Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация возбудителей болезней Шмалленберг и Акабане на основе ПЦР в режиме реального времени

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Идентификация возбудителей болезней Шмалленберг и Акабане на основе ПЦР в режиме реального времени"

На правах рукописи

/

Никитина Елена Григорьевна

Идентификация возбудителей болезней Шмалленберг и Акабане на основе ПЦР в режиме реального времени

03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I < НОЯ 2014

005555860

Вольгинский - 2014

005555860

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

зав. лабораторией Биофизики, Цыбанов

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии) Содном Жамьянович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник,

профессор кафедры радиобиологии и вирусологии имени Ярыгина

академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина Елена Игоревна

(ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, г. Москва)

кандидат ветеринарных наук,

зав. Референтной лаборатории болезней КРС Кононов

(ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир) Александр Владимирович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ФГБНУ ВНИТИБП), г. Щелково.

Защита диссертации состоится «30» декабря 2014 года в «10.00» часов на заседании диссертационного совета 006.003.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601125, Владимирская область, Петушинский район, пос. Вольгинский, ул. Академика Бакулова, строение 1. Тел/факс: (4922) 37-92-51.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «14» ноября 2014 года и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии wvvw.vniivvim.ru и на официальном сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВИМ

Россельхозакадемии, кандидат биологических наук

Балашова Елена Алексеевна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы

Семейство Bunyaviridae - это большая группа вирусов, поражающая позвоночных, членистоногих и растения; отдельные представители этого семейства, такие как лихорадка долины Рифт, Тягиня, Конго-крымская геморрагическая лихорадка вызывают опасные заболевания у животных и человека. В состав семейства входит более 300 вирусов, которые классифицированы в 5 родов (Tospovirus, Phlebovirus, Hantavirus, Nairovirus и Orthobunyavirus) и передаются кровососущими насекомыми и грызунами.

Одним из значимых представителей семейства Bunyaviridae является род Orthobunyavirus, объединяющий вирусы патогенные для крупного и мелкого рогатого скота. Представителями данного рода являются близкородственные вирусы болезней Акабане, Айно, Шамонда, Дуглас, которые циркулируют в Юго-Восточной Азии, а также новый вирус болезни Шмалленберг, недавно выделенный в Европе.

Болезнь Акабане (БА) - зоонозная, арбовирусная болезнь крупного и мелкого рогатого скота, характеризующаяся абортами, мертворождениями и различными пороками развития [Балашова, Е.А., 1993; Балашова, Е.А., 1992; Хан, Е.О., 2013; St. George, Т. D., 1978]. Антитела к вирусу болезни Акабане были обнаружены у буйволов, лошадей, верблюдов, свиней и обезьян. Вирус болезни Акабане широко распространен в странах Азии, Африки и Австралии [Балашова, Е.А., 1993; Балашова, Е.А., 1992; Хан, Е.О., 2013].

Вирус Шмалленберг вызывает болезнь у КРС, овец и коз с клиническими признаками, аналогичными симптомам при болезни Акабане [Hoffmann, В., 2012]. Антитела к вирусу были обнаружены у косуль, оленей, альпака, муфлона и бизона. В настоящее время болезнь зарегистрирована более чем в двадцати странах Европы [Спрыгин, A.B., 2012; Doceul, V., 2013; Herder, V., 2013; Hoffmann, В., 2012; Sweeney, S.J., 2012].

В связи со сходством клинической картины, патологических изменений и родства вирусов болезней Шмалленберг и Акабане актуальным становится вопрос их дифференциации. Немаловажной причиной разработки методов ПЦР-диагностики этих инфекций является тот факт, что на территории РФ широко распространены основные векторы-переносчики болезней

Шмалленберг и Акабане (Calico¡des obsoletus, Culicoides dewulß, Culicoides brevitarsis и Culicoides punctatus), а значит нельзя исключать вероятность распространения возбудителей этих болезней на территории нашей страны [Балашова, Е.А., 1993; Спрыгин, A.B., 2012].

1.2 Степень разработанности проблемы

Изучению вирусов болезней Шмалленберг и Акабане посвящено большое количество работ зарубежных и отечественных исследователей [Львов, Д.К., 1989; Бакулов, И.А., 2000; Балашова, Е.А., 2012; Балашова, Е.А., 2010; Балашова, Е.А., 1992; Спрыгин, A.B., 2012; Хан, Е.О., 2013; Beer, М., 2013; Fischer, М., 2013; De Regge, N., 2012; Yanase, Т., 2012; Goller, K.V., 2012; Herder, V., 2013; Akashi, H., 1997; Garigliany, M„ 2012].

Для лабораторной диагностики болезни Акабане за рубежом используются различные молекулярно - генетические и серологические методы [Kurogi, Н., 1978; Lee, J.K., 2002; Strain, Y., 2004].

В России также разработаны средства ПЦР-диагностики болезни Акабане (БА) [Львов, Д.К., 1989; Бакулов, И.А., 2000; Балашова, Е.А., 1993; Филдс Б., 1989; Гайдамович СЛ., 1986]. Так, Е.О. Хан с соавторами при создании тест-систем для идентификации генома вируса болезни Акабане (ВБА) на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией и ОТ-ПЦР в реальном времени были подобраны олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие фрагменты S - сегмента гена нуклеокапсидного белка N [Хан, Е.О., 2013].

Для диагностики болезни Шмалленберг разработаны и применяются два основных метода: непрямой вариант ИФА и ОТ-ПЦР в реальном времени [Doceul, V., 2013; Herder, V., 2013].

Отсутствие в научной литературе данных о создании в РФ способа диагностики болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени, а также метода дифференциальной диагностики болезней Шмалленберг и Акабане на основе мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, свидетельствует о необходимости и своевременности их разработки.

1.3 Цель работы и задачи исследования

Целью данной работы являлась разработка тест-систем на основе

полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для идентификации возбудителей болезней Шмалленберг и Акабане.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать оригинальные олигонуклеотидные праймеры для амплификации фрагмента генома вируса болезни Шмалленберг.

2. Разработать тест-систему для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, определить её специфичность и чувствительность.

3. Разработать тест-систему для выявления и дифференциации геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, определить её специфичность и чувствительность.

4. Оценить возможность использования разработанных тест-систем для выявления геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане в крови и пробах органов от животных.

1.4 Научная новизна результатов исследования

Подобраны оригинальные праймеры и разработана отечественная тест-система на основе ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления генома вируса болезни Шмалленберг, научная новизна которой подтверждена патентом на изобретение. Бюл. № 14 от 20.05.2014 г.

Впервые в Российской Федерации разработана тест-система на основе мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления и дифференциации геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане.

1.5 Теоретическая и практическая значимость

Подобранная система из четырех олигонуклеотидных праймеров и двух ДНК-зондов, меченных разными красителями, позволяет одновременно выявлять и дифференцировать геномы близкородственных вирусов болезней Шмалленберг и Акабане.

Разработаны «Методические положения по выявлению генома вируса болезни Шмалленберг методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени», которые утверждены академиком-секретарем Смирновым A.M. 15.08.2012 г.

Разработаны «Методические положения по выявлению геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени», которые утверждены директором института 31.03.2014 г.

Разработан Стандарт ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии «Тест-система для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» (СТО 00495549-0102-2013). Данный стандарт одобрен ученым советом и утвержден директором института 01.05.213 г.

С помощью «Тест-системы для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в реальном времени» за 2012 - 2014 гт. было исследовано более 700 проб крови от животных из различных областей Российской Федерации.

1.6 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов проведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Акты комиссионных испытаний утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 22.05.2012 г. и 17.03.2014 г. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений и стандартных отклонений результатов ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Научные положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументированно отражают содержание диссертации.

Основные результаты исследований по теме диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в 2012-2014 гг.; научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (г. Покров, 2012 г.); на выездном заседании секции «Ветеринарной биотехнологии» ВНИТИБП (г. Щелково, 2012 г.); на 2-м конгрессе Европейской ассоциации ветеринарной лабораторной диагностики (EAVLD) (Польша, 2012 г.); на 7-ой Ежегодной Встрече EPIZONE "Nothing permanent, except change" (Бельгия, 2013 г.) и на 7-ой всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2014» (г. Москва, 2014 г.).

1.7 Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ в соавторстве, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ: «Ветеринария» и «Сельскохозяйственная биология».

1.8 Структура и объем диссертационной работы

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который включает 139 источников, в том числе 43 на русском языке и 96 зарубежных авторов; дополнена приложениями. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 41 рисунками. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.9 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1. Тест-система для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в реальном времени обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет выявлять РНК вируса болезни Шмалленберг.

2. Мультиплексный вариант ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени чувствительный и специфичный метод, который позволяет выявлять и дифференцировать между собой РНК геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане.

3. Результаты исследований по использованию разработанных вариантов ПЦР для идентификации генома вируса болезни Акабане в крови и пробах органов от экспериментально зараженных животных и генома вируса болезни Шмалленберг в образцах биоматериала от импортированного КРС и КРС хозяйств Российской Федерации.

1.10 Личный вклад соискателя

Основной объем представленных в диссертационной работе исследований, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. Отдельные этапы экспериментальных работ выполнены совместно с сотрудниками лабораторий Биофизики и

Диагностики (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии), а также Референтной лаборатории болезней крупного рогатого скота (ФГБУ «ВНИИЗЖ»),

В выполнении исследований по разделам 3 и 4 диссертации консультативную помощь оказывали: ведущий научный сотрудник лаборатории Диагностики, кандидат биологических наук Балашова Е.А. (освоение серологических методов); зав. лабораторией Арбовирусных инфекций, кандидат биологических наук Сальников Н.И. (освоение молекулярно-биологических методов, эксперименты по заражению животных), старший научный сотрудник Референтной лаборатории болезней крупного рогатого скота, кандидат биологических наук Спрыгин A.B. (предоставление панели положительных образцов), за что автор выражает им глубокую признательность.

Диссертационная работа выполнена в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в 2011-2014 гт.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы 2.1.1 Вирусы

В работе были использованы вирусы, полученные из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии: вирус болезни Акабане (штаммы «В8935» и «Р»); вирус блютанга 8 серотипа (штамм «NET 2007»); вирус болезни Найроби (штаммы «ММ/К-05» и «МК»); вирус лихорадки долины Рифт (штамм «RVF 113/09-ПС»); вирус болезни Ибараки (штамм «Susaki»); вирус ЭГБО 1 серотипа (штамм «New Jersey»); РНК вируса болезни Шмалленберг (получена из института Ф. Леффлера, Германия); in vitro транскрибированная РНК, синтезированная на матрице рекомбинаотной плазмиды со встройкой фрагмента генома вируса болезни Шмалленберг (ВБШ); 10% и 20 % суспензии мозга белых мышей - сосунков, инфицированных вирусом болезни Акабане, штамм "Р" и вирусом лихорадки долины Рифт, штамм «RVF(S) 15»,соответственно.

Клиническим материалом служили кровь и пробы органов (мозг, сердце, легкие, почки, лимфатические узлы) от экспериментально зараженных вирусом болезни Акабане морских свинок.

В качестве отрицательных образцов использовали пробы органов от животных (КРС, овцы; белые мыши, инфицированные вирусом ЛДР);

вируссодержащие суспензии лизатов клеток, инфицированные близкородственными и гетерологичными вирусами; пробы крови от клинически здорового крупного и мелкого рогатого скота, а также интактные культуры клеток.

2.1.2 Животные

Для экспериментального заражения вирусом болезни Акабане в опытах использовали клинически здоровых овец и морских свинок из сектора подготовки животных ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии

2.1.3 Плазмиды

Для клонирования использовали коммерческие наборы Qiagen PCR Cloning Kit (Qiagen, Германия) и Ins TAclone PCR cloning kit (Fermentas, Латвия). В качестве вектора для клонирования использовали плазмиду pTZ57R/T (Fermentas, Латвия) и клетки E.coli, штамм «One shout Top 10» (Invitrogen, США).

2.1.4 Культуры клеток

Основная часть штаммов, используемых в работе, представляла собой культуральный вируссодержащий материал, полученный в результате пассирования в перевиваемых линиях клеток почки африканской зелёной мартышки (CV-1), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13), почки сайги (ПС) и почки ягненка (ГШ).

2.2 Методы

2.2.1 Культивирование вируса болезни Акабане, получение и титрование вируссодержащего материала

Для получения культурального вируссодержащего материала проводили заражение культуры клеток CV-1 вирусом болезни Акабане, шт. «В8935». Инфицированную культуру инкубировали в стационарных условиях при (37 ± 0,5) °С в течение 2-3 сут.

Для определения инфекционной активности проводили титрование десятикратных разведений вируссодержащего материала общепринятым во ВНИИВВиМ методом в 96-луночных полистироловых планшетах с монослойной культурой клеток CV-1. Учет титрования проводили по цитопатогенному действию (ТЦД5о) в течение 7 сут.

2.2.2 Заражение животных

Двух овец и 20 морских свинок заражали внутримышечно концентрированным кулыуральным вируссодержащим материалом (болезнь Акабане, штамм «В8935») с титром инфекционной активности 7 lg ТЦД50/см3. Кровь отбирали ежедневно в течение 6 сут после заражения.

От вынужденно убитых на четвертые сутки после заражения морских свинок второй группы отбирали пробы мозга, сердца, легких, печени и лимфатических узлов, которые были использованы при оценке специфичности разработанной мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

2.2.3 Выделение нуклеиновых кислот

Выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью методов нуклеосорбции и фенольной экстракции, с TRIzol LS Reagent (Life Technology, США) и фенольно-детергентным методом, предложенным N. Sacchi и P. Chomczynski [Маниатис, Т., 1984; Нахмансон, В.М., 1990; Хан, Е.О., 2013; Chomczynski, Р., 1987].

2.2.4 Выделение и очистка ПЦР-продукта

Выделение ПЦР - продукта из агарозного геля проводили прямым осаждением в «мягких» условиях с ацетатом аммония и методом фенольной экстракции [Нахмансон, В.М., 1990].

2.2.5 Постановка реакции обратной транскрипции

Реакционная смесь для реакции обратной транскрипции, общим объемом

25 мкл, содержала 4 мкл буфера для обратной транскрипции 5-кратной концентрации; 0,03 ммоль смеси dNTP; 10 ммоль обратного прайм ера, комплементарного последовательности фрагмента S - сегмента генома вирус болезни Шмалленберг; 3,0 ед. MMLV-ревертазы и вирусную РНК в количестве 5 мкл.

Реакционная смесь для мультиплексного варианта, общим обемом 25 мкл, содержала 4 мкл буфера для обратной транскрипции 5-кратной концентрации; 0,07 ммоль смеси dNTP; 1,5 ммоль обратного праймера, комплементарного последовательности фрагмента S - сегмента генома вирус болезни Шмалленберг; 1,5 ммоль обратного праймера, комплементарного последовательности участка S - сегмента генома вирус болезни Акабане; 3,0 ед. MMLV-ревертазы и вирусную РНК в количестве 5 мкл.

Синтеза кДНК осуществляли на амплификаторе «Терцик — МС2» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», Россия).

2.2.6 Постановка ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени

Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, общим объёмом 25 мкл, содержала: 5 мкл буфера для ПЦР 5-кратной концентрации; 0,03 ммоль смеси dNTP; по 15 пмоль каждого праймера и 0,12 пкмоль/мкл зонда; 0,05 ммоль MgCI2; 3 ед. Taq-полимеразы и 10 мкл матрицы.

Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени проводили в термоциклере «Rotorgene 6000» (Corbett Research, Австралия) при температуре отжига праймеров 60 °С. Уровень флуоресценции регистрировали по каналу Hex (Yellow).

Мультиплексный вариант полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане проводили при температуре отжига праймеров 60 °С. Раствор кДНК (10 мкл) амплифицировали в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 2,5 мкл буфера для ПЦР 10-кратной концентрации; 0,13 ммоль смеси dNTP; по 15 пмоль праймеров, фланкирующих участок генома вируса болезни Акабане и 0,12 пкмоль/мкл соответствующего зонда; по 20 пмоль праймеров, фланкирующих участок генома вируса болезни Шмалленберг и 0,12 пкмоль/мкл соответствующего зонда; 0,05 ммоль MgCb; 3 ед. Taq-полимеразы.

Для постановки ПЦР использовали термоциклер «Rotorgene 6000» (Corbett Research, Австралия). Уровень флуоресценции болезни Шмалленберг регистрировали по каналу Hex (Yellow), а болезни Акабане — Farn (Green).

2.2.7 Анализ продуктов ПЦР

Для анализа фрагментов ДНК методом гель-электрофореза использовали 1,5 % агарозный гель, содержащий интеркалирующий краситель (бромистый этидий). Электрофорез проводили, используя трис-ацетатный или трис-боратный буфер, при напряженности электрического поля 10-15 В/см в течении 30 мин.

2.2.8 Клонирование ПЦР-продукта в плазмидный вектор

Полученный ПЦР-фрагменг вируса болезни Шмалленберг размером

129 п.о. клонировали в составе плазмидного Т - вектора pTZ57 R/T (Fermentas, Латвия) в соответствии с инструкцией к набору [Маниатис, Т., 1984; Sambrook, J., 2001].

2.2.9 Компьютерный анализ и сравнение нуклеотидных последовательностей, расчет олигонуклеотидов

Анализ первичной структуры геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане проводили с использованием пакетов прикладных программ BioEdit 7.0. Подбор праймеров и зондов осуществляли в программе Oligo 6.0. Специфичность рассчитанных олигонуклеотидов проверяли при помощи интернет-сервиса BLAST (http://www.ncbi.gov.nIm.com).

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Разработка тест-системы для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ- ПЦР в режиме реального времени

В связи с отсутствием в доступной литературе информации о разработке отечественного средства идентификации возбудителя болезни Шмалленберг на основе ПЦР в режиме реального времени создали тест-систему для выявления генома вируса болезни Шмалленберг с помощью данного метода.

На момент проведения исследований в открытом доступе не были опубликованы олигонуклеотидные последовательности праймеров и зонда для детекции фрагмента S — сегмента генома ВБШ. Поэтому в 2012 году нами были подобраны свои оригинальные олигонуклеотиды.

На основе анализа доступной в базе данных GenBank нуклеотидной последовательности S — сегмента генома вируса болезни Шмалленберг (код доступа НЕ649914) с использованием программ Bio Edit 7.0 и Oligo 6.0 были подобраны олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие фрагмент размером 129 п.о., комплементарные последовательностям гена нуклеокапсидного белка N. Также для детекции продуктов амплификации в режиме реального времени подобран зонд технологии Taq-Man, комплементарный внутреннему фрагменту выбранного участка и содержащий на 5'-конце излучатель флуоресценции HEX, а на З'-конце - гаситель BHQ2.

В журнале Virology (том 10) в 2013 г. была опубликована статья немецких ученых М. Beer, В. Hoffmann [et al.] (сотрудники института им. Ф. Леффлера), в которой указаны последовательности праймеров, фланкирующих фрагмент

генома вируса болезни Шмалленберг размером 88 п.о. [Fischer, М., 2013]. Для сравнительной оценки наших (Schm L и Schm U, зонд Schm Z) и «леффлеровских» праймеров (SBV-S-382F и SBV-S-469R, зонд SBV-S-408FAM) и определения специфичности матричной РНК ВБШ нами были проведены дополнительные исследования. Результаты сравнения обеих пар праймеров показали, что подобранная нами система олигонуклеотидов и праймеры, разработанные в референс-центре института им. Ф. Леффлера, имеют одинаковую чувствительность и выявляют РНК ВБШ.

В ходе оптимизации условий постановки ПЦР нами были апробированы различные температурные режимы амплификации и буферные системы. На основании поставленных реакций был выбран температурный режим с отжигом праймеров при 60 °С и состав смеси, содержащий 0,05 ммоль ионов магния и 0,03 ммоль смеси dNTP.

Для конструирования положительного контроля к тест-системе нами было проведено клонирование ПЦР-фрагмента генома вируса болезни Шмалленберг (БШ) в плазмидный вектор pTZ57R/T (Fermentas, Латвия).

Следующим этапом работы был подбор внутреннего контроля к «Тест-системе...» для проверки достоверности получаемых результатов. При оптимизации ОТ-ПЦР в реальном времени была проведена серия экспериментов, в результате которых установлено, что наиболее оптимальным является эндогенный внутренний контроль на ген, кодирующий ß-акгин, являющийся структурным компонентом всех клеток. За основу была взята методика, предложенная J.F. Toussaint и К. De Clercq [Toussaint, J.F., 2007].

Подобранные олигонуклеотидные праймеры фланкируют фрагмент гена, кодирующего ß-актин, размером 160 п.о. Для детекции продуктов амплификации в режиме реального времени был подобран зонд, содержащий на 5'-конце излучатель флуоресценции Су 5. Использование разных красителей позволяет одновременно детектировать сигналы флуоресценции по разным каналам: канал Green — для ВБШ, канал Yellow - для ß-актина.

Подобранная нами система детекции эндогенного внутреннего контроля была использована при исследовании проб органов от животных на наличие генома вируса болезни Шмалленберг (ВБШ), так как он позволяет отслеживать качество проведения этапов исследований: выделения нуклеиновых кислот,

синтеза кДНК, постановки ПЦР, транспортировки, а также хранения биоматериала.

С целью определения специфичности и чувствительности разработанной мультиплексной тест-системы провели комиссионные испытания.

Для определения специфичности использовали 22 пробы, из которых 4 были положительными и 18 отрицательными. В качестве положительных образцов нами были использованы различные разведения РНК вируса БШ, полученной из референс-центра института Ф. Леффлера, и in vitro транскрипт РНК, синтезированный на матрице рекомбинантной плазмиды.

В качестве отрицательных образцов использованы вируссодержащие суспензии лизатов клеток, инфицированные близкородственными и гетерологичными вирусами, а также интактные культуры клеток и биоматериал от интакгных животных.

В результате исследований были выявлены 4 из 4 заведомо положительных образца (рисунок 1). Также было доказано, что подобранные нами праймеры не взаимодействуют с близкородственными вирусами данного семейства и гетерологичными вирусами, поражающими КРС и MPC, что свидетельствует о специфичности тест-системы.

Рисунок 1 — Результаты выявления генома вируса болезни Шмачленберг в шифрованных образцах. Цифрами 1. 2, 7 и 10 обозначены номера образцов, содержащих геном вируса БШ; образцы под номерами 4 - 6, 8, 9 и 11 содержат геномы близкородственных вирусов (вирусы болезней Найроби, Акабане и лихорадки долины Рифт); образцы под номерами 12 - 14 содержат геномы гетерологичных вирусов, поражающих КРС и MPC (вирусы блютанга. Ибараки, ЭГБО); образцы под номерами 15 - 23 содержат интактные культуры клеток (ВНК-21/13. CV-1J, пробы крови и суспензии органов от интактных животных; ПК - положительный контроль ПЦР, ОК — отрицательный контроль ПЦР

Аналитическую чувствительность определяли на основе амплификации последовательных десятикратных разведений рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей фрагмент генома вируса болезни Шмалленберг (рисунок 2).

п=10

Рисунок 2 — Результаты выявления генома вируса болезни Шмалленберг в разведениях рекомбинантной плазмиды pTZ57 R/T//SBV//BH80/11-4 129 p.b. Цифрами обозначены разведения плазмиды: 1 — плазмида с исходной концентрацией 6,б5х1010 молекул/мкл; 2 —разведение плазмиды 1:10; i -разведение плазмиды 1:10 ; 4 — разведение плазмиды 1: I03: 5 — разведение плазмиды 1:10 ; 6 — разведение плазмиды 1: 105: 7-разведение плазмиды 1:106; 8 — разведение 1:107; 9 - разведение пчазмчды 1:10s; OK — отрицательный контроль ПЦР

Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода составляет 6,65 х 103 копий в реакционной смеси.

На базе лаборатории Биофизики проведены комиссионные испытания тест-системы, по результатам которых разработаны методические положения, утвержденные директором института и академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. 15.08.2012 г. Научная новизна представленных праймеров и тест-системы подтверждена патентом РФ. Бюл. № 14 от 20.05.14 г.

Также нами совместно с сотрудниками института защиты животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир) были проведены дополнительные комиссионные испытания разработанной «Тест-системы...», по итогам которых получены положительные результаты и составлен соответствующий акт.

3.2 Разработка тест-системы для выявления геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане методом мультиплексной ОТ - ПЦР в режиме реального времени

Схожесть клинической картины и высокий уровень генетического родства вирусов Шмалленберг и Акабане привели к необходимости создания способа

дифференциальной диагностики данных болезней методом ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени.

Поэтому следующим этапом работы являлась разработка «Тест-системы для выявления геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени».

При разработке мультиплексного варианта ПЦР ставилась задача не только выявлять геномы вирусов болезней Шмалленберг и Акабане, но и дифференцировать их между собой в одной реакции. Данное условие выполнено при использовании подобранных нами зондов технологии Taq-Man, содержащие на 5-кондах излучатели флуоресценции FAM (для ВБА) и HEX (для ВБШ), а на З'-концах - гасители ВНС^ и BHQ2, соответственно. Использование разных красителей при синтезе зондов дало возможность одновременной идентификации фрагментов геномов обоих вирусов за счет неперекрывающихся спектров флуоресценции и, следовательно, детекции флуоресцентных сигналов по разным каналам: канал Green - для выявления генома ВБА, а канал Yellow - для выявления генома ВБШ.

В связи с тем, что подобранные нами праймеры, использованные в наборе реагентов для выявления РНК вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в реальном времени, имеют хорошие характеристики специфичности и чувствительности, то для постановки мультиплексного варианта ПЦР мы решили использовать эти же олигонуклеотиды.

Ранее во ВНИИВВиМ Е.О. Хан с соавторами была разработана тест-система для выявления РНК вируса БА методом ПЦР в реальном времени. Сравнительный анализ целого ряда показателей, таких как нуклеотидный состав праймеров, длина ПЦР-продуктов, температуры плавления и отжига обеих пар праймеров, процент образования димеров показал, что эти олигонуклеотиды пригодны для постановки мультиплексного варианта ПЦР [Хан, Е.О., 2013].

При оптимизации мультиплексной ПЦР нами были апробированы различные температурные режимы амплификации и буферные системы. На основании поставленных реакций был выбран температурный режим с отжигом праймеров при 60 °С и состав смеси, содержащий по 20 пмоль праймеров, фланкирующих фрагмент генома вируса болезни Шмалленберг;

по 15 пмоль праймеров, фланкирующих фрагмент генома вируса болезни Акабане; 0,05 ммоль М§С12, по 0,13 ммоль смеси с1МТР и 10 мкл матрицы.

В качестве положительных контролей (ПК) в мультиплексной тест-системе использовались ранее сконструированные плазмиды, так как они содержат участки, фланкируемые данными праймерами.

С целью определения специфичности и чувствительности разработанной мультиплексной тест-системы провели комиссионные испытания.

Для оценки специфичности разработанной тест-системы использовали образцы РНК вируса болезни Шмалленберг и нуклеиновых кислот, выделенных из культур клеток и суспензий органов от животных, инфицированных вирусом болезни Акабане. В качестве отрицательных образцов были использованы вируссодержащие суспензии лизатов клеток, инфицированные близкородственными и гетерологичными вирусами; а также интактные культуры клеток (ВНК-21/13, СУ-1) и кровь от интактных животных.

Всего в опыте было использовано 16 проб, из которых 9 были положительными и 7 отрицательными. В результате проведённой мультиплексной ПЦР положительный результат получили только для образцов, содержащих РНК вирусов болезней Шмалленберг и Акабане. Ложноположительных и ложноотрицательных результатов при этом получено не было. Результаты исследований представлены на рисунках 3 и 4.

Рисунок 3 - Результаты выявления

Рисунок 4 - Результаты выявления

генома вируса болезни Акабане в генома вируса болезни Шмалленберг в

шифрованных образцах. Цифрами шифрованных образцах. Цифрами

обозначены номера положительных обозначены номера положительных

образцов; ПК - положительный контроль образцов; ПК -положительный контроль

ПЦР; ОК- отрицательный контроль ПЦР ПЦР; О К —отрицательный контроль ПЦР

Аналитическую чувствительность определяли на основе амплификации последовательных десятикратных разведений препаратов рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагменты геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане. Результаты ПЦР представлены на рисунках 5 и 6.

Рассчитанные значения аналитической чувствительности мультиплексного метода составляют 6,65x103 копий в реакционной смеси для вируса болезни Шмалленберг и 6,57хЮ2 копий в реакционной смеси для вируса болезни Акабане.

Рисунок 5 - Результаты амплификации Рисунок б - Результаты амплификации

разведений рекомбинантной ппазмиды разведений рекомбинантной плазмиды

pTZ57 R/T//SBV//BH80/11-4 129 р.Ь. pTZ57 R/T//Akabane virus, st. B8935/AV U -

Цифрами 1-8 обозначены разведения от AV D_113 Ь.р. Цифрами 1-9 обозначены

исходной концентрации до 1:10'; ОК - разведения от исходной концентрации до

отрицательный контроль ПЦР 1:10'8; ОК - отрицательный контроль ПЦР

В результате оптимизации условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане была создана чувствительная и специфичная тест-система. Были проведены внутри институтские комиссионные испытания, которые показали, что данная тест-система позволяет дифференцировать геномы вирусов болезней Шмалленберг и Акабане. Также были разработаны методические положения по ее применению, утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 31.03.2014 г.

3.3 Выявление генома вируса болезни Акабане в крови и пробах органов от экспериментально зараженных животных

С целью апробации разработанной мультиплексной тест-системы провели экспериментальное заражение овец и морских свинок вирусом болезни Акабане.

Двух клинически здоровых овец романовской породы и 20 морских свинок внутримышечно заражали концентрированным культуральным материалом (С\М), содержащим вирус болезни Акабане (штамм «В 8935») с титром инфекционной активности 7,0 \% ТЦД50/см3. Овце № 1 вводили культуральный вируссодержащий материал в дозе 2*107 ТЦД50, овце № 2 - в дозе Зх107ТДЦ5О.

При экспериментальном заражении морских свинок животных делили на 2 группы. Морским свинкам первой группы вводили культуральный вируссодержащий материал в дозе 5х 105 ТЦД50, а морским свинкам второй группы - в дозе 5 х 106 ТЦД50.

Начиная со вторых по шестые сутки после заражения, у животных ежедневно отбирали пробы крови и исследовали с использованием 2-х тест-систем: «Тест-системы для выявления геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени» и «Тест-системы для выявления РНК вируса болезни Акабане методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени», разработанной ранее во ВНИИВВиМ [Хан, Е.О., 2013].

При исследовании проб крови от экспериментально зараженных овец и морских свинок, с использованием указанных ранее 2-х тест-систем, положительный результат получили для проб, отобранных на 3 и 4 сутки после заражения, соответственно (таблица 1).

Полученные данные свидетельствуют о том, что на третьи сутки после заражения в крови овец наблюдалось накопление вирусной РНК в концентрации, при которой возможно обнаружение вирусного генома с помощью метода ПЦР в реальном времени.

Дополнительно на 4-е сутки после заражения у морских свинок второй группы были взяты пробы органов (мозга, легких, почки, лимфоузла, сердца), которые исследовали с использованием указанных ранее двух тест-систем. Во всех исследуемых образцах с помощью обеих тест-системам был обнаружен геном вируса болезни Акабане. Результаты ПЦР представлены на рисунках 7 и 8.

Кроме того, на 14 сутки после заражения у остальных морских свинок были взяты пробы органов (мозга, почки, сердца), которые также исследовали

с помощью мультиплексного варианта ПЦР и стандартной ПЦР в реальном времени. В исследуемых образцах с использованием обеих тест-систем геном вируса болезни Акабане обнаружен не был.

Таблица 1 — Результаты выявления генома вируса болезни Акабане в крови экспериментально зараженных животных

№ пробы Наименование Время отбора крови, сутки после заражения Овца Овца №2 I руппа № 1 (12 морских свинок) Группа № 2 (8 морских свинок)

1 Культуральный материал (СУ-1), содержащий вирус болезни Акабане (штамм «В 8935»)

2 Проба крови, отобранная перед заражением — — — —

3 Проба крови, отобранная после заражения ВБА 2 сутки — — — —

4 Проба крови, отобранная после заражения ВБА 3 сутки + + — —

5 Проба крови, отобранная после заражения ВБА 4 сутки — — + +

6 Проба крови, отобранная после заражения ВБА 5 сутки — — — —

7 Проба крови, отобранная после заражения ВБА 6 сутки — — — —

Рисунок 7 — Результаты выявления генома вируса болезни Акабане в пробах органов от морской свинки № 4 с использованием «Тест-системы для выявления РНК вируса болезни Акабане методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени»: 1 - мозг; 2 -легкие; 3 — почка; 4 — лимфоузел; 5 — сердце; 6 - отрицательный контроль выделения РНК; 7—отрицательный контроль ПЦР; 8 - положительный контроль ПЦР

Yellow (детекция БШ) /

1-8 р

5 Ю 1S 20 2S ЗО 3S

Рисунок 8 — Результаты выявления генома вируса болезни Лкабане в пробах органов от морской свинки № 4 с использованием «Тест-системы для выявления геномов вирусов болезней Шмаллеиберг и Лкабане методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени»: 1 — положительный контроль ПЦР на болезнь Лкабане; 2 — мозг; 3 — сердце; 4 — лимфоузел; 5 — почка; 6 — легкие; 7 — отрицательный контроль выделения РНК; 8 - отрицательный контроль ПЦР: 9 — положительный контроль ПЦР на болезнь Шмаллеиберг

Таким образом, в пробах крови от всех экспериментально зараженных животных и в пробах органов от морских свинок второй группы с использованием обеих тест-систем был выявлен фрагмент генома вируса болезни Акабане, что свидетельствует о том, что мультиплексный вариант ПЦР в реальном времени может быть использован для идентификации ВБА в клиническом материале.

При сравнении результатов, полученных в ходе эксперимента, установлено, что мультиплексный метод не уступает тест-системе на основе ОТ-ПЦР для выявления генома ВБА, разработанной ранее во ВНИИВВиМ [Хан, Е.О., 2013], что свидетельствует о пригодности разработанной тест-системы для идентификации возбудителя этой инфекции.

В связи с отсутствием в нашем институте инфекционного вируса болезни Шмалленберг, у нас не было возможности воспроизвести болезнь в экспериментальных условиях.

3.4 Проведение мониторинговых исследований на наличие болезни Шмалленберг на территории отдельных субъектов Российской Федерации

В связи с возросшим импортом KPC из стран Европы, которые неблагополучны по болезни Шмалленберг, высока вероятность заноса и распространения данного заболевания на территорию РФ. Поэтому одной из поставленных задач являлось проведение мониторинговых исследований проб крови и сыворотки крови от животных, завезенных в хозяйства России, с применением молекулярно-биологических (ПЦР) и серологических (ИФА) методов.

За период с 2012 по 2014 гг. нами было исследовано 709 проб крови и 116 проб сыворотки крови от импортированного и местного КРС из хозяйств различных областей РФ; 30 проб сыворотки крови от ланей и 4 пробы крови от импортированных бизонов из Смоленской области.

При проведении лабораторных исследований использовали разработанную нами «Тест-систему для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в реальном времени» и тест-систему на основе непрямого метода ИФА, производства фирмы ID Vet, Франция.

В результате мониторинговых исследований 713 проб крови от животных из хозяйств Саратовской, Владимирской, Смоленской, Нижегородской, Курганской, Тамбовской, Липецкой и Ярославской областей, а так же республики Башкортостан, с использованием разработанной нами «Тест-системы для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в реальном времени» положительных проб не выявлено.

В ходе проведения серологических исследований 146 проб сыворотки крови из хозяйств Смоленской и Тверской областей, а так же республики Башкортостан, с использованием тест-системы на основе ИФА антитела к вирусу болезни Шмалленберг так же выявлены не были.

Дополнительно с использованием разработанной нами тест-системы для выявления генома вируса болезни Шмалленберг были исследованы пробы органов от павшей коровы и абортированных плодов (головной мозг, печень,

легкое, сердце и др.), полученные из хозяйств Нижегородской и Владимирской областей.

В результате исследования проб органов от животных геном вируса болезни Шмалленберг так же обнаружен не был.

4 ВЫВОДЫ

1. Подобранные нами оригинальные олигонуклеотидные праймеры, комплементарные фрагменту Б - сегмента генома вируса болезни Шмалленберг, имеют одинаковые характеристики специфичности и чувствительности, что и праймеры, предложенные референс-центром института им. Ф. Леффлера.

2. Разработанная «Тест - система для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени» характеризуется аналитической чувствительностью б,65><103 копий в реакционной смеси, специфичностью 100% и позволяет выявлять геном возбудителя.

3. Разработанная «Тест - система для выявления геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени» характеризуется аналитической чувствительностью 6,57* 102 копий в реакционной смеси для вируса болезни Акабане и 6,65* 103 копий в реакционной смеси для вируса болезни Шмалленберг и позволяет дифференцировать вирусы обеих болезней в одной реакции.

4. Установлено, что тест-система на основе мультиплексного варианта ПЦР позволяет выявлять геном вируса болезни Акабане в крови экспериментально зараженных овец и крови и органах экспериментально зараженных морских свинок.

5. Мониторинговые исследования проб биоматериала из отдельных хозяйств 10 субъектов Российской Федерации (Саратовской, Владимирской, Нижегородской, Смоленской, Курганской, Тамбовской, Липецкой, Тамбовской, Ярославской, Тверская областей, а также Республики Башкортостан) с применением методов ИФА и ПЦР-РВ свидетельствуют об отсутствии болезни Шмалленберг на их территории.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для мониторинга на болезнь Шмалленберг в учреждениях различной ведомственной подчиненности предлагается использовать «Тест-

систему для выявления генома вируса болезни Шмалленберг методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени», которая используется во ВНИИВВиМ и региональных ветеринарных лабораториях для выявления генома возбудителя болезни Шмалленберг.

2. Для дифференциальной диагностики болезней Шмалленберг и Акабане в ПЦР-лабораториях предлагается использовать «Тест-систему для выявления геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени».

3. В качестве руководства по применению разработанных тест-систем при исследовании на наличие генома вируса болезни Шмалленберг и его дифференциации от близкородственного вируса семейства Bunyaviridae (вируса болезни Акабане) рекомендуются «Методические положения по выявлению генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в реальном времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. 15.08.2012 г., и «Методические положения по выявлению геномов вирусов болезней Шмалленберг и Акабане методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 31.03.2014 г.

4. Разработанный стандарт ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии «СТО 00495549-0102-2013», утвержденный директором института 01.05.2013 г., рекомендован для использования в научно-исследовательских центрах при обнаружении генома вируса болезни Шмалленберг.

6 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Болезнь Шмалленберг - новая болезнь жвачных в Европе / Н. И. Сальников, Е. Г. Никитина, А. В. Луницин, С. Ж. Цыбанов, Д. В. Колбасов // Ветеринария. - 2012. - № 4. - С. 23-26.

2. Болезни Шмалленберг и Акабане: сходства и различия / Е.Г. Никитина, Н.И. Сальников, Е.А. Балашова, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов // Сельскохозяйственная биология. - 2013. - № 4. - С. 48-52.

3. Вирус болезни Шмалленберг: пути заражения и диагностика / Д.В. Колбасов, Н.И. Сальников, Е.Г. Никитина, A.B. Луницин // Животноводство России.-2012.-№ 11. - С. 35-36.

4. Вирус болезни Шмалленберг (обзор данных на февраль 2013 г.) / Е.Г. Никитипа, Н.И. Сальников, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов // Ветеринария. -2013,-№4.-С. 20-23.

5. Выявление генома вируса болезни Шмалленберг методом ОТ-ПЦР в реальном времени / Д.В. Колбасов, Н.И. Сальников, Е.Г. Никитина, Е.О. Жабон // Ветеринария. - 2012. - № 8. - С. 57-58.

6. Выявление РНК вируса болезни Акабане в крови экспериментально зараженных животных / Е.Г. Никитина, Н.И. Сальников, С.А. Каторкин, E.H. Глухарева, Е.О. Хан, Е.А. Балашова // Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных: материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2013.-С. 93-96.

7. Молекулярная диагностика особо опасных буньявирусных инфекций животных / Н.И. Сальников, Е.Г. Никитина, О.В. Капустина, Е.А. Балашова, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов // Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2014». - М., 2014. - ТII. - С. 70-71.

8. Никитина, Е.Г. Болезнь Шмалленберг — эмерджентная буньявирусная болезнь жвачных в Европе / Е.Г. Никитина, С.Ж. Цыбанов // Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине: материалы 2-ой конференции молодых ученых. - Покров, 2012. — С. 49-52.

9. Пат. № 2515916. Тест-система для обнаружения РНК вируса болезни Шмалленберг и способ выявления генома вируса болезни Шмалленберг / Е.Г. Никитина, Н.И. Сальников, А.Г. Гузалова, С.Ж. Цыбанов, A.B. Луницин, Д.В. Колбасов. - Опубл. 20.05.2014 г., Бюл. № 14.

10. Application of reverse transcription real-time PCR to detect the Schmallenberg virus genome / E. Nikitina, N. Salnikov, S. Tsybanov, D. Kolbasov // 2nd congress of the European association of veterinary laboratory diagnosticians (EAVLD) - Poland, 2012. - S3 - P - 17.

11. Application of reverse transcription real-time PCR to detect the Akabane virus genome / E. Nikitina, E. Han, N. Salnikov, S. Tsybanov, D. Kolbasov // - 7th Annual Meening EPIZONE "Nothing permanent, except change" -BELGIUM, 2013.-P. 131.

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

PCK — реакция связывания комплемента

РФ - Российская Федерация

РЗГА — реакция задержки гемагглютинации

РН - реакция нейтрализации

ПЦР - полимеразная цепная реакция

КРС - крупный рогатый скот

БА - болезнь Акабане

БШ - болезнь Шмалленберг

ВБА — вирус болезни Акабане

ВБШ — вирус болезни Шмалленберг

МФА — метод флюоресцирующих антител

ИФА — иммуноферментный анализ

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция

КС - культура клеток насекомых

РНК - рибонуклеиновая кислота

ПС — перевиваемая линия клеток почки сайги

ПЯ - перевиваемая линия клеток почки ягненка

ПСГК - перевиваемая линия клеток почки сибирского горного козерога ВНК-21/13 - перевиваемая линия клеток почки новорожденного хомячка CV-1 — перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, пос. Вольгинский, Владимирской области Тираж 85 экз.