Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация вируса болезни Акабане на основе методов анализа генома

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация вируса болезни Акабане на основе методов анализа генома"

На правах рукописи

Хан Евгения Олеговна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АКАБАНЕ НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ГЕНОМА

03.02.02 Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

12 СЕН 2013

005532885

Покров-2013

005532885

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии) Балашова Елена Алексеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, зав. лаборатории Биохимии

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии) Середа Алексей Дмитриевич

доктор биологических наук, главный научный сотрудник

(ФГБУ «ВНИИЗЖ») Мудрак Наталья Станиславовна

Ведущая организация: - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Щелково (ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии).

Защита диссертации состоится «11» октября 2013 г. в «1200» часов на заседании диссертационного совета при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская обл., г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел/факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «29» августа 2013 г. и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru и сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор

Цыбанов

Содном Жамьянович

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы

Болезнь Акабане - зоонозная, арбовирусная болезнь крупного и мелкого рогатого скота, характеризующаяся абортами, мертворождениями и различными пороками развития. Первую вспышку болезни Акабане зарегистрировали в Японии, в селении Акабане в 1959 г. [12]. Этиологический агент - вирус болезни Акабане, являющийся представителем рода Orthobunyavirus семейства Bunyaviridae - впервые изолирован в Японии от Aedes vexans и Culex triaeniorhynchus в 1960 и 1964 гг., соответственно. О спорадических вспышках болезни Акабане сообщалось из Японии, Тайваня, Австралии и Израиля. В Корее первая вспышка болезни Акабане произошла в 1980 г. [3,5].

Инцидентность и распространение болезни Акабане связаны с насекомыми - переносчиками вируса, вспышки болезни происходят с хорошо выраженной сезонностью. Вирус переносится кровососущими насекомыми — обычно мелкими комарами рода Culicoides: в Африке -С. milne и С. imicola, в Японии - С. oxystoma, в Австралии - С. brevitarsis и С. wadei. Также вирус выделен от москитов рода Anopheles fenestus в Кении и от Aedes vexans и Culex triaeniorhynchus в Японии [13,14].

У беременных животных, инфицированных вирусом болезни Акабане, обычно не развивается каких-либо клинических симптомов. Однако, в течение раннего или среднего периодов беременности, инфекция проявляется в виде абортов, мертворождения или рождения потомства с комплексом пороков развития, объединяемых под общим названием артрогрипоз-гидроэнцефалического синдрома. Степень поражения плода зависит от срока стельности или суягности, на котором произошло инфицирование, и от штамма вируса. В стадах крупного рогатого скота наибольшие потери (25 -30 %) наблюдаются, когда животные инфицированы на 3 - 6 месяцах стельности. У овец и коз наиболее тяжелые поражения плода происходят при инфицировании на 28 - 50 сутки суягности [13, 14].

Запоздалая диагностика болезни Акабане может принести экономические потери сельскохозяйственным комплексам России из-за недополучения поголовья скота, мясных и молочных продуктов, шерсти.

В последние годы интерес к болезни Акабане резко возрос в связи с возникновением в Европе нового заболевания — болезни Шмалленберг, вызывающей у мелкого и крупного рогатого скота болезнь с клиническими признаками, схожими с таковыми при болезни Акабане. Возбудитель болезни Шмалленберг, так же как и вирус болезни Акабане, относится к роду ОПЬоЬипуаутБ семейства Випуаушс1ае. Нуклеотидные последовательности Б - сегментов геномов этих вирусов характеризуются 69 % идентичностью [11].

Своевременная и точная лабораторная диагностика болезни Акабане и особенно экспресс-диагностика этой экзотической для Российской Федерации болезни, остается актуальной для практики ветеринарии, т.к. является решающей в предупреждении болезни и ее искоренении.

В настоящее время наиболее чувствительным и специфичным методом выявления возбудителя болезни Акабане является полимеразная цепная реакция (ПЦР) [9]. В связи с вышеизложенным, разработка методов идентификации возбудителя болезни Акабане на основе ПЦР имеет важное эпизоотологическое и диагностическое значение.

1.2 Степень разработанности проблемы

Для лабораторной диагностики болезни Акабане зарубежными исследователями используются различные серологические и молекулярно -генетические методы [9, 10]. В нашей стране разработаны серологические средства лабораторной диагностики болезни Акабане на основе реакций гемадсорбции, связывания комплемента, диффузной преципитации (РДП), твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА), метода флуоресцирующих антител (МФА) [1, 2, 6].

В Российской Федерации отсутствовали средства выявления генома вируса болезни Акабане методом ОТ-ПЦР.

1.3 Цель и задачи исследования

Основной целью исследований являлась разработка тест-систем на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией и ОТ-ПЦР в реальном времени для идентификации генома вируса болезни Акабане.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. разработать тест-систему на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией для выявления генома вируса болезни Акабане;

2. разработать тест-систему на основе ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления генома вируса болезни Акабане;

3.определить характеристики разработанных тест-систем и возможность их использования для лабораторной диагностики болезни Акабане;

4.определить нуклеотидные последовательности гена нуклеокапсидного белка (Ы) музейных штаммов вируса болезни Акабане и провести их филогенетический анализ.

1.4 Научная новизна работы

Впервые в РФ определены нуклеотидные последовательности гена N двух штаммов («Р», «В8935») вируса болезни Акабане, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Установлено, что геном штамма «Р» филогенетически близок геномам штаммов <иаСАг-39» и «Р0-90-3», выделенных в Японии (степень нуклеотидной идентичности составляет 99,3 - 99,5 %), а геном штамма «В8935» филогенетически близок геному штамма «117949» (степень нуклеотидной идентичности составляет 99,9 %).

Впервые в Российской Федерации разработаны тест-системы для выявления генома вируса болезни Акабане методами ОТ - ПЦР с электрофоретической детекцией и ОТ-ПЦР в реальном времени.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Разработаны «Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Акабане методом полимеразной цепной реакции», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Колбасовым Д.В. (28.01.2011 г.), и «Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Акабане методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», рассмотренные на секции «Биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии и утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым А.М. (10.11.2011 г.). Указанные методические положения предназначены для лабораторной диагностики болезни Акабане.

Определены нуклеотидные последовательности гена N музейных штаммов вируса болезни Акабане и проведен их филогенетический анализ.

1.6 Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с формулой специальности 03.02.02, вирусология -область науки, занимающаяся исследованием вирусов, генетикой, молекулярно-генетическими аспектами, разработкой диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включающей область исследований проблем генетики вирусов, структурной организации генома вирусов, проблем генной инженерии, разработкой диагностики вирусных заболеваний. В диссертационной работе проведены исследования по созданию тест-систем на основе ПЦР и ее модификаций, позволяющие проводить лабораторную диагностику болезни Акабане. Для данных тест-систем разработаны рекомбинантные конструкции, используемые в качестве положительных контролен амплификации. Проведено нуклеотидное секвенирование гена N двух штаммов («Р», «В8935») вируса болезни Акабане, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. На основании нуклеотидной последовательности гена N проведен филогенетический анализ и получены молекулярно-генетические паспорта данных штаммов.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 4, 5, 10.

1.7 Публикации результатов

По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 1 статья в журнале «Научный журнал КубГАУ», рекомендованном ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.8 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Статистическая обработка включала расчеты средних арифметических значений, достоверности статистической разницы между средними величинами, регрессивный и корреляционный анализ данных, расчет стандартных отклонений результатов с помощью пакета прикладных программ Microsoft Office Excel 2007, обработку результатов с помощью пакета прикладных программ STATGRAPHICS, версия 2.1. Научные положения и выводы диссертационной работы аргументированно отражают содержание работы.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (20092011 гг.). Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно -практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика -2010» (г. Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, прикладные и фундаментальные исследования в фармакологии, физиологии и медицине» (Санкт - Петербург, 2011 г.), Международном конгрессе EPIZONE (г. Сент-Мало, Франция, 2010 г).

1.9 Структура и объем диссертационной работы

Диссертация изложена на 80 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 14 отечественных и 93 иностранных источников, дополнена приложениями. Диссертация содержит 8 таблиц и 20 рисунков. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Тест-системы для выявления генома вируса болезни Акабане методами ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией и ОТ-ПЦР в реальном времени чувствительны и специфичны.

2. Тест-система на основе ОТ-ПЦР в реальном времени позволяет выявлять РНК вируса болезни Акабане в инфицированных культурах клеток, крови экспериментально зараженных овец, морских свинок и мозге белых мышей.

3. Нуклеотидные последовательности гена N и филогенетический анализ штаммов «Р» и «В 893 5» вируса болезни Акабане.

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.б.н., научный сотрудник лаборатории Биофизики Сальников Н.И., (освоение молекулярно-биологических методов), к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории Диагностики Балашова Е.А., аспирант лаборатории Биофизики Никитина Е.Г. (эксперименты по культивированию вируса, заражению животных).

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Вирусы

В работе использованы штаммы вируса болезни Акабане (шт. «Р», «В8935») из коллекции музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Материалом для исследований служили пробы органов (мозг, печень, сердце, легкие, селезенка, лимфатические узлы) и крови от экспериментально инфицированных животных.

В качестве гетерологичных образцов использовали пробы культур клеток, инфицированных вирусами болезней Найроби, Ибараки, лихорадки долины Рифт, блютанга. В качестве отрицательных контролей использовали пробы крови и органов от клинически здоровых животных, а также интактные культуры клеток.

2.1.2 Животные

Для экспериментального заражения вирусом болезни Акабане использовали клинически здоровых овец и белых мышей из сектора подготовки животных ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.1.3 Плазмиды и бактериальные штаммы

Для клонирования использовали коммерческий наборы «pGEM-T Easy vector system» (Promega, США) и «Ins TAclone PCR cloning kit» (Fermentas, Латвия). В качестве векторов для клонирования использовали плазмиды pGEM - Т Easy (Promega, США) и pTZ57R/T(Fermentas, Латвия) и клетки E.coli штамм ТОР 10.

2.2 Методы

2.2.1 Культивирование клеток

Выращивание культуры клеток VERO осуществляли в микропанелях в условиях стационарного монослоя. Для снятия клеток с пластика при пересевах использовали смесь 0,02 % раствора версена и 0,25 % раствора

трипсина в соотношении 2:1, подогретую до 37 °С. Посевная концентрация составила 150-200 тысяч клеток/см3.

2.2.2 Заражение животных

Одно-двухдневных мышей-сосунков заражали интрацеребрально вирусом болезни Акабане, полученным из лаборатории Музейных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров. Клинические признаки заболевания (потерю рефлекса сосания, параличи и гибель) наблюдали с первого пассажа.

От больных и павших через двое суток после заражения вирусом болезни Акабане мышей-сосунков отбирали мозг, который замораживали при минус 60 °С.

2.2.3 Выделение РНК

Выделение РНК методом нуклеосорбции проводили по методике, описанной R. Boom (1990) в нашей модификации [7], а для выделения РНК фенольно-детергентным методом использовали методику P. Chomczynski и N. Sacchi (1987) [8].

2.2.4 Синтез кДНК

Реакцию обратной транскрипции проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 10 пкмоль обратного праймера, 0,03 ммоль дНТФ, 0,07 ммоль MgCl2, 1,88 ммоль KCl, 1,25 ммоль Трис - HCl (pH 7,5), 0,25 ммоль дитиотрейтола, 30 ед. MMLV - ревертазы. В пробирки с реакционной смесью под масло вносили по 5 мкл РНК, далее пробирки инкубировали на термостате в течение 30 мин при температуре 42 °С и 5 мин при температуре 88 °С.

2.2.5 Постановка полимеразной цепной реакции

Для постановки классического варианта ПЦР использовали амплификаторы «Терцик - МС2» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», Россия) и «Palm Cycler» (Corbett Research, Австралия). Реакцию проводили в смеси объемом 25 мкл следующего состава: 10 пмоль каждого праймера, 0,03ммоль

дНТФ, 0,07 ммоль MgCl2, 1,88 ммоль КС1, 1,25 ммоль Трис - НС1 (рН 7,5), 3 ед. Taq - полимеразы и 5 мкл кДНК.

2.2.6 Анализ продуктов ПЦР

Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофореза ДНК в 1,5 — 2,0 % агарозном геле, содержащем 0,4-0,5 мкг/мл интеркалирующего красителя бромистого этидия. Электрофорез проводили, используя трис -ацетатный или трис - боратный буфер, при напряженности электрического поля 8-10 В/см в течение 20-30 минут.

2.2.7 Выделение и очистка продуктов ПЦР

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили с помощью этанольной преципитации непосредственно из реакционной смеси, а также из агарозного геля методами фенольной экстракции после механического разрушения геля, а также нуклеосорбции после растворения геля буфером на основе иодида натрия [4, 15].

2.2.8 Нуклеотидное секвенирование

Секвенирование очищенных амплифицированных фрагментов ДНК проводили с использованием реактивов «Big Dye v. 3.1. Terminator» и «5 х Sequencing buffer» (Applied Biosystems, США) в соответствие с прилагаемой инструкцией. Реакцию ставили в параллелях с прямыми и обратными праймерами.

2.2.9 Клонирование фрагментов генов

Фрагменты генов, амплифицированные методом ОТ-ПЦР, лигировали с Т-векторами в соответствии с инструкциями к наборам. Методом электропорации трансформировали рекомбинантной плазмидой компетентные клетки Е. coli, штамм Тор 10 (Invitrogen, США). Методом щелочного лизиса из 1,5 - 2 см3 бактериальной культуры каждого клона выделяли плазмидную ДНК, которую затем проверяли методом ПЦР на наличие вставки требуемой нуклеотидной последовательности [4, 15].

2.2.10 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием алгоритма «Clustal W» программы «Bio Edit 7.0.0». Для разработки олигонуклеотидных праймеров и зондов использовали программы «Oligo 6.0» и «Primer Express». Специфичность рассчитанных олигонуклеотидов проверяли при помощи интернет - сервиса BLAST (http://www.ncbi.gov.nlm.com). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы «Mega 5.05».

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Изучение репродукции вируса болезни Акабане в перевиваемой культуре клеток VERO

Для углубления данных вирусологического изучения вируса болезни Акабане использовали перевиваемую линию клеток VERO, инокулируя ее вирусом болезни Акабане.

Из мозга больных и павших мышей-сосунков, после заражения их вирусом болезни Акабане (шт. «В8935»), готовили 10 % суспензию. Десятикратным разведением (10"') данного материала заражали перевиваемую линию клеток VERO, выращенную в 96-луночных полистироловых панелях. После двухчасового контакта монослой клеток промывали 1-2 раза средой Игла MEM с добавлением антибиотиков и инкубировали в поддерживающей среде при 37 0 С. Начиная с первых суток по одной панели монослой клеток фиксировали 20 % раствором охлажденного ацетона и хранили при минус 60 °С. Для выявления специфических антигенов в инфицированной культуре клеток использовали прямой метод флуоресцирующих антител.

Через 24 часа после инокуляции вируса болезни Акабане в клетках VERO, обработанных ФИТЦ-конъюгатом, наблюдали одиночные флюоресцирующие клетки (рисунок 1).

Рисунок 1 - Культура клеток VERO, обработанная ФИТЦ-конъюгатом, через 24 часа после инфицирования вирусом болезни Акабане

Через 48 часов в культуре инфицированных клеток VERO, обработанных ФИТЦ-конъюгатом, наблюдали группы флюоресцирующих клеток (рисунок 2). При этом проявления специфического цитопатического действия вируса болезни Акабане не было обнаружено.

Только через 72 часа культивирования в инфицированных вирусом болезни Акабане клетках VERO наблюдали начало проявления специфических деструктивных изменений клеточного монослоя.

Отсутствие свечения в интактной (контрольной) культуре клеток VERO после обработки ее ФИТЦ-конъюгатом против вируса болезни Акабане свидетельствовало о специфичности флуоресценции в инфицированной культуре.

Результаты титрования показали, что вирус болезни Акабане накапливается в культуре 'клеток VERO до 5,0-5,5 lg ТЦЦ50/см3. С помощью метода прямой иммунофлуоресценции можно обнаружить репродукцию вируса болезни Акабане в зараженной культуре клеток на 1-2 суток раньше по сравнению с выявлением его по цитопатическому эффекту.

Рисунок 2 - Культура клеток VERO через 48 часов после инфицирования вирусом болезни Акабане

В дальнейшем культуру клеток VERO использовали для накопления вируса болезни Акабане с целью получения концентрированного вируссодержащего материала для заражения животных и выделения геномной РНК вируса.

3.2 Разработка тест-системы для выявления генома вируса болезни Акабане методом ОТ - ПЦР с электрофоретической детекцией

Данную тест-систему разрабатывали для проведения в дальнейшем генетических исследований. Применили методику, предложенную J. К. Lee, в основе которой лежит использование праймеров, фланкирующих на последовательности гена нуклеокапсидного белка (N) фрагмент размером 365 п.о. [10].

Для проверки специфичности данных праймеров была проведена амплификация участка геномной РНК вируса болезни Акабане (шт. «В8935»). Электрофорез продуктов амплификации показал, что в ходе ОТ-ПЦР синтезируется фрагмент рассчитанного размера - 365 п.н. (рисунок 3).

Рисунок 3 - Электрофореграмма результатов ОТ - ПЦР. М-маркер молекулярной массы (100-1000 п.о.); 1 - РНК вируса болезни Акабане (штамм «Р»); 2-отрицательный контроль

Для определения аналитической специфичности разработанного набора реагентов исследовали пробы РНК, выделенной из образцов биологического и патологического материала, содержащего вирус болезни Акабане, гетерологичные вирусы (болезней Найроби, Ибараки, ЛДР, блютанга), а также из интактных образцов. Ложноположительных и ложноотрицательных результатов при этом получено не было (рисунок 4).

Рисунок 4 - Электрофореграмма выявления РНК вируса болезни Акабане в образцах. 1-14 - РНК гетерологичных вирусов и интактных образцов; 15-18 - РНК вируса болезни Акабане; ОКВ - отрицательный контроль выделения; ОК - отрицательный контроль ПЦР; ПК-положительный контроль

Аналитическую чувствительность определяли амплификацией РНК вируса, выделенной из последовательных десятикратных разведений вируссодержащей жидкости культуры клеток CV-1, инфицированной вирусом болезни Акабане (штамм «Р»).

Рассчитанное значение аналитической чувствительности тест-системы

составило 1,5 ± 0,5 lg МЛД50/см3 при исследовании органного материала и 1,0 ± 0,5 lg ТЦД50/см3 при исследовании культурального материала.

Для конструирования положительных контроля амплификации к данной тест-системе использовали фрагмент S-сегмента генома вируса болезни Акабане (штамм «Р») размером 365п.о. Данный фрагмент клонирован в составе плазмидного вектора pGEM-T Easy (Promega, США).

В состав разработанной тест-системы входят наборы реагентов для выделения нуклеиновых кислот, постановки реакции обратной транскрипции, постановки ПЦР и проведения электрофореза.

На основе проведенных комиссионных испытаний разработаны методические положения по применению данной тест-системы, утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Д.В. Колбасовым.

3.3 Разработка тест-системы для выявления генома вируса болезни Акабане методом ОТ - ПЦР в реальном времени

Для выявления генома вируса болезни Акабане методом ОТ - ПЦР в реальном времени подобраны оригинальные олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие фрагмент размером 113 п.о. гена нуклеокапсидного белка (N) малого (S) сегмента генома. Для детекции продуктов амплификации в режиме реального времени подобран зонд технологии Taq -man, содержащий на 5'-конце излучатель флуоресценции FAM, а на З'-конце - гаситель BHQi.

Оптимизацию условий постановки ОТ-ПЦР в реальном времени проводили с использованием в качестве мишеней для отжига праймеров препараты РНК, выделенные из вируссодержащей жидкости культуры клеток почки сайги, инфицированной вирусом болезни Акабане (шт. «Р») и 20 % суспензии мозга белых мышей-сосунков, инфицированных вирусом болезни Акабане (шт. «Р»), Эмпирическим путем были подобраны оптимальная температура отжига праймеров - 60 °С, концентрации MgCl2 (3,3 мкМ), дНТФ (0,3 мкМ), зонда (0,12 пкмоль/мкл) и праймеров (0,4 пкмоль/мкл) в реакционной смеси для амплификации. Амплификацию с детекцией результатов в реальном времени проводили с использованием детектирующих термоциклеров «Rotor Gene 6000» (Corbett Research, Австралия) и «iQ5» (Bio Rad, США).

Специфичность тест-системы оценивали путем исследования препаратов РНК вирусов болезней Найроби, Ибараки, лихорадки долины Рифт, блютанга, а также препаратов нуклеиновых кислот, выделенных из крови интактных овец, коз и коров. Положительные результаты были получены только для препаратов РНК вируса болезни Акабане, что свидетельствует о специфичности разработанной тест-системы (рисунок 5).

Рисунок 5 - Результаты определения специфичности выявления РНК вируса болезни Акабане методом ОТ - ПЦР в реальном времени. 1,2,3,4 - образцы, содержащие РНК вируса болезни Акабане; ПК - положительный контроль; ОКВ - отрицательный контроль выделения; ОК -отрицательный контроль ПЦР

Рисунок 6 - Результаты выявления РНК вируса болезни Акабане в разведениях мозгового материала. 1-7 -разведения от 1:10° до 1:106; 8 - отрицательный контроль выделения; 9 - отрицательный контроль ПЦР

0,35 0,30 0,25

о

о

¿0,20 Е

¿0,15 0,10 0,05 0,00

Рисунок 7 - Результаты выявления РНК вируса болезни Акабане в разведениях культурального материала. 1-3 - разведения от 1:10° до 1:102; ОКБ -отрицательный контроль выделения; ОК - отрицательный контроль ПЦР

Рассчитанное значение аналитической чувствительности ОТ - ПЦР в реальном времени составило 1,5 ± 0,5 lg МЛД50/см3 при исследовании мозгового материала и 1,0 ± 0,5 lg ТЦД50/см3 при исследовании культурального материала. Разработанная тест-система состоит из наборов реагентов для выделения нуклеиновых кислот, постановки реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (рисунок 6,7).

На базе лаборатории Биофизики проведены комиссионные испытания набора реагентов, а также разработаны методические положения по ее применению, утвержденные директором института и академиком — секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым.

Для конструирования положительных контроля амплификации к данной тест-системе использовали фрагмент S-сегмента генома вируса болезни Акабане (штамм «Р») размером 113 п.о. Данный фрагмент клонирован в составе плазмидного вектора pTZ57 R/T (Fermenthas, Латвия).

Конструкция была использована для количественного анализа и определения дополнительных показателей: эффективности реакции и

Cycle

повторяемости тест-системы. Рассчитанное значение аналитической чувствительности тест-системы, определенное с использованием серии десятикратных разведений рекомбинантной плазмиды, позволило выявить 100 ± 10 копий амплифицируемой области вирусного генома. Эффективность реакции составила 98 % и стандартные отклонения значения О 0,3-0,8 при оценке повторяемости тест-системы.

3.4 Выявление генома вируса болезни Акабане в пробах крови от экспериментально зараженных овец и морских свинок и в пробах мозга инфицированных мышей-сосунков

Следующим этапом данного исследования являлось изучение возможности выявления РНК вируса болезни Акабане в крови экспериментально зараженных овец, морских свинок и мозге инфицированных мышей-сосунков с использованием разработанной тест-системы (на основе ОТ - ПЦР в реальном времени).

Здоровых овец и морских свинок заражали концентрированным культуральным материалом, содержащим вирус болезни Акабане (штамм «В 8935») с инфекционной активностью 7,0 1ц ТЦД50/СМ3. Овце № 1 ввели культуральный вируссодержащий материал в объеме 2 см3, овце № 2 - в объеме 3 см3. Обеим овцам вирус вводили внутримышечно.

Двум морским свинкам (№ 1, № 2) ввели культуральный вируссодержащий материал в объеме 0,05 см3; а морской свинке № 3 -0,5 см3; всем трем морским свинкам вирус вводили внутримышечно.

Со вторых по шестые сутки после заражения у животных отбирали пробы крови, которые исследовали методом ОТ-ПЦР в реальном времени на наличие РНК вируса болезни Акабане. Геном вируса болезни Акабане обнаружен у обеих овец в пробах крови, взятых на 3 сутки после заражения (рисунок 8). В пробах крови от морских свинок № 1, 2 и 3 геном вируса болезни Акабане обнаружен на 4 сутки после заражения (рисунок 8).

Cycle

Рисунок 8 - Результаты выявления генома вируса болезни Акабане у экспериментально зараженных овец и морских свинок:

1 - рекомбинантный положительный контроль амплификации;

2 - РНК вируса болезни Акабане, выделенная из крови овцы № 1 на 3 сутки;

3 - РНК вируса болезни Акабане, выделенная из крови овцы № 2 на 3 сутки,

4 - РНК вируса болезни Акабане, выделенная из крови морской свинки № 1 на 4 сут

5 - РНК вируса болезни Акабане, выделенная из крови морской свинки № 2 на 4 сут

6 — РНК вируса болезни Акабане, выделенная из крови морской свинки № 3 на 4 сутк

Десять белых мышей - сосунков интрацеребрально заражали вирусом болезни Акабане (шт. «Р», доза 1000 МДД50). На 2 и 3 сутки после заражения от больных и павших мышей отбирали пробы мозга. При исследовании проб мозга от этих мышей методом ОТ — ПЦР в реальном времени был выявлен геном вируса болезни Акабане (рисунок 9).

20 IS

S

10

Рисунок 9 - Результаты выявления генома вируса болезни Акабане в пробах мозга от инфицированных мышей. ПК - положительный контроль, ОКВ - отрицательный контроль выделения, ОК — отрицательный контроль

Таким образом, показано, что тест-система на основе ОТ-ПЦР в реальном времени позволяет выявлять РНК вируса болезни Акабане в крови экспериментально зараженных овец, морских свинок и мозге белых мышей.

3.5 Секвенирование нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ штаммов вируса болезни Акабане

Были определены нуклеотидные последовательности фрагмента размером 365 п.о. гена нуклеокапсидного белка вируса болезни Акабане штаммов «Р» и «В8935». Далее с помощью программы Mega 5.0 построили филогенетические деревья (рисунок 10). При этом, эволюционные дистанции между анализируемыми геномами рассчитывали по методу максимальной экономии, достоверность распределения последовательностей по группам оценивали бутстрэп - анализом со 100-кратной повторностью. Проведенный филогенетический анализ показал, что штамм «Р» наиболее близок к штаммам «JaGAr-39» и «FO-90-3», выделенным в Японии 1959 — 1990 гг. от Aedes vexans и Culicoides sp., соответственно. Процент нуклеотидной идентичности генома штамма «Р» с геномами этих штаммов составляет 99,3 - 99,5 %.

Штамм «В8935» образует кластер со штаммами, выделенными в Австралии, имея наибольший процент нуклеотидной идентичности (99,9 %) со штаммом «R7949», выделенным в Австралии в 1968 г. от Culicoides brevitarsis.

Японские штаммы

Австралийские штаммы

63,АВ000857.1| КТ3377 П АВ000857.1| КТ3377(2) АВ000856.1| 8АВ74(2) АВ000855.1| МВЕ-9 АВ000856.1| БАВ74 АВ000858.1| М171 АР034942.1| ОЬе-1 — АВ289320.1| 0кауата2004 ГАВ000865.1| N3-88-2 4- АВ000867.11 О N-89-2 * 1-AB000864.1I N3-88-1 AF034939.1I ^даг-39 АВ000852.1| иавАтЭЭ АВ000870.1| РО-ЭО-З АкаЬапе У1гиз э1гат Р АВ000873.1| КЭ-ЭО-З АВ000872.1| КЭ-90-2 АВ000871.1| ЯО-90-4 АВ000869.1| Мг-90-2 АВ000868.1| М2-90-1 АВ000866.1| УС-88-2 -AF529883.il N1-14 ■AF034940.1I РТ-17 ~AF034941.111Г1к1

- АВ000861.11 КС-15X84 -АВ000862.1|КС-04У84

- АВ289319.1| 0кауата2001

- АВ426279.11 КМ-11/В/06

Ен»шгэ.|| гилчшхио AB426280.1I КЭВ-З/Р/Об АВ373234.1| КЭИ/Р/Об

- АВ000854.1| К7949 -АкаЬапе йгат В8935

Рисунок 10. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента Б-сегмента вируса болезни Акабане (метод максимальной экономии)

4 ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система для выявления генома вируса болезни Акабане методом ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией с аналитической чувствительностью 1,5 ± 0,5 МЛД5о/см3 при исследовании мозгового мышиного материала и 1,0 ± 0,5 ^ ТЦД5о/сМ3 при исследовании культурального материала.

2. Разработана тест-система для выявления генома вируса болезни Акабане методом ОТ-ПЦР в реальном времени с аналитической чувствительностью 1,5 ± 0,5 ^ МЛД50/см3 при исследовании мозгового мышиного материала и 1,0 ± 0,5 ^ ТЦД5о/см3 при исследовании культурального материала.

3. На основе данных нуклеотидного секвенирования фрагмента Б -

сегмента генома штамма «Р» вируса болезни Акабане и филогенетического анализа установлена его гомология с геномами японских штаммов «JaGAr-39» и «FO-90-3» (степень нуклеотидной идентичности составляет 99,3 - 99,5 %).

4. На основе данных нуклеотидного секвенирования фрагмента S -сегмента генома штамма «В8935» вируса болезни Акабане и филогенетического анализа установлена его гомология с геномом австралийского штамма «R7949» (степень нуклеотидной идентичности составляет 99, 9 %).

5.Разработанные тест-системы на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией и ОТ-ПЦР в реальном времени пригодны для лабораторной диагностики болезни Акабане у чувствительных животных.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Культура клеток VERO пригодна для накопления вируса болезни Акабане (штаммы «Р» и «В8935»).

Специфические олигонуклеотидные праймеры могут быть использованы для определения нуклеотидных последовательностей гена N вируса болезни Акабане, проведения генетической характеристики его штаммов и изолятов, создания генетических паспортов и рекомендуются для практического применения в научно-исследовательских и диагностических лабораториях.

«Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Акабане методом полимеразной цепной реакции», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Д.В. Колбасовым, а также «Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Акабане методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», рассмотренные на секции «Биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (23.09.2011г.) и утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым,

предлагаются для лабораторной диагностики болезни Акабане в специализированных ветеринарных учреждениях.

6 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вишняков, И.Ф. Диагностика болезни Акабане методом флюоресцирующих антител / И.Ф. Вишняков, Е.А. Балашова // Информационный бюллетень 1994. ИЭКВМ. - Харьков, 1995. - С.52.

2. Изучение цитопатического эффекта, вызываемого вирусом Акабане, в перевиваемой культуре клеток CV-1 / Н.В. Черных, Е.А. Балашова, И.Ф. Вишняков, С.А. Витина, С.Ф. Чевелев // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ 13-18 апреля 1992 г.-Покров, 1992.-4.1.-С.140-141

3.Львов, Д. К. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. / Д.К. Львов, С.М. Клименко, С. Я. Гайдамович и др. - М.: Медицина. -1989.

4. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер.с англ. / Т.Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук - М.: Мир, 1984.-480с.

5. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина И.В. Вирусные болезни животных. - М., ВПИТИБП, 1998. - 928 с.

6. Чувствительность перевиваемых линий культур клеток к вирусу болезни Акабане / Е.А. Балашова, И.Ф. Вишняков, Г.Н. Чурбанова, С.А. Витина // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ 13-18 апреля 1992 г. -Покров, 1992. - 4.1. - С.142.

7. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom [et a!.] // J. of CI. Microbiology. - 1990. - Vol. 28, № 3. - P. 495 - 503.

8. Chomczynski, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 1987. - Vol.162, № 1. -P.156-159.

9. Detection and quantitation of Akabane and Aino viruses by multiplex real-time reverse-transcriptase PCR / Y. Stram [et al.] // J. of V. M. - 2004. - Vol. 116.-P. 147-154.

10. Encephalomyelitis associated with Akabane virus infection in adult cows / J. K. Lee [et al.] // Vet. Pathol. - 2002. - Vol. 39. - P. 269 - 273.

11. Hoffmann, B. Novel orthobunyavirus in cattle, Europe, 2011/ B. Hoffmann [et al.] // Emerg. Infect. Dis. [serial on the Internet], - 2012. - Vol.18, №3 / Centers for diseases control and prevention.- Режим доступа: http://www.nc.cdc., свободный. — Загл. с экрана.

12. Isolation of arbor viruses from mosquitoes collected at live-stock pens in Gumma Prefecture in 1959 / T. Matsuyama [et al.] // Jap. J. Med. Sci. Biol. - 1960. -Vol. 13.-P. 191-198.

13. Metselaar, D. Akabane virus isolated in Kenya / D. Metselaar, Y. Robin // The Veterinary Record. - 1976. - Vol. 99. - P. 86.

14. Murray, M.D. Akabane epizoonotis in New South Wales: Evidence for the long-distance dispersal of the biting midge Culicoides brevitarsis // Australian Veterinary Journal. - 1987. -v. 64 (10). - P. 305-308.

15. Sambrook, J. Molecular Cloning : a laboratory manual / J. Sambrook, D.W. Russell // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - Cold Spring Harbor, New York, 2001. - Vol. 1.-749 p.

7 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выявление генома вируса болезни Акабане методом Real-Time ПЦР / Е.О. Жабон, Н.И. Сальников, Е.А. Балашова, Ю.О. Селянинов // Молекулярная диагностика-2010: материалы Международной конференции. - М. - 2010. - Т. 2. - С. 97-99.

2. Балашова Е.А., Сальников Н.И., Жабон Е.О. Перспектива использования лабораторных животных и куриные эмбрионы для выделения вируса болезни Акабане // г. Москва. VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика-2010». Сборник трудов. Том И. 2010 г. - С.56.

3. Контроль персистенции вируса болезни Акабане в культуре клеток vero с помощью прямого метода иммунофлюоресценции / О.Ю. Котова, Е.О. Хан, С.Д. Кушнир и др. // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. -Краснодар: КубГАУ, 2012. - № 9 (83). - С.764-773. - Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2012/09/pdC52.pdf, свободный. - Загл. с экрана.

4. Сальников Н.И. Тест-системы на основе ОТ-ПЦР в режиме реальном времени для диагностики особо опасных экзотических буньявирусных инфекций/ Н.И. Сальников, Е.О. Жабон, Е.А. Балашова, С.Ж. Цыбанов// Высокие технологии, прикладные и фундаментальные исследования в фармакологии, физиологии и медицине: материалы Международной научно - практической конференции. - Санкт-Петербург, 2011.-Т.2.-С. 290-291.

8 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота;

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция со стадией обратной транскрипции;

п.о. - пара оснований;

ПЦР- полимеразная цепная реакция;

РНК- рибонуклеиновая кислота;

шт.- штамм;

дНТФ — дезоксирибонуклеозид трифосфат;

МЛД50 - 50 % -ная мышиная летальная доза вируса;

ТЦД50 - 50 %-ная тканевая цитопатогенная доза вируса;

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области Тираж 80 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хан, Евгения Олеговна, Покров

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ

На правах рукописи

04201362388 Л л

Хан Евгения Олеговна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АКАБАНЕ НА ОСНОВЕ

МЕТОДОВ АНАЛИЗА ГЕНОМА

03.02.02 Вирусология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель:

кандидат биологических наук

Балашова

Елена

Алексеевна

Покров -2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Список сокращений..............................................................................................................................5

1 ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................................7

1.1 Актуальность темы..................................................................................................................................7

1.2 Степень разработанности проблемы......................................................................................8

1.3 Цель и задачи исследования..........................................................................................................9

1.4 Научная новизна работы....................................................................................................................9

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы..................................................10

1.6 Соответствие диссертации паспорту научной специальности........................10

1.7 Публикации результатов..................................................................................................................11

1.8 Степень достоверности и апробация работы..................................................................11

1.9 Структура и объем диссертационной работы..................................................................12

1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту..............................12

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы..................................................................13

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................................14

2.1 Общая характеристика семейства Випуаутёае........................................................14

2.2 Распространение и пути передачи вируса болезни Акабане..........................16

2.3 Характеристика возбудителя болезни Акабане............................................................18

2.3.1 Этиология болезни Акабане..........................................................................................................18

2.3.2 Структура и физико - химические свойства вируса болезни Акабане. 20

2.3.3 Структура генома и особенности репликации вируса болезни Акабане..............................................................................................................................................................21

2.3.4 Изучение нуклеотидного состава и филогенетический анализ буньявирусов и вируса болезни Акабане..........................................................................24

2.4 Диагностика болезни Акабане....................................................................................................25

2.4.1 Клинико-эпизоотологческая диагностика........................................................................26

2.4.2 Выделение вируса болезни Акабане......................................................................................28

2.4.3 Серологические методы диагностики....................................................................................29

2.4.4 Полимеразная цепная реакция......................................................................................................31

2.5 Заключение по обзору литературы..........................................................................................32

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................................................34

3.1 Материалы......................................................................................................................................................34

3.1.1 Вирусы................................................................................................................................................................34

3.1.2 Животные........................................................................................................................................................34

3.1.3 Плазмиды и бактериальные штаммы....................................................................................34

3.1.4 Культуры клеток........................................................................................................................................34

3.1.5 Реактивы............................................................................................................................................................35

3.1.6 Лабораторное оборудование..........................................................................................................35

3.2 Методы..............................................................................................................................................................36

3.2.1 Культивирование клеток..................................................................................................................36

3.2.2 Заражение животных............................................................................................................................37

3.2.3 Выделение РНК..........................................................................................................................................37

3.2.4 Синтез кДНК................................................................................................................................................38

3.2.5 Постановка полимеразной цепной реакции......................................................................39

3.2.6 Анализ продуктов ПЦР........................................................................................................................39

3.2.7 Выделение и очистка продуктов ПЦР....................................................................................39

3.2.8 Нуклеотидное секвенирование....................................................................................................41

3.2.9 Клонирование фрагментов генов................................................................................................42

3.2.10 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей..........................42

3.2.11 Статистическая обработка полученных результатов................................................43

3.3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................................43

3.3.1 Изучение репродукции вируса болезни Акабане в перевиваемой культуре клеток VERO......................................................................................................................43

3.3.2 Разработка тест-системы для выявления генома вируса болезни Акабане методом ОТ - ПЦР с электрофоретической детекцией..................45

3.3.3 Разработка тест-системы для выявления генома вируса болезни Акабане методом ОТ - ПЦР в реальном времени....................................................52

3.3.4 Выявление генома вируса болезни Акабане в пробах крови от экспериментально зараженных овец и морских свинок и в пробах

мозга инфицированных мышей-сосунков........................................................................60

3.3.5 Секвенирование нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ вируса болезни Акабане, депонированного

в музее ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии..........................................................62

4 ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................................................................................64

5 ВЫВОДЫ........................................................................................................................................................................68

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ....................................................................................................69

7 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................70

8 ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................................................................................................................81

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.а. - аминокислотный остаток;

ВНИИВВиМ - Всероссийский научно-исследовательский институт;

ветеринарной вирусологии и микробиологии;

ГНУ - государственное научное учреждение;

ГТЦ - гуанидина тиоцианат;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфат;

Да - дальтон;

ИФА - иммуноферментный анализ; КРС - крупный рогатый скот;

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота; кДа - килодальтон;

МЛД50 _ 50% -ная мышиная летальная доза вируса;

мкл - микролитр;

MPC - мелкий рогатый скот;

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией;

ОРС - открытая рамка считывания;

об/мин - обороты в минуту;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

п.о. - пара оснований;

ПС - перевиваемая культура клеток почки сайги;

ПСГК - перевиваемая культура клеток почки сибирского горного козерога; РФ - Российская Федерация;

ТЦД5о - 50%-ная тканевая цитопатогенная доза вируса;

Трис - N,N,N-Tpnc (гидроксиметил)-аминометан;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ВНК-21 - культура клеток почки новорожденного сибирского хомяка; VERO - перевиваемой линии клеток почки африканской зеленой мартышки; CV-1 - перевиваемая культура клеток почки зелёной мартышки; ПСГК - перевиваемая культура клеток почки сибирского горного козерога; рН - обратный десятичный логарифм концентрации ионов Н+.

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы

Болезнь Акабане - зоонозная, арбовирусная болезнь крупного и мелкого рогатого скота, характеризующаяся абортами, мертворождениями и различными пороками развития. Первую вспышку болезни Акабане регистрировали в Японии, в селении Акабане в 1959 г. [57]. Этиологический агент - вирус болезни Акабане, являющийся представителем рода Orthobunyavirus семейства Bunyaviridae - впервые изолирован в Японии от Aedes vexans и Culex triaeniorhynchus в 1960 и 1964 гг., соответственно. О спорадических вспышках болезни Акабане сообщалось из Японии, Тайваня, Австралии и Израиля. В Корее первая вспышка болезни Акабане произошла в 1980 г. [1, 5].

Инцидентность и распространение болезни Акабане связаны с насекомыми - переносчиками вируса, вспышки болезни происходят с хорошо выраженной сезонностью. Вирус переносится кровососущими насекомыми - обычно мелкими комарами рода Culicoides: в Африке -С. milne и С. imicola, в Японии - С. oxystoma, в Австралии - С. brevitarsis и С. wadei. Также вирус был выделен от Anopheles fenestus в Кении и от Aedes vexans и Culex triaeniorhynchus в Японии [72, 74].

В течение раннего или среднего периодов беременности животных, инфицированных вирусом болезни Акабане, заболевание проявляется в виде абортов, мертворождения или рождения потомства с комплексом пороков развития, объединяемых под общим названием артрогрипоз -гидроэнцефалического синдрома. Степень поражения плода зависит от срока стельности или суягности, на котором произошло инфицирование, и от штамма вируса. В стадах КРС наибольшие потери (25-30 %) наблюдаются, когда животные инфицированы на 3-6 месяцах стельности. У овец и коз наиболее тяжелые поражения плода происходят при инфицировании на 28 -50 сутки суягности [72, 74].

В случае запоздалой диагностики болезни Акабане возможны экономические потери сельскохозяйственным комплексам страны из-за недополучения поголовья скота, мясных и молочных продуктов, шерсти.

В последние годы интерес к болезни Акабане резко возрос в связи с возникновением в Европе нового заболевания - болезни Шмалленберг, вызывающей у MPC и КРС болезнь с клиническими признаками, схожими с таковыми при болезни Акабане. Возбудитель болезни Шмалленберг, так же как и вирус болезни Акабане, относится к роду Orthobunyavirus семейства Bunyaviridae. Нуклеотидные последовательности S - сегментов геномов этих вирусов характеризуются 69 % идентичностью [78].

Своевременная и точная лабораторная диагностика болезни Акабане и особенно экспресс-диагностика этой экзотической для РФ болезни остается актуальной для ветеринарии, т.к. является решающей в предупреждении болезни и ее искоренении.

В настоящее время наиболее чувствительным и специфичным методом выявления возбудителя болезни Акабане является ПЦР [35]. В связи с вышеизложенным, разработка методов идентификации возбудителя Акабане на основе ПЦР имеет важное эпизоотологическое и диагностическое значение.

1.2 Степень разработанности проблемы

Для лабораторной диагностики болезни Акабане зарубежными исследователями используются различные серологические и молекулярно-генетические методы [35, 40]. В нашей стране разработаны серологические средства лабораторной диагностики болезни Акабане на основе реакций гемадсорбции, связывания комплемента (РСК), диффузионной преципитации (РДП), твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА), метод флуоресцирующих антител (МФА) [4, 7, 8].

В Российской Федерации отсутствовали средства выявления генома вируса болезни Акабане методом ОТ-ПЦР.

1.3 Цель и задачи исследования

Основной целью исследований являлась разработка тест-систем на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией и ОТ-ПЦР в реальном времени для идентификации генома вируса болезни Акабане.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. разработать тест-систему на основе ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией для выявления генома вируса болезни Акабане.

2. разработать тест-систему на основе ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления генома вируса болезни Акабане.

3. определить характеристики разработанных тест-систем и возможность их использования для лабораторной диагностики болезни Акабане.

4.определить нуклеотидные последовательности гена

нуклеокапсидного белка (14) музейных штаммов вируса болезни Акабане и провести их филогенетический анализ.

1.4 Научная новизна работы

Впервые в Российской Федерации определены нуклеотидные последовательности гена N двух штаммов («Р», «В8935») вируса болезни Акабане, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Установлено, что геном штамма «Р» филогенетически близок геномам штаммов «1аОАг-39» и «Р0-90-3», выделенных в Японии (степень нуклеотидной идентичности составляет 99,3 - 99,5 %), а геном штамма «В 893 5» филогенетически близок геному штамма «117949»,

выделенного в Австралии (степень нуклеотидной идентичности составляет 99,9 %).

Впервые в Российской Федерации разработаны тест-системы для выявления генома вируса болезни Акабане методами ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией и ОТ-ПЦР в реальном времени.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Разработаны «Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Акабане методом полимеразной цепной реакции», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Колбасовым Д.В. (28.01.2011 г.), и «Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Акабане методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», рассмотренные на секции «Биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии и утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым A.M. (10.11.2011 г.). Указанные методические положения пригодны для лабораторной диагностики болезни Акабане.

Определены нуклеотидные последовательности гена N музейных штаммов вируса болезни Акабане и проведен их филогенетический анализ.

1.6 Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с формулой специальности 03.02.02, вирусология -область науки, занимающаяся исследованием вирусов, генетикой, молекулярно-генетическими аспектами, разработкой диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включающей область исследований проблем генетики вирусов, структурной организации генома вирусов, проблем генной инженерии, разработкой диагностики вирусных заболеваний. В диссертационной работе проведены исследования по созданию тест-систем на основе ПЦР и ее модификаций, позволяющие

проводить лабораторную диагностику болезни Акабане. Для данных тест-систем разработаны рекомбинантные конструкции, используемые в качестве положительных контролем амплификации. Проведено нуклеотидное секвенирование гена N двух штаммов («Р», «В8935») вируса болезни Акабане, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. На основании нуклеотидной последовательности гена N проведен филогенетический анализ и получены молекулярно-генетические паспорта данных штаммов.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 4, 5, 10.

1.7 Публикации результатов

По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 1 статья в журнале «Научный журнал КубГАУ», рекомендованном ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.8 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Статистическая обработка включала расчеты средних арифметических значений, достоверности статистической разницы между средними величинами, регрессивный и корреляционный анализ данных, расчет стандартных отклонений результатов с помощью пакета прикладных программ Microsoft Office Excel 2007, обработку результатов с помощью пакета прикладных программ STATGRAPHICS, версия 2.1. Научные положения и выводы диссертационной работы аргументированно отражают содержание работы.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2009-

2011 гг.). Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно -практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (г. Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, прикладные и фундаментальные исследования в фармакологии, физиологии и медицине» (Санкт - Петербург, 2011 г.), Международном конгрессе ЕР КОКЕ (г. Сент-Мало, Франция, 2010 г).

1.9 Структура и объем диссертационной работы

Диссертация изложена на 80 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 14 отечественных и 93 иностранных источников, дополнена приложениями. Диссертация содержит 8 таблиц и 20 рисунков. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Тест-системы для выявления генома вируса болезни Акабане метода