Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференциация вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе анализа геномов

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Дифференциация вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе анализа геномов"

На правах рукописи

Аронова Елена Владимировна

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИРУСОВ БОЛЕЗНИ ИБАРАКИ И ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ОЛЕНЕЙ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОМОВ

03.02.02 Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 2 СЕН 2013

005532880

Покров -2013

005532880

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссий ский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микро биологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВи Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, заместитель директора

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии) Луницин Андрей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

заместитель директора

(ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии) Еремец Владимир Иванович

кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник

(ФГБУ «ВГНКИ») Сазонкин Владимир Николаевич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образова тельное учреждение высшего профессионального образования Московская гос ударственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И Скрябина (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ), г. Москва.

Защита диссертации состоится «10» октября 2013 г. в «12°°» часов на за седании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научно учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарно" вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Влади мирская обл., Покров. Тел/факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВи1 Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «29» августа 2013 г., размещён на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniiwim.ru и на официальном сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru

Учёный секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВИМ

Россельхозакадемии, кандидат биологических наук

Балашова Елена Алексеевна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность

Наблюдаемая в последние десятилетия тенденция к расширению ареала трансмиссивных инфекций делает актуальным вопрос разработки методов диагностики возбудителей данных болезней. Сложившаяся ситуация усугубляется мировым изменением климатических условий, способствующим распространению векторов-переносчиков на новые территории и увеличению численности насекомых. Следствием этого может быть проникновение патогенов в умеренные климатические пояса обоих полушарий и рост количества вспышек в эндемических очагах [Githeko, А.К., 2000; Gould, Е.А., 2009].

В число трансмиссивных болезней входят и такие неконтагиозные вирусные болезни парнокопытных жвачных, как эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей и болезнь Ибараки. Возбудители данных инфекций — вирус эпизоотической геморрагической болезни оленей и вирус болезни Ибараки, соответственно, - относятся к роду Orbivirus семейства Reoviridae и имеют сегментированные геномы, представленные двухцепочечной рибонуклеиновой кислотой [Сюрин, В.Н., 1998а; Сюрин, В.Н., 19986].

Спектр животных, восприимчивых к вирусу эпизоотической геморрагической болезни оленей, достаточно широк, но на евразийском континенте вспышки данной болезни регистрировали только у крупного рогатого скота, также являющегося хозяином и для вируса болезни Ибараки [Temizel, Е.М., 2009; Yadin, Н., 2008; Omori, Т., 1970]. Причём, заражение крупного рогатого скота вирусами эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки вызывает развитие сходных симптомов. Это затрудняет постановку диагноза на основании общей картины течения болезни и приводит к необходимости разработки эффективных методов лабораторной диагностики возбудителей перечисленных инфекций. Аналогичными признаками при эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки являются ано-рексия, наличие язв на морде и в ротовой полости, избыточное слюноотделение, хромота, дисфагия, гиперемия, отёк конъюнктивы, нарушение репродуктивной функции rhttp://www.cfsph. iastate.edu; Temizel, Е.М., 2009; Omori, Т., 1969; Ohashi, S., 1999].

До конца XX в. эпизоотическую геморрагическую болезнь оленей на территории нашей страны не регистрировали. Однако в 1991 г. вирус эпизоотической геморрагической болезни оленей был выделен в Приморском крае из крови пятнистого

оленя [Чичикин, А.Ю., 2004]. Несмотря на отсутствие болезни Ибараки в Российско" Федерации распространённость возбудителя названной инфекции в пограничных гос ударствах (Северная Корея, Япония) создаёт угрозу заноса вируса на территори нашей страны.

Риск возникновения эпизоотии данных болезней в Российской Федераци возрастает и в связи с активным импортом восприимчивого к вирусам эпизоотиче ской геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки крупного рогатого скот проводимым в рамках Государственной программы развития сельского хозяйства регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия н 2013 - 2020 гг. |mcx.ru>documents/file document/show/19570.77.htm]. Так, только до 2016 г. программой предусмотрен импорт племенного скота в объёме 72 тыс. голов.

Распространение эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки на новые территории может привести к серьёзным экономическим последствиям в сфере животноводства. Так, страны, неблагополучные по указанным инфекциям, несут материальные потери, складывающиеся из прямых убытков от гибели животных и косвенных затрат. Последние связаны с ограничением на международную торговлю и спортивную охоту, низким приростом стада; снижением упитанности оленей и качества кожевенно-мехового и пантового сырья; снижением удоя и ухудшением качества молочной продукции, а также потерей веса у крупного рогатого скота. Только в штате Небраска (США) за лето-осень 2012 г. от эпизоотической геморрагической болезни оленей погибло около 6000 белохвостых оленей fhttp://www.promedmail.org/direct.php?id=20121220.14618641. В результате эпизоотии болезни Ибараки, зарегистрированной в 1959 г. в Японии, было инфицировано более 30 тыс. голов крупного рогатого скота; причём летальный исход наблюдался у 4000 животных [Reed, С., 2009].

Таким образом, перекрывающийся спектр восприимчивых животных, сходные клинические признаки протекания болезней у крупного рогатого скота, возможность заноса вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей в Российскую Федерацию из приграничных стран, а также в результате торгово-экономического сотрудничества со странами, неблагополучными по данным инфекциям, создают необходимость разработки методов идентификации и дифференциации указанных вирусов.

1.2 Степень разработанности проблемы

В Российской Федерации и за рубежом разработаны различные варианты по-лимеразной цепной реакции, позволяющие идентифицировать рибонуклеиновую кислоту вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, а также дифференцировать серотипы данного вируса [Снетков, К.А., 2003; Aradaib, I.E., 1994а; Harding, M.J., 1996; Aradaib, I.E., 1998; Aradaib, I.E., 2003; Wilson, W.C., 2009; Wilson, W.C., 2009a; Clavijo A., 2010; Maan, N.S., 2010]. Для обнаружения генома вируса болезни Ибараки используют классическую полимеразную цепную реакцию (стандартную или гнездовую, с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза или с проведением последующего анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) [Ohashi, S., 1999; Shin, Y.-K., 2009].

Отсутствие в доступной литературе информации о разработке тест-систем на основе полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для дифференциации вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки, а также полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, позволяющей выявлять рибонуклеиновую кислоту вируса болезни Ибараки, свидетельствует о необходимости и своевременности проведения исследований по их разработке.

1.3 Цели и задачи исследования

В связи с вышеизложенным, основной целью исследований являлась дифференциация возбудителей эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки на основе анализа геномов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие

задачи:

1. Разработать тест-систему для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, определить её специфичность и чувствительность.

2. Разработать тест-систему для выявления геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, определить её специфичность и чувствительность.

3. Провести экспериментальное заражение животных, восприимчивых к вирусам эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки, с целью по-

лучения клинического материала, а также изучения характера течения инфекционно го процесса у представителей отечественной фауны.

4. Определить нуклеотидные последовательности различных участков ген 810 трёх штаммов и одного изолята вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, а также шести штаммов вируса болезни Ибараки, имеющихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

5. Провести филогенетический анализ трёх штаммов и одного изолята вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, а также шести штаммов вируса болезни Ибараки, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, с целью определения степени филогенетического родства.

1.4 Научная новизна работы

Впервые разработана тест-система для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, позволяющая идентифицировать геном указанного возбудителя и обладающая аналитической чувствительностью 1,5 ^ ТЦД50/СМ3.

Впервые разработана тест-система для выявления геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с аналитической чувствительностью 2,0 ^ ТЦЦ50/см3 для вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей и 3,0 ТЦЦ50/СМ3 для вируса болезни Ибараки.

Впервые определён нуклеотидный состав фрагмента гена 810 изолята Приморский-91 вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, выделенного на территории Российской Федерации в 1991 г., и установлена гомологичность данной последовательности с аналогичными последовательностями штаммов вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей 2 серотипа.

Определены нуклеотидные последовательности участка гена 810 шести штаммов вируса болезни Ибараки (8ша1а (инв. № 1791а), 1пшгигш (инв. № 17916), 1Ьага1а (инв. № 261), В0501 (инв. № 1711), Ибараки вакцинный (инв. № 602) и Вакцина (инв. № 415)), депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и установлено, что геномы данных штаммов филогенетически более близки геному вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей 2 серотипа австралийского происхождения.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Разработаны «Методические положения по выявлению рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» и «Методические положения по выявлению геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утверждённые академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 30.11.2011 г. и 15.08.2013 г., соответственно.

Определены нуклеотидные последовательности участка 10 сегмента генома штаммов вируса болезни Ибараки, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и фрагмента 10 сегмента генома изолята Приморский-91 вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, выделенного на территории Российской Федерации в 1991 г.

1.6 Публикация результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах «Биотехнология», «Ветеринария» и «Российский ветеринарный журнал», включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.7 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов проведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Акты комиссионных испытаний утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 13.10.2011 г. и 05.07.2013 г. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, вычисления эволюционных дистанций с помощью программы «MEGA 5.0». Научные положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументировано отражают содержание диссертации.

Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Покров, 2011 г.), а также в рамках заседания секций «Инфекционная патология животных» и

«Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозака-демии (Москва, 2011 и 2013 гг.).

1.8 Структура и объём диссертационной работы

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 19 отечественных источников и 152 иностранных источника; дополнена приложениями. Диссертация содержит 12 таблиц и 26 рисунков. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.

1.9 Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Тест-система для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяет идентифицировать геном указанного вируса и обладает аналитической чувствительностью 1,5 lg ТЦД50/см3.

2. Тест-система для вьивления геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяет дифференцировать данные вирусы и обладает аналитической чувствительностью 2,0 lg ТЦД5о/см3 для вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей и 3,0 lg ТЦД50/см3 для вируса болезни Ибараки.

3. Экспериментальное заражение телят отечественной чёрно-пёстрой породы и пятнистого оленя вирусами болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей, соответственно, вызывает бессимптомное течение болезни.

4. В результате определения нуклеотидных последовательностей участка 10 сегмента генома и филогенетического анализа выявлено филогенетическое родство изолята Приморский-91 и штаммов вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей 2 серотипа, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (New Jersey, Alberta, А496).

5. В результате определения нуклеотидных последовательностей фрагмента 10 сегмента генома и филогенетического анализа установлено филогенетическое родство штаммов вируса болезни Ибараки, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (Susaki (инв. № 1791а),

Imaizumi (инв. № 17916), Ibaraki (инв. № 261), B0501 (инв. № 1711), Ибараки вакцинный (инв. № 602) и Вакцина (инв. № 415)), и вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей 2 серотипа австралийского происхождения.

1.10 Лнчный вклад автора в выполнение работы

Основной объём исследований проведён автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.б.н., ст.н.с. лаб. Биофизики И.М. Калабеков (освоение компьютерных программ, используемых для анализа нуклеотидных последовательностей); к.в.н., н.с. лаб. Биофизики А.Ю. Чичикин (эксперименты по заражению животных); к.б.н., н.с. лаб. Молекулярной вирусологии Г.С. Бурмакина (освоение молекулярно-биологических методов исследования); научный сотрудник НЭО Н.В. Малоголовкина (освоение вирусологических и серологических методов исследования). Патоморфологические исследования проведены совместно с сотрудниками ФГОУВПО «Ивановская государственная сельскохозяйственная академия им. Д.К. Беляева» д.б.н., зав. кафедрой нормальной патологической анатомии и ветсанэкспер-тизы В. В. Прониным и к.в.н., доцентом Г.В. Корневой.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Вирусы

В работе использовали штаммы вирусов: болезни Ибараки (Susaki (инв. № 1791а), Kyushu (инв. № 1791), Imaizumi (инв. № 17916), Ibaraki (инв. № 261), Ibaraki-2 (инв. № 209), В0501 (инв. № 1711), Ибараки-вакцинный (инв. № 602), Вакцина (инв. № 415)), эпизоотической геморрагической болезни оленей (New Jersey (инв. № 962), Alberta (инв. № 963), А496 (инв. № 1471)), африканской чумы лошадей (вакцинный штамм (инв. № 452)), блютанга (BTV-8 (инв. № 2823), BTV-21 (инв. № 2836)), полученные из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также изолят Приморский-91 вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, выделенный в 1991г. на территории Российской Федерации.

Кроме того, при оценке специфичности тест-системы для выявления геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени использовали образцы рибонуклеиновых кислот вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей 3-8 серотипов, любезно предоставленные William С. Wilson - со-

трудником Arthropod-Borne Animal Diseases Research Unit Center for Grain and Animal Health Research (USA, KS).

2.1.2 Животные

Для экспериментального заражения животных вирусами болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей с целью получения вируссодержа-щего материала (пробы крови, сывороток крови, органов) и изучения характера течения инфекционного процесса использовали: телят чёрно-пёстрой породы в возрасте 6 месяцев (4 головы); пятнистых оленей в возрасте 10 месяцев (2 головы); овец романовской породы в возрасте 6 месяцев (2 головы); эмбрионы кур, свободных от патогенной микрофлоры.

2.1.3 Культуры клеток

Большая часть исследуемых в работе штаммов представляла собой культу-ральный вируссодержащий материал, полученный в результате пассирования вирусов на следующих культурах клеток: перевиваемых линиях клеток почки африканской зелёной мартышки (CV-1), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13), почки сайги (ПС), почки сибирского горного козерога (ПСГК), почки телёнка (ПТ).

2.1.4 Кровь и сыворотки

В работе использовали кровь и сыворотки крови, отобранные от экспериментально заражённых животных (пятнистый олень, телята, овцы) на различных сроках инфицирования.

2.1.5 Плазмида и бактериальные штаммы

Конструирование рекомбинантных положительных контролей к разработанным тест-системам проводили на основе плазмидного вектора pGEM-T Easy (Promega, США). Клонирование осуществляли в генетически модифицированных клетках Е. coli линии DH5a (Invitrogen, США).

2.2 Методы

2.2.1 Выделение рибонуклеиновой кислоты

Для выделения вирусной рибонуклеиновой кислоты использовали 2 метода, модифицированные нами: метод нуклеосорбции, описанный R. Boom, и разработанный P. Chomczynski и N. Sacchi фенольно-детергентный метод [Chomczynski, Р., 1987; Boom, R., 1990].

2.2.2 Постановка реакции обратной транскрипции

Реакцию обратной транскрипции осуществляли в термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия) в 2 этапа: 1) денатурация цепей рибонуклеиновой кислоты (10 мин при 88°С или 5 мин при 95°С); 2) синтез комплементарной дезоксирибону-клеиновой кислоты (30 мин при 42°С или 30 мин при 48°С). Смесь для денатурации содержала по 10 пМ каждого праймера, 5 мкл деионизированной воды и 9 мкл выделенной рибонуклеиновой кислоты. В случае мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени использовали по 5 пМ праймеров, комплементарных фрагменту генома вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, по 10 пМ праймеров, фланкирующих участок генома вируса болезни Ибараки, и, соответственно, объём добавляемой воды снижался до 4 мкл. Смесь для обратной транскрипции общим объёмом 9 мкл состояла из 0,3мкл 25 мМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 0,2 мкл MMLV-ревертазы (200 ед/мкл), 4 мкл 5х буферного раствора для обратной транскрипции (250 мМ Tris-HCl рН8,3; 375 мМ КС1; 15 мМ MgCl2, 50 мМ DTT), 4,5 мкл деионизированной воды.

2.2.3 Постановка полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени

Реакционная смесь при постановке полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки общим объёмом 25 мкл содержала: 5 мкл буфера для Taq-полимеразы 5-кратной концентрации, 0,5 мкл 25 мМ MgCl2, 0,2 мкл 25мМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 0,2 мкл Taq-полимеразы (20 ед/мкл), по 10 пМ каждого праймера, 3 пМ флуоресцентного зонда, 8 мкл деионизированной воды и 9 мкл матрицы. Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени проводили в термоциклере «Rotorgene 6000» (Corbett Research, Австралия) при температуре отжига праймеров 62°С. Уровень флуоресценции регистрировали по каналу Yellow.

Мультиплексный вариант полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей проводили при температуре отжига праймеров 65°С. Реакционная смесь содержала следующие компоненты: 5 мкл буфера для Taq-полимерэзы 5-кратной концентрации, 1,0 мкл 25 мМ MgCl2, 0,4 мкл 25мМ дезоксирибонуклео-зидтрифосфатов, 0,2 мкл Taq-полимеразы (20 ед/мкл), по 15 пМ праймеров, фланкирующих участок генома вируса болезни Ибараки и 7 пМ соответствующего им флуо-

ресцентного зонда, по 5 пМ праймеров и 3 пМ флуоресцентного зонда, комплементарных фрагменту генома вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, 7,4 мкл деионизированной воды и 6 мкл матрицы. Детекцию флуоресценции осуществляли по каналам Green (вирус эпизоотической геморрагической болезни оленей) и Yellow (вирус болезни Ибараки).

Учёт результатов реакции осуществляли, анализируя кривые накопления флуоресцентного сигнала для каждой пробы с помощью программного обеспечения прибора.

2.2.4 Постановка классического варианта полимеразиой цепной реакции

Постановку классического варианта полимеразной цепной реакции осуществляли в термоциклере «Palm Cycler» (Corbett Research, Австралия) при температуре отжига праймеров 53°С. Реакцию проводили в смеси общим объёмом 25 мкл, состоящей из: 10 пМ каждого праймера, 0,3-0,4 мкл 25 мМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 1-1,5 мкл 25 мМ MgCl2, 5 мкл 5х буферного раствора для ПЦР (AmpliSens, Blue), 0,2-0,3 мкл Taq-полимеразы (20 ед/мкл), 7,5-6,8 мкл деионизированной воды и 9 мкл синтезированной кДНК. Результаты реакции учитывали при помощи разделения продуктов амплификации в геле агарозы методом электрофореза.

2.2.5 Проведение электрофореза

Постановку электрофореза осуществляли в 1,0-2,0 % агарозном геле, содержащем 0,001 % бромистого этидия. Электрофорез проводили в течение 40-60 минут при значениях силы тока 50 мА и напряжения 100 В. В качестве буферного раствора использовали однократный трис-ацетатный буфер.

2.2.6 Нуклеотидное секвенирование

Выделение специфичных продуктов амплификации из агарозного геля осуществляли с помощью коммерческого набора для выделения нуклеиновых кислот «AxyPrep DNA Gel Extraction Kit» («Axygen», США). Секвенирование очищенных амплифицированных фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты проводили на автоматическом секвенаторе «Genetic Analyzer 3130» (Applied Biosystems, США) с использованием набора «Big Dye v. 3.1. Terminator» (Applied Biosystems, США) в соответствии с инструкцией производителя.

2.2.7 Филогенетический анализ

Филогенетические деревья строили с использованием метода присоединения соседей (метод дистанционных матриц); расчёт эволюционных дистанций осуществляли по алгоритму р-дистанций в программе «MEGA 5.0».

2.2.8 Клонирование продуктов полимеразной цепной реакции

Клонирование полученных в результате полимеразной цепной реакции

специфичных фрагментов дезоксирибонуклеиновых кислот размером 159 и 123 пар оснований осуществляли с использованием коммерческого набора «pGEM-T Easy cloning kit» (Promega, США) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

2.2.9 Искусственное заражение животных

Для получения вируссодержащего материала (пробы крови, сывороток крови, органов) и изучения характера течения инфекционного процесса проводили искусственное заражение подопытных животных. Инфицирование осуществляли путём инокуляции вируссодержащего материала внутривенно, либо симультанным методом внутривенно и подкожно.

2.2.10 Заражение эмбрионов кур

В качестве лабораторной модели для выделения вируса болезни Ибараки использовали 10-дневные эмбрионы кур, свободных от патогеннной микрофлоры. Заражение эмбрионов кур осуществляли путём внутривенного введения 0,1 см3 вируссодержащего материала, в качестве которого использовали 10 проб вирус-крови, отобранные от инфицированного вирусом болезни Ибараки телёнка №1. Из полученного после вскрытия эмбрионов кур вируссодержащего материала (органы эмбриона с характерными изменениями: лёгкие, сердце, печень, головной мозг) готовили 10%-ную суспензию, которую исследовали на наличие фрагментов генома вируса болезни Ибараки с помощью метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, разработанного нами ранее.

2.2.11 Исследование проб сывороток крови от заражённого пятнистого оленя в реакции нейтрализации

Реакцию нейтрализации проводили на перевиваемой культуре клеток почки африканской зелёной мартышки (CV-1) с постоянной дозой вируса (100 ТЦД5о/сМ3) по общепринятой методике [Смирнов, A.M., 2008].

2.2.12 Программное обеспечение и интернет-ресурсы

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием алгоритма «Clustal W» программы «Bio Edit 7.0». Дизайн олиго-нуклеотидных праймеров и зондов осуществляли в программе «Oligo 6.0». Специфичность рассчитанных олигонуклеотидов проверяли при помощи интернет-ресурса BLAST rblast.ncbi.nlm.nih.govl. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программы «MEGA 5.0».

2.2.13 Критерии оценки разработанных тест-систем

Для характеристики разработанных тест-систем использовали 3 основных критерия: 1) аналитическая специфичность тест-системы; 2) аналитическая чувствительность тест-системы; 3) воспроизводимость результатов, получаемых при применении тест-системы.

2.2.14 Статистическая обработка результатов исследований

Полученные результаты подвергали статистической обработке общепринятыми методами, используемыми в биологии. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов полиме-разной цепной реакции в режиме реального времени, вычисления эволюционных дистанций с помощью программы «MEGA 5.0».

2.3 Результаты собственных исследований

2.3.1 Разработка тест-системы для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

В связи с отсутствием в доступной литературе информации о разработке полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для идентификации генома вируса болезни Ибараки создали тест-систему для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки с помощью данного метода

На первом этапе работы подобрали видоспецифичные праймеры IbarF и IbarR, фланкирующие участок 10 сегмента генома размером 159 пар оснований, и флуоресцентный зонд IbarZ, комплементарный внутреннему фрагменту выбранного участка и несущий в качестве флуоресцентного красителя молекулу HEX на 5'-конце, а в качестве тушителя флуоресценции - гаситель ВН2 на 3'-конце.

На следующем этапе оптимизировали параметры постановки реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, ука-

занные в разделе «2.2 Методы». Для этого использовали рибонуклеиновую кислоту вируса болезни Ибараки (штамм ЗиБакл, титр инфекционной активности вируса 6,5 ^ ТЦЦ50/см3), выделенную из вируссодержащей клеточной суспензии.

Аналитическую специфичность тест-системы оценивали по результатам по-лимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием в качестве матрицы рибонуклеиновых кислот восьми штаммов культурального вируса болезни Ибараки и трёх проб рибонуклеиновых кислот вируса болезни Ибараки, выделенных из клинического и патологического материала. Кроме того, для исследования были взяты четыре пробы, содержащие рибонуклеиновые кислоты близкородственных орбивирусов, и три интактные пробы. При этом положительный результат получили только для образцов вируса болезни Ибараки, тогда как для остальных исследованных проб кривые накопления флуоресцентного сигнала не превышали пороговую линию (рисунок 1).

Рисунок 1 - Результаты оценки специфичности выявления генома вируса болезни Ибараки с помощью метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: пробы, содержащие геном вируса болезни Ибараки: 1 - кровь, отобранная у телёнка на 14 сутки после заражения; 2 - кровь, отобранная у телёнка на 11 сутки после заражения; 3 -штамм Susaki; 4 - штамм Imaizumi; 5 - штамм Kyushu; 7 - штамм Ибараки-вакцинный; 8 -штамм Ibaraki-2; 12 - штамм В0501 (культуральный материал); 13 - штамм Вакцина; 15 -штамм Ibaraki; 18 - штамм В0501 (мозговой материал); пробы, не содержащие геном вируса болезни Ибараки: 6 - референс-штамм BTV-8 вируса блютанга, 8 серотип; 9 - штамм Alberta вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, 2 серотип; 10 — штамм New Jersey вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, 1 серотип; 11 - проба крови здорового телёнка; 14 - референс-штамм BTV-21 вируса блютанга, 21 серотип; 16 - 20%-ная суспензия мозга здоровой мыши; 17 - культура клеток почки сибирского горного козерога; 19 — отрицательный контроль выделения нуклеиновых кислот; 20 - отрицательный контроль полимеразной цепной реакции

Аналитическую чувствительность тест-системы определяли, используя панель

10-кратных разведений культурального материала, содержащего вирус болезни Иба-

раки (штамм Susaki с титром инфекционной активности 6,5 lg ТЦЦ50/см3). В ходе проведённой полимеразной цепной реакции в режиме реального времени рибонуклеиновую кислоту вируса болезни Ибараки обнаружили в разведении 1:100 ООО, что соответствует 1,5 lg ТЦЦ50/см3.

При оценке воспроизводимости результатов обнаружения генома вируса болезни Ибараки с помощью предлагаемого метода двумя независимых исследователями были получены сходные данные, и стандартное отклонение (S) варьировало в пределах от 0,007 до 1,138.

По результатам исследования на базе лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии были проведены комиссионные испытания тест-системы для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, использование которой позволяет идентифицировать геном указанного вируса, а также разработаны «Методические положения по выявлению рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утверждённые академиком-секретарём отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 30.11.2011 г.

2.3.2 Конструирование рекомбинантного контроля амплификации к тест-системе для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

С целью получения положительного контроля амплификации к тест-системе для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на основе плазмидного вектора pGEM-T Easy (Promega, США) создали рекомбинантную конструкцию, несущую последовательность участка гена S10 вируса болезни Ибараки (штамм Susaki) длиной 129 пар оснований.

На матрице последовательных десятикратных разведений полученной реком-бинантной плазмиды провели количественную полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, позволяющую определять число молекул дезоксирибону-клеиновой кислоты в исследуемых вируссодержащих образцах. В результате установили, что с помощью предложенного метода можно выявлять 24x103 копии дезокси-рибонуклеиновой кислоты в 1 мл.

Также рассчитали значение эффективности амплификации фрагмента гена S10 вируса болезни Ибараки (Е), составившее 1,20.

Таким образом, сконструировали рекомбинантную плазмиду, которая может быть использована для подтверждения специфичности показаний предложенного варианта полимеразной цепной реакции.

2.3.3 Разработка тест-системы для выявления геномов вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки с помощью мультиплексного варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

В качестве олигонуклеотидных «затравок» при синтезе специфичных фрагментов геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей в разработанной тест-системе использовали сконструированные ранее прай-меры IbarF, IbarR и зонд IbarZ (п. 2.3.1) и рассчитанные нами позднее синтетические олигонуклеотиды, комплементарные участку 7 сегмента генома вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей (EH-VP7 F, EH-VP7 R, EH-VP7 Z). При выборе флуорофора для зонда EH-VP7 Z учитывали его спектральные характеристики, что позволило проводить детекцию накопления специфичного фрагмента вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей по другому каналу - Green.

Эмпирическим путём были подобраны условия постановки реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, приведённые в разделе «2.2 Методы».

Для оценки аналитической специфичности данной тест-системы использовали образцы рибонуклеиновых кислот вирусов болезни Ибараки, эпизоотической геморрагической болезни оленей, близкородственных орбивирусов, а также образцы нуклеиновых кислот, выделенных из интактных образцов. Пробы, содержащие геномы вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки, представляли собой культуральный вируссодержащий материал, вирус-кровь от экспериментально заражённых животных и 10 % суспензию из мозга белых мышей-сосунков, инфицированных вирусом эпизоотической геморрагической болезни оленей или вирусом болезни Ибараки. В результате проведённой мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени положительный результат получили только для образцов вируса болезни Ибараки и вируса эпизоотической геморрагиче-

ской болезни оленей, тогда как в остальных исследованных пробах не регистрировали амплификацию специфичных фрагментов геномов выявляемых вирусов (рисунок 2).

Рисунок 2 - Результаты оценки аналитической специфичности мультиплексного варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (А - результаты детекции специфичного фрагмента генома вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей по каналу Green; Б - результаты детекции специфичного фрагмента генома вируса болезни Ибараки по каналу Yellow): пробы, содержащие геном вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей - 1 — штамм NVSL 046 ODV 9201 (4 серотип); 2 - штамм Alberta (2 серо-тип); 3 - штамм NVSL 47 ODV 0001 (3 серотип); 4 - штамм New Jersey ВЭГБО (1 серотип); 5 - штамм NVSL CS775 (7 серотип); 6 -штамм NVSL С6753 (6 серотип); 7 - NVSL CSIRO 157 (5 серотип); 8 - штамм NVSL DPP059 (8 серотип); 9 - кровь, отобранная у овцы романовской породы на 5 сутки после заражения вирусом эпизоотической геморрагической болезни оленей (штамм Alberta); пробы, содержащие геном вируса болезни Ибараки - 10 — штамм Susaki; 11 - штамм Ibaraki; 12 - штамм В0501 (мозговой материал); 13 - штамм Imaizumi; 14 - кровь, отобранная у телёнка на 2 сутки после заражения

При определении аналитической чувствительности разработанной тест-

системы рибонуклеиновую кислоту вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей обнаружили в разведении 1:10 000 (исходный штамм New Jersey, титр 6,0 lg ТЦЦ5о/смз), что соответствует 2,0 lg ТЦЦ50/Смз, тогда как геном вируса болезни Ибараки выявили в разведении 1:10 (исходный штамм Imaizumi, титр 4,0 lg ТЦЦ5о/смз), что соответствует 3,0 lg ТЦД50/смз.

При исследовании вышеперечисленных образцов с целью оценки воспроизводимости результатов, получаемых с использованием предложенного варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, двумя независимыми исследователями были получены сходные данные, и стандартное отклонение (S) находилось в пределах от 0,035 до 1,690.

По результатам проведённой работы на базе лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии были проведены комиссионные испытания тест-системы для выявления геномов вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки с помощью мультиплексного варианта полимеразной цеп-

А

Б

ной реакции в режиме реального времени, использование которой позволяет обнаруживать и дифференцировать рибонуклеиновые кислоты названных вирусов, а также разработаны «Методические положения по выявлению геномов вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки с помощью мультиплексного варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утверждённые академиком-секретарём отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 15.08.2013 г.

2.3.4 Конструирование рекомбинантного контроля амплификации комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей к тест-системе для выявления геномов вирусов эпизоотической геморрагической болезнн оленей и болезни Ибараки на основе мультиплексного варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Так как для контроля амплификации комплементарной дезоксирибонуклеино-вой кислоты вируса болезни Ибараки в предложенной тест-системе может применяться рекомбинантная плазмида, сконструированная к тест-системе для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, то возникла необходимость в создании только положительного контроля амплификации специфичного фрагмента генома вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе плазмидного вектора.

С этой целью было проведено клонирование участка 7 сегмента генома вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, кодирующего структурный белок VP7, в плазмидном векторе pGEM-T Easy (Promega, США).

В результате мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, проведённой с использованием в качестве матрицы последовательных 10-кратных разведений полученной рекомбинантной плазмиды, установили, что пределом обнаружения дезоксирибонуклеиновой кислоты является 9 разведение исходной матрицы. Дальнейшие расчёты позволили вычислить, что с помощью предложенного метода можно выявлять 64х103 копии дезоксирибонуклеиновой кислоты в 1 мл.

Таким образом, сконструированный рекомбинантный вектор может быть использован в разработанной тест-системе для выявления геномов вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки с помощью мультиплексно-

го варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в качестве положительного контроля амплификации фрагмента генома вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей.

2.3.5 Экспериментальное заражение телят отечественной чёрно-пёстрой породы вирусом болезни Ибараки (штамм Биваку

С целью изучения характера течения инфекционного процесса у отечественной чёрно-пёстрой породы крупного рогатого скота и получения проб крови, использованных при оценке специфичности разработанных тест-систем, было проведено экспериментальное заражение трёх телят 6-месячного возраста вирусом болезни Ибараки (штамм БивакГ) путём внутривенного введения 2 см3 вируссодержащего материала.

В ходе всего срока наблюдения у заражённых телят не отмечали каких-либо признаков болезни; температура тела находилась в пределах нормы.

При исследовании проб крови от экспериментально заражённых телят с помощью метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, разработанного нами для детекции рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки, фрагмент генома данного вируса обнаружили в образцах, отобранных со 2 по 28 сутки после заражения (т.е. на протяжении всего срока отбора проб).

В результате вскрытия погибших эмбрионов кур, заражённых кровью от инфицированного телёнка №1, отмечали многочисленные кровоизлияния на поверхности тела, вследствие чего эмбрионы имели вишнёво-красную окраску; отёчность тканей; наличие дегенеративных изменений и кровоизлияний во многих органах (сердце, печень, почки, головной мозг).

При исследовании методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени 10%-ных суспензий, полученных из органов данных эмбрионов, фрагмент генома вируса болезни Ибараки обнаружили в 90 % проб. Это указывает на наличие инфекционных вирусных частиц в материале, использованном для заражения эмбрионов кур.

Таким образом, экспериментальное заражение телят чёрно-пёстрой породы вирусом болезни Ибараки (штамм БиБакО вызывает скрытое (бессимптомное) течение болезни, о чём свидетельствует выделение вируса на эмбрионах кур и выявление специфичного фрагмента генома с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при отсутствии клинических признаков болезни.

2.3.6 Экспериментальное заражение пятнистого оленя вирусом эпизоотической геморрагической болезни оленей (штамм New Jersey)

В связи с наличием эпизоотической геморрагической болезни оленей на евразийском континенте актуальным становится вопрос изучения восприимчивости к вирусу видов оленевых, обитающих на данной территории и, в частности, в Российской Федерации, так как существуют немногочисленные сведения о патогенности вируса для отечественной фауны.

Поэтому было проведено экспериментальное заражение самца пятнистого оленя (Cervus nippon) десятимесячного возраста вирусом эпизоотической геморрагической болезни оленей 1 серотипа, штамм New Jersey (титр инфекционной активности 6,0 Ig ТЦЦ50/СМ3) посредством инокуляции вируссодержащей суспензии симультанным методом внутривенно и подкожно (по 2 см3).

В ходе всего срока наблюдения у заражённого пятнистого оленя не отмечали каких-либо клинических признаков болезни. Температура тела не превышала значений физиологической нормы.

В результате полного патологоанатомического вскрытия заражённого животного наблюдали изменения тканей и органов, характерные для бессимптомной (скрытой) формы течения эпизоотической геморрагической болезни оленей: гиперемия слизистых оболочек носовой полости, верхней губы, тонкого кишечника; мелкоочаговые геморрагии в подкожной клетчатке и в заглоточных лимфатических узлах; гиперплазия заглоточных лимфоузлов; язвенные поражения копыт.

При исследовании проб крови от заражённого пятнистого оленя с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, разработанного A. Clavijo et al. [Clavijo, A., 2010], положительный результат получили для проб, отобранных на 6, 9, 12, 15, 23 сутки после инфицирования (отбор проб крови осуществляли с 3 по 28 сутки после заражения).

При исследовании сывороток крови от заражённого пятнистого оленя в реакции нейтрализации с гомологичным вирусом эпизоотической геморрагической болезни оленей 1 серотипа вирусспецифические антитела выявляли, начиная с 9 суток после инфицирования и до окончания срока эксперимента. Титр специфических антител находился в диапазоне 1:4-1:32.

Таким образом, при экспериментальном инфицировании пятнистого оленя вирусом эпизоотической геморрагической болезни оленей (штамм New Jersey) разви-

вается бессимптомная (скрытая) форма течения болезни, о чём свидетельствует наличие изменений в тканях и органах при отсутствии клинической картины, а также обнаружение специфичного фрагмента генома вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей в крови заражённого животного.

2.3.7 Секвенирование и филогенетический анализ геномов изолята При-морскин-91 н штаммов вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхоза-кадемии

С целью изучения нуклеотидного состава и определения степени филогенетического родства использовали 3 штамма вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (New Jersey, Alberta, А496) и изолят Приморский-91, выделенный из крови пятнистого оленя в 1991 г. в Приморском крае Российской Федерации. Определение нуклео-тидных последовательностей проводили на участке 10 сегмента генома указанного вируса длиной 535 пар оснований при использовании праймеров, сконструированных I.E. Aradaib [Aradaib, I.E., 1998].

При сопоставлении полученных в результате секвенирования нуклеотидных последовательностей фрагмента гена S10 штаммов вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей (Alberta, New Jersey) была подтверждена их 100%-ная идентичность с последовательностями аналогичных штаммов, представленными в базе данных GenBank, что подтверждает их принадлежность к заявленным штаммам.

В результате сравнения нуклеотидной последовательности изолята Примор-ский-91 с последовательностями аналогичного участка генома штаммов вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, относящихся к разным серотипам, отмечали наибольший уровень гомологии со 2 серотипом (99,8 %). Это согласуется с данными реакции нейтрализации, позволившими отнести указанный изолят ко 2 се-ротипу вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей [Чичикин, А.Ю., 2004].

Филогенетическое родство изолята Приморский-91 и штаммов, относящихся ко 2 серотипу вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, чётко прослеживается и на построенной дендрограмме (рисунок 3), где они входят в один кластер.

EHOV6,st.M44/96 BHDV6 (Reunion Island) EHDV7,st.lSR2006 - EHDV6,st.318

EHDV1,st. New Jersey г BHDV2,is.Primorski -91 EHDV2,st.Alberta ^¡EHDV2,st.A496

- EHW7,stCSIR0775

- BHDV8,st.CPR3961 A

- EHCV3,is. Nigeria-ODOOOl

— EHDV4,st.bAr33853

€

3HCV5,st.CSIR0157

EHCVe.st.CS IR0753

I-

0.05

H

Рисунок 3 - Дендрограмма, построенная на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 810 штаммов вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, относящихся к разным серотипам, и изолята Приморский-91

Дальнейшее изучение нуклеотидного состава изолята Приморский-91, в частности 2 сегмента генома, несущего детерминанту серотипоспецифичности, позволит сделать окончательный вывод о его серотиповой принадлежности.

2.3.8 Секвенирование и филогенетический анализ геномов штаммов вируса болезни Нбараки, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии

С целью определения нуклеотидных последовательностей 10 сегмента генома штаммов вируса болезни Ибараки, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, были рассчитаны праймеры 8 ЮР и Б1011, фланкирующие фрагмент гена Б10 длиной 802 пар оснований.

В результате сравнения нуклеотидного состава указанного участка генома и анализа построенной дендрограммы установили, что штаммы вируса болезни Ибараки, депонированные в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, филогенетически наиболее близки вирусу эпизоотической геморрагической болезни оленей 2 серотипа австралийского происхождения (штамм 439) (рисунок 4).

Susaki Imaizumi Ibaraki . - B0501

■ Vaccina 881 ibaraki \accinnyi - EHDV-2 Australia

-EHDV-2 Canada

100

H

0.02

Рисунок 4 - Дендрограмма, построенная на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена S10 штаммов вируса болезни Ибараки, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и штаммов вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей 2 серотипа, взятых из базы данных GenBank

Примечание: при построении дендрограммы использовали нуклеотидные последовательности штаммов вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей 2 серотипа, выложенные в базе данных GenBank под номерами АМ744996 (EHDV-2, Australia) и АМ745006 (EHDV-2, Canada).

Также в построенном древе отмечали разделение вирулентных и вакцинных штаммов на два отдельных кластера. Согласно данным литературы вакцинный штамм вируса болезни Ибараки был получен в результате пассирования штамма Ibaraki-2 в культуре клеток эмбрионов кур. Соответственно, можно предположить, что вакцинные штаммы, депонированные в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и штамм Ibaraki-2 вируса болезни Ибараки должны быть близкородственными в пределах вида.

3 ВЫВОДЫ

1. Разработана специфичная тест-система для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, позволяющая идентифицировать геном указанного вируса и обладающая аналитической чувствительностью 1,5 lg ТЦД50/см3.

2. Разработана специфичная тест-система для выявления рибонуклеиновых

кислот вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе мультиплексного варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, позволяющая дифференцировать друг от друга геномы указанных вирусов с аналитической чувствительностью 2,0 lg ТЦЦ50/см3 для вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей и 3,0 lg ТЦД50/см3 для вируса болезни Ибараки.

3. Экспериментальное заражение телят отечественной чёрно-пёстрой породы вирусом болезни Ибараки (штамм Susaki) вызывает бессимптомное течение болезни, о чём свидетельствует выделение вируса на эмбрионах кур и выявление специфичного фрагмента генома с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при отсутствии клинических признаков.

4. При экспериментальном заражении пятнистого оленя вирусом эпизоотической геморрагической болезни оленей (штамм New Jersey) наблюдали скрытую (бессимптомную) форму течения болезни, о чём свидетельствует наличие патомор-фологических изменений в тканях и органах, а также обнаружение специфичного фрагмента генома в пробах крови, отобранных на разные сутки после инфицирования, при отсутствии клинической картины.

5. Данные нуклеотидного секвенирования фрагмента гена S10 изолята Приморский-91 вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, выделенного на территории Российской Федерации в 1991 г., и проведённого на его основе филогенетического анализа соответствуют результатам реакции нейтрализации, позволившим отнести указанный изолят ко 2 серотипу вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей.

6. На основании данных нуклеотидного секвенирования участка гена S10 шести штаммов вируса болезни Ибараки ((Susaki (инв. № 1791а), Imaizumi (инв. № 17916), Ibaraki (инв. № 261), В0501 (инв. № 1711), Ибараки вакцинный (инв. № 602) и Вакцина (инв. № 415)), депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и филогенетического анализа установлена гомология геномов данных штаммов с геномом вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей 2 серотипа австралийского происхождения.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Специфичные оригинальные олигонуклеотидные праймеры и зонды предлагаются для использования в целях идентификации рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки и дифференциации геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей, а также для изучения генетической изменчивости последовательности 10 сегмента генома штаммов и изолятов вируса болезни Ибараки.

Разработанная методика выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени реко-

мендуется для обнаружения генома данного вируса с аналитической чувствительностью 1,5 Ig ТЦД50/см3.

Разработанная методика выявления геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе мультиплексной полимераз-ной цепной реакции в режиме реального времени рекомендуется для дифференциации указанных вирусов с аналитической чувствительностью 2,0 lg ТЦД5о/см3 для вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей и 3,0 lg ТЦЦ50/см3 для вируса болезни Ибараки.

В качестве руководства по применению разработанных тест-систем предлагаются «Методические положения по выявлению рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» и «Методические положения по выявлению геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утверждённые академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 30.11.2011 г. и 15.08.2013 г., соответственно.

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Обзор мировой ситуации по вирусу ЭГБО и оценка эпизоотического риска на территории Российской Федерации / К.А. Снетков, A.B. Книзе, А.Ю. Чичикин, Е.В. Аронова, A.B. Луницин // Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации: материалы Международной научно-практической конференции / ВНИИВВиМ. - Покров, 2011. - С. 57-65.

2. Обнаружение генома вируса болезни Ибараки в крови экспериментально заражённых телят методом ПЦР в режиме реального времени / Е.В. Аронова, И.М. Калабеков, А.Ю. Чичикин, A.B. Луницин // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине: материалы второй Международной научно-практической конференции. - Санкт-Петербург, 2011. - Т. 3. - С. 7-11.

3. Конструирование положительного контроля к тест-системе для выявления РНК вируса болезни Ибараки методом ПЦР в режиме реального времени / Е.В. Аронова, Г.С. Бурмакина, A.B. Луницин // Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине: материалы II конференции молодых учёных, ВНИИВВиМ. - Покров, 2012. - С. 98-103.

4. Экспериментальное воспроизведение болезни Ибараки / Е.В. Аронова, А.Ю. Чичикин, Н.В. Малоголовкина, В.Н. Пономарёв, С.Ж. Цыбанов, A.B. Луницин // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. - 2012. - № 4. -С. 34-36.

5. Разработка тест-системы на основе ПЦР-РВ для идентификации генома вируса болезни Ибараки / Е.В. Аронова, И.М. Калабеков, Г.С. Бурмакина, С.Ж. Цыбанов, A.B. Луницин // Биотехнология. -2012. -№ 6. - С. 70-75.

6. Экспериментальное воспроизведение эпизоотической геморрагической болезни оленей у пятнистого оленя / Е.В. Аронова, А.Ю. Чичикин, Н.В. Малоголовкина, С.Ж. Цыбанов, A.B. Луницин, Д.В. Колбасов, В.В. Пронин, Г.В. Корнева // Ветеринария. - 2013. - № 5. - С. 34-36.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области. Тираж 80 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аронова, Елена Владимировна, Покров

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИРУСОВ БОЛЕЗНИ ИБАРАКИ И ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ОЛЕНЕЙ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОМОВ

04201362387

АРОНОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

03.02.02 - Вирусология

диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Луницин Андрей Владимирович

ПОКРОВ-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ..................................................................6

1. ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................8

1.1 Актуальность......................................................................................................................................8

1.2. Степень разработанности проблемы..........................................................................10

1.3 Цели и задачи исследования................................................................................................11

1.4 Научная новизна работы........................................................................................................11

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы....................................12

1.6 Публикация результатов исследований..................................................................13

1.7 Степень достоверности и апробация работы......................................................13

1.8 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите........................................................................14

1.9 Структура и объём диссертационной работы..................................................15

1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту..................15

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы......................................................16

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................17

2.1 Краткая характеристика вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки................................................................17

2.1.1 Краткая характеристика вируса эпизоотической геморрагической 17 болезни оленей................................................................

2.1.2 Краткая характеристика вируса болезни Ибараки......................................25

2.2 Источники и пути передачи орбивирусных инфекций..............................26

2.3 Эпизоотическая ситуация по эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки в мире..........................................................28

2.3.1 Эпизоотическая ситуация по эпизоотической геморрагической болезни оленей в мире..............................................................................................................28

2.3.2 Эпизоотическая ситуация по болезни Ибараки в мире............................36

2.4 Строение вирионов вирусов эпизоотической геморрагической бо-

лезни оленей................................................................... 38

2.4.1 Морфология и химический состав вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки.................. 38

2.4.2 Строение геномов вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки.......................................... 41

2.5 Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения геномов вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки...................................................... 43

2.6 Изучение нуклеотидного состава и филогенетический анализ геномов штаммов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей........................................... 48

2.7 Заключение по обзору литературы....................................... 53

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................... 54

3.1 Материалы..................................................................... 54

3.1.1 Вирусы.......................................................................... 54

3.1.2 Животные....................................................................... 56

3.1.3 Культуры клеток.............................................................. 56

3.1.4 Кровь и сыворотки........................................................... 57

3.1.5 Плазмида и бактериальные штаммы..................................... 57

3.1.6 Реактивы........................................................................ 57

3.1.7 Лабораторное оборудование.............................................. 58

3.2 Методы......................................................................... 59

3.2.1 Выделение рибонуклеиновой кислоты.................................... 59

3.2.2 Постановка реакции обратной транскрипции......................... 61

3.2.3 Постановка полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени........................... 62

3.2.4 Постановка классического варианта полимеразной цепной реакции................................................................................ 63

3.2.5 Проведение электрофореза................................................... 64

3.2.6 Нуклеотидное секвенирование............................................. 64

3.2.7 Филогенетический анализ................................................... 65

3.2.8 Клонирование продуктов полимеразной цепной реакции............ 65

3.2.9 Искусственное заражение животных..................................... 67

3.2.10 Заражение эмбрионов кур.................................................. 67

3.2.11 Исследование проб сывороток крови от заражённого пятнистого оленя в реакции нейтрализации........................................... 68

3.2.12 Программное обеспечение и интернет-ресурсы....................... 68

3.2.13 Критерии оценки разработанных тест-систем........................... 68

3.2.14 Статистическая обработка результатов исследований............... 70

3.3 Результаты собственных исследований.................................. 71

3.3.1 Разработка тест-системы для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени......................................... 71

3.3.2 Конструирование рекомбинантного контроля амплификации к тест-системе для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени....................................................... 75

3.3.3 Разработка тест-системы для выявления геномов вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки на основе мультиплексного варианта полимеразной цепной реакции

в режиме реального времени............................................... 77

3.3.4 Конструирование рекомбинантного контроля амплификации комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты вируса эпи-

зоотической геморрагической болезни оленей к тест-системе для выявления геномов вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки на основе мультиплексного ва-

рианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.................................................................................. 81

3.3.5 Экспериментальное заражение телят отечественной чёрно-пёстрой породы вирусом болезни Ибараки (штамм Susaki)....... 83

3.3.6 Экспериментальное заражение пятнистого оленя вирусом эпизоотической геморрагической болезни оленей (штамм New Jersey)... 89

3.3.7 Секвенирование и филогенетический анализ геномов изолята Приморский-91 и штаммов вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии....................... 95

3.3.8 Секвенирование и филогенетический анализ геномов штаммов вируса болезни Ибараки, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.................... 99

4 ОБСУЖДЕНИЕ............................................................... 104

5 ВЫВОДЫ....................................................................... 111

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.................................... 113

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................... 114

8 ПРИЛОЖЕНИЕ............................................................... 136

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ЭГБО - эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей ВЭГБО - вирус эпизоотической геморрагической болезни оленей БИ - болезнь Ибараки ВБИ - вирус болезни Ибараки ВБ - вирус блютанга

BA4JI - вирус африканской чумы лошадей ^ КРС - крупный рогатый скот КЭ - эмбрионы кур

СПФ-КЭ - эмбрионы кур, свободных от патогенной микрофлоры

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

РФ - Российская Федерация

США - Соединённые Штаты Америки

ВНИИВВиМ - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Ветеринарной Вирусологии и Микробиологии

ГНУ - государственное научное учреждение

NAQS - Северо-Австралийская карантинная стратегия (Northern Australian Quarantine Strategy)

NAMP - Национальная программа по мониторингу арбовирусов (National Arbovirus Monitoring Programm)

MKTB - Международный комитет по таксономии вирусов

МЭБ - Международное эпизоотическое бюро

IPCC - Межгосударственный комитет по изменению климата

НК - нуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

к-ДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

ОРС - открытая рамка считывания

п.о. - пар оснований

ЫТЯ-область - нетранслируемая область РН - реакция нейтрализации МФА - метод флуоресцирующих антител РСК - реакция связывания комплемента ИФА - иммуноферментный анализ ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени С( - пороговый цикл

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ВНК-21/13 - перевиваемая культура клеток почки новорожденного сирийского хомячка

Ь-клетки — перевиваемая линия клеток подкожной клетчатки мыши ПС - перевиваемая линия клеток почки сайги ПСГК - перевиваемые клетки почки сибирского горного козерога ПЭАК - перевиваемая линия клеток почки эмбриона африканской козы СУ-1 — перевиваемая линия клеток почки африканской зелёной мартышки (Сегсорикесш аеМорэ)

ПТ - перевиваемая линия клеток почки телёнка ГуГОВК - перевиваемая линия клеток почки телёнка ГТЦ - гуанидин тиоцианат

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность

Наблюдаемая в последние десятилетия тенденция к расширению ареала трансмиссивных инфекций делает актуальным вопрос разработки методов диагностики возбудителей данных болезней. Сложившаяся ситуация усугубляется мировым изменением климатических условий, способствующим распространению векторов-переносчиков на новые территории и увеличению численности насекомых. Следствием этого может быть проникновение патогенов в умеренные климатические пояса обоих полушарий и рост количества вспышек в эндемических очагах [Githeko, А.К., 2000; Gould, Е.А., 2009].

В число трансмиссивных болезней входят и такие неконтагиозные вирусные болезни парнокопытных жвачных, как эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей (ЭГБО) и болезнь Ибараки (БИ). Возбудители данных инфекций - вирус эпизоотической геморрагической болезни оленей (ВЭГБО) и вирус болезни Ибараки (ВБИ), соответственно, - относятся к роду Orbivirus семейства Reoviridae и имеют сегментированные геномы, представленные двухцепочечной рибонуклеиновой кислотой (РНК) [Сюрин, В.Н., 1998а; Сю-рин, В.Н., 19986].

Спектр животных, восприимчивых к вирусу эпизоотической геморрагической болезни оленей, достаточно широк, но на евразийском континенте вспышки данной болезни регистрировали только у крупного рогатого скота (КРС), также являющегося хозяином и для вируса болезни Ибараки [Temizel, Е.М., 2009; Yadin, Н., 2008; Omori, Т., 1970]. Причём, заражение КРС вирусами эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки вызывает развитие сходных симптомов. Это затрудняет постановку диагноза на основании общей картины течения болезни и приводит к необходимости разработки эффективных методов лабораторной диагностики возбудителей перечисленных инфекций. Аналогичными признаками при ЭГБО и БИ являются анорексия, наличие язв на морде и в ротовой полости, избыточное слюноотде-

ление, хромота, дисфагия, гиперемия, отёк конъюнктивы, нарушение репродуктивной функции Гhttp://www.cfsph. iastate.edu; Теггпге!, Е.М., 2009; Отоп, Т., 1969; ОЬаэЫ, Б., 1999].

До конца XX в. эпизоотическую геморрагическую болезнь оленей на территории нашей страны не регистрировали. Однако в 1991 г. вирус эпизоотической геморрагической болезни оленей был выделен в Приморском крае из крови пятнистого оленя [Чичикин, А.Ю., 2004]. Несмотря на отсутствие болезни Ибараки в Российской Федерации (РФ) распространённость возбудителя названной инфекции в пограничных государствах (Северная Корея, Япония) создаёт угрозу заноса вируса на территорию нашей страны.

Риск возникновения эпизоотий данных болезней в РФ возрастает и в связи с активным импортом восприимчивого к вирусам ЭГБО и БИ крупного рогатого скота, проводимым в рамках Государственной программы развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013 - 2020 гг. [тсх.ш>ёосише^8/й1е с1оситеп1/8110ш/19570.77.htm]. Так, только до 2016 г. программой предусмотрен импорт племенного скота в объёме 72 тыс. голов.

Распространение ЭГБО и БИ на новые территории может привести к серьёзным экономическим последствиям в сфере животноводства. Так, страны, неблагополучные по указанным инфекциям, несут материальные потери, складывающиеся из прямых убытков от гибели животных и косвенных затрат. Последние связаны с ограничением на международную торговлю и спортивную охоту, низким приростом стада; снижением упитанности оленей и качества кожевенно-мехового и пантового сырья; снижением удоя и ухудшением качества молочной продукции, а также потерей веса у крупного рогатого скота. Только в штате Небраска (США) за лето - осень 2012 г. от эпизоотической геморрагической болезни оленей погибло около 6000 белохвостых оленей [http://www.promedmail .org/direct■php?id==20121220.1461864]. В результате эпизоотии болезни Ибараки, зарегистрированной в 1959 г. в Японии, было инфи-

цировано более 30 тыс. голов крупного рогатого скота; причём летальный исход наблюдался у 4000 животных [Reed, С., 2009].

Таким образом, перекрывающийся спектр восприимчивых животных, сходные клинические признаки протекания болезней у крупного рогатого скота, возможность заноса вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей в Российскую Федерацию из приграничных стран, а также в результате торгово-экономического сотрудничества со странами, неблагополучными по данным инфекциям, создают необходимость разработки методов идентификации и дифференциации указанных вирусов.

1.2 Степень разработанности проблемы

В Российской Федерации и за рубежом разработаны различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющие идентифицировать рибонуклеиновую кислоту вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, а также дифференцировать серотипы данного вируса [Снетков, К.А., 2003; Aradaib, I.E., 1994а; Harding, M.J., 1996; Aradaib, I.E., 1998; Aradaib, I.E., 2003; Wilson, W.C., 2009; Wilson, W.C., 2009a; Clavijo A., 2010; Maan, N.S., 2010]. Для обнаружения генома вируса болезни Ибараки используют классическую ПЦР (стандартную или гнездовую, с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза или с проведением последующего анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) [Ohashi, S., 1999; Shin, Y.-K., 2009].

Отсутствие в доступной литературе информации о разработке тест-систем на основе ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для дифференциации вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки, а также полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, позволяющей выявлять РНК вируса болезни Ибараки, свидетельствует о необходимости и своевременности проведения исследований по их разработке.

1.3 Цели и задачи исследования

В связи с вышеизложенным, основной целью исследований являлась дифференциация возбудителей эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки на основе анализа геномов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать тест-систему для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, определить её специфичность и чувствительность.

2. Разработать тест-систему для выявления геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагической болезни оленей на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, определить её специфичность и чувствительность.

3. Провести экспериментальное заражение животных, восприимчивых к вирусам эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки, с целью получения клинического материала, а также изучения характера течения инфекционного процесса у представителей отечественной фауны.

4. Определить нуклеотидные последовательности различных участков гена 810 трёх штаммов и одного изолята вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, а также шести штаммов вируса болезни Ибараки, имеющихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

5. Провести филогенетический анализ трёх штаммов и одного изолята вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей, а также шести штаммов вируса болезни Ибараки, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, с целью определения степени филогенетического родства.

1.4 Научная новизна работы

Впервые разработана тест-система для выявления рибонуклеиновой кислоты вируса болезни Ибараки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, позволяющая идентифицировать геном указанного возбудителя и обладающая аналитической чувствительностью 1,5 ^ ТЦЦ50/см3.

Впервые разработана тест-система для выявления геномов вирусов болезни Ибараки и эпизоотической геморрагическо�