаммов довакцинальной эры и 60-х годов, обнаружен у большего числа штаммов (41 %), циркулирующих в Санкт-Петербурге, в то время как аналогичный вариант гена пертактина выявлен в Нидерландах, Финляндии и Италии у 13, 7 и 6 % штаммов соответственно. Возможной причиной менее выраженной изменчивости современных штаммов в Санкт-Петербурге в сравнении с зарубежными может быть низкий уровень охвата иммунизацией в начале девяностых годов, что, надо полагать, способствовало более широкому распространению штаммов, совпадающих по вышеуказанным генетическим характеристикам с вакцинными. Все десять штаммов, выделенных в 1998-2000 гг., изученных методом секвенирования и отнесенных к группе IVP, содержали ген ргп 2 типа (по данным французских исследователей, все штаммы IV группы также содержали ргп 2 типа). Принимая во внимание данные С. Weber et al. (2001 г.) о том, что во Франции в последнее десятилетие происходит постепенное снижение доли штаммов группы IVa при одновременном нарастании числа штаммов группы IVP, а также тот факт, что в исследуемой нами группе IVa почти половина штаммов содержит ген ргп 1, можно предположить, что эта группа является переходной. Эти данные указывают на необходимость дальнейшего мониторинга за возбудителем коклюша.

Была установлена взаимосвязь между принадлежностью штаммов к ЭФПП-группам и характером их взаимоотношений с макроорганизмом. Если штаммы IV группы вызывали заболевание в 83-85 % случаев, то штаммы III группы более чем в половине случаев выделены от контактных без клинических проявлений в очаге инфекции и лишь 47 % детей — источников этих штаммов заболели коклюшем. Возможной причиной такого различия в этиологической значимости образовавших генетические группы штаммов является формирование за годы проведения вакцинопрофилактики коллективного иммунитета к штаммам, сходным по структуре с вакцинными.

При сравнении клинико-лабораторных данных установлено, что между возрастными группами 4-6 и 7-10 лет также есть различия. В группе 4-6 лет чаще выделяли штаммы III группы: их источниками стали 33 % больных детей этого возраста, а в целом по данной возрастной группе - 52 % детей. В то же время в возрастной группе 7-10 лет только в 11 % случаев больные дети были источниками штаммов этой ЭФПП-группы (в целом по группе - 14 %). Достоверного объяснения данному факту в настоящее время нет. Однако можно предположить, что дети старшей возрастной группы оказались менее чувствительны к ним. Возможно, что адаптация В. pertussis к длительной циркуляции в условиях прессинга вакцины сочеталась со снижением вирулентности у штаммов III группы.

Учитывая высокую степень сходства клинических проявлений коклюша и паракоклюша, распространенность паракоклюшной инфекции в Санкт-Петербурге, регистрацию вспышечной заболеваемости этой инфекцией нам представлялось важным провести исследования штаммов В. parapertussis, аналогичные описанным выше для В. pertussis. При исследовании штаммов, выделенных в 1998-2000 гг. и штаммов, выделенных в России в 60-е годы было установлено, что популяция В. parapertussis однородна по ЭФПП-профилям. При секвенировании гена пертактина установлено, что семь штаммов, выделенных в 1998-2000г.г. содержали нуклеотидную последовательность, идентичную описанной ранее зарубежными исследователями. В то же время штамм № 34 (год выделения - 1998) и все 3 штамма 60-х годов отличались по структуре последовательности, кодирующей иммунодоминантный участок 2, от описанных ранее штаммов В. parapertussis. По номенклатуре этот новый вариант участка 2 был обозначен как 2.8е и зарегистрирован в GenBank.

На основании полученных данных можно предположить, что популяция В. parapertussis неоднородна. Вероятно, это не является следствием влияния вакцинопрофилактики, так как применение коклюшной вакцины неэффективно для защиты от В. parapertussis [85, 149]. Возможно, что в данном случае действуют другие факторы, которые предстоит расшифровать.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Курова, Наталия Николаевна, Санкт-Петербург

1. Галазка А. Иммунологические основы иммунизации. Вып. 4. Коклюш.-ВОЗ: Женева, 1993.- 34 с.

2. Иоффе В.И., Осипова П.В., Склярова Н.Н., Козлова Н.А. Коклюш (микробиология, иммунология, специфическая профилактика).- Москва.: Медицина, 1964.- 278 с.

3. Кириллова Г.А., Сухинова Е.Е., Шмелева Е.И. и др. Опыт применения иммуноферментного анализа для диагностики коклюша// Журн. микробиол.- 1994.- № 6.- С. 83-84.

4. Куляшова Л.Б. Разработка и применение иммунодиагностических методов при псевдотуберкулезе: Автореф. дис. .канд. мед. наук.-Л, 1989.- 25 с.

5. Ларшутин С.А., Смирнов В.Д., Сюндюкова Р.А., Просвиркина Т.Д. Лабораторная диагностика коклюша// Эпидемиол. и инфекц. бол,- 1998.- № 4.- С. 50-52.

6. Машков А.В., Михайлова З.М., Дядюнова И.В. Ответные реакции организма ребенка на антиген коклюшного микроба при инфекции и вакцинации// Проблемы коклюша.- Москва, 1961.- С. 57-62.

7. Носков Ф.С., Лернер О.М., Эртте А.А. Получение менингококковых сывороток серогруппы А// Вопр. вирусол.- 1970.- С. 614-618.

8. Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Платонова О.В. Мультилокусное секвенирование новый метод генотипирования бактерий и первые результаты его применения// Генетика. - 2000. -Т. 36.- С. 597-605.

9. Попова О.П., Селезнева Т.С., Милюкова В.И. Клинико-эпидемиологические аспекты коклюшной инфекции в современных условиях// Эпидемиол. и инфекц. бол.-1999.- № 2.- С. 63-64.

10. Попова О.П., Селезнева Т.С., Милюкова В.И. Связь серовариантов возбудителя с клиническими формами коклюша// Эпидемиол. и инф. бол.-1999,-№3,- С. 24-26.

11. Свиридов В.В., Селезнева Т.С., Буркин М.А. и др. Бактериологическаядиагностика коклюша с использованием моноклональных антител// Тез. 7 съезда Всерос. общ. эпидемиол. микробиол. и паразитол.- Москва, 1997,- С. 492-493.

12. Степаншина В.Н., Алексеева JI.H., Коробова О.В. и др. Взаимосвязь состава питательных сред с ростовыми и биологическими свойствами В. pertussis// Журн. микробиол.- 1994.- № 6. С. 26-27.

13. Учение о коклюше/ Под ред. С.Д. Носова, В.Д. Соболевой.- Медгиз, 1962.278 с.

14. Феклисова Л.В., Спирина Г.В., Шобухова Т.С. и др. Применение новой тест-системы для диагностики коклюшной инфекции// Эпидемиол. и инф. бол.-2000.-№2,- С. 59-61.

15. Цветкова Н.В., Борисенко Ю.В., Шмыглева В.И. Определение антител к экзотоксину Bordetella pertussis в сыворотках доноров и сырье для получения нормального иммуноглобулина человека// Журн. микробиол.-1994,-№6.- С. 79-81.

16. Шамардин В.А.// Здравоохранение Казахстана.- 1979.- № 8.- С. 91-93.

17. Якунин Н.Я. Клинико-эпидемиологическая характеристика коклюша у детей в условиях массовой иммунизации: Автореф. дис. .канд. мед. наук.-Москва, 1967.- 22 с.

18. Alonso S., Pethe К., Mielcarek N. et al. Role of ADP-ribosyltransferase activity of pertussis toxin in toxin adhesion redundancy with filamentous hemagglutinin diring Bordetella pertussis infection// Infect. Immun.- 2001.-Vol. 69, N10.- P. 6038-6043.

19. Aoyama Т., Takeuchi Y., Goto A. et al. Pertussis in adults// AJDC.- 1992.-Vol. 146,-P. 163-166.

20. Arico В., Rappuoli R. Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica contain transcriptionally silent pertussis toxin genes//J. Bacteriol.- 1987.- Vol. 169,-P. 2847-53.

21. Ayme G., CarofTM., Chaby R. et. Al. Biological activities of fragments derivedfrom Bordetella pertussis endotoxin: isolation of a nontoxic, Shwartzman-negative lipid A possessing high adjuvant properties// Infect. Immun.- 1980,-Vol. 49.- P. 739-745.

22. Baron S., Haeghebaert S., Laurent E., Guiso N. Renacoq: surveillance de la coqueluche a l'hospital en 1998. Bilan de 3 annees de surveillance// BEH.-2000.-N34,-P. 143.

23. Bass J.W., Wittier R.R. Return of epidemic pertussis in the United States// Pediatr. Infect. J.- 1994,- Vol. 13.- P. 343-345.

24. Bassinet L., Gueirard P., Maitre B. Role of adhesions and toxins in invasion of human tracheal epithelial cells by Bordetella pertussisII Infect. Immun.- 2000.-Vol. 68, N4,-P. 1934-1941.

25. Betsou F., Sebo P., Guiso N. The C-terminal domain is essential for protective activity of the Bordetella pertussis adenylate cyclase-hemolysin// Infect. Immun.- 1995.- Vol. 63.- P. 3309-3315.

26. Boucher P.E., Murakami K., Ishinama A., Stibitz S. Nature of DNA binding and RNA polymerase interaction of the Bordetella pertussis Bvg A transcriptional activator at the FHA promoter// J. Bacteriol.- 1997.- Vol. 179 (Pt5).-P. 1755-1763.

27. Boursaux-Eude C., Guiso N. Polymorphism of the repeated regions of pertactin in Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica!I Infect. Immun.- 2000.- Vol. 68, № 8,- P. 4815-4817.

28. Boursaux-Eude C., Thiberge S., Carletti G., Guiso N. Intranasal murine model of Bordetella pertussis infection. II. Prediction of protection in human infants by acellular vaccines// Vaccine.- 1999,- Vol. 17.- P. 2651-2660.

29. Brennan M.J., Shahin R.D. Pertussis antigens that abrogate bacterial adherence and elicit immunityII Am. J. Respir. Crit. Care Med.- 1996.- Vol. 154 (4 pt2).- P. 145-149.

30. Brennan M.J., Zhong Ming Li, Cowell J.L. et al. Identification of a 69-kilodalton nonfimbrial protein as a agglutinogen of Bordetella pertussis!I Infect.1.mun.- 1988.- Vol. 56, N 12.-P. 3189-3195.

31. Carter E.J., Preston N.W. Association between Bordetella pertussis agglutinogen 2 and fimbriae// J. Med. Microbiol.- 1984,- Vol. 18,- P. 87-94.

32. Cookson B.T., Vandamme P., Carlson L.C. et al. Bacteremia caused by a novel Bordetella species, "Bordetella hinzifV/ J. Clin. Microbiol.- 1994.- Vol. 32.- P. 2569-2571.

33. De Melker H.E., Conyn-Van Spaendock H.C., Rumke H.C. et al. Pertussis in the Netherlands: an outbreak despite high levels of immunization with whole cell vaccine// Emerg. Infect. Dis.- 1997.- Vol. 3,- P. 175-178.

34. De Tejada M.G., Cotter P.A., Heininger U. et.al. Neither the Bvg- phase nor the vrg 6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice// Infect. Immun.- 1998.- Vol. 66 P. 2762-2768.

35. Douglas E., Coote J.G., Parton R., McPheat W. Identification of Bordetella pertussis in nasopharyngeal swabs by PCR amplification of a region of the adenylate cyclase gene// J. Med. Microbiol.- 1993,- Vol. 38.- P. 140-144.

36. Edelman K., Nikkari S., Ruuskanen O. et al. Detection of Bordetella pertussis by polymerase chain reaction and culture in the nasopharynx of erythromycin-treated infants with pertussis// Pediatr. Infect. Dis. J.- 1996.- Vol. 15.- P. 54-57.

37. Ewanovich C.A., Melton A.R., Weiss A.A., Peppier M.S. Invasion of HeLa 229 cells by virulent Bordetella pertussis!I Infect. Immun.- 1989.- Vol. 57.- P. 26982704.

38. Farrell D.J., McKeon M., Daggard G. et al. Rapid-cycle PCR method to detect Bordetella pertussis that fulfills all consensus recommendations for use of PCR in diagnosis of pertussis// J. Clin. Microbiol.- 2000.- Vol. 38.- P. 4499-4502.

39. Fernandez R.C., Weiss A.A. Cloning and sequencing of a Bordetella pertussis serum resistance locus// Infect. Immun.- 1994,- Vol. 62.- P. 4727-4738.

40. Fernandez R.C., Weiss A.A. Serum resistance in Z>vg-regulated mutants of Bordetella pertussis!IFEMS Microbiol. Lett.- 1998.- Vol.1, N 163.- P. 57-63.

41. Finn T.M., Amsbaugh D.E. Vag-8, a Bordetella pertussis bvg-regulatedprotein// Infect. Immun.- 1998.- Vol. 66.- P. 3985-3989.

42. Friedman R.L., Nordensson K., Wilson L. et. Al. Uptake and intracellular survival of Bordetella pertussis in human macrophages// Infect. Immun.- 1992.-Vol. 60.-P. 4578-4585.

43. Fry N.K., Neal S., Harrison T.G. et al. Genotypic variation in the Bordetella pertussis virulence factors pertactin and pertussis toxin in historical and recent clinical isolates in the United Kingdom// Infect. Immun.-. 2001.- Vol. 69,- P. 5520-5528.

44. Garcia-Corbeira P., Dal-Re R., Aguilar L. Seroepidemiology of Bordetella pertussis infections in the Spanish population: a cross-sectional study// Vaccine.- 2000,- Vol. 18,- P. 2173-2176.

45. Geuijen C.A., Willems R.J., Hoogerhout P. Identification and characterisation of heparin binding regions of the Fim2 subunit of Bordetella pertussis!I Infect. Immun.- 1998.- Vol. 66,- P. 2256-2263.

46. Geuijen C.A., Willems R.J., Mooi F.R. The major fimbrial subunit of Bordetella pertussis binds to sulfated sugars// Infect. Immun.- 1996.- Vol. 64.-P. 2657-2665.

47. Gilchrist M.J.R. Bordetella/ In Manual of clinical microbiology. 5th ed./ Ed. Balows A., Hansler W.J., Herrmann K.L., Isenberg H.D., Shadomy H.J.Washington, D.C., 1991,- P. 471-477.

48. Glare E.M., Paton J.C., Premier R.R. et al. Analysis of a repetive DNA sequence from Bordetella pertussis and its application to the diagnosis of pertussis using the PCR// J. Clin. Microbiol.- 1990.- Vol. 28.- P. 1982-1987.

49. Granstrom G., Askelof P., Granstrom M. Specific immunoglobulin A to Bordetella pertussis antigens in mucosal secretion for rapid diagnosis of whooping cough// J. Clin. Microbiol.- 1988.- Vol. 26,- P. 869-874.

50. Granstrom G., Wretlind В., Salenstedt C.R., Granstrom M. Evaluation of serologic assays for diagnosis of whooping cough// J. Clin. Microbiol.- 1988.-Vol. 26.- P. 1818-1823.

51. Grant C.C., McKey E.J., Simpson A., Buckley D. Pertussis encephalopathy with high cerebrospinal fluid antibody titers to pertussis toxin and filamentous hemagglutinin// Pediatrics.- 1998.- Vol. 102, N 4 (Ptl).- P. 986-990.

52. Grimont P. Taxotron 2000 user's manual/ Ed. Institut Pasteur.- Paris, 2000.

53. Grimprel E., Begue P., Anjak I. Et al. Comparison of polymerase chain reaction, culture, and Western immunoblot serology for diagnosis of Bordetella pertussis!I Inf. J. Clin. Microbiol.- 1993,- P. 2745-2750.

54. Grimprel E., Begue P., Anjak I. Et al. Long-term human serum autibody responses after immunization with whole cell pertussis vaccine in France// Clin. Diagn. Lab. Immunol.- 1996 .- Vol. 3, N 1.- P. 93-97.

55. Grimprel E., Njamkepo E., Begue P., Guiso N. Rapid diagnosis of pertussis in young infants: comparison of culture, PCR, and infant's and mother's serology// Clin. Diagn. Lab. Immunol. -1997.- P. 723-726.

56. Gueirard P., Druilhe A., Pretolani M., Guiso N. Role of adenylate cyclase-hemolysin in alveolar macrophage apoptosis during Bordetella pertussis infection in vivo// Infect. Immun.- 1998.- Vol. 66.- P. 1718-1725.

57. Guiso N., Capian C., Carletti G. et al. Intranasal murine model of Bordetella pertussis infection. I. Prediction of protection in human infants by acellular vaccines// Vaccine.- 1999.- Vol 17.- P. 2366-2376.

58. Guiso N., Grimprel E., Anjak I., Begue P. Western blot analysis of antibody responses of young infants to pertussis infection// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. -1993,-P. 596-600.

59. Guiso N., Iwaki M., Bousaux-Eude C. et al. Analysis of Bordetella pertussis isolates collected in Japan before and after introduction of acellular pertussis vaccines// Vaccine.- 2001,- Vol. 30.- P. 3248-3252.

60. Guiso N., Rocancourt M., Szatanik M., Alonso J.-M. Bordetella adenylate cyclase is a virulence associated factor and an immunoprotective antigen// Microbial Pathogenesis.- 1989.- Vol. 7.- 373-380.

61. Guiso N., Szatanik M., Rocancourt M. Protective activity of Bordetella adenylate cyclase hemolysin against bacterial colonization// Microbial. Pathogenesis -1991.- Vol. 11.- P. 423-431.

62. Guiso N., von Konig C.H.W., Becker C., Hallander H. Fimbrial typing of Bordetella pertussis isolates: agglutination with polyclonal and monoclonal antisera// J. Clin. Microbiol. -2001.- Vol. 39.- P. 1684-1685.

63. Gustafsson В., Askelof P. Rapid detection of Bordetella pertussis by a monoclonal antibody-based colony blot assay// J. Clin. Microbiol.- 1989.- Vol. 27.-P. 628-631.

64. Halperin S.A., Bortolussi R., Wort A.I. Evaluation of culture, immunofluorescence and serology for the diagnosis of pertussis// J. Clin. Microbiol.-1989.- Vol. 21.- P. 752-757.

65. Hamstra H.J., Kuipers В., Schijf-Evers D. The purification and protective capacity of Bordetella pertussis outer membrane proteins// Vaccine.- 1995.-Vol. 13, Pt. 8,-P. 747-752.

66. Hardwick Т.Н., Cassiday P., Weyant R.S. et al. Changes in predominance and diversity of genomic subtypes of Bordetella pertussis isolated in the United States, 1935-1999// Emerg. Infect. Dis.- 2002.- Vol. 8, N 1.- P. 44-49.

67. Hardwick Т.Н., Plikaytis В., Cassiday P.K. et al. Reproducibility of Bordetella pertussis genomic DNA fragments generated by Xbal restriction and resolved by pulsed-field gel electrophoresis// J. Clin. Microbiol.- 2002.- P. 811-816.

68. He Q. Diagnosis of Bordetella pertussis infection and investigation of pertussis immunity by PCR and EIA serology dissertation.// Annales universitatis Turkuensis. Medica-odontologica.-Turku, 1994.-Vol.145.-P. 1-152.

69. He Q., Mertsola J. Epidemiology and prevention of pertussis// Current opinion in pediatrics.- 1997.- Vol. 9,- P. 14-18.

70. He Q., Mertsola J., Soini H., Scurnik M., Ruuskanen O., Viljanen M.K. Comparison of polymerase chain reaction with culture and enzyme immunoassay for diagnosis of pertussis// J. Clin. Microbiol.- 1993.- Vol. 31.- P. 642-645.

71. He Q., Mertsola J., Soini H., Viljanen M.K. Sensitive and specific polymerase chain reaction for detection of Bordetella pertussis in nasopharyngeal specimens//J. Pediatr.- 1994,- VoU24(Pt6).- P. 421-426.

72. He Q., Schmidt-Schlapfer G., Just M. et al. Impact of polymerase chain reaction on clinical pertussis reseach. Finnish and Swiss experiences// J. Infect. Dis.-1996.- Vol. 174.-P. 1288-1295.

73. He Q., Viljanen M.K., Arvilommi H. et al. Whooping cough caused by Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis in an immunized population// JAMA.- 1998,- Vol. 280, N 7.- P. 635-637.

74. He Q., Viljanen M.K., Nikkari S. et al. Outcomes of Bordetella pertussis infection in different age groups of an immunized population// J. Infect. Dis.1994,- Vol. 170.- 873-877.

75. He Q., Viljanen M.K., Olander R.M. et al. Antibodies to filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis and protection against whooping cough in school children// J. Infect. Dis.- 1994.- Vol. 170.- P. 705-708.

76. Hewlett E.L., Sauer K.T., Myers G.A. et al. Induction of a novel morphological response in Chinese hamster ovary cells by pertussis toxin// Infect. Immun.-1983,- Vol. 40.-P. 1198-1230.

77. Hoiby N., Hertz J.B., Andersen V. Cross-reactions between Bordetella pertussis and 28 other bacterial species// Acta pathol. Microbial. Scand.- 1976.- Vol. 84B.- P. 395-400.

78. Hoiby N., Hertz J.B., Andersen V., Baekgaard P. Crossed immunoelectrophoretic analysis of Bordetella pertussis antigens and of corresponding antibodies in human sera// Acta pathol. Microbiol. Scand.- 1976.1. Vol. 84В.- P. 386-394.

79. Hoppe J.E., Schlagenhauf M. Comparison of three kinds of blood and two incubation atmospheres for cultivation of Bordetella pertussis on charcoal agar// J. Clin. Microbiol.- 1989,- Vol. 27.- P. 2115-2117.

80. Houard S, Hackel C., Herzog A., Bollen A. Specific identification of Bordetella pertussis by the p.c.r.// Res. Microbiol.- 1989,- Vol. 140.- P. 477^87.

81. Hozbor D., Rodziquez M. E., Fernandez J. et a1. Release of Outer Membrane Vesicles from Bordetella pertussisII Curr. Microbiol.- 1999.- Vol. 38.- P. 273278.

82. Hsia J.A., Moss J., Hewlett E.L., Vaughan M. ADP-ribosylation of adenylate cyclase by pertussis toxin: effects on inhibitory agonist bindingII J. Biol. Chem.-1984,- Vol. 259,- P. 1086-1090.

83. Khelef N., Bachelet C.-M., Vargaftig B.B., Guiso N. Characterization of murine lung inflammation after infection with parental Bordetella pertussis and mutants deficient in adhesions or toxins// Infect. Immun.- 1994.- Vol. 62, N 7.- P. 28932900.

84. Khelef N., Danve В., Quentin-Millet M.J., Guiso N. Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis: two immunologically distinct species// Infect. Immun.- 1993,- Vol. 61,- P. 486-490.

85. Khelef N., Sakamoto H., Guiso N. Both adenylate cyclase and hemolytic activities are required by Bordetella pertussis to initiate infection// Microbial. Pathogenes.- 1992,- Vol. 12.-P. 227-235.

86. Khelef N., Zychlinsky A., Guiso N. Bordetella pertussis induces apoptosis in macrophages: role of adenylate cyclase-hemolysin// Infect. Immun.- 1993.- Vol. 61, N10,- P. 4064-4071.

87. King A. J., Berbers G., van Oirschot H.F.L.M. Role of the polymorphic region 1 of the Bordetella pertussis protein pertactin in immunity// Microbiol. 2001. - N 147,- P. 2885-2895.

88. Kosters K., Reischl U., Schmetz J. et al. Real-Time LightCycler PCR for

89. Detection and Discrimination of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis!I J. Clin. Microbiol. -2002 .- Vol. 40,- P. 1719-1722.

90. Le Blay K., Caroff M., Blandiard F. et al. Epitopes of Bordetella pertussis LPS as potential markers for typing of isolates with monoklonal antibodies// Microbiology.- 1996,- Vol. 142, Pt 4.- P. 971-978.

91. Leininger E., Roberts M., Kenimer J.G. et al. Pertactin, an Arg-Gly-Asp-containing Bordetella pertussis surface protein that promotes adherence of mammalian cells// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.- Vol. 88,- P. 345-349.

92. Lenz D.H., Weingart C.L., Weiss A.A. Phagocytosed Bordetella pertussis fails to survive in human neutrophils// Infect. Immun.- 2000.- Vol. 68, N 2.- P. 956959.

93. Lind-Brandberg L., Welinder-Olssan C., Lagergard T.Evaluation of PCR for diagnosis of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis infections// J. Clin. Microbiol.- 1998.- Vol. 36,- P. 679-683.

94. Locht C., Antoine R., Jacob-Dubuisson F. Bordetella pertussis, molecular pathogenesis under multiple aspects// Curr. Opinion in Microbiol.- 2000,- Vol. 4.-P. 82-89.

95. Locht C., Keith J.M. Pertussis toxin gene: nucleotide sequence and genetic organization// Science.- 1986.- Vol. 232,- P. 1258-1264.

96. Marchitto K.S., Smith S.G., Locht C., Keith J.M. Nucleotide sequence homology to pertussis toxin gene in Bordetella bronchiseptica and Bordetella parapertussis!7 Infect. Immun.- 1987.- Vol. 55,- p. 497-501.

97. Mastrantonio P., Spigaglia P., van Oirschot H. Antigenic variants in Bordetella pertussis strains isolated from vaccinated and unvaccinated children// Microbiology.- 1999,- Vol. 145.- P. 2069-2075.

98. Merkel T.J., Stibitz S., Keith J.M. Contribution of regulation by the bvg locus to respiratory infection of mice by Bordetella pertussis!! Infect. Immun.- 1998.-Vol. 66.- P. 4367-4373.

99. Mertsola J., Ruuskanen O., Kuronen T. et al.Serologic diagnosis of pertussis: evaluation of pertussis toxin and other antigens in enzyme-linked immunosorbent assay// J. Infect. Dis.-1990.- Vol. 161.- P. 966-971.

100. Mertsola J., Ruuskanen O., Kuronen Т., Viljanen M.K. Serological diagnosis of pertussis: comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and bacterial agglutination// J. Infect. Dis.- 1983.- Vol. 147,- P. 252-257.

101. Mooi F.R., Hallander H., von Konig C.H.W., Hoet В., Guiso N. Epidemiological typing of Bordetella pertussis isolates: recommendations for a standard methodology// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.- 2000.- Vol. 19.- P. 174-181.

102. Mooi F.R., He Q., van Oirschot H., Mertsola J. Variation in the Bordetella pertussis virulence factors pertussis toxin and pertactin in vaccine strains and clinical isolates in Finland// Infect. Immun.- 1999.- Vol. 67, Pt 6,- P. 3133-3134.

103. Morrill W.E., Barbaree J.M., Fields B.S. et al. Effects of transport temperature and medium on recovery of Bordetella pertussis from nasopharyngeal swabs// J. Clin. Microbiol.- 1988.- Vol. 26.- P. 1814-1817.

104. New perspectives on Bordetella pathogenity editorial.// J. Med. Microbiol.-1996.- Vol. 44.- P. 233-235.

105. Nicosia A., Rappuoli R. Promoter of the pertussis toxin operon and production of pertussis toxin// J. Bacteriol .-1987.- Vol. 169.- P. 2843-2846.

106. Onorato I.M., Wassilak S.G.K. Laboratory diagnosis of pertussis: the state of the art// Pediatr. Infect. Dis.- 1987.- Vol. 6,- P. 145-151.

107. Pagliaccia C., Manetti R., Rappuoli R. Pertactin antigens extracted from Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica differ in the isoelectric point// Arch. Microbiol.- 1997.- Vol. 168, Pt 5,- P. 437-440.

108. Pang J., Modlin J., Yolken R. Use of modified nucleotides and uracil-DNA glycosylase (UNG) for the control of contamination in the PCR-based amplification of RNA// Mol. Cell Probes.- 1992.- Vol 6.- P. 251-256.

109. Parton R. New perspectives on Bordetella pathogenicity// J. Med. Microbiol.-1996,- Vol. 44.-P. 233-235.

110. Peppier M.S., Kuny S., Nevesinjac A. et al. Strain variation among Bordetella pertussis isolates from Quebec and Alberta provinces of Canada from 1985 to 1994// J. Clin. Microbiol. -2003.- Vol. 41.- P. 3344-3347.

111. Porter J.F., Connor K., Donachie W. Isolation and characterization of Bordetella parapertussis-like bacteria from ovine lungs// Microbiology.- 1994,- Vol. 140.-P. 255-261.

112. Porter J.F., Wardlaw A.C. Long-term survival of Bordetella bronchiseptica in lakewater and in buffered saline without added nutrients// FEMS Microbiol. Lett.- 1993.- Vol. 110.- P. 33-36.

113. Preston N.W. Essential immunogens in human pertussis: the role of fimbriae// Developments in Biological Standartization.- 1983.- Vol. 51.- P. 137-141.

114. Preston N.W., Matthews R.C. Components of acellular pertussis vaccines// Lancet.- 1996,- Vol. 16, N 347.- P. 764.

115. Rambow A.A., Fernandez R.C., Weiss A.A. Characterization of Brk A expression in Bordetella bronchiseptica!I Infect. Immun.- 1998.- Vol. 66,- P. 3978-3980.

116. Rappuoli R., Gross R., Arico B. Conversion from Bordetella parapertussis to

117. Bordetella pertussis!I Lancet.- 1987.- P. 511.

118. Redd S.C., Rumschlad H.S. et al. Immunoblot analysis of humoral immune responses following infection with Bordetella pertussis or immunisation with diphtheria-tetanus-pertussis vaccine// J. Clin. Microbiol.- 1988,- Vol. 26.- P. 1373-1377.

119. Redhead K., Watkins J., Barnard A., Mills K.H.G. Effective immunization against Bordetella pertussis respiratory infection in mice is dependent on induction of cell-mediated immunity// Infect. Immun.- 1993,- Vol. 61.- P. 31903198.

120. Regan J., Lowe F. Enrichment medium for the isolation of Bordetella!I J. Clin. Microbiol.- 1977.- Vol. 6,- P. 303-309.

121. Register K.B. Novel genetic and phenotypic heterogeneity in Bordetella bronchiseptica pertactin// Infect. Immun.- 2001.- Vol. 69.- P. 1917-1921.

122. Reizenstein E. Diagnostic polymerase chain reaction// Develop. Biol. Standartiz.- 1997,- Vol. 89.- P. 247-254.

123. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees// Mol.Biol.Evol.- 1987.- Vol.4.- P.406-425.

124. Shahin R.D., Brennan M.J., Li Z.M. Characterization of the protective capacity and immunogenity of the 69-kD outer membrane protein of Bordetella pertussis!I J.Exp. Med.-1990.- Vol. 171,-P. 63-73.

125. Simondon F., Iteman I., Preziosi M.P. Evaluation of serology based on IgG Elisa for pertussis toxin and filamentous hemagglutinin in the diagnosis of pertussis cases. A case study from Senegal// Clin. Diagn. Lab. Immunol.- 1998.- Vol. 5,-P. 130-134.

126. Simondon F., Preziosi M.-P., Yametal A. A randomized double-blind trial comparing a two-component acellular to a whole-cell pertussis vaccine in Senegal// Vaccine.- 1997.- Vol. 15, N 15.- P. 1606-1612.

127. Soane M.C., Jackson A., Maskell D. Interaction of Bordetella pertussis withhuman respiratory mucosa in vitro// Respir. Med.- 2000.- Vol. 94, N 8.- P. 791799.

128. Stenson Т.Н., Peppier M.S. Identification of two bvg-repressed surface proteins of Bordetella pertussis// Infect. Immun.- 1995.- Vol. 63.- P. 3780-3789.

129. Strauss E. New clues to whooping cough pathology// Science.- 1999.- Vol. 285.-P. 810-811.

130. Strugo I., Benilevi D., Madeb R. Pertussis infection in fully vaccinated children in day-care centers, Israel// Emerg. Infect. Dis.- 2000,- Vol. 6, N 5,- P. 526-529.

131. Tamura M., Nogimori L., Murai S. et al. Subunit structure of islet-activating protein, pertussis toxin, in conformity with A-B model// Biochemistry.- 1982,-Vol.21.- P. 5516-5522.

132. Tang Y.W., Hopkins M.K., Kolbert C.P. Bordetella holmesii-like organisms associated with septicemia, endocarditis and respiratory failure// Clin. Infect. Dis.- 1998.- Vol. 26.- P. 389-392.

133. Van den Berg В., Beekhuizen H., Willems R.J.L. et al. Role of Bordetella pertussis virulence factors in adherence to epithelial cell lines derived from the human respiratory tract// Infect. Immun.- 1999,- Vol. 67, N 3.- P. 1056-1062.

134. Van der Zee A., Agterberg C., Peeters M. Polymerase chain reaction assay for pertussis: simultaneous detection and discrimination of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis!I J. Clin. Microbiol.- 1993,- Vol. 31.- P. 2134-2140.

135. Van Loo I.H.M., Heuvelman K.J., King A.J., Mooi F.R. Multilocus Sequence Typing of Bordetella pertussis Based on Surface Protein Genes// J. Clin. Microbiol. -2002.- Vol. 40.- P. 1994-2001.

136. Van Loo I.H.M., van der Heide G.J., Nagelkerke N.J.D. et al. Temporal Trends in the Population Structure of Bordetella pertussis during 1949-1996 in a Highly Vaccinated Population//J. Infect. Dis.- 1999.- Vol. 179.-P. 915-923.

137. Von Konig C.H.W., Finger H. Role of pertussis toxin in causing symptoms of parapertussis infection// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.- 1994.- Vol. 13,- P. 455-458.

138. Waclowsky R.M. Inhibition of PCR-based assay for Bordetella pertussis by using calcium alginate fiber and alumunium shaft components of a NF swab// J. Clin. Microbiol.- 1994,- Vol. 34,- P. 1054-1057.

139. Westdijk J., van den Ijssel J. Quantification of cell-associated and free antigensin Bordetella pertussis su^etrsions by antigen binding ELISA// J. Immunoassay.- 1997.- Vol.18, Pt 3.- P. 267-284.

140. Weyant B.S., Hollis D.G., Weawer R.E. et al. Bordetella holmesii sp. nov., a new gram-negative species associated with septicemia// J. Clin. Microbiol.-1995.- Vol. 33.-P. 1-7.

141. Willems R.J.L., van der Heide H.G.J., ter Avest A.R., Mooi F.R. Fimbrial phase variation in Bordetella pertussis: a novel mechanism for transcriptional regulation//EMBO.- 1990.- Vol. 9,- P. 2803-2809.

142. Williamson P., Matthews R. Epitope mapping the Fim2 and Fim3 proteins of Bordetella pertussis with sera from patients infected with or vaccinated against whooping cough// FEMS Immunol. Med. Microbiol.- 1996.- Vol. 13.- P. 169178.

Информация о работе

Курова, Наталия Николаевна
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молекулярно-биологическая характеристика Bordetella pertussis, циркулирующих в период подъема заболеваемости, и совершенствование лабораторной диагностики коклюша - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы