Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Наумкина, Марина Алексеевна, Покров

61 • М-У чм - У

РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИЯ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии

на правах рукописи

НАУМКИНА МАРИНА АЛЕКСЕЕВНА

Разработка методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства

03.00.06 - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Член-корреспондент РАСХН, профессор И.Ф.Вишняков

д. б. н. С.Ж. Цыбанов

Покров - 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................5

1. ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................................6

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................10

2.1. Структура генома вируса бешенства............................................................10

2.2. Антигенные свойства вируса бешенства........................................................15

2.3.География распространения бешенства........................................18

2.4. Эпизоотическая обстановка по бешенству..........................................20

2.5. Диагностика бешенства ..............................................................................................22

2.5.1. Диагностические методы, применяемые

для выявления вируса бешенства..............................................................22

2.5.2. Гибрццизация............................................................................................................24

2.5.3. Принцип метода ОТ-ПЦР...................................................26

2.5.4. Практическое применение метода ПЦР

в диагностике бешенства..................................................................27

2.5.5. Альтернативные методы ПЦР........................................................................29

2.6. Филогенетический анализ генома лиссавирусов........................................32

2.6.1. Применение филогенетического анализа в

молекулярной эпизоотологии............................................................................32

2.6.2. Полиморфизм гена нуклеопротеина

вируса бешенства............................................................32

2.6.3. Филогенетический аналго изолятов

первого генотипа вируса бешенства............................................................36

2.6.4. Полиморфизм РиМгенов

вируса бешенства..........................................................................................................38

2.6.5. Полиморфизм в-Ь генов

вируса бешенства ...............................................................39

2.6.6. Сравнительный анализ Ь протеина

Мопопе|*а\лга1е8 ..........................................................................................................41

2.7. Заключение по обзору литературы................................................................................44

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................................46

3.1. Материалы......................................................................................................................................................46

3.1.1. Штаммы

46

3.1.2. Ферменты..............................................................................................................46

3.1.3. Реактивы................................................................................47

3.1.4. Среды......................................................................................................................................47

3.1.5. Лабораторное оборудование............................................................................47

3.2. Методы.............................................-........................................48

3.2.1. Очистка вируса бешенства....................................................................................48

3.2.2. Фенольно-детергегапый метод выделения РНК..............................48

3.2.3. Выделение РНК по Р. Chomezynski и Sacchi......................................48

3.2.4.Выделение РНК горячим фенолом................................................................49

3.2.5. Синтез кДНК и клонирование..........................................49

3.2.6. Трансформация в Е coli с применением СаС12....................................50

3.2.7. Постановка дот-тбридизации..........................................................................50

3.2.8. Постановка ОТ-ПЦР..................................................................................................52

3.2.9. Компьютерный анализ, расчет олигонуклеотидов........................32

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЯВДОВАШЙ..........................................53

4.1. Очистка вируса бешенства..................................................................................53

4.2. Исследование полипептидного состава вируса бешенства..............53

4.3. Результаты отработки методов выделения РНК..........................................53

4.4. Клонирование фрагментов генома вируса

бешенства в плазмидаых векторах............................................................................55

4.5. Исследование экспрессии в клетках

Е coli гена нуклеопротеина..............................................................................................61

4.6. Разработка «Набора препаратов...» для выявления РНК

вируса бешенства методом дот-гибридизации................................................63

4.6.1. Конструирование ДНК-зондов, оптимизация

условий проведения дот-гибридизации................................................63

4.6.2. Определение чувствительности ДНК-зондов для

выявления РНК вируса бешенства..............................................................64

4.6.3. Определение специфичности ДНК-зондов для

выявления РНК вируса бешенства..............................................................66

4.6.4.Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт.ТС-80) в культуре клеток почки сайги с

помощью дот-гибридизации..............................................................................66

4.6.5. Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт.ТС-80) в мозге инфицированных мышей

с помощью дот-гибридизации............................................................................69

4.6.6. Выявление РНК вируса бешенства в пробах головного мозга инфицированных мышей, хранившихся при

температуре 8° -10° С, с помощью дот-гибрщщзации..................70

4.6.7. Выявление РНК вируса бешенства в патологическом

материале с помощью дот-гибридизации....................................................71

4.7. Разработка «Набора препаратов...» для идентификации вируса

бешенства с помощью ПЦР........................................................................................................73

4.8. Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт. ТС-80)

в культуре клеток почки сайги методом ПЦР..............................................................80

4.9. Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт. ТС-80)

в головном мозге инфицированных мышей с помощью ПЦР.................81

4.10. Выявление РНК вируса бешенства в пробах головного мозга инфицированных мышей, хранившихся при

температуре 8° -10° С, с помощью ПЦР..........................................................................82

4.11. Выявление РНК вируса бешенства в патологическом

материале с помощью ПЦР..........................................................................................................83

4.12. Дифференциация полевых изолятов от вакцинных штаммов

вируса бешенства....................................................................................................................................86

4.13. Дифференциация вакцинных штаммов вируса бешенства................................90

4.14. Стабильность генома вируса бешенства (штамм ТС-80)

при пассировании в культурах клеток ВНК-21 и ПС.................................96

5. ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................................................................100

6. ВЫВОДЫ ........................................................................................................................................................................................109

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ......................................................................................................................110

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................................111

9. ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................................................................................................................................129

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а. к. - аминокислота

Био-11-дУТФ- биотинилированный дезоксиуридин трифосфат БСА - бычий сывороточный альбумин ВБ - вирус бешенства ВБА - вирус болезни Ауески

ВНК-21 - культура клеток почки новорожденного хомяка ВСВ - вирус везикулярного стоматита г/м - головной мозг ДНК-аза - дезоксирибонуклеаза ДСН - додецилсульфат натрия дНТФ - дезоксинуклеотид трифосфаты ИПТГ - юопропил-бета-Д-тиогалактопиранозид ИФА - иммуноферментный анализ кДа - килодальтон кДНК - комплементарная ДНК к.кл. - культура клеток КЧС - классическая чума свиней МонАТ - моноклональные антитела ОТ-ПЦР - обратно транскриптазная ПЦР ОРТ - открытая рамка трансляции пкг - пикограмм п.о. -пар оснований ПС - культура клеток почки сайги ПЦР - полимеразная цепная реакцияп РНК-аза - рибонуклеаза СТЕ - Трис-ЭДГА-натриевый буфер т.п.о. - тысяч пар основашш тРНК - транспортная РНК ТЕ - трис-ЭДТА буфер ФСБ - фосфатно-солевой буфер ЭДТА - этилендиамннотетроацетат

1. ВВЕДЕНИЕ

Контроль за распространением бешенства продолжает оставаться актуальной проблемой во всем мире. Хотя диагностика бешенства за последние несколько десятилетий значительно усовершенствовалась, она все еще нуждается в разработке новых более чувствительных лабораторных методов. Классическая гистопатология оказалась недостаточно надежной. Внутримозговое заражение мышей все еще остается наиболее широко применяемым методом в диагностике бешенства. Однако главным недостатком биопробы остается длительный инкубационный период уличного бешенства у мышей (7-18 суток).

М.А. Селимовым, H.A. Хисматулиной, Р.Х. Юсуповым было показано, что в культуре клеток НГУК-1 (клетки невриномы Гассерова узла крысы) уличный рабический вирус может быть выделен в более ранние сроки (24-72 ч.), с последующим анализом по МФА. Данный метод выделения уличного вируса бешенства в культуре клеток НГУК-1 был рекомендован для внедрения в практику ветеринарных лабораторий

Одним из эффективных методов быстрой диагностики бешенства является иммуноферменгаый метод определения вирусных антигенов с использованием поликлональных и моноклональных антител. При использовании сенсибилизированных специфическим иммуноглобулином пластин результат может быть получен спустя 3-4 часа после внесения исследуемого антигена. Метод ИФА позволяет выявлять рабический антиген с титром инфекционного вируса не менее 3,3 lg МЛД50/мл и процент выявления вируса бешенства составляет 94,2%. Следует отметить, что основным недостатком серологических методов и биопробы является то, что они не позволяют работать с деградированным патологическим материалом.

В последние годы, в связи с широким распространением арктического бешенства за пределы полярного круга, возрастает актуальность этой проблемы. А. Д. Ботвинкиным с сотрудниками с помощью набора моноклональных антител (36 МонАТ института Вистар, США, Wiktor et al., 1980; 36 МонАТ центральной ветеринарной лаборатории, Великобритания, King et al., 1990; МонАТ Р-41 исследовательского института вирусных болезней животных, Германия, Schneider et al., 1985), исследована антигенная вариабельность изолятов вируса бешенства, выделенных от животных и человека с 1969 по 1991 гг. из различных ландшафтно-географических зон России. Изоляты вируса бешенства первого серотипа были классифицированы на 9

антигенных вариантов, большинство которых связано с определенной территорией. Изоляты вируса бешенства, циркулирующею на северо-востоке нашей страны, имели общие эпитопы с изолятами с Аляски и северо-западных территорий Канады. Изоляты, имеющие маркер арктического варианта вируса бешенства, впервые были обнаружены в умеренных широтах России в виде отдельных очагов, наиболее крупный из которых находится в Прибалтийском регионе.

В Азиатской части Российской Федерации арктический вариант вируса бешенства обнаружены в горных районах на удалении до 1700 км от Северного полярного круга (Забайкалье, Тува, Якутия), в северо-западных районах России (Калининградская, Псковская, Ленинградская области), в Прибалтике и Белорусии - до 1000 км (А. Д. Ботвинкин, 1992 г.). На американском континенте арктический вирус бешенства также обнаружен не только на Аляске, Северо-Западных территориях Канады, но и в умеренных широтах - в штатах Онтарио, Квебек, Нью-Йорк, то есть до 50° северной широты (Smith, 1989).

Хотя вирус арктического бешенства не патогенен для человека, однако, дифференциация штаммов и изолятов классического и арктического бешенства, а также поиск генетических маркеров является важной задачей.

Анализ данных литературы показывает, что, несмотря на все преимущества традиционных методов даашостики бешенства, во многих лабораториях за рубежом и в нашей стране все шире и шире для лабораторной диагностики используются методы молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции. Преимуществом этих методов является их высокая чувствительность, специфичность, быстрота и безопасность.

Методы ПЦР и молекулярной гибридизации имеют преимущество перед серологическими методами в тех случаях, когда выявление специфического антигена не дает четких результатов или невозможно выделить вирус в культуре клеток и лабораторных животных при исследовании деградировавших патматериалов.

В настоящее время ПЦР технологию применяют в комбинации с секвенированием, что делает ее незаменимым и очень чувствительным методом идентификации вируса и определения его родства в отношении других штаммов. Для сравнительной характеристики геномов штаммов вирусов также проводят рестрикционный анализ ПЦР продуктов.

Исходя из вышесказанного нами были поставлены следующие цели и задачи исследования. Целью данной рабош является разработка методов идентификации вируса бешенства на основе молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

- провести клонирование фрагментов кДНК вируса бешенства в составе плазмидных векторов и отобрать клоны для конструирования ДНК-зондов;

оптимизировать условия проведения дот-гибридизации, определить специфичность ДНК-зондов и чувствительность метода молекулярной гибридизации для выявления РНК вируса бешенства в культуре клеток н в патологическом материале;

- подобрать специфичные праймеры для амплификации различных участков генома вируса бешенства, отработать методы подготовки проб и оптимизировать условия проведения ПЦР;

- определить специфичность и чувствительность метода полимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства;

- провести дифференциацию вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса бешенства на основе рестрикционного анализа ПЦР продуктов.

Научная новизна работы состоит в том, что:

- клонированы нуклеотидные последовательности генома вируса бешенства штамма ТС-80, разработаны условия постановки дот-гибридизации для идентификации вируса бешенства.

- определены праймеры и разработаны условия постановки ПЦР, позволяющие идентифицировать вирус бешенства в пробах патматериала.

- проведена дифференциация вакцинных штаммов вируса бешенства на основе рестрикционного анализа ПЦР продуктов. Установлена принадлежность штамма ТС-80 к генетической группе ERA.

- показана возможность дифференциации полевых изолятов арктического бешенства методом ПЦР.

Практическая значимость. Практическая ценность работы состоит в том, что на основании экспериментальных данных разработаны: «Набор препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом молекулярной гибридизации», «Набор препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом ПЦР». Проведены комиссионные испытания «Наборов препаратов...» для выявления РНК вируса

бешенства, разработаны методические указания по применению методов молекулярной гибридизации и ПЦР, которые утверждены на заседании ученого совета и подписаны директором ВНИИВВиМ (протокол № 6 от 09.07.98). «Наборы препаратов...» могут быть рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований с целью диагностики болезни. Предложен способ дифференциации вакцинных штаммов вируса бешенства с помощью рестрикционного анализа ПЦР - продуктов, который может быть использован для паспортизации производственных штаммов и контроля за изменениями вакцинных штаммов в процессе их хранении и культивирования.

На защиту выносятся следующие положения:

результаты разработки «Набора препаратов...» на основе метода молекулярной гибридизации для выявления РНК вируса бешенства;

результаты разработки «Набора препаратов ....» на основе полимеразной цепной реакции для выявления РНК вируса бешенства с использованием праймеров, комплементарных консервативной и вариабельной областям генома вируса бешенства;

результаты дифференциации вакцинных штаммов вируса бешенства с помощью рестрикционного анализа ПЦР продуктов;

результаты исследований арктических изолятов вируса бешенства, выделенных из патологических материалов, и дифференциация их от вакцинных штаммов вируса бешенства методом ПЦР.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1996 -1998 г.г. во ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями (тема 01.03.02.М),

Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: заседании ученого совета ВНИИВВиМ, 1998 г.; научных конференциях: ВНИИВиМ 1998г, институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН, г. Москва 1998г.

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ в материалах научных конференций.

В выполнении отдельных разделов работы оказали помощь научный сотрудник лаб. Биофизики, кандидат биологических наук Пантюшенко М.С., младший научный сотрудник лаб. Диагностики Недосеков В.В., зав. отделом Республиканской ветеринарной лаборатории Саха (Якутия) Романова У.Н., которым автор выражает искреннюю признательность.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 2.1. Структура генома вируса бешенства.

Вирус бешенства относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae, его геном представлен од