Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Усовершенствование системы лабораторной диагностики Блютанга
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов
Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование системы лабораторной диагностики Блютанга"
На правах рукописи
Вялых Иван Владимирович
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БЛЮТАНГА
06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
Покров-2011
1 6 июн 2011
4850472
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)
Научный руководитель:
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)
Новикова Марина Борисовна
Официальные оппоненты:
доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник
Кушнир Анатолий Тимофеевич
(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)
доктор ветеринарных наук,
Мищенко Владимир Александрович
профессор (ФГУ «ВНИИЗЖ»)
Ведущая организация:
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ), г. Москва.
Защита диссертации состоится «16» июня 2011 г. в «И30» ч. на заседании диссертационного совета Д.006.003.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская обл., Петушинский район, г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел/факс: (49243) 62125 7 л
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.
Автореферат разослан «12» мая 2011 г. и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru
Ученый секретарь
диссертационного совета
ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,
кандидат биологических наук
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность темы
В настоящее время блютанг зарегистрирован на всех континентах, где развито овцеводство. Блютанг наносит овцеводству многих стран мира огромный экономический ущерб [Savini G. et al., 2004,. Meiswinkel R. et al., 2008., Papadopoulos O. et al., 2008].
При выполнении с 2006 года приоритетного национального проекта «Развитие АПК» основным экспортером племенного скота в нашу страну оказались европейские страны. В конце того же года ряд европейских стран объявили о своем неблагополучии по блютангу 8 серотипа, в том числе Германия и Нидерланды [МЭБ: [сайт]. URL: http://www.oie.int]. За период с 2006 по 2010 гг. было импортировано более 120 тыс. животных в хозяйства, расположенные на всей европейской территории РФ, Урала и Сибири.
В настоящее время система диагностики блютанга, как совокупность связанных между собой вирусологических и серологических методов, основана на выявлении специфических антигенов и антител у наиболее восприимчивых к нему животных - овец, инфекция у которых обычно протекает в острой и подострой форме, и включает комплекс методов выделения вируса с использованием мышат-сосунов и культуры клеток.
Несмотря на имеющиеся в научной литературе данные о биологии вируса, роль крупного рогатого скота в распространении инфекции и вопросы выделения вируса от него пока в России не изучали.
Необходимость совершенствования средств и методов диагностики с учетом новых достижений науки и постановки диагноза при бессимптомном течении болезни у крупного рогатого скота поставило перед нами задачу разработки усовершенствованной системы диагностики блютанга у жвачных животных.
1.2 Степень разработанности проблемы
Среди отечественных ученых проблему выделения вируса блютанга изучали Вишняков И.Ф., Стрижаков A.A., Новикова М.Б. и др. [1], Хижинский П.Г. [2].
Оценку различных методов выделения вируса блютанга проводили Foster
N.M. et al. [10], Howard Т.Н. et al. [12], Gard G.P. et al. [11], Wechsler S.J. и Luedke
AJ. [18], Billinis C. et al. [5]. Как правило, в данных работах сравнивали только
методы выделения вируса с использованием куриных эмбрионов и различных
культур клеток. При этом отсутствуют данные по комплексной сравнительной
3
оценке методов с использованием куриных эмбрионов и культуры клеток, применяемых согласно рекомендациям МЭБ, и метода с использованием новорожденных мышат-сосунов, успешно применявшегося многими исследователями, в том числе и в России.
Длительность виремии у овец и крупного рогатого скота изучали MacLachlan N.J. et al. [6, 17], Foster N.M. et al. [16], Barratt-Boyes S.M. и MacLachlan N.J. [4], Koumbati M. et al. [7], Bonneau K.R. et al. [8], Singer R.S. et al. [14], однако исследования в течение длительного периода после заражения животных (более 3-4 месяцев) в литературе практически не описаны.
В России разработкой методов ТФ ИФА на основе моноклональных антител для диагностики блютанга занимался Стрижаков А.А. [3]. Иммунный ответ у крупного рогатого скота и овец при инфицировании вирусом блютанга описан в работах Stott J.L. и Osbum B.I. [15], Foster N.M. et al. [16], Shringi S. и Shringi B.N. [13], Dal Pozzo F. et al. [9]. В данных работах не проводили исследований сывороток на наличие антител параллельно РН, РДСК и конкурентным ТФ ИФА.
1.3 Цель и задачи исследования
В соответствии с вышеизложенным целью наших исследований являлось усовершенствование системы лабораторной диагностики блютанга овец и крупного рогатого скота.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- дать сравнительную оценку методов выделения вируса блютанга с использованием куриных эмбрионов, мышат-сосунов и культур клеток;
- определить уровень и длительность виремии у крупного рогатого скота и овец после их экспериментального заражения вирусом блютанга 1 и 8 серотипов;
- определить динамику накопления антител у крупного рогатого скота и овец после их экспериментального заражения вирусом блютанга 1 и 8 серотипов;
- определить диагностические характеристики серологических методов;
- внести изменения в существующую систему лабораторной диагностики блютанга.
1.4 Научная новизна результатов исследования
Впервые выделено 5 новых изолятов вируса блютанга 8 серотипа от крупного рогатого скота, импортированного из Нидерландов и Германии в
хозяйства Курской, Калининградской и Нижегородской областей РФ, в том числе 2 - от рожденных от них телят.
Установлено, что эффективность выделения вируса блютанга из проб крови и органов овец и крупного рогатого скота с использованием куриных эмбрионов в 30-100 раз превышает ранее применявшиеся методы с использованием мышат-сосунов и культуры клеток.
Изучены иммунобиологические свойства выделенного вируса блютанга (штамм ФКл/4-09) в сравнении с вирусом блютанга 8 серотипа, выделенным в Нидерландах, и 1 серотипа, выделенным в Испании.
1.5 Практическая значимость работы
Выделены от импортированного крупного рогатого скота, паспортизированы и заложены в коллекцию ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии новые штаммы вируса блютанга (ФК/1-08, ФК/2-09, ФК/3-09, ФКл/4-09, ФН/5-09).
Разработанные «Методические рекомендации по лабораторной диагностике блютанга» рассмотрены, одобрены на секции «Инфекционной патологии животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 30.09.2010 г. и утверждены Академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 24.11.2010 г.
1.6 Апробация работы
Основные результаты исследований по теме диссертации доложены на:
- научной конференции в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины», г.Покров, 2009г.;
- международной научно-практической конференции в ГНУ УрНИВИ «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц», г. Екатеринбург, 2010г.;
- выездном заседании секции «Инфекционной патологии животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 30.09.2010 г.;
- заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в 20082010 гг.
1.7 Публикации
По материалам диссертации опубликовано пять научных работ, из них две статьи - в рекомендованном ВАК журнале «Ветеринария», 2010г. - №8. - С. 23-26. и№10. -С. 58-59.
1.8 Соответствие диссертации паспорту научной специальности
В соответствии с формулой специальности 06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, охватывающей проблемы разработки и применения средств и методов диагностики, лечения, профилактики и ликвидации болезней, включая области исследований - биологические свойства вирусов, методы выделения вирусов из патологического материала, средства и методы лабораторной диагностики инфекционных болезней животных, частная инфекционная патология, серология инфекционных болезней животных, в диссертационном исследовании усовершенствована система диагностики блютанга посредством включения в диагностические процедуры выделения вируса с использованием куриных эмбрионов и комплекса серологических и вирусологических методов, применяемых в зависимости от формы течения болезни, дана сравнительная оценка методов выделения вируса, определена диагностическая характеристика серологических и вирусологических методов.
Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 1, 5, 6,14.
1.9 Структура диссертации
Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 20 отечественных и 247 иностранных источников, дополнена приложениями. Диссертация содержит 16 таблиц и 57 рисунков. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Результаты сравнительной оценки эффективности методов выделения вируса блютанга.
2. Иммунобиологические свойства выделенного вируса блютанга (штамм ФКл/4-09) в сравнении с вирусом 8 серотипа, выделенным в Нидерландах, и 1 серотипа, выделенным в Испании.
3. Диагностические показатели серологических методов для выявления специфических антител к вирусу блютанга.
4. Обоснование предлагаемой схемы лабораторной диагностики блютанга.
1.11 Личный вклад автора в выполнение работы
Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы выполнены при методической и консультативной помощи сотрудников лаборатории Диагностики к.в.н., с.н.с. Фёдорова Г.П., к.б.н., с.н.с. Хижинского П.Г. и сотрудников лаборатории Биологии и культивирования вирусов д.в.н. Закутского Н.И. и аспиранта Нестерова Е.А. Данные результатов серологического мониторинга импортированного крупного рогатого скота для статистической обработки получены из материалов диагностических исследований лаборатории Диагностики.
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы
2.1.1 Вирусы: вирус блютанга 8 серотипа шт. BTV NET2006-A, 2-й пассаж в культуре клеток ВНК-21/13, получен из научно-исследовательского Центра CIDC, Лелистат, Нидерланды; вирус блютанга 1 серотипа, Spanish pool 1,2 ovine blood, 3 пассажа в культуре клеток CV-1 и 2 пассажа в культуре клеток VERO, титр 6,5 lg ТЦД50/СМ3, выделен из материала, полученного из IAH, Пирбрайт, Великобритания.
2.1.2 Сыворотки: исследуемые сыворотки крупного рогатого скота, овец и коз, получены из хозяйств РФ с 2006 по 2010 гг.; сыворотки крупного рогатого скота и овец, не имеющие антител к вирусу блютанга; контрольные специфические сыворотки овец или иммуноасцитические жидкости мышей к 1, 4, 6, 8,9, 11 серотипам вируса блютанга.
2.1.3 Животные: телята чёрно-пёстрой и голштино-фризской породы 3-4-месячного возраста; овцы породы романовская, курдючная и меринос 6-12-
месячного возраста; мышата-сосуны 1-2-х-суточные; куриные эмбрионы 9-10-суточные.
2.1.4 Культуры клеток: перевиваемые линии клеток почки африканской зеленой мартышки (CV-1 и VERO), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21), почки сайги (ПС).
2.2 Методы
2.2.1 Воспроизведение блютанга на восприимчивых животных
Для воспроизведения блютанга на крупном рогатом скоте и овцах, получения вируссодержащих материалов и оценки известных методов выделения вируса блютанга, проводили экспериментальное заражение животных по единой схеме. Данная схема включала: 1) Телят (I пассаж) заражали вируссодержащей культуральной жидкостью (п.2.1.1). 2) Телят (II пассаж) заражали вирус-кровью, отобранной от телят I пассажа на 7-10 сутки после заражения. 3) Овец заражали вирус-кровью, отобранной от телят II пассажа на 7-10 сутки после заражения.
Клиническое состояние всех животных после инфицирования оценивали по результатам термометрии и клинического осмотра. Кровь для исследований брали, начиная с 3 по 21 сутки после заражения с интервалом 2 суток и далее с интервалом 7 суток до конца опыта. В случае гибели животных брали пробы органов. Пробы крови и органов использовали для выделения вируса. Иммунный ответ оценивали по наличию антител в сыворотках крови РН, РДСК и конкурентным ТФ ИФА.
Для проведения ОТ-ПЦР и выделения вируса у телят и овец брали пробы крови в объеме 5-10 см3 из яремной или подхвостовой вены, в пробирки с ЭДТА. Сыворотку крови получали по стандартной методике.
От павших животных получали пробы крови (сгустки из сердца), легких, селезенки, печени, лимфатических узлов (подчелюстные, предлопаточные, мезентериальные), сердца. Органы отбирали не позднее 3-5 часов после гибели животного. Пробы внутренних органов и сгустки крови консервировали жидкостью Эдингтона в соотношении 1:1.
2.2.2 Определение инфекционной активности вируса в культуре клеток
Инфекционную активность вируса блютанга определяли титрованием в
культуре клеток VERO или ВНК-21/13, выращенной на 96-луночных
культуральных микропланшетах. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦЦ50/0,1 см3.
2.2.3 Определение инфекционной активности вируса па куриных эмбрионах
Инфекционную активность вируса определяли титрованием на 10-12-суточных куриных эмбрионах. Вируссодержащие материалы в десятикратных разведениях от 10"' до 10"7 внутривенно вводили куриным эмбрионам по 0,1 см3. Куриные эмбрионы инкубировали в течение 7 суток, при этом ежедневно овоскопировали для учета гибели. На каждое разведение использовали по 4 куриных эмбриона. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ЭЛД5о/0,1 см3.
2.2.4 Определение вируснейтрализующих антител к вирусу блютанга реакцией нейтрализации (РН) проводили по стандартной методике с постоянной дозой вируса (1000 ТЦЦ50/0,1 см3).
2.2.5 Определение специфических антител к вирусу блютанга реакцией длительного связывания комплемента (РДСК)
Постановку РДСК проводили в микроварианте, на холоду, согласно «Инструкции по применению Набора препаратов для диагностики блютанга РДСК», утвержденной зам. начальника Россельхознадзора 03.03.2009 г. Исследуемые и контрольные сыворотки использовали в разведении от 1:2 до 1:256.
2.2.6 Определение специфических анти-УР7 антител к вирусу блютанга конкурентным ТФ ИФА
Для постановки реакции использовали «Набор для определения анти-УР7 антител в конкурентном ТФ ИФА» («ID.VET», Франция) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя.
2.2.7Выделение вируса блютанга
Подготовка проб. Из стабилизированной крови получали отмытую клеточную фракцию, ресуспендировали в стерильном ЗФР рН 7,2-7,4, доводя объем до первоначального. Из проб органов готовили 10%-ную суспензию на ЗФР рН 7,2-7,4. Перед использованием в работе отмытые клетки и приготовленные суспензии обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе на средней мощности двукратно по 30 сек с перерывом в 60 сек, осветляли центрифугированием при
2500-3000 об/мин в течение 20 мин. Для исследований использовали надосадочную жидкость в разведении 10"' и КГ2 на ЗФР рН 7,2-7,4.
Выделение вируса на куриных эмбрионах. Для выделения вируса использовали 10-12-суточные куриные эмбрионы. Их заражали внутривенно по 0,1 см3 через отверстие в скорлупе, которое высверливали без повреждения подскорлупной оболочки. Каждым разведением материала инокулировали не менее 4 эмбрионов. Погибших вскрывали и при выявлении характерных изменений (вишнево-красная окраска, многочисленные кровоизлияния на голове и туловище) из проб органов эмбрионов (печень без желчного пузыря, сердце, почки, мышечная ткань, головной мозг) готовили 10%-ную суспензию. При необходимости проводили два последовательных слепых пассажа на куриных эмбрионах.
Выделение вируса на мышатах-сосунах. Для выделения вируса исследуемый материал вводили интрацеребрально в дозе 0,02 см3 2-3-суточным мышатам-сосунам. Пробы крови и суспензии органов использовали в разведении 10"' и 10"2. На каждое разведение материала использовали не менее 6 мышат. При необходимости проводили еще 4 слепых пассажа на мышатах с использованием 10%-ной суспензии головного мозга мышат предыдущего пассажа в разведении 10'1 и 10"2.
Выделение вируса в культуре клеток. 10%-ной суспензией куриных эмбрионов, мозга мышат-сосунов или подготовленными пробами крови и органов в разведении 10"1 и 10"2 инокулировали культуру клеток VERO, выращенную в культуральных пластиковых матрасах площадью 25 см2.
Цитопатическое действие вируса (ЦПД) в культуре клеток VERO обнаруживали на 3-5 день по наличию округления клеток, разрежения и дезагрегации клеточного монослоя. В контрольной незараженной культуре цитопатические изменения отсутствовали.
В случае отсутствия ЦПД вируса в первом пассаже проводили последовательно до 4 слепых пассажей, используя для заражения материал предыдущего пассажа.
2.2.8 Идентификация изолята вируса реакцией прямой иммунофлюоресцепции (РПИФ)
При выявлении в культурах ЦПД отбирали из матрасов культуральную жидкость и инфицировали монослой клеток, выращенных на покровных стеклах, помещенных в 4-6 пробирок. После 48-72 ч инкубации в термостате при температуре (37,0±0,5)°С или после появления ЦПД покровные стекла извлекали из пробирок, высушивали, обрабатывали охлажденным ацетоном и использовали для идентификации вируса в иммунофлюоресценции.
Препараты окрашивали специфическими ФИТЦ-иммуноглобулинами в рабочем разведении, отмывали в ЗФР рН 7,2-7,4 и проводили люминесцентную микроскопию.
2.2.9 Tunupoeanue выделенного вируса блютанга реакцией нейтрализации с типоспецифическими сыворотками
Реакцию ставили по стандартной методике с постоянной дозой сыворотки и определением индекса нейтрализации.
2.2.10 Статистические методы анализа результатов
Статистический анализ результатов проводили согласно рекомендациям
Лакина Г.Ф. (1990) с использованием пакета прикладных программ Statgrafics версия 2.1. или MS Excel. Диагностические показатели серологических методов рассчитывали согласно рекомендациям Thrusfield М. (2005).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Сравнительная оценка эффективности методов выделения вируса блютанга
Согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике катаральной лихорадки овец», утвержденным в 1995 г., в РФ применяли два метода выделения вируса блютанга - с использованием 2-3-х-суточных мышат-сосунов и в культуре клеток, в то время как МЭБ рекомендован метод с использованием куриных эмбрионов.
Перед нами стояла задача определить эффективность выделения вируса блютанга из проб крови и различных органов данными методами: 1) с использованием предварительного внутривенного введения материалов куриным эмбрионам - 1 пассаж на эмбрионах и 2-3 пассажа в культуре клеток VERO; 2) с
Таблица 1
Результаты выделения вируса из проб крови телят и овец, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт. ВТУ №Т2006-А
п = 3
Мате риал Титр вируса в крови, ЭЛД5(/0,1см3 Выделение вируса
Види№ животного Сутки после заражения На куриных эмбрионах На мышатах-сосунах В культуре клеток VERO
Теленок №3314 4 1,75±0Д2 + а Н.и.с +
11 2,50±0,10 + + +
20 1,30±0Д2 + _ ь -
27 1,00±0,17 + - -
Теленок №1 7 3,00±0Д5 + + +
15 2,00±0,17 + Н.и. +
21 1,50±0Д0 + Ни. -
28 1,50±0,12 + - -
34 0,75±0,13 + - -
Овца №1 2 3,50±0Д1 + - -
3 4,50±0,10 + + +
4 4,50±0,12 + + +
5 5,00±0,15 + + +
6 5,00±0,14 + + +
7 7,50±0,17 + + +
11 2,50±0Д5 + - -
14 2,00±0,13 + - -
а + - положительный, о - - отрицательным результат выделения вируса; с н.и. - не исслсдовали.
Таблица 2
Результаты выделения вируса из проб крови телят и овец, зараженных вирусом блютанга 1 серотипа
п = 3
Мате риал Титр вируса в крови, ЭЛД5о/0,1см3 Выделение вируса
Вид и № животного Сутки после заражения На куриных эмбрионах На мышатах-сосунах В культуре клеток VERO
Теленок №464 21 3,00±0,15 + а + +
25 2,50±0,17 + Н.и/ +
39 1,50±0,17 + _ ь -
46 2,00±0,15 + Н.и. +
67 1,00±0,14 + - -
Теленок №846 36 3,00±0,15 + + +
43 2,50±0,10 + + +
50 1,50±0,11 + Н.и. -
57 1,00±0Д0 + - -
64 1,30±0,13 + - -
Овца №19 21 3,00±0,15 + + +
28 2,00±0,16 + Н.и. -
35 3,00±0,14 + + +
49 1,50±0Д1 + Н.и. -
56 1,25±0ДЗ + - -
а + - положительным, Ь • ♦ отрицательный результат выделения вируса, с Н и - не исслсдовали-
использованием предварительного интрацеребрального введения материалов 2-3-х-суточным мышатам-сосунам - 3-4 пассажа на мышатах и 1-3 пассажа в культуре клеток VERO; 3) в культуре клеток VERO - 3-4 пассажа в культуре клеток VERO. Результаты сравнительного выделения вируса из проб крови экспериментально зараженных телят и овец представлены в таблицах 1, 2.
Инфекционная активность вируса блютанга в 10%-ных суспензиях органов павших экспериментально зараженных овец при титровании на куриных эмбрионах и результаты сравнительного выделения вируса приведены в таблицах 3,4.
Таблица 3
Результаты выделения вируса из проб органов овец, павших после заражения вирусом блютанга 8 серотипа шт. BTV NET2006-A
п = 3
Материал Титр вируса в 10%-ной суспензии, 1а ЭЛД5о/0,1см Выделение вируса
На куриных эмбрионах На мышатах-сосунах В культуре клеток VERO
Сгустки крови 1,75±0,12 + а _ ь -
Селезёнка - - - -
Лимфоузлы 0,75±0,13 + - -
Печень - - Ни.с -
Почки - - - -
Лёгкие 0,75±0,13 + Ни. -
Сердце - - - -
а + • положительный, b - - отрицательный результат выделения вируса, с Н.и. - не исследовали.
Таблица 4
Результаты выделения вируса из проб органов овец, павших после заражения вирусом блютанга 1 серотипа
п = 3
Материал Титр вируса в 10%-ной суспензии, lg ЭЛД5о/0,1см Выделение вируса
На куриных эмбрионах На мышатах-сосунах В культуре клеток VERO
Сгустки крови 4,50±0,10 + а + +
Селезёнка 2,50±0,17 + Н.и.с +
Лимфоузлы 3,00±0,15 + + +
Печень - _ ь - -
Почки 1,50±0,11 + - -
Лёгкие 2,50±0,12 + Н.и. +
Сердце 1,50±0,10 + - -
а + - положительный, b - -отрицательный результат выделения вируса, с Н и. — не исследовали.
На основании полученных данных (на примере 1 и 8 серотипов) метод выделения вируса блютанга с использованием предварительного внутривенного
введения куриным эмбрионам в 30-100 раз чувствительнее методов выделения с использованием предварительного интрацеребрального введения мышатам-сосунам и прямого выделения в культуре клеток VERO и может быть рекомендован для изоляции вируса блютанга из образцов, содержащих вирус в минимальных титрах.
Таким образом, выделение вируса блютанга из проб крови и органов целесообразно проводить с использованием предварительного внутривенного введения куриным эмбрионам. В качестве проб органов для изоляции вируса можно рекомендовать использовать не только селезёнку и лимфоузлы, но также лёгкие и сгустки крови.
3.2 Выделение вируса блютанга от импортированного в Россию крупного рогатого скота и полученных от них телят
Таблица 5
Изоляты вируса блютанга от импортированного в РФ крупного рогатого
скота
№ п/п Область, хозяйство Страна-импортёр Кол-во жив-х в группе Дата ввоза Интервал между ввозом и выделением вируса (сут.) Вирус
1 Курская обл. ЗАО «Агрофирма «Благодатенская» Германия 104 17.01.2008 50 Вирус блютанга изолят «ФК/1-08» корова №42553
2 Нидерланды 181 27.02.2008 220 Вирус блютанга изолят «ФК/2-09» теленок №883 от коровы №0551
3 Нидерланды 158 07.03.2008 205 Вирус блютанга изолят «ФК/3-09» теленок №785 от коровы №9446
4 Калининградская обл. Колхоз «Суворовский» Германия (вакцинирован ный скот) 296 22.12.2008 30 Вирус блютанга изолят «ФКл/4-09» корова №12981
5 Нижегородская обл. ООО «Узольские Ключи» Нидерланды 162 25.08.2007 690 Вирус блютанга изолят «ФН/5-09» изолирован от 2-х животных одной партии коров №№8360 и 5073
Всего было исследовано 158 проб крови и 15 проб органов от 123 голов серо- и/или ОТ-ПЦР-положительного импортированного крупного рогатого скота
из 16 хозяйств. В результате нами выделено пять изолятов вируса блютанга (таблица 5).
Таким образом, выявлены случаи ввоза из Германии и Нидерландов на территорию РФ крупного рогатого скота, инфицированного вирусом блютанга, с наличием инфекционного вируса в крови, рождение от ввезенных животных инфицированных телят, а также случай виремии у ввезенного вакцинированного крупного рогатого скота.
Применение метода выделения вируса с использованием куриных эмбрионов позволило нам выделить вирус блютанга из ряда полевых образцов.
3.3 Характеристика изолятов вируса блютанга
Установлено, что выделенные нами изоляты вируса блютанга размножаются в перевиваемых линиях культур клеток почечного происхождения (VERO, ВНК-21 и ПС) с накоплением в титрах от 4,8 до 5,5 lg ТЦД50/0,1см3, на куриных эмбрионах с накоплением в титрах от 5,5 до 6,5 lg ЭЛД5о/0,1см3. Все изоляты типированы в РН как вирус блютанга 8 серотипа.
3.4 Патогенность выделенного вируса для крупного рогатого скота и
овец
У телят вне зависимости от использованных для заражения штаммов вируса (кроме вируса блютанга 8 серотипа шт. ФКл/4-09) явных клинических признаков заболевания не отмечали, за исключением кратковременной лихорадки и периодов лейкоцитоза/лейкопении. У овец помимо этого отмечали признаки воспаления верхних дыхательных путей, пневмонии, конъюнктивита, общего угнетения.
После заражения вирусом блютанга пало 3 овцы: №1 и 2, зараженные вирусом блютанга 8 серотипа шт. BTV NET2006-A, и №19, зараженная вирусом блютанга 1 серотипа. У павших животных наблюдали признаки воспаления верхних дыхательных путей, крупозную пневмонию верхушечных долей легких, лимфаденит предлопаточных, средостенных и брыжеечных лимфоузлов, воспаление селелезенки, а у овцы, зараженной вирусом блютанга 1 серотипа, также слипчивый плеврит и эндокардит.
3.4.3 Динамика и длительность вирелши у телят и овец, зараженных вирусом блютанга
У всех животных виремию обнаруживали с 3-их суток после инфицирования.
Динамика накопления вируса в крови телят в ^ ЭЛД5о/0,1см3 отражена на рисунках 1, 2, 3. Результаты дальнейшего выделения вируса были отрицательными и на рисунках не отражены.
Титр вируса, ЭЛД „/О,! см'
Рисунок 1 - Динамика изменения уровня виремии у телят, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт. ФКл/4-09
Рисунок 2 - Динамика изменения уровня виремии у телят, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт. ВТУ МЕТ2006-А
Титр вируса, ЭЛД и/0,1 см'
3,5
1 8 15 22 29
Сутки после заражения теленок 3314 -«•»•теленок 1
Максимальный титр вируса достигал 5,0-5,5 ^ ЭЛД50/0,1 см3 в крови, отобранной в период с 6 по 13 сутки после заражения, затем снижался до 2,5-3,5 ^ ЭЛД50/ОД см3. В крови, отобранной в последующее время, наблюдали постепенное снижение титра вируса. Виремию у телят наблюдали до 34 суток (длительность опыта) после заражения вирусом блютанга 8 серотипа шт. ВТУ НЕТ2006-А, 72 суток - вирусом 8 серотипа шт. ФКл/4-09 и 96 суток после заражения вирусом блютанга 1 серотипа.
Динамика инфекционной активности вируса в крови овец в ^ ЭЛД5О/0,1см3 отражена на рисунках 4, 5, 6.
Тип) вируса, зДД см1
Рисунок 4 - Динамика изменения уровня виремии у овец, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт. Ф1Сл/4-09
Рисунок 5 - Динамика изменения уровня
виремии у овец, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт ВТУ ЫЕТ2006-А
Тетр труса,
I 8 15 12 29 36 43 50 57 64 71 78 85 52 99 Сутен после сражения —«иу19 Овца20 ••'••овца28 -*=оо1и29
Рисунок 6 - Динамика изменения уровня виремии у овец, зараженных вирусом блютанга 1 серотипа
Максимальный титр вируса в крови овец достигал 5,0-7,5 Ig ЭЛД5О/0,1 см3 в период с 3 по 14 сутки после заражения. В последующее время наблюдали постепенное снижение титра вируса в крови. Длительность виремии составила 45 суток для вируса блютанга 8 серотипа шт. ВТУ ЫЕТ2006-А, 56 суток для вируса 8 серотипа шт. ФКл/4-09 и 67 суток для вируса блютанга 1 серотипа.
3.5 Иммунный ответ у зараженных вирусом блютанга телят и овец Серологические исследования всех проб сывороток крови, взятых от зараженных вирусом блютанга телят и овец, проводили тремя реакциями: конкурентным ТФ ИФА, РДСК и РН,
3.5.1 Иммунный ответ у телят, зараженных вирусом блютанга Анти-УР7 антитела к вирусу блютанга выявили конкурентным ТФ ИФА в сыворотках крови телят, начиная с 11-13 суток после заражения вирусом блютанга 1 серотипа и с 17-18 суток после заражения вирусом 8 серотипа шт. ФКл/4-09. Сыворотки от всех животных, отобранные в течение всего срока наблюдения (1215 месяцев), были положительными в конкурентном ТФ ИФА. Специфические к вирусу блютанга комплементсвязывающие антитела выявили в пробах сывороток крови телят, зараженных вирусом блютанга 1 серотипа, с 13-15 суток после заражения (рисунок 6), а при заражении вирусом 8 серотипа шт. ФКл/4-09 - с 1720 суток после заражения (рисунок 7). Вируснейтрализующие антитела к вирусу блютанга 1 серотипа выявили в сыворотках крови телят с 15-17 суток (рисунок 8), а к вирусу 8 серотипа шт. ФКл/4-09 - с 19-20 суток (рисунок 9), соответственно.
11 В1 91 121 ISI leí ш m т 301 .131 т
Суши после сражения
1С.ЧХО* 163 -^-"w Е46 ..»..
Рисунок 6 - Динамика изменения уровня комплементсвязывающих антител в сыворотке крови телят, зараженных вирусом блютанга 1 серотипа
Тигр витктея, ЮС|
лпл
: 1 31 61 91 121 151 181 211 241 271 301 331 36 Сутки после гграисеимя » теленок464 гелонокМб •••• теленок848
Рисунок 8 - Динамика изменения уровня вируснейтрапизующих антител в сыворотке крови телят, зараженных вирусом блютанга 1 серотипа
Ш 151 181 211 241 271 301 331 361 391 «1 Сутхк пссле иражгиич
Рисунок 7 - Динамика изменения уровня комплементсвязывающих антител в сыворотке крови телят, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт. ФКл/4-09
п
0=
тж
31 61 91 121 151 181 211 241 271 !
Сутки после иражения
Рисунок 9 - Динамика изменения уровня вируснейтрализующих антител в сыворотке крови телят, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт. ФКл/4-09
Максимальный уровень специфических антител выявлен в сыворотках крови, отобранных в течение первых трех месяцев после заражения животных, затем титры несколько снижались. Конкурентным ТФ ИФА и РН специфические к
вирусу блютанга антитела в сыворотке крови телят выявляли до конца опыта (более года), в то время как титр антител в РДСК существенно снижался через 5 месяцев после заражения до 2-3 а через 7-10 месяцев - до 0-1 1о§2 3.5.2 Иммунный ответу овец, зараженных вирусом блютанга Анти-УР7 антитела к вирусу блютанга выявили конкурентным ТФ ИФА в сыворотках крови овец, начиная с 10-11 суток после заражения вирусом блютанга 1 серотипа, с 7 суток после заражения вирусом 8 серотипа шт. ВТУ ИЕТ2006-А и с 7-11 суток после заражения шт. ФКл/4-09 до конца срока наблюдения (4-6 месяцев). Специфические к вирусу блютанга комплементсвязывающие антитела выявили в пробах сывороток крови овец, зараженных вирусом блютанга 1 серотипа, с 11-13 суток после заражения (рисунок 10), при заражении вирусом блютанга 8 серотипа шт. ВТУ ЫЕТ2006-А - с 10-11 суток (рисунок 11), а при заражении вирусом блютанга 8 серотипа шт. ФКл/4-09 - с 11-15 суток после заражения (рисунок 12).
Титр антител. 1оь
I 8 15 И 29 36 43 50 57 64 71 7В 85 92 99 106 113 120 177 Сутки после ааражения оаца! -»-овцаг ... . ода 11 12 — »-м^а 13 * • аовца 14
I)
1 8 15 22 29 36 43 10 57 64 71 78 85 92 90 1С« 113 120177 134 Сутки после заражении овца 19 -*-ооцв20 -••••ооцаТЭ одца29
Рисунок 10 - Динамика изменения уровня комплементсвязывающих антител в сыворотке крови овец, зараженных вирусом блютанга 1 серотипа
Рисунок 11 - Динамика изменения уровня комплементсвязывающих антител в сыворотке крови овец, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт. ВТУ ШТ2006-А
Титр антител, Ьч,
0 30 СО 90 120 150
Сутки после заражения • -о«цл17 ■»■=<» овца 18 ново о>ца2/
Рисунок 12 - Динамика изменения уровня комплементсвязывающих антител в сыворотке крови овец, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт. ФКл/4-09
Вируснейтрализующие антитела выявили в сыворотках крови овец, зараженных вирусом блютанга 1 серотипа, с 11-15 суток (рисунок 13), после
заражения вирусом 8 серотипа шт. ВТУ 1ЧЕТ2006-А - с 10-14 суток (рисунок 14), а после заражения вирусом 8 серотипа шт. ФКл/4-09 - с 11-14 суток (рисунок 15).
Рисунок 13 - Динамика изменения уровня вируснейтрализующих антител в сыворотке крови овец, зараженных вирусом блютанга 1 серотипа
1 В 15 22 29 36 аз 50 57 54 71 78 85 92 99 105 113 120 127 Сутск после заражения
—■ оецз2 ••'« овца 11 овца 12 =-~оацэ13 ■ ■ «овца 14
Рисунок 14 - Динамика изменения уровня вируснейтрализующих антител в сыворотке крови овец, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт. ВТУ КЕТ2006-А
Рисунок 15 - Динамика изменения уровня вируснейтрализующих антител в сыворотке крови овец, зараженных вирусом блютанга 8 серотипа шт. ФКл/4-09
Максимальные титры специфических антител в РДСК и РН выявили в сыворотках крови, отобранных с 3 по 7 неделю после заражения, затем титры несколько снижались. РДСК позволяет выявить специфические антитела в сыворотках крови, отобранных в течение первых 3 месяцев после инфицирования овец, затем титр антител снижается. РН и конкурентный ТФ ИФА позволяют выявить специфические антитела к вирусу блютанга у зараженных овец в течение 4-6 месяцев (срок наблюдения).
Таким образом, конкурентный ТФ ИФА по сравнению с РН и РДСК позволяет выявить антитела в более ранние сроки после инфицирования крупного рогатого скота и овец, а также в наиболее поздние сроки после заражения животных.
3.6 Сравнительная оценка эффективности основных серологических методов диагностики блютанга
3.6.1 Выбор материалов для расчетов диагностических показателей
Проведение мониторинговых исследований в течение 2006-2010 гг. по выявлению специфических к вирусу блютанга антител дало нам возможность получить большую выборку сывороток от животных, как здоровых, так и подозреваемых в заражении вирусом блютанга 8 серотипа. Схема исследований представлена на рисунке 16.
Рисунок 16 - Схема серологического скрининга импортированного скота на блютанг
За период с сентября 2006 по октябрь 2010 серологическими методами было исследовано 126827 проб сывороток крови от крупного рогатого скота, овец и коз, ввезенных в РФ из стран Европы. В результате данных исследований из 734 групп, имевших при ввозе статус «ОТ-ПЦР-отрицательные», РДСК была идентифицирована 31 группа животных (4%), в которых из 5087 тестированных животных выявлено 281 серо-положительное (таблица 6).
Таким образом, был создан пул сывороток, исследованных тремя серологическими методами, на котором и был проведен расчет диагностической чувствительности и специфичности методов.
3.6.2 Расчет диагностической чувствительности и специфичности методов серологической диагностики блютанга
Из данных таблицы 6 видно, что из всех проверенных сывороток специфические антитела к вирусу блютанга были обнаружены одновременно РДСК, конкурентным ТФ ИФА и РН только у 190 животных (3,7%). Всего ложно-
положительных результатов РДСК было 83 (29,5%), ложно-отрицательных - 91 (32,4%).
Таблица 6
Количество животных «неблагополучных» групп, у которых в РДСК, конкурентном ТФ ИФА и РН получены положительные и отрицательные _ результаты в различных комбинациях_
Результаты Всего Конкурентный ТФ ИФА Всего
5087
РДСК+ИФА+РН+ 190 + _
РДСК+ИФА+РН- 0 РДСК + 190 83 273
РДСК+ИФА-РН+ 0 91 4723 4814
РДСК+ИФА-РН- 83 Всего 281 4806 5087
РДСК-ИФА+РН+ 91 ДЧ=67,6% ДС=98,3% Совпадение результагов=96,6 %
РДСК-ИФА+РН- 0
РДСК-ИФА-РН+ 0
РДСК-ИФА-РН- 4723
В связи с тем, что положительные и отрицательные результаты РН и
конкурентного ТФ ИФА полностью совпали, сравнивали диагностические показатели только РДСК и конкурентного ТФ ИФА, которые ввели в четырехпольную таблицу 2x2.
Относительно конкурентного ТФ ИФА (эталонный метод) диагностическая чувствительность РДСК на уровне индивидуальных скринируемых животных составила 190/(190+91)х100 = 67,6%, диагностическая специфичность РДСК была 4723/(4723+83)х100 = 98,3%.
В данном случае, на неплохое совпадение положительных и отрицательных результатов в РДСК и конкурентном ТФ ИФА (190+4723)/5087х 100 = 96,6%, повлияло хорошее соответствие отрицательных результатов РДСК и ИФА.
Оценивая диагностическую чувствительность комбинации серологических методов (РДСК+конкурентный ТФ ИФА и РН) по отношению к эпизоотической единице «стадо», вероятность обнаружения серо-позитивных групп животных будет 99% и более, так как количество серо-положительных в каждой группе более 1 (средняя превалентность 5,5%).
Несмотря на низкий показатель диагностической чувствительности на уровне индивидуальных скринируемых животных, РДСК показывает высокую эффективность при выявлении инфицированных групп животных, в то время как для выявления индивидуальных инфицированных животных в группах целесообразно применять наиболее чувствительные методы - конкурентный ТФ
ИФА и РН. Таким образом, в диагностике блютанга необходимо использовать конкурентный ТФ ИФА, а при выявлении инфицированных животных в стаде (мониторинг, бессимптомное течение) на первом этапе возможно применение РДСК, как более дешевого метода, а в случае выявления сероположительных животных в стаде проводить поголовную проверку конкурентным ТФ ИФА.
На основании проведенных исследований нами разработана схема лабораторных исследований для диагностики блютанга, в которой учтены различные формы течения болезни у овец и крупного рогатого скота, определено место вирусологических и серологических методов в системе диагностики блютанга (рисунок 17).
Острая
/
Подостра*
Бессимптомная
Вирус
Пробы хтя ис с лед о ваши
ZSZ
Вирус
ОТ-ПЦР
шш
Вшеление н идентификация вируса
ОТ-ПЦР
Эпизоотологияеское обследование
ИФА
"51
|_» Биопроба
Вшеление и идентификация вируса
Тншфо ванне вируса РН
Диагноз
Тшшрование вируса РН
Диагноз
Антитела
I
РДСК ИФА
Диагноз
(по указанию Госветслужбы РФ)
Рисунок 17 - Схема лабораторных исследований для диагностики блютанга
Данная схема включена в «Методические рекомендации по лабораторной диагностике блютанга», утвержденные Академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 24.11.2010 г.
4 ВЫВОДЫ
1. Метод выделения вируса блютанга с использованием куриных эмбрионов в 30-100 раз чувствительнее методов выделения с использованием мышат-сосунов и культуры клеток VERO, что позволило выделить пять изолятов вируса блютанга 8 серотипа от персистентно инфицированного импортированного из Германии и Нидерландов крупного рогатого скота и рожденных от них телят.
2. Максимальное содержание вируса у овец, павших после заражения вирусом блютанга 1 серотипа, составляет в сгустках крови 6,5 ^ ЭЛД50/г, в тканях лёгких и селезенки - 4,5 ^ ЭЛД50/г, в лимфоузлах - 5,0 ^ ЭЛД50/Г, а у овец, павших после заражения вирусом блютанга 8 серотипа шт. ВТУ №Т2006-А, максимальное содержание вируса составляет в сгустках крови - 3,75 ^ ЭЛД50/Г, в тканях лёгких и лимфоузлов - 2,75 ^ ЭЛД5о/г.
3. Вирус блютанга 8 и 1 серотипа после двух последовательных пассажей на крупном рогатом скоте сохраняет свою патогенность для овец.
4. Установлено, что при экспериментальном заражении длительность виремии у крупного рогатого скота составляет до 72 суток для вируса 8 серотипа и до 96 суток для 1 серотипа, а у овец - до 56 суток для вируса блютанга 8 серотипа и 67 суток для вируса 1 серотипа.
5. Конкурентный ТФ ИФА позволяет выявлять специфические к вирусу блютанга антитела в сыворотках крови овец с 7 до 170 суток после заражения, в то время как РДСК и РН - с 10 до 170 суток (срок наблюдения), а в сыворотках крови крупного рогатого скота конкурентным ТФ ИФА и РН с 11-15 до 439 суток (срок наблюдения), а РДСК с 13 до 325 суток.
6. На индивидуальном уровне диагностическая чувствительность РДСК составляет 67,6%, а диагностическая специфичность - 98,3%, в то время как на групповом уровне при превалентности 5,5% чувствительность данного метода превышает 99%, что показывает высокую эффективность РДСК при выявлении групп животных, инфицированных вирусом блютанга.
7. Усовершенствована система диагностики блютанга посредством включения в диагностические процедуры выделения вируса с использованием куриных эмбрионов и комплекса серологических и вирусологических методов, применяемых в зависимости от формы течения болезни.
5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Выделенные и паспортизированные новые штаммы вируса блютанга (ФК/1-08, ФК/2-09, ФК/3-09, ФКл/4-09, ФН/5-09) используются при проведении фундаментальных и прикладных исследований.
«Методические рекомендации по лабораторной диагностике блютанга» предложены для практического использования в научно-исследовательских
учреждениях и в ветеринарных диагностических лабораториях Российской Федерации.
6 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вишняков И.Ф. Идентификация и типирование вируса катаральной лихорадки овец / И.Ф. Вишняков [и др.]// Ветеринария. - 1995. - №4. - С. 20-25.
2. Катаральная лихорадка овец (KJ10, блютанг, синий язык)// Пятьдесят лет борьбы с особо опасными болезнями животных/Рос.акад.с.-х.наук; ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии; ред.кол.: Д.В. Колбасов (гл.ред.) [и др.] -Владимир: Атлас. - 2008. - С.52-54.
3. Стрижаков, А.А. Получение и использование моноклональных антител к вирусу катаральной лихорадки овец: дисс. ... канд.вет.наук: 16.00.03 /Стрижаков Александр Анатольевич. - Покров. - 1994. - 148 с.
4. Barratt-Boyes, S М. Dynamics of viral spread in bluetongue virus infected calves/ S.M. Barratt-Boyes, N.J. MacLachlan// Vet. Microbiol. - 1994. - 40(3-4). - P. 361-371.
5. Bluetongue virus diagnosis of clinical cases by a duplex reverse transcription-PCR: a comparison with conventional methods/ C. Billinis [et al.] // J. Virol. Methods. -2001.-98(1).-P. 77-89.
6. Detection of bluetongue virus in the blood of inoculated calves: comparison of virus isolation, PCR assay, and in vitro feeding of Culicoides variipennis / N.J. MacLachlan [et al.] // Arch. Virol. - 1994. - 136(1-2). - P. 1-8.
7. Duration of bluetongue viraemia and serological responses in experimentally infected European breeds of sheep and goats/ M. Koumbati [et al.] // Vet. Microbiol. -1998.-64.-P. 277-285.
8. Duration of viraemia infectious to Culicoides sonorensis in bluetongue virus-infected cattle and sheep/ K.R. Bonneau [et al.] //Vet. Microbiol. - 2002. - 88(2). - P. 115-125.
9. Experimental reproduction of bluetongue virus serotype 8 clinical disease in calves/ F. Dal Pozzo [et al.]// Vet.Micr. - 2009. - 136. - P. 352-358.
10. Foster, N.M. Bluetongue in sheep and cattle: efficacy of embryonating chicken eggs in viial isolations/ N.M. Foster, A.J. Luedke, H.E. Metcalf// Am. J. Vet. Res. -1972.-33(1).-P. 77-81.
11. Gard, G.P. Arboviruses recovered from sentinel cattle using several virus isolation methods/ G.P. Gard, R.P. Weir, S.J. Walsh// Vet. Microbiol. - 1988. - 18(2). -P. 119-125.
12. Howard, Т.Н. Isolation of bluetongue virus from bull semen/ Т.Н. Howard, R.A. Bowen, B.W. Pickett//Prog. Clin. Biol. Res. - 1985. - 178. - P. 127-134.
13. Shringi, S. Comparative efficacy of standard AGID, CCIE and competitive ELISA for detecting bluetongue virus antibodies in indigenous breeds of sheep and goats in Rajasthan, India/ S. Shringi, B.N. Shringi// J. Vet. Sci. - 2005. - 6(1). - P. 77-79.
14. Singer, R.S. Maximal predicted duration of viraemia in bluetongue virus-infected cattle/ R.S. Singer, N.J. MacLachlan, Т.Е. Carpenter // J. Vet. Diagn. Invest. -2001,- 13.-P. 43-49.
15. Stott, J.L. Immune response to bluetongue virus infection/ J.L. Stott, B.I. Osburn// Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1990. - 162. - P. 163-178.
16. Temporal relationships of viremia, interferon activity, and antibody responses of sheep infected with several bluetongue virus strains/ N.M. Foster [et al.] // Am. J. Vet. Res. - 1991. - 52(2).-P. 192-196.
17. The pathogenesis of experimental bluetongue virus infection of calves/ N.J. MacLachlan [et al.] // Vet. Pathol. - 1990. - 27(4). - P. 223-229.
18. Wechsler, S.J. Detection of bluetongue virus by using bovine endothelial cells and embryonated chicken eggs/ S.J. Wechsler, A.J. Luedke// J. Clin. Microbiol. - 1991. -29(1).-P. 212-214.
7 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Выделение вируса блютанга от импортированного крупного рогатого скота/ И.В. Вялых, Г.П. Фёдоров, И.В. Ногина, В.В. Куриннов, М.Б. Новикова// Ветеринария. - 2010. - 8. - С. 23-26.
2. Эффективность методов выделения вируса блютанга/ И.В. Вялых, Г.П, Фёдоров, И.В. Ногина, В.В. Куриннов, М.Б. Новикова// Ветеринария. - 2010. - 10. -С. 58-59.
3. Вялых, И.В. Продолжительность виремии и выявления генома вируса блютанга при экспериментальном заражении овцы/ И.В. Вялых, A.B. Панферова// Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых/ ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2009. - С. 87-90.
4. Сравнение методов выделения вируса блютанга/ И.В. Вялых, Г.П. Федоров, И.В. Ногина, В.В. Куриннов, М.Б. Новикова// Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц: Сборник научных трудов ведущих ученых России и Зарубежья. Вып. 3. - Уральское издательство. - Екатеринбург. -2010. - С. 102-106,
5. Чувствительность и специфичность основных серологических методов диагностики блютанга/ И.В. Вялых, В.М. Лыска, О.М. Стрижакова, Е.А. Балашова, И.В. Ногина, В.В. Куриннов, М.В. Сидлик, М.Б. Новикова// Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации/ ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2011. -С. 143-145.
Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области Тираж 80 экз.
Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Вялых, Иван Владимирович
УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.
1 ВВЕДЕНИЕ.
1.1 Актуальность темы.
1.2 Степень разработанности проблемы.
1.3 Цель и задачи исследования.
1.4 Научная новизна результатов исследования.
1.5 Практическая значимость работы.
1.6 Апробация работы.
1.7 Публикации.
1.8 Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
1.9 Структура диссертации.
1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1.11 Личный вклад автора в выполнение работы.
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1 КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЛЮТАНГА.
2.1.1 Историческая справка.
2.1.2 Экономическое значение.
2.1.3 Географическое распространение.
2.1.4 Эпизоотологические особенности.
2.1.5. Патогенез блютанга.
2.1.6 Клинические признаки и патологоанатомические изменения.
2.2 КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ БЛЮТАНГА.
2.2.1 Таксономическое положение вируса блютанга.
2.2.2 Структура вируса.
2.2.3 Антигенная вариабельность и родство вируса блютанга с другими представителями рода Orbivirus.
2.2.4 Устойчивость вируса к физико-химическим факторам.
2.3 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БЛЮТАНГА.
2.3.1 Выделение вируса.
2.3.2 Идентификация вируса.
2.3.3 Типирование вируса блютанга.
2.3.4 Выявление специфических антител к вирусу блютанга.
2.3.5 Молекулярно-биологические методы - выявление РНК вируса блютанга.
2.3.6 Статистические диагностические показатели методов.
Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Усовершенствование системы лабораторной диагностики Блютанга"
1.1 Актуальность темы
Блютанг (катаральная, лихорадка овец) — вирусная трансмиссивная, инфекция домашних и диких жвачных животных, преимущественно овец, характеризующаяся лихорадочным состоянием, воспалительно-некротическим поражением ротовой полости, особенно языка, пищеварительного тракта, эпителия венчика и основы кожи копыт, а также дегенеративными изменениями скелетных мышц [2].
Блютанг включен в перечень болезней, подлежащих регистрации в МЭБ [165] и в «Перечень карантинных и особо опасных болезней животных» в РФ [15]. Согласно классификации Роспотребнадзора вирус блютанга относят ко II группе патогенности для человека [1]. Смертность у овец при блютанге от 2 до 30%, летальность иногда достигает 90-100% [2].
В настоящее время болезнь зарегистрирована на всех континентах, где развито овцеводство. В XX столетии блютанг нанес овцеводству многих стран мира огромный экономический ущерб [170, 184, 239].
Для России проблема блютанга потребовала повышенного внимания после эпизоотии этой болезни в Бурятии в 1993 г. [3,4].
При выполнении с 2006 года приоритетного национального проекта «Развитие АПК» основным экспортером племенного скота в нашу страну оказались европейские страны. В конце того же года ряд европейских стран объявили о своем неблагополучии по блютангу 8 серотипа, в том числе Германия и Нидерланды. За период с 2006 по 2010 гг. было импортировано более 120 тыс. животных в хозяйства, расположенные на всей европейской территории РФ, Урала и Сибири.
Таким образом, существенно повышается вероятность заноса блютанга в Россию при импорте животных-вирусоносителей.
В настоящее время система диагностики блютанга, как совокупность связанных между собой вирусологических и серологических методов, основана на выявлении специфических антигенов и антител у наиболее восприимчивых к нему животных — овец, инфекция у которых обычно протекает в острой и подострой форме, и включает комплекс методов выделения вируса с использованием мышат-сосунов и культуры клеток.
Несмотря на имеющиеся в научной литературе данные о биологии вируса, роль крупного рогатого скота в распространении инфекции и вопросы выделения вируса от него пока в России не изучали.
Необходимость совершенствования средств и методов диагностики с учетом новых достижений науки и постановки диагноза при бессимптомном течении болезни у крупного рогатого скота поставило перед нами задачу разработки усовершенствованной системы диагностики блютанга у жвачных животных.
Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Вялых, Иван Владимирович, Покров
1. Безопасность работы с микроорганизмами 1.I - IV групп патогенности (опасности) ис возбудителями паразитарных болезней: СП 1.3.2322-08: утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ 28.01.08. N4: введ. в действие с 1.05.08.
2. Вирусные болезни животных/ В.Н. Сюрин и др.. М.: ВНИТИБП, 1998.-928 с.
3. Вишняков И.Ф. Выделение, идентификация и типирование вируса КЛО в Бурятии/И.Ф: Вишняков и др.//Актуальные проблемы вирусологии: Тезисы докладов научной конференции (май 1994 г.). НИСХИ. - п. Гвардейский. -1994.-Ч. 2.-С. 16-17.
4. Вишняков И.Ф. Идентификация и типирование вируса катаральной лихорадки овец / И.Ф. Вишняков и др.// Ветеринария. 1995. - №4. - С. 20-25.
5. Гаврилова Е.А. Совершенствование средств мониторинга блютанга на основе полимеразной цепной реакции: Автореф. дис. . канд. вет. наук. -Покров, 2010.-25 с.
6. Захаров, В.М. Комплексность мер по предотвращению заноса и распространения блютанга в Российской Федерации/ В.М. Захаров //Ветеринария.- 2009. №5. - С. 3-5.
7. Катаральная лихорадка овец (КЛО, блютанг, синий язык)// Пятьдесят лет борьбы с особо опасными болезнями животных/Рос.акад.с.-х.наук; ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии; ред.кол.: Д.В. Колбасов (гл.ред.) и др. — Владимир: Атлас. 2008. - С.52-54.
8. Лакин, Г.Ф. Биометрия. М.: «Высшая школа». - 1990. - 352 с.
9. Метод ингибирования ТФ ИФА для серологического мониторинга блютанга/ A.A. Стрижаков и др.// Ветеринария. 2003. - 12. - С. 23-25.
10. Методические указания по лабораторной диагностике катаральной лихорадки овец, утвержденные начальником Департамента Ветеринарии МСХ РФ Авиловым В.М. в 1995 г.
11. Методы ветеринарной клинической- лабораторной диагностики: Справочник/Под ред.проф. И:П. Кондрахина. М,: КолосС, 2004. - 520 с.
12. Мониторинг блютанга у животных, импортированных из стран ЕС/ С.Ж. Цыбанов и др.//Ветеринария. 2008. - 10. - С. 25-27.
13. Перечень карантинных и особо опасных болезней животных, утвержден Приказом Министерства сельского хозяйства Российской Федерации от 17 мая 2005 г. N 81 г.
14. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации и дифференциации вируса блютанга / К.А. Снетков и др. // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. — Воронеж. 2002. - С. 547-549.
15. Применение РТГА для скрининга моноклональных антител к вирусу катаральной лихорадки овец/ A.A. Стрижаков и др. // Информационный бюллетень ИЭКВМ. Харьков. - 1995. - С. 54.
16. Стрижаков, А.А. Получение и использование моноклональных антител к вирусу катаральной лихорадки овец: дисс. . канд.вет.наук: 16.00.03 /Стрижаков Александр Анатольевич. Покров. - 1994. - 148 с.
17. A comparison of some serological tests for bluetongue virus infection/ F.C Thomas et al. // Can. J. Сотр. Med. 1976. - 40(3). - P. 291-297.
18. A duplex RT-PCR assay for detection of genome segment 7 (VP7 gene) from 24 BTV serotypes/ S. Anthony et al. // J. Virol. Methods. 2007. - 141. - P. 188-197.
19. A multiplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection and differentiation of Bluetongue virus and Epizootic hemorrhagic disease virus serogroups /W.C. Wilson et al.// J Vet Diagn Invest 2009. - 21. -P.760-770.
20. A possible overwintering mechanism for bluetongue virus in the absence of the insect vector/ H. Takamatsu et al.//J. Gen. Virol. 2003. - 84(Pt 1). - P. 227235.
21. A preliminary report on the isolation and identification of the bluetongue virus from sheep in California/ D.G. McKercher et al. // J. Am. Vet. Med. Assoc. -1953. 122. - P. 300-301.
22. A sandwich ELISA for the detection of bluetongue virus in cell culture using antiserum against the recombinant VP7 protein/ K. Chand et al. //Vet. Ital. -2009.-45(3).-P. 443-448.
23. Active circulation of bluetongue vaccine virus serotype-2 among unvaccinated cattle in central Italy/G., Ferrari et al. // Prev. Vet. Med. 2005. - 68. — P. 103-113;
24. Afshar, A. Bluetongue: laboratory diagnosis/ A. Afshar// Comp. Immunol. Microbiol; Infect. Dis. — 1994! L7(3r4)i- P: 221-2421 .
25. Alexander, R.A. The propagation? of bluetongue virus in the developing chick embryo with particular reference to the temperature of incubation/ R.A. Alexander// Onderstepoort J. Vet. Sci. 1947. - 22. - P. 7.,
26. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes/ S. Maan et al.// J. Gen. Vir. 2007. - 88. -P. 621-630.
27. Analysis of the roles of bluetongue virus outer capsid proteins VP2 and VP5 in determination of virus serotype/P.Pi Mertens et al..// Virology. 1989. — 170.-P. 561-565.
28. Anderson, J. Use monoclonal antibodies in blocking ELISA to detect group specific antibodies to bluetongue virus/ J. Anderson//J. Immun. Meth. 1984. — 74. — P. 139-149:
29. Assessment of efficacy of a bivalent BTV-2 and BTV-4, inactivated vaccine by vaccination and challenge in cattle/ G. Savini et al. //Vet. Microbiol. 2009. -133(1-2).-P. 1-8.
30. Barber, T.L. Serological characterization of selected bluetongue virus strains from the United States/ T.L. Barber, M.M. Jochim // Proc. 77th Annu. Meet. U.S; Anim. Hlth. Assoc. 1973. - P. 352-3591
31. Barnard, B J.H. Bluetongue virus as a cause of hydranencephaly in cattle/ B.J.H. Barnard, J.G. Pienaar// Onderstepoort J: Vet. Res. 1976. - 43(3). - P. 155157.
32. Barratt-Boyes, S M. Dynamics of viral spread in bluetongue virus infected calves/ S;M. Barratt-Boyes, N.J. MacLachlan// Vet. Microbiol: 1994. - 40(3-4). - P. 361-371.
33. Barzilai, E. Multiplication of bluetongue virus in goats following experimental infection/ E. Barzilai, A. Tadmor// Refuah Vet. 1971. - 23. - P. 1120.
34. Biting midges overwintering in Belgium/ B. Losson et al. // Vet. Rec. —2007.-160.-P. 451-452.
35. Blacksell, S.D. A rapid indirect ELISA for the serogrouping of Australian orbiviruses/ S.D. Blacksell , R.A. Lunt , J.R. White// J. Virol. Methods. 1994. -49(1).-P. 67-78.
36. Blocking dot-ELISA, using a monoclonal antibody for detection of antibodies to bluetongue virus in bovine and ovine sera/ A. Afshar et al. //J. Virol. Methods. 1987. - 18(4). - P. 271-279.
37. Bluetongue associated with abnormalities in newborn Iambs/ L. A. Griner et al. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1964. - 145. - P. 1013-1019.
38. Bluetongue disease in dogs associated with contaminated vaccine/ G. Akita et al. // Vet. Rec. 1994. - 134. - P. 283-284.
39. Bluetongue in Captive Yaks/ A. Mauroy et al. // Emerg. Infect. Dis. —2008.-14(4). P. 675-676.
40. Bluetongue in Eurasian Lynx/ T.P. Jauniaux et al. // Emerg. Infect. Dis. -2008. 14(9). - P. 1496-1498.
41. Bluetongue in free-ranging pronghorn antelope (Antilocapra americana) in Wyoming: 1976 and 1984/ E.T. Thome et al. // J. Wildl. Dis. 1988. - 24(1). - P. 113-119.
42. Bluetongue in western Turkey/ A. D. Yonguc et al. // Vet. Rec. 1982. -111.-P. 144-146.
43. Bluetongue infection rate in mithun (Bos frontalis) in the north-eastern upland region of India/S. Rajkhowa et al. // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 2008. -27(3).-P. 907-914.
44. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two different genomic segments/J.F. Toussaint et al. // J. Vir. Meth. 2007. - 140. - P. 115-123.
45. Bluetongue virus detection: a safer reverse-transcriptase polymerase chain reaction for prediction of viremia in sheep/ G. Shad et al. // J. Vet. Diagn. Invest. -1997.-9.-P. 118-124.
46. Bluetongue virus diagnosis of clinical cases by a duplex reverse transcription-PCR: a comparison with conventional methods/ C. Billinis et al. // J. Virol. Methods. -2001. 98(1). - P. 77-89.
47. Bluetongue vims does not persist in naturally infected cattle/L.F. Melville et al.// Vet. Ital. 2004. - 40 (4). - P. 502-507.
48. Bluetongue Virus in Wild Deer, Belgium, 2005-2008/A. Linden et al.// Emerg. Infect. Dis. 2010. - 16(5). - P. 833-836.
49. Bluetongue virus infection of bovine monocytes/ L.E. Whetter et al.// J. Gen. Virol. 1989. - 70. - P. 1663-1676.
50. Bluetongue virus infection of cattle/N. J. MacLachlan et al. //Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses. 1991. - P. 725-736.
51. Bluetongue virus serotype 20: experimental infection of pregnant heifers/ I.M. Parsonson et al.// Aust. Vet. J. 1987. - 64(1). - P. 14-17.
52. Bluetongue virus serotype 8-associated congenital hydranencephaly in calves/ G. Vercauteren et al. // Transbound. Emerg. Dis. 2008. - 55(7). - P. 293298.
53. Bluetongue virus serotypes 1 and 3 infection in Poll Dorset sheep/ C. Hamblin et al. // Aust. Vet. J. 1998. - 76. - P. 622-629.
54. Bluetongue virus VP4 is an RNA-capping assembly line/ G. Sutton et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. - 14. - P. 449-451.
55. Bluetongue virus VP6 protein binds ATP and exhibits an RNA-dependent ATPase function and a helicase activity that catalyze the unwinding of double-stranded RNA substrates/ N. Stauber et al. // J. Virol. 1997. - 71. - P. 7220-7226.
56. Bluetongue: isolation and characterization of the virus and identification of vectors in northeastern Argentina/ C. Gorch et al. // Rev. Argent. Microbiol. 2002. -34(3).-P. 150-156.
57. Breeding sites of bluetongue virus vectors, Belgium / J.Y. Zimmer et al. // Emerg. Infect. Dis. 2010. - 16. - P. 575-576.
58. Brewer, A.W. The pathogenesis of bluetongue virus infection of bovine blood cells in vitro: ultrastructural characterization/ A.W. Brewer, N.J. MacLachlan // Arch. Virol. 1994. - 136. - P. 287-298.
59. Brewer, A.W. Ultrastructural characterization of the interaction1 of bluetongue virus-with bovine erythrocytes in vitro/ A.W. Brewer, N.J. MacLachlan// Vet. Pathol. 1992. - 29(4). - P. 356-359.
60. Browne, J.G. Cytopathologic changes and development of inclusion bodies in cultured cells infected with bluetongue virus/ J.G. Browne, M.M. Jochim// Am. J. Vet. Res. 1967. - 28(125). - P. 1091-1105.
61. Carpenter, S. Culicoides and the emergence of bluetongue virus in northern Europe/ S. Carpenter, A. Wilson, P.S. Mellor // Trends. Microbiol. 2009. - 17. - P. 172-178.
62. Comparison of competitive and indirect enzyme-linked immunosorbent assays for detection of bluetongue virus antibodies in serum and whole blood/ A. Afshar et al. //J. Clin. Microbiol. 1987. - 25(9). - P. 1705-1710.
63. Comparison of virologic and serologic responses of lambs and calves infected with bluetongue virus serotype 10/ R.G. Richards et al. // Vet. Microbiol. -1988.- 18(3-4).-P. 233-242.
64. Competitive ELISA for serodiagnosis of bluetongue: evaluation of group-specific monoclonal antibodies and expressed VP7 antigen/A. Afshar et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 1992. - 4. - P. 231-237.
65. Della-Porta, A J. A serological comparison of the Australian isolate of bluetongue virus type 20 (CSIRO 19) with blue tongue group viruses/ A.J. Della-Porta, K.A.J. Herniman, R.F. Sellers// Vet. Microbiol. 1981. - 6. - P. 9-21.131
66. Design of primers and use of RT-PCR' assays for typing European bluetongue virus isolates: differentiation of field and vaccine strains/ P.P. Mertens et al. // J. Gen. Virol. 2007. - 88(Pt 10). - P. 2811-2823.
67. Detection and differentiation of epizootic haemorrhagic disease of deer and bluetongue viruses by serogroup-specific sandwich ELISA/J.A. Thevasagayam et' al. // J. Virol. Methods. 1996. - 56. - P. 49-57.
68. Detection- by ELISA of bluetongue antigen directly in the blood of experimentally infected sheep/ W.L. Stanislawek et al. // Vet. Microbiol. 1996. -52.-P. 1-12.
69. Detection of bluetongue virus group-specific antigen using monoclonal antibody based sandwich ELISA/ P.N. Gandhale et al. // Virol. Sin. 2010. - 25(6). -P. 390-400.
70. Detection of bluetongue vims in Culicoides variipennis (Diptera: Ceratopogonidae) by an antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay/ J.O. Mecham et al.*//J. Med. Entomol. 1990. - 27(4). - P. 602-606.
71. Detection of bluetongue virus in the blood of inoculated calves: comparison of virus isolation, PCR assay, and in vitro feeding of Culicoides variipennis / N.J. MacLachlan et al. // Arch. Virol. 1994. - 136(1-2). - P. 1-8.
72. Development and evaluation of an IgM-capture ELISA for detection, of recent infection with bluetongue viruses in cattle/ E.M. Zhou et al. // J. Virol. Methods.-2001.-91.-P. 175-182.
73. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment 1// A.E. Shaw et al.// J. Vir.Meth. 2007. - 145. -P. 115-126.
74. Diagnosis of bluetongue and epizootic haemorrhagic disease/ J.E. Pearson et al. //Proc. Second International Symposium, Paris, CRC Press, Boca Raton. -1992.-P. 533-546.
75. Diagnostic analysis of the prolonged bluetongue virus RNA presence found in the blood of naturally infected cattle and experimentally infected sheep/ J. Katz et al. //J. Vet. Diagn. Invest. 1994. - 6(2). - P. 139-142.132
76. Dot immunoblotting assay in comparison with enzyme linked immunosorbent assay for the detection of BTV antibodies in sheep/ Y. Gupta et al. // Vet. Microbiol. 1990. - 22. - P. 365-371.
77. Du Plessis, D.H: Serological differentiation of five bluetongue virus serotypes in» indirect ELISA/ D.H. Du Plessis// Onderstepoort J. Vet. Res. 1992. -59(2).-P. 119-122.
78. Duration of bluetongue viraemia and serological responses in experimentally infected European breeds of sheep and goats/ M. Koumbati et al.'// Vet. Microbiol. 1998. - 64. - P. 277-285.
79. Duration of viraemia infectious to Culicoides sonorensis in bluetongue virus-infected cattle and sheep/ K.R. Bonneau et al. //Vet. Microbiol. 2002. -88(2).-P. 115-125.
80. Efficacy and safety studies on an inactivated vaccine against bluetongue virus serotype 2/B. Di Emidio et al. // Vet. Ital. 2004. - 40 (4). - P. 640-644.
81. Endophily in Culicoides associated with BTV-infected cattle in the province of Limburg, south-eastern Netherlands, 2006/ R. Meiswinkel et al. // Prev. Vet. Med. 2008. - 87. - P. 182-195.
82. Epidemiologic study of bluetongue in sheep, cattle and different species of wild animals in the Ivory Coast/ P. Formenty et al. // Rev. Sci. Tech. 1994. -13(3). — P.737-751.
83. Evaluation of a commercial competitive ELISA' test kit for the detection of group-specific antibodies to bluetongue virus/A. Afshar et al.// J. Vet. Diagn. Invest. 1993. - 5. - P. 336-340.
84. Evidence for the presence of bluetongue virus in Kosovo between 2001 and 2004 / A.Osmani et al. // Vet. Rec. 2006. - 158. - P. 393-396.
85. Evidence for transplacental and contact transmission of bluetongue virus in cattle/ F.D. Menzies et al. // Vet. Rec. 2008. - 163. - P. 203-209.
86. Evidence of natural bluetongue virus infection among African carnivores/ K.A. Alexander et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994. - 51(5). - P. 568-576.
87. Excretion of; bluetongue virus in cattle semen: a feature of laboratory adapted virus/ P.D. Kirkland et al. //Vet. Ital. 2004. - 40. - P. 497-501.
88. Experimental infection! of bulls and cows with bluetongue virus serotype 20/ I.M. Parsonson et al. //Aust. Vet. J. 1987. - 64(1).-P. 10-13.
89. Experimental reproduction of bluetongue virus serotype 8 clinical' disease in calves/ F. Dal Pozzo et al.// Vet.Micr. 2009; - 136; - P. 352-358.
90. Experimental viral-induced^ congenital encephalopathies I. Pathology of hydraneneephaly and porencephaly caused'by bluetongue vaccine virus/B: I. Osburn et al. //Lab. Invest. 1971. - 25(3). - P. 197-205.
91. Experimental viral-induced congenital encephalopathies. II. The pathogenesis of bluetongue vaccine virus infection in fetal lambs/ B. I. Osburn et al. // Lab. Invest. 1971. - 25. - P. 206-210.
92. Fatal Bluetongue virus infection in an alpaca (Vicugna pacos) in California/J.'n,Ortega et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 2010. - 22. - P. 134-136.
93. Fernandes, M. Isolation and'propagation of bluetongue virus in tissue culture/ M. Fernandes// Am. J. Vet. Res. 1959. - 20, - P. 398.
94. Fievre catarrhale du mouton (blue-tongue)/J. Manso-Ribiero et al.//Bull. Off Int. Epiz. 1957. - 48. - P. 350-367.
95. First report of bluetongue virus serotype 1 isolated from a white-tailed deer in the United States/ D J. Johnson- et al.// J. Vet. Diagn. Invest. 2006. - 18(4). -P. 398-401.
96. Foster, N.M. Bluetongue in sheep and cattle: efficacy of embryonating chicken eggs in viral isolations/ N.M. Foster, A.J. Luedke, H.E. Metcalf// Am. J. Vet. Res. 1972. - 33(1). - P: 77-81.
97. Foster, N.M. Direct assay for bluetongue virus by intravascular inoculation of embryonating chicken eggs/ N.M. Foster, A.J. Luedke// Am. J. Vet. Res. 1968. - 29(3). - P. 749-753.
98. Frequency of serological cross-reactions between Ibaraki and bluetongue viruses using the agar gel immunodiffusion test /S. Shimizu et al. // Vet. Ital. -2004. 40 (4). - P. 583-586.
99. Gambles, R.M. Bluetongue of sheep in Cyprus/R.M. Gambles//J.Comp. Pathol. 1949. - 59. - P. 176-190.
100. Gard, G.P. Arboviruses recovered from sentinel cattle using several virus isolation methods/ G.P. Gard, R.P. Weir, S.J. Walsh// Yet. Microbiol. 1988. - 18(2). -P. 119-125.
101. Genetic Characterization of Toggenburg Orbivirus, a New Bluetongue Virus, from Goats, Switzerland/ M.A. Hofmann et al.// Emerg. Inf. Dis. 2008. — 14(12).-P. 1855-1861.
102. Gibbs, E.P.J. Preliminary observations on transplacental infection of bluetongue virus in sheep—A possible overwintering mechanism/ E.P.J. Gibbs, MJ.P. Lawman, K.A.J. Herniman // Res. Vet. Sci. 1979. - 27. -P. 118-120.
103. Gildernew, M. Ministerial Statement: Update on bluetongue. Official report (Hansard) of the Northern Ireland Assembly. 2008. - 27(8). - P. 425-431.
104. Goldsmit, L. An improved method for the isolation and identification of bluetongue virus by intravenous inoculation of embiyonating chicken eggs/ L. Goldsmit, E. Barzilai // J. Comp. Pathol. 1968. - 78. - P. 477.
105. Goldsmit, L. Isolation and propagation of bluetongue virus in embryonating chicken eggs/ L. Goldsmit, E. Barzilai// Prog. Clin. Biol. Res. 1985. -178.-P. 307-318.
106. Goldsmit, L. The comparative sensitivity of sheep and chicken embryos to bluetongue virus and observations on viraemia in experimentally infected sheep/ L. Goldsmit, E. Barzilai, A. Tadmor// Aust. Vet. J. 1975. - 51(4). - P. 190-196.
107. Gray, D.P. Studies on Bluetongue I. Infectivity of the Virus in the Sheep Ked, Melophagus ovinus (L.)/ D.P. Gray, G.L.Bannister// Can. J. Comp. Med. Vet. Sci. - 1961. - 25(9). - P. 230-232.
108. Gur, S.A serologic investigation of bluetongue virus (BTV) in cattle, sheep and gazella subgutturosa subgutturosa in southeastern turkey/S. Gur//. Trop. Anim. Health. Prod. 2008. - 40(3). - P. 217-221.
109. Gustafson, G.A. A comparison of the bluetongue competitive ELISA to other serologic tests/ G.A. Gustafson, J.E. Pearson, K.M. Moser// Proc. Second1351.ternational Symposium, Paris, 17-21 June 1991. CRC Press, Boca Raton. 1992. -P. 570-574.
110. Gutsche, T. There was a man /T. Gutsche// Timmins.- Cape Town. 1979.- P.4.
111. Hafez, S.M. Serotypes of bluetongue virus present in Saudi Arabia/S.M. Hafez , W.P. Taylor//Prog. Clin. Biol. Res. 1985. - 178. - P. 531—537.
112. Haig, D.A. The'cytopathogenic action of bluetongue virus on tissue cultures and its application to the detection of antibodies in the serum of sheep/ D.A. Haig, D.G. McKercher, R.A. Alexander// Onderstepoort J. Vet. Res. 1956. - 27. -P. 171.
113. Hardy, W.T. Soremuzzle of sheep/W.T. Hardy, D.A. Price//J. Am. Vet. Med. Assoc. 1952. - 120. - P. 23-25.
114. Hassan, S.S. Expression and functional characterization of bluetongue virus VP2 protein: role in cell entry/ Hassan S.S., Roy P. // J. Virol. 1999. - 73. - P. 9832-9842.
115. Hemorrhagic disease in bighorn sheep in Arizona/ T.H. Noon , S.L. Wesche, D. Cagle et al.// J. Wildl. Dis. 2002. - 38(1). - P. 172-176.
116. Herniman, K.A.J. BTV in Nigerian dairy cattle herd. Serological studies and correlation of vims activity to vector population/ K.A.J. Herniman, J.P.T. Boorman, W.P. Taylor // J. Hyg. 1983. - 90. - P. 177-193.
117. Hoff, G.L. Observations on bluetongue and epizootic hemorrhagic disease viruses in white-tailed deer: (1) Distribution of virus in the blood (2) Crossehallenge/ G.L. Hoff, D.O. Trainer// Wildl. Dis. 1974. - 10(1). - P. 25-31.
118. Hoffmann, B. Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays Specifically Detecting Bluetongue Virus Serotypes 1, 6, and 8/ B. Hoffmann, M. Eschbaumer, M. Beer// J. Clin. Micr. 2009. - 47 (9). - P. 2992-2994.
119. Hourrigan, J. Bluetongue: The disease in cattle/ J. Hourrigan, A. Klingsporn // Aust. Vet. J. 1975. - 51. - P. 170-174.
120. Hourrigan, J.L. Epizootiology of bluetongue: the situation in the United'; States of America/ J.L. Hourrigan , A.L. Klingsporn//Aust. Vet. J. — 1975. 51(4). -P. 203-208.
121. House, C. Detection of bluetongue group-specific antibody by competitive ELISA/ G. House , J.A. House/, MiL. Berninger //J. Vet. Diagn. Invest: 1990! -2(2).-P. 137-139.
122. Howard; T.I-i. Isolation of bluetongue virus from bull semen/ T.H. Howard, R.A. Bowen, B.W. Pickett//Prog. Clin. Biol. Res. 1985. - 178. - P. 127134.
123. Howell, P.G. A preliminary antigenic classification of strains of bluetongue virus/ P.G. Howell// Onderstepoort J. Vet. Res. 1960. - 28. - P. 357-363.
124. Howell, P.G, The antigenic classification and distribution of naturally occurring strains of bluetongue virus / P:G; Howell // J. S. Afr. Vet. Med; Assoc. -1970. -41. -P. 215-223.
125. Howerth, E.W. Experimentally induced bluetongue virus infection in white-tailed deer: ultrastructural findings/ E.W. Howerth , D.E. Tyler //Am: J. Vet. Res. 1988. - 49(11). - P. 1914-1922.
126. Hiibschle, OJ. Bluetongue virus hemagglutination and, its inhibition by specific sera/ O.J. Hiibschle //Arch. Virol. 1980. - 64(2); - P. 133-140.
127. Hiibschle, O.J. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bluetongue virus antibodies/ O.J. Hiibschle , R.J. Lorenz , H.D. Matheka //Am. J. Vet. Res. 1981. - 42(1). -P. 61-65:
128. Huismans, H. Bluetongue virus structural components/ H. Huismans, A.A. Van Dijk // Gurr. Top. Microbiol; Immunol. 1990. - 162. - P. 21-41.
129. Huismans, H. Identification of the serotype-specific and group-specific antigens of bluetongue virus/ H. Huismans, B.J. Erasmus //Onderstepoort J. Vet. Res. . -1981.-48.- P. 51-58.
130. Hutcheon D. Malarial catarrhal fever of sheep/ D. Hutcheon//Vet. Rec. -1902.- 14.-P. 629-633.
131. Hydranencephaly in calves following the bluetongue serotype 8,epidemic in the Netherlands / W. Wouda et al. I J Vet. Rec. 2008: - 162. - P. 422-423.
132. In vitro effects of endotoxin on bovine and sheep lung microvascular and pulmonary artery endothelial cells/ B. Meyrick et al. // J. Cell. Physiol. 1989. -138.-P. 165-174.
133. Inaba, Y. Ibaraki disease and its relation to bluetongue/ Y. Inaba // Aust. Vet. J.-1975.-51.-P. 178-185.
134. Indoor activity of Culicoides associated with livestock in the bluetongue virus (BTV) affected region of northern France during autumn 2006/ T. Baldet et al. // Prev. Vet. Med. 2008. - 87(1-2). - P. 84-97.
135. Interactions between the inner and outer capsids of bluetongue virus/ E.L. Nason et al. //J. Virol. 2004. - 78. - P. 8059-8067.
136. Isolation and identification of bluetongue virus /A. Clavijo et al. //J. Vir. Meth. 2000. - 87. - P. 13-23.
137. Isolation of bluetongue and epizootic hemorrhagic disease viruses from mosquitoes collected in Indonesia/ S.E. Brown et al. //Vet. Microbiol. 1992. -32(3-4).-P. 241-252.
138. Isolation of bluetongue virus from sheep in Rajasthan State, India/ G. Prasad et al. //Rev. Sci. Tech. 1994. - 13(3). - P. 935-938.
139. Jennings, M. The effect of paraffin wax embedding procedures on the ability of the fluorescent antibody test to demonstrate bluetongue virus antigen in insect tissue/ M. Jennings , J.P. Boorman// Acta Virol. 1984. - 28(6). - P. 495-500.
140. Jochim, M.M. An overview of diagnostics for bluetongue/ M.M. Jochim // Prog. Clin. Biol. Res. 1985. - 178. - P. 423-433.
141. Kettle, D.S. The bionomics and control of Culicoides and Leptoconops (Diptera, Ceratopogonidae=Heleidae)/ D.S. Kettle// Annu. Rev. Entomol. 1962. - 7. -P. 401-418.
142. Komarov, A. A disease similar to bluetongue in cattle and sheep in Israel/ A. Komarov, L. Goldsmit/ZRefuah. Yet. 1951. - 8. - P. 96-100.
143. Laboratory and field studies of an antigen capture ELISA for bluetongue virus/ R.A. Hawkes et al. // J. Virol. Methods. 2000. - 85(1-2). - P. 137-149.
144. Livingston, C.W. Cytochemical changes of bluetongue virus in tissue cultures/ C.W. Livingston, R.W. Moore//Am. J. Vet. Res. 1962. -23. - P. 701-710.
145. Luedke, A.J. Bluetongue in cattle: Effects of calves previously infected in utero/ A.J. Luedke, M.M. Jochim, R.H. Jones// Am. J. Vet. Res. 1977. - 38(11). - P. 1697-1700.
146. Luedke, A.J. Bluetongue in cattle: effects of Culicoides variipennis-transmitted bluetongue virus on pregnant heifers and their calves/ A.J. Luedke, M.M. Jochim, R.H. Jones// Am. J. Vet. Res. 1977. - 38(11). - P. 1687-1695.
147. Luedke, A.J. Bluetongue in cattle: Repeated exposure of two immunologically tolerant calves to bluetongue virus by vector bites/ A.J. Luedke, M.M. Jochim, R.H. Jones// Am. J. Vet. Res. 1977. - 38(11). - P. 1701-1704.
148. Luedke, A.J. Bluetongue in cattle: viremia/ A.J. Luedke, M.M. Jochim, R.H. Jones// Am. J. Vet. Res. 1969. - 30(4). - P. 511-516.
149. Luedke, A.J. Bluetongue virus in goats/ A.J. Luedke, E.I. Anakwenze// Am. J. Vet. Res. 1972. - 33. -P. 1739-1745.
150. Luedke, A.J. Overwintering mechanism for bluetongue virus: Biological recovery of latent virus from a bovine by bites of Culicoides variipennis/ A.J. Luedke, R.H. Jones, T.E. Walton // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1977. - 26. - P. 313
151. Luedke, A.J. Preliminary bluetongue Transmission with the sheep ked Melophagus ovinus (L.)/ A.J. Luedke, M.M. Jochim, J.G. Bowne// Can. J. Comp. Med. Vet. Sci. 1965. - 29(9). - P. 229-231.
152. Luedke, A.J. WHO/FAO Working Team Report: Virology/ A.J. Luedke // Prog. Clin. Biol. Res. 1985. - 178. - P. 665-668.
153. Lunt, R.A. Evaluation of'a monoclonal antibody blocking ELISA for the detection of group specific antibodies to bluetongue virus experimental and field sera/ R.A. Lunt, J.R. White, S.D. Blacksell//J. Gen. Virol. 1988. - 69. - P: 2729-2740.
154. Mahrt, C.R. Experimental bluetongue virus infection of sheep; effect of vaccination: pathologic, immunofluorescent, and ultrastructural studies/ C.R. Mahrt, B.I. Osburn //Am J Vet Res. 1986. - 47(6). - P. 1198-1203.
155. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 2.1.3. Bluetongue. OIE. - 2009.
156. Martin, S.A. Isolation and characterization of two types of bluetongue virus particles/ S.A. Martin, H.J. Zweerink// Virology. 1972. - 50(2). - P. 495-506.
157. Mason, J.H. Cultivation of bluetongue virus in fertile eggs produced on a vitamin deficient diet/ J.H. Mason, J.D.W.A. Coles, R.A. Alexander// Nature (London). 1940. - 145. - P. 1022.
158. McPhee, D.A. Comparative studies on the growth of Australian bluetongue virus serotypes in continuous cell lines and embryonated chicken eggs/ D.A. McPhee, I.M. Parsonson, A.J. Della-Porta// Vet. Microbiol. 1982. - 7(5). - P. 401-410.
159. Mecham, J.O. Detection of bluetongue virus from blood of infected sheep by use of an antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay after amplification of the virus in cell culture/ J.O. Mecham //Am. J. Vet. Res. 1993. - 54. - P. 370372.
160. Mellor, PIS. Bluetongue/ P.S. Mellor // State Vet. J. 1994. - 4. - P. 710.
161. Mellor, P.S. Culicoides-biting midges: Their role as arbovirus vectors/ P.S. Mellor, J. Boorman, M. Baylis // Annu. Rev. Entomol. 2000. - 45. - P. 307340.
162. Mellor, P.S. Culicoides: vectors, climate change and disease risk/ P.S. Mellor// Vet. Bull. 1996. - 66. - P. 301-306.
163. Mellor, P.S., The replication of bluetongue virus in Culicoides vectors/ P.S. Mellor//Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. - 162. - P. 143-161.
164. Mertens, P.P. Analysis of the terminal sequences of the genome segments of four orbiviruses/P.P. Mertens, D.V. Sangar//Virology. 1985. - 140. - P. 55-67.
165. Murray, J.O. Bluetongue virus in North American elk/ J.O. Murray , D.O. Trainer/J. Wildl. Dis. 1970. - 6(3). - P. 144-148.
166. Neitz, W.O. Immunological studies on bluetongue in sheep/ W.O. Neitz// Onderstepoort J. Vet. Sei. Anim. Ind. 1948. - 23. - P. 93-136.
167. Nevill, E.M. Cattle and Culicoides biting midges as possible overwintering hosts of bluetongue virus/ E.M! Nevill //Onderstepoort J. Vet. Res. -1971.-38.-P. 65-72.
168. Niedbalski, W. Detection of bluetongue virus in blood samples jf infected ruminants by RT-PCR for genome segment 7/W. Niedbalski// Bull. Vet. Inst. Pulawy. 2007. - 51. - P. 199-201.
169. Opinion of the Scientific Panel on Animal Health and Welfare on-request from the Commission on bluetongue: Bluetongue vectors and insecticides// EFSA J. -2008.-735.-P. 1-70.
170. Papadopoulos, O. Bluetongue control strategies/ O. Papadopoulos, P.S. Mellor, P.P. Mertens/ZBluetongue/ eds. P.S. Mellor, M. Baylis, P.P. Mertens. -Amsterdam; London. 2008. - P. 429-452.
171. Parsonson, I. Overview of bluetongue virus infection in sheep/ I. Parsonson // Bluetongue, African Horse Sickness, and Related Orbiviruses. -1991. -P. 713-724.
172. Pearson, J.E. Protocol for the immunodiffusion test for bluetongue/ J.E. Pearson, M.M. Jochim// Proc. Am. Assoc. Vet. Lab. Diagn. 1979. - 22. - P. 463471.
173. Performance of clinical signs to detect bluetongue virus serotype 8 outbreaks in cattle and sheep during the 2006-epidemic in The Netherlands/A.R. Elbers et al. //Vet. Microbiol.- 2008. 129. - P. 156-162.
174. Persistence of bluetongue virus in the insect vector and its implications for disease control / J.O. Mecham et al. // US Animal Health Assoc. Proc. 2005. -108.-P. 100-107.
175. Pini, A. Concentration of bluetongue virus in experimentally infected sheep and virus identification by immune fluorescence technique/ A. Pini , W. Coackley , H. Ohder //Arch. Gesamte Virusforsch. 1966. - 18(4). - P. 385-390.
176. Pini, A. Study on the pathogenesis of bluetongue: replication of the virus in the organs of infected sheep/ A. Pini //Onderstepoort J. Vet. Res. 1976. - 43(4). — P. 159-164.
177. Portanti, O. Rapid detection of bluetongue virus in blood and organ samples using a capture enzyme-linked immunosorbent assay/ O. Portanti , M. Luciani, G.F Ronchi //Vet. Ital. 2005. -41(1). - P. 15-21.142
178. Potential role of ticks as vectors of bluetongue virus/ C. Bouwknegt et al.// Exp. Appl. Acarol. 2010. - 52(2). - P. 183-192.
179. Prevalence of bluetongue virus expression in leukocytes from experimentally infected'ruminants/ J.A. Ellis et al. / Am: J: Vet. Res. 1993. -54(9).-P. 1452-1456.
180. Purified recombinant bluetongue virus VP1 exhibits RNA* replicase activity/ M. Boyce et al. // J. Virol. 2004. - 78. - P. 3994-4002.
181. Quantitative assessment of the probability of bluetongue virus overwintering by horizontal transmission: application to Germany / S. Napp et al. // Vet. Res. 2011. - 42(1). - P. 4.
182. Rapid screening of embryonated chicken eggs for bluetongue virus infection with an antigen capture enzyme linked immunosorbent assay/ M. Hosseini et al. //J. Virol. Methods. 1998. - 75(1). - P. 39-46.
183. Reddington, J J. A competitive ELISA for detection of antibodies to the group antigen of bluetongue virus/ J.J. Reddington , G.M. Reddington , N.J. MacLachlan//J. Vet. Diagn. Invest. 1991. - 3(2). - P. 144-147.
184. Reed, L.J. A simple method of estimating fifty percent endpoints/ L.J. Reed, H.A. Muench // Am: J. Hyg. 1938. - 27. - P. 493—497.
185. Review of the IAEA meeting in Vienna on Standardisation of the competitive ELISA test and reagents for the diagnosis of bluetongue/ M. Jeggo et al.// Proc. Second International Symposium, Paris, CRC Press, Boca Raton. 1992. -P. 547-560.
186. Richards, W.P.C. Bluetongue virus infection: Pathologic responses of nervous systems in sheep and mice/ W.P.C. Richards, D.R. Cordy// Science. 1967. -156(774).-P. 530-531.
187. Richards, W.P.C. Hydranencephaly of calves associated with natural bluetongue virus infection/ W.P.C. Richards, G.L. Crenshaw, R.B. Bushnell// Cornell. Vet. 1971. - 61(2). - P. 336-348.
188. Roy, P. Bluetongue virus proteins/ P. Roy// J. Gen. Virol. 1992. - 73. -P. 3051-3064.
189. Roy, P. Structure of bluetongue virus genome and its encoded proteins/ P. Roy, J.J.A. Marshall, T.J. French// Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. - 162. -P. 43-87.
190. Salt-dependent hemagglutination with bluetongue virus/ S. Tokuhisa et al. // Arch. Virol. 198k - 70(1). - P. 75-78.
191. Schmidt, R.E. Cerebral malformation in fetal lambs from a bluetongue-enzootic flock/ R.E. Schmidt, R.J. Panciera// J. Am. Vet. Med. Assoc. 1973. -162(7).-P. 567-568.
192. Seasonal dynamics of biting midges (Diptera:Ceratopogonidae, Culicoides spp.) on daiiy farms of Central Germanyduring the 2007/2008 epidemic of bluetongue/ P. Clausen et al. // Parasitol. Res. 2009. -105. - P.381-386.
193. Sellers, R.F. Epidemiology of bluetongue and the import and export of livestock, semen and embryos/ R.F. Sellers, W.P. Taylor // Bull. Off. Int. Epizoot. -1980.-92.-P. 587-592.
194. Seminal shedding of bluetongue virus in experimentally infected mature bulls/ R.A. Bowen et al. //Am. J. Vet. Res. 1983. - 44(12). - P. 2268-2270.
195. Seroepizootiological survey on bluetongue virus infection in cattle in Japan/ Y.Miura et al. // Natl. Inst. Anim. Health. Q (Tokyo). 1982. - 22 (4). - P. 154—158.
196. Serologic surveillance for selected viral agents in captive and free-ranging populations of Arabian oryx (Oryx leucoryx) from Saudi Arabia and The United Arab Emirates/K. Frolich et al.//J. of Wildl. Dis.- 2005.- 41(1).- P.67-79.
197. Serosurvey for selected infectious disease agents in free-ranging black and white rhinoceros in Africa/ C. Fischer-Tenhagen et al. //J. Wildl. Dis. — 2000. -36(2).-P. 316-323.
198. Shimshony, A. Bluetongue in Israel a brief historical overview/ A. Shimshony// Vet. Ital. - 2004. - 40 (3). - P. 116—118.
199. Shringi, S. Comparative efficacy of standard AGID, CCIE and competitive ELISA for detecting bluetongue virus antibodies in indigenous breeds ofsheep and goats in Rajasthan, India/ S. Shringi, B.N. Shringi// J. Vet. Sci. 2005. -6(1).-P. 77-79.
200. Singer, R.S. Maximal predicted duration of viraemia in bluetongue virus-infected cattle/ R.S. Singer, NJ. MacLachlan, T.E. Carpenter // J. Vet. Diagn. Invest. -2001.-13.-P. 43-49.
201. Sohn, R. Bluetongue and epizootic haemorrhagic disease in wild ruminants/ R. Sohn, T. Yuill // Bull. Soc. Vector. Ecol. 1991. - 16. - P. 17-24*.
202. Spreull, J. Malarial catarrhal fever (bluetongue) of sheep in4 South Africa/J. Spreull //J. Comp. Pathol. Ther. 1905. - 18. - P.321-337.
203. Stott, J.L. Bluetongue virus in pregnant elk and their calves/ J.L. Stott , L.H. Lauerman , A.J. Luedke //Am. J. Vet. Res. 1982. - 43(3). - P. 423-428.
204. Stott, J.L. Immune response to bluetongue virus infection/ J.L. Stott, B.I. Osburn// Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. - 162. - P. 163-178.
205. Stott, J.L. Ornithodorus coriaceus (Pajaroello tick) as a vector of bluetongue virus/ J.L. Stott, B.I. Osburn, L. Alexander // Am. J. Vet. Res. 1985. -46.-P. 1197-1199.
206. Structural studies of orbivirus particles/ D.I. Stuart et al. // Arch. Virol. Suppl. 1998. - 14. - P. 235-250.
207. Studdert, M.J. Sensitivity of bluetongue virus to ether and sodium deoxycholate/ M.J. Studdert // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1965. - 118. - P. 10061009.
208. Studies on bluetongue II. Complement-fixing activity of ovine and bovine sera/ A. Robertson et al. // Can. J. Comp. Med. Vet. Sci. 1965. - 29. - P. 113-117.
209. Studies on bluetongue V. Detection of the vims in infected materials by immunofluorescence/ G. M. Ruckerbauer et al. // Can. J. Comp. Med. Vet. Sci. -1967.-31(7).-P. 175-181.
210. Studies on bluetongue: III Comparison of two complement-fixation methods/ P. Boulanger et al. //Can. J. Comp. Med. Vet. Sci. 1967. - 31. - P. 166170.
211. Studies on fluorescent and neutralising antibodies to the bluetongue virus in sheep/ A. Pini et al. // Arch, fur ges. Virus. 1968. - 25. - P. 129-136.
212. Studies on overwintering of bluetongue viruses in insects/ D.M. White et al. // J. Gen. Virol. 2005. - 86. - P. 453-462.
213. Studies on the epidemiology of bluetongue virus in China/ P.D. Rirkland-et al. // Epidemiol. Infect. 2002. - 128(2). - P. 257-263.
214. Svehag, S:E. Quantal and graded dose-responses of bluetongue virus: A comparison of- their sensitivity as assay methods for neutralizing antibody/ S. E. Svehag // J. Hyg. 64(2). - P. 231-244.
215. Svehag, S.E. Sensitivity of bluetongue virus to lipid solvents, trypsin and pH changes and its serological relationship to arboviruses/ S.E. Svehag, L. Leendertsen, J.R. Gorham //J. Hyg. (Lond). 1966. - 64(3). - P. 339-346.
216. T lymphocyte subset alterations following bluetongue virus infection in sheep and cattle/ J.A. Ellis et al. // Vet. Immunol. Immunopathol. 1990. - 24. - P. 49-67.
217. Taylor, W.P. Distribution of bluetongue virus in Turkey, 1978-81/ W.P. Taylor, P.S. Mellor // Epidemiol. Infect. 1994. - 112. - P. 623-633.
218. Temporal relationships of viremia, interferon activity, and antibody responses of sheep infected with several bluetongue virus strains/ N.M. Foster et al. // Am. J. Vet. Res. 1991. - 52(2). - P. 192-196.
219. Tessaro, S.V. Duration of bluetongue viremia in experimentally infected American bison/ S.V. Tessaro, A. Clavijo// J. of Wildl. Dis. 2001. - 37(4). - P. 722729.
220. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe-the entomological perspective/ R. Meiswinkel et al. // Prev. Vet. Med. 2008. - 87. - P. 55-63.
221. The epizootiological occurrence of bluetongue in the central Balkans/ B. Djurcic et al.// Vet. Ttal. 2004. - 40 (3). - P. 105-107.
222. The isolation of a bluetongue serotype new to Australia/ G.P. Gard et al. // Aust. Vet. J. 1987.- 64. - P. 87-88.
223. The; isolation of a Bluetongue; virus from Culicoides collected in the: Northen Territory of Australia/ T.D. St. George et al. //Aust. Vet. J. 1978. - 54. -P. 153-154.
224. The isolation of bluetongue virus from field populations of the obsoletus complex in central ltaly/ G. Savini et al. // Vet. Ital. 20041 - 40 (3). - P. 369-373.
225. The isolation of bluetongue vims types 3 and 16 from northern Australia/G.P. Gard et al. // Aust. Vet. J. 1987. - 64(12). - P. 388.
226. The isolation of two bluetongue vimses from healthy cattle in Australia/ T.D. St. George et al.//Aust. Vet. J. 1980. - 56. - P. 562-563. .
227. The pathogenesis of experimental bluetongue vims infection of calves/ N.J; MacLachlan et al. // Vet. Pathol. 1990. - 27(4). - P. 223-229.
228. The use of tissue culture propagated; bluetongue«vims for complement fixation studies on sheep sera/ D. K. Shone et al. // Onderstepoort J. Vet. Res. — 1956.-27.-P.- 179.
229. Theiler, A. Inoculation of sheep against bluetongue and results in practice/ A. Theiler//Vet. J. 1908. - 64. - P. 600-607.
230. Thomas, F;C. Bluetongue vims: (1) In pregnant white-tailed?deer, (2) A plaque reduction neutralization test/ F.C Thomas., D.O. Trainer // J. Wildl. Dis. — 1970.-6(4).-P. 384-388.
231. Thomas, F.G. Bluetongue vims: Some relationships among North American isolates and further comparisons with EHD virus/ F.C Thomas., D.O. Trainer// Can. J. Comp. Med. 1971. -35(3). -P. 187-191.
232. Thomas, , F.C. Comparison of some storage and isolation methods to recover bluetongue vims from bovine blood/ F.G. Thomas// Can: J. Comp. Med. — 1984.-48(1).-P. 108-110.
233. Thrusfield; M. Veterinary epidemiology. 3rd edition. Blackwell Science, Oxford, England, 2005. 600 p.
234. Transplacental bluetongue infection in cattle/ K. De Clerq et al. // Vet. Rec. 2008. - 162(17). - P. 564.
235. Transplacental infection and apparently immunotolerance induced by a wild-type bluetongue virus serotype 8 natural infection/ K. De Clercq et al. // Transbound. Emerg. Dis. 2008. - 55(8). - P. 352-359.
236. Transplacental transmission of bluetongue virus 8 in cattle, UK/ K.E. Darpel et al. // Emerg. Infect. Dis. 2009. - 15. - P. 2025-2028.
237. Van den Ende, M. Experiments with the Cyprus strain of bluetongue virus: Multiplication in the central nervous system of mice and complement fixation/ M. Van den Ende,« A. Linder, V. R. Kaschula // J. Hyg. 1954. - 52(2). - P. 155-164.
238. Van der Walt, N.T. A haemagglutination and haemagglutination inhibition test for bluetongue virus / N.T. van der Walt// Onderstepoort J. Vet. Res. — 1980.-47(2).-P. 113-117.
239. Veronesi, E. Live attenuated bluetongue vaccine viruses in Dorset Poll sheep, before and after passage in vector midges- (Diptera: Ceratopogonidae)/ E. Veronesi, C. Hamblin, P.S. Mellor//Vaccine. -2005. 23(48-49). - P. 5509-5516.
240. Vertical transmission of bluetongue virus serotype 8 virus in Dutch dairy herds in 2007 / I.M.G.A. Santman-Berends et al. // Vet. Microbiol. 2010. - 141. -P. 31-35.
241. Verwoerd, D.W. Bluetongue/ D.W. Verwoerd, B.J. Erasmus// Infectious Diseases ot Livestock with special reference to Southern Africa. Coetzer J.A.W., Thomson G.R., Tustin R.C. (Eds.). Oxford Univ. Press. - 1994. - P. 443—459.
242. Verwoerd, D.W. Orbiviruses/ D.W. Verwoerd, H. Huismans, B.J. Erasmus// Comprehensive Virology. 1979. - 14. - P. 285-345.
243. Verwoerd, D.W. Studies on the in vitro and in vivo transcription of the bluetongue virus genome/ D. W. Verwoerd, H. Huismans// Onderstepoort J. Vet. Res. -1972.-39(4).-P. 185-191.
244. Wang, C.S. Soluble antigen of bluetongue virus/ C.S. Wang, D.C. Lueker, T.L. Chow // Infect. Immun. 1972. - 5(4). - P. 467-473.
245. Wechsler, S.J. Detection of bluetongue virus by using bovine endothelial cells and embryonated chicken eggs/ S.J. Wechsler, A.J. Luedke// J. Clin. Microbiol. -1991.-29(1).-P. 212-214.
246. Wechsler, S.J. Susceptibilities of 14 cell lines to bluetongue virus infection/ S.J. Wechsler, L.E. McHolland// J. Clin. Microbiol. 1988. - 26(11). - P. 2324-2327.
247. White, D.M. Lack of detectable bluetongue virus in skin of seropositive cattle: implications for vertebrate overwintering of bluetongue virus/D.M. White, J.O. Mecham//Vet. Ital. 2004. - 40 (4). -P. 513-519.
248. Wilson, A. Where does bluetongue virus sleep in the winter? / A. Wilson, K. Darpel, P.S. Mellor//PLoS Biol. 2008. - 6 (8, e210). - P. 1612-1617.
249. Wilson, A.J. Bluetongue in Europe: past, present and future/ A.J. Wilson, P.S. Mellor// Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 2009. - 364. - P. 2669-2681.
250. Титр вируса в исследуемых образцах крови составил от 0,75 до 4,5 lg ЭЛД50/0,1см (Протокол №1). Титр вируса в культуре клеток определить не удалось, т.к. на первых трех пассажах ЦПД не обнаружили (Протокол №3).
251. С использованием куриных эмбрионов вирус блютанга выделен из всех исследуемых образцов (Протокол №1). Вирус выделен после 1-го пассажа на куриных эмбрионах и последующих 2-3 пассажей в культуре клеток.
-
Вялых, Иван Владимирович
-
кандидата ветеринарных наук
-
Покров, 2011
-
ВАК 06.02.02
- Генотипирование серотипов вируса блютанга
- Совершенствование средств мониторинга блютанга на основе полимеразной цепной реакции
- Идентификация возбудителей блютанга и эпизоотической геморрагической болезни оленей с помощью полимеразной цепной реакции
- Разработка и совершенствование биотехнологических приемов приготовления рабического антигена для производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина
- Биолого-экологический анализ охотничьих угодий и болезней диких и домашних животных Новгородской области
