Совершенствование средств мониторинга блютанга на основе полимеразной цепной реакции

Гаврилова, Екатерина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Совершенствование средств мониторинга блютанга на основе полимеразной цепной реакции
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование средств мониторинга блютанга на основе полимеразной цепной реакции"

УДК: 619:616.98:578.823.1:577.2

На правах рукописи

ГАВРИЛОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ МОНИТОРИНГА БЛЮТАНГА НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

06.02.02.- Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологиен и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук Луницин А.В.

Покров, 2010

1 3 НОЯ 2010

004613124

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийа

научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиоло:

Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВ Россельхозакадемии).

Научный руководитель

кандидат ветеринарных наук Луницин Андрей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

(ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир) Рыбаков Сергей Сергеевич

доктор ветеринарных наук,

Ведущая организация - Государственное научное учреждение «Всероссийс научно-исследовательский и технологический институт биологичес промышленности», г. Щелково.

Защита диссертации состоится «25» ноября 2010 г. в «10-00» часов на заседа диссертационного совета при ГНУ Всероссийском научно-исследовательс институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601! Владимирская обл., Покров, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел/факс: (49243) 62125. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ. Автореферат разослан октября 2010 г

Ученый секретарь диссертационного совета, ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии

профессор

(ФГУ ЦНМВЛ, г. Москва)

Белоусов Василий Иванович

кандидат биологических наук

Е.А. Балашова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

В 2006 г. в Западной Европе было зарегистрировано заболевание блютангом. В последующем установлено, что болезнь вызывается вирусом, относящимся к 8 серотипу. Актуальность блютанга для Российской Федерации значительно возросла с начала 2006 г., когда российскими внешнеторговыми организациями был начат импорт племенного крупного рогатого скота из стран Евросоюза, в том числе из неблагополучных по нему стран. Блютанг может быть занесен в Россию не только из стран Евросоюза, но и из стран Центрально-Азиатского и Дальневосточного регионов. Кроме того, на территории России есть все условия для «укоренения» заболевания. Прежде всего - это наличие различных видов мокрецов, потенциальных резервуаров и переносчиков вируса (С. с1еи>и1/1, С. оЬхоЫш, С. риИсат и др), которые вызвали распространение болезни в странах Европы (Захаров В.М., 2007, 2009). В целом необходима строгая целенаправленная система, предусматривающая комплекс мер по недопущению заноса болезни, включающих раннюю диагностику, четкие схемы мониторинга и надзора, эффективные противоэпизоотические мероприятия. Согласно «Санитарному кодексу наземных животных МЭБ» основными методами диагностики блютанга при экспорте животных являются ИФА и ОТ-ПЦР. Одним из достоинств ПЦР-анализа является обнаружение вирусного генома у животных, начиная с первых дней заболевания, когда еще не сформировался иммунный ответ организма.

Таким образом, при ввозе животных из неблагополучных стран или зон, а также в ходе проведения противоэпизоотических мероприятий при вспышках блютанга необходимо проведение быстрых и эффективных лабораторных исследований, позволяющих в кратчайшие сроки выявить возбудитель.

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции, дополняя серологические методы, открывает новые возможности для разработки тест-систем для идентификации вируса блютанга. В 2003 г. Снетковым К.А. были разработаны наборы препаратов для выявления РНК вируса блютанга и ЭГБО методом ПЦР с электрофоретической детекцией результатов. В 2008 г. сотрудниками лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ был

усовершенствован набор препаратов для выявления генома вируса блютанга метод ПЦР с электрофоретической детекцией.

Одним из перспективных направлений является использование метода ПЦР режиме реального времени. Его принципиальной особенностью являв! количественная оценка динамики накопления продуктов полимеразной цепи реакции с автоматической регистрацией результатов. Он позволяет получ: результат в 2-3 раза быстрее по сравнению с классической ПЦР электрофоретической системой детекции; снижает риск контаминации, связанный исключением 3-го этапа ПЦР (электрофореза); использование внутренне контрольного образца (ВКО) позволяет проследить прохождение реакции в каж/; пробе, что согласно новым рекомендациям МЭБ (OIE, 2008) является необходим! условием при создании тест-систем на основе ПЦР.

Цель и задачи исследований

Целью данной работы является совершенствование и разработка молекуляр1 биологических средств мониторинга блютанга в пробах крови и патологичесм материала на основе полимеразной цепной реакции.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие за;

чи:

1. Подобрать специфические праймеры и олигонуклеотидные зонды для идентификации генома вируса блютанга.

2. Разработать тест-систему на основе метода ПЦР в режиме реального времени для идентификации генома вируса блютанга, содержащую внутренний контрольный образец (ВКО), при исследовании материала от инфицированны животных.

3. Провести сравнительное изучение чувствительности и специфичност разработанных тест-систем с использованием праймеров, комплементарны различным участкам генома вируса блютанга.

4. Провести мониторинговые исследования на наличие генома вируса блюташ в пробах крови, взятых от импортированных животных, с использование разработанных тест-систем.

Научная новизна работы

Подобраны специфические олигонуклеотиды к различным сегментам генома

руса блютанга, использование которых в ПЦР позволяет выявлять вирус в низкой концентрации.

Разработана «Тест-система» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакции в режиме реального времени для выявления генома вируса блютанга с использованием внутреннего контрольного образца Показана высокая чувствительность метода, которая составила 1,5 ^ ТЦД50/см3. Модифицированная методика ОТ-ПЦР в режиме реального времени с предварительной амплификацией специфического участка кДНК позволила повысить чувствительность метода до 0,5 ^ ТЦЦ5о/см3.

С помощью комплекса молекулярно-биологических методов (ОТ-ПЦР в режиме реального времени, нуклеотидного секвенирования и последующего филогенетического анализа 10-го сегмента генома) при исследовании животных, импортированных из стран ЕС, идентифицирован 8-ой серотип вируса блютанга.

Установлено, что геном вируса блютанга выявляется в пробах крови и патологического материала от инфицированных животных в течение 90 дней у овец и 173 дней у КРС (период наблюдения), начиная с 3 дня после заражения.

Практическая значимость

Разработанная «Тест-система для выявления генома вируса блютанга (ВБ) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» утверждена Россельхознадзором (ПВР-1-5.0/02618 от 30.08.20010г.) и внедрена в практику для выявления РНК вируса блютанга в пробах крови, патологического материала и в инфицированных культурах клеток.

Для использования ветеринарной практикой разработаны «Методические рекомендации по выявлению генома вируса блютанга (ВБ) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени», утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (28.12.2009г.), а также рассмотрены и одобрены на секции «Инфекционной патологии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (30.09.2010г.).

Публикации результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 5 научных статей, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2008-2010 гг.).

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых Г1 ВНИИВВиМ Россельхозакадемии «Актуальные проблемы инфекционной патолог ветеринарной медицины» (г. Покров, 2009 г.), Международной научно-практическ конференции «Научные основы производства ветеринарных биологическ препаратов», посвященной 40-летию ВНИТИБП (г. Щелково, 2009г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получена тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени, содержащая внутренний контрольный образец, для идентификации генома вируса блютанга в пробах крови и патологического материала от инфицированных животных.

2. Установлена чувствительность и специфичность усовершенствованных и разработанных тест-систем с использованием праймеров, гомологичных различным сегментам генома вируса блютанга.

3. Получены данные мониторинговых исследований распространения блюта! на территории РФ с использованием разработанных тест-систем на основе ОТ-ПЦР.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация изложена на 145 страницах, включая приложение. Иллюстрировг 26 таблицами и 28 рисунками. Список литературы включает 135 источников, в т числе 99 зарубежных авторов.

Личный вклад автора в выполнении работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятелы Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этаг работы оказывали следующие сотрудники института: к.б.н. Малоголовкин А (освоение молекулярно-биологических методов, клонирование рекомбинантн плазмиды). Часть работы по выделению вируса выполнена совместно с аспирант лаборатории Диагностики Вялых И.В. и сотрудником Отдела биологического технологического контроля (ОБТК) Бобровской Н.К.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

2.1.1. Вирусы: В работе использованы штаммы вируса блютанга 8, 2, 4, 9, серотипов, полученные из музея ГНУ ВНИИВВиМ: БРА 2005/05 (полевой изолят, серотип), Е2/ВНК6 (8 серотип), ЕЗ/ВН6 (9 серотип), «Тапхар» (16 серотип); 8 серот РФ (полевые изоляты фн/5-09 и ФКл/4-09), выделены сотрудниками лаборатор

Диагностики ГНУ ВНИИВВиМ; эпизоотический шт. 8-го серотипа - BTV NET 2006-А, 1 серотип Испания (BTV-1 Spain), 4 серотип Испания (BTV-4 Spain) получены из научно-исследовательского Центра CIDC - Лелистат (Нидерланды). Шт. «Нью-Джерси», «Альберта», «А 496», WA вируса ЭГБО (Эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей); вирус болезни Ибараки (шт. «Сасаки»); вирус АЧЛ (Африканская чума лошадей) 6, 8, 9 серотипов получены из музея ГНУ ВНИИВВиМ.

2.1.2. Пробы крови н патматериала от естественно инфицированных и экспериментально зараженных овец и КРС: пробы крови и органов от телят и овец, экспериментально зараженных 1, 4, 8 серотипами вируса блютанга, взятые на разные сутки после заражения, предоставлены сотрудниками лаборатории Диагностики, а также сотрудниками Отдела биологического и технологического контроля. Лимфоузлы и селезенка от овец и КРС, зараженных ВБ (вирусом блютанга) 1, 8 серотипов.

2.1.3. Культуры клеток: перевиваемая линия клеток Vero, культуры клеток ВНК-21, ПСГК. 10% суспензия из головного мозга здоровых мышей.

2.1.4. Животные: телята чёрно-пёстрой породы 3-4-мес. возраста; первотелки (за 1,5-2 месяца до отела) голштино-фризской породы; ягнята романовской породы и породы меринос 6-12 мес. возраста; нетель черно-пестрой породы в возрасте 6 мес., доставленная из хозяйства «Узольские ключи» Нижегородской области.

2.1.5. Плазмида и бактериальные штаммы: для клонирования ПЦР-продуктов использовали коммерческий набор QIAGEN PCR Cloning Kit («QIAGEN», Германия). В качестве вектора для клонирования использована плазмида pDrive Cloning Vector 3,85 kb.

Трансфекцию рекомбинантной плазмиды проводили в клетки E.coli шт. ТОР 10 («Promega», США).

2.1.6. Реактивы

Для выделения нуклеиновых кислот: гуанидин тиоцианат (Fluka Biochemika №50990); Trizol LS («Invitrogene»); деионизированная вода; сорбент нуклеиновых кислот (силика) («Helicón», г. Москва); трис-HCl («Serva»); борная кислота (о.с.ч.); ЭДТА («Serva»); этиловый спирт 96%; хлороформ; фенол; изоамиловый спирт.

Для проведения обратной транскрипции и ПЦР: 5х реакционный буфер Амплисенс Blue («Интерлабсервис», г. Москва); 5х реакционный ПЦР буфер

(«Fermentas», Латвия); 5x реакционный буфер для обратной транскрипц («Интерлабеервис», г. Москва); смесь нуклеозидтрифосфатов 25mM («Fermentai Латвия); специфические олигонуклеотиды и флуоресцентные зонды (ЗАО «Синто; «Литех» г. Москва); магний хлористый (25тМ); Taq-ДНК-полимераза (5ед./мк ревертаза-MMLV («Интерлабеервис», г.Москва); минеральное масло для П1 («Интерлабеервис»);

Для проведения электрофореза: агароза («Helicón», г. Москва); бромид этид («Helicón», г. Москва); маркеры молекулярной массы («Fermentas», Латвия);

Для секвенирования: формамид; 10х буфер с ЭДТА; Big dye v.3.1. terminât' полимер POP 7 («Applied Biosystems», США).

2.2. Методы

2.2.1. Выделение и очистка нуклеиновых кислот Для исследования бы использованы пробы органов (печень, легкие, сердце, селезенка, лимфатическ узлы) от вынужденно убитых и павших животных, кровь инфицированн! животных, а также инфицированные культуры клеток.

Для выделения вирусной нуклеиновой кислоты из проб цельной крови испо: зовали пробирки с антикоагулянтом (ЭДТА или ацетатом калия). Последующее в деление тотальной РНК из патологических материалов, цельной крови и инфицщ ванных культур клеток проводили по модифицированной методике Boom et al. (199 либо с использованием гуанидинового буфера с фенол-хлороформенной экстракцш а также с применением наборов «Рибо-преп» («Интерлабеервис») и Trizol LS. П<м ченный раствор РНК сразу использовали в ПЦР.

2.2.2. Постановка ОТ-ПЦР

Исследования по выявлению генома вируса блютанга осуществляли при помо] тест-систем и наборов препаратов на основе «гнездовой» и «стандартной» ОТ-П1 разработанных в ГНУ ВНИИВВиМ (2006г., 2008г.).

Для проведения различных вариантов ОТ-ПЦР использовали термоцикле «Терцик МС-2» (ДНК-технология, г. Москва) или PalmCycler (Corbett Resear Австралия) и пробирки емкостью 0,5 см3 и 0,2 см3.

ОТ-ПЦР для выявления РНК ВБ проводили с предварительной денатурацией специфическими праймерами при 88°С в течение 10 мин; под масло вносили вы, ленную РНК в объеме 8 мкл. Обратную транскрипцию проводили в течение 30 м

при 42°С с использованием следующих компонентов, согласно инструкции по применению: смеси праймеров (10 пкм каждого) - 2 мкл; ревертазы-MMLV - 1 ед; буфера для обратной транскрипции — 5 мкл; деионизированной воды.

Для дальнейшей амплификации применяли: смесь праймеров (10 пкМ каждого) 2,0 мкл; dNTP (25 мМ) 0,5 мкл; MgCl2 (25 мМ) 0,5 мкл; 5Х буфер для ПЦР (Амплисенс Blue) 5 мкл; Taq ДНК-полимеразу 1 ед.; кДНК (исследуемый образец) 5 мкл; деиони-зированную воду до 25 мкл.

Переносили пробы в амплификатор и проводили «стандартную» ОТ-ПЦР при следующих режимах: 94°С - 2 мин; 94°С - 15 сек, 62°С - 15 сек, 72°С - 15 сек (42 цикла); 72°С - 2 мин. Для «гнездовой» ОТ-ПЦР: 94°С - 2 мин; 94°С - 30 сек, 57°С - 30 сек, 72°С - 30 сек (25 циклов); 72°С - 5 мин.

В каждой серии анализов использовали контрольные образцы: положительный контроль (инактивированный культуральный вирус блютанга 8-ого серотипа), и отрицательный контроль (деионизированная вода). Смеси для контрольных образцов готовили по той же прописи, что и для исследуемых образцов.

2.2.3. Анализ ПЦР продуктов Анализ продуктов реакции осуществляли при помощи электрофореза в 1,5 - 2,0% агарозном геле, содержащем 0,001% бромистого этидия, при силе тока 50 мА и напряжении 170 В.

Результаты ПЦР оценивали обнаружением специфических полос в треках с исследуемыми образцами относительно фрагмента в пробе с положительным контролем. С помощью маркера молекулярной массы («Fermentas», Латвия) вычисляли размеры исследуемых продуктов реакции.

Электрофорез проводили в течение 20 минут. Результаты электрофореза учитывали на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Регистрацию полученных результатов проводили с помощью гельдокументирующей системы.

2.2.4. ПЦР в формате реального времени

В работе использовали технологию гибридизационных флуоресцентных зондов - TaqMan, основанную на детекции репортерной флуоресценции при гидролизе меченого зонда. В ходе амплификации, когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время синтеза ПЦР - продукта за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-

полимеразы, зонд разрушается и флуоресцентная метка переходит в раствс освобождаясь от тушителя, что генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающий в реальном времени пропорционально накоплению амплифицируемого фрагмента, основу была взята методика, предложенная J.F. Toussaint и Kris De Clerq (2007).

Обратную транскрипцию проводили аналогичным способом, также как и д] классического варианта ОТ-ПЦР.

Амплификацию и детекцию репортерной флуоресценции проводили в терм циклерах «IQ-5» (BioRad, США) и « Rotorgene 6000» (Corbett Research, Австралия) i двум каналам. Постановку ПЦР в реальном времени проводили в пробирках ш плашках емкостью 0,2 см3.

Параметры реакции и состав ПЦР-смеси указаны в результатах исследований.

2.2.5. Нуклеотидное секвенирование Нуклеотидное секвенирован полноразмерного 10 сегмента генома вируса блютанга проводили с использовани специфических праймеров на концевые участки сегмента. Выделение специфическ продуктов амплификации из агарозного геля или реакционной смеси осуществля коммерческим набором для выделения нуклеиновых кислот «DNA purification k («Fermentas», Латвия), с последующей реамплификацией фрагментов при помо1 компонентов «BigDye v. 3.1. Terminator» («Applied Biosystems», США).

Секвенирование проводили в автоматическом анализаторе Genetic Analy; 3130XL («Applied Biosystems», США).

2.2.6. Программное обеспечение Для разработки специфических праймеров зондов использовали пакет прикладных программ «Bio Edit», «Oligo 6.0». Специф! ность рассчитанных олигонуклеотидов проверяли при помощи интернет-серви BLAST (http://www.BLAST.NCBI.nlm.nih.gov).

2.2.7. Постановка ИФА Сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для в явления специфических антител вируса блютанга был выполнен сотрудниками ла£ ратории Диагностики.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Сравнительные исследования чувствительности и специфично вариантов ОТ-ПЦР с использованием праймеров, гомологичных различи сегментам генома вируса блютанга

Для проведения исследований в работе использованы варианты ПЦР, ранее разработанные в нашем институте: «стандартная» ОТ-ПЦР и «гнездовая» ОТ-ПЦР (табл.1).

С целью повышения чувствительности «стандартной» ОТ-ПЦР нами был подобран дополнительный олигонуклеотид (10SN к паре 10SF и 10SR), комплементарный участкам 10-го сегмента генома. Анализ нуклеотидных последовательностей участков 10-го сегмента геномов различных изолятов вируса блютанга, взятых из базы данных GenBank (NCBI), проводили с применением пакета прикладных программ «Bio Edit». На консервативный участок 10-го сегмента РНК был рассчитан специфический праймер 10SN с использованием программы «Oligo 6.0». Специфичность праймера 10SN с последовательностью 5'-agc gca асс аса gca gcc act-3' проверена при помощи интернет-сервиса BLAST.

Таблица 1. Характеристика различных вариантов ПЦР-анализа

Название реакции Используемые праймеры Комплементарные участку генома Размер продукта

«Стандартная» ОТ-ПЦР 10SF 5'-cat get ate egg get gatccaaa-3'; 10SR 5'-cat cat cac gaa acg ett ctg c-3' 10 сегменту генома, кодирующего неструктурный белок ЫБЗ 250 п.о.

«Полугнездовая» ОТ- ПЦР 10SF 5'-cat get ate egg get gatccaaa-3'; 10SN 5'-age gca асс аса gca gcc act-3'; 10SR 5'-cat cat cac gaa acg cttctgc-3' 10 сегменту генома, кодирующего неструктурный белок №3 10SF - 10SN = 396 п.о. 10SF - 10SR = 250 п.о.

«Гнездовая» ОТ-ПЦР 1 раунд: G34 5'-gtt aaa aat ctatagagaatg-3'; G35 5'-gta agt gta ate taa gag-3' 2 раунд: G36 5'-аса act gat gctgcgaatga-3'; G37 5'-aac cca cac ccg tgc taagtgg-3' 7 сегменту генома, кодирующего \Т7 белок 1 раунд: 1156 п.о. 2 раунд: 769 п.о.

Процедура постановки «полугнездовой» ОТ-ПЦР являлась сходной со

«стандартным» вариантом ОТ-ПЦР, за исключением добавленного шага амплификации с внешним праймером при тех же температурных режимах. При постановке «полугнездового» варианта ОТ-ПЦР для 1-го и 2-го раундов использовались те же температурные режимы, что и для «стандартной» ОТ-ПЦР. Только для первого раунда брали праймеры ЮБР-ЮБЫ, а для второго - ЮБР-ЮБЯ.

3.1.1. Изучение чувствительности и специфичности «полугнездовой» ОТ-ПЦР

Определение чувствительности отобранных вариантов ПЦР проводили пут€:;( выявления вирусной РНК в серии приготовленных десятикратных разведений (10"'-10"5) культурального вируссодержащего материала с титром вируса 6,5 ^ ТЦЦ50/см3 Для заражения культуры клеток ПСГК использовали 8 серотип вируса блютанга.

Анализ данных показал, что при проведении одностадийной ОТ-ПЦР : «гнездовой» ОТ-ПЦР удалось обнаружить РНК вируса блютанга в первых тр>_: разведениях (т.е. с титром вируса до 3,5 ^ ТЦД5о/см3). С помощью «полугнездовоп. варианта ПЦР можно обнаружить вирус в пяти разведениях (титр вируса 1,5 ТЦД50/см3) (рис.1).

1 2 34 5678 9

Рисунок 1. Результаты постановки «полугнездовой» ОТ-ПЦР д f выявления генома вируса при разных концентрациях

Треки: 1 - маркер молекулярной массы, 2 -разведение 1С1, 3 -разведение Ш2, - ' - разведение 10~3, 5 - разведение 1СГ4, 6 - разведение 10~5, 7 — К+, 8 - К-, 9 - марке^' молекулярной массы.

Таким образом, при сравнении трех видов ОТ-ПЦР установлено, ч-чувствительность «полугнездового» варианта, разработанного на осно «стандартной» ОТ-ПЦР, была в 100 раз выше.

Для оценки специфичности различных вариантов ПЦР были использоваг штаммы вируса блютанга 1, 2, 4, 8, 16 серотипов, штаммы вируса ЭГБО (New Jerse Alberta), A4JI (серотипы 6, 8, 9) и болезни Ибараки (штамм Сасаки), полученные . лаборатории Музейных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рисунок 2. Электрофореграмма оценки специфичности «полугнездового» варианта ОТ-ПЦР

Треки: 1 - вирус блютанга 1 серотипа, 2 - вирус блютанга 2 серотипа, 3 -вирус блютанга 4 серотипа, 4 - вирус блютанга 8 серотипа, 5 - вирус блютанга 16 серотипа, 6 - вирус ЭГБО, штамм New Jersey, 7 - вирус ЭГБО, штамм Alberta, 8 -вирус АЧЛ 6 серотипа, 9 - вирус АЧЛ 8 серотипа, 10 - вирус АЧЛ 9 серотипа, 11 -вирус болезни Ибараки штамм Сасаки, 12 - интактная культура клеток, 13 - К-, 14 - маркер молекулярной массы.

При проведении сравнительных исследований чувствительности и специфичности вариантов ПЦР установили, что продукт ПЦР ожидаемого размера (250 п.о.) образуется при амплификации кДНК вируса блютанга и не образуется при амплификации кДНК гетерологичных образцов (рис.2).

3.2. Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени

Основными задачами этого этапа исследований являлись: подбор специфичных праймеров и олигонуклеотидных зондов, синтез кДНК, оптимизация условий постановки ПЦР в режиме реального времени, оценка специфичности и чувствительности метода.

3.2.1. Подбор праймеров и гибридизационного зонда

Для детекции использовали зонды, несущие флуорофор и тушитель, комплементарные части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента (табл.2). Для подбора праймеров и зонда был выбран консервативный 5 сегмент РНК, кодирующий неструктурный белок NS1 Подбор олигонуклеотидов проводили в сравнении с известными нуклеотидными последовательностями NS1, представленными в базе данных GenBank при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit», «Oligo 6.0».

За основу была взята методика, предложенная J.F. Toussaint и Kris De Clercq 2007 г.

Таблица 2. Характеристика праймеров и зондов

N пУп Название Последовательность олигонуклеотидов Длина п.о.

1. ActF cAggTcATcAccATcggcAATg 22

2. ActR gcAccgTgTTggcgTAgAggTc 22

3. ActZ Cy 5 -cTTccTTccTgggcATggAATccTg-BHQ2 25

4. BTV S5 F AgSgcTTTTTgAgAAAATAc 20

5. BTV S5 R TTRAATARAcAATTccTTTTTA 22

6. BTV S5 Z FAM-ggATTAYgcDAATgccAcgAgAA-BHQ 1 23

В качестве источника флуоресценции на 5' конце зонда применяли красите. РАМ, а для тушения флуоресценции на 3' конце ВН<31. Также были по добра* праймеры на В-актин, присутствующий в крови и органах животных, которь используется в качестве внутреннего контрольного образца (ВКО) для контроля эта: выделения нуклеиновых кислот и обратной транскрипции, где в качестве источни флуоресценции на 5' конце зонда Ай Ъ применяли краситель Су5, для тушения ВН(}2 (табл. 2).

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработа] мультиплексная реакция с использованием двух пар праймеров и зондов на разш биологические агенты в одной пробирке. Длина продукта реакции амплификащ специфического участка кДНК составила 115 п.о., длина ВКО составила 160 п.о.

3.2.2. Оптимизация условий постановки ОТ-ПЦР в режиме реально времени При оптимизации условий постановки полимеразной цепной реакщ учитывали то, чтобы наборы реагентов давали воспроизводимые результаты на ПЦ амплификаторах, наиболее широко распространенных в областных ветлабораториях.

Эмпирическим путем отработаны температурные и временные режимы провес ния реакции, подобраны буферные растворы, концентрация праймеров, ионов магн: и сЮТР. На приборе «1(3-5» (Вю11ас1, США) отработан градиент температуры, нач ная от 50°С до 62°С для определения наиболее оптимальной температуры отжи праймеров (рис.3).

Рисунок 3. Кривые накопления продуктов ПЦР при разных температурах отжига праймеров

1-Температура отжига праймеров 50°С; 2-Температура отжига праймеров 57,7°С; З-Температура отжига праймеров 59,9°С; 4-Температура отжига праймеров 61,3°С; 5-Температура отжига праймеров 62°С.

Было показано, что при отжиге праймеров в пределах 50°-60°С кривые накопления продуктов ПЦР имели высокий уровень флуоресценции, что свидетельствует о взаимодействии праймеров с матрицей в широком температурном диапазоне. С целью повышения специфичности реакции выбрана температура, равная 60°С. В результате проведения оптимизации реакции выбраны следующие параметры: денатурация - 95°С - 4 мин; амплификация - 95°С -15 сек, 60°С - 15 сек, 72°С -15 сек (5 циклов); амплификация - 95°С -15 сек, 60°С - 15 сек (детекция), 72°С -15 сек (35 циклов).

В результате титрования праймеров и зондов их оптимальная концентрация в ПЦР-смеси составила 10 пкМ и 5 пкМ соответственно. Таким образом, в состав полученной ПЦР-смеси входили следующие компоненты: 5х реакционный ПЦР буфер-5 мкл, 10 пкМ праймеры - по 1 мкл, 10 пкМ флуоресцентные зонды - по 0,5 мкл, 25 мМ MgCl2 - 1 мкл, 25 мМ dNTP - 0,5 мкл, Taq ДНК-полимераза-1 ед., 5 мкл кДНК, деионизированная вода-до 25 мкл.

Постановку ПЦР и детекцию продуктов амплификации проводили на наиболее распространенных в России моделях оборудования: приборе «IQ5» (BioRad, США) и «Rotor gene 6000» (Corbett Research, Австралия).

Детекцию флуоресцентного сигнала проводили по двум каналам FAM (Green) и

Су5 (Red). По каналу Fam/Green вели учет результатов амплификации

специфического участка кДНК вируса блютанга (рис.4), а по каналу Су5 (Red) - учет результатов амплификации ВКО (рис.5). Для постановки следующей реакции были взяты пробы культурального вируссодержащего материала, полученного на культуре клеток ПСГК с титром инфекционной активности 6,5 lg ТЦД50/см3(рис.4), а также пробы крови от здоровых животных (рис.5):

Рисунок 4. Кривые накопления Рисунок 5. Кривые накопления

продуктов амплификации продуктов амплификации ВКО по

специфического участка кДНК ВБ каналу Су5 (Red) по каналу Fam (Green)

3.2.3. Определение чувствительности и специфичности ОТ-ПЦР в режип реального времени

При определении чувствительности ОТ-ПЦР в режиме реального в реме! выявили РНК вируса блютанга 8-го серотипа в пяти разведениях, пред| чувствительности составил 1,5 lg ТЦДо/см3 (рис.6).

"SM -ci:

»'е-in

ек.

Рисунок 6. Результаты постановки ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления генома вируса при разных концентрациях (п=3)

К+ - кулътуральный вируссодержащий материал с титром инфекционной активности 6,5 lg ТЦЦ5о/см3; Ш ,.1(Т - последовательные десятикратные разведения вируссодержащего материала.

Все значения Ct определяли только у тех флуоресцентных сигналов, которые поднимались выше флуоресцентного фона и имели вид экспоненциальных кривых. Пробы считали отрицательными, если эмиссия красителя не превышала флуоресцентного фона.

Для оценки специфичности использованы штаммы вируса блютанга 1, 2, 4, 8, 9, 16 серотипов, штаммы New Jersey, Alberta вируса ЭГБО и A4JI (6, 8, 9 серотипов), полученные из лаборатории Музейных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ.

При проведении исследований специфичности ОТ-ПЦР в режиме реального времени был специфично выявлен вирус блютанга без ложноположительных результатов.

3.3. Модификация ОТ-ПЦР в режиме реального времени с предварительной амплификацией специфического участка кДНК

Для повышения чувствительности ПЦР в режиме реального времени использовали предварительную амплификацию искомого фрагмента Для постановки амплификации к праймеру S5 F подобран олигонуклеотид S5 Rev также на участок 5 сегмента РНК, кодирующий неструктурный белок NS1. Подбор олигонуклеотида проводили в сравнении с известными нуклеотидными последовательностями 5 сегмента, представленными в базе данных GenBank при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit», «Oligo 6.0». Праймер S5 Rev имеет следующую последовательность 5'-ТТС ССТ TCG АСА ТСС ТСС ТС-3\ Специфичность праймера была проверена с помощью интернет-сервиса BLAST. Длина синтезируемого фрагмента S5 F - S5 Rev составила 294 п.о.

После предварительной денатурации вирусной РНК в присутствии специфических праймеров S5 F - S5 Rev проводили обратную транскрипцию с последующей амплификацией на приборе «Терцик МС-2», при этом применяли следующие компоненты: буфер для обратной транскрипции - 5 мкл; dNTP (25 мМ) -0,3 мкл; Taq ДНК-полимераза- 0,1 мкл; MMlv Revertase -0,2 мкл; деионизированная вода- 3,5 мкл.

Температурные режимы амплификации: 50°С - 30 мин, 72°С-5 мин (1 цикл); 94°С - 20 сек; 58°С - 20 сек, 72°С - 20 сек (20 циклов).

Затем отбирали 10 мкл матрицы из исходной реакции и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили на термоциклерах «IQ-5» (BioRad, США) и «Rotor gene 6000» (Corbett Research, Австралия) по схеме, указанной в разделе 3.2.2.

Для сравнения аналитической чувствительности данной методики с ранее разработанной готовили также серию десятикратных разведений (10"'-10 8) культуральног вируссодержащего материала (рис.7).

Рисунок 7. Сравнительная чувствительность ОТ-ПЦР в режиме реального времени и ее модификации (п=3)

К+ - проба культурального вируссодержащего материала с титром инфекционной активности 6,5 ^ Т[Щ51/см3; К+мод - проба культурального вируссодержащего материала с титром инфекционной активности 6,5 /£ ТЦЦ5(/см3, поставленная по модифицированной методике с предварительной амплификацией; 1-пробы с разведениями Ш'-Ш4; 2- Ш5 с предварительной амплификацией; 3- 1С5 режиме реального времени; 4- 1(Т6 с предварительной амплификацией.

Данная модификация ОТ-ПЦР позволяла выявлять геном вируса блютанга в шести последовательных десятикратных разведениях культуральног вируссодержащего материала (титр 6,5 ^ ТЦД50/см3), то есть преде чувствительности составил 0,5 ^ ТЦД50/см}, что в 10 раз выше (на одно разведени больше), чем без предварительной амплификации.

3.4. Количественная оценка содержания копий специфической последовательности кДНК в пробе

Одним из достоинств ПЦР в режиме реального времени является возможность проведения не только качественного, но и количественного анализов для точного измерения количества молекул, копий специфической последовательности кДНК в пробе. Для получения стандартов кДНК, позволяющих проводить количественную

реакцию, фрагмент 5-го сегмента генома вируса блютанга клонировали в составе плазмидного вектора pDrive Cloning Vector 3,85 kb в E. coli.

Далее из исходного препарата плазмиды готовили серию десятикратных разведений с расчетным содержанием плазмиды от 2,25 х 10° до 2,25x1011 молекул/0,001см3. Предельное разведение, детектируемое прибором, составило 2,25

Рисунок 8. Титрование плазмиды для получения стандартов (п=3)

1СР-10" - последовательные десятикратные разведения плазмиды.

Таким образом, полученные разведения плазмиды можно использовать в качестве стандартов при анализе образцов, что позволяет определять общее количество молекул.

Полученную рекомбинантную плазмиду можно использовать в качестве дополнительного положительного контроля на этапе постановки амплификации. Эта система является стабильной, не разрушается при многократном оттаивании.

3.5. Определение персистенции РНК вируса блютанга в пробах крови от экспериментально зараженных животных

В рамках государственного контракта № 1208/13 от 03.06.2009г. проводились исследования по изучению персистенции вируса блютанга у экспериментально зараженных животных. Материалом служили пробы крови и патологического материала от животных, экспериментально зараженных вирусом блютанга 1, 4 и 8 серотипов, отобранные в динамике согласно календарному плану, предоставленные сотрудниками лаборатории Диагностики и ОБТК.

Пробы крови от 3 групп животных.

Группа №1 - животные, инфицированные изолятом ФКл/4-09, РФ (6,0 ТЦЦ50/мл) вируса блютанга 8 серотипа;

Группа №2 - животные, инфицированные вирусом блютанга 1-го серотип Испания, BTV-1 (6,5 lg ТЦЦ50/мл);

Группа №3 - животные, инфицированные вирусом блютанга 4-го серотип Испания, BTV-4 (6,5 lg ТЦД50/мл).

Согласно результатам проведенных исследований геном вируса блютанга пр помощи «полугнездового» варианта ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времег удалось обнаружить у телят, начиная с 3 дня после заражения и в течение 158 (тел нок №848) -171 дня (теленок №846) для группы №2, зараженных 1 серотипом; до группы №3, зараженных 4 серотипом вирус обнаруживался также начиная с 3 дня течение 139 (теленок №824) - 173 (теленок №830) дней (период наблюдения). Пр исследовании прюб крови от овец, инфицирюванных ВБ, прюшедшего пассажи на т лятах, вирусную РНК получали, начиная с 3 дня после заражения и в течение 90 дне (период наблюдения).

3.5.1. Результаты исследований проб крови от телят, инфицировании вирусом блютанга (1,4 и 8 ееротипы), в ОТ-ПЦР в режиме реального времени

Для определения количественного содержания РНК вируса блютанга организме зараженных животных брали пробы крови от телят из каждой групга Методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени были определены значения Ct пробах для каждого животного.

На основании прюведенных исследований установлено, что геном возбудите; обнаруживается в крови, начиная с 3 суток после заражения. В течение 6-7 дш происходит накопление вируса в крови, на 7-9 день наблюдается пик виремии. В эт срюки обнаруживали максимальное содержание вируса в крови, значение < соответственно уменьшается. В дальнейшем титр вируса в крови постспеш снижается до 170 дня (период наблюдения), значение Ct при этом соответствен! увеличивается (рис.9).

15 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 111 131 152 167

Дни после заражения

Рисунок 9. Диаграмма результатов исследований проб крови от телят, инфицированных ВБ (1, 4 и 8 серотипов), в ОТ-ПЦР в режиме реального времени (п=3)

1- теленок N9830, зараженный ВБ 4 серотипа; 2- теленок №16, зараженный ВБ 8 серотипа; 3- теленок №848, зараженный ВБ 1 серотипа.

3.6. Мониторинговые исследования проб крови импортированного крупного рогатого скота на блютанг, проведенные в ГНУ ВНИИВВиМ за 2008 и 2009гг

За 2008 год исследовано всего 41 323 проб крови крупного рогатого скота, завезенного из Германии, Швейцарии, Австрии, Голландии, Дании, Белоруссии, Чехии, Венгрии. Выявлено 81 положительных результатов по хозяйствам в Курской, Белгородской, Калужской, Липецкой, Ярославской, Рязанской, Московской, Тюменской областях; Ставропольском крае; Р. Башкирия; Р. Мари-Эл. Исследования проводили утвержденными тест-системами («стандартной» и «гнездовой» ОТ-ПЦР) при первичном и повторном поступлении проб.

За 2009 год исследовано 44 067 проб крови крупного рогатого скота и овец, завезенных из Венгрии, Австрии, Германии, Чехии, Голландии, Финляндии, Словакии, Монголии. Выявлено 19 положительных результатов проб крови от животных, завезенных в хозяйства Тюменской, Владимирской, Калужской областей. В качестве дополнительного метода в 2009 г. использовали разработанные «полугнездовую» ОТ-ПЦР, а также ОТ-ПЦР в режиме реального времени (табл. 3).

Таблица 3. Результаты мониторинговых исследований

Исследования за 2008г Исследования за 2009г

Метод Общее кол-во Полож. Метод исследо- Общее кол- Полож.

исследования проб вания во проб

«Стандартная» 22114 81 «Стандартная» 28447 4

ОТ-ПЦР ОТ-ПЦР

«Гнездовая» 199209 81 «Полугнездовая» 48 15

ОТ-ПЦР ОТ-ПЦР

Real-Time ПЦР 15620 19

Real-Time ПЦР с 48 19

предварительной

амплификацией

3.7. Филогенетический анализ выделенного полевого изолята ВБ

Сотрудниками лаборатории Диагностики был получен полевой изолят 8-го сер типа (ФКл/4-09), выделенный от коровы, импортированной из Голландии в Калини градскую область (колхоз «Суворовский»), При проведении нуклеотидного секвен] рования ПЦР-продукга данного изолята использовали специфические праймер 10SF-BNNS3Rev, комплементарные 10-му сегменту вируса блютанга. Длина ПЦ] продукта составила 822 п.о.

Филогенетический анализ и построение дендрограммы, характеризующей ст пень гомологии исследованного участка генома, провели с использованием програм «Mega version 3.1» и «Bio Edit». Для сравнения использованы опубликованные в ба данных GenBank последовательности полноразмерного 10 сегмента генома, код: рующего белок NS3, всех имеющихся серотипов вируса блютанга (рис. 10).

В результате проведенного анализа определена групповая принадлежнос российского изолята вируса блютанга к группе европейских и южно-африкансю изолятов, формирующих один генетический кластер 8-го серотипа данно] возбудителя, процент гомологии с которыми составляет 98%.

BTV-10 Martinique 2006 (10FMI06-33) BTV-10 USA:North Carolina 2002(10US02-9) BTV-10 USA:ldaho 2003 (10US03-25) BTV-17 USA:North Karollna 2000(17us00-5j BTV-17 USA:Idaho 2003 (17US03-13) BTV-17 USA: Kansas 2003 (17US03-10)

I BTV-13 USA:Idaho 2003 (13US03-23)

100 I BTV-13 USA:North Carolina 1999(13US99-4)

-B1V-11 USA 2009 (11B09)

100 | BTV-9 Greece 2004

I BTV-9 North Africa 2004 (vaccine) BTV-6 South Africa 1958 (5011-60E) BTV-6 USA 2006 (USA 2006/01) BTV-6 South Africa 1982 (RSAmT/06) vguyoroyskiy FKI/4^09^?

BTV-8 Germany 2007 (BH141/7) BTV-8 Netherlands 2007 (NET 2007/01) BTV-8 Switzerland 2008 (080022) BTV-8 Netherlands 2006 (BTV-6NT) BTV-8 South Africa 1982(BT8E2BHK6 12/82)

I BTV-4 South Africa 2004 (vaccine) BTV-4 Greece 1999 BTV-4 France 2003 - BTV-2 Martinique 2006 (2FMI 06-32)

100 I BTV-20 Australia 2002 (V3692)

100 ' ~

BTV-20 Australia 2002 (V3598) — BTV-3 Australia 2002 (RIVS 53)

100 ] BTV-23 Australia 2002 (RIVS 39) ' BTV-23 Australia 2002 (RIVS 60)

-BTV-21 Japan 2008

-BTV-1 Australia 2002 (RIVS 46)

100 | BTV-1 Greece 2001 (GR1472/01LS) - BTV-1 Greece 2003 (GR15/01/Gre) - BTV-16 Greece 2003 (GR308/99 RS)

100 | ВТ ol l_E

I-BTV,

I BTV-18 India 2007 (BTV 18S) J BTV-18 India 2007 (BTV 18M) I BTV-18 India 2007 (BTV 18B)

Рисунок 10. Дендрограмма, отражающая филогенетические отношения изолята ФКл/4-09 (Суворовский)

4. ВЫВОДЫ

1. На основе анализа банка нуклеотидных последовательностей подобраны уникальные праймеры, комплементарные участку 5 сегмента генома вируса блютанга, а также дополнительный специфический праймер, комплементарный участку 10 сегмента генома. Отработаны оптимальные условия постановки «полугнездовой» ОТ-ПЦР, позволяющей выявлять геном вируса блютанга в пробах крови и патологического материала.

2. Разработанная тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времен содержащая внутренний контрольный образец, позволяет выявлять наличие генои вируса блютанга с аналитической чувствительностью 1,5 lg ТЦД50/см3 (675 кого кДНК/см3) в пробах крови больных животных, начиная с 3 суток после заражения.

3. Модифицированная методика ОТ-ПЦР в режиме реального времени с предварительной амплификацией специфического участка кДНК обеспечивает увеличение пороговой чувствительности до 0,5 lg ТЦЦ50/см3.

4. Установлено, что геном вируса блютанга персистирует в организме экспериментально зараженных животных в течение 173 (КРС) и 90 (MPC) суток после заражения (период наблюдения) с пиком виремии, приходящимся на 7-9 сутки после заражения.

5. Установлено различными вариантами ОТ-ПЦР наличие генома вируса блютанга в пробах крови КРС, импортированных из Голландии, Германии, Швейцарии и Австрии. За период 2008-2009гг выявлено 100 положительных из 85390 проб крови.

6. По результатам филогенетического анализа изолят ФКл/4-09 (Суворовский), выделенный в ГНУ ВНИИВВиМ, имеет высокую степень гомологии (98%) с группой европейских и южно-африканских изолятов, формирующих один генетический кластер 8-го серотипа вируса блютанга.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана и утверждена Россельхознадзором (ПВР-1-5.0/02618 < 30.08.20010г.) тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времен позволяющая в короткие сроки выявлять геном вируса блютанга в пробах крови патологического материала при проведении мониторинговых исследований.

На основании проведенных исследований разработаны, утверждены рекомендованы для практического использования в диагностических лабораторш Российской Федерации, а также научно-исследовательских учреждениях:

1. «Методические рекомендации по выявлению генома вируса блютанга (В! методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» утверждены директором ГН ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (28.12.2009г.). Рассмотрены и одобрены на секщ «Инфекционной патологии» Отделения ветеринарной медицины РАСХ (30.09.2010г.).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мониторинг блютанга у животных, импортированных из стран ЕС/ С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов, A.B. Луницин, О.Н. Жигалева, И.М. Калабеков, О.Л. Колбасова, С.П. Живодеров, A.C. Малоголовкин, Е.А. Гаврилова// Ветеринария. -2008.-№10.-С.25-27.

2. Сравнительная оценка вариантов ПЦР-анализа для выявления генома вируса блютанга/ Е.А. Гаврилова, Д.В. Колбасов, A.C. Малоголовкин, С.Ж. Цыбанов// Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2009. -С. 83-87.

3. Сравнительная оценка различных методов выделения РНК из проб крови крупного рогатого скота для выявления генома вируса блютанга методом ОТ-ПЦР/ Е.А. Гаврилова, A.B. Панферова, A.C. Малоголовкин, А.Г. Шендрик// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию института. - Щелково,2009,- С. 328-332.

4. Панферова, A.B. Применение диагностических тест-систем для выявления генома вируса блютанга методом ПЦР в мониторинговых исследованиях/ A.B. Панферова, A.C. Малоголовкин, Е.А. Гаврилова// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию института. - Щелково,2009,- С. 301-306.

5. Monitoring and surveillance of bluetongue in Russian Federation/ D. Kolbasov, S. Tsybanov, A. Malogolovkin, A. Panfyorova, E. Gavrilova// 4^ Annual meeting Epizone «Bridges to the Future».- Saint Malo, 2010,- P.189.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области

Тираж 80 экз.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Гаврилова, Екатерина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Характеристика вируса блютанга.

1.1.1. Устойчивость к физико-химическим воздействиям.

1.1.2. Структурная организация генома и полипептидный состав вируса.

1.2. Антигенные свойства вируса блютанга.

1.3. Патогенез, тропизм, цикл репродукции вируса.

1.4. Клиническая картина блютанга.

1.4.1. Клинические признаки у КРС.

1.4.2. Клинические признаки у овец.

1.5. Эпизоотическая ситуация по блютангу в мире.

1.6. Эпизоотическая ситуация по блютангу в Европе.

1.7. Диагностика блютанга.

1.7.1. Применение ПНР в идентификации вируса блютанга.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Совершенствование средств мониторинга блютанга на основе полимеразной цепной реакции"

Актуальность

В 2006 г. в Западной Европе было зарегистрировано заболевание блютангом. В последующем установлено, что болезнь вызывается вирусом, относящимся к 8 серотипу. Актуальность блютанга для Российской Федерации значительно возросла с начала 2006 г., когда российскими внешнеторговыми организациями был начат импорт племенного крупного рогатого скота из стран Евросоюза, в том числе из неблагополучных по нему стран. Блютанг может быть занесен в Россию не только из стран Евросоюза, но и из стран Центрально-Азиатского и Дальневосточного регионов. Кроме того, на территории России есть все условия для «укоренения» заболевания. Прежде всего - это наличие различных видов мокрецов, потенциальных резервуаров и переносчиков вируса (С. йеюиЩ, С. оЪяоШш, С. риИсаггх и др), которые вызвали распространение болезни в странах Европы (Захаров В.М., 2007, 2009). В целом необходима строгая целенаправленная система, предусматривающая комплекс мер по недопущению заноса болезни, включающих раннюю диагностику, четкие схемы мониторинга и надзора, эффективные противоэпизоотические мероприятия. Согласно «Санитарному кодексу наземных животных МЭБ» основными методами диагностики блютанга при экспорте животных являются ИФА и ОТ-ПЦР. Одним из достоинств ПЦР-анализа является обнаружение вирусного генома у животных, начиная с первых дней заболевания, когда еще не сформировался иммунный ответ организма.

Таким образом, при ввозе животных из неблагополучных стран или зон, а таюке в ходе проведения противоэпизоотических мероприятий при вспышках блютанга необходимо проведение быстрых и эффективных лабораторных исследований, позволяющих в кратчайшие сроки выявить возбудитель.

Одним из перспективных направлений является использование метода ПЦР в режиме реального времени. Его принципиальной особенностью является количественная оценка динамики накопления продуктов полимеразной цепной реакции с автоматической регистрацией результатов. Он позволяет получать результат в 2-3 раза быстрее по сравнению с классической ПЦР с электрофоретической системой детекции; снижает риск контаминации, связанный с исключением 3-го этапа ПЦР (электрофореза); использование внутреннего контрольного образца (ВКО) позволяет проследить прохождение реакции в каждой пробе, что согласно новым рекомендациям МЭБ (OIE, 2008) является необходимым условием при создании тест-систем на основе ПЦР.

Цель и задачи исследований

Целью данной работы является совершенствование и разработка молекулярно-биологических средств мониторинга блютанга в пробах крови и патологического материала на основе полимеразной цепной реакции.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать специфические праймеры и олигонуклеотидные зонды для идентификации генома вируса блютанга.

2. Разработать тест-систему на основе метода ПЦР в режиме реального1 времени для идентификации генома вируса блютанга, содержащую внутренний контрольный образец (ВКО), при исследовании материала от инфицированных животных.

3. Провести сравнительное изучение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем с использованием праймеров, комплементарных различным участкам генома вируса блютанга.

4. Провести мониторинговые исследования на наличие генома вируса блютанга в пробах крови, взятых от импортированных животных, с использованием разработанных тест-систем.

Научная новизна работы

Подобраны специфические олигонуклеотиды к различным сегментам генома вируса блютанга, использование которых в ПНР позволяет выявлять вирус в низкой концентрации.

Разработана «Тест-система» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакции в режиме реального времени для выявления генома вируса блютанга с использованием внутреннего контрольного образца. Показана высокая чувствительность метода, которая составила 1,5 ^ ТЩЬо/см3. Модифицированная методика ОТ-ПЦР в режиме реального времени с предварительной амплификацией специфического участка кДНК позволила повысить чувствительность метода до 0,5 ^ ТЦД50/см3.

Практическая значимость

Разработанная «Тест-система для выявления генома вируса блютанга (ВБ) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» утверждена Россельхознадзором (ПВР-1-5.0/02618 от 30.08.2010г.) и внедрена в практику для выявления РНК вируса блютанга в пробах крови, патологического материала и в инфицированных культурах клеток.

Для использования ветеринарнойшрактикой разработаны «Методические рекомендации по выявлению генома вируса блютанга (ВБ) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени», утверждены директором ГНУ ВНИИВВйМ Россельхозакадемии (28; 1212009 г.), а также рассмотрены и одобрены на секции «Инфекционной патологии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (30.09.2010г.).

Публикации результатов исследований По теме диссертации опубликовано: 5 научных статей, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ. '

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВйМ (2008-2010 гг.).

Материалы» диссертации доложены на конференции молодых ученых. ГНУ ВНИИВВйМ Россельхозакадемии «Актуальные проблемы инфекционной, патологии ветеринарной медицины» (г. Покров, 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной! 40-летию ВНИТИБП (г. Щелково, 2009г.).

Основные положения, выносимые иа защиту:

1. Получена«. тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени, содержащая внутренний контрольный образец; для идентификации генома вируса блютанга в пробах крови и патологического материала от инфицированных животных.

2: Установлена; чувствительность и специфичностьусовершенствованных и разработанных тест-систем с использованием праймеров, гомологичных различным; сегментам генома вируса блютанга.

3. Получены данные мониторинговых исследований распространения блютанга на территории РФ с использованием разработанных тест-систем на основе ОТ-ПЦР.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация изложена на 145 страницах, включая приложение. Иллюстрирована 26 таблицами и 28 рисунками. Список литературы включает 135 источников, в том числе 99 зарубежных авторов.

Личный вклад автора в выполнении работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.б.н. Малоголовкин A.C. (освоение молекулярно-биологических методов, клонирование рекомбинантной плазмиды). Часть работы по выделению вируса выполнена совместно с аспирантом лаборатории Диагностики Вялых И.В. и сотрудником Отдела биологического и технологического контроля (ОБТК) Бобровской Н.К.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Гаврилова, Екатерина Анатольевна

5. ВЫВОДЫ

2. Разработанная тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени, содержащая внутренний контрольный образец, позволяет выявлять наличие генома вируса блютанга с аналитической чувствительностью 1,5 lg

3 3

ТЦД50/см (675 копии кДНК/см ) в пробах крови больных животных, начиная с 3 суток после заражения.

3. Модифицированная методика ОТ-ПЦР в режиме реального времени с предварительной амплификацией специфического участка кДНК, л обеспечивает увеличение пороговой чувствительности до 0,5 lg ТЦД50/см .

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана и утверждена Россельхознадзором (ПВР-1-5.0/02618 от 30.08.2010г.) тест-система на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющая в короткие сроки выявлять геном вируса блютанга в пробах крови и патологического материала при проведении мониторинговых исследований.

На основании проведенных исследований разработаны, утверждены и рекомендованы для практического использования в диагностических лабораториях Российской Федерации, а также научно-исследовательских учреждениях:

1. «Методические рекомендации по выявлению генома вируса блютанга (ВБ) методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (28.12.2009г.). Рассмотрены и одобрены на секции «Инфекционной патологии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (30.09.2010г.).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Гаврилова, Екатерина Анатольевна, Покров

1. Анализ риска заноса блютанга (катаральной лихорадки овец) со скотом, импортируемым в Россию из стран Западной Европы/ А.К. Караулов,

2. B.М. Гуленкин, М.А. Титов, В.М. Захаров, Н.С. Дудникова, CA. Дудников// Российский ветеринарный журнал СХЖ. — 2008. — Спец.выпуск сентябрь.1. C.33-35.

3. Блютанг скрытая угроза/ Д.В. Кол басов, A.A. Коломыцев, К. А. Снетков, A.B. Книзе, С.А. Коломыцев// Ветеринарная жизнь. - 2006. - №17. -С.6.

4. Блутанг (катаральная лихорадка овец)// Российский ветеринарный журнал СХЖ. 2008. - Спец. выпуск. - сентябрь. - С.49-50.

5. Вирусные болезни животных/ В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина.- М.: ВНИТИБП, 1998.- 928с.

6. Вспышка катаральной лихорадки овец в Бурятии/ В.П. Левченко, Г.А. Угрюмов, В.Г. Гончиков, Б.Б. Цыдыпов, А.К. Пуев, М.Г. Штыбова, Д.А. Петухов// Ветеринария. 1995. - №4. - С.7-8.

7. Захаров, В.М. Комплексность мер по предотвращению заноса и распространения блютанга в Российской Федерации/ В.М. Захаров// Ветеринария. 2009. - №5. - С.3-5.

8. Идентификация и типирование вируса катаральной лихорадки овец/ И.Ф. Вишняков, A.A. Стрижаков, М.Б.Новикова, А.В.Луницин, В.В. Куриннов, Г.М. Карпов, В.И. Балышева, К.С. Волокитина// Ветеринария. -1995. -№4.-С.20-25.

9. Луницин, A.B. Блютанг продвигается на восток эффективные методы его предотвращения/ A.B. Луницин// Ветеринарная жизнь. - 2008. -№21. - С.З.

10. Метод ингибирования ИФА для серологического мониторинга блютанга/ A.A. Стрижаков, М.Б. Новикова, В.В. Куриннов, A.B. Луницин// Ветеринария. 2003. - №12. - С.23-25.

11. Митрофанов, П.М. Патологоанатомическая диагностика малоизвестных инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. -Саранск, 1997.- 105с.

12. Сборник статей Международной научно-практической конференции/ ГНУ ВНИИВВиМ.- Покров, 2000. С. 143-146.

13. Новикова, М.Б. Непрямой вариант ТФ ИФА для выявления антител, специфичных к вирусу KJIO/ М.Б. Новикова, И.Ф. Вишняков, Б.В. Новиков// Институт экспериментальной ветеринарной медицины: информ. бюл. 1994. — Харьков, 1995.-С.55.

14. Особо опасные болезни животных. Справочник/ И.А. Бакулов, В.М. Котляров, A.C. Донченко, И.Ю. Хухоров, С.Ф. Терновая, A.B. Книзе.- Покров-Новосибирск, 2002. С.99-109.

15. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)/ H.A. Федоров, Ю.С. Суханов, А.Х. Асади Мобархан, М.И. Артемьев,- М., 1996.- С.36.

16. ПЦР «в реальном времени»/ Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семенов, A.M. Савилова, И.А. Кофиади, Д.Д. Абрамов.-М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009.- 223с.

17. Распространение блютанга в Европе и его реальная угроза для животноводства России/ В.М. Захаров, В.М. Гуленкин, А.К. Караулов, С.А.Дудников// Российский ветеринарный журнал. 2007. - №4. - С.4-6.

18. Система эпизоотологического мониторинга особо опасных экзотических, малоизученных, в том числе зооантропонозных болезней животных/ И.А. Бакулов, A.B. Книзе, В.М. Котляров, И.В. Дмитренко, A.A. Коломыцев, A.JI. Семенихин. М., 2001. - 76с.

19. Снетков, К.А. Идентификация возбудителей блютанга и эпизоотической геморрагической болезни оленей с помощью ПЦР: Дис.канд. биол. наук 03.00.06/ Константин Александрович Снетков -Покров, 2003.-116с.

20. Спрыгин, А.В. Разработка методов диагностики микоплазмозов кур и изучение изолятов Mycoplasma gallisepticum, выявленных на территории Российской Федерации: Дис.канд. биол. наук 03.00.23/ Александр Владимирович Спрыгин Щелково, 2009. - 144с.

21. Стрижаков, А.А. Получение и использование моноклональных антител к вирусу KJIO: автореф. дис. канд. биол. наук 03.00.06/ Всерос. НИИ вет. вирусологии и микробиологии. Покров, 1994 - 25с.

22. Стрижаков, А.А. Создание средств эпитопного анализа структурных и неструктурных полипептидов вируса блютанга/ А.А. Стрижаков// Вестник РАСХН. 2003. - №3. - С.63-66.

23. Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология/ В.Н. Сюрин, Н.Ф. Фомина,-М.: Колос, 1979.- С. 174-181.

24. Сюрин, В.Н. Диагностика вирусных болезней животных. Справочник/ В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина.- М.: ВО Агропромиздат, 1991.- С.254-270.

25. Сэндвич-метод твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител для обнаружения антигенов вируса блютанга/

26. A. А. Стрижаков, М.Б. Новикова, В.В. Куринов, А.В. Луницин// Сельскохозяйственная биология. 2003. - №4. — С. 114-120.

27. Тимина, A.M. Разработка ПЦР в реальном времени для выявления и количественной оценки Mycoplasma hyopneumoniae/ A.M. Тимина, М.В. Челышева, А.В. Щербаков// Российский ветеринарный журнал СХЖ. 2008. -Спец.выпуск .— сентябрь. - С.53-55.

28. Шоопала, Д. Особенности проявления инфекционной катаральной лихорадки овец в Намибии/ Д. Шоопала// Ветеринария. 2005. - №12. - С.22-23.

29. Шуляк, Б.Ф. Блутанг новая угроза животноводству России?/ Б.Ф. Шуляк // Российский ветеринарный журнал. - 2007. - №1. - С.2-3.

30. Эпизоотология и меры борьбы с блютангом/ А.А. Стрижаков, Н.И. Закутский, А.А. Коломыцев, А.В. Книзе// Ветеринария. 2008. - №8. - С. 1822.

31. Эпизоотологический лексикон: учебное пособие для с.-х. вузов/

32. B.В. Макаров, А.А. Гусев, Е.В. Гусева, О.И. Сухарев. М.: Колосс, 2001. -176с.

33. A comparison of different orbivirus proteins that could affect virulence and pathogenesis/ H. Huismans, V. Van Staden, W.C. Fick, M. van Niekerk, T.L. Meiring //Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N4. - P.417-425.

34. A possible overwintering mechanism for bluetongue virus in the absence of the insect vector/ H. Takamatsu, P.S. Mellor, P.C. Mertens, P.A. Kirkham, J.N. Burroughs, M.E. Parkhouse// J. Gen. Virol. 2003. -Vol.84, N1. - P.227-235.

35. Abu Elzein, E.M.E. Bluetongue in Sudan/ E.M.E. Abu Elzein// Rev. sci. tech. OffintEpiz. 1985. - Vol.4, N4. -P.795-801.

36. Alexander, G.I. Bluetongue research in Australia —1993/ G.I. Alexander, G. Gpgard // Australian Veterinary Journal.- 1994.- Vol.71, N6.-P.182-183.

37. Bandyopadhyay, S.K. Detection of bluetongue vims genome segment 6 sequences by RT-PCR/ S.K. Bandyopadhyay, R.S. Kataria, A.K. Tiwari// Indian J. of Experimental Biology. 1998. - Vol.36.- P. 1034-1037.

38. Barrat-Boyes, S.M. Pathogenesis of bluetongue virus infection of cattle/ S.M. Barrat-Boyes, N.J. MacLachlan// J. Am. Vet. Med. Assoc. 1995. -N206. -P.1322-1329.

39. Bexiga, R. Differential diagnosis of bluetongue 8/ R. Bexiga, H. Guyot, G. Saegerman // Bluetongue in northern Europe. 2008.- P.57-68.

40. Bluetongue in Northern Europe/ E. Thiry, C. Saegerman, H. Guyot, M. Bodmer et al.// Vet.Rec.- 2006.- P. 159,327.

41. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two different genomic segments/ J.F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq //J. of Virological Methods. 2007. -N140. - P.l 15-123.

42. Bluetongue virus isolations from midges belonging to the Obsoletus complex (Culicoides, Diptera: Ceratopogonidae) in Italy/ G. Savini, M. Goffredo, F. Monaco, A. Di Gennaro, M.A. Cafiero et al.//Vet. Rec. 2005. - N157. - P. 133139.

43. Bluetongue virus isolations from vectors and ruminants in Central America and the Caribbean/ C.L. Mo, L.Ii. Thompson, E.J. Homan et al.// Am. J. Vet. Res. 1994. - Vol.55, N2. - P.211-215.

44. Bluetongue virus replication, molecular and structural biology/P.P.C. Mertens, J. Diprose, S. Maan, K.P. Singh, H. Attoui and A.R. Samuel// Vet. Ital. -2004. Vol.40, N4. - P.426-437.

45. Bluetongue Virus Structural Components/ H. Huismans, A.A. Van Dijk// Current Topics in Microbiology and Immunology.- 1990.- Vol.162.- P.21-41.

46. Bluetongue virus surveillance in a newly infected area/ A.Giovannini, P.Calistri, A. Conte, L. Savini, D. Nannini, C. Patta, U. Santucci and V. Caporale //Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P.188-197.

47. Bluetongue virus: European Community inter-laboratory comparison tests to evaluate ELISA and RT-PCR detection methods/C.A. Batten, K. Bachanek-Bankowska, A. Bin-Tarif, L. Kgosana, A.J. Swain et al//Vet. Microbiol. 2007. -nov. — P. 17.

48. Bluetongue: Laboratory diagnosis/ K. De Clercq, F. Vandenbussche, V T. anbinst, E. Vandemeulebroucke, N. Goris, S. ZientaraII Bluetongue in northern Europe. 2008,- P.68-80.

49. Brewer, A.W. The pathogenesis of bluetongue virus infection of bovine blood cells in vitro: ultrastructural characterization/ A.W. Brewer, N.J. MacLachlan// Arch. Virol. 1994. - Vol.136, N3-4. - P.287-298.

50. Brightwell, G. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis/ G. Brightwell, M. Pearce, D. Leslie// Mol. Cell. Probes. 1998. - Vol.12. -P.367-377.

51. Campbell, C.H. Current Knowledge on the Biochemistry and Immunology of Bluetongue/ C.H. Campbell, J. Marvin and Grubman// Prog. Vet. Microbiol. Immun.- 1985.- Vol.1.- P. 58-79.

52. Climate change and the recent emergence of bluetongue in Europe/ B.V. Purse, P.S. Mellor, D.J. Rogers, A.R. Samuel, P.P. Mertens and M. Baylis// Nat. Rev. Microbiol. 2005.- Vol.3, N2. -P.171-181.

53. Clinical aspects of bluetongue in ruminants/ H. Guyot, A. Mauroy, N. Kirschvink, F. Rollin, C. Seagerman// Bluetongue in northern Europe. 2008.-P.34-53.

54. Comparison of genome segments 2, 7 and 10 of bluetongue viruses serotype 2 for differentiation between field isolates and the vaccine strain/ E. Breard, C. Sailleau, H. Coupier, K. Mure-Ravaud, S. Hammoumi et al.//Vet Rec.2003. Vol.34, N6. - P.777-789.

55. Detection of bluetongue virus in clinical samples by polymerase chain reaction/ G.Y. Akita, J. Glenn, A.E. Castro, B.I. Osburn// Journal-of-Veterinary-Diagnostic-Investigation.- 1993.- Vol.5, N2.- P.154-158.

56. Detection of bluetongue virus serogroup by polymerase chain reaction/ G.Y. Akita, J. Chinsangaram, B.I. Osburn, M. Ianconescu, R. Kaufman //Journal-of-Veterinary-Diagnostic-Investigation.- 1992.- Vol.4, N4.- P.400-405.

57. Differential diagnosis of bluetongue virus using a reverse transcriptase-polymerase chain reaction for genome segment 7/ S. Anthony, S. Maan, A.R. Samuel, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N4. - P.546-551.

58. Differentiation between field and vaccine strain of bluetongue virus serotype 16/ F. Monaco, C. Camma, S. Serini and G. Savini // Vet. Microbiol. — 2006.-N116.-P.45-52.

59. Differentiation of Italian field and South African vaccine strains of bluetongue virus serotype 2 using real-time PCR/ G. Orru, P.D. Santis, E. Solinas, G. Savini, V. Piras and V. Caporale // J. Virol. Methods. 2004. - N122. - P.37-43.

60. Distribution of bluetongue in the United States of America, 1991-2002/ E.N. Ostlund, K.M. Moser, D.J. Johnson, J.E. Pearson, B.J. Schmitt // Vet. Ital.2004. Vol.40,N3. - P.83-88.

61. Eaton, B.T. Developing new orbivirus diagnostic platforms/ B.T. Eaton and G.R. White // Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N.4 - P.525-530.

62. Emergence of bluetongue in the Mediterranean Basin and Entomological surveillance in France/ T. Baldet et al.// Rev. clevage Med. Veter. Pays. Trop. 2005. - Vol.58, N3. - P.125-132.

63. Epidemiological surveillance of bluetongue in Sicily/ S. Caracappa, M. Bagnato, P. Sghembry, A. Guercio et al.// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P. 124130.

64. First occurrence of Culicoides obsoletus-transmitted Bluetongue virus epidemic in Central Europe/ H. Mehlhom, V. Walldorf, S. Klimpel, B. Hahn, F. Jaeger, J. Eschweiler, B. Hoffmann and M. Beer// Parasitol. Res. 2007. - Vol.101, N1. -P.219-228.

65. Fukusho, A. Variation in the bluetongue virus neutralization protein VP2/ A. Fukusho, G.D. Ritter, P. Roy// J. Gen. Virol.- 1987,- Vol.68.- P. 29672973.

66. Genetic Characterization of Toggenburg Orbivirus, a new Bluetongue virus, from goats, Switzerland/ M.A. Hofmann, S. Renzullo, M. Mader, V. Chaignat et al.// Emerging Infectious Diseases.- 2008.- Vol.14, N13. P.1855-1861.

67. Gomez-Tejedor, C. Brief overview of bluetongue situation in Mediterranean Europe, 1998-2004/ C. Gomez-Tejedor// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P.57-60.

68. Gorman, B.M. The bluetongue viruses/ B.M. Gorman //Current topics in Microbiology and Immunology. 1990. - Vol.162 - P. 1-19.

69. Gould, A.R. Relationships amongst bluetongue viruses revealed by comparisons of capsid and outer coat protein nucleotide sequences/ A.R. Gould and L.I. Pritchard //Finis Res. 1990. -N17. -P.31-52.

70. Grubman, M.J. Identification of bluetongue virus type 17 genome segments coding for polypeptides associated with virus neutralization andintergroup reactivity/ M.J. Grubman, J.A. Appleton, C.J. Letchworth // Virology.-1983.- Vol.131.-P.355-366.

71. Hamblin, C. Bluetongue virus antigen and antibody detection, and the application of laboratory diagnostic techniques/ C. Hamblin// Vet. Ital. 2004. -N40. - P.538-545.

72. Huismans, H. Control of transcription during the expression of the bluetongue virus genome/ H. Huismans, D.W. Verwoerd // Virology.- 1973.- Vol. 52,- P.81-88.

73. Hwang, G.Y. Analyses and conservation of sequences among the cognate L3 segments of the five United States bluetongue viruses/ G.Y. Hwang, M. Xiang, J.K.K. Li// Virus-Research.- 1994.- Vol.32, N3.- P.381-389.

74. Identification and characterization of conserved and variable regions in the neutralization VP2 gene of bluetongue virus/ H. Ghiasi, A. Fukusho, Y. Eshita and P. Roy//Virology. 1987.-N160.-P. 100-109.

75. Identification of a novel bluetongue virus vector species of Culicoides in Sicily/ S. Caracappa, A. Torina, A. Guercio, R. Vitale, A. Calabro, G. Purpari et al// Vet. Rec.- 2003.- Vol.153, N3. -P.71-74.

76. Isolation of bluetongue virus serotype 12 from an outbreak of the disease in South America/ A. Clavilo et al.// Vet. Rec. 2002. - Vol.151, N10. -P.301-302.

77. Johnson, D.J. Validation of a reverse transcriptase multiplex PCR test for the serotype determination of U.S. isolates of bluetongue virus/ D.J. Johnson, W.C. Wilson, P.S. Paul //Vet. Microbiology. -2000. -N76. -P.105-115.

78. Kirkland, P.D. Bluetongue viruses, vectors and surveillance in Australia the current situation and unique feature/ P.D. Kirkland// Vet. Ital. - 2004. - Vol.40, N3. - P.47-50.

79. La fievre catarrhale ovine (bluetongue): quand une maladie du sud s"invite au nord/E. Albina, S. Zientara, C. Sailleau, A. Perrin, C. Cetre-Sossah, E. Breard, C. Grillet //Virology. 2007. -Nil.- P.63-74.

80. Lager, I.A. Bluetongue virus in South America: overview of viruses, vectors, surveillance and unique features/ I.A. Lager // Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P.89-93.

81. Lecatsas, G. Electron microscopic study of the formation of bluetongue viruses/ G. Lecatsas // Onderstepoort J. Vet. Res.- 1968.- Vol. 35.- P.139-149.

82. MacLachlan, N.J. Bluetongue and equine viral arteritis viruses as models of virus-induced fetal injury and abortion/ N.J. MacLachlan, A.J. Conley and P.C. Kennedy// Anim. Repwd. Sci. 2000.- N.60-61. - P.643-651.

83. MacLachlan, N.J. Bluetongue: pathogenesis and duration of viremia/ N.J. MacLachlan //Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N4. - P.462-467.

84. MacLachlan, N.L. The pathogenesis and immunology of bluetongue virus infection of ruminants/ N.L. MacLachlan //Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1994. -N17. -P.197-206.

85. McColl, K.A. Bluetongue virus infection in sheep: haematological changes and detection by polymerase chain reaction/ K.A. McColl and A.R. Gould// Aust. Vet. J. 1994. - N71. - P.97-101.

86. Meiswinkel, R. Potential new culicoides vector in northern Europe/ R. Meiswinkel, P. van Rijn, P. Leijs// Vet. Rec. 2007. -N161. - P. 564-565.

87. Mellor, P.S. Bluetongue virus in the Mediterranean basin 1998-2001/ P.S. Mellor and E. Wittmann //Vet. J. 2002. - Vol.164. - P.20-37.

88. Mellor, P.S. Infection1 of the vectors and bluetongue epidemiology in Europe/ P.S. Mellor // Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P. 167-174.

89. Mellor, P.S. The Replication of Bluetongue Virus in Culicoides Vectors/ P.S Mellor// Current Topics in Microbiology and Immunology.- 1990.- Vol. 162.-P.143-161.

90. Mellor, P.S. The transmission and geographical spread of African horse sickness and bluetongue viruses/ P.S. Mellor and J. Boorman //Ann. Trop. Med. Parasitol.- 1995. Vol.89-P. 1-15.

91. Melville, L.F. Bluetongue surveillance methods in an endemic area: Australia/ L.F. Melville// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P. 184-187.

92. Mertens, P.P. Assignment of the genome segments of bluetongue virus type 1 to the proteins which they encode/ P.P. Mertens, F. Brown and D.V. Sangar// Virology. 1984. -N135. -P.207-217.

93. Murray, M.D. The seasonal abundance offemal biting-midges, Culicoides brevitarsis (Diptera, Ceratopogonidae), in coastal south-eastern Australia/ M.D. Murray // Aust. J. loot. 1991.- N39. - P.333-342.

94. Nomikov, K. Overview of bluetongue in Greece/ K. Nomikov, O. Mangana-Vougiouka and D.H. Panagiotatos //Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. -P.108-116.

95. OIE quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: infectious diseasis. OIE, Paris, 2008.

96. Osburn, B.I. Bluetongue virus/ B.I. Osburn //Veterinary-Clinics-of-North-America-Food-Animal-Practice. 1994. - Vol.10, N3. -P.547-550.

97. Polymerase chain reaction and non radio labeled DNA probe for detection of BTV/ Y. Malik, G. Prasad, Minakshi and S. Maan// Indian J. of Animal Sciences. 2001.- Vol.71, N5. - P.405-409.

98. Ramadevi, N. Bluetongue virus core protein VP4 has nucleoside triphosphate phosphohydrolase activity/ N. Ramadevi, P. Roy// J. Gen. Virol. -1998. Vol.79, N10. - P.2475-2480.

99. Rapid and simple method for purification of nucleic acids/ R. Boom, S.J.A. Sol, M.M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M.E. Wertheim-van Dillen and J. van der Noordaa// J. of Clinical Microbiology. 1990. - Vol.28, N3. -P.495-503.

100. Rapid detection and quantitation of bluetongue virus (BTV) using a Molecular Beacon fluorescent probe assay/ G. Orru, M.L. Ferrando, M. Meloni, M. Liciardi, G. Savini, P. De Santis // Journal of Virological Methods. 2006. - N137. - P.34-42.

101. Regional overview of bluetongue viruses in South-East Asia: viruses,vectors and surveillance/ P.W. Daniels, I.Sendow, L.I. Pritchard, Sukarsih and B.T. Eaton // Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P.94-100.

102. Results of current surveillance of likely bluetongue virus vectors of the genus Culicoides in Catalonia, Spain/ V. Sarto i Monteys, C. Aranda, R. Escosa, N. Pages and D. Ventura// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P. 130-133.

103. Rossmann, M.G. Courageous science: structural of bluetongue virus core/ M.G. Rossmann and Y. Tao// Structure.- 1999.- Vol.7.- N3.- P.43-46.

104. Roy, P. Bluetongue virus genetic and genome structure/P. Roy// Virus Research.- 1989.- Vol.13, N3,- P.179-206.

105. Roy, P. Bluetongue virus proteins/ P. Roy// Gen. Virol. 1992. - N73. -P.3051-3064.

106. Roy, P. Structure of the bluetongue virus genome and its encoded proteins/ P. Roy, J.J. Marshall, T.J. French // Curr. ToP. Microbiol. Immunol. -1990. -N162. -P.43-87.

107. Seagerman, C. Bluetongue: Epidemiology in the European Union/ C. Seagerman, D. Berkvens, Ph. Mellor // Bluetongue in northern Europe. 2008. -P. 13-24.

108. Segment 10 based molecular epidemiology of bluetongue virus (BTV) isolates from Turkey: 1999-2001/ A. Ozkul, A. Erturk, E. Caliskau, F. Sarae, C. Ceylan et al.// Virus Rec. 2009. - Vol.142, N1-2. - P. 134-139.

109. Sequence analysis of the S10 gene of six Bluetongue virus isolates from India/ G.S. Desai, M. Hosamane, R.S. Kataria, S.S. Patil, K. Prabhudas et al.// Trasbound Emerg Dis. 2009. - Vol.56, N8. - P.329-336.

110. Serogrouping of United States and some African serotypes of bluetongue virus using RT-PCR/ I.E. Aradaib, M.E. Mohamed, T.M. Abdalla, J. Sarr, M.A. Abdalla et al.// Vet. Microbiol. 2005. - N111(3-4). - P.145-150.

111. Singer, R.S. Maximal predicted duration of viremia in bluetongue virus-infected cattle/ R.S. Singer, N.J. MacLachlan, T.E. Carpenter// J. Vet. Diagn. Invest. 2001. -N13. -P.43-49.

112. Tabachnick, W.J. Culicoides and the global epidemiology of bluetongue virus infection/ W.J. Tabachnick// Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. - P.145-150.

113. Taylor, W.P. The epidemiology of Bluetongue/ W.P. Taylor// Rev. sci. tech. Off int. Epiz. 1986. - Vol.5, N2. -P.351-356.

114. The atomic structure of the bluetongue virus core/ J.M. Grimes, J.N. Burroughst, P. Gouet, J.P. Diprose, P. Malby, S. Zientara, P.P.C. Mertens; D.I. Stuart//Nature.- 1998.- Vol.395, N1.- P.138-146.

115. The current situation of bluetongue in Turkey/ A. Erturk, N. Tatar, O. Kabakli, S. Incoglu, S.G. Cizmeci and F.M. Barut //Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. -P.137-140.

116. The epizootiological occurrence of bluetongue in the central Balkans/ B. Djuricic, D. Nedic, D. Lausevic and M. Pavlovic // Vet. Ital. 2004. - Vol.40, N3. -P.105-107.

117. The membrane trafficking protein calpactin forms a complex with bluetongue virus protein NS3 and mediates virus release/A.R. Beaton, J. Rodriguez, Y.K. Reddy, P. Roy// Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 2002.- Sep. 16.

118. Thiry, E. Bluetongue: virology, pathogenesis and biology of the culicoides vector/ E. Thiry, J.Y. Zimmer, E. Haubruge // Bluetongue in northern Europe 2008. - P.3-13.

119. Verwoerd, D.W. Characterization of Bluetongue Virus Ribonucleic Acid/ D.W. Verwoerd, H. Louw, and R.A. Oellermann // Journal of Virology.-1970,- Vol.5, N1.- P.1-7.

120. Verwoerd, D.W. Purification and characterization of bluetongue virus/ D.W. Verwoerd// Virology. 1969. -N38. -P.203-212.

121. Wade-Evans, A.M. Development of the polymerase chain reaction for the detection of bluetongue virus in tissue samples/ A.M. Wade-Evans, P.P. Mertens and C.J. Bostock //J. Virol. Methods 1990. -N30. - P. 15-24.

122. Ward, M.P. The epidemiology of bluetongue virus in Australia a review/ M.P. Ward // Austr. Vet. J. - 1994. - Vol.71, N1. - P.3-7.

123. Wilson, W.C. Nested and multiplex polymerase chain reactions for the identification of bluetongue virus infection in the biting midge, Culicoides variipennis/ W.C. Wilson and C.C. Chase// J. Virol. Methods 1993. - N45. - P.39-47.

124. Wittmann, E. J. Effect of temperature on the transmission of orbiviruses by the biting midge, Culicoides sonorensis/ E. J. Wittmann, P. S. Mello, M. Baylis// Med. Vet. EntomoL- 2002.- N2.- P. 147-156.

125. Yongue, A.D. Bluetongue in western Turkey/ A.D. Yongue, W.P. Taylor// Vet. Rec. 1982. - Vol.111, N7. - P. 144-146.

Информация о работе

Гаврилова, Екатерина Анатольевна
кандидата ветеринарных наук
Покров, 2010
ВАК 06.02.02

Диссертация

Совершенствование средств мониторинга блютанга на основе полимеразной цепной реакции - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы