Особенности генетической структуры современных штаммов Bordetella pertussis.

Гадуа, Натия Торникеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности генетической структуры современных штаммов Bordetella pertussis.
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности генетической структуры современных штаммов Bordetella pertussis."

На правах рукописи

ГАДУА НАТИЯ ТОРНИКЕЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ СОВРЕМЕННЫХ ШТАММОВ BORDETELLA PERTUSSIS

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 май 2012

Москва-2012

005044855

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

Ведущий научный сотрудник

лаборатории диагностики дифтерийной инфекции

ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского

Доктор медицинских наук Борисова Ольга Юрьевна

Официальные оппоненты:

Шендеров Борис Аркадьевич доктор медицинских наук, профессор, главный научны" сотрудник лаборатории биологии бифидобактерий ФБУ МНИИЭМ им. Г. Н Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей 1 благополучия человека;

Червинец Вячеслав Михайлович доктор медицинских наук, профессор, зав. Кафедро микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО Тверская государственная медицинска академия Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Ведущая организация:

ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И Мечникова РАМН (г. Москва)

диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении наук «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии и\ Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителе и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН МНИИЭМ ии Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирал Макарова, д.10.

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук О.Ю. Борисова

Защита состоится

12 г. в 10 часов на заседани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Коклюш является воздушно-капельной инфекцией, управляемой средствами специфической вакцинопрофилактики. Однако, несмотря на 50-летную массовую иммунизацию детского населения, коклюш до сих пор остается важной причиной младенческой смерти во всем мире и продолжает быть проблемой здравоохранения даже в странах с высоким уровнем охвата профилактическими прививками. Так, во многих странах Европы и Америки с 1990-х годов отмечается рост заболеваемости коклюшем, несмотря на высокий уровень охвата профилактическими прививками, который считается наиболее распространенным среди вакциноуправляемых инфекций. Одной из особенностей коклюшной инфекции в последние годы является рост числа случаев заболевания среди подростков и взрослых (Taranger J., 2001; Cherry J.D., 2005; Celentano L.P., 2005; Diavatopoulos D.A., 2005; Edwards K.M., 2005; Ward J.I., 2006; Forsyth K.D., 2007).

Коклюш в России в конце IXX и начале XX века также занимал первое место среди четырех капельных инфекций (коклюш, кори, скарлатины, дифтерии). Снижение заболеваемости отмечалось лишь в 1950-ые годы прошлого столетия и решающую роль в проблеме борьбы с коклюшем сыграла специфическая массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной, которая в нашей стране впервые была введена в широкую практику в 1958-1960 гг. Специфическая вакцинопрофилактика коклюша на протяжении последних 50 лет привела к резкому снижению заболеваемости, летальности и уменьшению тяжести течения болезни. Однако, несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения и высокий уровень охвата профилактическими прививками, до настоящего времени сохраняются подъемы и спады заболеваемости, как за счет непривитых, так и привитых лиц увеличилась заболеваемость детей школьного возраста. Регистрируется высокая заболеваемость детей раннего возраста с тяжелым течением заболевания, а также единичные случаи летальных исходов (Лыткина И.Н., 2004; Селезнева Т.С., 2004; Озерецковский H.A., 2004; Чистякова Г.Г., 2005). Кроме того, учитывая низкую эффективность лабораторной диагностики коклюша, можно полагать, что имеется недовыявление случаев коклюша и существует скрытое течение эпидемического процесса коклюшной инфекции. Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша и, следовательно, существовании риска возникновения заболеваний.

Одной из причин продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша является изменение его биологических свойств, как фенотипических, так и генотипических.

Молекулярно-генетический мониторинг возбудителя коклюша, проводимый в различи! странах на 4 континентах, а также в нашей стране показал, что штаммы B.pertus: подвержены генетической вариабельности, затрагивающей, в первую очередь, ген кодирующие основные факторы патогенности (Мазурова И.К., 2003; Семенов Б.Ф., 200 Борисова О.Ю., 2010; Guiso N., 2001; van Loo I.H.M., 2002; Preziozi M.P., 2002; Gzyl / 2004; Elomaa A„ 2005, 2007; Mooi F.R., 2010).

Возбудитель коклюша - Bordetella pertussis (B.pertussis) имеет множество фактор! патогенности, однако, основным является коклюшный токсин, который играет ведущу роль в развитии инфекционного процесса (Tamura М., 1982; Hsia J.А., 1984). Коклюшнь токсин (KT) имеет А-В структуру и состоит из A-комплекса (S1 субъединиц! обеспечивающего основные изменения в патогенезе коклюшной инфекции, и ] комплекса, состоящего из 5-ти субъединиц S2-S5, который отвечает за связывай] токсина с рецепторами мишени и способствует проникновению A-комплекса в клет! хозяина. У возбудителя коклюша продукция всех факторов патогенности находится m контролем двухкомпонентной BvgAS системы регуляции, включающей промоторну область коклюшного токсина, кодируемая регуляторным геном ptxP, экспрессия которо влияет на уровень продукции коклюшного токсина (Mooi F.R., 2010; Mooi F.I 2009).Кроме того, в развитии инфекции существенное значения имеют и другие фактс^ патогенности, в первую очередь пертактин, отвечающий за адгезию возбудителя i поверхности слизистой оболочки ротоглотки (Tuomanen Е., 1985; Shahin R.D., 1990; Hijnc М., 2004; Hijnen М., 2007). Изменения в генах, ответственных за проявление патогенное-возбудителя, его адгезию может привести к появлению штаммов' с измененныи свойствами и оказать влияние на течение эпидемического и инфекционного процессо поэтому наблюдение за возбудителем коклюша, за его фенотипическими и молекулярн генетическими свойствами является актуальным.

Цель исследования - выявление особенностей генотипической изменчивос-штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном эта1 эпидемического процесса коклюшной инфекции (2000 - 2010 гг.).

Задачи исследования:

1. Выявить особенности структуры генов ptxA, ptxB, ptxC, ptxD и ptxE, кодирующ! SI субъединицу A-комплекса и S2, S3, S4 и S5 субъединицы B-комплекса коклюшно! токсина (KT), и гена ргп, кодирующего пертактин, штаммов B.pertussis, выделенных < больных коклюшем в 2000 - 2010 гг.

2. Изучить особенности структуры регуляторного гена ptxP, кодирующего промоторную область коклюшного токсина, у современных штаммов В.pertussis и сопоставить со степенью их вирулентности.

3. Оценить динамику распространения штаммов В.pertussis с измененной структурой генов, кодирующих А-, В- комплексы и промоторную область коклюшного токсина и пертактин, на разных этапах эпидемического процесса коклюшной инфекции.

4. Изучить структуру генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxP и prn) штаммов B.pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и провести сравнительный анализ со структурой этих генов у штаммов B.pertussis, циркулирующих в России в последние 10 лет.

5. Пополнить музей штаммами современного периода (2005 - 2010 гг.) развития эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Научная новизна

Получены новые данные об особенностях структуры семи генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxD, ptxE, ptxP и prn), кодирующих субъединицы А-В-комплексов и промоторную область коклюшного токсина, а также пертактин штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и в настоящее время. Выявленные существенные и множественные мутации в структуре этих генов приводят к изменениям формирования белковых молекул антигенных детерминант (коклюшного токсина и пертактина), а также возможны функциональные изменения уровня продукции коклюшного токсина при мутациях в регуляторном гене.

Впервые показана генетическая структура современной популяции возбудителя коклюша, доминирующее положение в которой занимают штаммы B.pertussis с новыми «невакцинными» аллелями основных генов патогенности (коклюшного токсина и пертактина), а также выявлены новые мутации, приводящие к еще более существенным изменениям структуры и функции основных антигенных детерминант B.pertussis.

Полученные данные свидетельствуют, что формирование популяции штаммов B.pertussis в динамике развития эпидемического процесса коклюшной инфекции идет по пути вытеснения штаммов, содержащих «вакцинные» аллели, характерные для производственных вакцинных штаммов B.pertussis, штаммами с новыми «невакцинными» аллелями генов, кодирующими А-В-комплексы и промоторную область коклюшного токсина и пертактин, что указывает на необходимость продолжения исследований по подбору современных штаммов B.pertussis при производстве новых перспективных вакцинных препаратов.

Практическая значимость

Полученные данные о динамике распространение штаммов B.pertussis различными аллельными вариантами генов, кодирующих основные фактор патогенности, позволили проследить формирование популяции возбудителя коклюша различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и создать основ молекулярно-генетического мониторинга возбудителя коклюша в систеи эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией.

Пополнена уникальная коллекция штаммов B.pertussis, выделенными от больнь коклюшем в различных регионах России, дающая возможность проводить многоплановь исследования возбудителя коклюша с целью слежения за популяцией циркулирукшц штаммов и прогнозирования распространения штаммов с различной генетическс структурой основных детерминант патогенности возбудителя.

Выявленные особенности структуры генов, кодирующих А-В-комплека промоторную область коклюшного токсина и пертактин, послужили основой да определения «мишеней» (нуклеотидных последовательностей), при разработ! ускоренного метода лабораторной диагностики коклюша и ускоренных методе молекулярно-генетического мониторинга его возбудителя.

Внедрение результатов работы в практику

Полученные данные о генотипических особенностях структуры штамме B.pertussis послужили основой патента на изобретение РФ № 2007147797 от 20.02.2009 i «Способ и набор для ускоренной диагностики коклюша».

Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей-бактериологс «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на ба: ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2004 г.; 2005 г.; 2006 i 2009; 2010 гг.); семинаров тематического усовершенствования «Биологические свойсп возбудителя коклюша и лабораторная диагностика» для врачей-бактериологов филиале ФБУЗ ЦГиЭ г. Москвы (2008 г., 2009 г., 2010 г., 2012 г.) и обучающем курсе пр подготовке ординаторов ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Современные молекулярно-генетические методики изучения генотипическ? особенностей структуры штаммов B.pertussis используются в Референс центре г мониторингу за возбудителями дифтерии и коклюша ФБУН МНИИЭМ им. Г.1 Габричевского Роспотребнадзора при проведении микробиологического и молекулярш генетического мониторинга популяции штаммов возбудителя коклюша, циркулирующк на территории России.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Произошли существенные мутационные изменения в структуре генов,

кодирующих субъединицы А- и В- комплексов КТ и пертактин у штаммов B.pertussis, приводящие к изменениям на аминокислотном уровне иммуногенных областей КТ и пертактина. Впервые у штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, выявлены изменения структуры регуляторного гена ptxP, кодирующего промоторную область КТ. Новый «невакцинный» plxP3 аллель гена несет мутации, влияющие на уровень продукции КТ.

2. Установлен состав популяции штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции, - доминируют штаммы с новыми «невакцинными» ptxAl и ptxC2 аллелями генов, кодирующих S1 и S3 субъединицы КТ, ргп2 и ргпЗ аллелями гена, кодирующим пертактин, обнаружены единичные штаммы с измененной структурой гена ptxB, кодирующего S2 субъединицу, и с новым «невакцинным» ргп9 аллелем гена пертактина.

3. Показано несоответствие структуры генетических детерминант, кодирующих субъединицы А-В- комплексов и промоторную область КТ и пертактин, штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, и производственных вакцинных штаммов B.pertussis, входящих в состав АКДС-вакцины.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета «Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных заболеваний» ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол №7 от 8 декабря 2011 г.

Результаты диссертационной работы представлены на конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (пос. Оболенск, Московская обл., 2009, 2010 гг.); Международном форуме по нанотехнологиям (г.Москва, 2009 г.); VIII Конгрессе детских инфекционистов (г.Москва, 2010 г.); II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (г.Москва, 2010 г.), IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (г.Москва, 2012 г.). Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 9 статей - в рецензируемых изданиях, 12 работ - в материалах конференций и 1 патент на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 135 страницах машинописного текста включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 3 главы собственнь исследований, заключение и выводы. Работа иллюстрирована 7 таблицами и ^ рисунками. Список литературы включает 259 источников, в том числе 53 - отечественнь и 206 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Штаммы микроорганизмов. Объектами исследования служили 371 штам В.pertussis, выделенные от больных коклюшем и полученные из бактсриологичесю лабораторий ЛПО и ФБУЗ ЦГиЭ в субъектах Российской Федерации в период 2000-201 гг., а также штаммы В.pertussis, выделенные от больных коклюшем в 1948-1999 гг. (i коллекции лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФБУН МНИИЭМ ш Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора). Изученные штаммы выделены в различнь периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции, характеризующиеся различным уровне заболеваемости и охвата прививками: допрививочный период (1948 - 1959 гг.) и первь 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной (1960 1969 гг.) (34 штамма); период 1970 - 1989 гг. (60 штаммов); последние 20 лет (1990 - 201 гг.) (277 штамма). В работу включено три производственных штамма B.pertussis (№№ 47 267, 305), используемые для производства АКДС-вакцины в России (из коллекции ФГБ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвит! (ГИСК им. JI.A. Тарасевича).

Микробиологические методы. Источниками выделения B.pertussis был назофарингиапьные мазки, полученные при обследовании больных с подозрением t коклюш и коклюшеподобные заболевания. Исследование штаммов проводили согласи «Инструкции по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше паракоклюше» (1984 г.). Исследуемый материал засевали на казеиново-угольный ага (КУА) (ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России), с добавление 10% крови крупного рогатого скота (КРС). Идентификацию полученных штамме B.pertussis осуществляли путем оценки их морфологических, тинкториальных культуральных свойств с последующей сероидентификацией. Серотипову] принадлежность штаммов B.pertussis оценивали в реакции агглютинации диагностическими коклюшными сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 (производств ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России) согласно инструкци производителя.

Молекулярно-генетические методы. Выделение хромосомной ДНК проводили, согласно (Маниатис Т., 1984 г.) из 72-часовых культур В.pertussis, выращенных на КУА с добавлением 10% крови КРС. Выявление фрагментов генов ptxA, ptxB, ptxC, ptxD, ptxE, и ptxP штаммов B.pertussis осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), согласно международному протоколу генотипирования штаммов B.pertussis (Mooi F., 1999) в модификациях (van Loo I.H., 2002; Mooi F., 2009). Для постановки ПЦР использовали реактивы фирмы «Fermentas» (Литва) и праймеры, синтезированные в НПФ «Литех» (г. Москва). ПЦР проведена в автоматическом режиме на амплификаторе «Терцик» («ДНК - технология», г. Москва) с последующим анализом продуктов амплификации в 1,8% агарозном геле. Учет результатов осуществляли путем сравнения электрофоретической подвижности ампликонов с подвижностью маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Для выявления особенностей структуры гена ptxA применяли метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ) (Борисова О.Ю., 2008) с использованием двух рестриктаз (Ehel и Bful), позволяющий получить характерный рестрикционный профиль, определяющий генотип микроорганизма. Для выявления особенностей структуры гена ргп штаммов B.pertussis применяли метод «гнездовой» ПЦР (Muyldermans G., 2004) с использованием двух пар праймеров (C-D для первого раунда и E-D для второго раунда амплификации). Секвенирование фрагментов генов ptxB, ptxC, ptxD, ptxE и ptxP осуществляли по методу Сенгэра (Senger et al., 1977) на ABI DNA секвенаторе (Perkin-Elmer Applied Biosystems) с помощью ABI Prism Big Dye terminator cycle sequencing ready reaction kit. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием базы данных EMBL/GenBank на сайте Национального центра биотехнологической информации США (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez).

Вирулентные свойства штаммов B.pertussis изучали в опытах in vivo на мышах при интрацеребральном заражении согласно «Инструкция по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий» (2009 г.). В опытах использовали мышей - гибридов линии Fl. Для исследования использовали культуры 3-4 пассажа на среде Борде-Жангу с кровью. Кратные разведение 48- часовой культуры в опытной дозе вводили интрацеребрально 6-ти мышам и вели наблюдения в течение 14 дней. Животных погибших в первые три дня из опыта исключали. Подсчет результатов проводили по методу Рида и Менча.

Статистическая обработка результатов, анализ данных и программное обеспечение. Статистическую обработку и анализ полученных данных осуществляли по стандартным программам и общепринятым алгоритмам с помощью компьютерных

программ Microsoft Office Excel 2003. Компьютерный анализ подбора праймерс проводили с помощью: NCBI BIast2 (http://www.ncbi.nlrn.nih.gov/BLAST) - определен! гомологии при изучении секвенсов с соответствующих праймеров; РпшегЗ.О (http://ww\ genome.wi.mit.edu) - подбор праймеров и температур их плавления; Oligo 6.31 - основнс расчет характеристик ПЦР, возможности образования праймерами дуплексов и вторичнь структур. Нуклеотидные последовательности штаммов B.pertussis были сопоставлены базой данных EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez).

Экспериментальные результаты работы получены автором лично и совместно коллегами из ФРЛДДИ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзо! (руководитель лаборатории - д.м.н., профессор Мазурова И.К.). Изучение вирулентнь свойств B.pertussis выполнено совместно с коллективом сотрудников лаборатор!^ иммуномодуляторов ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва - к.м.н. Н.С. Захаровой, к.б.н. Н.У. Мерцаловой, к.м.н. Е.М. Зайцевым и А.< Шинкаревым.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Особенности структуры генов - ptxA, кодирующего S1 субъединицу А-комплекс ptxB, ptxC, ptxD и ptxE, кодирующих S2, S3, S4 и S5 субъединицы В-комплек< коклюшного токсина, и гена ргп, кодирующего пертактин, штаммов B.pertussi выделенных от больных коклюшем в период 2000 - 2010 годы. Результаты изучения особенностей молекулярно-генетической структуры генов ptx. ptxB, ptxC, ptxD, ptxE и ргп, кодирующих основные факторы патогенности возбудите.г коклюша представлены (табл. 1). У современных штаммов B.pertussis, выделенных < больных коклюшем выявлены мутационные изменения в структуре этих генов.

При секвенировании фрагментов гена ptxA, кодирующего А-комплекс КТ, штаммов B.pertussis обнаружены 3 варианта последовательности нуклеотидов, которы согласно GenBank, соответствовали одному их трех аллелей гена ptxA - ptxА2 (AJ245367 ptxA4 (AJ245368) или ptx Al (AJ245366) аллелям (табл. 1). Среди них ptxAl аллель являете «невакцинным», ptxA2/ptxA4 - старыми «вакцинными» аллелями, согласг EMBL/GenBank. Наиболее существенные замены произошли у штаммов с новы «невакцинным» ptxAl аллелем в двух положениях - 204 (А - С) и 684 (G - А), которь приводили к заменам на аминокислотном уровне - G68A и M228I. Эти изменеш затрагивают Т- и В-эпитопы КТ, имеющие непрерывные иммунодоминантные структур! распознаваемые протективными моноклональными mAbs-антителами к этим эпитопа (Mooi F., 2009, 2010). Среди штаммов B.pertussis, выделенных в 2000-2010 годы оказалос что большинство штаммов 97,7% несут «невакцинный»ptxAl аллель гена.

При изучении фрагментов гена р!хВ штаммов В.регт^и обнаружено 2 варианта последовательности нуклеотидов (табл.1), из которых вариант 1 соответствовал опубликованной в СепВапк последовательности нуклеотидов гена р1хВ штамма В.рел/гт;.? (М13223), а последовательность нуклеотидов варианта 2 отличалась от варианта 1 в восьми положениях, из которых наиболее существенные замены произошли в двух положениях - 65 (С - й) и 290 (Т - А), приводящие к контрастным заменам на аминокислотном уровне - Б22С и У97С1и. При изучении динамики распространения штаммов оказалось, что в начале этого века в 2007 году появились единичные

штаммы в 2,2% случаях с новым «невакцинным» р/хВ2 аплелем гена. Следовательно, впервые у штаммов В.регйти, выделенных от больных коклюшем в России, показана вариабельность структуры гена р1хВ с появлением нуклеотидных контрастных замен, оказывающих влияние на скорость и интенсивность синтеза Б2 субъединицы В-комплекса КТ (Алтухов Ю.П., 2003).

По структуре гена р!хС у изученных штаммов В.рел/ыгси также выявлено два варианта последовательности нуклеотидов, которые соответствовали, согласно СепВапк, двум аллелям гена р1хС (табл. 1): вариант 1 - «вакцинному» р!хС1 аллелю (М13223), вариант 2 - «невакцинному» р[хС2 аллелю (А.1420987) и различались между собой в одном положении - замена нуклеотида в положении 681 (С - Т), которая является не контрастной и не сопровождается изменениями на аминокислотном уровне БЗ субъединицы В-комплекса КТ. Среди штаммов выделенных в 2000-2010 годы

оказалось, что в популяции доминируют штаммы с «невакцинным» р1хС2 аллелем гена в 91,2% случаев. Вместе с тем, согласно по данным литературы, штаммы с этим «невакцинным» аллелем относятся к одному пульс-гель-профилю и вызвали с 1990-х годов прошлого века рост заболеваемости коклюшем в Европейских странах.

При изучении структуры генов рОгО и р!хЕ штаммов В.реМ1хз1з не выявлены изменения в структуре этих генов. Варианты последовательностей нуклеотидов гена р1хО и гена р1хЕ соответствовали нуклеотидным последовательностям генов р1хО (М13223) и р1хЕ (М13223), опубликованным в СепВапк, т.е. по структуре этих генов популяция циркулирующих штаммов возбудителя коклюша является однородной.

При изучении особенностей структуры гена ргп, кодирующего главный адгезии возбудителя - белок пертактин, оказалось, что данный ген является одним из наиболее полиморфных генов. Структура гена ргп циркулирующих штаммов соответствовала одному из четырех выявленных аллелей - ргп1 (АКИ1091), ргпЗ (Л 1011093), ргп2 (АЛИ1092) или ргп9 (А.Г315611.1), из которых ргп1 аллель является «вакцинным» аллелем этого гена, согласно ЕМВЬ/СепПапк. «Невакцинные» ргп2, ргпЗ и ргп9 аллели отличаются

от «вакцинного» рт1 аллеля наличием «немолчащих» мутаций в шести положениях 828, 831, 832, 833, 834 и 836, приводящих к контрастным заменам на аминокислотно уровне - А278Р и \291G.

Табл. 1. Положение нуклеотидных замен в различных аллелях генов р1хЛ, р!х1 р!хС и ргп штаммов современной популяции В.реПш.ч^.ч.

Вар-ты нукл. посл-тей Алле ли генов Положение нуклеотидных замен У, ы ш

ген ptxA 204 684 696

Вар. 1 ptxA2 С G А 1

Вар. 2 ptxA4 А G G С

Вар. 3 ptxAl С А А 9

ген ptxB 55 65 75 129 252 290 360 510

Вар. 1 ptxBl С С G Т С Т Т G 9

Вар. 2 ptxB2 т G С С т А С А 2

ген ptxC 680

Вар. 1 ptxCl С 1

Вар. 2 ptxC2 Т 8

ген ргп 828 831 833 833 834 836 Дополнительная вставка

841-855 856-871

Вар. 1 pml Т т G с G Т

Вар. 2 prn2 С с т т С G GGCGGCCTCGGTCCC - 9.

Вар. 3 ргпЗ с с т т С G 1

Вар. 4 prn9 с с т т С G GGCGGCCTCGGTCCC GGCGGCCTCGGTCCC С

Последовательность нуклеотидов ргп2 аллеля отличается от последовательност нуклеотидов ргпЗ аллеля наличием вставки дополнительного фрагмента в 15 п.н. в области гена. Нами впервые обнаружены штаммы с другим (третьим) «невакцинным ргп9 аллелем гена, который является «невакцинным» и имеет еще дополнительны фрагмент в 30 п.н. в 1 области гена. Все изменения в ргп2, ргпЗ и ргп9 аллелях произошл в 1 и 2 областях Ргп белка, которые являются иммуногенными и участвуют формировании В-клеточного иммунного ответа (Boursaux-Eude С., 1999; Bernard М., 199! King A.J., 2001).

Таким образом, изучение молекулярно-генетических особенностей структур]

штаммов B.pertussis, выделенных с 2000-2010 гг., показало, что в настоящее время

циркулирующей популяции доминируют штаммы с новой генетической структурой - ген

ptxA, кодирующего А-комплекс КТ (97,7%); гена ptxC, кодирующего S3 субъединицу Е

комплекса КТ (87,4%); гена ргп, кодирующего пертактин (97,1%); также появились изменения гена р1хВ, кодирующего Б2 субъединицу В-комплекса КТ (2,2%). Изменения в структуре генов р/хВ и р1хЕ, кодирующих 84 и Э5 субъединицы В-комплекса КТ, у современных штаммов не обнаружены.

Особенности структуры регуляторного гена рЬсР, кодирующего нромоторную область коклюшного токсина.

При секвенировании фрагментов гена р1хР у штаммов В.регШяи обнаружено 3 варианта последовательности нуклеотидов, которые различались между собой в двух положениях (-167) и (-65) (рис. 1). Полученные последовательности нуклеотидов полностью соответствовали последовательностям, опубликованным в ОепВапк, и соответствовали трем аллелям гена р1хР\ вариант 1 - «вакцинному» р1хР1 аллелю (М13223), вариант 2 - «невакцинному» ргхР2 аллелю (А.1420987) и вариант 3 -«невакцинному» р!хРЗ аллелю (А.Г420987).

Iiis GIJT ...81И§г«я... Акр ..еге0»1е- ._=-

Туг

V : -im \ ---—у •w I -у / f—Тайт iw< яд^п ^v у V сгэ <Z» с_:.

Ii 1

«S »0 -JS -ю

Рис. 1. Мутации в структуре гена ptxP, кодирующего регуляторную промоторную область коклюшного токсина, штаммов B.perlussis, выделенных от больных коклюшем.

«Невакцинный» аллель ptxP2 отличается от «вакцинного» ptxPl аллеля наличием «немолчащей» мутации в (-167) положении (С - Т), приводящей к замене на аминокислотном уровне - Н57Т в промоторе КТ. Другой «невакцинный» ptxPi аллель характеризуется наличием «немолчащей» мутации в (-65) положении нуклеотидной последовательности, приводящей к замене на аминокислотном уровне - G22Asp в промоторе КТ. Такая замена находится в одном из основных сайтов связывания с димером BvgA, точность присоединения которого на такой сайт и прочность образуемой связи влияет на экспрессию генов ptx и, следовательно, на уровень продукции КТ. При изучении современных штаммов B.perlussis оказалось (рис.2), что 4,0% штаммов B.perlussis имели

«вакцинный» р1хР1 аллель гена, 2,7% штаммов - р1хР2 аллель и 93,3% штаммов -«невакцинный» р1хРЗ аллель гена.

Л no.i

2J%

OptxPi

93 Шр£сР2

Q реаРЗ

Рис. 2. Характеристика современных штаммов В.pertussis гена ptxP.

Следовательно, большинство современных штаммов В.pertussis, выделенных от больных коклюшем в нашей стране, несут новую структуру этого гена - «невакцинный ptxPi аллель гена.

С целью сопоставления структуры регуляторного гена ptxP, кодирующег: промоторную область КТ, и биологических свойств современных штаммов В.pertussin совместно с сотрудниками института ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечников РАМН - к.м.н. Н.С. Захаровой, к.б.н. Н.У. Мерцаповой, к.м.н. Е.М. Зайцевым и А.С Шинкаревым проведено изучение вирулентных свойств 15 штаммов В .pertussis, выделенных от больных коклюшем в последние годы. Исследования проводили in vivo н мышах путем их интрацеребрального заражения и последующего расчета LDso- Оказалось, что все штаммы с высокой и один штамм со средней степенью вирулентности несл 7 новый «невакцинный» ptxP3 аллель гена. В то время как среди двух современны., слабовирулентных штаммов, LDso которых значительно превышала критерий оценк -слабовирулентности штаммов, один штамм характеризовался новым «невакцинным.. ptxP3 аллелем, а другой штамм - старым «вакцинным» ptxPl аллелем геш Следовательно, большинство современных штаммов обладают высокой степены вирулентности, которая объясняется наличием у них значительных мутационны изменений в структуре гена ptxP, кодирующего регуляторную промоторную область КТ, несут новый «невакцинный» ptxP3 аллель.

Сравнительный анализ структуры генов ptxA, ptxB, ptxC, ptxP и ргп штаммов В. pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и современных штаммов, выделенных от больных коклюшем в России.

При изучении структуры генов, кодирующих А-, B-комплексы, проморную область KT и пертактин, штаммов B.pertussis, вызывающих заболевания коклюшем на современном этапе, и отечественных производственных вакцинных штаммов (табл. 2), оказалось, что все три вакцинных штамма имели старые «вакцинные» ptxA2/plxA4 аллели гена, кодирующего S1 субъединицу А-комплекса KT. В то время как, структура гена ptxA штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем в последние 10 лет, характеризуется в 97,7% случаях новым «невакцинным» ptxAl аллелем гена. При изучении структуры генов ptxB и ptxC, кодирующих субъединицы B-комплекса KT, у вакцинных и современных штаммов B.pertussis обнаружено, что все три вакцинных штамма B.pertussis несут «вакцинные» ptxBl и ptxCl аллели генов, кодирующих S2 и S3 субъединицы B-комплекса KT; современная циркулирующая популяция в 87,4% случаев представлена штаммами с новым «невакцинным» ptxC2 аллелем и обнаружено 2 штамма, несущих новый «невакцинный» ptxB2 аллель гена. По структуре гена ptxP, кодирующего промоторную область KT, выявлено, что из трех вакцинных штаммов, два штамма, выделенных в 1950-х годах, несут старый «вакцинный» ptxPl аллель гена; один штамм B.pertussis № 475, который введен в состав АКДС-вакцины в конце 1960-х годов, несет уже «невакцинный» ptxP2 аллель этого гена. Современная популяция в 93,3% случаях характеризуется штаммами с другим новым «невакцинным» ptxP3 аллелем гена.

Табл.2. Сравнительный анализ структуры генов ptxA, ptxB, ptxC, ptxP и ргп штаммов В. pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и современных штаммов, выделенных от больных коклюшем в России.

Штаммы Ссротип Генотип(аллель гена)

B.pertussis ptxA ptxB ptxC ptxP pm

вакцинные штаммы

№475 (1966 г.) 1.2.3 ptxA4 ptxBl ptxCl ptxP2 prnl

№305 (1956 г.) 1.2.0 ptxA2 ptxBl ptxCl ptxPl prnl

№267 (1956 г.) 1.0.3 ptxA2 ptxBl ptxCl ptxPl prnl

Штаммы, выделенные от больных коклюшем

2000-2010 гг. 1.2.3 1.2.0 1.0.3 ptxAl-97,7% ptxA2-l,5% ptxA4 -0,8% ptxBl-91,8% ptxB2-2,2% ptxCl-\2,6% ptxC2- 87,4% ptxPl- 4,0% ptxP2 - 2,TU ptxP3 -93,3% prnl - 3,9% prn2 - 94,0% pm3 - 2,7% prn9 - 0,4%

Следовательно, показано несоответствие структуры генетических детерминант, кодирующих субъединицы А-, В- комплексов и промоторную область коклюшного токсина и пертактин, у современных циркулирующих штаммов В.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, и производственных штаммов B.pertussis, используемых для АКДС-вакцины.

Распространение штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, с аллельными вариантами генов ptxA, ptxB, ptxC, ptxP и prn.

Для оценки динамики формирования современной популяции возбудителя коклюша изучены особенности структуры 5 генов, детерминирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша, у 371 штамма B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России в различные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции.

Анализ динамики распространении штаммов B.pertussis с различной структурой гена ptxA показал (рис. 3), что в допрививочный период (1948 - 1959 гг.) вся циркулирующая популяция характеризовалась старыми «вакцинными» ptxA2/ptxA4 аллелями гена ptxA, кодирующего S1 субъединицу А-комплекса KT. В конце 1960-х годов в популяции штаммов B.pertussis стали регистрироваться единичные штаммы (9,5%) с новым «невакцинным» ptxAl аллелем гена. Остальные штаммы несли ptxA4 (38,0%) и ptxA2 (52,5%) аллели гена. В 1970-е годы большинство циркулирующих штаммов имели старые «вакцинные» аллели ptxA гена: 48,4% штаммов - «вакцинный» ptxA4 аллель, 35,5% штаммов - «вакцинный» ptxA2 аллель и 16,1% штаммов характеризовались «невакцинным» ptxAl аллелем, имеющим значительные мутационные изменения в иммуногенных областях коклюшного токсина.

100% 80% -бон

40% -20% 0%

1.5!

15,1!

8,3%

5 2,5% 3 5,5%

8,0%1

$,4!'<

00U

00?!

'2,1

оptx.il UptxA2 иргх.и

5,3%

•"■■-1-J61

1948-1959 1960-19691970-1979 1980-1999 2000-2005 2006-2010

Рис. 3. Удельный вес штаммов B.pertussis с аллельными вариантами гена ptxA,

циркулирующие в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Все изученные штаммы B.pertussis, выделенные в 1980-е и 1990-е гг. (39 штаммов) прошлого столетия и в начале нового столетия 2000-2005 гг. (185 штаммов), имели «невакцинный» ptxAl аллель гена; 70 (92,1%) штаммов, выделенных в 2006 - 2010 гг., также несли этот аллель гена, т.е. в современной популяции возбудителя коклюша доминируют штаммы с новой генетической структурой, кодирующей А-комплекс KT.

При изучении распространения штаммов B.pertussis, с различной структурой гена ptxB, кодирующего S2 субъединицу B-комплекса KT, оказалось (рис. 4), что вплоть до настоящего времени, т.е. в периоды, охватывающие допрививочный и 50 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной, циркулирующая популяция штаммов B.pertussis, по структуре гена ptxB была однородной.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10%

_1948-1959 1960-1969 1970-1979 : [980-1999 2000-2010_

Рис. 4. Удельный вес штаммов B.pertussis с аллельными вариантами гена ptxB в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции. Однако, среди штаммов B.pertussis, выделенных в 2000 - 2010 гг., зарегистрированы 2 (2,2%) штамма B.pertussis, несущие ptxB2 аллель гена с значительными мутационными изменениями в двух положениях, приводящими к заменам на аминокислотном уровне. Следовательно, отмечается начало перестройки циркулирующей популяции штаммов B.pertussis, идущей по пути появления генетической вариабельности и в гене ptxB, кодирующем S2 белок B-комплекса KT.

При анализе распространения штаммов B.pertussis с различной структурой гена ptxC, кодирующего S3 субъединицу B-комплекса KT, установлено (рис. 5), что для всех изученных штаммов B.pertussis, выделенных в 1948 - 1959 гг., 1960 - 1969 гг. и в 1970 -1979 гг., характерным было наличие «вакцинного» ptxCl аллеля гена. В 1980 - 1999 гг. удельный вес штаммов B.pertussis, несущих ptxCl аллель, составил 92,0%. Вместе с тем, в начале 1980-х годов в циркулирующей популяции стали регистрировать единичные

штаммы (8,0%) с новым «невакцинным» р1хС2 аплелем. В последующие годы удельный вес таких штаммов увеличился.

Так, среди штаммов, выделенных в 2000 - 2005 гг., только 14,0% штаммов несли старый «вакцинный» р1хС1 аллель и 86,0% штаммов характеризовались новым «невакцинным» р1хС2 аллелем гена.

Рис. 5. Удельный вес штаммов B.pertussis с аллельными вариантами гена ptxC, циркулирующие в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Из 60 штаммов, выделенных в 2006 - 2010 гг., 7 (И,7%) штаммов имелиplxCl аллель и 53 (88,3%) штамма - ptxC2 аллель гена. Следовательно, с 2000 г. в циркулирующей популяции штаммов возбудителя коклюша доминируют штаммы с новым «невакцинным» ptxC2 аллелем гена, кодирующим S3 субъединицу B-комплекса KT.

По структуре гена ptxP среди изученных штаммов B.pertussis, выделенных в допрививочный период (1948 - 1959 гг.), 71,4% штаммов имели «невакцинный» ptxP2 аллель и 28,6% штаммов - «вакцинный» ptxPl аллель (рис. 6). В последующие годы отмечается постепенное увеличение удельного веса штаммов с ptxPl аллелем до 41,7% в 1960-1969 гг. и 70,6% в 1970-1979 гг. и уменьшение удельного веса штаммов с ptxP2 аллелем до 58,3% в 1960-1969 гг. и 29,4% в 1970-1979 гг. В 1980-1989 гг. удельный вес штаммов с ptxPl аллелем составил 95,0%, а с ptxP2 аллелем снизился до 5,0%. В 19901999 гг. впервые зарегистрированы в 11,1% случаев штаммы B.pertussis, несущие новый «невакцинный» ptxP3 аллель гена, имеющий немолчащие мутации, влияющие на уровень продукции коклюшного токсина.

Среди 75 штаммов B.pertussis, выделенных в последние десять лет, большинство (93,3%) штаммов характеризуются «невакцинным» ptxP3 аллелем, 2,7% штаммов -

«невакцинным» р1хР2 и 4,0% штаммов - «вакцинным» р1хР1 аллелями гена. Следовательно, в последние десять лет в циркулирующей популяции доминируют штаммы с «невакцинным» р1хРЗ аллелем гена, кодирующим промоторную область КТ.

Рис. 6. Удельный вес штаммов B.pertussis с аллельными вариантами гена ptxP, выделенные в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Одним из главных адгезинов возбудителя коклюша является пертактин. Показано (рис. 7), что для всех штаммов B.pertussis допрививочного периода (1948-1959 гг.) характерным было наличие «вакцинного» prnl аплеля гена. В последующие годы отмечалось постепенное сокращение доли таких штаммов и увеличение удельного веса штаммов с новой генетической структурой. Среди штаммов B.pertussis, выделенных в 1970-е годы, 96,9% штаммов имели «вакцинный» prnl аллель и 3,1% штаммов -«невакцинный» ргпЗ аллель гена, которое отличается от «вакцинного» аллеля наличием «немолчащих» мутаций, приводящих к замене на аминокислотном уровне. В 1980-е годы доля штаммов с «невакцинным» ргпЗ аллелем увеличилась до 31,1%. Вместе с тем, уже к концу 1980-х годов в популяции появились также штаммы с другим «невакцинным» ргп2 аллелем гена, имеющим мутационные изменения приводящие к заменам на аминокислотном уровне. Среди штаммов B.pertussis, выделенных в 1990 - 1999 гг., 44,5% штаммов имели «вакцинный» prnl аллель, 22,2% штаммов - «невакцинный» ргп2 аллель и 33,3% штаммов - «невакцинный» ргпЗ аллель, т.е. значительно увеличилась доля циркулирующих штаммов B.pertussis с «невакцинным» ргп2 аллелем гена.

Большинство (97,9%) штаммов B.pertussis, выделенных в начале нового столетия (2000-2005 гг.), характеризовались «невакцинными» ргп2 и ргпЗ аллелями гена пертактина. В 2006 - 2010 гг. у циркулирующих штаммов B.pertussis наблюдается большая гетерогенность «невакцинных» аллелей: 89,5% штаммов характеризуются новым

«невакцинным» ргп2 аллелем, 5,3% штаммов - «невакцинным» ргпЗ аллелем и впервые выявлено 1,3% штаммов с другим новым «невакцинным» ргп9 аллелем гена, который ранее не регистрировали и характеризуется еще более значительными мутационными изменениями.

1945-19691970-19791920-19991990-19992000-20052006-2010

Рис. 7. Удельный вес штаммов В.ретиж с аллельными вариантами гена ргп, циркулирующие в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции.

Анализ динамики изменчивости штаммов В.регШя.ч/х, выделенных в различные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции, позволил проследить формирование популяции возбудителя коклюша, которое идет путем замены штаммов со старыми «вакцинными» аллелями на штаммы, несущие новые «невакцинные» аллели, и происходит поступательно, затрагивая последовательно генетические детерминанты, кодирующие основные факторы патогенное™ возбудителя (рис. 8).

Рис. 8. Динамика появления штаммов В.регШ$Ь с новыми «невакцинными» аллелями генов, кодирующих А- (р1хА) и В- (раС) комплексы коклюшного токсина, его промоторную область (рГхР) и пертактин (ргп).

С середины 1960-х годов, т.е. через 10 лет проведения массовой иммунизации, в популяции первыми появились штаммы с новым «невакцинным» аллелем гена А-комплекса KT. Далее изменения затронули рт ген, отвечающий за адгезию возбудителя к поверхности чувствительного эпителия, с появлением в 1970-е годы штаммов В.pertussis сначала с новым «невакцинным» ргпЗ аллелем, в 1980-е годы с «невакцинным» ргп2 аллелем и в 2000-е годы «невакцинным» ргп9 аллелем гена (рис. 8).

В 1990-е - 2000-е годы изменения затронули не только ген, отвечающий за основные патоморфологические процессы в эукариотической клетке (А-комплекс), но и отвечающие за прикрепление его к рецептору и проникновение внутрь клетки (В-комплекс). В середине 1990-х годов были выявлены штаммы B.pertussis, у которых существенные изменения произошли в структуре генетической детерминанты, кодирующей промоторную область KT, т.е. регуляторную область, влияющую на продукцию основного фактора патогенности возбудителя, что привело к увеличению продукции коклюшного токсина у современных штаммов возбудителя коклюша. Такие изменения расширяют приспособительные возможности возбудителя коклюша, что способствует его адаптации в меняющихся условиях существования, и прежде всего, в условиях длительной массовой иммунизации (Godfroid F., 2005; van Boven M., 2005; Brinig M.M., 2006). Все это свидетельствует о происходящей клонапьной экспансии штаммов с новой генетической структурой основных факторов патогенности, которая не соответствует генетической структуре производственных штаммов, используемых для производства вакцинных препаратов при профилактике коклюша.

выводы

1. Выявлены существенные мутации в структуре генов современных штаммов В.регШзз1х приводящие к изменениям на аминокислотном уровне иммуногенных областей Т- и В-эпитопов коклюшного токсина и В-эпитопа пертактина, что может влиять на формирование иммунного ответа.

2. Впервые у штаммов В.регШззк, выделенных от больных коклюшем в России, выявлены изменения в структуре регуляторного р!хР гена, кодирующего промоторную область коклюшного токсина, с формированием нового «невакцинного» р1хРЗ аллеля, что влияет на уровень продукции коклюшного токсина.

3. Установлено, что популяция штаммов В.реМюзЬ формируется путем клональной экспансии штаммов с новой генетической структурой основных факторов патогенности - коклюшного токсина и пертактина. Установлен состав популяции штаммов В.регШъъЬ, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции - с доминированием штаммов с новыми «невакцинными» аллелями генов - р1хА1 (97,7%), р1хС2 (87,4%) и ргп2 (89,5%).

4. Обнаружено, что среди современных штаммов В.регШжк циркулируют единичные штаммы с еще более существенными и множественными изменениями генетической структуры коклюшного токсина и пертактина - в 2,2% случаях с р1хВ2 аллелем и в 1,3% случаях с ргп9 аллелем, влияющие на адгезивные свойства возбудителя коклюша. Изменений в структуре детерминант, кодирующих Б4 и Э5 субъединицы В - комплекса КТ, не обнаружено.

5. Показано несоответствие структуры генетических детерминант, кодирующих субъединицы А- и В- комплексов коклюшного токсина, его промоторную область и пертактин, у современных циркулирующих штаммов В.реПшзю, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, и производственных вакцинных штаммов входящих в состав АКДС-вакцины.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Продолжение исследований по выявлению генетических изменений в штаммах возбудителя коклюша с целью установления механизмов формирования популяции в различные периоды эпидемического процесса позволяет обосновать замену штаммов при производстве вакцинных препаратов при профилактике коклюша.

Изучение генотипических особенностей структуры штаммов возбудителя коклюша может быть рекомендовано как дополнительный критерий при выборе штаммов для включения в состав профилактических препаратов.

Уникальная коллекция штаммов В.рел-/иж$ю пополненная штаммами, выделенными от больных коклюшем в современный период эпидемического процесса коклюшной инфекции может быть использована для проведения фундаментальных прикладных исследований посвященных, изучению биологии возбудителя коклюша и слежению за циркулирующей популяции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Борисова О.Ю. Полиморфизм генов, кодирующих основные факторы патогенности штаммов ¡¡.pertussis / Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Герасимова А.Г., Пяева А.П., Скачкова В.Г., Захарова Н.С., Мерцапова Н.У., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Материалы IX Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - 2007. - том 1. - С. 50 -51.

2. Борисова О.Ю. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов В.pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции / Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мерцапова Н.У., Шинкарев A.C., Захарова Н.С., Пяева А.П., Лыткина И.Н., Требунских И.П., Салова Н.Я., Савинкова B.C., Скачкова В.Г., Мазурова И.К. // Материалы 4-ой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», 2-4 июня 2008 г., Санкт - Петербург. - 2008. - С. 7.

3. Борисова О.Ю. Молекулярно-генетический метод ускоренного выявления штаммов B.pertussis, обладающих различными ptx генами / Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. // Журнал микробиологии. -2008.-№5.-С. 80-83.

4. Мазурова И.К. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве (1948 -2005 гг.) / Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Алешкин В.А. // Журнал молекулярной медицины. - 2008. - № 1. - С. 40 - 45.

5. Мерцалова Н.У. Динамика изменений патогенных свойств штаммов B.pertussis / Мерцалова Н.У., Борисова О.Ю., Шинкарев A.C., Брицина М.В., Озерецковская М.Н., Мазурова И.К., Алешкин В.А., Гадуа Н.Т., Захарова Н.С. // Журнал микробиологии. - 2009. - № 6. - С. 7 - 11.

6. Борисова О.Ю. Мониторинг штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в 1948 - 2007 гг. / Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т. // Материалы научно-практ. конференции молодых ученых и специалистов НИУ Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» 21-22 апреля 2009 г. (г. Оболенск, Московская область). - 2009.-С.49-51.

7. Борисова О.Ю. Ускоренный молекулярно-генетический метод выявления возбудителя коклюша / Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова

О.П., Комбарова С.Ю., Мазурова U.K., Алешкин В.А. // Медицинский альманах. - 2009. - № 2 (7). - С. 51 - 53.

8. Гадуа Н.Т. Ускоренный молекулярно-генетический метод выявления возбудителя коклюша, основанный на изотермальной амплификационной технологии / Гадуа Н.Т., Борисова О.Ю., Петрова М.С., Попова О.П., Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Материалы Международного форума по нанотехнологиям «Rusnanotech», 6-8 октября 2009 г. (г. Москва). - 2009. - стр. 851 - 852.

9. Гадуа Н.Т. Сопоставление генетической структуры штаммов B.pertussis, используемых для производства АКДС-вакцины, и штаммов, выделенных от больных коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции» / Гадуа Н.Т., Борисова О.Ю. // Материалы научно-практ. конференции молодых ученых и специалистов НИУ Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» 21 - 22 апреля 2009 г. (г. Оболенск, Московская область). - 2009. - С. 52 - 53.

Ю.Борисова О.Ю. Характеристика штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем / Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Гадуа Н.Т., Салова Н.Я., Требунских И.П., Скачкова В.Г., Савинкова B.C., Алешкин В.А. // Материалы международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», 18-20 мая 2010 г., г. Санкт-Петербург). - 2010. - С. 120.

11 .Борисова О.Ю. Особенности коклюшной инфекции в различные периоды эпидемического процесса в г. Москве / Борисова О.Ю., Петрова М.С., Мазурова И.К., Лыткина H.H., Попова О.П., Гадуа Н.Т., Мерцалова Н.У., Захарова Н.С., Пяева А.П., Салова Н.Я., Требунских И.П., Комбарова С.Ю., Шинкарев A.C., Скачкова В.Г., Савинкова B.C., Алешкин В.А. // Журнал эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2010. - № 4. - С. 33 - 39.

12.Борисова О.Ю. Прямой ускоренный метод выявления возбудителя коклюша / Борисова О.Ю., Петрова М.С., Гадуа Н.Т., Скачкова В.Г., Савинкова B.C., Попова О.П., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 5. - С. 53 - 55.

1 З.Борисова О.Ю. Особенности циркуляции штаммов возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции / Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Лыткина И.Н., Гадуа Н.Т., Пяева А.П., Салова Н.Я., Требунских И.П., Алешкин В.А. // Материалы VII Всеросс.научно-практ.

конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2010», 24 -26 ноября 2010 г. (г. Москва).-2010.-С. 153- 154.

14.Борисова О.Ю. Молекулярио-геиетические особенности структуры гена, кодирующего фактор колонизации трахеи штаммов ¡¡.pertussis / Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Гадуа Н.Т., Салова Н.Я., Требунских И.П., Алешкин В.А. // Журн. Микробиологии - 2010. - № 5. - С. 11 -15.

15.Борисова О.Ю. Антибиотикорезистентность циркулирующих штаммов В.pertussis. /Борисова О.Ю., Ивашинникова Г.А., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К. // Материалы III Ежегодного Всеросс. Конгресса по инфекционным болезням, 28 -30 марта 2011 г. (г. Москва). - 2011. - С. 54.

16.Ивашинникова Г.А. Чувствительность штаммов B.pertussis к антибактериальным препаратам. / Ивашинникова Г.А., Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Материалы научно-практической конференции молодых ученых Роспотребнадзора, посвященной 90-летию со дня рождения академика РАМН И. Н. Блохиной, 20 -21 апреля 2011 г. (г. Н. Новгород). - 2011 г. -С. 81.

17.Борисова О.Ю. Особенности структуры генов, кодирующих А- и В-комплексы коклюшного токсина, штаммов B.pertussis. / Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Салова Н.Я., Требунских И.П., Скачкова В.Г., Панферова P.A., Ивашинникова Г.А., Рудакова И.А., Мазурова И.К., Алешкин В.А. // Журнал молекулярной медицины.-2012. - № 1.-С. 44 — 48.

18.Борисова О.Ю. Мультилокусное секвенирование штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в настоящее время в России / Борисова О.Ю., Ивашинникова Г.А., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К. // Материалы IV Ежегодного Всеросс. Конгресса по инфекционным болезням. - 2012. - С. 64.

19.Ивашинникова Г.А. Характеристика современных штаммов B.pertussis по структуре ptxP гена, кодирующего промоторную область коклюшного токсина / Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К. // Материалы IV Ежегодного Всеросс. Конгресса по инфекционным болезням. - 2012 - С. 161.

20.Борисова О.Ю. Мониторинг штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России / Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Гадуа Н.Т., Ивашинникова Г.А., Рудакова И.А. // Материалы X съезда Всеросс. научно-практич. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы

обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ» 12-13 апреля 2012 г. (г. Москва). - 2012. - С. 245.

21.Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Ивашиниикова Г.А., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Салопа Н.Я., Требунских И.П., Скачкова В.Г., Панферова P.A., Mooi F., Алешкнн В.А. Характеристика штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве, с помощью мультилокусного секвеннровання. // Журнал мнкробнол. - 2012. - № 2. - С. 28 - 34.

Изобретения:

1. Патент РФ № 2007147797 от 20.02.2009, бюлл № 5 Способ и набор для ускоренной диагностики коклюша /Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова О.П., Алешкин В.А.; заявитель и патентообладатель: ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Росиотребнадзора. - заявка №2007147797/13 от 25.12.2007.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КТ - коклюшный токсин

КУА - казеиново-угольный агар

ЛПО - лечебно-профилактические организации

ПЦР-ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФБУЗ ЦГиЭ — федеральное бюджетное учреждение здравоохранения центр гигиены и эпидемиологии

ФРЛДДИ - Федеральная референс лаборатория диагностики

дифтерийной инфекции ргп - ген пертактина

р!хЛ - ген, кодирующий Б1 субъединицу коклюшного токсина

р1хВ - ген, кодирующий Э2 субъединицу коклюшного токсина

р1хС - ген, кодирующий ЭЗ субъединицу коклюшного токсина

р1хй - ген, кодирующий Б4 субъединицу коклюшного токсина

р1хЕ - ген, кодирующий Б5 субъединицу коклюшного токсина

р1хР - ген, кодирующий промотурную область коклюшного токсина

Ргп - белок пертактин

Отпечатано в ООО "Литера-Принт". Адрес: г. Москва, ул. Прянишникова, Д.19А, стр.4. Заказ № 177 от 11.05.2012г. Тираж: 150 штук

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Гадуа, Натия Торникеевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I.ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ 12 АСПЕКТЫ КОКЛЮШНОЙ ИНФЕКЦИИ

1.1. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции на рубеже веков в России и зарубежом.

1.2. Особенности клинической картины коклюша. \ j

Глава II. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ 21 КОКЛЮША

2.1. Культурально - морфологические свойства Bordetella pertussis.

2.2. Антигенная структура Bordetella pertussis

2.2.1. Особенности структуры поверхностных агглютиногенов.

2.2.2. Основные факторы патогенности B.pertussis.

2.2.3. Патогенные свойства штаммов B.pertussis.

2.4. Генетическая структура B.pertussis.

2.5. Молекулярно-генетическая характеристика циркулирующих штаммов B.pertussis. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Штаммы микроорганизмов

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Микробиологические методы.

3.2.2. Определение вирулентности штаммов В. pertussis

3.2.3. Молекулярно-генетические методы.

3.2.4. Статистическая обработка результатов, анализ данных и программное обеспечение. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава IV. Структура генов {ptxA, ptxB, ptxC, ptxD и ptxE), кодирующих S2, S3, S4 и S5 субъединицы В-комплекса коклюшного токсина и гена ргп штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в настоящее время.

4.1. Структура TQm.ptxA, кодирующего S1 субъединицу А-комплекса коклюшного токсина.

4.2. Структура гена ptxB, кодирующего S2 субъединицу В-комплекса коклюшного токсина.

4.3. Структура гена ptxC, кодирующего S3 субъединицу В-комплекса коклюшного токсина.

4.4. Структура генов ptxD и ptxE, кодирующих S4 и S5 субъединицы B-комплекса коклюшного токсина.

4.5. Структура промоторной области коклюшного токсина (ptxP).

4.6. Структура гена ргп, кодирующего пертактин.

Глава V. Распространение штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции с различными аллельными вариантами генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxD и ptxE), кодирующих 77 A- (S1 субъединица) и В- (S2, S3, S4 и S5 субъединицы) комплексы коклюшного токсина и его промоторную область, и гена ргп, кодирующего пертактин.

5.1. Распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами гена ptxA, кодирующего S1 77 субъединицу А-комплекса коклюшного токсина.

5.2. Распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами гена ptxB, кодирующего S2 79 субъединицу B-комплекса коклюшного токсина.

5.3. Распространение штаммов B.pertussis, с различными аллельными вариантами гена ptxC, кодирующего S3 субъединицу B-комплекса коклюшного токсина.

5.4. Распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами промоторной области коклюшного 82 токсина {ptxP).

5.5. Распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами гена рт, кодирующего пертактин.

Глава VI. Сравнительный анализ структуры генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxP и prri) штаммов B.pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и современных штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности генетической структуры современных штаммов Bordetella pertussis."

Актуальность проблемы

Коклюш является воздушно-капельной инфекцией, управляемой средствами специфической вакцинопрофилактики. Однако, несмотря на 50-летнюю массовую иммунизацию детского населения, коклюш до сих пор остается важной причиной младенческой смертности во всем мире и продолжает быть проблемой здравоохранения даже в странах с высоким уровнем охвата профилактическими прививками. Так, во многих странах Европы и Америки с 1990-х годов отмечается рост заболеваемости коклюшем, несмотря на высокий уровень охвата профилактическими прививками, который считается наиболее распространенным среди вакциноуправляемых инфекций. Одной из особенностей коклюшной инфекции в последние годы является рост числа случаев заболевания среди подростков и взрослых [85, 89, 105, 107, 232, 251].

Коклюш в России в конце 1ХХ и начале XX века занимал первое место среди четырех капельных инфекций (коклюш, корь, скарлатина, дифтерия). Снижение заболеваемости отмечалось лишь в 1950-ые годы прошлого столетия, и решающую роль в проблеме борьбы с коклюшем сыграла специфическая массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной, которая в нашей стране впервые была введена в широкую практику в 19581960 гг. Специфическая вакцинопрофилактика коклюша на протяжении последних 50 лет привела к резкому снижению заболеваемости, летальности и уменьшению тяжести течения болезни. Однако несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения и высокий уровень охвата профилактическими прививками, до настоящего времени сохраняются подъемы и спады заболеваемости, как за счет непривитых, так и привитых лиц, увеличилась заболеваемость детей школьного возраста. Регистрируется высокая заболеваемость детей раннего возраста с тяжелым течением заболевания, а также единичные случаи летальных исходов [24, 33, 42, 47]. Кроме того, учитывая низкую эффективность лабораторной диагностики коклюша, можно полагать, что имеется недовыявление случаев коклюша и существует скрытое течение эпидемического процесса коклюшной инфекции. Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша и, следовательно, существовании риска возникновения заболеваний.

Одной из причин продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша является изменение его биологических свойств, как фенотипических, так и генотипических. Молекулярно-генетический мониторинг возбудителя коклюша, проводимый в различных странах на 4 континентах, а также в нашей стране показал, что штаммы B.pertussis подвержены генетической вариабельности, затрагивающей, в первую очередь, гены, кодирующие основные факторы патогенности [12, 25, 43, 109, 110, 129, 134, 194, 216, 247].

Возбудитель коклюша - Bordetella pertussis {B.pertussis) имеет множество факторов патогенности, однако основным является коклюшный токсин, который играет ведущую роль в развитии инфекционного процесса [154, 229]. Коклюшный токсин (KT) имеет А-В структуру и состоит из А-комплекса (S1 субъединица), обеспечивающего основные изменения в патогенезе коклюшной инфекции, и B-комплекса, состоящего из 5-ти субъединиц S2-S5, который отвечает за связывание токсина с рецепторами мишени и способствует проникновению А-комплекса в клетки хозяина. У возбудителя коклюша продукция всех факторов патогенности находится под контролем двухкомпонентной BvgAS системы регуляции, включающей промоторную область коклюшного токсина, (ptxP), которая влияет на экспрессию оперона ptx и уровень продукции коклюшного токсина [193, 194]. Кроме того, в развитии инфекции существенное значение имеют и другие факторы патогенности, в первую очередь пертактин, отвечающий за адгезию возбудителя на поверхности слизистой оболочки ротоглотки [148, 149, 223, 238]. Изменения в генах, ответственных за проявление патогенности возбудителя, его адгезию, может привести к появлению штаммов с измененными свойствами и оказать влияние на течение эпидемического и инфекционного процессов, поэтому наблюдение за возбудителем коклюша, за его фенотипическими и молекулярно-генетическими свойствами является актуальным.

Цель исследования - выявление особенностей генотипической изменчивости штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции (2000 -2010 гг.).

Задачи исследования:

1. Выявить особенности структуры генов ptxA, ptxB, ptxC, ptxD и ptxE, кодирующих S1 субъединицу А-комплекса и S2, S3, S4 и S5 субъединицы В-комплекса коклюшного токсина (KT), и гена ргп, кодирующего пертактин, штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в 2000 - 2010 гг.

2. Изучить особенности структуры промоторной области коклюшного токсина {ptxP), у современных штаммов B.pertussis и сопоставить со степенью их вирулентности.

3. Оценить динамику распространения штаммов B.pertussis с измененной структурой генов, кодирующих А-, В- комплексы и промоторную область коклюшного токсина и пертактин, на разных этапах эпидемического процесса коклюшной инфекции.

4. Изучить структуру генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxP и ргп) штаммов B.pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, и провести сравнительный анализ со структурой этих генов у штаммов B.pertussis, циркулирующих в России в последние 10 лет.

Научная новизна

Получены новые данные об особенностях структуры семи генов (ptxA, ptxB, ptxC, ptxD, ptxE, ptxP и prri), кодирующих субъединицы A-B-комплексов и промоторную область коклюшного токсина, а также пертактин штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и в настоящее время. Выявленные существенные мутации в структуре этих генов приводят к изменениям формирования белковых молекул антигенных детерминант (коклюшного токсина и пертактина), а также возможны функциональные изменения уровня продукции коклюшного токсина при мутациях в промоторной области.

Впервые показана генетическая структура современной популяции возбудителя коклюша, доминирующее положение в которой занимают штаммы B.pertussis с новыми «невакцинными» аллелями основных генов патогенности (коклюшного токсина и пертактина), а также выявлены новые мутации, приводящие к существенным изменениям структуры и функции основных антигенных детерминант B.pertussis.

Практическая значимость

Полученные данные о динамике распространение штаммов B.pertussis с различными аллельными вариантами генов, кодирующих основные факторы патогенности, позволили проследить формирование популяции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и создать основы молекулярно-генетического мониторинга возбудителя коклюша в системе эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией.

Пополнена уникальная коллекция штаммов В.регЫьзгБ штаммами, выделенными от больных коклюшем в различных регионах России, дающая возможность проводить многоплановые исследования возбудителя коклюша с целью слежения за популяцией циркулирующих штаммов и прогнозирования распространения штаммов с различной генетической структурой основных детерминант патогенности возбудителя.

Выявленные особенности структуры генов, кодирующих А-В-комплексы, промоторную область коклюшного токсина и пертактин, послужили основой для определения «мишеней» (нуклеотидных последовательностей), при разработке ускоренного метода лабораторной диагностики коклюша и ускоренных методов молекулярно-генетического мониторинга его возбудителя.

Внедрение результатов работы в практику

Полученные данные о генотипических особенностях структуры штаммов В.реНи8Б1Б послужили основой патента на изобретение РФ № 2007147797 от 20.02.2009 г.; «Способ и набор для ускоренной диагностики коклюша».

Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей-бактериологов «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2004 г.; 2005 г.; 2006 г.; 2009 г; 2010 г.); в учебном процессе на курсах информации и стажировки для врачей-бактериологов филиалов ФБУЗ ЦГиЭ г. Москве (2008 г., 2009 г., 2010 г., 2012 г.) и обучающем курсе при подготовке ординаторов ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Современные молекулярно-генетические методики изучения генотипических особенностей структуры штаммов используются в

Референс центре по мониторингу за возбудителями дифтерии и коклюша ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора при проведении микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга популяции штаммов возбудителя коклюша, циркулирующих на территории России.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 139 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 3 глав собственных исследований, заключение и выводы. Работа иллюстрирована 7-ю таблицами и 27-ю рисунками. Список литературы включает 259 источников, в том числе 53 - отечественных и 206 - зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гадуа, Натия Торникеевна

ВЫВОДЫ

1. Выявлены существенные мутации в структуре генов современных штаммов B.pertussis, приводящие к изменениям на аминокислотном уровне иммуногенных областей Т- и В-эпитопов коклюшного токсина и В-эпитопа пертактина, что может влиять на формирование иммунного ответа.

2. Впервые у штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, выявлены изменения в структуре регуляторной промоторной области коклюшного токсина (ptxP), с формированием нового «невакцинного» ptxP3 аллеля, что влияет на уровень продукции коклюшного токсина.

3. Установлено, что популяция штаммов B.pertussis формируется путем клональной экспансии штаммов с новой генетической структурой основных факторов патогенности - коклюшного токсина и пертактина. Установлен состав популяции штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции - с доминированием штаммов с новыми «невакцинными» аллелями генов - ptxAl (97,7%), ptxC2 (87,4%) и рт2 (89,5%).

4. Обнаружено, что среди современных штаммов B.pertussis циркулируют единичные штаммы с еще более существенными и множественными изменениями генетической структуры коклюшного токсина и пертактина - в 2,2% случаях с ptxB2 аллелем и в 1,3% случаях с ргп9 аллелем, влияющие на адгезивные свойства возбудителя коклюша. Изменений в структуре детерминант, кодирующих S4 и S5 субъединицы В - комплекса KT, не обнаружено.

5. Показано несоответствие структуры генетических детерминант, кодирующих субъединицы А- и В- комплексов коклюшного токсина, его промоторную область и пертактин, у современных циркулирующих штаммов B.pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, и производственных вакцинных штаммов B.pertussis, входящих в состав АКДС-вакцины.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Уникальная коллекция штаммов B.pertussis, пополненная штаммами, выделенными от больных коклюшем в современный период эпидемического процесса коклюшной инфекции, может быть использована для проведения фундаментальных и прикладных исследований, посвященных изучению биологии возбудителя коклюша и слежению за циркулирующей популяцией.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Гадуа, Натия Торникеевна, Москва

1. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях // М.: Академкнига. - 2003. - 431 С.

2. Бабаченко И.В., Тимченко В.Н., Мартынкин A.C. Особенности эпидемиологии и клиники коклюша в г. Санкт-Петербурге // Здравоохранение Российской Федерации. 2002. - № 4. - С. 31-33.

3. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса // Журн. Микробиол. 1997. - № 4. - С. 20-26.

4. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условнопатогенных бактериях // Журн. Микробиол. 1999. - № 5. - С. 34-39.

5. Бондаренко В.М. Острова патогенности бактерий // Журн. Микробиол. -2001,-№4.-С. 67-74.

6. Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. Молекулярно-генетический метод ускоренного выявления штаммов Bordetella pertussis, обладающих различными ptx генами // Журн. Микробиол. 2008. - № 5. - С. 80-83.

7. Борисова О.Ю. Молекулярио генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики при этих инфекциях.: автореф. дис.: докт. мед. наук // Москва. - 2009. - 49 С.

8. И.Герасимова А.Г., Петрова М.С., Тихонова Н.Т. Клинико-эпидемиологическая характеристика современного коклюша // Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация. 2004. - № 5. - С. 4-5.

9. Доморадский И.В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде // Журн. Микробиол. 1997. - № 4. - С. 31-35.

10. Доморадский И.В. Вирулентность бактерий как функция адаптации // Журн. Микробиол. 1997. - № 4. - С. 16-20.

11. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше // Министерство здравоохр. СССР. 1984. - 20 С.

12. Иоффе В.И., Осипова П.В., Склярова H.H., Козлова H.A. Коклюш // Медицина, Москва. 1964 г. - 284 С.

13. Каратаев Г.И. Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша.: автореф. дис.: докт. биол. наук // Москва. 2008. - 48 С.

14. Кондратьева A.M. Характеристика возбудителя коклюша в период массовой специфической профилактики // Дис. канд. мед. наук, М. -1977.- 161 С.

15. Кузнецов Е.А. Биологические закономерности антигенной изменчивости коклюшных бактерий // Дис. докт. мед. наук, М. 1975. -233 С.

16. Курова H.H. Молекулярно-биологическая характеристика B.pertussis, циркулирующих в период подъема заболеваемости и совершенствование лабораторной диагностики коклюша.: автореф. дис.: канд. мед. наук // С.Пб. 2003. - 20 С.

17. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Петрова М.С. Бордетеллы // Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинскаямикробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга 2. -2010.-С. 646-665.

18. Лыткина И.Н., Чистякова Г.Г., Филатов H.H. Заболеваемость коклюшем в Москве и организация мероприятий по ее снижению // Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация. 2004. - № 5 (35). - С. 8-9.

19. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Захарова Н.С., Алешкин В.А. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов

20. B.pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции // Мол. ген. микробиол. вирусол. -2005.-№4.-С. 21-25.

21. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Алешкин В.А. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов B.pertussis, выделенных от больных коклюшем в Москве (1948 2005 гг.) // Молекулярная медицина. - 2008. - № 1. - С. 40-45.

22. Мамаева Е.А. Паракоклюш. Экспериментальные исследования, клинико-иммунологические и эпидемиологические наблюдения // Дисс. докт. мед. наук, М. 1969. - С. 461.

23. Мерцалова Н.У., Борисова О.Ю., Шинкарев A.C., Брицина М.В., Озерецковская М.Н., Мазурова И.К., Алешкин В.А., Гадуа Н.Т., Захарова Н.С. Динамика изменений патогенных свойств штаммов Bordetella pertussis II Журн. Микробиол. 2009. - № 6. - С. 7-11.

24. ЗЗ.Озерецковский H.A., Чупрынина Р.П. Вакцинопрофилактика коклюша- итоги и перспективы // Новости вакцинопрофилактики: Вакцинация.- 2004. № 5 (35) - С. 6-7.

25. Петрова М.С. Коклюш в 70-е годы по материалам очагов инфекций.: автореф. дис.: канд. мед. наук // Москва. 1978. - 24 С.

26. Петрова М.С., Сигаева Л.А., Антонова H.A. Клиника коклюша на этапах массовой вакцинопрофилактики // Вакцинопрофилактике 200 лет. Сборн. научн. трудов, М. - 1997. - С. 54-56.

27. Петрова М.С., Попова О.П., Москалева Т.Н. Коклюш и паракоклюш (профилактика, клиника, лечение) // Методические рекомендации, М. -2000.-25 С.

28. Петрова М.С., Сигаева Л.А., Попова О.П., Маркелов В.П., Звонарева C.B. Особенности эпидемиологии и клиники коклюша в период эпидемического неблагополучия // Проблемы инфекционных болезней. Часть 1: Сборн. научн. трудов, 2000. - С. 80-86.

29. Попова О.П., Селезнева Т.С., Милюкова В.И. Клинико-эпидемиологические аспекты коклюшной инфекции в современныхусловиях // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999. -№ 3. -С. 24-26.

30. Попова О.П., Петрова М.С., Чистякова Г.Г. и др. Клиника коклюша и серологические варианты коклюшного микроба в современных условиях // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. - № 1. -С. 44-46.

31. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий // Молекулярная генетика. 1999. - № 2. - С. 22-29.

32. Селезнева Т.С., Титова Н.С., Заргарьянц А.И., Максимова Н.М., Маркина С.С. Влияние вакцинопрофилактики на эпидемический процесс управляемых инфекций в Российской Федерации // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - № 2. - С. 6-11.

33. Селезнева Т.С. Серологический мониторинг за инфекциями, управляемыми средствами вакцинопрофилактики // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2004. - № 5 (18). - С. 14-16.

34. Семенов Б.Ф., Захарова Н.С., Мазурова И.К. Подъем заболеваемости коклюшем на фоне массовой вакцинации. Гипотезы, объясняющие этот феномен // Журн. Микробиол. 2003. - № 6. - С. 70-73.

35. Сигаева Л.А., Кузнецова Л.С. Заболеваемость коклюшем в условиях отмены второй ревакцинации // Эпидемиология, микробиология и профилактика капельных инфекций: Сборн. научн. трудов, М. 1983. -С. 67-73.

36. Сигаева Л.А., Кузнецова Л.С., Окиншевич Е.А. Заболеваемость коклюшем и состояние привитости // Журн. Микробиол. 1986. - № 3. -С. 43-47.

37. Сигаева Л.А., Петрова М.С., Шакирова Р.Г. Осуществление эпидемиологического надзора за коклюшем // Эпидемиологический надзор как основа профилактики капельных и кишечных инфекций: В сборн. научн. трудов, М. 1990. - С. 95-102.

38. Чистякова Г.Г., Борисова О.Ю., Лыткина И.Н., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Петрова М.С., Мельникова Ф.М., Скачкова В.Г. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции в Москве // Журн. Микробиол. 2005. - № 5 - С. 18-21.

39. Чупрынина Р.П. Вакцинопрофилактика коклюша в национальных программах иммунизации // Материал VI Всерос. съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. 1991. - Том 2. - С. 206-207.

40. Чупрынина Р.П., Алексеева И.А., Озерецковский H.A. Профилактика коклюша: разработка и применение бесклеточной коклюшной вакцины // Журн. Микробиол. 2006. - № 1. - С. 99-105.

41. Ценева Г.Я., Курова H.H. Микробиологическая характеристика возбудителя коклюша и лабораторная диагностика коклюша // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003. -№4(5).-С. 329-341.

42. Шакирова Р.Г. Патогенные свойства коклюшного микроба в различные периоды вакцинопрофилактики.: автореф. дис.: канд. мед. наук // Москва. 1987. - 22 С.

43. Ясинский A.A., Котова Е.А., Чернявская О.П., Ершов А.Е., Перевощикова A.J1. Вакцинопрофилактика управляемых инфекционных заболеваний в Российской Федерации (1995 2004 гг.) // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2005. - № 5 (24). - С. 814.

44. Advani A., Donnelly D., Hallander H.O. Reference system for characterization of Bordetella pertussis pulsed-field gel electrophoresis profiles // J. Clin. Microbiology. 2004. - Vol. 42. - P. 2890-2897.

45. Advani A., Donnelly D., Gurstafsson L., Hallander H.O. Changes of the Swedish Bordetella pertussis population in incidence peaks during an acellular pertussis vaccine period between 1997 and 2004 // APMIS. -2007.-Vol. 115(4).-P. 299-310.

46. Advani A., Gurstafsson L., Carlsson R.M., Donnelly D., Hallander H.O. Clinical outcome of pertussis in Sweden: association with pulsed-field gel electrophoresis profiles and serotype // APMIS. 2007. - Vol. 115(6). - P. 736-742.

47. Advani A., H.G.J. Van der Heide, H.O. Hallander, F.R. Mooi. Analysis of Swedish Bordetella pertussis isolates with three typing methods: characterization of an epidemic lineage // J. of Microbiological Methods. -2009.-Vol. 78.-P. 297-301.

48. Ashworth L.A.E., Irons L.I., Dowsett A.B. Antigenic relationship between serotype-specific agglutinogen and fimbriae of Bordetella pertussis II J. Infect. Immunity. 1982. - Vol. 37. - № 3. - P. 1278-1281.

49. Babu M.M., Bhargavi J., Saund R., Singh S.K. Virulence factors of Bordetella pertussis II Current science. 2001. - Vol. 80. - № 12. - P. 1512-1522.

50. Baron S., Njamkepo E., Grimprel E., Begue P., Desenclos J.C., Drucker J., Guiso N. Epidemiology of pertussis in French hospitals in 1993 and 1994: thirty years after a routine use of vaccination // J. Pediatr. Infect. Dis. -1998.-Vol. 17.-P. 412-418.

51. Bass J.W., Wittier R.R. Return of epidemic pertussis in the United States // J. Pediatr. Infect. Dis. 1994. - Vol. 13. - P. 343-345.

52. Berbes G.A., de Greeft S.C., Mooi F.R. Improving pertussis vaccinations // Hum. Vacc. 2009. - Vol. 5. - P. 38-44.

53. Betsou F., Sebo P., Guiso N. The C-terminal domain is essential for protective activity of the Bordetella pertussis adenylate cyclase-hemolysin //J. Infect. Immunity. 1995. - Vol. 63. -№ 9. - P. 3309-3315.

54. Blaskett A.C., Gulasekharam J., Fulton L.C. The occurrence of Bordetella pertussis serotypes in Australia, 1950-1970 // J. Med. Aust. 1971. - Vol. l.-P. 781-784.

55. Bouchez V., Caro V., Levillain E., Guigon G., Guiso N. Genomic content of Bordetella pertussis clinical isolates circulating in areas of intensive children vaccination // PLoS ONE. 2008. - Vol. 3(6). - P. e2437.

56. Boucher P.E., Murakami K., Ishinama A., Stibitz S. Nature of DNA binding and RNA polymerase interaction of the Bordetella pertussis BvgA transcriptional activator at the FHA promoter // J. Bacteriology. 1997. -Vol.179 (Pt 5). - P. 1755-1763.

57. Boursaux-Eude C., Thiberge S., Caletti G., Guiso N. Intranasal murine model of Bordetella pertussis infection: II. Sequence variation and protection induced bya tricomponent acellular vaccine // Vaccine. 1999. -Vol. 17 (20-21).-P. 2651-2660.

58. Boursaux-Eude C., Guiso N. Polymorphism of repeated regions of pertactin in Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica II J. Infect. Immunity. 2000. - № 68. - P. 4815-4817.

59. Brennan M.J., Shahin R.D. Pertussis antigens that abrogate bacterial adherence and elicit immunity // Am. J Respir. Crit. Care Med. 1996. -Vol. 154(4 Pt 2). - P.S 145-149.

60. Brinig M.M., Cummings C.A., Sanden G.N., Stefanelli P.-, Lawrence A., Relman D.A. Significant gene order and expression differences in B. pertussis despite limited gene content variation // J. Bacteriology. 2006. -Vol. 188.-N. 7.-P. 2375-2382.

61. Brownlie R.M., Parton R., Coote J.G. The effect of growth conditions on adenylate cyclase activity and virulence-related properties of Bordetella pertussis II J. Gen. Microbiology. 1985. - Vol. 131. - Pt 1. - P. 17-25.

62. Carbonetti N.H. Immunomodulation in the pathogenesis of Bordetella pertussis infection and disease // Curr. Opin. Pharmacol. 2007. - Vol. 7. -P. 272-278.

63. Caro V., Njamkepo E., van Amersfootrh SC et al. Pulsed-field gel electrophoresis analysis of Bordetella pertussis populations in various European countries with different vaccine policies // Microbes Infect.2005. Vol. 7 (7-8). - P. 976-982.

64. Caro V., Hot D., Guigon G et al. Temporal analysis of Bordetella pertussis isolates by comparative whole-genome hybridization // Microbes Infect.2006. Vol. 8(8). - P. 2228-2235.

65. Caro V., Elomaa A., Brun D., Mertsola J., He Q., Guiso N. Bordetella pertussis, Finland and France // Emerg. Infect. Dis. 2006. - Vol. 12(6). -P. 987-989.

66. Caro V., Bouchez V., Guiso N., Gatti B., Agosti M.R., Ayala S.E. Pertussis in Argentina and France // Vaccine. 2007. - Vol. 25(22). - P. 4335-4339.

67. Carroll S.B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. // Cell. 2008. - Vol. 134. - P. 25-36.

68. Cassiday P., Sanden G., Heuvelman K., Mooi F., Bisgard K.M., Popovic T. Polymorphism in Bordetella pertussis pertactin and pertussis toxin virulence factors in the United States, 1935-1999 // J. Infect. Dis. 2000. -Vol. 182.-P. 1402-1408.

69. Celentano L.P., Massari M., Paramatti D., Salmaso S., Tozzi A.E. Resurgence of pertussis in Europe // J. Pediatr. Infect. Dis. 2005. - Vol. -24(9).-P. 761-765.

70. Chalvardjian N. The content of antigens 1, 2 and 3 in strains of B. pertussis and in vaccine // J. Canad. Med. Ass. 1965. - Vol. 92. - P. 1114-1116.

71. P. 69) from Bordetella pertussis II Eur. J. Immunology. 1991. - Vol. 21. -P. 1147-1153.

72. Cherry J.D., Gonbein J., Heininger U., Stehr K. A search for serologic correlates of immunity to Bordetella pertussis cough illnesses // Vaccine. -1998.-Vol. 16.-P. 1901-1906.

73. Cherry J.D.The epidemiology of pertussis: a comparison of the epidemiology of the disease with the epidemiology of Bordetella pertussis infection // Pediatrics. 2005. - Vol. 115. - P. 2004-2648.

74. Cordova S.P., Gilles M.T., Beers M.Y. The outbreak that had to happen: Bordetella pertussis in north-west Western Australia in 1999 // Commun. Dis. Intell. 2000. - Vol. 24. - P. 375-379.

75. Cromer B.A., Goydos J., Hackell J., Mezzatesta J., Dekker C., Mortimer E.A. Unrecognized pertussis infection in adolescents // Am. J. Dis. Child. -1993,-Vol. 147.-P. 575-577.

76. Crowcroft N.S., Stein C., Duclos P., Birmingham M. How best to estimate the global burden of pertussis? // Lancet. 2003. - Vol. 3. - P. 413.

77. Cummings C.A., Brinig M.M., Lepp P.W., van de Pas., Relman D.A. Bordetella species are distinguished by patterns of substantial gene loss and host adaptation // J. Bacteriology. 2004. - Vol. 186(5). - P. 1484-1492.

78. Cummings C.A., Bootsma H.J., Relman D.A., Miller J.F. Species and strain-specific control of a complex, flexibe regulin by Bordetella BvgAS // J. Bacteriology. - 2006. - Vol. 188.-P. 1775-1785.

79. Edwards K.M., Decker M.D., Plitkin S.A., Orenstein W.A. Pertussis vaccine // In: Vaccine, Saunders. 2004. - P. 471-528.

80. Edwards K.M. Overview of pertussis: focus on epidemiology, sources of infection, and long term protection after infaint vaccination // J. Pediatr Infect. Dis. 2005. - Vol. 24. - P. 104.

81. Eldering G., Holwerda J., Davis A., Baker J. Bordetella pertussis serotype in the United States // Applied Microbiology. 1969. - Vol. 18. -№4.-P. 618-621.

82. Elomaa A., Advani A., Donnelly D et al. Population dynamics of Bordetella pertussis in Filand and Sweden, neighbouring countries with different vaccination histories // Vaccine. 2007. - Vol. 25(5). - P. 918926.

83. Emsley P., Charles I.G., Fairweather N.F., Isaacs of the N.W. Structure Bordetella pertussis virulence factor P. 69 pertactin // Nature. -1996.-№381.-P. 90-92.

84. Expert Reviews. Bordetella pertussis strains variation and evolution postvaccination // Expert Rev. Vaccines. 2009. - Vol. 8 (7). - P. 863-875.

85. Ewald P.W. Evolution of infectious Diseases // Oxford University Press, Oxsford. 1994.

86. Fennelly N.K., Sisti F., Higgins S.C et al. Bordetella pertussis expresses a functional type III secretion system that subverts protective innate and adaptive immune responses // J. Infect. Immunity. 2008. - Vol. 76 (3). -P. 1257-1266.

87. Finn T.M., Stevens L.A. Tracheal colonization factor: a Bordetella pertussis secreted virulence determinant // J. Mol. Microbiology. 1995. -Vol. 16.-№4.-P. 625-634.

88. Fingermann M., Fernandez I., Sisti F. et al. Difference of circulating Bordetella pertussis population in Argentina from the stain used in vaccine production // Vaccine. 2006. - Vol. 24 (17). - P. 3513-3521.

89. Forsyth K.D., Wirsing von Konig C.H., Tan T., Caro J., Plotkin S. Prevention of pertussis: recommendations derived from the second Global Pertussis Initiative roundtable meeting // Vaccine. 2007. Vol. - 25 (14). -P. 2634-2642.

90. Gandom S., Day T. The evolutionary epidemiology of vaccination // J. R. Soc. Interface. 2007. - № 4. - P. 803-817.

91. Geuijen C.A., Willems R.J., Mooi F.R. The major fimbrial subunit of Bordetella pertussis binds to sulfated sugars // J. Infect. Immunity. 1996. -Vol. 64.-P. 2657-2665.

92. Geuijen C.A., Willems R.J., Bongaerts M., Top J., Gielen H., Mooi F.R. Role of the Bordetella pertussis minor fimbrial subunit, FimD, incolonization of the mouse respiratory tract // J. Infect. Immunity. 1997. -Vol. 65 (10).-P. 4222^1228.

93. Geuijen C.A., Willems R.J., Hoogerhout P., Puijk W.C., Meloen R., Mooi F.R. Identification and characterization of heparin binding regions of the fim2 subunit of Bordetella pertussis. II J. Infect. Immunity. 1998. -Vol. 66. - № 5. - P. 2256 - 2263.

94. Godfroid F., Denoel P., Poolman J. Are vacctination programs and isolate polymorphism linked to pertussis re-emergence? // Expert Rev. Vaccines. 2005. - Vol. 4(5). - P. 757-778.

95. Goyzrd S., Bellalou J., Mireau H., Ullmann A. Mutations in the Bordetella pertussis bvgS gene that confer altered expression of the fhaB gene in Eshberichia coli I I J. Bacteriology. 1994. - Vol. 176 (16). - P. 5163-5166.

96. Granstrom M., Granstrom G. Serological correlates in whooping cough // Vaccine. 1993. - Vol. 11. - P. 445-448.

97. Greenberg D.P., von Konig C.H.W., Heininger U. Health burden of pertussis in infants and children // J. Pediatr. Infenct. Dis. 2005. - Vol. 24. -P. S39-S43.

98. Guerirard P., Druilhe A., Pretolani M., Guiso N. Role of adenylate cyclase-hemolysin in alveolar macrophage apoptosis during Bordetella pertussis infection in vivo II J. Infect Immunity. 1998. - Vol. 66. - P. 1718-1725.

99. Gustafsson L., Hallander H.O., Olin P., Reizenstein E., Storsaeter J. A controlled trial of a two component acellular, a five component acellular, and a whole cell pertussis vaccine // N. Engl. J. Med. 1996. - Vol. 334. -P. 349-355.

100. Gzyl A., Augustynowicz E., Rabczenko D., Gniadek G., Slusarczyk J. Pertussis in Poland // Int. J. Epidemiology. 2004. - Vol. 33. - P. 358-365.

101. Gzyl A., Augustynowicz E., van Loo I., Slusarczyk J. Temporal nucleotide changes in pertactin and pertussis toxin genes in Bordetella pertussis strains isolated from clinical cases in Poland // Vaccine. 2001. -Vol. 20.-P. 299-303.

102. Halperin S.A. The control of pertussis: 2007 and beyond // N. Engl. J. Med. 2007. - Vol. 356 (2). - P. 110-113.

103. Hardwick T.H., Cassiday P., Weyant R.S., Bisgard K.M., Sanden

104. G.N. Changes in predominance and diversity of genomic subtypes of Bordetella pertussis isolated in the United States, 1935 to 1999 // J. Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8. - P. 44-49.

105. Hausman S.Z., Burns D.L. Use of pertussis toxin encoded by ptx genes from Bordetella pertussis to model the effect of antigenic drift of pertussis toxin on antibody neutralization // J. Infect. Immunity. 2000. -Vol. 68.-P. 3763-3767.

106. Hazenbos W.L., Geuijen C.A., van den Berg B.M., Mooi F.R., van Furth R. Bordetella pertussis fimbriae bind to human monocytes via the minor fimbrial subunit FimD // J. Infect. Dis. 1995. - Vol. 171. - P. 924929.

107. He Q., Makinen J., Berbers G., Mooi F.R., Viljanen M.K., Arvilommi

108. H., Mertsola J. Bordetella pertussis protein pertactin induces type-specific antibodies: one possible explanation for the emergence of antigenic variants? // J. Infect. Dis. 2003. - Vol. 187. - P. 1200-1205.

109. He Q., Mertsola J. Factors contributing to pertussis resurgence // Future Microbiology. 2008. - Vol. 3. - P. 329-339.

110. Heikkinen E., Kallonen T., Saarinen L et al. Comparative genomics of Bordetella pertussis reveals progressive gene loss in Finnish stains // PLoS ONE. 2007. - Vol. 2(9). - P. e904.

111. Heikkinen E., Xing D.K., Olander R.M. et al. Bordetella pertussis isolates in Finland: serotype and fimbrial expression // BMC. Microbiology. -2008.-P. 8, 162.

112. Hellwing S.M., Rodriguez M.E., Berbers G.A., van de Wilkel J.G, Mooi F.R. Crucial role of antibodies to pertactin in Bordetella pertussis immunity // J. Infect. Dis. 2004. - Vol. 189. - № 2. - P. 354.

113. Hentschel U., Hacker J. Pathogenicity islands: the tip of the iceberg // J. Microbes and Infect. 2001. - Vol. 3. - P. 545-548.

114. Hodder S.L., Cherry J.D., Mortimer Jr., E.A., Ford A.B., Gornbein J., Papp K. Antibody responses to Bordetella pertussis antigens and clinical correlations in elderly community residents // Clin. Infect. Dis. 2000. -Vol. 31.-P. 7-14.

115. Hoiby N., Hertz J.B., Andersen V., Baekgaard P. Crossed immunoelectrophoretic analysis of Bordetella pertussis antigens and of corresponding antibodies in human sera // Acta Pathol. Microbiology. Scand. 1976. - Vol. 84 B. - P. 386-394.

116. Hoiby N., Hertz J.B., Andersen V. Cross-reactions between Bordetella pertussis and 28 other bacterial species // Acta Pathol. Microbiology. Scand. 1976. - Vol. 84 B. - P. 395-400.

117. Hot D., Anotine R., Renauld-Mongenie G. et al. Differential modulation of Bordetella pertussis virulence genes as evidenced by DNA microarray analysis !// Mol. Genet. Genomics. 2003. - Vol. 269(4). - P. 475-486.

118. Hijnen M., de Voer R., Mooi F.R., Schepp R., Moret E.E., van Gageldonk P., Smits G.,Berbers Guy A.M. The role of peptide loops of the Bordetella pertussis protein P.69 pertactin in antibody recognition // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 5902-5914.

119. Hsia J.A., Moss J., Hewlett E.L., Vaughan M. ADP-ribosylation of adenylate cyclase by pertussis toxin: effects on inhibitory agonist binding // J. Biology Chem 1984. - Vol. 259. - P. 1086-1090.

120. Jacob-Dubuisson F., Locht C. The Bordetella pertussis II In: Locht, C. (Ed.), Bordetella Molecular Microbiology. Horizon Bioscience, Norfolk, UK.-2007.-P. 69-96.

121. Jansen D.L., Gray G.C., Putnam S.D., Lynn F., Meade B.D. Evaluation of pertussis in U.S. Marine Corps trainees // J. Clin. Infect. Dis. 1997. - Vol. 25. - № 5. - P. 1099-1107.

122. Jefferson T., Rudin M., Di Pietrantonj C. Systematic review of the effects of pertussis vaccines in children // Vaccine. 2003. - Vol. 21. - P. 2003-2014.

123. Kallonen T., He Q. Bordetella pertussis strain variation and evolution postvaccination // Expert Rev Vaccines. 2009. - Vol. 8(7). - P. 863-875.

124. Kaper J.B., Hakcer J. Pathogenicity Island and other mobile virulence elements // Washington, ASM. 1993.

125. Kasuga T., Nakase Y., Ukishima K., Takastu K. Studies on Haemophilis pertussis. III. Some properties of each phase of H. pertussis II Kitasato Arcb. Exp. Med. 1954. - Vol. 27 (3). - P. 37-47.

126. King A.J., Berbers B., Van Oirschot H.F.L.M., Hoogerhout P., Knipping K., Mooi F.R. Role of the polymorphic region 1 of the Bordetella pertussis protein pertactin in immunity // J. Microbiology. 2001. - Vol. 147.-P. 2885 -2895.

127. King A.J., van Gorkom T., Pennings J.L. ey al. Comparative genomic profiling of Dutch clinic Bordetella pertussis isolates using DNA microarrays: identification of genes absent from epidemic strains // BMC Genomics. 2008. - Vol. 9. - P. 311.

128. Kourova N., Caro V., Weber C. Comparisson of the Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis isolates circulating in Sankt

129. Peterburg between 1998 2000 with Russian vaccine strains // J. Clin. Microbiology.-2003.-Vol. 41.-№ 8.-P. 3709-3711.

130. Lee Y.S., Yang C.Y., Lu C.H., Tseng Y.H. Molecular epidemiology of Bordetella pertussis isolated in Taiwan, 1992 1997 // J. Microbiology Immunology. - 2003. - Vol. 47. - P. 903 - 909.

131. Lee M.S., Lee Y.S., Chiou C.S. The suitable restriction enzymes for pulsed-field gel electrophoresis analysis of Bordetella pertussis II Diagn. Microbiology Infect. Dis. 2006. - Vol. 56 (2). - P. 217-219.

132. Leusch M.S., Paulaitis S., Friedman R.L. Adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis: production, purification, and partial characterization // J. Infect. Immunity. 1990. - Vol. 58. - № 11. - P. 3621-3626.

133. Li Z.M., Brennan M.J., David J.L., Carter P.H., Cowell J.L., Manclark C.R. Comparison of type 2 and type 6 fimbriae of Bordetella pertussis by using agglutinating monoclonal antibodies // J. Infect. Immunity. 1988. -Vol. 56.-P. 3184-3188.

134. Lin Y.C., Yao S.M., Yan J.J. et al. Molecular epidemiology of Bordetella pertussis in Taiwan, 1993-2004: suggest one possibleexplanation for the outbreak of pertussis in 1997 // Microbes Infect. 2006.- Vol. 8 (8) P. 2082-2087.

135. Livey I., Duggleby C.J., Robinson A. Cloning and nucleotide sequence of the serotype 2 fimbrial subunit gene of Bordetella pertussis II J. Mol. Microbiology. 1987. - Vol. 1. - P. 203-209.

136. Locht C., Bertin P., Menozzi F.D., Renauld G. The filamentous haemagglutinin, a multifaceted adhesion produced by virulent Bordetella spp // J. Mol. Microbiology. 1993. - Vol. 9. - № 4. - P. 653-660.

137. Locht C., Antoine R., Lemoine Y., Jacob-Dubuisson F. Bordetella pertussis molecular pathogenesis under multiple aspects // J. Microbiology. -2001.-Vol. 4.-P. 82-89.

138. Locht C., Antoine R., Rase D., Mielcarek N., Hot D., Mascart F. Bordetella pertussis from functional genomics to intranasal vaccination // Int. J. Med. Microbiology. 2004. - Vol. 293. - № 7 8. - P. 583-588.

139. Manson J.M., Gilmore M.S. Pathogenicity island integrase cross-talk: a potential new tool for virulence modulation // J. Molecular Microbiology.- 2006. № 61 (3). - P. 555-559.

140. Maharyan R.P., Gu C., Reeves P.R., Sintchenko V., Gilbert G.L., Lan R. Genome-wide analysis of single nucleoitide polymorphisms in Bordetella pertussis using comparative genomic sequencing // Res. Microbiology. 2008. - Vol. 159 (9-10). - P. 602-608.

141. Mclntyre P., Gidding H., Gilmour R et al. Vaccine preventable diseases and vaccination coverage in Australia, 1999 to 2000 // Commun. Dis. Intel 1. (Suppl. i-xi). 2002. - P. 1-11.

142. Miller E., Vurdien J.E., White J.M. The epidemiology of pertussis in England and Wales // Commun. Dis. Rep. CDR Rev. 1992. - Vol. 2(13). -P. R152-R154.

143. Mira A., Pushker R., Rodriguez-Valera F. The Neolithic revolution of bacterial genomes // Trends Microbiology. 2006. - Vol.14. - P. 200-206.

144. Moerman 1., Leventhal A., Slater P.E., Anis E., Yishai R., Marva E. The reemergence of pertussis in Israel // J. Isr. Med. Assoc. 2006. - Vol. 8(5).-P. 308-311.

145. Mooi F.R., ter Avest A., van der Heide H.G.J. Structure of the Bordetella pertussis gene coding for the serotype 3 fimbrial subunit // FEMS Microbiology Lett. 1990. - Vol. 66. - P. 327-332.

146. Mooi F.R., He Q., van Oirschot H., van der Heide H.G.J. Antigenic variants in Bordetella pertussis strains isolated from vaccinated andunvaccinated children // J. Microbiology. 1999. - Vol. 145. - P. 20692075.

147. Mooi F.R., He Q., van Oirschot H., Mertsola J. Variation in the Bordetella pertussis virulence factors pertussis toxin and pertactin in vaccine strains and clinical isolates in Finland // J. Infect. Immunity.1999.-Vol. 67.-P. 3133-3134.

148. Mooi F.R., Hallander H., Wirsing C.H., Hoet B., Guiso N. Epidemiological typing of Bordetella pertussis isolates: recommendations for a standard methodology // Eur. J. Clin. Microbiology Infect. Dis.2000.-Vol. 19.-P. 174-181.

149. Mooi F.R., van Loo I.H.M., King A. Adaptation of Bordetella pertussis to vaccination: a cause for its reemergence? // Emerging Infect. Diseases. 2001. - Vol. 7. - N. 3. - P. 526-528.

150. Mooi F.R. Bordetella pertussis and vaccination: the persistence of a genetically monomorphic pathogen // J. Infect. Genet. Evol. 2010. - Vol. 10(1).-P. 36-49.

151. Nielsen A., Larsen S.O. Epidemiology of pertussis in Denmark: the impact of herd immunity // Int. J. Epidemiology. 1994. - Vol. 23. - P. 1300- 1308.

152. Njamkepo E., Cantinelli T., Guigon G., Guiso N. Genomic analysis and comparison of Bordetella pertussis isolates circulating in low and high vaccine coverage areas // Microbes Infect. 2008. - Vol. 10 (14-15). - P. 1582-1586.

153. Ntezayabo B., De Serres G., Duval B. Pertussis resurgence in Canada largely caused by a cohort affect // J. Pediatr. Infect. Dis. 2003. - Vol. -22(1).-P. 22-27.

154. Nygren M., Reizenstein E., Ronaghi M., Lundeberg J. Polymorphism in the pertussis toxin promoter region affecting the DNA-based diagnosis of Bordetella infection // J. Clin. Microbiology. 2000. - Vol. 38. - P. 55-60.

155. Packard E.R., Parton R., Coote J.G., Fry N.K. Sequence variation and conservation in virulence-related genes of Bordetella pertussis isolates from the UK // J. Med. Microbiology. 2004. - Vol. 53. - P. 355-365.

156. Parkhill J., Sebaihia M., Preston A., Murphy L.D., Thomson N., Harris D.E., Holden M.T., Churcher C.M., Bentley S.D., Mungall K.L., Cerdeno-Tarraga A.M., Temple L., James K., Harris B., Quail M.A.,

157. Perez J.C., Groisman E.A. Transcription factor function and promoter architecture govern the evolution of bacterial regulons // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2009. - Vol. 106. - P. 4319-4324.

158. Pertussis vaccine: WHO position paper // Wkly Epidemiology Rec. -2005.-Vol. 80 (4).-P. 31-39.

159. Pertussis (whooping cough). In: WHO-recommended standards for surveillance of selected vaccine-preventable diseases // WHO, Geneva, Switzerland. 2003.

160. Poetre J.F., Connor K., Donachie W. Isolation and characterization of Bordetella parapertussis like bacteria from ovine lungs // J. Microbiology. - 1994,-№ 140.-P. 255-261.

161. Poolman J.T., Hallander H.O. Accellular pertussis vaccines and the role of pertactin and fimbtiae // Expert. Rev. Vaccines. 2007. - Vol. 6(1). -P. 47-56.

162. Poynten M., Mclntyre P.B., Mooi F.R., Heuvelman K.J., Gilbert G.L. Temporal trends in circulating Bordetella pertussis strains in Australia // Epid. Infect. 2004. - Vol. 132.-№2.-P. 185-193.

163. Preston N.W. Prevalent serotypes of Bordetella pertussis in non-vaccinated communities // J. Hyg. 1976. - Vol. 77. - P. 85-91.

164. Preston N.W., Matthews R.C. Components of acellular pertussis vaccines // Lancet. 1996. - № 347. - P. 764.

165. Preston A. Bordetella pertussis: the intersection of genomics and pathobiology // CMAJ. 2005. - Vol. 173. - № 1.

166. Preston N.W., Carter E.J. Serotype specificity of vaccine-induced immunity to pertussis // Commun. Dis. Per. CDR Rev. 1992. - Vol. -2(13).-P. R155-R156.

167. Preziozi M.P., Yam A., Wassilak S.G. et al. Epidemiology of pertussis in a West African community before and after introduction of a widespread vaccination program // Am. J. Epidemiology. 2002. - Vol. 155(10). - P. 891-896.

168. Redhead K., Watkins J., Barnard A., Mills K.H.G. Effective immunization against Bordetella pertussis respiratory infection in mice is dependent on induction of cellmediated immunity // J. Infect. Immunity. -1993.-№61.-P. 3190-3198.

169. Rossier E., Chan F. Bordetella pertussis in National capital region: prevalent serotype and immunization status of patients // CMA Journal. -1977.-Vol. 117.-P. 1169-1171.

170. Roush S.W. Murphy T.V. Historical comparisons of morbidity and mortality for vaccine-preventable diseases in the United States // J. Am. Med. Assoc. 2007. - Vol. 298. - P.2155-2163.

171. Sato Y., Kimura M., Fukumi H. Development of a pertussis comronent vaccine in Japan // Lancet. 1984. - Vol. 1(8369). - P. 122-126.

172. Sato Y., Sato H. Further characterization of Japanese acellular pertussis vaccine prepared in 1988 by 6 Japanese manufacturers // Tokai. Exp. Clin. Med. 1988. - Vol. 13 (Suppl). - P. 79-88.

173. Smith A.M., Guzman C.A., Walker M.J.The virulence factors of Bordetella pertussis: a matter of control // FEMS Microbiology Rev. -2001.-Vol. 25. № 3. - P. 309-333.

174. Smith A.M., Hewinson R.G., Kremer K., Brosch R., Gordon S.V. Myths and misconceptions: the origin and evolution of Mycobacterium tuberculosis II Nat. Rev. Microbiology. 2009. - Vol. 7. - P. 537-544.

175. Shahin R.D., Brennan M.J., Li Z.M., et al. Characterization of the protective capacity and immunogenity of the 69 kD outer membrane protein of Bordetella pertussis II J. Exp. Med. - 1990. - № 171. - P. 63-73.

176. Still G.F. The History of Pediatrics // Oxford University Press, London. 1931.-P. 150.

177. Stibitz S. The bvg regulon. In: Locht, C. (Ed.), Bordetella Molecular Microbiology // Horizon Bioscience, Norfolk, UK. 2007. - P. 47-67.

178. Tamura M., Nogimori L., Murai S., et all. Subunit structure of islet-activating protein, pertussis toxin, in conformity with A-B model // J. Biochemistry. 1982. - № 21. - P. 5516-5522.

179. Tanaka M., Vitek C.R., Pascual F.B., Bisgard K.M., Tate J.E., Murphy T.V. Trends in pertussis among infants in the Unted States, 1980 -1999 // Jama. 2003. - Vol. 290. - N. 22. - P. 2968-2975.

180. Taranger J., Trollfors B., Lagergard T., Sundh V., Bryla D.A., Robbins J.B. Correlation between pertussis toxin IgG antibodies in postvaccination sera and subsequent protection against pertussis // J. Infect. Dis.-2000.-Vol. 181.-P. 1010-1013.

181. Tiru M., Askelof P., Granstrom M., Hallander H. Bordetella pertussis serotype of clinical isolates in Sweden during 1970 1995 and influence of vaccine efficacy studies // Dev. Biol. Stand. - 1997. - Vol. 89. - P. 239245.

182. Toma S., Lo H., Magus M. Bordetella pertussis serotypes in Canada // CMA journal. 1978. - Vol. 119. - P. 722-724.

183. Tsang R.S.W., Lau A.K.H., Sill M.L., Halperin S.A., van Caeseele P., Jamieson F., Martin I.E. Polymorphisms of the Fimbria fimS Gene of Bordetella pertussis Strains Isolated in Canada // J. Clin. Microbiology. -2004. Vol. 42. - P. 5364-5367.

184. Wang J., Yang Y., Li J et al. Infantile pertussis rediscovered in China // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8 (8). - P. 859-861.

185. Watanabe M., Nagai M. Acellular pertussis vaccines in Japan: past, present and future // Expert Rev. Vaccines. 2005. - Vol. 4 (2). - P. 173184.

186. WHO. Challenges in global immunization and the Global Immunization Vision and Strategy 2006-2015 // Weekly Epidemiology. Ree. 2006. - Vol. 81.-P. 190-195.

187. WHO. Vaccine Preventable Diseases Monitoring System, global summary. 2007.

188. Willems R., Paul A., van der Heide H.G., ter Avest A.R., Mooi F.R. Fimbrial phase variation in Bordetella pertussis: a novel mechanism for transcriptional regulation // EMBO. J. 1990. - Vol. 9. - P. 2803-2809.

189. Williamson P., Matthews R. Epitope mapping the Fim2 and Fim3 proteins of Bordetella pertussis with sera from patients infected with or vaccinated against whooping cough // FEMS Immunol. Med. Microbiology. 1996. -№ 13.-P. 169-178.

190. Zhang L., Xu Y., Zhao J., Kallonen T., Cui S., Xu Y., Hou Q., Li F., Wang J., He Q., Zhang S. Effect of vaccination on Bordetella pertussis strains, China 11 Emerg. Infect. Dis. 2010. - Vol. 16 (11). - P. 1695-701.

Информация о работе

Гадуа, Натия Торникеевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Особенности генетической структуры современных штаммов Bordetella pertussis. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы