Эпизоотическая ситуация по бешенству животных в Московской области и совершенствование методов экспресс-диагностики

Анисина, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эпизоотическая ситуация по бешенству животных в Московской области и совершенствование методов экспресс-диагностики
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Эпизоотическая ситуация по бешенству животных в Московской области и совершенствование методов экспресс-диагностики"

На правах рукописи АНИСИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА ; Д) ¿Г

1// 7/

І/

ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ СИТУАЦИЯ ПО БЕШЕНСТВУ ЖИВОТНЫХ В МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005533486 г 5 СЕН 2013

Щелково-2013

005533486

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Щелково

Научный доктор биологических наук, профессор, заведующая

руководитель отделом иммунологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Кпюкина Валентина Ивановна

Официальные доктор биологических наук, профессор, оппоненты ведущий научный сотрудник отдела молекулярной биологии и вирусологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Кузнецова Светлана Владимировна

доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории эпизоотологии и мониторинга ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Мищенко Владимир Александрович

Ведущая ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

организация институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р. Коваленко» РАСХН

Защита диссертации состоится 18 октября 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ГНУ ВНИТИБП РАСХН; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН

Автореферат разослан 17 сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю.Д. Фролов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. К важнейшим задачам ветеринарной науки относится внедрение научных достижений в производство, разработка эффективных методов диагностики, профилактики и ликвидация инфекционных болезней животных, среди которых особое место занимает - бешенство. По данным ВОЗ бешенство по наносимому экономическому ущербу занимает пятое место среди инфекционных болезней (Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001).

Проблемы проявления бешенства в Российской Федерации и в отдельных ее регионах отражены в работах ведущих отечественных специалистов по вопросам рабической инфекции: Селимов М.А. (1978, 1998); Кузнецов П.П., Таршис М.Г., (1981); Сочнев В.В. (1987); Кузьмин И.В. (2001); Авилов В.М (2002); Джупина С.И. и др.(2002, 2007); Макаров В.В., Воробьев A.A. (2002, 2004); Ботвинкин А.Д. (2004); Иванов B.C. и др. (2004); Хрипунов Е.М. и др. (2005); Сидорова Д.Г. (2009); Сидоров Г.Н. и др. (1995, 1998,2011); Ведерников В.А. и др. (2010); Иванов A.B., Хисматуллина H.A., Чернов А.Н., Гулюкин A.M. (2010); Самуйленко А .Я., Гринь С.А. и др. (2012), Дудников С.А. (2012) и др.

Особенностям эпизоотологии бешенства животных и эффективности профилактических мероприятий в Московской области посвящены исследования Цвиль ДА., Родиной JI.B. и др. (2001, 2002); Балдиной И.В. (2003, 2004); Мовсесянц A.A. (2003, 2011); Заводских A.B. (2007). Причины сохранения напряженности эпизоотической обстановки по бешенству в таком быстроизменяющемся регионе, как Московская область, требуют дополнительного изучения. При этом необходимо проанализировать современную эпизоотическую ситуацию по бешенству с учетом влияния экологических и социальных факторов в сочетании с экспериментальными исследованиями.

Опасность распространения бешенства связана с особенностью патогенеза заболевания - передачей вируса зараженными животными при укусе или ослюнении. По данным Роспотребнадзора, в Российской Федерации за период 2008-2011 гг. зарегистрировано 57 летальных случаев среди людей. На территории Московской области в 2011 году зарегистрировано 3 чрезвычайных ситуации, связанные с укусами и ослюнениями бешеными безнадзорными собаками и кошками, от которых пострадало 50 человек. В этой связи постановка своевременного диагноза с применением экспресс-методов для обнаружения антигена вируса бешенства является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является анализ эпизоотической ситуации по бешенству животных на территории Московской области и разработка иммунохроматографической тест-системы для экспресс-выявления антигена вируса бешенства.

Достижение поставленной цели включало решение следующих задач:

1. Провести анализ социально-экономического положения Московской области и оценить ситуацию по бешенству животных в регионе за период 2008-2012 гг.;

2. Изучить роль собак в проявлении бешенства в Московской области;

3. Разработать технологию получения компонентов для конструирования иммунохроматографической тест-системы;

4. Определить эффективность применения разработанной тест-системы для экспресс-диагностики бешенства.

Научная новизна. Охарактеризованы особенности эпизоотического и эпидемического проявления бешенства с учетом экологической ситуации и современного социально-экономического положения Московской области. Показано, что предпосылками к обострению эпизоотической обстановки по бешенству в Московской области за период 2008-2012 гг. служили активизация природных очагов инфекции, увеличение популяции лисиц и

вовлечение в эпизоотии «городского» бешенства безнадзорных собак.

Получены компоненты, предложена схема и условия постановки иммунохроматографического анализа для индикации антигена вируса бешенства, основанные на использовании конъюгата антирабических антител с коллоидным золотом, антинуклеокапсидных и антивидовых антител.

Показана эффективность применения разработанной иммунохроматографической тест-системы при выявлении антигена вируса бешенства в ткани мозга, слюне и культуре клеток. Предлагаемая тест-система, с использованием указанных реагентов, может быть использована в качестве экспресс-метода для диагностики бешенства.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и предложены:

• набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого ИФА;

• тест-система для выявления вируса бешенства методом иммунохроматографии;

Результаты исследований представляют практическую ценность для оптимизации противоэпизоотических мероприятий по борьбе с бешенством.

Основные положения работы, выносимые на защиту:

1. Анализ эпизоотической ситуации по бешенству животных в Московской области за период 2008-2012 гг. с учетом экологического и социально-экономического положения региона.

2. Разработка технологии получения компонентов иммунохроматографической тест-системы и оценка ее эффективности при выявлении антигена вируса бешенства.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы проводились совместно

с к.б.н. Истоминой М.А. Автор выражает благодарность доктору биологических наук, профессору Матвеевой И.Н., главному ветврачу ЗооВетЦентра «Лебеди» к.б.н. Масимову Э.Н., ветврачу питомника «Восторг» Вдовиной И.М., ветврачу клиники «Добрый доктор» Царьковой К.Г.

Апробация результатов работы. Основные положения работы и результаты исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и Методической комиссии ГНУ ВНИИТБП 2011-2013 гг. в виде ежегодных отчетов по теме задания 08.06.01 «Разработать технологию изготовления и применения новых диагностикумов, средств профилактики и иммунокоррекции наиболее распространенных и экономически значимых инфекционных болезней животных на основе современного оборудования и технологических процессов».

Материалы диссертации представлены на: Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты интегрированной защиты животных от болезней», посвященной 50-летию ПТУ ВНИИВЭА (Тюмень, 2011); И-ой конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» (Покров, 2012); Международной конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» (Щелково, 2012); Международном конгрессе «Инновации - основа модернизации АПК» (Санкт-Петербург, 2012); на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Щелково, 2011, 2013).

На Международной выставке «Биоиндустрия-2012», Санкт-Петербург, 11-13 октября 2012 г. «Набор компонентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных» награжден серебряной медалью.

Публикации результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 в изданиях,

рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ («Ветеринарная медицина - 1, «Ветеринария и кормление» - 2).

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 160 стр. машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждений, выводов, практических предложений, списка использованных источников литературы и приложений. Список литературы включает 242 источника, в том числе 126 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 14 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 2011-2013 гг. в отделе иммунологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2011-2015 гг. по заданию 08.06: «Разработать высокоэффективные технологии изготовления новых лекарственных средств для ветеринарии и животноводства на основе современных биотехнологических процессов, базовых конструкций и универсальных технологических линий».

Материалы и методы

Материалы. В работе использовали производственный штамм фиксированного вируса бешенства «Овечий-ВГНКИ» и стандартный штамм «CVS» (ВГНКИ). Инактивацию вируса бешенства проводили 0,025% В-пропиолактоном. Вирус бешенства штамм «CVS», репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 с титром инфекционности 6,5 lg LD5()/0,03cm3, предоставлен доктором биологических наук, профессором Матвеевой И.Н.

Антисыворотки. Сыворотки, специфичные к вирусу бешенства и нуклеокапсиду (НК) получали иммунизацией баранов и морских свинок по схеме, разработанной в отделе иммунологии ГНУ ВНИТИБП.

Динамику накопления антирабических антител в сыворотке крови, полученной на 14, 21 и 28 сутки после окончания схемы иммунизации, определяли в реакциях диффузионной преципитации (РДП), связывания комплемента (РСК) и непрямом ИФА. Иммуноглобулины антивидовые к IgG барана получали на кроликах согласно ТУ 46-21-78-85. В качестве референс-антирабической сыворотки в непрямом ИФА служила антирабическая сыворотка крови собак, откалиброванная относительно отраслевого стандартного образца - «Референс-сыворотка антирабическая сухая» (ГНУ ВНИТИБП РАСХН) ТУ 9388-131-00494189-05.

Иммунохроматографическая тест-система. Для конструирования тест-системы ИХА использовали набор нитроцеллюлозных мембран «Advanced Mikrodevicts» (Индия); Protran ВА83 «Sigma» (размер пор 0,20,45 мкм); нитроцеллюлозные мембраны производства «Millipore» (США), на которые с помощью диспенсера IsoFlow («Imagene Technology», США) наносили иммуноспецифические и контрольные реагенты. Нитроцеллюлозные мембраны склеивали, нарезали на тест-полоски 0,5x6 см (ИХА-полоски) и хранили в плотно закрытых пластиковых тубах при 4°С.

Анализируемый материал. Антиген вируса бешенства выявляли методом иммунохроматографического анализа (ИХА) в ткани мозга мышей, зараженных вирусом бешенства штамм «CVS» (5,6 lg LD50/0,03cm ) и баранов, зараженных вирусом бешенства штамм «Овечий» (3,8 lg LD50/0,03cm3); в смеси вируса бешенства и слюны; в суспензии культурального вируса бешенства штамм «CVS» (6,5 lg LD50/0,03 cm3).

Контрольными препаратами служили слюна здоровых собак, ткань

мозга незараженных мышей и баранов. Содержание антирабических

антител (МЕ\мл) в сыворотке крови собак, полученных из ветлечебниц,

приютов и питомников за период 2011-2013 гг., определяли непрямым вариантом иммуноферментного анализа (ИФА). Пробы сыворотки хранили при -20°С и перед исследованием инактивировали при 37°С в течение 30 мин.

Индикация антигена вируса бешенства. Антиген вируса бешенства в ткани мозга мышей и баранов выявляли прямым методом флюоресцирующих антител с компонентами набора «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» ТУ 9388-0300497963-97 (ГНУ ВНИИТИБП РАСХН).

Очистка вируса бешенства и выделение нуклеокапсида. Вирус бешенства очищали ступенчатым центрифугированием суспензии ткани мозга баранов, зараженных вирусом бешенства штамм «Овечий». Препарат нуклеокапсида получали центрифугированием суспензии частично очищенного и концентрированного вируса бешенства, обработанной тритоном Х-100 по методу A. Helenius (1973).

Выделение IgG. IgG из антирабической, антинуклеокапсидной и нормальной сывороток выделяли методом ионообменной хроматографии на DEAE-TRISACRYL PLUS LS («Sigma») сефарозе, из кроличьей антивидовой (анти-IgG барана) - методом аффинной хроматографии на Protein A Agarose CL-4B («Fluka») по рекомендациям фирм изготовителей. Специфичность антирабических IgG подтверждали в непрямом МФА с конъюгатом кроличьих анти-IgG барана и морской свинки антител, меченных ФИТЦ (98% чистоты, «Sigma»), который готовили по ТУ 9388003-00497963-97. Концентрацию белка в сыворотке крови, препаратах антигенов и антител определяли по методу О.Н. Lowry et al. (1958).

Анализ ситуации по бешенству в Московской области. В работе

проанализированы доступные официальные данные Федеральной службы

по ветеринарному и фитосанитарному надзору (г. Москва);

Роспотребнадзора (г. Москва); ИАЦ ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир);

Главного управления ветеринарии Московской области (г. Москва) и

, ФГБУ «Центр ветеринарии» (г. Москва) по заболеваемости животных бешенством. Анализ экологической ситуации в Московской области проводили на основе доступных данных отчетов Правительства Московской области.

Определение антирабических антител. Активность антирабической сыворотки устанавливали в РСК по методу Е. Kuwert (1973), в РДП с «Набором компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации» ТУ 9388-006-0049763-99 (ВНИТИБП). Содержание антирабических антител (МЕ\мл) в сыворотке крови вакцинированных против бешенства собак определяли непрямым ИФА с сорбированным гликопротеином (G) вируса бешенства и пероксидазным конъюгатом протеина А (ГНУ ВНИТИБП, 2011). Результат вакцинации оценивали как эффективный, если в сыворотке вакцинированных против бешенства собак содержание вируснейтрализующих антител составляло не менее 0,5 МЕ/мл.

Иммунохроматографический анализ. «Сэндвич» вариант ИХА проводили по методу Lembo Т., et. al. (2006). Золь коллоидного золота получали по методу G. Frens (1973). Конъюгат антирабических IgG с частицами коллоидного золота готовили по методу G.T. Hermanson (1996). Оптимальные условия сорбции иммунореагентов, состав лизирующего буфера, условия постановки и учет результатов ИХА определяли экспериментально. Чувствительность (предел обнаружения) ИХА определяли по результатам титрования в тест-системе инфицированной ткани мозга и суспензии вируса бешенства в слюне. Эффективность ИХА оценивали путем сравнения с результатами выявления антигена вируса бешенства в прямом МФА.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами (Г.Ф. Лакин, 1980). Графический анализ выполнен с использованием

программного обеспечения «Microsoft Excel».

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Анализ эпизоотической ситуации по бешенству животных в Московской области за период 2008-2012 гг. с учетом экологического и социально-экономического положения региона

Анализ эпизоотической ситуации по бешенству животных на территории Московской области. (МО) требует необходимости учета влияния природных и социально-экономических факторов. Московская область - это уникальное сочетание урботехногенных и природных геоэкосистем: крупнейший мегаполис со значительными массивами лесов, сельскохозяйственных угодий, речных долин с естественными природными ресурсами и биоразнообразием.

Территория современной МО заселена более 20 тыс. лет назад. Исторически Московской области предшествовала Московская губерния, утвержденная Петром I в 1708 году. В настоящее время (2013) в МО -субъекте Российской Федерации в составе Центрального ФО, насчитывается 77 городов, 16 из которых с населением свыше 100 тыс. человек. Подмосковье занимает 44379 км2 (0,3% всей территории России), с общей численностью населения 7 048 089 человек (5% всего населения страны), средней плотностью - 158,82 чел/км2 (2013), в 19 раз выше, чем в целом по стране. Летом население МО увеличивается на 2 млн. человек.

В Московской области, 41% территории которой занимают леса, прослеживается характерная ландшафтная география бешенства.

Область располагается на границе трех природных областей: таежной, широколиственной и степной, где природные очаги бешенства выявлены в Рузском, Истринском, Лотошинском, Клинском, Дмитровском, Шатурском, Орехово-Зуевском, Павлово-Посадском районах, расположенных в зоне Смоленско-Московской возвышенности и ее Клинско-Дмитровской гряды и зоне Мещерской низменности.

Около 4,6% площади Московской области занимают 13 охраняемых природных массивов, крупнейшими из которых являются Приокско-Террасный государственный природный биосферный заповедник и Национальный парк «Лосиный остров», а также 165 заказников, 80 памятников природы, 54 заповедных лесных участков.

Особенность данных территорий заключается в их статусе, который устанавливает ограничения, не позволяющие снижать численность диких плотоядных животных в необходимых объемах.

Причины осложнения эпизоотической ситуации по бешенству в Московской области за последние 20 лет тесно связаны с нарушением экосистем, вызванное деятельностью человека. Основными источниками загрязнения в Подмосковье являются автотранспорт, промышленность, а также свалки. Москва и область в год производят 10 млн. т. твердых бытовых отходов, которые вывозятся на 41 Подмосковный полигон и около 200 «диких», несанкционированных мусорных свалок, которые занимают свыше 800 га. По состоянию на 2013 г., объем твердых бытовых отходов на полигонах Подмосковья превысил 120 млн. тонн, которые являются не только источниками биологического загрязнения, но и факторами эпизоотологической и эпидемиологической опасности из-за скопления на их территории диких и безнадзорных, одичавших животных. В течение многих лет на территории свалок происходит деградация растительности, размножение грызунов - разносчиков заболеваний, ухудшение здоровья населения, проживающего в окрестностях.

Наблюдаемая в настоящее время тенденция расширения границ Москвы и городов Подмосковья, вторжение в лесные массивы, а также усиление рекреационного использования территории, привели к распространению бешенства среди лисиц, рост популяции которой связан с высокой урбанизацией региона, увеличением численности грызунов на оставшихся площадях сельскохозяйственных угодий, переходом вида на

новые источники питания (свалки, пищевые отходы вдоль дорог и т. д.).

По оценкам МСХ и продовольствия Московской области в регионе не обрабатываются более 40% земель сельскохозяйственного назначения.

Ежегодно отмечается рост случаев бешенства собак, контактирующих с дикими животными, которые являются главным переносчиками вируса бешенства человеку.

Анализ природных условий,. экологии и социально-экономической характеристики МО на современном этапе указывает на существование предпосылок формирования и поддержания эпизоотий бешенства как природного, так и городского типа в этом регионе.

Процесс урбанизации МО, расширение границ Москвы, городов Подмосковья и вторжение в лесные массивы, рост численности диких плотоядных и безнадзорных животных способствуют обострению эпизоотической ситуации по бешенству на территории Московской области.

2. Эпизоотическая ситуация по бешенству животных в Московской области

В Московской области первые послевоенные случаи бешенства животных зарегистрированны в 1976 году в южных районах: Серпуховском, Зарайском и Луховицком.

На протяжении последующих 20 лет уровень заболеваемости не превышал 30 случаев в год. К 1998 году на юго- и северо-западе (Клинский, Волоколамский, Лотошинский, Можайский, Рузский, Шаховской районы) сформировался стойкий эпизоотический очаг бешенства диких животных, с вовлечением в процесс домашних животных.

Данные, характеризующие эпизоотическую ситуацию за период 1999— 2012 гг. в МО, представленные на рис.1, свидетельствуют о выраженной динамике эпизоотического процесса.

Анализ многолетней динамики заболеваемости бешенством показал, что с 1999-2012 гг. зарегистрировано 1864 случая бешенства всех видов животных, при среднегодовом показателе - 133,1±24,1 случаев.

Значительный рост числа случаев бешенства зарегистрирован в 2005 году - 9,5% (от общего числа), в 2009 - 13,9% и 14,8% в 2012 году. Кратковременное улучшение ситуации отмечено в 2004 (4,8%), 2006 (3,3%) и 2010 (8,4%) годах. С 2002 по 2012 г. обстановка по бешенству характеризуется высокими показателями заболеваемости.

За исследуемый период (2008-2012 гг.) на территории МО зарегистрировано 1148 случаев бешенства разных видов животных, при среднегодовом показателе 229,6±16,4 случаев.

На фоне резкого роста числа случаев заболевания наблюдается тенденция к расширению популяционных и территориальных границ эпизоотического проявления бешенства (табл. 1).

Основная доля случаев заболеваемости бешенством регистрировалась среди диких животных, из которых 60,8% (698 случаев) приходится на лисиц, 16,2% (186) на енотовидную собаку, менее 1,0% - на лося, куницу, барсука, ежа. Удельный вес заболевших собак составил 12,5% (144 случаев), кошек - 7,1% (82).

Таблица 1 - Структура заболеваемости бешенством в МО

Вид животного Годы исследования/случаи бешенства

2008 2009 2010 2011 2012

Лисица 119(55,6%) 144 (55,4%) 98 (62,1%) 159(66,4%) 178(64.5%)

Енотовидная собака 52 (24,2%) 52 (20%) 27(17,1%) 32 (13,3%) 23 (8,3%)

Собака 26 (12,2%) 36(13,8%) 16(10,1%) 25 (10,4%) 41 (14,8%)

Кошка 8 (3,7%) 18(6,8%)' 13 (8,3%) 19 (7,9%) 24 (8,7%)

КРС 4(1,9%) 3 (1,2%) - 2 (0,8%) 4(1,5%)

MPC 1 (0,5%) 3 (1,2%) - 1 (0,4%) 2 (0,7%)

Свинья - 1 (0,4%) - - .

Лось - - 1(0,6%) ■ 2 (0,7%)

Лошадь - 1 (0,4%) - - -

Хомяк - - - 1 (0,4%)

Хорь - 1 (0,4%) 1 (0,6%) - -

Бобер - - 1(0,6%) - -

Крыса - 1 (0,4%) - - -

Куница - - - - 1 (0,4%)

Барсук - - - 1 (0,4%)

Еж 3 (1,4%) - 1 (0,6%) 1 (0,4%) -

Белка 1 (0,5%) - - -

Всего 214 (100%) 260 (100%) 158(100%) 240(100%) 276(100%)

За пятилетний период в МО зарегистрировано 186 (16,3%) случаев

бешенства енотовидной собаки. Наблюдаемая интенсивность эпизоотии бешенства, по оценкам специалистов, связана с увеличением популяции лисицы, численность которой на 2012 год составила 10 тыс. голов, что в 2 раза больше, чем в 90-е годы.

За исследуемый период с 22 до 40 возросло число муниципальных образований Московской области, в которых регистрировались случаи бешенства животных. Природные очаги бешенства выявлены в северных и северо-западных районах Подмосковья. Наиболее неблагополучными по бешенству являются Рузский - 120 случаев (10,4%), Истринский - 95 (8,2%), Лотошинский - 83 (7,2%), Клинский - 82 (7,1%), Дмитровский - 66 (5,7%), Можайский - 52 (4,5%) районы. Наблюдается продвижение эпизоотии в северо-восточном направлении, с захватом ранее благополучной Костромской области ЦФО, из 7 пограничных с МО

областей, 6 являются неблагополучными по бешенству животных (табл. 2).

Область Годы исследования/случаи бешенства

2010 2011 2012 Всего(100%)

Твеоская 97 (34,9%) 50(18%) 131 (47,1%) 278

Ярославская 10 (7,9%) 58 (45,7%) 59 (46,4%) 127

Владимирская 39 (33,3%) 52 (44,5%) 26 (22,2%) 117

Рязанская 18(64,2%) 8 (28,6%) 2 (7,1%) 28

Тульская 45 (22,9%) 78 (39,8%) 73 (37,3%) 196

Калужская 54 (22,3%) 123 (50,8%) 65 (26,9%) 242

Смоленская 65 (16,7%) 215 (55,6%) 107 (27,6%) 387

Опасная эпизоотическая ситуация по бешенству выявлена в Смоленской, Тверской, Калужской и Тульской областях, откуда возможен приток больных животных в другие регионы, в том числе и в Московскую область.

Оценивая роль собак в эпизоотическом и эпидемическом процессе проявления бешенства на территории МО, следует отметить, что собаки представляют собой группу наивысшего риска в реализации связей между природными и антропургическими типами бешенства. За 5-летний период в МО зарегистрировано 144 случая бешенства собак, причем 18,0% приходится на 2008 г., 25,0% на 2009 г. и 28,4% на 2012 год (рис. 2).

■ Всего * Собаки

2008 2009 2010 2011 2012 Годы

Рис. 2 Случаи бешенства собак в МО за 2008-2012 гг. Рост заболеваемости бешенством собак с учетом эпидемиологических данных указывает на существование в МО антропургических очагов инфекции.

Одной из эпидемических особенностей проявления бешенства в последние годы является ежегодное увеличение числа лиц, укушенных бешеными животными: 119 человек в 2008 году, 230 - в 2009 г., 79 - в 2010 г. Наибольшая обращаемость населения по поводу укусов животных приходится на г. Зеленоград (показатель - 2207,4), Рузский (739,1), Истринский (618,7) районы при среднем показателе по области 358,0 на 100 тыс. населения.

Другая негативная особенность — регистрация случаев укусов крупных групп людей больными животными (табл. 3).

Таблица 3 - Случаи контакта больных животных с людьми за 2008-2010 гг.

Территория МО районы год Вид и статус животного Число пострадавших Число в контакте

Истринский 2012 Собака безнадзорная 12

2012 Собака безнадзорная 14 _

2011 Собака домашняя 19

2010 Собака безнадзорная 8 -

2009 Козленок - 13

2009 Лошадь - 49

2008 Собака безнадзорная 11 _

Солнечногорский 2012 Собака домашняя 9

Клинский 2010 Собака безнадзорная 11 _

Орехо-Зуевский 2009 Собака домашняя 14 -

Красноармейский 2009 Собака безнадзорная 10

Подольский 2008 Собака безнадзорная 13 -

Луховицкий 2008 Кошка безнадзорная 8

Серпуховской 2008 Собака безнадзорная 10 _

Наро-Фоминский 2012 Собака домашняя 10 -

2011 Кошка безнадзорная 7 _

Чеховский 2012 Собака безнадзорная 5

Шаховской 2011 Кошка безнадзорная 24 -

Одинцовский 2012 Лось - 14

2012 Собака безнадзорная 16 -

Как видно из данных, представленных в таблице 3, случаи нападений

больных животных на людей с числом пострадавших от 5 до 24 человек были зарегистрированы в 12 районах Московской области.

За период 2008-2012 годы на территории МО от гидрофобии погибло 5 человек, в том числе в 2008 году - 3, в 2011 году - 1, в 2012 - 1.

Источником заражения явились лисицы (2 случая), енотовидная собака (1), безнадзорная кошка (1) и безнадзорная собака (1).

Ежегодно в лечебно-профилактические организации Московской области за антирабической помощью по поводу укусов животными обращаются от 24 до 26 тыс. человек.

Несмотря на то, что число вакцинированных против бешенства собак в МО с 2009 по 2011 гг. увеличилось в 1,5 раза, ежегодно в области регистрируется в среднем 28,8±4,9 случаев бешенства собак. В этой связи, обязательная ежегодная вакцинация домашних и регулирование численности безнадзорных собак являются основными мерами по ликвидации «городского» бешенства.

Методом непрямого ИФА было определено содержание (МЕ/мл) антител в 124 пробах сыворотки крови собак: 1-я группа - безнадзорные собаки, с травмами из ветлечебниц и приютов (п=55); 2-я группа -домашние собаки (п=40) из частных ветеринарных клиник; 3-я группа -собаки из питомника (п=20); 4 группа - щенки (п=9) от домашних собак (табл.4).

Таблица 4 - Результаты исследования сывороток крови собак в ИФА

Группа/Срок п/в Всего собак Содержание антител МЕ/мл

Не обнаружено <0,5 >0,5 <5,0 <5,0

I Всего 55 46 (83,6%) 8 (14,5%) 1 (1,8%) -

Через 1 год 24 . - - 20 (83,3%) 4(16,7%)

Через 3 года 14 - - 3 (21,4%) 11 (78 ,5%)

II Всего 40 - - 3 (7,5%) 37 (92,5%)

Через 3 года 24 - - 12 (50%) 12 (50%)

III Всего 20 - - - 20 (100%)

IV 30 день п/в 9 - - 9 (100%) 8 (88,8%)

6 мес. п/в 9 - - 9 (100%) 7 (77,7%)

Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что 83,6% обследованных безнадзорных уличных собак не защищены от заражения бешенством и в их сыворотке крови не были выявлены специфические антитела.

Среди домашних собак 2-3 групп содержание антител >0,5 МЕ/мл установлено у 100% собак. У щенков на 30-й день после первой вакцинации содержание антител >0,5 <5,0 МЕ/мл установлен во всех пробах. Плановая иммунизация через 6 месяцев индуцировала иммунный ответ на уровне >0,5 МЕ/мл у 100% животных, из которых в 77,7% уровень антител (>5,0 МЕ/мл) был оценен, как высокий.

Полученные результаты свидетельствуют о неоднородности антирабического иммунитета у собак уличного и домашнего содержания. Показано, что ежегодные вакцинации моно- и комплексными вакцинами, поддерживают иммунный статус выше порогового уровня у собак в течение 3-х лет (срок наблюдения). Установлено, что результаты антирабической вакцинации зависят от сопутствующих заболеваний собак и не обнаружено значительных различий в содержании антител в сыворотке крови собак, привитых импортными и отечественными антирабическими вакцинами.

3. Разработка технологии получения компонентов иммунохроматографической тест-системы и оценка ее эффективности для выявления антигена вируса бешенства

Задачей настоящего исследования было определение возможности использования ИХА на нитроцеллюлозных мембранах с применением нерастворимого субстрата (частиц коллоидного золота) для выявления антигена вируса бешенства, локализованного в ткани мозга, слюне животных, культуре клеток и подбор условий проведения анализа.

Ранее автором совместно с Истоминой М.А. (2011) были разработаны две тест-системы точечного анализа на нитроцеллюлозных мембранах для диагностики бешенства: dot-ELISA с конъюгатом анти-рибонуклеопротеиновых (РНП) антител с пероксидазой и частицами коллоидного золота, и показана эффективность выявления антигена вируса бешенства в экспериментальных пробах слюны собак.

Чувствительность dot-ELISA составила 2,3 lg LD50/0,03cm3, с частицами коллоидного золота - 2,0 lg LD50/O,O3cm3 выявляемого вируса.

- К недостаткам тест-систем можно отнести многокомпонентность и длительность проведения анализа (1-2 часа).

Для визуализации результатов анализа мембрану необходимо инкубировать в растворе маркеров - конъюгата анти-РНП IgG с пероксидазой (dot-ELISA) или частицами коллоидного золота, что требует большого расхода иммуноспецифических компонентов.

Предложенный нами «сэндвич» вариант ИХА предполагает стратегию выявления антигена вируса бешенства на нитроцеллюлозной мембране с предварительно фиксированными конъюгатом высокоаффинных антирабических IgG с частицами коллоидного золота (подушка конъюгата), антинуклеокапсидными IgG (тестовая линия) и антивидовыми IgG (контрольная линия).

О наличии антигена вируса бешенства в пробе свидетельствует появление окрашенных полос на тестируемой и контрольной линии. Технология'приготовления компонентов для ИХА тест-системы включала: очистку вируса бешенства и нуклеокапсида (НК); получение высокоактивных антисывороток; выделение IgG из антирабической и анти-НК сыворотки; синтез конъюгата с частицами коллоидного золота; приготовление на кроликах анти-IgG барана сыворотки и очистка антивидовых IgG.

Очистка вируса бешенства и нуклеокапсида. Вирус бешенства

очищали из 20% суспензии инфицированной ткани мозга

центрифугированием в течение 30 мин. при 5 тыс. об/мин. и 90 мин. на

центрифуге «Thermo Fishcer» при 40 тыс. об/мин. В результате

оптимизации параметров процесса выделения НК, таких как концентрация

тритона Х-100, температура и время инкубации, препарат НК с

содержанием белка 1,80 мг/см3 был получен центрифугированием

обработанной 2% тритоном Х-100 суспензии очищенного вируса при 40

тыс. об/мин в течение 1,5 ч. Препарат НК после очистки сохранял антигенные свойства и с референс-антирабической сывороткой выявлял специфические антитела в РСК 1:320 и РДП 1:64 в более высоких титрах, чем очищенный вирус бешенства (1:160 и 1:32).

В результате 5-ти кратного введения с интервалом 5 дней баранам очищенного вируса и НК вируса бешенства морским свинкам были получены антирабические сыворотки с максимальной активностью на 28-й день после окончания схемы иммунизации, которая сохранялась до 56 суток (срок наблюдения). Очищенный вирус индуцировал образование у баранов и препарат НК у морских свинок комплементсвязывающих антител в титре 1:160, 1:320 и преципитирующих антител - 1:128, 1:512 соответственно (рис 3).

и РСК (б)

Выделение препаратов IgG. Методом ионообменной хроматографии на DEAE TRISACRYL PLUS LS сефарозе и на Protein A Agarose CL-4B с последующим концентрированием получены препараты IgG из антирабической, анти-НК, нормальной и антивидовой сывороток с содержанием белка 0,8-1,2 мг/см3 (табл. 4).

Примененная нами схема иммунизации кроликов IgG барана позволила получить антивидовую сыворотку, максимальная активность которой на 28 день после окончания иммунизации в РДП составила 1:64, в непрямом ИФА - 1:51200.

Таблица 4 - Характеристика препаратов 1§0-антител

Сыворотка/ Антисыворотка Препарат 1йй

Титры Белок (мг/см3) Применение

РСК РДП

Антирабическая 1:320 1:512 0,8 ^в-антитела для коньюгирования с частицами коллоидного золота

Анти-нуклеокапсидная 1:128 1:160 0,92 Анти-НК ^О-ангитела для сорбции на тестовую линию

Нормальная сыворотка барана 1,2 ^О-антитела для иммунизации кроликов и приготовления антивидовой сыворотки

Кроличья анти-^О барана 1:64 1,0 1§0-антитела для сорбции на контрольную линию

Результаты контроля препаратов ^О методом электрофореза в ПААГ свидетельствовали о чистоте выделенных Специфическая активность выделенных из антирабической и анти-НК сывороток, была показана в непрямом МФА. При исследовании ткани мозга мышей, инфицированных вирусом бешенства штамм «С\^8», после нанесения специфических и антивидовых антител, меченных ФИТЦ, антиген вируса обнаруживался в виде окрашенных внутриклеточных цитоплазматических включений.

Для синтеза иммунозолотого маркера устойчивый золь коллоидного золота красного цвета с размером частиц 30 нм был получен по технологии, основанной на кипячении раствора 0,01% золотохлористо-водородной кислоты, НАиСЦ*п Н20 (ОАО «Аурат», Россия) и 0,015% цитрата натрия («Р1ика»), Титрованием антирабических в диапазоне 5320 мкг/см3 в и-лунках планшета с 1,0 см3 золя коллоидного золота (А52о -1,0) установлена оптимальная доза - 100 мкг для иммобилизации на частицы коллоидного золота при рН 9,0±0,2. Сорбционная доза конъюгата антирабических с коллоидным золотом, анти-НК и кроличьих анти-^О барана антител на нитроцеллюлозной мембране, установленная экспериментально в ИХА по интенсивности окрашивания тестовой и контрольной линий, составила 50, 80 и 50 мкг/см3 соответственно.

Изучение сорбированных на нитроцеллюлозной мембране компонентов показало, что они сохраняют специфическую активность в течение 12 месяцев при 4°С.

Оценка эффективности тест-системы ИХА. С помощью

разработанной тест-системы была изучена возможность обнаружения

антигена вируса бешенства в ткани мозга зараженных мышей и баранов,

экспериментальных пробах смеси слюны с вирусом бешенства, пробах

культурального вируса. Для обеспечения максимального специфического

связывания выявляемого антигена вируса бешенства с

иммуноспецифическими реагентами предложен трис-НС1 буфер рН

8,0±0,2 с тритона Х-100 и додецилсульфата натрия. О наличии вируса

бешенства в пробе свидетельствовало появление двух окрашенных полос

на тестируемой и контрольной линиях. Образец считался отрицательным,

если проявляется только одна линия в контрольной зоне. В результате

проведенных исследований установлено, что методами МФА и ИХА в

ткани мозга зараженных животных антиген вируса бешенства был

обнаружен в 100% образцов. В пробах слюны и инфицированной культуре

антиген вируса бешенства был обнаружен 83,3% (15 из 18) и 77,7% (7 из 9)

образцов. Показано, что интенсивность окраски тестовой полосы зависит

от исследуемых проб и находится в прямой зависимости от концентрации

вируса в пробе. Увеличение интенсивности окраски, как правило,

совпадало с повышением концентрации искомого вируса в пробе. При

нанесении на ИХА полоску ткани мозга мышей менее 2,5%, мозга барана

5%, смеси вирус+слюна в разведении менее 1:64, культурального вируса

1:4 не приводило к появлению окраски в аналитической зоне, что

свидетельствует о пределе чувствительности обнаружения вируса

бешенства в данных пробах методом ИХА. Контрольный материал не

давал реакций с разработанным нами ИХА-тестом для выявления антигена

вируса бешенства. Результаты анализа ткани мозга после хранения в 50%

глицерине и при 20°С в течение 72 часов показали, что образцы были

пригодны для исследования методом ИХА. Разработанная тест-система ИХА позволяет сократить общее время анализа до 30 минут и может служить основой для создания безинструментальных систем экспресс-диагностического тестирования.

Выводы

1. Анализ природных условий, социально-экономической характеристики МО и эколого-эпизоотической ситуации на современном этапе указывает на существование предпосылок формирования и поддержания эпизоотий бешенства как природного, так и городского типа. Важнейшими предпосылками осложнения эпизоотической обстановки по бешенству в 2008-2012 гг. послужили процесс урбанизации городов Подмосковья, высокая численность лисиц и рост численности безнадзорных собак.

2. Бешенство животных регистрировалось на территории 40 муниципальных образований Московской области. Наиболее неблагополучными остаются северные и северо-западные районы Подмосковья: Рузский, Истринский, Лотошинский, Клинский, Дмитровский и Можайский. Существует вероятность заноса возбудителя болезни из неблагополучных по бешенству соседних Смоленской, Тверской, Калужской и Тульской областей ЦФО.

3. Анализ видовой структуры заболеваемости бешенством животных в Московской области свидетельствует о том, что наибольшее число случаев регистрируется среди диких плотоядных, из которых 60,8% приходится на долю лисиц, 16,2% - енотовидной собаки, с вовлечением в эпизоотические цепи домашних плотоядных - 12,5% собак и 7,1% кошек.

4. Процесс урбанизации Московского региона создал предпосылки для

эпизоотии городского типа, главными медиаторами которой являются

безнадзорные собаки. К негативным особенностям проявления бешенства

собак следует отнести ежегодное увеличение числа лиц, укушенных

бешеными животными: 230 человек (2009 год) против 119 человек (2008

год) и регистрация нападений больных животных на группы людей с числом пострадавших от 8 до 24 человек в Щ населенных пунктах.

5. Полученные результаты свидетельствуют о неоднородности антирабического иммунитета у собак уличного и домашнего содержания. Показано, что ежегодные вакцинации моно- и комплексными вакцинами, поддерживают содержание антител в сыворотке крови выше порогового уровня у собак всех групп в течение последующих 1-3 лет (срок наблюдения). Установлено, что результаты антирабической вакцинации зависят от сопутствующих заболеваний собак и не обнаружено значительных различий применения импортных и отечественных антирабических вакцин.

6. Разработана технология получения компонентов иммунохроматографической тест-системы на основе очистки IgG из антисывороток методом ионообменной хроматографии. Установлено, что иммуноспецифические и контрольные компоненты, сорбированные на поверхность нитроцеллюлозной мембраны в оптимальной концентрации, сохраняют активность в течение 12 месяцев при 4°С.

7. Показана принципиальная возможность выявления антигена вируса бешенства «сэндвич» методом иммунохроматографического анализа с использованием нитроцеллюлозных мембран с фиксированным конъюгатом высокоаффинных антирабических IgG с частицами коллоидного золота (подушка конъюгата), антинуклеокапсидных IgG (тестовая линия) и кроличьими анти-IgG барана антителами (контрольная линия).

8. Показано, что результаты определения антигена вируса бешенства методом иммунохроматографического анализа находятся в прямой зависимости от концентрации вируса в пробе. Метод ИХА пригоден для исследования ткани мозга после хранения в 50% глицерине и после длительного (72 ч.) хранения при 20°С.

Практические предложения

В результате проведенных исследований предлагаются для практики:

• НТД на «Набор реагентов для количественного определения антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА)», утверждена директором ГНУ ВНИТИБП РАСХН А.Я. Самуйленко, 05.04.2011 г.;

• «Методические положения по количественному определению антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа», утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН, A.M. Смирновым, 08.08.2011 г.;

• НТД на тест-систему для выявления вируса бешенства методом иммунохроматографии, утверждена директором ГНУ ВНИТИБП РАСХН А.Я. Самуйленко, 16.07.2013 г.;

• «Методические положения по выявлению вируса бешенства методом иммунохроматографии», утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН A.M. Смирновым, 02.07.2013 г.

• «Методические положения по выявлению антигена вируса бешенства методом контрастной иммунофлюоресценции», утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН, А.М. Смирновым 8 августа 2011 г.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Истомина М.А., Юпокина В.И., Анисина О.В. Тест-система на основе dot-ELISA для экспресс-диагностики бешенства. // Ветеринарная медицина. - 2011. - № 3 - С. 46-48.

2. Клюкина. В.И., Анисина O.B. Выявление антигена вируса бешенства с использованием иммунохроматографического экспресс-теста // Ветеринария и кормление. - 2012. - № 6. - С 23-24.

3. Клюкина В.И., Анисина О.В., Бондарева H.A., Богомолова O.A. ИФА для оценки эффективности вакцинации собак против бешенства.

// Ветеринария и кормление.- 2012. - № 6. - С 28-29.

Материалы и тезисы Международных и Всероссийских конференций

4. Клюкина В .И., Истомина М.А., Анисина О.В. Сравнительный анализ тест-систем на основе точечного анализа для экспересс-диагностики бешенства // Материалы Международной научно-практической конференции "Труды Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной энтомологии и арахнологии". Тюмень 2011 г. - Сборник №51. - С. 69-74.

5. Анисина О.В., Матвеева И.Н., Клюкина В.И. Усовершенствование технологии получения антирабической гипериммунной сыворотки // Материалы П-ой конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине», ГНУ ВНИИВВиМ. -Покров. - 2012. - С. 154-157.

6. Анисина О.В., Клюкин И.О., Клюкина В.И. Оценка коньюгатов для диагностики бешенства методом иммунофлюоресценции // Материалы 11-ой конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине», ГНУ ВНИИВВиМ. - Покров. -2012.-С. 96-97.

7. Анисина О.В., Клюкина В.И., Бондарева H.A., Богомолова O.A. Эколого-эпизоотическая ситуация по бешенству в Московской области // Международная конференция «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК», ГНУ ВНИТИБП. -2012. - С. 215-218.

8. Клюкина В.И, Бондарева H.A., Богомолова О.А, Анисина О.В. Иммунохроматографичеекий тест для выявления антигена вируса бешенства. // Международная конференция «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК», ГНУ ВНИТИБП. - 2012. - С. 152-154.

9. Клюкина В.И., Бондарева H.A., Богомолова O.A., Анисина О.В. Эпизоотическая ситуация и оценка эффективности вакцинации собак против бешенства методом ИФА. // Международная конференция «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК», ГНУ ВНИТИБП. - 2012. - С. 212-215.

10. Анисина О.В., Юпокин И.О. Региональные эколого-эпизоотические особенности рабической инфекции // «Теоретические и практические аспекты развития современной ветеринарной науки», КазНИВИ,- Алматы - №58.-2012. - С.15-16

11. Клюкина В.И., Анисина О.В. Тест-системы для диагностики бешенства/Международная конференция «Инновационные биотехнологии в странах ЕврАзЭС». (Международная выставка «Биоиндустрия-2012»), Санкт-Петербург. - 2012. - С 50.

12. Анисина О.В., Клюкина В.И. Современная эколого-эпизоотическая ситуация по бешенству в Московской области // Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов», ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - Казань. - 2012. - С.28-29

Заказ № 224. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул .Палиха 2а.тел.(499)250-92-06 www.postator.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анисина, Ольга Владимировна, Щёлково

Российская академия сельскохозяйственных наук

Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ «ВНИТИБП» РАСХН)

На правах рукописи

04201361876

АНИСИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ СИТУАЦИЯ ПО БЕШЕНСТВУ ЖИВОТНЫХ В МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

по специальности 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В. И. Клюкина

Щелково-2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..........................................................6

1. ВВЕДЕНИЕ..........................................................................8

1.1 Актуальность темы............................................................8

1.2 Цель и задачи исследования.................................................9

1.3 Научная новизна...............................................................9

1.4 Основные положения работы, выносимые на защиту................10

1.5 Личный вклад соискателя..................................................10

1.6 Апробация результатов работы............................................10

1.7 Публикация результатов исследования..................................11

1.8 Объем и структура диссертации........................................11

2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................12

2.1 Экология и география распространения бешенства.....................12

2.2 Эпизоотическая ситуация по бешенству в РФ............................16

2.3 Экологическая обстановка и социально-экономическое положение МО.......................................................................................18

2.4 Эпизоотическая ситуация по бешенству в МО...........................22

2.5 Роль безнадзорных собак в эпизоотии бешенства в МО.................23

2.6 Возбудитель бешенства........................................................26

2.6.1 Классификация ЬуззауипБ................................................26

2.6.2 Морфология и свойства вируса бешенства...........................27

2.6.3 Восприимчивость к бешенству животных............................29

2.7 Патогенез..........................................................................30

2.8 Формирование иммунитета у животных при бешенстве................32

2.9 Диагностика бешенства........................................................33

2.9.1. Традиционные методы диагностики бешенства....................33

2.9.2. Метод иммунохроматографического анализа (ИХА)..............41

2.10 Профилактика и меры борьбы с бешенством............................45

2.11 Мероприятия по борьбе с бешенством.....................................50

Заключение...........................................................................52

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................53

3.1. Материалы и методы........................................................53

3.1.1 Материалы................................................................53

3.1.2 Методы....................................................................55

3.2. Результаты исследований..................................................58

3.2.1 Характеристика современной экологической обстановки и социально-экономического положения МО..............................58

3.2.2 Эпизоотическая ситуация по бешенству животных в МО за период 2008-2012 гг...........................................................65

3.2.3 Оценка роли собак в эпизоотическом процессе бешенства на территории МО.................................................................71

3.2.4 Заболевание людей гидрофобией в МО............................72

3.2.5 Результаты определения эффективности вакцинации собак антирабическими вакцинами................................................76

3.2.6 Разработка тест-системы ИХА для выявления вируса бешенства........................................................................79

3.2.6.1 Получение компонентов тест-системы ИХА................81

3.2.6.2 Очистка нуклеокапсида вируса бешенства...................81

3.2.6.3 Получение антирабических сывороток.......................83

3.2.6.4 Выделение ^О из антирабических сывороток...............84

3.2.6.5 Получение анти-^О барана.....................................85

3.2.6.6 Получение конъюгата высокоаффинных антирабических ^О с частицами коллоидного золота...................................87

3.2.6.7 Конструирование тест-системы ИХА.........................87

3.2.6.8 Определение условий проведения ИХА......................88

3.2.6.9 Оценка эффективности тест-системы ИХА..................90

4. ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................93

5. ВЫВОДЫ.........................................................................107

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.......................................109

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ........................110

8. ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................136

Приложение 1 Стандарт организации «Набор реагентов для количественного определения антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного

анализа».....................................................................................137

Приложение 2 Технологический регламент по изготовлению и контролю набора реагентов для количественного определения антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом

варианте иммуноферментного анализа..............................................139

Приложение 3 Временная инструкция по применению набора реагентов для количественного определения антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте

иммуноферментного анализа..........................................................140

Приложение 4 Акт комиссионной проверки набора реагентов для количественного определения антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови животных в непрямом варианте иммуноферментного

анализа.....................................................................................141

Приложение 5 Методические положения «Количественное определение антител к антигену вируса бешенства в сыворотке крови

животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа»...............143

Приложение 6 Стандарт организации «Набор реагентов для выявления вируса бешенства методом иммунохроматографического

анализа».....................................................................................145

Приложение 7 Технологический регламент по изготовлению и контролю набора реагентов для выявления вируса бешенства методом

иммунохроматографического анализа...............................................147

Приложение 8 Временная инструкция по применению набора реагентов для выявления вируса бешенства методом иммунохроматографического анализа...............................................148

Приложение 9 Акт комиссионной проверки набора реагентов для выявления вируса бешенства методом иммунохроматографического анализа......................................................................................149

Приложение 10 Методические положения по выявлению вируса

бешенства методом иммунохроматографического анализа.....................151

Приложение 11 Акт комиссионной проверки тест-системы на основе

(1о1-ЕЫ8А для выявления вируса бешенства в слюне............................153

Приложение 12 Акт комиссионной проверки тест-системы на основе точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для выявления

вируса бешенства в слюне..............................................................155

Приложение 13 Методические положения «Выявление антигена

вируса бешенства методом контрастной иммунофлюоресценции».............157

Приложение 14 Акт о взятии проб крови и слюны собак...............159

Приложение 15 Свидетельство к серебряной медали за инновационную биотехнологическую разработку «Набор компонентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных...................................160

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВНИТИБП - Всероссийский научно-исследовательский технологический институт биологической промышленности ВНА - вируснейтрализующие антитела ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ИФА - иммуноферментный анализ ИХА - иммунохроматографический анализ КСА - комплементсвязывающие антитела JIA - лизирующие антитела мкАТ - моноклональные антитела МО - Московская область МФА - метод флюоресцирующих антител НК - нуклеокапсид

ООПТ - особо охраняемые природные территории ОП - оптическая плотность

ОТ-ПЦР - обратнотранскриптазная полимеразная цепная реация

ПА - преципитирующие антитела

ПЦР - полимеразная цепная реация

РДП - реакция диффузионной преципитации

РН - реакция нейтрализации

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНП - рибонуклеопротеин (рибонуклеокапсид)

РСК - реакция связывания комплемента

РФ - Российская Федерация

СП - санитарные правила

Т.н. - тысяча нуклеотидов

ТФ-ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ

ФО - Федеральный округ

ЦНС - центральная нервная система

ABLY - Australian bat lyssavirus

CVS - Challenge Virus Standard

dot-ELISA - точечный иммуноферментный анализ

DUW - Duven-hage virus

EBLV - European Bat Lyssa Vims

FAVN - fluorescent antibody virus neutralisation

IgG - иммуноглобулины класса G

IRKV - Irkut virus

KHUV - Khujand virus

LBV - Lagos bat virus

MOKV - Mokola virus

RABV - rabies virus

RFFIT - rapid fluorescent focus inhibition test SAD - Street-Alabama-Dufferin WCBV - West Caucasian bat virus

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы

К важнейшим задачам ветеринарной науки относится внедрение научных достижений в производство, разработка эффективных методов диагностики, профилактики и ликвидация инфекционных болезней животных, среди которых особое место занимает бешенство.

Особенностям проявления бешенства в Российской Федерации и в отдельных ее регионах посвящены работы ведущих отечественных специалистов по вопросам рабической инфекции: Селимов М.А. (1978, 1998); Кузнецов П.П., Таршис М.Г. (1981); Сочнев В.В. (1987); Кузьмин И.В. (2001); Авилов В.М. (2002); Джупина С.И. и др. (2002, 2007); Макаров В.В., Воробьев A.A. (2002, 2004); Ботвинкин А.Д. (2004); Иванов B.C. и др. (2004); Хрипунов Е.М. и др. (2005); Сидорова Д.Г. (2009); Сидоров Г.Н. и др. (1995, 1998, 2011); Ведерников В. А. и др. (2010); Иванов А. В., Хисматуллина H.A., Чернов А.Н., Гулюкин A.M. (2010); Самуйленко А .Я., Гринь С.А. и др. (2012), Дудников С.А. (2012) и др.

Эпизоотологические основы профилактики бешенства животных в Московской области в разные годы были изучены Цвиль Л.А., Родиной J1.B. и др. (2001, 2002); Балдиной И.В. (2003, 2004); Мовсесянц A.A. (2003, 2011); Заводских A.B. (2007). Причины сохранения напряженности эпизоотической обстановки по бешенству в таком быстроизменяющемся регионе, как Московская область, требуют дополнительного изучения. При этом необходимо проанализировать современную эпизоотическую ситуацию по бешенству с учетом влияния экологических и социальных факторов в сочетании с экспериментальными исследованиями.

На территории Московской области в 2011 году зарегистрировано 3 чрезвычайных ситуации, связанные с укусами и ослюнениями бешенными безнадзорными собаками и кошками, от которых пострадало 50 человек.

В этой связи постановка своевременного диагноза с применением экспресс-методов для обнаружения вируса бешенства является актуальной задачей.

1.2 Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является анализ эпизоотической ситуации по бешенству животных на территории Московской области и разработка иммунохроматографической тест-системы для экспресс-выявления антигена вируса бешенства.

Достижение поставленной цели включало решение следующих задач:

2. Изучить роль собак в проявлении бешенства в Московской области;

3. Разработать технологию получения компонентов для конструирования иммунохроматографической тест-системы;

4. Определить эффективность применения разработанной тест-системы для экспресс-диагностики бешенства.

1.3 Научная новизна

Охарактеризованы особенности эпизоотического и эпидемического проявления бешенства с учетом экологической ситуации и современного социально-экономического положения Московской области. Показано, что предпосылками к обострению эпизоотической обстановки по бешенству в Московской области за период 2008-2012 гг. служили активизация природных очагов инфекции, увеличение популяции лисиц и вовлечение в эпизоотии «городского» бешенства безнадзорных собак.

Показана эффективность применения разработанной

иммунохроматографической тест-системы при выявлении антигена вируса бешенства в ткани мозга, слюне и культуре клеток. Предлагаемая тест-система, с использованием указанных реагентов, может быть использована в качестве экспресс-метода для диагностики бешенства.

1.4 Основные положения работы, выносимые на защиту

1.5 Личный вклад соискателя

Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы проводились совместно с к.б.н. Истоминой М.А. Автор выражает благодарность заведующей отделом молекулярной биологии и вирусологии ГНУ ВНИТИБП РАСХН, доктору биологических наук, профессору Матвеевой И.Н., главному ветврачу ЗооВетЦентра «Лебеди» к.б.н. Масимову Э.Н., ветврачу питомника «Восторг» Вдовиной И.М., ветврачу клиники «Добрый доктор» Царьковой К.Г.

1.6 Апробация результатов работы

Основные положения работы и результаты исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и Методической комиссии ГНУ ВНИИТБП 2011-2013 гг. в виде ежегодных отчетов по теме задания 08.06.01 «Разработать технологию изготовления и применения новых

диагностикумов, средств профилактики и иммунокоррекции наиболее распространенных и экономически значимых инфекционных болезней животных на основе современного оборудования и технологических процессов».

Материалы диссертации представлены на: Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты интегрированной защиты животных от болезней», посвященной 50-летию ГНУ ВНИИВЭА (Тюмень, 2011); П-ой конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» (Покров, 2012); Международной конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» (Щелково, 2012); Международном конгрессе «Инновации - основа модернизации АПК» (Санкт-Петербург, 2012); на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Щелково, 2011, 2013).

1.7 Публикации результатов исследований

По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ («Ветеринарная медицина» - 1, «Ветеринария и кормление» - 2).

1.8 Объем и структура диссертации

Диссертация объемом 160 стр. машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждений, выводов, практических предложений, списка использованных источников литературы и приложений. Список литературы включает 242 источника, в том числе 126 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 14 таблицами.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Экология и география распространения бешенства

Бешенство (Lyssa - лат., Rabies - анг. - водобоязнь, гидрофобия) -особо опасная, острая природно-очаговая зооантропонозная болезнь всех видов животных и человека, характеризующаяся поражением центральной нервной системы и 100%-ным летальным исходом [123, 199, 233]. Бешенство известно с древних времен, однако до настоящего времени продолжает оставаться опасной инфекцией для человека и животных из-за наличия обширных резервуаров в разных видах диких животных.

В настоящее время можно говорить о мировой проблеме распространенности бешенства по всему миру. На современном этапе бешенство регистрируется более чем в 150 странах мира, ежегодно более 55 тыс. человек умирают от бешенства, из них около 60% не обращались за медицинской помощью [129, 169, 199, 200].

Бешенство выявлено во всех природных зонах мира, однако для каждой зоны характерен свой видовой состав хозяев вируса и свои закономерности [40, 41, 56, 102, 178]. Из числа всех случае бешенства, зарегистрированных во всем мире в 2005 году на долю диких животных приходится 42%, летучих мышей 4%, собак 54% [234]. Лидерами по числу случаев заболеваний бешенством среди животных и людей являются страны Африки, Азии и Латинской Америки [132, 137, 169, 235]. В этих странах причиной более 90% смертельных случаев человека являются инфицированные бешенством собаки [199, 233]. В странах, где бешенство собак в значительной степени элиминировано вакцинацией, разносчиками вируса являются лисы, койоты, скунсы, еноты, летучие мыши и другие млекопитающие. Во многих регионах мира резервуары вируса в дикой природе продолжают расширяться [48, 49, 102, 194, 199, 207, 233].

Некоторые страны, (особенно окраинные и остров

Информация о работе

Анисина, Ольга Владимировна
кандидата биологических наук
Щёлково, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Эпизоотическая ситуация по бешенству животных в Московской области и совершенствование методов экспресс-диагностики - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы