Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тест-систем для идентификации вируса миксомы кроликов на основе анализа генома

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-систем для идентификации вируса миксомы кроликов на основе анализа генома"

На правах рукописи

Моргунов Сергей Юрьевич

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА МИКСОМЫ КРОЛИКОВ ИА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОМА

03.02.02 Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

18 АПР Ш

005051877

V__

Покров - 2013

005051877

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).

Научный руководитель

доктор ветеринарных наук, профессор

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Колбасов Денис Владимирович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Ярыгина Елена Игоревна

(ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

доктор ветеринарных наук,

профессор Уласов Валентин Ильич

(ФГБУ «ВГНКИ»)

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ), г.Владимир.

Защита диссертации состоится «16» мая 2013 г. в «II30» часов на заседании диссертационного совета при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская обл., г. Покров, Тел/факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «26» марта 2013 г. и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии чучулу.уппуутпч.гц и сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии, кандидат биологических наук ¿Л^ Е.А. Балашова

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1 Актуальность темы

Миксоматоз (лат. — Mixomatosis cuniculi; англ. — Infectious myxoma of rabbits) — остро протекающая, высококонтагиозная болезнь кроликов, характеризующаяся воспалением слизистых оболочек и появлением студенисто-гнойных отеков в области головы, ануса, гениталий и кожи [2].

К вирусу высокочувствительны как домашние, так и дикие кролики независимо от возраста. Болезнь часто заканчивается летальным исходом. Смертность может достигать 95-100% поголовья [1].

С момента открытия миксоматоза кроликов в 1896 г. и до настоящего времени, благодаря высокой контагиозности вируса миксомы и способности к быстрому распространению, болезнь стали регистрировать практически во всех странах мира [2].

Однако основное значение в распространении возбудителя миксоматоза в природе имеют кровососущие насекомые, такие как комары, клещи и блохи, в организме которых вирус сохраняется до 7 месяцев, создавая очаг возбудителя в природе [1].

При этом единственный в России надежный метод выявления вируса миксомы кроликов - биопроба на кроликах с последующим выделением вируса в культуре клеток, что делает актуальной задачу разработки новых методов лабораторной диагностики миксоматоза, позволяющих выявлять вирус в течение короткого времени из различных биологических материалов и объектов ветеринарного надзора (кровь, кожа, шерсть, смывы, насекомые и т.п.) и контролировать распространение и изменчивость изолятов вируса.

Настоящая работа посвящена разработке чувствительных и специфических методов выявления генома вируса миксомы кроликов с помощью различных модификаций полимеразной цепной реакции (классическая, мультиплексная, а также ПЦР в режиме реального времени).

В целом ряде случаев во время эпизоотий возникала необходимость исследования патологического материала, поступающего на экспертизу в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, как на миксоматоз, так и на ВГБК. Оба вируса поражают одни и те же виды животных, обладают перекрывающимися ареалами и вызывают инфекции со сходными клиническими проявлениями, что явилось побудительным мотивом разработки мультиплексной ПЦР для

одновременного выявления геномов вирусов миксомы кроликов и геморрагической болезни кроликов.

1.2 Степень разработанности проблемы Изучению вируса миксомы кроликов посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных исследователей. Лабораторное подтверждение диагноза на миксоматоз в России проводят с помощью серологических методов, электронной микроскопии и постановкой биопробы на кроликах с последующим выделением вируса в культуре клеток. Эти методы являются длительными, трудоемкими и далеко не всегда позволяют дифференцировать данную болезнь от оспы кроликов [1,2,6].

За рубежом для выявления генома вируса миксомы широко используется метод ПЦР. Данный метод является не только необходимой диагностической реакцией, но и этапом для последующего определения первичной структуры фрагментов генома для дифференциации штаммов и изолятов вируса, а также изучения роли отдельных генов в патологии и эволюции вируса [3,4,5].

Однако в отечественной ветеринарной практике нет данных о разработке тест-систем для выявления генома вируса миксомы кроликов, что затрудняет диагностические исследования и не позволяет провести генетический анализ циркулирующих в Российской Федерации полевых изолятов вирусов.

1.3 Цели и задачи исследования Цель настоящего исследования - разработка методов выявления генома вирусов миксомы кроликов на основе различных вариантов ПЦР.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- на основе анализа нуклеотидной последовательности участков генома вируса миксомы кроликов рассчитать и синтезировать специфичные праймеры;

- оптимизировать условия постановки ПЦР и разработать тест-систему на основе ПЦР с электрофоретической детекцией для выявления генома вируса миксомы;

- разработать тест-систему для выявления геномов вирусов миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени;

- определить специфичность и чувствительность разработанных тест-систем при идентификации генома вируса миксомы кроликов.

- провести филогенетический анализ вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов.

1.4 Научная новизна исследований

Впервые определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена M022L двух отечественных вакцинных штаммов (В-82 и Микс-98) и четырёх полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в различных регионах РФ в 2009-2012 гг.

Показано, что отечественные вакцинные штаммы В-82 и Микс-98 формируют отдельную ветвь филограммы с зарубежными штаммами RIAM, Borghi и отличаются от нуклеотидных последовательностей данного участка полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в РФ.

Установлено, что полевые изоляты вируса миксомы кроликов, выделенные в период с 2009-2012 гг. в разных субъектах Российской Федерации, идентичны друг другу, имеют наибольшее сходство (99 %) с группой вирусов, выделенных на территории Европы (шт. Lausanne, изолятами из Греции GR-Lal, GR-Thl, GRS/07).

Впервые в России разработан комплекс методов для идентификации геномов вирусов миксомы кроликов, фибромы Шоупа и геморрагической болезни кроликов на основе различных вариантов ПЦР (ПЦР в формате электрофоретической детекции, ПЦР в режиме реального времени).

1.5 Практическая и теоретическая значимость

Разработан метод идентификации генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР в формате электрофоретической детекции.

Разработан метод идентификации геномов вирусов миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Разработан метод для выявления геномов вирусов миксомы и геморрагической болезни кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

Разработанная тест-система для выявления генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР в формате электрофоретической детекции применена для мониторинговых исследований 45 проб от домашних кроликов из частных хозяйств, отобранных в различных регионах РФ (Московской, Смоленской, Тверской и Ивановской областях и др.) в период вспышки миксоматоза. В 20 пробах обнаружена ДНК вируса миксомы кроликов. Данные ПЦР подтверждены результатами биопробы.

Разработаны и утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым A.M.: «Методические положения по выявлению ДНК вируса миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции» 16.11.2011, «Методические положения по выявлению нуклеиновой кислоты вируса миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» 12.12.2012, «Методические положения по выявлению нуклеиновых кислот вирусов геморрагической болезни кроликов и миксомы кроликов методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» 28.5.2012.

1.6 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите

В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы исследования вирусов, их химического состава, механизмов их размножения, молекулярно-генетических аспектов их взаимоотношений с клеточными организмами, а также проблемы инфекционности вирусов, разработки средств диагностики, вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований: изучение химического состава, структуры и строения вирусов, антигенных свойств вирусов; исследование особенностей репродукции вирусов и их взаимоотношений с восприимчивыми к вирусам клетками; стратегию вирусного генома; разработку диагностики и совершенствование лабораторных диагностических систем в диссертационной работе представлены данные по разработке тест - системы для выявления генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР с электрофоретической детекцией, тест - система для выявления генома вируса миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом ПЦР в режиме реального времени и тест-система для выявления геномов вирусов миксомы и геморрагической болезни кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Приведены результаты секвенирования и филогенетического анализа фрагментов генома вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в РФ.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 2, 3,4, 6,10.

1.7 Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2010-2013 гг.). Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2010» (г. Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (г. Покров, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века. Инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (г. Ульяновск, 2011 г.).

1.8 Публикация научных исследований

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 статья опубликована в журнале «Ветеринарная патология», включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.9 Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1.Тест-система на основе ПЦР с электрофоретической детекцией для идентификации генома вируса миксомы кроликов позволяет определять наличие генома возбудителя в пробах крови, органов и тканей больных животных с аналитической чувствительностью до 0,5 ^ ТСШ50/см3 или 0,5 ^ 1Л350/см3.

2. Тест-система для идентификации геномов вируса миксомы кроликов и вируса фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяет быстро и надежно выявлять вирусы с аналитической чувствительностью до - 0,5 ТСЮ5о/см3 или -0,5 ЬЭ 5о/см3 в одном образце.

3.Тест-система для выявления геномов вирусов миксомы и геморрагической болезни кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени позволяет быстро и надежно выявлять ДНК вирусов с аналитической чувствительностью 0 ^ ЬО50/См3 и менее - 0,5 ^ ТСШ50/СМ3 при исследовании биоматериала на наличие ДНК вируса миксомы кроликов, а также - 0,5 ^ ЬО50/См3 при исследовании патологического материала на наличие РНК вируса геморрагической болезни кроликов.

4.Результаты филогенетического анализа вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов позволяющие утверждать, что отечественные вакцинные штаммы В-82 и Микс-98 и зарубежные штаммы

RIAM и Borghi формируют отдельную ветвь филограммы и отличаются от нуклеотидных последовательностей данного участка гена M022L полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в период с 2009-2012 гг. в разных субъектах Российской Федерации, идентичных друг другу и имеющих наибольшее сходство (99 %) с группой вирусов, выделенных на территории Европы (шт. Lausanne, изолятами из Греции GR-Lal, GR-Thl, GRS/07).

1.10 Структура и объем диссертационной работы

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 13 отечественных и 98 иностранных источников и 2 интернет-ресурса, дополнена приложениями. Диссертация содержит 9 таблиц и 15 рисунков. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.11 Личный вклад соискателя Экспериментальные исследования, анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении исследований практическую и консультативную помощь оказывали кандидат биологических наук Жигалева О.Н., кандидат биологических наук Бурмакина Г.С., кандидат биологических наук | Южук Т.Э.|, за что автор выражает им глубокую признательность.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы

2.1.1 Вирусы

В работе использовали музейные штаммы из коллекции ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии: лиофилизированный материал, содержащий штамм МР вируса миксомы, лиофилизированный культуральный материал (CV-1), содержащий штамм Микс-98 вируса миксомы, Лепоривак (адаптированный к перевиваемой культуре клеток RK-13) и производственный штамм В-82, с активностью 3,5 - 4,5 lg TCIDjo/cm3, культуральный материал (ФЭК), содержащий штамм В-82 вируса миксомы, культуральный материал (RK-13/2-03), содержащий штамм Лепоривак вируса миксомы и вирулентный штамм МР (50 пас), а также ДНК вируса миксомы штамм Lausanne любезно

предоставленный GRANT MCFADDEN Professor, Dept.Molekular Genetics& Microbiology, College of Mdicine, University of Florida, США.

В работе использовали лиофилизированный материал, содержащий вирус фибромы Шоупа из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

В работе использовали штамм вируса ГБК Манихино-09 из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

В качестве отрицательных контролей использовали ДНК культурального вируса оспы овец штамм Б5/96 клонированный вариант штамма НИСХИ.

Кроме того, в работе для выделения генома использованы пробы органов (подкожная клетчатка, селезенка, печень, цельная кровь), полученные от павших или подозреваемых на миксоматоз (вынужденно убитых) кроликов.

Пробы для исследования поступили в ходе мониторинговых обследований хозяйств Московской, Ивановской, Тверской и Смоленской областей во время вспышек заболевания в период с 2009-2012 гг.

2.1.2 Культуры клеток

Для наработки вируса использовали перевиваемые линии клеток почки кролика (RK-13), культуру клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), перевиваемую линию клеток африканской зеленой мартышки (CV-1), которые получали в лаборатории «Биотехнология» ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

В качестве отрицательных контролей для ПЦР использовали ДНК, выделенную из перевиваемых линий клеток почки кролика RK-13, культуры клеток ФЭК, культуры клеток CV-1.

2.1.3 Бактериальный штамм и плазмида

Для трансформации использовали компетентные клетки E.coli штамма Тор 10 (Invitrogen, США), а в качестве вектора для клонирования - плазмидный вектор pGEM -Т Easy (Promega, США).

2.2 Методы

2.2.1 Выделение нуклеиновых кислот

Для выделения нуклеиновых кислот из проб цельной крови, суспензий органов использовали методику нуклеосорбции на силикагеле Boom et al (1991), гуанидин тиоционат-фенол-хлороформную экстракцию и коммерческий реагент Trizol LS («Invitrogen», США).

2.2.2 Постановка полимеразпой цепной реакции

Для постановки классического варианта ПЦР использовали амплификаторы "Терцик - MC 2" (ЗАО "НПФ ДНК-технология", Россия) и "Palm Cycler" (Corbett Research, Австралия). ПЦР проводили в реакционной смеси объёмом 25 мкл, содержащей необходимые компоненты для амплификации.

2.2.3 Электрофоретическая детекция продуктов ПЦР

Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофорезной детекции в 1,5 - 2,0 % агарозном геле, содержащем 0,4-0,5 мкг/мл интеркалирующего красителя бромистого этидия. Электрофорез проводили, используя трис -ацетатный или трис - боратный буфер при напряжении 15 В/см длины геля в течение 20 минут. Учет результатов электрофореза проводили по определению размера ПЦР-продуктов при сравнении с маркером молекулярного веса ДНК с помощью гель-документирующей системы GelDoc (BioRad, США).

2.2.4 Выделение и очистка продуктов ПЦР

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили с помощью этанольной преципитации непосредственно из реакционной смеси, а также из агарозного геля методами фенольной экстракции после механического разрушения геля, методом нуклеосорбции после растворения геля буфером на основе иодида натрия, а также выделение с помощью набора Quagen.

2.2.5 Нуклеотидное секвенирование

Секвенирование проводили на автоматическом анализаторе Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130 с использованием наборов для секвенирования Big Dye terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit.

2.2.6 Клонирование фрагментов генов

Методом электропорации трансформировали рекомбинантной плазмидой компетентные клетки Е. coli, штамм Тор 10 (Invitrogen, США). Методом щелочного лизиса из 1,5 -2 мл бактериальной культуры каждого клона выделяли плазмидную ДНК, которую затем проверяли методом ПЦР на наличие вставки требуемой нуклеотидной последовательности.

2.2.7 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей

проводили с использованием алгоритма "Clustal W" программы "Bio Edit 7.0.0". Для разработки олигонуклеотидных праймеров и зондов использовали

и

программы "Oligo 6.0" и "Primer Express". Специфичность рассчитанных олигонуклеотидов проверяли при помощи интернет - сервиса BLAST (http://www.ncbi.gov.nlrn.com). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы "Mega 5.05". 2.2.8 Статистическая обработка результатов исследований Полученные результаты подвергали статистической обработке общепринятыми методами, используемыми в биологии. Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента - Фишера, согласно которому для большинства биологических экспериментов уровень вероятности Р > 0,05 свидетельствует об отсутствии закономерных отличий между сравниваемыми величинами. Обнаруженные отличия считались достоверными, если уровень вероятности Р < 0,05, а при Р< 0,01 и Р < 0,001 существенность разницы приобретает соответственно более значимую достоверность.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Разработка тест-системы для выявления ДНК вируса миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции На первом этапе исследований разработана тест-система для выявления ДНК вируса миксомы кроликов с помощью полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией.

На основе анализа опубликованных в GenBank первичных последовательностей геномов изолятов возбудителя миксомы кроликов с помощью компьютерных программ 01igo4, BioEdit 6.0, BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTA. были подобраны специфические праймеры, комплементарные консервативной области фрагмента гена M022L, кодирующего оболочечный белок, ответственный за упаковку вирусной ДНК. Подобранные нами праймеры фланкировали участок геномной ДНК размером 550 п.о.

Для оптимизации условий постановки ПЦР были подобраны концентрация реагентов, состав реакционной смеси и температурно-временной режим реакции.

ПЦР продукты синтезировали в двух температурных режимах (+50°С и +65°С), амплифицированные фрагменты анализировали методом

электрофоретической детекции в агарозном геле. Данные эксперимента приведены на рисунке 1.

Отжиг при 65" 0гж1гпри50°

Рисунок 1. Электрофореграмма результатов определения специфичности выявления генома вируса миксомы методом ПЦРс электрофоретической детекцией. Треки: 1-отрицательный контроль, 2, 6 культуральный материал ФЭК, содержащий штамм В-82, вируса миксомы, 3, 7 лиофилизированный материал, содержащий штамм MP вируса миксомы, 4, 8 органный материал, содержащий изолят Смоленск 2011 вируса миксомы , 5, 9 органный материал содержащий изолят Хабаровск 2009 вируса миксомы М- маркер молекулярной массы GeneRuler 100 bp Ladder DNA marker (100bp-3000bp) (Axygen Biosciences).

«Тест-система» обеспечивала специфическую 100% амплификацию генома вируса миксомы, выделенного из испытуемых образцов биоматериала.

Как видно из результатов опыта при более жестких условия отжига происходит амплификация геномов вирулентных штаммов вируса миксомы и отсутствует амплификация генома вакцинного штамма В-82 вируса миксомы, что позволяет использовать этот метод для дифференциации производственного штамма В-82 от других штаммов вируса миксомы кроликов.

Для определения специфичности разработанной тест-системы проводили исследование культуральных материалов вакцинных штаммов вируса миксомы кроликов с исходным титром 4,0-4,5 Ig TCID50/cm3 органный вируссодержащий материал полевых изолятов с исходным титром 5,0 lg ИД 50/см3, а также контрольных отрицательных образцов.

В таблице 1 представлены результаты проверки специфичности тест-системы для выявления генома вируса миксомы методом ПЦР с электрофоретической детекцией.

Таблица 1 - Результаты выявления геномов вирусов миксомы кроликов

п=3

№ проб Наименование образца Результат ПЦР

1 10 % суспензия печени интактного кролика -

2 10 % суспензия кожи интактного кролика -

3 кровь интактного кролика -

4 интактная культура клеток RK-13 -

5 Вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная ( сер.№ 02-10) -

6 10 % суспензия легкого кролика, зараженного вирусом ГБК (экспертизный материал, г. Нижний Новгород 2011 г.) -

7 культуральный материал (CV-1),содержащий штамм Микс-98 вируса миксомы кроликов +

8 культуральный материал (RK-13) , содержащий штамм МР вируса миксомы кроликов +

9 культуральный материал (ФЭК), содержащий штамм МР вируса миксомы кроликов +

10 культуральный материал (RK-13), содержащий штамм МЭ вируса миксомы кроликов(50 пас., 21.11.2004 г.) +

11 10 % суспензия печени кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Хабаровск-09 (подкожное заражение, 14 сутки после заражения) +

12 кровь кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Хабаровск-09 (подкожное заражение, 7сутки после заражения) +

13 10 % суспензия кожи кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, (экспертизный материал, г. Балашиха, 2011 г.) +

14 10 % суспензия кожи кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, (экспертизный материал, г. Тверь, 2011 г.) +

15 10 % суспензия кожи кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Смоленск-11 (экспертизный материал, г. Смоленск, 2011 г.) +

16 лиофилизированный материал, содержащий, штамм В-82 вируса миксомы кроликов +

17 культуральный материал ( ФЭК),содержащий штамм В-82 вируса миксомы кроликов +

18 смыв из носа кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Хабаровск-09 (подкожное заражение, 9 сутки после заражения) +

19 смыв из глаз и носа кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Смоленск-11 (экспертизный материал, г. Смоленск, 2011г.) +

20 смыв из глаз и носа кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов (экспертизный материал, г. Балашиха, 2011 г.) +

21 смыв из глаз и носа кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов (экспертизный материал, г. Иваново, 2011 г.) +

22 ассоциированная вакцина против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов сухая (сер № 20 от 7.04.10 г.) +

23 культуральный материал (RK-13/2-03) содержащий штамм Лепоривак вируса миксомы +

Примечание: «+»- положительный результат, « - » - отрицательный результат.

В комиссионных испытаниях с помощью полученной тест-системы, содержащей «Набор для выделения ДНК», «Набор для выявления генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР », «Набор для электрофоретической детекции ПЦР продуктов» из 23 образцов были выявлены все 17 положительных образцов ДНК вируса миксомы кроликов и б заведомо отрицательных образца.

Аналитическую чувствительность «Тест-системы» определяли амплификацией ДНК, выделенной из десятикратных разведений вирулентного штамма МР с исходным титром 4,0 ^ ЬБ 50/см3 (рисунок 2).

1 2 3 4МБ

12 3 4 6 6 7

Рисунок 2. Электрофореграммы результатов определения аналитической чувствительности Тест-системы для выявления генома вируса миксомы методом ПЦР с электрофоретической детекцией.

Треки : 1-исходная ДНК; далее разведения 2-1:10 3-1:10"2; 4-1:10 "3; 5-1:10 6-1:10 -5; 7-1:10 Л

В результате определения аналитической чувствительности разработанной «Тест-системы» было установлено, что с ее помощью можно выявлять ДНК вируса миксомы в разведении 1:10"4 , что соответствует 0,5 ^ ЬВ50/см3.

На следующем этапе исследований изучали возможность использования «Тест-системы....» для выявления ДНК миксомы у экспериментально зараженных кроликов. С этой целью суспензию вирулентного вируса миксомы шт. МР с титром 4,0 ^ ЬО 50/см3 вводили кроликам подкожно в область лопатки в дозе 1,0 см3 .

Материалом для исследований служили пробы органов, взятые на 3, 6 и 9 сутки после заражения кроликов. Во всех пробах был выявлен геном вируса.

Кроме того, ежедневно, в течение 9 суток проводили отбор проб крови зараженных кроликов, из которых выделяли ДНК вируса и амплифицировали с помощью специфических праймеров.

Электрофореграмма результатов выявления генома вируса миксомы методом ПЦР с электрофоретической детекцией представлена на рисунке 3.

Рисунок 3. Электрофореграмма результатов выявления генома вируса миксомы методом ПЦР с электрофоретической детекцией.

Треки : 1-9- образцы ДНК вируса миксомы в крови инфицированных животных, отобранные начиная с 1 суток по 9 сутки эксперимента включительно, М- маркер молекулярной массы GeneRuler 100 bp Ladder DNA marker (100bp-3000bp).

Как видно из рисунка, разработанная нами тест-система на основе ПЦР позволяет идентифицировать геном вируса миксомы кроликов в крови инфицированных животных начиная с 3 суток (рис.4, трек 4). Начиная с 5 суток после заражения у животных появились клинические признаки, т.есть на коже образовались плотные утолщения сначала в месте инъекции суспензии (первичные очаги), а затем и вторичные очаги, которые на 7- 8-й день слились в одно очень плотное утолщение диаметром около 8- 10 см. Болезнь проявлялась слизисто-гнойным конъюнктивитом, отеком век, ушных раковин, генитальной области, спины. С развитием болезни появились угнетение, сонливость и отказ от корма. К концу болезни кролики сильно похудели, появилась одышка, хриплое дыхание, синюшность слизистых оболочек, отмечалось повышение температуры тела и гибель через 9- 11 дней после заражения.

3.2 Разработка тест-системы для выявления генома вируса миксомы кроликов и вируса фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Разработка тест - системы для одновременного выявления геномов вирусов миксомы кроликов и фибромы Шоупа в формате реального времени стала возможной благодаря тому, что гомология нуклеотидных последовательностей консервативных областей геномов вирусов миксомы кроликов и фибромы Шоупа составляет до 99 %.

шшштштш'шттш:ш-шт

Использование этого метода сокращает время постановки реакции, трудозатраты и уменьшает риск контаминации компонентов реакции ампликонами.

Расчёт праймеров и зонда при разработке методики ПЦР в реальном времени для обнаружения генома вируса миксомы кроликов и фибромы Шоупа осуществляли на основании данных, полученных при анализе последовательностей гена, кодирующего основной оболочечный белок различных изолятов и штаммов вирусов вируса миксомы кроликов (ген M022L) и фибромы Шоупа (ген S022L). Для амплификации был выбран консервативный участок размером 150 п.о., поскольку он имел 100% гомологию у ДНК указанных вирусов. Последовательности праймеров и ДНК-зонда представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Последовательности праймеров и ДНК-зонда

Праймер Последовательность 5' - 3'

MF (прямой) [CGTCCTTGTTTCCGCTTTGATAA]

MR (обратный) [CAGGCCAAACGATACATCCACAT]

MZ (ДНК-зонд) [FAM][CGCACAACCGATCAAGGAAGACTG[BHQ1]]

В результате проведенных исследований был определён оптимальный состав ПЦР смеси и количество циклов для прибора Rotor Gene 6000 составил: 95°С - 3 мин (1 цикл); 95°С - 15 сек, 58'С - 20 сек, 72 " С - 20 сек (15 циклов); 94°С - 15 сек, 58°С - 20 сек - детекция,72'С - 20 сек (35 циклов). Учёт результатов проводили по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM при 58°С с помощью программного обеспечения используемого прибора. Значение Ct при этом колебалось от 11 до 20.

Результаты определения специфичности выявления ДНК вируса миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом ПЦР в режиме реального времени представлены в таблице 3.

При использовании испытуемой тест-системы в комиссионных испытаниях из 12 образцов было выявлено 9 положительных образцов (8 образцов ДНК вируса миксомы кроликов) и 1 образец фибромы Шоупа) из 9 и 3 отрицательных образцов из 3.

Таблица 3 - Результаты выявления геномов вирусов миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом ПЦР в реальном времени

п=3

№ проб Наименование образца результат ПЦР

1 культуральный материал (СV-1),содержащий штамм Микс-98 вируса миксомы кроликов +

2 культуральный материал (ЯК-13),содержащий штамм МР вируса миксомы кроликов +

3 культуральный (ФЭК) вирус миксомы кроликов шт. МР +

4 культуральный материал (КК-13),содержащий штамм МЭ вируса миксомы кроликов(50 пас., 21.11.2004 г.) +

5 кровь кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Хабаровск-09 (подкожное заражение, 7сугки после заражения) +

6 10 % суспензия кожи кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Смоленск-11 (экспертизный материал, г. Смоленск, 2011г.) +

7 лиофилизированный материал, содержащий, штамм В-82 вируса миксомы кроликов +

8 лиофилизированный материал, содержащий, вирус фибромы Шоупа (2004 г.) +

9 смыв из носа кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Хабаровск-09 (подкожное заражение, 9 сутки после заражения) +

10 10 % суспензия кожи интактного кролика -

11 интактная культура клеток ЮС-13 -

12 Вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная ( сер.№ 02-10) -

Во всех экспериментах не было выявлено ложноотрицательных и ложноположительных результатов.

Аналитическая чувствительность метода Real -Time ПЦР была определена на основе анализа ДНК, выделенной из последовательных десятикратных разведений вируссодержащих материалов с известным титром инфекционной активности, выраженной в LD50/cm3 . Результаты определения аналитической чувствительности, представлены в таблице 4.

Поскольку положительный сигнал регистрировали в разведениях ДНК до 10"6, то рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ПЦР в режиме реального времени составило 0,5 lg ТСШ50/см3 или 0,5 lg LD 50/см 3-

Таблица 4 - Результаты определения аналитической чувствительности метода, выраженной в инфекционных единицах

п=4

Образец Исходный титр Результат ПЦР в режиме реального времени

Разведение

Исходный образец 1:10 1:102 1:103 1:10" 1:105 1:106 1:107

Вирус миксомы культураль ный шт. МР 4,0-4,5 ^ ТСШ5о/См н/и н/и + + + + + -

Вирус миксомы лиофилизи ро ванный шт. МР 5,0 18 ЬЭзо/см3 н/и н/и + + + + + -

Примечание: «+»- положительный результат, « - » - отрицательный результат, «н/и» - не исследовали.

В ходе работы установлено, что разработанная тест-система обладает более высокой чувствительностью и позволяет выявлять ДНК вируса миксомы из образцов с признаками трупного разложения. Диагностическая специфичность и чувствительность тест-системы были подтверждены в ходе комиссионных испытаний и составили 100 %.

Конструирование рекомбинантной плазмиды, несущей последовательность консервативной области гена М022Ь вируса миксомы кроликов было вызвано необходимостью создания положительного контроля амплификации (ПК ПЦР). Использование такой конструкции позволило оценить аналитическую чувствительность разработанных тест-систем. С целью оценки возможности применения рекомбинантной плазмиды в качестве положительного контроля в тест-системе для выявления ДНК вируса миксомы кроликов методом ПЦР были подобраны оптимальные концентрации плазмиды в качестве матрицы для постановки ПЦР. Рассчитанная аналитическая чувствительность тест-систем определенная с использованием серии десятикратных разведений рекомбинантной плазмиды позволила выявлять (10+5) копий амплифицируемой области гена ДНК вируса миксомы (рисунок 6).

Цикл

Рисунок 4. Чувствительность тест-системы с положительным контролем.

1-исходная ДНК; далее разведения 2-1:10 3-1:10"2; 4-1:10°; 5-1:10"*;

6-1:10 "5; 7-1:10 8-1:10 "7.

3.3 Разработка тест-системы для выявления геномов вирусов миксомы кроликов и ГБК методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

В целом ряде случаев во время эпизоотий возникала необходимость исследования патматериала как на миксоматоз, так и на ВГБК, что явилось побудительным мотивом разработки мультиплексной ПЦР для одновременного выявления геномов вирусов миксомы кроликов и геморрагической болезни кроликов.

Данный раздел работы был выполнен совместно с научным сотрудником Бурмакиной Г.С.

Были подобраны две пары олигонуклеотидных праймеров, комплементарных генам M022L вируса миксомы кроликов и VP60 вируса геморрагической болезни кроликов. Для детекции накопления продуктов амплификации генома вируса ГБК использовали зонд, несущий флуорофор FAM (канал Green), а генома вируса миксомы канал Orange с использованием гибридизационного зонда, несущего флуорофор ROX. В результате проведенных исследований был определён оптимальный состав реакционной смеси. В процессе реакции наблюдали некоторое снижение уровня флуоресцентного сигнала по каналу FAM, что практически не влияло на чувствительность выявления генома вируса ГБК, а для системы праймеров

вируса миксомы кроликов было отмечено незначительное снижение чувствительности и уменьшения значения СК максимум на 2 цикла.

Специфичность тест-системы была подтверждена тестированием 25 проб, из которых 16 были заведомо положительными и 9 заведомо отрицательными.

Присутствие генома вируса ГБК в образцах было подтверждено с помощью ПЦР с электрофоретической детекцией. А наличие специфического антигена подтверждено серологическими методами (ИФА, РГА), соответственно. Наличие вируса миксомы кроликов и титр его инфекционной активности определяли методом ПЦР с электрофоретической детекцией и выделением вируса в культурах клеток ЯК-13 и ФЭК. Результаты опыта представлены в таблице 5.

Использование испытуемого набора позволило выявить 15 из 15 заведомо положительных образцов, содержащих как РНК вируса ВГБК, так и ДНК вируса миксомы и фибромы кроликов. Ложноположительные результаты отсутствовали.

Аналитическая чувствительность набора препаратов была определена амплификацией очищенных нуклеиновых кислот, выделенных из последовательных десятикратных разведений вируссодержащих материалов (вирус миксомы кроликов шт. «МР», 5,0 ^ Г.О50/см3 , вирус ГБК шт. «Манихино-09», 5,5 ^ ЬО50).

Рассчитанное значение аналитической чувствительности "Набора препаратов для выявления геномов вирусов геморрагической болезни кроликов (ГБК) и миксомы кроликов методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени", выраженное в инфекционных единицах, составляет 0,5 ^ Ь05о,<см3 и менее - 0,5 ^ ТСШ50/см3 при исследовании биоматериала на наличие ДНК вируса миксомы кроликов, а также - 0,5 ^ Ь050/см3 при исследовании патологического материала на наличие РНК вируса геморрагической болезни кроликов.

Таблица 5 - Результаты выявления геномов вирусов миксомы кроликов и

ВГБК

п=3

№ пробы Наименование образца Результат выявления РНК ВГБК Результат выявления ДНК вируса миксомы кроликов

1 кровь кролика, зараженного вирусом ГЕК, изолят Раменский-10 (внутримышечное заражение, 24 ч. после заражения) + -

2 10 % суспензия печени кролика, зараженного вирусом ГБК изолят Пермь-10 (в/м заражение, через 72 ч. Гемагглютинирующая активность 4 ГАЕ) + -

3 10 % суспензия печени кролика, зараженного вирусом ГБК (экспертизный материал, г. Тамбов 2010 г.) + -

4 10 % суспензия легкого кролика, зараженного вирусом ГБК (экспертизный материал, г. Нижний Новгород 2011 г.) + -

5 10 % суспензия печени кролика, зараженного вирусом ГБК, изолят Раменский-10 (г. Раменское 2010 г. Гемагглют. активность 256 ГАЕ) + -

6 10 % сусп. печени кролика, искусственно контаминированная РНК, выделенной из печени кролика инфицированного ВГБК шт. Ргапкй1П-12 (Германия, 1996 г.) + -

7 10 % сусп. печени кролика, искусственно контаминированная РНК, выделенной из печени кролика инфицированного вирусом ГБК шт. Ш1КА (Германия, 1996 г.) + -

8 кровь кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Хабаровск-09 (подкожное заражение,72 ч. после заражения) - +

9 смыв из носа кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Хабаровск-09 (подкожное заражение, 9 сутки после заражения) - +

10 смыв из глаз и носа кролика, инфицированного вирусом миксомы кроликов, изолят Смоленск-11 ( г. Смоленск, 2011 г.) - +

11 культура клеток ЯК-13, инфицированная вирусом миксомы кроликов, вирулентный шт. МР - +

12 культура клеток ЮС-13, инфицированная вирусом миксомы кроликов, вирулентный шт. МЭ (50 пас., 21.11.2004 г.) - +

13 культура клеток ФЭК, инфицированная вирусом миксомы кроликов, вакцинный шт. В-82 (23.01.12 г.) - +

14 положительный контроль рекомбинантная плазмида, несущая последовательность гена М022Ь вируса миксомы кроликов. - +

15 10 % суспензия кожи кролика, зараженного вирусом фибромы Шоупа (2004 г.) - +

16 ассоциированная вакцина против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов сухая (сер № 20 от 7.04.10 г.) + +

17 кровь от интактного кролика - -

18 10 % суспензия печени от интактного кролика - -

19 10 % суспензия легкого от интактного кролика - -

Продолжение таблицы 5

№ пробы Наименование образца Результат выявления РНК ВГБК Результат выявления ДНК вируса миксомы кроликов

20 10% суспензия печени кролика, инфицированного Раз1еиге11а тииоЫс1а (экспертизный материал, г. Нижний Новгород 2011 г.) - -

21 вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная (сер. № 06-09) - -

22 вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная (сер. № 02-10) - -

23 вакцина против панлейко пении, ринотрахеита, калицивирусной инфекции и хламидиоза кошек «Мультифел-4» (сер. №11) - -

24 интактная культура клеток ЮС-13 - -

25 интактная культура клеток ФЭК - -

Примечание: «+»- положительный результат, « - » - отрицательный результат.

3.4 Определение филогенетического родства вакцинных штаммов и изолятов, выделенных при вспышках миксоматоза в Российской Федерации

Нами проведено секвенирование участка гена M022L, кодирующего коровый протеин вируса миксомы кроликов, размером 1116 п.о. двух вакцинных штаммов и четырех отечественных изолятов, выделенных в 20092012г.. Филогенетические взаимоотношения исследуемых изолятов и штаммов вируса, а также изолятов вируса миксомы кроликов из стран Европы, известных в настоящее время (получены из базы данных GeneBank), анализировали с помощью программы Mega/UPGMA method (version 3.6а 2.1) с 1 ООО повторов.

Выравнивание нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ показали, что изоляты, выделенные на территории России, принадлежат к Европейской группе штаммов и изолятов (рисунок 5).

Как видно из дендрограммы отечественные вакцинные штаммы В-82 и Микс-98 и зарубежные штаммы RIAM и Borghi формируют отдельную ветвь филограммы, что, возможно, связано с адаптацией данных штаммов и длительным пассированием их в культурах клеток.

При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей по участку гена M022L российских изолятов вируса миксомы кроликов с помощью

компьютерной программы "BLAST" было установлено, что они имеют наибольшее сходство с группой вирусов, выделенных на территории Европы. Процент гомологии нуклеотидных последовательностей российских изолятов со штаммом Lausanne и изолятами из Греции GR-Lal, GR-Thl, GRS/07 составляет 99 %.

Myxome viru« major Mvtl«p« protaln gen« partial cd« A Myxorna_vlnj»_l*olat«_Habarov»k.2009

▲ Myxoma_v1rue_»traln_L«pof1vae

▲ Myxoma_vHru«_l*elata_Smo4«fl»i<.2011

▲ Myxoma_sHru»_l«olata_lvei>ovo«2012 Myxoma_viru«_i«olota_BRK_12-2-93 Myxoma_vlru»_i»olat«_Bandigo Myxom a_vtni»_l»olet«_GI«nfltld Myxom«jvlru»J «olata_KM_13

Мух om «„vi ru»_l »o lata_Maby Myxom a_vi ru«_l «olata_0 В1_406 Myxoma,vlru«J»olata_SWH_8-2-93 My x om a_yi ru«_i-«o lat«_Uriar ra Myxoma_v1r\i«Jeolat«Iws1_328 Myxom a_vl ru «_l »ol nte_WS->6_3 46 Myxom a_\dru«_Uolate_SWH_1209 Myxoma_vHru«i_l*olat«_BRK Myxom a_viru«

Myxoma__vi ru «__l *olata_Cornwall Myxoma_vlrua_l»olate_GufrgaMln

Myxoma_vlru«_l»ol«w_LuC$L

My xoma_vi ru«J *olata_No Ring ham _att*nuat«d

Myxom a^vi ru«J «o lat»_. SL S

Мух om a_vi ru «_l «olata_ S WH

Мух om a_vl ruaJ *o la«a_W S1 _23 4

Myxoma_vlru»J«olatt_WSe_10 71

Myxom a_yi ru»_l »oiet«..B D2 3

Myxomt^viruwtr«] n_SG33

Myxomajvlru»j»creln_GfVl6tt1_mejor_»nv«lop«jprocrin <m022L) gana M)^come_vlni«_«traln_GR/15/11_mejor__a»walope_prota<n (m022L) gao* Myxoma_vlru«_atibln_GRS/07-major_anv«lopa_pr©t«ln (m022L) g*n« Myxoma_viru«_partiali_m022L_g«n a_fo r_m a| or_anv «1 opaj? rotaln J «ola<«_G R-TH1 Myxoma_vlru«_parTlal_m022L_gen«_<o r_major_a*tvalopa_p rotaln_l»ola<e_GRJ-a1 Myxoma^vlru»_»traln-.69ie_M022L_g«n« Myxom«,vlru«<a«tr«lnaUu *anna__M022l.-.gana A Myxom a^vi ru e^atraio^MP

Myxoma__vlru»_»traln_RlAM_m022tvj3ena_partIa1_cd» A Myxoffi«ayiru«a,Mrilna,B42

Myxoma_vlru«-»treln-Borflhl_MO22L1-XmO22L)-0at»«j9*rtl»l_cd» A Myxoma_v<ru«_«tr»ln_MJx$$

0<bv fti?!

ob»

Рисунок 5. Дендрограмма, построенная на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей фрагмента M022L вакцинных штаммов и изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных на территории России. Треугольниками отмечены российские штаммы и нзоляты вируса миксомы кроликов.

Таким образом, при проведении сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей ДНК с использованием программы Clustal W (version 1.4.) и Bioedit 6.0 установлено, что нуклеотидные последовательности всех четырех

анализируемых изолятов, выделенных в период с 2009-2011 гт. в разных субъектах Российской Федерации, идентичны друг другу, но в тоже время они отличаются от нуклеотидных последовательностей данного участка гена вакцинных штаммов В-82.

4 ВЫВОДЫ

1. Подобранные уникальные праймеры, фланкирующие ПЦР продукт размером 550 п.о., комплементарные гену М022Ь располагающемуся в левой вариабельной области генома и оптимизированный температурный режим (65°С) позволяют дифференцировать вакцинный штамм В82 от полевых изолятов.

2. Разработана тест-система для выявления генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР в формате электрофоретической детекции, позволяющая выявлять ДНК вируса миксомы кроликов в крови экспериментально инфицированных животных начиная с 3 суток с аналитической чувствительностью 0,5 ЬО 50/см3.

3.Разработана тест-система для идентификации генома вируса миксомы кроликов и генома вируса фибромы Шоупа методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, позволяющая выявлять ДНК вируса в инфицированной культуре клеток, в образцах крови и органов от инфицированных или павших животных с аналитической чувствительностью - 0,5 ^ ТСШ50/см3 или -0,5 ^ ЬЭ 5о/см3.

4. Разработана тест-система для выявления геномов вирусов миксомы и геморрагической болезни кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, позволяющая выявлять нуклеиновые кислоты вирусов в инфицированной культуре клеток, в образцах крови и органов от инфицированных или павших животных с аналитической чувствительностью 0,5 ^ Ь050/см3 и менее - 0,5 ^ ТСШ50/СМ3 при исследовании биоматериала на наличие ДНК вируса миксомы кроликов, а также - 0,5 ^ Ь05<усм3 при исследовании патологического материала на наличие РНК вируса геморрагической болезни кроликов.

5. Установлено, что нуклеотидные последовательности участка гена М022Ь четырех анализируемых изолятов, выделенных в период с 2009-2012 гт.

в разных субъектах Российской Федерации, идентичны друг другу, имеют наибольшее сходство (99 %) с группой вирусов, выделенных на территории Европы (шт. Lausanne, изолятами из Греции GR-Lal, GR-Thl, GRS/07).

6. Отечественные вакцинные штаммы В-82 и Микс-98 и зарубежные штаммы RIAM и Borghi формируют отдельную ветвь филограммы и отличаются от нуклеотидных последовательностей данного участка гена M022L полевых изолятов вируса миксомы кроликов.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Специфические оригинальные олигонуклеотидные праймеры рекомендованы для использования при определении нуклеотидных последовательностей сегментов генома вируса миксомы кроликов, проведения генетической характеристики штаммов и изолятов возбудителя, создания генетических паспортов вакцинных штаммов в научно-исследовательских и диагностических лабораториях.

Рекомендуются в практику научно-исследовательских учреждений и специализированных ПЦР-лабораторий следующие разработанные методические положения:

«Методические положения по выявлению ДНК вируса миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции» № 53 от 16.11.2011, «Методические положения по выявлению нуклеиновой кислоты вируса миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» № 69 от 12.12.2012, «Методические положения по выявлению нуклеиновых кислот вирусов геморрагической болезни кроликов и миксомы кроликов методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» № 61 от 28.05.2012.

6 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. О диагностике и профилактике миксоматоза кроликов / В. В. Гуненков, Г. Д. Кузнецова, Е. Л. Смыченко, 3. Я. Чистова // Ветеринария. -1987. - № 12. - С. 44 -45.

2. Вирусные болезни животных /В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, И.В. Фомина // - М., ВПИТИБП. -2006. -С. 928.

3.Genome sequence of SG33 strain and recombination between wild-type and vaccine myxoma viruses / Camus-Bouclainville C, Gretillat M, Py R, Gelfi J, Gucrin JL, Bertagnoli S // Emerg Infect Dis. 2011 Apr;17(4):633-8.

4. Poxvirus genomes: a phylogenetic analysis. J. Gen / Gubser, C, S. Hue, P. Kellam, and G. L. Smith. 2004,//Virol. 85:105-117.

5. Genome Comparison of a Nonpatogenic Myxoma Virus Fields Strain with Its Ancestor ,the Virulent Lausanne Strain. J.of. / Monica Morales , Miguel A.Ramirez, Maria J. Cano, Mario Parraga, Joaquin Castilla, Luisl. Perez-Ordoyo, Juan M.Torres and Juan Barcena . // Virol. -2009. -P.2397-2403.

6. Stanford, M.M. Myxoma virus in the European rabbit: interactions between the virus and its susceptible host / Stanford, M.M. Werden SJ, McFadden // G.Vet Res. 2007 Mar-Apr;38(2):299-318. Epub 2007 Feb 13.

7 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1.Жигалева, О.Н. ДНК- диагностика миксоматоза кроликов. / О.Н. Жигалева, С.Ю. Моргунов, Д.В. Колбасов // Молекулярная биология - 2010. Сборник трудов 7-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, под редакцией В.И.Покровского; ООО «ИнтерЛаб -Сервис »Т.П. - 2010. -С.149-151.

2. Разработка тест-системы для выявления ДНК вируса миксомы / И.П. Синдрякова, С.Ю. Моргунов, Н.И. Сальников, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов // Ветеринарная патология.- М., 2011.-№4.- С.59-64.

3.Конструирование положительного контроля к тест-системе для выявления ДНК вируса миксомы методом ПЦР / И.П. Синдрякова, С.Ю. Моргунов Н.И. Сальников, Д.В. Колбасов // Ветеринарная медицина XXI века. Инновации, опыт, проблемы и пути их решения. Международная научно-практическая конференция. Ульяновск, 2011.-T.I. -С.171-174.

4. Моргунов, С.Ю. Некоторые особенности практического применения вакцинных препаратов против вирусных болезней кроликов / С.Ю. Моргунов, А.В. Луницин, Ю.П. Моргунов // Кролиководство и звероводство. - М., 2012. -№ 3. -С.29-30.

5.Development of multiplex real-time PCR assay for the detection of RHDV and Myxoma virus /G. Burmakina, A. Lunitsin, S. Tsybanov, N. Malogolovkina, S. Morgunov, E. Gluhareva, N. Bobrovskaya, D. Kolbasov; National Research Institute of Veterinary Virology // 6th Annual Meeting EPIZONE "Viruses on the move ".-Brighton,United Kingdom, 2012.

8 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПЦР - полимеразная цепная реакция; ВГБК - вирусная гемморагическая болезнь кроликов; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; РНК - рибонуклеиновая кислота; RK-13 - перевиваемые линия клеток почки кролика; ФЭК - культура клеток фибробластов эмбрионов кур; CV-1 - перевиваемая линия клеток африканской зеленой мартышки;

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Моргунов, Сергей Юрьевич, Покров

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ

04201356455

дыр

На правах рукописи

МОРГУНОВ СЕРГЕИ ЮРЬЕВИЧ

Разработка тест-систем для идентификации вируса миксомы кроликов на основе анализа генома

03.02.02 Вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Колбасов Д.В.

Покров 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ...................................................................................5

1.1 Актуальность темы.......................................................................5

1.2 Степень разработанности проблемы................................................6

1.3 Цели и задачи исследования.........................................................7

1.4 Научная новизна работы................................................................7

1.5 Практическая и теоретическая значимость работы...............................8

1.6 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите.......................................................9

1.7 Апробация работы.....................................................................10

1.8 Публикация научных исследований..............................................10

1.9 Основные положения диссертации выносимые на защиту...................10

1.10 Структура и объем диссертационной работы..................................11

1.11 Личный вклад соискателя........................................................ 12

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................13

2.1 Историческая справка.............................................................. 13

2.2 Распространение и эпизоотологические особенности миксоматоза кроликов..................................................................................... 15

2.2.1 Источники и пути передачи инфекции........................................ 18

2.2.2 Молекулярные механизмы эволюции вируса миксомы....................20

2.2.3 Патогенез и клинические признаки миксоматоза кроликов................22

2.3 Общая характеристика возбудителя миксоматоза кроликов.....................25

2.3.1 Молекулярная биология вируса миксомы.................................. 25

2.3.2 Антигенная структура, вариабельность и родство.......................... 27

2.3.3 Генетическое родство................................................................28

2.3.4 Культивирование вируса миксомы кроликов..................................29

2.3.5 Устойчивость возбудителя..........................................................30

2.4 Диагностика миксоматоза кроликов..............................................31

2.4.1 Гистологические исследования...................................................31

2.4.2 Серологические исследования...................................................32

2.4.3 Биопроба................................................................................34

2.4.4 Диагностика миксоматоза кроликов на основе методов анализа генома............................................................................................35

2.4.5 Профилактика и меры борьбы....................................................................41

2.5 Заключение по обзору литературы................................................................48

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................50

3.1 Материалы........................................................................................................50

3.1.1 Вирусы...........................................................................................................50

3.1.2 Культуры клеток...........................................................................................51

3.1.3 Образцы патологических материалов........................................................51

3.1.4 Животные......................................................................................................52

3.1.5 Соли, реагенты для приготовления растворов, буферных смесей..........52

3.1.6 Растворы и реактивы.............................................................. 52

3.1.7 Бактериальный штамм и плазмида.............................................53

3.2 Методы.............................................................................................................54

3.2.1 Отбор и подготовка биологических материалов для исследований.... 54

3.2.2 Выделение нуклеиновых кислот................................................................55

3.2.3 Постановка полимеразной цепной реакции...............................................56

3.2.4 Электрофоретическая детекция продуктов ПЦР....................................57

3.2.5 Выделение и очистка продуктов ПЦР..........................................57

3.2.6 Нуклеотидное секвенирование.................................................. 57

3.2.7 Клонирование фрагментов генов............................................... 57

3.2.8 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей................58

3.2.9 Статистическая обработка результатов исследований..................... 58

4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ..................................................................59

4.1 Разработка тест-системы для выявления ДНК вируса миксомы методом ПЦР.........................................................................................................................59

4.1.1 Подбор праймеров и оптимизация режима амплификации ........... 59

4.1.2 Проверка специфичности тест-системы.......................................61

4.1.3 Определение чувствительности тест-системы................................64

4.2 Разработка тест-системы для выявления геномов вируса миксомы и вируса фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме

реального времени................................................................................................66

4.2.1 Расчет праймеров для выявления геномов вируса миксомы и вируса

фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени........................................................................ 67

4.2.2 Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального ремени.................................................................67

4.2.3 Конструирование положительного контроля к тест-системе для выявления ДНК вируса миксомы методом полимеразной цепной реакции

в режиме реального времени................................................................................73

4.3 Разработка тест-системы для выявления геномов вирусов миксомы кроликов и ГБК методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени...........................................................................................75

4.3.1 Определение аналитической чувствительности набора препаратов для одновременного выявления геномов вирусов ГБК и миксомы кроликов ....81

4.3.2 Определение аналитической чувствительности, выраженной в количестве копий нуклеиновых кислот...............................................83

4.4 Определение филогенетических связей вакцинных штаммов и изолятов, выделенных при вспышках миксоматоза в Российской Федерации.........87

5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ...................................91

6 ВЫВОДЫ............................................................................................................98

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...............................................................99

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ........................................100

9 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................114

10 ПРИЛОЖЕНИЯ ......................................................................116

1 ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность темы

Миксоматоз (лат. — Mixomatosis cuniculi; англ. — Infectious myxoma of rabbits) — остро протекающая, высококонтагиозная болезнь кроликов, характеризующаяся воспалением слизистых оболочек и появлением студенисто-гнойных отеков в области головы, ануса, гениталий и кожи [2].

К вирусу высокочувствительны как домашние, так и дикие кролики независимо от возраста. Болезнь, как правило, часто заканчивается летальным исходом. Смертность может достигать 95-100% поголовья [Гуненков В. В. и др., 1987].

С момента открытия миксоматоза кроликов в 1896 г. и до настоящего времени, благодаря высокой контагиозности вируса миксомы и способности к быстрому распространению, болезнь стали регистрировать практически во всех странах мира[Сюрин В.Н. и др., 2006].

Однако, основное значение в распространении возбудителя миксоматоза в природе имеют кровососущие насекомые, такие как комары, клещи и блохи, в организме которых вирус сохраняется до 7 месяцев, являясь очагом возбудителя в природе в межэпизоотический период [Гуненков В. В. и др., 1987].

При этом единственный в России надежный метод выявления вируса миксомы кроликов - биопроба на кроликах с последующим выделением вируса в культуре клеток, что делает актуальной задачу разработки новых методов лабораторной диагностики миксоматоза, позволяющих выявлять вирус в течение короткого времени из различных биологических материалов и объектов ветеринарного надзора (кровь, кожа, шерсть, смывы, насекомые и т.п.) и контролировать распространение и изменчивость изолятов вируса.

Исходя из вышеизложенного, настоящая работа посвящена разработке чувствительных и специфических методов выявления генома вирусов миксомы кроликов, фибромы Шоупа и геморрагической болезни кроликов с помощью различных модификаций полимеразной цепной реакции (классическая, мультиплексная, а также ПЦР в режиме реального времени).

В целом ряде случаев во время эпизоотий возникала необходимость исследования патологического материала, поступающего на экспертизу в ГНУ ВНИИВВ и М Россельхозакадемии, как на миксоматоз, так и на ВГБК. Оба вируса поражают одни и те же виды животных, обладают перекрывающимися ареалами и вызывают инфекции со сходными клиническими проявлениями, что явилось побудительным мотивом разработки мультиплексной ПЦР для одновременного выявления геномов вирусов миксомы кроликов и геморрагической болезни кроликов.

1.2 Степень разработанности проблемы

Изучению вируса миксомы кроликов посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных исследователей. Как отмечалось ранее, лабораторное подтверждение диагноза на миксоматоз в России, проводят с помощью серологических методов, электронной микроскопии и постановкой биопробы на кроликах с последующим выделением вируса в культуре клеток. Эти методы являются длительными, трудоемкими и далеко не всегда позволяют дифференцировать данную болезнь от оспы кроликов. [Гуненков В. В. и др., 1987, Сюрин В.Н. и др., 2006, Stanford M.M.et al, 2007].

За рубежом для выявления генома вируса миксомы широко используется метод ПЦР. Данный метод является не только необходимой диагностической реакцией, но и этапом для последующего определения первичной структуры фрагментов генома для дифференциации штаммов и изолятов вируса, а также изучения роли отдельных генов в патологии и

эволюции вируса [Camus-Bouclainville С. et al, 2011,Gubser, С, S. et al, 2004, Monica Morales et al, 2009].

Однако в отечественной ветеринарной практике нет данных о разработке тест-системы для дифференциации геномов вирусов миксомы кроликов и фибромы Шоупа, что затрудняет диагностические исследования и затрудняет проведение генетического анализа циркулирующих в Российской Федерации полевых вирусов.

--------1.3 Цели и задачи исследования

Цель настоящего исследования - разработка методов выявления генома

вирусов миксомы кроликов на основе различных вариантов ПЦР.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- на основе анализа нуклеотидной последовательности участков генома вируса миксомы кроликов рассчитать и синтезировать специфичные праймеры;

- оптимизировать условия постановки ПЦР и разработать тест-систему на основе ПЦР с электрофоретической детекцией для выявления генома вируса миксомы;

- разработать тест-систему для выявления геномов вирусов миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени;

- определить специфичность и чувствительность разработанных тест-систем при идентификации генома вируса миксомы кроликов.

- провести филогенетический анализ вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов.

1.4 Научная новизна исследований

Впервые определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена M022L двух отечественных вакцинных штаммов (В-82 и Микс-98) и четырех полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в различных регионах РФ в 2009-2012 гг.

Показано, что отечественные вакцинные штаммы В-82 и Микс-98 формируют отдельную ветвь филограммы с зарубежными штаммами RIAM, Borghi и отличаются от нуклеотидных последовательностей данного участка полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в РФ.

Установлено, что полевые изоляты вируса миксомы кроликов, выделенные в период с 2009-2012 гг. в разных субъектах Российской Федерации, идентичны друг другу, имеют наибольшее сходство (99 %) с группой вирусов, выделенных на территории Европы (шт. Lausanne, изолятами из Греции GR-Lal, GR-Thl, GRS/07).

Впервые в России разработан комплекс методов для идентификации геномов вирусов миксомы кроликов, фибромы Шоупа и геморрагической болезни кроликов на основе различных вариантов ПЦР (ПЦР в формате электрофоретической детекции, ПЦР в режиме реального времени).

1.5 Практическая и теоретическая значимость работы

Разработан метод идентификации генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР в формате электрофоретической детекции.

Разработан метод идентификации геномов вирусов миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Разработан метод для выявления геномов вирусов миксомы и геморрагической болезни кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

Разработанная тест-система для выявления генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР в формате электрофоретической детекции применена для мониторинговых исследований 45 проб от домашних кроликов из частных хозяйств, отобранных в различных регионах РФ (Московской, Смоленской, Тверской и Ивановской областях и др.) в период вспышки миксоматоза. В 20 пробах обнаружена ДНК вируса миксомы кроликов. Данные ПЦР подтверждены результатами биопробы.

Разработаны и утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым A.M.: «Методические положения по выявлению ДНК вируса миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции» 16.11.2011, «Методические положения по выявлению нуклеиновой кислоты вируса миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» 12.12.2012, «Методические положения по выявлению нуклеиновых кислот вирусов геморрагической болезни кроликов и миксомы кроликов методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» 28.5.2012.

1.6 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите

В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы исследования вирусов, их химического состава, механизмов их размножения, молекулярно-генетических аспектов их взаимоотношений с клеточными организмами, а также проблемы инфекционности вирусов, разработки средств диагностики, вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследований: изучение химического состава, структуры и строения вирусов, антигенных свойств вирусов; исследование особенностей репродукции вирусов и их взаимоотношений с восприимчивыми к вирусам клетками; стратегию вирусного генома; разработку диагностики и совершенствование лабораторных диагностических систем в диссертационной работе представлены данные по разработке тест - системы для выявления генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР с электрофоретической детекцией, тест - система для выявления генома вируса миксомы кроликов и фибромы Шоупа методом ПЦР в режиме реального времени и тест-система для выявления геномов вирусов миксомы и геморрагической болезни кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Приведены результаты секвенирования и филогенетического анализа фрагментов генома

вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в РФ.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 2, 3,4, 6,10.

1.7 Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2010-2013 гг.). Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2010» (г. Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (г. Покров, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века. Инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (г. Ульяновск, 2011г.).

1.8 Публикация научных исследований

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 статья опубликована в журнале «Ветеринарная патология», включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.9 Основные положения диссертации выносимые на защиту:

1 .Тест-система на основе ПЦР с электрофоретической детекцией для идентификации генома вируса миксомы кроликов позволяет выявлять наличие генома возбудителя в пробах крови, органов и тканей больных животных с аналитической чувствительностью до 0,5 1§ ТСГО5о/см3 или 0,5 ^ Ь050/см3.

2. Тест-система для идентификации геномов вируса миксомы кроликов и вируса фибромы Шоупа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяет быстро и надежно выявлять ДНК вирусов с аналитической чувствительностью до - 0,5 lg TCIDso/cm3 или

- 0,5 lg LD 50/см3 в одном образце.

3. Тест-система для выявления геномов вирусов миксомы и геморрагической болезни кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени позволяет быстро и надежно выявлять ДНК вирусов с аналитической чувствительностью 0 lg LD5o/CM3 и менее - 0,5 lg TCID50/cm3 при исследовании биоматериала на наличие ДНК вируса миксомы кроликов, а также - 0,5 lg LD50/