Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация возбудителей блютанга и эпизоотической геморрагической болезни оленей с помощью полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Снетков, Константин Анатольевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Эпизоотическая ситуация по блютангу и ЭГБО.

2.2. Патогенез и клинические проявления болезни.

2.3. Строение вириона.

2.3.1. Морфология вирусов блютанга и ЭГБО.

2.3.2. Структурная организация генома орбивирусов.

2.3.3. Полипептидный состав вирусов.

2.3.4. Антигенные свойства вирусов блютанга и ЭГБО.

2.4. Филогенетический анализ генома орбивирусов.

2.4.1. Филогенетическое родство серотипов вируса блютанга.

2.4.2. Филогенетические связи между вирусами блютанга, ЭГБО и родственными орбивирусами.

2.5. Диагностика блютанга и ЭГБО.

2.5.1. Диагностика серологическими методами.

2.5.2. Идентификация возбудителя на основе анализа генома

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация возбудителей блютанга и эпизоотической геморрагической болезни оленей с помощью полимеразной цепной реакции"

Блютанг (катаральная лихорадка овец) и эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей (ЭГБО) - острые трансмиссивные вирусные инфекции, характеризующиеся лихорадкой, воспалительно-некротическими процессами слизистой рта, языка, пищеварительного тракта, эпителия венчика и основы копыт, а также дегенеративными изменениями в скелетной мускулатуре, вызываемые вирусоми из рода Orbivirus, семейства Reoviridae. Возбудители блютанга и ЭГБО в основном распространены на территории Африканского континента, Австралии, странах Северной и Латинской Америки, Ближнего Востока и некоторых странах Европы. В связи с тем, что в последние годы значительно увеличился импорт в Россию сельскохозяйственной продукции, животных и продуктов их переработки , повысился риск заноса на территорию нашей страны этих вирусов [2, 6, 7, 27, 28, 29,36, 72, 77, 139, 174].

В естественных условиях к вирусу блютанга наиболее восприимчив молодняк овец, а к вирусу ЭГБО - белохвостые олени и антилопы, которые также являются восприимчивыми к блютангу. Кроме того, из представителей дикой фауны восприимчивыми к вирусам блютанга и ЭГБО являются лоси, снежные и болыперогие бараны. У крупного рогатого скота и коз обе болезни протекают субклинически, вызывая сходные симптомы. Основными переносчиками вирусов блютанга являются мокрецы Culicoides des brevitaris. Некоторые сходные симптомы, у восприимчивых животных, вызывает заражение близкородственными вирусами - болезни Ибараки и африканской чумы лошадей (АЧЛ) [26, 27, 28, 77, 99, 115, 132, 133, 144, 153, 165, 181].

Взаимосвязь динамики изменения численности популяций мокрецов -переносчиков возбудителя и распространения этих вирусов является сложным, многофакторным процессом, и поэтому трудно прогнозировать во временном и региональном масштабах вспышки болезни.

На территории бывшего СССР очаги блютанга регистрировались в 1981 году в Нахичеваньской АССР. В 1993 году произошла вспышка этой 7 инфекции в местности Тапхар Иволгинского р-на Бурятии. В 1991 году впервые в нашей стране на территории Октябрьского р-на Приморского края сотрудниками ВНИИВВиМ от оленей был выделен вирус ЭГБО. Наша страна граничит с государствами, многие из которых являются неблагополучными по блютангу и ЭГБО. В 1999 году было зарегестрировано 17 очагов возникновения заболевания на территории Болгарии и Турции. Наибольшая вероятность заноса в РФ возбудителей этих заболеваний исходит из Турции, Пакистана, Северной Америки, Монголии и Китая [2, 6, 7, 8, 17, 146].

В настоящее время для лабораторной диагностики блютанга и ЭГБО используются: реакция нейтрализации, реакции гемагглютинации, задержки гемагглютинации, диффузионной преципитации, связывания комплемента, метод флюоресцирующих антител и твердофазный иммуноферментный анализ. Каждый из этих методов имеет определенные достоинства и недостатки в плане чувствительности, воспроизводимости и экспрессности [3,4, 12, 13,20, 24, 44, 49, 110, 111, 112, 132, 149, 150, 161].

Определенные трудности при идентификации возбудителей представляет существование 24 серотипов вируса блютанга и 9 серотипов ЭГБО, а также наличие тесного антигенного родства между этими вирусами, которые ограничивают возможности серологических методов при постановке диагноза.

Применение существующих тестов лабораторной диагностики, в которых используются поликлональные антитела, не всегда позволяет проводить дифференциацию штаммов вирусов блютанга и ЭГБО.

В последние годы для изучения свойств орбивирусов животных применяются методы с использованием моноклональных антител [100]. Во ВНИИВВиМ А.А. Стрижаковым, М.Б. Новиковой и соавторами (1994) были получены моноклональные антитела к группо- типоспецифическим эпитопам структурных белков (VP2, VP5, VP9) вируса блютанга и разработаны "Наборы препаратов ." для постановки различных вариантов твердофазного 8

ИФА [19, 20, 22, 24, 25, 26]. С целью дифференциации вируса ЭГБО А.В. Лунициным (1994) был разработан "Набор препаратов." на основе моноклональных антител [10, 11, 13].

Анализ данных литературы показывает, что, несмотря на ряд преимуществ традиционных методов диагностики блютанга и ЭГБО, во многих лабораториях за рубежом все шире и шире для диагностики используются методы молекулярной гибридизации и полимеразная цепная реакция. Преимуществами этих методов являются их высокая чувствительность, специфичность, быстротам безопасность [5, 15, 16, 18, 30, 32, 33, 37, 45, 51, 138, 154]. Для сравнительной характеристики геномов вирусов различных серотипов в настоящее время также находит применение рестрикционный анализ ПЦР продуктов [5, 15, 16, 21, 37].

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции, дополняя серологические методы, открывает новые возможности при разработке тест-систем для идентификации и дифференциации вирусов блютанга и ЭГБО. Одним из перспективных направлений исследований является использование ПЦР с последующим рестрикционным анализом и секвенированием продукта ПЦР.

В связи с вышеизложенным, вопрос о разработке новых высокочувствительных и специфичных методов идентификации патогенных орбивирусов животных остается актуальным.

Цель и задачи исследований.

Целью данной работы являлась разработка «Наборов препаратов.» на основе полимеразной цепной реакции для идентификации возбудителей блютанга и эпизоотической геморрагической болезни оленей.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей структурных генов различных серотипов вирусов блютанга и ЭГБО подобрать специфические праймеры для идентификации генома 9 возбудителей.

2. Разработать «Наборы препаратов.» для идентификации различных серотипов вирусов блютанга и эпизоотической геморрагической болезни оленей и оценить их специфичность

3. Провести дифференциацию различных серотипов вируса блютанга на основе праймеров, комплементарных вариабельному участку генома, а также с помощью рестрикционного анализа ПЦР продуктов.

Научная новизна работы.

- Подобраны специфические праймеры и отработаны условия постановки ПЦР, позволяющей выявлять РНК вирусов блютанга и ЭГБО в пробах патологического материала и инфицированных клеток.

Методом рестрикционного анализа продуктов ПЦР, комплементарных участку гена Мб, выявлены отличия в последовательностях нуклеотидов вируса блютанга 2, 4, 9, 12, 13, 16 и 17-го серотипов.

- Доказана гомология последовательностей нуклеотидов штамма «Тапхар» 16 серотипа, выделенного на территории Республики Бурятия, с австралийскими штаммами того же серотипа. Показана возможность дифференциации вируса блютанга 9 и 16-го серотипов при помощи ПЦР с праймерами, комплементарными вариабельному участку гена L2.

Практическая значимость.

Разработанные «Набор препаратов для выявления РНК вируса блютанга методом ПЦР» и «Набор препаратов для выявления РНК вируса ЭГБО методом ПЦР» позволяют обнаруживать РНК этих вирусов в культуре инфицированных клеток, пробах головного мозга зараженных мышей и крови овец.

Результаты комиссионных испытаний этих наборов и методические рекомендации по их применению одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИВВиМ (протокол № 13 от 6 декабря 2002 г.). «Наборы

10 препаратов.» рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни.

Рекомендуемый рестрикционный анализ ПЦР продукта, комплементарного гену Мб позволяет дифференцировать вирусы блютанга 2, 4, 9, 12, 13, 16 и 17-го серотипов.

На защиту выносятся следующие положения:

- Разработка наборов препаратов на основе полимеразной цепной реакции для выявления РНК вирусов блютанга и ЭГБО с использованием праймеров, комплементарных различным областям их геномов;

- Использование ПЦР для идентификации различных серотипов вирусов блютанга и ЭГБО, выделенных из патологических материалов;

Применение методов ПЦР и рестрикционного анализа для дифференциации различных серотипов вируса блютанга.

Апробация результатов исследований.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 2000-2002 г.г. во ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями (темы: 01.01.02,01.03.02.).

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ (2000, 2001, 2002 гг.); международной научно-практической конференции «Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных, и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей» ВНИИВВиМ (2002 г.), международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИТИБП (Щелково, 2001 г.); материалах международной конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» - НИЦ новейших медицинских и специальных технологий и систем РАМН (АНО «НИЦ») (Москва, 2002 г.).

11

Публикации по работе.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ в материалах научно-практических конференций: ВНИИВВиМ (Покров, 2001, 2002 г.г.), ВНИТИБП (Щелково, 2001 г.); ВНИВИПФиТ (Воронеж); НИЦ новейших медицинских и специальных технологий и систем РАМН (АНО «НИЦ») (Москва, 2002 г.).

В выполнении отдельных разделов работы оказали помощь старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Кривонос Г.И., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Власова Н.Н., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Новикова М.Б., зав. лабораторией «Эпизоотологии», доктор биологических наук Стрижаков А.А., научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук Чичикин А.Ю., ведущий научный сотрудник, доктор биологических наук Балышева В.И., аспирант Недосекова В.В., которым автор выражает искреннюю признательность.

12

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Снетков, Константин Анатольевич

6. ВЫВОДЫ

1. Подобранные наружные и внутренние праймеры, комплементарные нуклеотидной последовательности гена Мб, специфически гибридизируются с РНК 2, 4, 9, 12, 13, 14, 16 и 17-го серотипов вируса блютанга.

2. Праймеры комплементарные нуклеотидной последовательности гена L3 вируса ЭГБО, специфически гибридизируются с фрагментами генома 1 и 2-го серотипов и не взаимодействуют с РНК других орбивирусов.

3. Установлено, что серотипо-специфические праймеры комплементарные вариабельному участку гена L2 австралийского штамма вируса блютанга 16 серотипа взаимодействуют с нуклеотидными последовательностями штамма «Тапхар» того же серотипа, выделенного на территории Бурятии. Подтверждена возможность дифференциации вируса блютанга 9 и 16 серотипов.

4. Рестрикционный анализ ПЦР продукта участка гена Мб эндонуклеазами рестрикции, ВатШ, Bbvl, Bell, Mspl, PvuII позволяет выявить различия между геномами вируса блютанга 2, 4, 9, 12, 13, 16 и 17 серотипов.

5. Разработанные наборы препаратов для выявления РНК вирусов блютанга и ЭГБО методом ПЦР, обладают пороговой чувствительностью 3 составляющей 10 ТЦД50/см вируса и могут быть рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни.

97

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. На основании результатов проведенных исследований для практического использования предлагаются:

- «Набор препаратов для выявления РНК вируса блютанга методом ПЦР»

- «Набор препаратов для выявления РНК вируса ЭГБО методом ПЦР»

2. Разработаны:

- «Методические указания по выявлению РНК вируса блютанга методом полимеразной цепной реакции».

- «Методические указания по выявлению РНК вируса ЭГБО методом полимеразной цепной реакции».

- Подготовлены проекты НТД (наставление по применению, ТУ, инструкция по изготовлению).

98

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Снетков, Константин Анатольевич, Покров

1. Бакулов И.А., Книзе А.В., Котляров В.М., Дмитренко И.В., Коломыцев

2. A.А., Семенихин А.Л. Система эпизоотологического мониторинга особо опасных экзотических, малоизученных, в том числе зооантропонозных болезней животных. // Москва. 2001.

3. Вишняков И.Ф., Стрижаков А.А., Новикова М.Б., Луницин А.В., Куринов

4. B.В., Карпов Г.М., Балышева В.И., Волокитина К.С. Идентификация и типирование вируса катаральной лихорадки овец. // Ветеринария 1995.-N. 4.- с. 20-25.

5. Горбунова В.Н. Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. Санкт-Петербург.: Изд-во Специальная литература.- 1997.

6. Левченко В.П., Угрюмов Г.А., Гончиков В.Г., Цыдыпов Б.Б., Пуев А.К., Штыбова М.Г., Петухов Д.А. Вспышка катаральной лихорадки овец в Бурятии. //Ветеринария.- 1995.- N. 4.- с. 7-8.

7. Луницин А.В. Разработка средств и методов лабораторной диагностики ЭГБО. // Диссертация кандидата биологических наук.: Покров.-ВНИИВВиМ.- 1994 г.

8. Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование // Москва.: Изд-во Мир.- 1984.- с. 97-120

9. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. С.Херрингтона и Дж. Макги. // Изд-во Мир.- 1999.100

10. Наумкина М.А. Разработка методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства. // Диссертация кандидата биологических наук.: Покров.- ВНИИВВиМ. -1999 г.

11. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. // М.: Изд-во Наука.- 1981.

12. Стрижаков А.А. Получение и использование моноклональных антител к вирусу KJTO. Диссертация кандидата биологических наук.: Покров.-ВНИИВВиМ.- 1994 г.

13. Сюрин В.Н., Фомина Н.Ф. Частная ветеринарная вирусология. М.: Изд-во Колос.- 1979.

14. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагногстика вирусных болезней животных. // Справочник, Москва.: ВО «Агропромиздат».-1991.- с. 254-270

15. Сюрин В.Н., Самуйленко А .Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. // М.: ВНИТИБП.- 1998.- 928 с.

16. Федоров Н.А., Суханов Ю.С., Асади Мобархан А.Х., Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). // Изд-во.: Москва.- 1996.- с 36.

17. Харитоненков И.Г. Тенденции развития методов диагностики в вирусологии. // Современные методы иммунохим. и молекулярно-биол. диагност, в мед. АМН СССР. - НИИ вакцин сывороток.- М.- 1992.- с. 12-20

18. Хаустов В.И. Казачков Ю.А., Королев М.Б., Шекоян Л.А. Исследование ротавирусов методами электронной микроскопии и электрофореза РНК в полиакриламидном геле. // Вопросы вирусологии. 1988.- с. 270-271.

19. Цыбанов Я.С. Разработка тест-системы для идентификации изолятов вируса арктического бешенства на основе методов анализа генома. // Диссертация кандидата биологических наук.: Покров.- ВНИИВВиМ.-2001 г.

20. Чичикин А.Ю. Изучение эпизоотологии эпизоотической геморрагической болезни оленей. // Диссертация кандидата биологических наук.: Покров.- ВНИИВВиМ.- 2002 г.102

21. Чичикин А.Ю., Луницин А.В., Книзе А.В. Эпизоотическая ситуация по ЭГБО. // Вопросы ветеринарной вирусологии. Покров.- 1992.

22. Шабарова З.А., Богданов А.А., Золотухин А.С. Химические основы генетической инженерии. // Издательство Московского университета 1994 г.

23. Abu Elzein Е.М.Е. Bluetongue in the Sudan. // Rev. Sci. et tech. Off. Internac. Des. Epizoot.- 1985.- v. 4.- N 4.- p. 795-801

24. Akita G.Y., Chinsangaram J., Osburn B.I., Ianconescu M., Kaufman R. Detection of bluetongue virus serogroup by polymerase chain reaction. // Journal-of-Veterinary-Diagnostic-Investigation.- 1992.- v.4.- N.4.- p. 400-405

25. Akita G.Y., Glenn J., Castro A.E., Osburn B.I. Detection of bluetongue virus in clinical samples by polymerase chain reaction. // Journal-of-Veterinary-Diagnostic-Investigation.- 1993.- v.5.- N.2, p. 154-158

26. Alexander G.I., Gpgard G. Bluetongue research in Australia —1^93. // Australian Veterinary Journal.- 1994.- Vol. 71.- N. 6.- p. 182-183

27. Anderson C.L. Use monoclonal antibodies in bloking ELISA to detect group specific antibodies to bluetongue virus antigenic determinants. // Virology.-1983.- v. 124, N2.-p. 286-299103 I

28. Aradaib I.E., McBride J.W., Wilson W.C., Osburn B.I. Development of polymerase chain reaction for specific identification of epizootic hemorrhagic disease virus serotype 1. // Arch. Virol.- 1995.- v. 140.- p. 2273-2281

29. Bandyopadhyay S.K., Kataria R.S., Tiwari A.K. Detection of bluetongue virus genome segment 6 sequences by RT-PCR. // Indian J. Exp. Biol.- 1998.- v. 36.-N.10.-p. 1034-1037

30. Barber T.L., Jochim M.M. Serotyping bluetongue and and epizootic haemorrhagic diseases virus strain. // Proc: Amer. Assoc. Vet. Lab. Diagn.-1975.-p. 149-162

31. Beaton A.R., Rodriguez J., Reddy Y.K., Roy P. The membrane trafficking protein calpactin forms a complex with bluetongue virus protein NS3 and mediates virus release. //Proc .Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 2002. Sep 16.

32. Belak S., Ballagipordany A. Application of the Polumerase Chain Reaction (PCR) in Veterinary Diagnosis Virology. // Veterinary Research Commynication, 1983.- Vol. 17.- Iss. 1.- p. 55-72 *

33. Bishop A.L., Barchia I.M., Spohr L.J. Models for the dispersal in Australia of the arbovirus vector, Culicoides brevitarsis Kieffer (Diptera: Ceratopogonidae) // Preventive Veterinary Medicine.- 2000.- v.47.- p. 243254

34. Borden E.C., Shope R.E., Murphy F.A. Physicochemical and morphological relationship os some arthropod-borne viruses to bluetongue virus a new taxonomic group: physicochemical and serological studies. // J. Gen. Virol.-1971.-v. 13.-p. 261-271104

35. Brewer A.and Osburn В. I. Sequential distribution of neurovirulent and avirulent strains of bluetongue virus in neonatal mice by RT-PCR. // Archives of Virology.- 1998.-Vol. 143.-N 1.-p. 145-155

36. Campbell C.H. Bluetongue: diagnostic / antigenic interpretation. // In. Barber T.L. Jochim M.M. eds. "Bluetongue and related orbiviruses". New York: Alan R. Liss. Inc.- 1985.- p. 435-4431

37. Campbell C.H. Barber T.L. Jochim M.M. Antigenic and morphologic of Ibaraki, bluetongue and epizootic haemorrhagic diseases viruses. // Vet. Microbiol.- 1978.- v. 3.- p. 15-22

38. Campbell C.H., Marvin J. Grubman. Current Knowledge on the Biochemistry and Immunology of Bluetongue. // Prog. Vet. Microbiol. Immun.- 1985 vol. 1.- p. 58-79.

39. Ghiasi H., Purdy M.A., Roy, P. The complete sequence of bluetongue vims serotype 10 segment 3 and its predicted VP3 polypeptide compared with those of BTV serotype 17. // Virus Res.- 1985.- v. 3.- p. 181-190.

40. Clavijo A., Heckert R.A., Dulac G.C., Afshar A. Isolation and identification of bluetongue virus. // Journal of virological Methods.- 2000.- Vol. 87.- p. 1323.105

41. Clavijo A., Sepulveda L., Riva J., Pessoa-Silva M., Tailor-Ruthes A., Lopez J. W. Isolation of bluetongue vims serotype 12 from an outbreak of the disease in South America. // Vet Rec.- 2002.- v. 151.- N.10.- p. 301-302.

42. Crameri G.S., Wang L.F., Eaton B.T., Wang-Lin Fa. Differentiation of cognate dsRNA genome segments of bluetongue virus reassortants by temperature gradient gel electrophoresis. // Journal-of-Virological-Methods. 1995,51:2-3,211-220.

43. Cowley J.A. Nucleotide sequence of the genome segment encoding nonstructural protein NS1 of bluetongue virus serotype 20 from Australia. // Virus-Genes.- 1992.- v.6.- N.4.- p. 387-392

44. Dangler C.A., de Mattos C.A., de Mattos C.C., Osburn B.I. Identifyin bluetongue virus by the polymerase chain reaction. // Journal of Virological Methods.- 1990.- v. 28.- N. 3.- p. 281-292.

45. Diprose J.M., Grimes J. M., Sutton, G. C., Burroughs, J. N., Meyer, A., Maan, S. The core of bluetongue virus binds double-stranded RNA. // J. Virol.-2002.- v. 76.- N.18.- p. 9533-9536.

46. Eaton B.T., Hyatt A.D., Brookes S.M. The replication of Bluetongue Virus. // Current Topics in Microbiology and Immunology.- 1990 v. 162.- p. 8<|L117.

47. Fenner F., Bachmann P.A., Gibbs P.J., Murphy F.A., Studdert M.J., White D.O. Veterinary Virology. // Academic Press, Inc.- 1987.- p. 577-593.

48. Fukusho A., Ritter G.D., Roy P. Variation in the bluetongue virus neutralization protein VP2. // J. Gen. Virol.- 1987.- v. 68.- p. 2967-2973

49. Goldsmit L., Barzilai E. An improved method for the isolation and identification of bluetongue virus by intravascular inoculation of embrionating chiken eggs. //J. Сотр. Pathol.- 1968.- v. 78.- p.477-487

50. Goldsmit L., Barzilai E. Isolation and propagation of bluetongue virus in embryonating chicken eggs. // In: Barber T.L., Jochim M.M., Osburn B.I. (Eds.), Bluetongue and related orbiviruses. Alan Liss.- New York.- 1985.- p. 307-318106

51. Gonzalez H.A., Knudson D.Z. Intra- and Inter-Serogroup Genetic Relatedness of Orbiviruses. J. Gen. Virol.- 1988.- v. 69.- N.I.- p. 125-127.

52. Gorman B.M. The Bluetongue Viruses. // Current Topics in Microbiology and Immunology.- 1990.-v. 162.-p. 1-19.

53. Gorman B.M., Taylor J., Walker P.J., Davidson W.L., Brown F. Comparisons of bluetongue type 20 with certain viruses of the bluetongue and eubenangee serological groups of orbiviruses. // J. Gen. Virol.- 1981.- v. 57.- p. 251-261

54. Gouet P., Diprose J.M., Grimes J.M., Malby R., Burroughs J.N., Zientara S., Stuart D.I., and Mertens P.P.C. The Highly Ordered Double-Stranded RNA Genome of Bluetongue Virus Revealed by Crystallography. // Cell.- 1999.-Vol.97.- p.481-490

55. Gould, A.R., Hyatt A.D., Eaton B.T., White J.R., Hooper P.Т., Blacksell S.D., Smith P.M., Le-Blanc-Smith P.M. Current techniques in rapid bluetongue virus diagnosis. // Australian-Veterinary-Journal.- 1989,- v.66.- N.12, p. 450454.

56. Gould A.R. and Pritchard L.I. Relationships amongst bluetongue viruses revealed by comparison of capsid and outer coat protein nucleotide sequences. // Virus research.- 1990,- v. 17.- N. 1.- p. 31-52.

57. Gould A.R., Pritchard L.I., Tavaria M.D. Nucleotide and deduced amino acid sequences of the non-structural protein, NS1, of Australian and South African bluetongue virus serotype 1. // Virus Research.- 1988.- v. 11.- p. 97-107.

58. Grimes J.M., Burroughst J.N., Gouet P, Diprose J.P., Malby P., Zientara S., Mertens P.P.C., Stuart D.I. The atomic structure of the bluetongue virus core. //Nature.- 1998.- October.- Vol.395.- N.l. p.138-146

59. Grubman M.J. Expression of bluetongue virus serotype 17 NS1 protein fromm a cloned gene. // Virus Research.- 1990.- v. 18.- N.l.- p. 21-28

60. Grubman M.J., Appleton J. A., Letchworth III C.J. Identification of bluetongue virus type 17 genome segments coding for polypeptides associated with virus neutralization and intergroup reactivity. // Virology.- 1983.- v. 131.- p. 355-366

61. Haig D.A., McKercher P.G., Alexander R.A. The citopatogenic action of the bluetongue vims of antibodies in the serum of sheep. // Onderstepoort J. Vet. Res.- 1956.-v.27.-p. 171-177

62. Hammami S., Osburn B.I. Analysis of genetic variation of epizootic hemorrhagic disease virus and bluetongue virus field isolates by cielectrophoresis of their double-stranded RNA. // Arn.Ver. Res.- 1992,- v. 53.-N. 5.-p. 636-642.

63. Harding M.J., Prud'homme I., Rola J., and Gilles C. Dulac. Development of PCR-based Tests for the Identification of North American Isolates of Epizootic Haemorrhagic Disease Virus. // Can J. Vet. Res.- 1996.- Vol. 60.- p. 59-64.

64. Brown C.C., Meyer R.F., Grubman M.J. Use of dioxigenin-labeled RNA probe to detect all 24 serotypes of bluetongue virus in cell culture. // J. Vet. Diagn. Invest.- 1993.- N. 5, p. 159 162

65. Hawkes R.A., Kirkland P.D., Sanders D.A., Zhang F., Li Z., Davis R.J., Zhang N. Laboratory and field studies of an antigen capture ELISAfor bluetongue virus. // Journal of Virological Methods.- 2000.- v. 85.- p. 137— 149

66. Heidner H.W. Bluetongue virus genome remains stable throughout prolonged infection of cattle. //J. Gen. Virol. 1988,- Vol. 69.-N 10,- p. 2629-2636.

67. Heidner H.W., Iezzi L.G., MacLachlan N.J. A simplified procedure for oligonucleotide fingerprint analysis of multiple bluetongue virus genome segments utilizing small gels. // Journal-of-Virological-Methods. 1989.- v.26.-N.2.- p. 223-228108

68. Heidner H.W., Iezzi L.G., Osburn B.I., MacLachlan N.J. Genetic variation and evolutionary relationships amongst bluetongue viruses endemic in the United States. // Virus-Research.- 1992.- v.21.- N.2.- p. 91-109

69. Hirt B. Selective Extraction of polyoma DNA from infected Mouse Cell Cultures. // J. Mol. Biol.- 1967.- v. 26.- p. 365-369.

70. Howerth E.W. Studies on the patogenesis of bluetongue virus in white-tailed deer (Odocoileus virginianus). // Diss. Abstr. Inter., b.- 1986.- v. 47.- N 4.- p. 1497-1498

71. Hubschle O.J.B., Lorenz R.J., Matheka H.D. Enzime-Linked Immunosorbent Assay for Detection of bluetongue Virus Antibodies. // Am. J. Vet. Res.-1981.- v. 42.-N1.-p. 61-65

72. Hunter, R, Modumo J. A monovalent attenuated serotype 2 bluetongue virus vaccine confers homologous protection in sheep. // Onderstepoort J. Vet. Res.-2001.-v. 68.-N.4.-p.331-333.

73. Huismans H. Protein synthesis in bluetongue virus-infected cells. // Virology. -1979.-v. 92.-p. 385-396 t

74. Huismans H., Cloete M. A comparison of different cloned bluetongue virus genome segment as probes for the detection of virus-specified RNA. // Virology.- 1987,- v. 158,- p. 373-380

75. Huismans H., Van Dijk A.A. Bluetongue Virus Structural Components. // Current Topics in Microbiology and Immunology.- 1990.- v. 162.- p. 21-41.

76. Huismans H, Verwoerd D.W. Control of transcription during the expression of the bluetongue virus genome. //Virology.- 1973.- v. 52.- p. 81-88

77. Hwang G.Y., Xiang M., Li J.K.K. Analyses and conservation of sequences among the cognate L3 segments of the five United States bluetongue viruses. //Virus-Research.- 1994.-v.32.-N.3.-p. 381-389

78. Shope R.E., MacNamara L.G., Mangold R. A virus-induced epizootic hemorragic disease of Virginia White-tailed deer // J.Exp. Med., I960., Ill: 155-170.

79. Jochim M.M., Barber T.L., Bando B.M. Identification of bluetongue and epizootic haemorrhagic disease viruses by the indirect fluorescent antibody procedure. // Ann. Meet. Amer. Assoc. Vet. Lab. Diagn.- 1974.- v. 17.- p. 91103

80. Jochim M.M., Jones S.C. Plaque neutralization of bluetongue virus and epizootic hemorrhagic disease virus in BHK 21 cell. // Amer. J. Vet. Res.-1976.- v. 37, N 11.- p. 1345-1347

81. Jochim M.M., Suzzane С J. Enhancement of bluetongue and epizootic hemorrhahagic disease virae neutralization with anti-gammaglobulin. // Proc. Amer. Assoc. Vet. Lab. Diagn.- 1974.- v. 17.- p. 91-103 f

82. Johnson D.J., William C. Wilson, Prem S. Paul. Validation of feverse transcriptase multiplex PCR test for the serotype determination of U.S. isolates of bluetongue vims. // Veterinary Microbiology.- 2000.- Vol. 76.- p. 105-115.

83. Koumbati М., Mangana О., Nomikou К., Mellor Р.С., Papadopoulos О. Duration of bluetongue viraemia and serological responses in experimentally infected European breeds of sheep and goats // Veterinary Microbiology.-1999.-v. 64.- p. 277-285

84. Kowalik Т.; Li J.K.K. Bluetongue virus evolution: sequence analyses of the genomic SI segments and major core protein VP7. // Virology-New-York.-1991.-v.181.- N.2.- p. 749-755

85. Kowalik T.F., Yang Y.Y., Li J.K.K. Molecular cloning and comparative sequence analyses of bluetongue virus S1 segments by selective synthesis of specific full-length DNA copies of dsRNA genes. // Virology-New-York. 1990, 177: 2, 820-823.110

86. Kirkland, P. D., Zhang, N., Hawkes, R. A., Li, Z., Zhang F. Studies on the epidemiology of bluetongue virus in China. // Epidemiol. Infect.- 2002.- v. 128.- N.2.- p. 257-263.

87. Klontz G.W., Svehag S-E., Gorham J.R. A study by the agar diffusion technique of precipitating antibody directed against blue tongue virus and its relation to homotypic neutralizing antibody. // Arch. Gen. Virusforsch.-1962.-v. 12.-p. 259-268

88. Lee H. Infection diseases testing by ligase chain reaction. // Clin. Chem.-1993.-v.30.- p.729-730.

89. Lecatsas G. Electron microscopic study of the formation of bluetongue viruses. // Onderstepoort J. Vet. Res.- 1968.- v. 35.- p. 139-149

90. Loudon P.T., Roy P. Interaction of nucleic acids with core-like and subcore-like particles of bluetongue virus. // Virology-New-York.- 1992.- v. 191.-N.l.-p. 231-236

91. Lizardi P.M., Kramer F.R. Exponential amplification of nucleic acids: new diagnostics using DNA polumerase and RNA replicases. // Trends in Biotechnol.- 1991.- v. 9.- p. 53-59

92. Manning J.S., Chen M.F. Bluetongue virus: detection of antiviral immunoglobulin G by means of enzyme-linked immunosorbent assay. // Curr. Microbiol.- 1980.- v. 4.- p. 381-385

93. Mellor P.S., Boorman J. The transmission and geographical spread of African horse sickness and bluetongue viruses. // Annals-of-Tropical-Medicine-and-Parasitology. 1995, 89: 1, 1-15; p.6

94. McColl K.A. and Gould A.R. Detection and characterization of bluetongue virus using the polymerase chain reaction. // Virus Research.- 1991.- v. 21 .-N 1.- p. 1-18

95. McColl K.A., Gould A.R., Pritchard L.I., Melville L., Bellis G. Phylogenetic characterisatioon of bluetongue viruses from naturally-infected insects, cattle and sheep in Australia. // Australian veterinary Journal.- 1994.- v. 71.- N. 4.- p. 102-105.

96. Mayr Y. Handbuch der Schutzimpfugen in der Fiermedizin. // Parrey.-1984.- p. 436-441.

97. Mellor P.S. The Replication of Bluetongue Virus in Culicoides Vectors. // Current Topics in Microbiology and Immunology- 1990.- v. 162.- p. 143161.

98. Mertens P.P.C., Sangar D.V. Analysis of the terminal sequences of the genome segments of four orbiviruses. //Virology.- 1985.- v. 140.- p. 55-67

99. Moore D.L. Bluetongue and related viruses in Ibadan, Nigeria: serologic comparison of bluetongue, epizootic hemorrhagic disease of deer and Abadina (Palyam) viral isolates. // Am. J. Vet. Res.- 1974.- v. 35.- p. 11091113

100. Moore D.L., Lee V.H. Antigenic relationship between the virus of epizootic haemorrhagic disease of deer and bluetongue virus. // Arch. Gen. Virusforsch.- 1972.- v. 7.- p. 282 284

101. Mullis K.B. The Unusual Origin of Polymerase Chain Reaction. // Scientific American.- 1990.- April.- p. 36-43

102. Osburn B.I. Bluetongue virus. // Veterinary-Clinics-of-North-America,-Food-Animal-Practice. 1994, 10: 3, 547-560.

103. Osburn B.I. The current world status of bluetongue. // Bovine-Practitioner. -1990.-N.25.-p. 12-14.

104. Ozawa Y. Bluetongue and related orbiviruses: overview of the world situation. In: Barber T.L., Jochim M.M. eds "Bluetongue and related orbiviruses", New York: 1985.- Alan R. Liss Inc,: 13-20.

105. Parsonson I.M. Patology and Patogenesis of Bluetongue Infections. // (Jurrent Topics in Microbiology and Immunology.- 1990.- v. 162,- p. 119-141.

106. Parvaiz S. A note on an outbreak of bluetongue in sheep in Kishmir. Livestock-Adviser. 1992, 17:12,17-18.

107. Pedley S., Mohamed M.E.H., Mertens P.P.C. Analysis of genome segments from six different isolates of bluetongue virus using RNA-RNA hybridisation: a generalised coding assignment for bluetongue viruses. // Virus-Research. 1988.- 10- 4- 381-390.

108. Pierce C.M., Balasuriya U.B.R., MacLachlan NJ. Phylogenetic analysis of the S10 gene of field and laboratory strains of bluetongue virus from the United States // Virus Research.- 1998.- v.55.- p. 15-27

109. Rao C.D., Kiuchi A., Roy P. Homologous terminal sequences of the genome double-stranded RNAs of bluetongue virus. // J. Virol.- 1983.- v. 46.- p. 378383

110. Ritter D.G., Roy P. Genetic relationship of bluetongue virus seritypes isolated from different parts of the world. // Vims Research.- 1988.- v. 11.- N l.-p 33-47

111. Rossmann M.G. and Tao Y. Courageous science: stmctural of bluetongue vims core. // Structure.- 1999.- Vol. 7.- N 3.- p. 43-46.

112. Roy R, Marshall J.J.A., Frenc T.J. Structure of the Bluetongue Virus Genome and Its Encoded Proteins. // Current Topics in Microbiology and Immunology.- 1990.- v. 162.- p. 43-87.I

113. Ritter D.G., Roy P. Genetic relationships of bluetongue vims serotypes isolated from different parts of the world. // Vims Research.- 1988.- v. 11.- N. 1.-p. 33-47. j

114. Sellers R.F. Bluetongue and related diseases. In: Gibbs E.P.J, eds "Vims deseases of food animals". II, New-York: Academic Press Inc.: 1981.- p. 567-584.

115. Sreenivasulu D., Subba Rao M. V., Gard G. P. Isolation of bluetongue virus serotype 2 from native sheep in India. // Veterinary Record .- 1999.- v. 144.-p. 452-453114

116. Stott J. Z., Osburn B. J. Immune Response to Bluetongue Virus Infection. // Current Topics in Microbiology and Immunology.- 1990.- v. 162 p. 163193.

117. Stott J.Z., Osburn B. J. Simple procedure for preparation of bluetongue virus and epizootic haemorrhagic disease virus antigens for agar gel immunodiffusion. // J. Clinical Microbiol.- 1983.- v. 18.- N 6.- p. 131C| 1313

118. Stott J. Z., Osburn B. J., Oberst R. D. Genetic diversity of blutongue virus. // Proc. 91 Ann. Meet. Unit St. Animal Hlth. Assoc.- 1987.- 25-30 oct.- pp. 229 234.

119. Theiler A. Inoculation of sheep against bluetongue and results in practice. // Vet J.- 1908.- 64.- p. 600 607.

120. Thomas F.C., Prestwood A.K. Plaque neutralization test reactors to bluetongue and EHD viruses in the southeastern USA. // Wildlife Dis.- 1976.-p. 401-411

121. Uren M.F. Clinical and pathological responses of sheep and cattle to experimental infection with different of the epizootic haemorrhagic disease of deer serogroup. //Austral. Vet. J.- 1986.- v. 63.- N 6.- p. 91-103

122. Verwoerd D. W. Purification and characterization of bluetongue virus. // Virology.- 1969.- 38.- p. 203-212. f115

123. Verwoerd D.W., Louw H., and Oellermann R.A. Characterization of Bluetongue Virus Ribonucleic Acid. // Journal of Virology.- 1970.- Vol. 5.- N l.-p. 1-7.

124. Vishnyakov I., Strizhackov A., Novickova M., Baluisheva V. Development of inactivated vaccine against sheep bluetongue. // XI International Congress of Virology: Abstract, 9 - 13, August, 1999, - Sydney, Australia, - 1999, p. -35.

125. Wade-Evans A.M., Mertens P.P.C., Bostock С.J. Development of polymerase chain reaction for the detection of bluetongue virus in tissue samples. // Journal of Virological Methods.- 1990.- v. 30.- p. 15024.

126. Wang L.F., Doi R.H., Osburn B.I., Chuang R.Y. Complete sequence of the NSI gene (S6 RNA) of US bluetongue virus serotype 17. // Nucleic-Acids-Research.- 1989.-v. 17.-N. 19.-p. 8002

127. Ward M.P. The epidemiology of bluetongue virus in Australia — a review. // Australian Veterinary Journal.- 1994.- Vol. 71.- N 1.- p. 3-7.

128. Wilson W.C. Development of a nested-PCR test based on sequence analysis of epizootic hemorrhagic disease viruses non-structural protein 1 (NSI). // Virus-Research.- 1994.- v.31.- N.3.- p. 357-365

129. Wilson W.C. Sequence analysis of the non-structural protein 2 from epizootic hemorrhagic disease viruses. // Virus-Research.- 1994.- v.34.- N.I.- p. 63-68

130. Wilson W.C. Preliminary description of a polymerase chain reaction test for bluetongue and epizootic hemorrhagic disease viral RNA in bovine semen. // J. Vet. Diagn. Investig.- 1999.- Vol. ll.-N 4.- p. 377 379.

131. Wilson W.C. Molecular comparison of VP3 from bluetongue and epizootic hemorrhadgic disease viruses. // Virus Research.- 1991.- 21.- p. 2225-236.

132. Wilson W.C., Ma H.C., Venter A.A., van Djik A.A., Seal B.S., Mecham J.O. Phylogenetic relationships of bluetongue viruses based on gene S7. // Virus Research.- 2000.- v. 67. -p. 141-151.

133. Wittmann, E. J., Mello, P. S., Baylis, M. Effect of temperature on the transmission of orbiviruses by the biting midge, Culicoides sonorensis. // Med. Vet. Entomol.- 2002.- N 2.- p. 147-56.

134. Wu M.J., Zhang C.J., Zhang Z.C., Zhu W.C. Application of the gel electrophoresis technique to studying the RNA of bluetongue virus. // Chinese-Journal-of-Veterinary-Science-and-Technology.- 1988.- N. 10, p. 59-60.

135. Yang Y.Y., Chiou J.F., Hwang G.Y., Huang I.J., Li J.K.K. Evolutionary analyses of five US bluetongue viruses using the cognate S2 genes. // Comparative-Haematology-International.- 1993.- v. 3.- N3.- p. 241-249

136. Yang Y., Li J.K.K. Complete genomic sequences of the GP5 protein gene of bluetongue virus serotype 11 and 17. //Virus-Research.- 1992.- v.23.- N.l-2, p. 163-171

137. Yamakawa M., Krasnyck V., Roy P. Phylogenetic relationships of the VP2 protein of a virulent isolate of bluetongue virus (BTV-23) compared to those of 6 other BTV serotypes. // Virus-Research.- 1994.- v.34.- N.I.- p. 81-92

138. Yonguc A.D, Taylor W.P, Csontos L., Worrall E. Bluetongue in western Turkey. // Vet. Rec.- 1982.- v.l 11.- N.7.- p. 144-146 J

139. Zientara S., Sailleau C., Moulay S., Plateau E., Cruciere C. Diagnosis and molecular epidemiology of African horsesickness virus by the polymerase chain reaction and restriction patterns. // Ann. Rech. Vet.- 1993.- v. 24.- p. 385-395.

140. Zhou E-M., Ridd D., Riva J., Fernando L., Clavijo A. Development and evaluation of IgM-capture ELISA for detection of recent infection with bluetongue viruses in cattle. // Journal of Virological Methods.- 2001.- v. 91.-p. 175-182

141. ОСНОВАНИЕ: Выполнение НИР по темам «Г-10», «У-27», «01.01.03.» и указание директора ВНИИВВиМ №14 от 27 августа 2001 г.

142. Комиссия в период с 26 ноября по 30 ноября 2001 г. провела проверку «Набора препаратов для выявления РНК вируса блютанга методом ПЦР» в соответствии с программой комиссионных испытаний, утвержденной директором ВНИИВВиМ от 27 августа 2001 г.

143. Комиссионные испытания проведены на базе лабораторий «Биофизики» и «Диагностики».

144. При амплификации РНК близкородственных Орбивирусов (вирусы Ибараки, ЭГБО, АЧЛ), а также, вирус болезни Абакане и проб головного мозга незараженных контрольных мышей и интактных клеток ПС, продуктов ПЦР не обнаружено.

145. Расчетная чувствительность «Набора препаратов.» для обнаружения РНК вируса блютанга 13 серотипа в пробах головного мозга зараженных мышей составила 50100 МЛД50/мл. •

146. Основные этапыисследований представлены в проекте «Методических указаний по выявлению РНК вируса вируса блютанга методом полимеразной цепной реакции»

147. Предоставить акт комиссионных испытаний "Набора препаратов для выявления РНК вируса блютанга методом ПЦР" на рассмотрение Ученого совета ВНИИВВиМ и утверждение его директором института. .

148. Провести межведомственные комиссионные испытания «Набора препаратов .» с целью определения его места в схеме диагностики блютанга.1. ПРЕДЛОЖЕНИЯ1. Председатель1. Члены комиссии:1. Новикова М.Б. Южук Т.Э.

149. Кривонос Г.И. Снетков К.А.1. Покров 2001 г.

150. Методические указания рассмотрены и одобрены ученым советом ВНИИВВиМ (протокол №13 от б декабря 2001г.).

151. АКТ '^Ud^L^^ комиссионных испытаний набора препаратов для выявления РНК вируса серогруппы ЭГБО методом полимеразной цепной реакции

152. ОСНОВАНИЕ: Выполнение НИР по темам "Г-10", "У-27", "01.01.03." и указание директора ВНИИВВиМ №14 от 27 августа 2001 г.

153. Комиссия в период с 26 ноября по 30 ноября 2001 г. провела проверку "Набора препаратов для выявления РНК вируса ЭГБО методом ПЦР" в соответствии с программой комиссионных испытаний, утвержденной директором ВНИИВВиМ от 27 августа 2001 г.

154. Комиссионные испытания проведены на базе лабораторий "Биофизики" и "Диагностики".

155. При амплификации РНК близкородственных Орбивирусов (вирусы Ибараки, блютанга, АЧЛ), а также вирус болезни Абакане и проб головного мозга незараженных контрольных мышей и интактных клеток ПС ПЦР продуктов не обнаружено.

156. Расчетная чувствительность "Набора препаратов." для обнаружения РНК вируса ЭГБО в пробах головного мозга мышей, зараженных вирусом ЭГБО 2 серотипа (шт. "Альберта") составила 100 МЛД50/мл. •

157. Основные этапы исследований представлены в проекте "Методических указаний по выявлению РНК вируса вируса ЭГБО методом полимеразной цепной реакции"1. ПРЕДЛОЖЕНИЯ

158. Предоставить акт комиссионных испытаний "Набора препаратов для выявления РНК вируса ЭГБО методом ПЦР" на рассмотрение Ученого совета ВНИИВВиМ и утверждение его директором института.

159. Провести межведомственные комиссионные испытания "Набора препаратов ." с целью определения его места в схеме диагностики ЭГБО.1. Председатель

160. Кривонос Г.И. Снетков К. А.1. Покров 2001 г.