Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка средств и методов лабораторной диагностики болезни Акабане

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка средств и методов лабораторной диагностики болезни Акабане"

. \\ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ЛАСОРАТОРНОИ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ АКАБАНЕ

03.00.06 — вирусология

На правах рукописи

Аспирант

БАЛАШОВА ЕЛЕНА АЛЕКСЕЕВНА

УДК 619:616.988-035.371.

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров — 1993 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно

исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор ветеринарных наук, член-коррсспопдент РАСХН ВИШНЯКОВ И. Ф.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор ретеринарных наук, профессор ЧЕРНЯЕВ Ю. А. (ВНИИЗЖ),

кандидат биологических наук ЩЕТНИКОВА Л. А. (ВНИИВВиМ).

Ведущее учреждение — ВНИИ экспериментальной

на заседании специализированного совета Д-12061.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, г. Покров, Владимирской области, ВНИИВВиМ.

С дпг^ертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

ветеринарии.

Защита состоится

Автореферат разослан «

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

ФЕДОРОВ Т.П.

1. ОБДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальнее?^ теш. Для успешного выполнения заг.лч по развитию лисотнсводства в нак&й стране важное значение имеют меры, направлении*? на разработку я совериенстЕоваяие средств и методов диагностики индукционных болезней жгестнш.

В связи с многообразием и разносторонностью политических, экономических. культурных и туристячес их связей с ближним и дальним зарубежны не исключен случайный иди цеденопраЕлеяный занос на территорию РФ боз 6 удит елей экзотических шфегатй, в том числе болезни Акабане. б настоящее время цнгроко распространенной в странах Австралии, - юмгай Африки, Европы, Азии и вплотную приблизив-глгпсп к границам GIF. Наличие болезни в Турции создает потенциальную угрозу попадания возбудителя б Грузию и далее на нашу тер-рнторию.

Болезнь Акабане - вирусная 'трансмиссивная болезнь крупного рогатого окота, овец и коз, проявляющаяся абортами, преждевременными родаш и синдромом врожденного артрогряпоза-гидроэнцефалита, наносящат значительный экономический угсерб животноводству стран, в которих шеет распространение. Например, в западной и центральных частях Японии в период с лета 1972 по зиму 1973, затем в 1973 -1974 гг и 1974- 1975 гг было зарегистрировано около 40 ООО случаев заболевания крупного рогатого скота, прямые и косвенные экономические потери составили более 1 млрд. иен. В отношении возможной патогенности вируса для человека имеется единичное сообщение, в частности в Международном каталоге арбовируоов (1975).

По данным зарубедяой научней литературы при диагностике болезни Акаба'.е применяют кошлекс методов, направленных на выделение Вируса, выявление его антигенов, а также антител к вирусу:

реакцию свягываиия комплемента. реакцию -нейтрализации, методь бляшкообразования, задержи гемзггдютннащи, фшооресцирувщпс антитез, твердофззный иммуноферментньй анализ.

ТФ ИФА наиёл аирокое применение г медлшнской и ветеринарной практике. Высокая разрешающая способность зтс-го метода обусловлена, главным образок, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующие наблюдаемый эф-ект. Этот метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, зксйрессность». простотой и доступностью поста-ковки iE Б.' Дзаитаев, к. IL Егоров, 1982; И. Ф. Вишняков и др., 1983; М. Б. Новикова, Е. R КарзсеЕа и др. 398?; Voller A., Bart let. А. , Bidwell D.E. let all., 3976).

Ш>А является быстро выполнимым, чувствительным, специфичным и доступным методом лабораторной диагностики заболеваний при выявлении антигенов .вирусов в культурах клеток и обнаружении антител к вирусам (3. ЛЯрски, 1980; B.R Сюрин, 19S6: Kurogi Н. et. al., 1976). Отсутствие жфорыации о возможной цир^ляиии вируса у животных хозяйств приграничной гона, возмоаностъ заноса возбудителя на территорию. СНГ -вызывают необходимость уделять особое внимание разработке средств и экспрессных, чувствительных и высокопроизводительных методов диагностики болезни Акабане.

Данная работа является результатом .завершенных .исследований по разработке и совершенствованию диагностики болезни 'Акабане, выполненных во ВШОШВиМ в соответствии с Российской научно-технической программой фундаментальных и приорететных прикладных исследований (01.02).

Дель и задачи ясслеловазия. Йаучаая необходимость изыскания системы диагностики болезни Акабаяе определила следующую основную цель:. разработать средства и ыетодц лабораторной диагностики бо■

лезли Акабанэ.

Для достижения этой гели мы поставили перед собой следующие задачи:

- изучить некоторые биологические свойства вируса болезни АкаЗане, такие как чувствительность перевивзешх клеточных культур и патогенносгь для естественно восприимчивых и лабораторных

' жготпых: ''

- изучить антигенные свойства вируса болезни Акаба»? н разработать- методы изготовлении специфического здтигена,. пригодного для постановки серологических реакций;

- отработать методы получения специфической сыьоротта к вирусу болезни Акабане на чувствительных к'вирусу лзтвотгаг, а такхв иьоунной асцитическпй жидкости мшей (ИДЯ), специфичной к этому вирусу;

- отработать лабораторные методы исследований для выявления

специфических антител и антигенов вируса болезни Акабане; реакции

связывания комплемента, диффузионной преципитации, гекагглютина-

цш, задерякл гемагглютинашт, метода иммунофлворесцонции и инму-

/ ■

иоферыентного анализа;

- изучить диагностическую ценность этих методов;

- выдать рекомендации по применению предло-генных образцов препаратов я методов исследования для лабораторной диагностики болезни Акабане; ' :

- предломггь схему. лабораторной диагностики болезни Акабане.

*

Научная новизна. Научней новизна проведенных' исследований состоит в том. что:

гкерглг- 2 оге^ег^ииьа вирусологии зроведемс изучение . основных зоологических, амгико-ггишческих к биологических свойств вируса болезни Акабане, на оснорзнии история разработан» средства

и методы лабораторной диагностики болезни Акабане;

- определены оптимальные условия получения специфического антигена вируса болезни Акабане;

- впервые при диагностировании болезни Акабане методом ТС ИФА используется специфический сахарозо-фреоновьй антиген;

- впервые обнаружение антигена вируса болезни Агабане прямым методом флюоресцирукода антител и выявление антител к вирусу непрямым методом Фдюсресцирукшх антител проводится в культурах клеток ЛСГК и СУ-1.

Разработанные методы диагностики болезни АкаЗале позволяют в короткий срок диагностировать эту болезнь.

Прзстпческак. значимость к реализация результатов исследования. На основании экспериментальных исследований отработаны и рекомендованы для включения в .схему диагностики болезни Акабане чувствительные, специфичные прямой метод флюоресцируют« антител и экспрессный "Сзндвич"-Бариант твердофазного ' нмыуноферментного анализа,, предназначенные для обнаружения антигена вируса болеггги Акабане, а также непрямой метод флюорезиируюкк антител ¡г метод ингибированш. твердофазного ишукоферментного анализа, предназначенные для выявления антител к вирусу болезни АкаОане.

Изготовлены лабораторные образцы-"Набора диагностических препаратов для твердофазного нммунофермектного анализа при болезни Акабане" и "Набора препаратов для ишунофлхюресцентной диагностики болезни Акабане"» которые прошли межлабораторную комиссионную апробацию.

Разработана нормативно-техническая документация "Набора диагностических препаратов для твердофазного иммунофэрмектного анализа при болезни Акабане" и,"Набора препаратов для иммун-.флюоресцентной диагностики болезни Акабане" (Временная инструкция по из-

•отовлению ¡г контролю; Технические условия; Методические указания г Наставление по применению наборов).

Апрсбащп работы и публикация результатов. Ре зультаты 'основ-'их научных исследований апробированы и подтвержены комиссионными спытаншшг ( акт от Сб. И. 1992).

!,Ьтернаяи диссертации доложены на заседаниях ученого совета ЯИИВВиМ (1929-1992 гг. I и научной конференции ВНИИВВиМ 1992г. о теме диссертации опуйликовачо 6 научных работ.

Основные положила диссертационной работы, выносимые на заш-

- результаты экспериментальных исследований по получению и равнительной оценке диагностической ценности антигена вируса бо-езкя Акабане. полуденного сахарозо-ацетоновой и сахарозо-фрвоно-эй' экстракцией из головного мозга мьшей-сосунов и специфического ультурашюго антигена;

- результаты экспериментальных исследований по разработке эямого и непрямого методов флюоресцирующих антител ж антител, ¡являвших вирус болезни Акабане а культуральных жидкостях и ыоз-г мшей-сосунов.

- результаты экспериментальных исследований по разработке йндеич"-варианта, и метода шпибирования твердофазного ишуно-грментного анализа и "Набора" соответствующих диагностических зе паратов. ■ <

Объём работы. Диссертация изложена на 114 листах дашинописно-> текста и включает: введение, обзор литературы, собственные ис-[едования, обсуждение, выводы, практические предложения и список ггературы ( 151 источник, в том числе 54 отечественных ). Ра-<та иллштрирована 20 таблицам;?, 4 рисунками и 3 фотографиями и ¡полнена приложениями.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В работе использовали штаммы "В3935" и "Р" вируса болезни Акабане.

Для получения вируссодержадаго материала в опытах использовала овец породы "прекос" в возрасте 12 месяцев, нелинейных белых ишвй массой 20-30 г, швей линии BALB/c массой 18-20 г, мы~ лет-прыгунков массой 10-32 г, крысят-сосунов 1-2 дневного возраста. мышат-сосунов 1-2 дневного возраста.

Животные получены из ваутао-эксперишятальной базы Главагро-бкопроыа РФ. питомников "Светлые горы", "Белый мох" и "Столбовая" АШХ>, а такяе хозяйств Владимирской области.

Двя ввделешш, культивирования, титрования и изучения накопления антигена вируса болезни Акабане -использовали перевиваемые культуры клеток ночки эмЭркона африканской козы ( ПЭАК), африканской зелёной нартышки (CV-1), поросенка (РЕ-15), сибирского горного козерога (ЮТ), теленка (ЩКУ. . . .

Культуры клеток получали в лаборатории "Биология и культивирования вирусов" и в лаборатории "Культур клеток с музеем клеточных штаммов" ВНййВВиМ.

При определении инфекционной активности вирус болезни Акабане титровали в реащши шшунофлуЪреоцевдш или на мышатах-сосунах, титр вируса рассчитывали по методу Рида и Шнча, выражая в кле-точно культуральныг инфекционных дозах (ВЗОД) и мшиных интраце-ребральшх летальных лозах ( 1Ш0.

При получении ИАЖ мьшей использовали клетки саркомы 180 - те. хранящиеся в жидком азоте.

Для проверки активности и специфичности препаратов антигенов, глобулинов, специфических сывороток, а таю» для сравнения диагностической ценности ТФ ИФА и МФА использовали ?ДП, РСК.РН и бя-опробу на мкшатах-сосуках.

Электронно-микроскопические и цитологические исследования проводили, ислользуя метод ультратонких срезов (препараты обрабатывали по общепринятой методике dauert-, 1382), метод окрашивания культуры клеток по Майн-Грктальду и Гдазз ( Goldstar] G. Я et. al., 19С1; Капли;, ¡11 Копровский, 1975). Помощь в проведении исследований любезно оказана Ii. С. Малаховой, ■ Е Е Черных.

В качестве специфических антигенов вируса болезни Акабане использовал:! материалы, приготовленные из инфицированных культур клеток и мозга заражённых мшгат-соеуноЕ. Контролйми служили антигены, приготовленные из верифицированной культуры клеток и мозга мышат-сосунов.

Комерческие препараты антигенов гегерохогичных вирусов болезней Найроби, ДЕР, Йбарагаг, КЛО, ЭГБО, использованные для. контроля специфичности "Сэндвич"-варианта ТФ ИФА и прямого ША, предоставлены сотрудниками лаборатории "Диагност 1

Специфические сыворотки получали при заражении овец породы "прекос" массой 50-70 кг и телят черйЬ-пестрой- породы массой 80-100 кг штаммом В3935 вируса болезни Акабанэ. В качестве антигена для иммунизации использовали ЮХ суспензию мозга заражённых штат-сосунов с инфекционной активностью 6,0 lg МЛДоО/ял и спеця-фический культуралъкый антиген, титр которого в ' РДП составдгд 1:64.

В'качестве контрольных сывороток использовали сыворотки яеза-рзжзнньк оЕец и КРС.

Для получения I1A2 гзросльи бэсгсорадных мшеа нммунизирсвали

lQZ-воа суспензиейшзга с активностью 7.0 1? ШЕДО/мл.

Сыворотки овец и KÎC, специфичные к вирусам болезней Найроби. ДДР, йбараки,. ШЮ, ЭГВО, использованные для контроля специфичности метода ингибирогляия Т£ ЙФА и непрямого Ш>А, получены из лабораторий "Диагноста".

Для выделения Igi3 из сывороток овец и ИАЖ ыыщей использовали следующие хродатогрзфичесгае методы: ионообменную . хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе ЛЕ-52 ( [рб из сыворотки овец); гельпрошгкгюпу» хроиатографип на Удьтрогеде ДсА-34 ( I«G из сыворотки овец).; аффинную хроматографию на Protein-A-Sepharcse CUB (IgG из ЙАЖ мышей).

Приготовление пероксцдазных кокглгатов о Irü проводили по катоду Wilson à Hakane (1976)»

ШП,-иммуноглобулины гшучади на основе ряда ыетодов, предложению ранее (Фогт П.. 1972; Фзрнн JL, 1981; Эрнст Б.. 1979).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием персонального кошьргера IBÛ PC/AT 283 и пакета прикладных nporpawi "Stafceraf*.

2.2, РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ЮСЛЕДОВАНШ

Изучение некоторых биологических свойств вируса болезни Акабане

♦

йсследоьание чувствительности различных лабораторных яизотных показало, что вирус размножается в мозговой ткани ыкаат-, крысят-сосунов, шаат- прыгунков, куриных эмбрионах. Максимальное накопление вируса происходит при интрацаребральнзм заражении мышат-сосунов (7,07 lg МДП50/Г), поэтов этих лабораторных животных ис-

пользовали при постановке биологической пробы и изготовлении спе- . пифических антигенов. В результате проведенных исследований по определен:® чувствительности различных перевиваемьх культур кле-' ток установлено, что вирус болезни Акабзне размножается в культурах клеток ПСГК, CV-1, ГОАК и ШЕЕК. Наиболее высокие и стзбильные результаты по накоплению вируса получены в культурах клеток ПСГК (6,38 lg ШСЕО/ЫЯ) и CV-1 (6,24 lg ККИДБО/ыл), которые были выбраны для приготовления специфического культурального антигена и отработки ÍWA.

Поскольку на начальных этапах работы отсутствовали специфические - сыворотки к BEA, , то'для . подтверждения вирусной природы ШШ, наблюдаемого в инокулированных культура, были проведены электрошю-шкроскопические исследования. Вирионы в препаратах Q4tàK>иного вируса, обработанные по методу негативного контрастирования, по морфологии и структуре соответствовали буньявирусам. Таким образом, было подтверждено, что ииеинийея в музее института пхашц с паспортными данными "В8935" я "Р" действительно относятся к буньявирусам. Позднее стличие вируса болезни Акабаяе от вирусов клинически сходных заболеваний этого семейства было доказано отсутствием перекрестной реактивности па данный РН, MSA, ТФ ЯФА. . - '

Воспроизвести клинически выраженное заболевание при зарашшш овец Еарусоы болезни Акабзне нам не удалось. Однако, на 4 - 5 день после первого введения вируссодердааего югериала у вдоткых

наблхдаял повмяэнне температуры до 41°CL Из крови, взятой во время внремга, удалось выделать вирус на мышатах-сосунах с инфекционным титром 3,0 lg шщ50/Г, После трех инъекций вйруса s сыеорот-ках крови orea выявлены нейтрализуемте антитела в титрах 1:800-1:1000.

разработка "Сзндвич*'-вариаята ТФ 1Ш

С целью выбора антигена, пригодного ш постановки "Сэндвич"-варианта 'ТФ ША, исследования проводив с -культуральными и мышиными мозговыми антигенами.

Шибольтей активностью (1:3125-1:78125' в "Сэндвич"-варианте ТФ ИФА, 1:16-1:54 в РДШ обседали антигены, приготовленные с использованием культуры кдеток су-1. Активность антигенов, подученных сахарозо-фреоновой и сахарозо-ацетоновой экстракцией из мозга инфицированных шяей, не отличалась и составляла 1:625-1:3125 в "Сэндвич*,-варизнте ТФ, 1:8-1:16 в РСК. Б результате изучения влияния условий и длительности хранения на активность специфических антигенов установлено, что культуральный специфический антиген не выдерживает одного из основных требований, предъявляемых к препаратам антигена - длительности срока хранения. Учитывая, что активность специфических антигенов, полученных из мозга мышат, практически не отличалась и не изменялась.при хранении, способ приготовления сахарозо-ацетонового антигена многостадиен при экс-травдга антигена ацетоном, технологически трудоемок'и занимает около 24 часав, а способ приготовления сахарозо-фреонового снижает трудовые затраты на его изготовление и занимает около 2 часов, в дальнейшей работе по отработке "Сэндвич"-варианта ?4> ША использовали сахарозо-фреоновый антиген.

Иммуноглобулины 6, необходимые в качестве препаратов антител для сенсибилизации твердой фазы и приготовления кониогатов, выделяли ив специфической сыворотки овец и ЙАК мышей. Из сыворотки и пая глией было выделено по 3 серии Активность выделенных из ИДЕ была в средне« в 2 раза выше, чем выделенных из сыворотки овды и составляла в РДП 1:32-1: 64 и в РСК 1:64-1:123.

Для сенсибилизации твердой фазы Сылн использованы IgG, выделенные аз КАЖ мышей, концентрацией 20 мет/мя. С использованием Ig3 из сывороток овец и-ИАЖ мышей были приготовлены специфические перок-свдазные конъюгаты.

Отработку "Сзпашгч"-варианта ТФ $№А проводили по.принципу шахматного титрования. • При постановке 'М> отрабатывали ; дозу IgQ для сенсибилизации, оптимальные разведения. специфических йе-рсжилазных конгюгатов, температурный и временной рэжш аяаша. '

В результате испытаний 3 серий препарата fgâ кэ ЛАЙ «ДЗй, значения оптической плотности шходили на плато, начиная с концентрации иммуноглобулинов для сенсибилизации - 20 i&r/ш.

Для определения титра полеченных специфических пероксидазных конъюгатов проводили их аахматное TîîtpoEaHiie со специфическим и нормальным антигенами.

В результате проведенных исследований установлено* что специфические иимукопероксидазные конъюгаты, полученные с использованием IgB из ЙАЖ, были активнее конгюгатов, при получении которых « использовались igS ira. 'сывороток овец. При отработке "Сэндвича-варианта ТФ ИФА использовали специфические гогалгаты' с активность» 1:600 - 1:800 в рабочем разведении, равной удвоенному титру. Конъюгаг сохранял свою шггизность в течение Двух лет (срок наблюдения) при хранении нативного яри минус $0еС и лисФплизироваиного при 4°с.

. для сокращения времени постановки реакции необходимо иметь готовые сенсибилизированные иммуноглобулинами пластина При выяс

нении срока годности пластин, ееясиошизярованных 2 часа при 37°С

и 13 часов при 4°С, установлено. что целесообразно закладывать на хранение пластины, сенсибилизированные в течение .18 часов при ;

4°С. Шастины годны в течение 1 месяца при хранении при 4°С.

. Была определена зависимость результатов ТФ ЙФА от времени сенсибилизации пластин времени инкубации пластин с антигеном и конгюгатои. Результаты оценивали по выявлению специфического антигена в "Сднрвич"- варианте ТФ Шк.

Шидущих результатов удавалось достичь при сенсибилизации

пластин б в течение 2 часов при 37°С или 18 часов при 4°С и времени контакта с антигеном и конъюгатом в течение 2 часов и 45 минут соответственно. .

Для забивки активных несвязавлшхся центров пластин был применён буферные раствор, предложенный Кепга (1985) и состоящий из 0,01 Ы Трас НС1 РН 7,8-7,8, содержащего 0,Й% ЫаС1, 0,5% казеина и 0.02Х мертиолята (КШ. На КМБ готовили разведения антигенов и конгазгатов.

В опытах по обнаружении антигенов вируса болезни Акабане и для сравнения чувствительности ТФ ЙФА с РДП, РСК исследовали сахароза-фреоновый антиген, 10Х-ную суспензию мозга инфицированных мышат-сосунов, вируссодержзщую культуральнуо жидкость культур клеток ЖГИ и СУ-1. В качестве отрицательных контролей использовали нормальный сахарозо-фреоновый антиген, культуральные жидкости иктаетных культур клеток и мозг незараженных мышат.

5 качестве гетерологичных контролей использовали антигены вирусов болезней Шйроби, ДДР, ИЗараки, Ш>, ЭГБО.

В оптимальных условиях постановки "Сэндвич"-вариант ТФ ИФА обеспечивал выявление только специфического антигена вируса болезни Акабане.

Таким образом, с помощью "Сэндвич"- варианта ТФ ИФ/ можно выявить антиген вируса болезни Акабане при подращивании на мышатах-

сосунах (титр до 1:3125) и в заралеяой культуре клеток (титр до 1:125).

Разработка метода ингибироааняа ТФ Шк

Дяя постановки метода ингкбирования ТФ 1Ш использовали плае-ппш, сенсибилизированные IgG из ИДЯ мьппей с концентрацией 20 мкг/мд. специфический сахарсзо- доеоковыа антиген,. активность которого в "Сэндвич"-варианте ТФ ИФА составляла 1:625. Определение рабочего разЕедения специфического антигена для постановки метода ингибирсвания ТФ ИФА проводили шахматным титрованием со специфической и нормальной сыворотками. Из полученных результатов следует, что при всех разведениях специфической сыворотки оптическая плотность максимальна в лунках, содержащих специфический антиген в разведении 1:200.

Для определения чувствительности метода исследовали специфические к вирусу болезни Акабаие я нормальные сыворотки телят и овец. Для определения специфичности метода исследовали гетероло-гичные сыворотки КРС и овец: сыворотки, специфичные к вирусам болезней Найроби, ДПР, "ИГО,- ¡{бараки, ЭГБО. Результаты исследований показали, что метод ннгибироваяия ТФ ИФА является строгоспештфич-ным и позволяюет выявлять только специфические антитела

Штодом ингибированяя ТФ Шк в период с по 1992 гг. было исследовано 1 116 проб сывороток крови овец и КРС из Украины, Молдовы, Таджикистана, Грузии. Сывороток, положительно реагирующих со специфическим антигеном вируса болезни АкаСане, не обнаружено. '

Разработка метода ишувофлуоресценнии ддя обнаружения алтиге-иа вируса болезни Дкабаие

Дитопагкческое действие, специфичное для вируса болезни Ака-бане, можно наблюдать н- 3-4 сутки после заражения вирусом чувствительной культуры клеток. Выявление вируса Болезни Акабане в культурах клеток до ЦЩ обладает рядом недостатков: замедляет получение результатов исследований на 2-3 суток по сравнению с методом фзщэеещруадих антител, значительны}/ расходом питательной среды. К тому «е ШЩ свойственно для многих вирусов болезней клинически сходных с болезнью Акабане'и при первичном обнаружении вируса не может служить неопровержимым доказательством наличия такового в 'культуре клеток. 5 связи с выше сказанный для обнаружения вируса болезни 'Акабане в культуре клеток был предложен прямой ША, который ставили на культуре клеток ПСГК, выраженной в пробирках на стеклянных пластинках и в лунках лодистироловых панелей. . • "...

Лряьюй Ы&А, поставленный в культура клеток, выращенной на стеклянных пластинках, обладает рядом недостатков: необходимостью приготовления пробирок, с стеклянными пластинками; значительным расходом культуры клеток и питательной ср^ды; трудоёмкостью про. цесса . фиксации и " окразшакия культуры клеток на покровных стёклах; больвеыу расхояу йШЬконоюгата. . •

Йозгоку ядй устранения этих недостатков нами был усовершенствован методтитрования вируса болезни Акабане с помрщыз ишуноф-луорвсиещвда с' использованием мякрокузьтуры клеток ПСГК. Метод выгодно сочетает преимущества иикротитрационной техники с чувс-твительностьо и спешйичкосььа традиционного Щ&. ;1ри этом повышается ороизЕодателыгость и упродается процедура обработки клеток

ФИТД-кондаатом.

Культуры клеток ПСГК фиксировали в лунках пластиковых панелей 20 7. раствором ацетона на ЗФР в течение 10-20 минут.

Определены условия постановки и показала возможность титрования вируса болезни Акабане в шкрскудьтуре ПСГК с использованием реакции флуоресцирующих антител. Результаты реакции учитывают через 18-24 часа. Антиген вируса болезни Акабане в культуре клеток, обработанной ФИТЦ-конъюгатом сбпарукигадг по дифйганэ светящейся ' цитоплазме клеток и гранудлярному свечению в ядрах клеток.

В лунки пластиковых панелей с образовавшимся сплошным клеточным монослоем вносили 10-кратные разведения вируссодержащего материала на поддерживающей среде. ' Чэрез 18-24 часа 'инкубирования клетки в лунках- фиксировали 20 % раствором ацетона, окрашивали ФИТЦ-иммуноглобулинами, специфичными к вирусу.болезни Акабане, я определяли тигр вируса по характерному свечению.

Уровень накопления вируса болезни .Акабане штамм "Б8935" в микрокультуре клеток ПСГК составил 6,38 КЮ1Д50/мл, *чта соответствовало уровню накопления вируса в культуре клеток, выращенной. в пробирках.

•Я '

Отработка реакции нейтрализации флюоресцирующих бляшек и неп- • рямого МФА для выявления антител в иикрокудьтуре ШГК.

РНЕБ ставили, используя специфический ФИТД-кохгногат. Титром нейтрализуют« антител считали последнее разведение исследуемого материала, при котором наблюдали снижение количества выявляемых прямым М5ЕА флооресщфуюадс бляшек нз 90 % в сравнении с контроле« вируса в смеси с нормальной сывороткой крови животных. Титр нейт-; рализующих антител в сыворотках крова гтернммукиз ироЕанных овец

--'ч, •л' \ ' - 16 -

. COQÎiœJKi 1: 800-1; 1000, KPC 1:400-1:600.

\РЩ5. даад0тся,сввдаи{«гв1Ыы,' высокоэффективным тестом, но трудоемка аадподнента» - при это« основная трудность связана с необходимостью .работы с культурой клеток и инфекционным материалом. Щщ выявлении антител в реакции непрямой гошунофлюоресценция этих .недостатков и^нью». Учитывая неудобства, связанные с приготовлением специфических тест-антигенов на стеклянных пластинках, их хранением и последующими шнипуляшиш, отрабатывали непрямой ША, используя тест-препараты, приготовленные в лунках полистироловых панелей. С целью инактивации вируса в лунках,после удаления 20%-го раствора ацетона панели высушивали с одновременным облучением ультрафиолетовым ceôtûu. При постановка непрямого ш>А использовали аитиввдовыэ ФйТЦ-иэнъогату. Тжроы специфических антител считали последнее ! разведение сыворотки, при котором обнаруживали специфические для Ечруса Солёзна Акабане фдшресци-руш» . бЛйвкз, ' Гетр- емварото^ крова ггяершиун.тзироваяных овец составлял 1; 160-1:350. К?С 1:80-1; 160.

йзучеяйе агностической кенасстй прямого ЬКА и "Сзндвиг-Г-ва-ригчнтз ТФ MA

с целью изучения диагностической данюсти "Сэидк1ч"~варианта ТФ ИГА .были проведены сравнительные исследования по выявлена» антигена ВБА в 102-ной суспензии мозга дафжягрогашшх шэгй-сосу-нов, культура»ной жидкости зараженной культуры клеток CV-1 и сз-харозо-фреояавоы штягене в PFA, FCK и "Сэндвич" -варианте ТФ KiA.

Установлено, что иСзщшач"~еаркаэт ТФ ИФА чувствительнее РГА и РСК в 400-600 раз и Ш-400 раз соответственно.

йрядам ША зьтигеи е яруса. болезни Акабане в 102 суспензии

мозга инйщированзых мьш.т-ссеунов обнаруживали через 18-24 часа после заражения культуры' клеток ПСГХ или CV-1. что на 2-3 суток быстрее по сравнению с выявлением антигена"вируса болезни Акабаяе в культуре клеток по ЯПД.

Таким образом, "Сэндв1П"-взриаят Т5> И1А и прямой !ЛА являются чувствительными, специфичными и экспрессными меголаш диагностики 5олезни Акабане и могут быть использованы для выявления антигена зируса болезни Акабане в мозговой ткани инфицированных мыек?й-со~ :унов.

Лучение диагностической ценности ТЕ ИФА it ЫДД для обнаруде-;::я антител к вирусу болезни Акабане

•3 методе ингибировэния ТФ. ИФА, непрямом ISA, PCR и РДП была гаучеяа динамика накопления антител к ВБА в сыворотках крови за» >аженных овец

Метод ингибирования ТФ ИФА и непрямой ЫФА позволял выявлять :пеш!фпческие антитела в сыворотках кровя овец, начиная с б суток госле заражениям титрах 1:25-1:125 и 1:10-1:40 соответственно, з •о времй как методами РДП и РСК в иеследуемда * сроки антитела в шоротках крови не обнаружены, фи помощи РДП и PCR специфичес-ж антитела удалось выявить на 14-е сутки после заражения в тит-¡ах 0-1:4 И 1:4-1:8. „ V

Результаты сравнительного щкучения чувствительности метода ягибирования ТФ ИФА, МФА, РЛП, РСК и РН показали, что чувстви-ельность ТФ ИФА превышает РДП в 80-200 раз, РСК в 40-400 раз и Н в 1,5-4 раза, а чувствительность непрямого W5A превышает РДП в 0-40 раз; РСК в 10-20 раз.

Результаты проведенных исследование позволяют рассматривать

метод ингибярования !ГФ ЩА и непрямой М1А, как наиболее чугстви-тельный и быстрый метод определения в сыворотках крови антител.

Таким образом, в результате проведенных исследований били решены поставленные перед наш задачи и достигнута цель исследований : разработаны средства и методы лабораторной диагностики болезни-Акабане. .

Схема лабораторных исследований по диагностике болезни Акабане

В результате изучения иммунобиологических свойств вируса болезни Акабане.и испытания серологических методов диагностики разработана схема лабораторных исследований по диагностике этой болезни (рисунок 1), в которой предложено при первичном возникновении заболевания проводить выделение вируса из проб органов плода абортировавших животных («озг, кровь), проб крови больных мытных, отобранной во время гипертермии (виремии), на культуре меток ЮГЕ или СТ-1 (Ш>А или ТФ ИФА) к (.штатах -сосунах с последующей идентификацией в РН и РНФБ и, при неоходишсти, с последующей оценкой патогенности на восприимчивых животных.

В неблагополучных зонах предложено исследовать патологический материал заражением мышат-сосунов. При гибели животных через 48-72 часа проводить выявление специфического антигена прямой им-мунофлюоресценцией в культуре клеток 1ЮГК или СТ-1 или "Сэндвич" варианте ТФ ИФА.

Ретроспективная диагностика проводится путей выявления антител к ВВА при исследовании парных сывороток крови животных методом ингибирования ТС ЯФА и непрямым ¡¿ФА.

Рис. 1. СХЕМА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ АЙАБАЕЕ

Постановка диагноза при первичном возникновении заболевания

©

Постанов!» диагноза в неблагополучных зонах

Иеследуешй материал (мозг, кровь)

¡Выделение БРА! 1 | в культуре | I клеток и на Г" I мышатах-сос. |

I . , .. —__I

Биопроба на естественно |3 восприимчивых( животных * |

Идентификация вируса

"СэнДЕ1г.;"-варк;1нт ТФ ИФА прямой Ы4А РН и РШБ

Исследуемый материал (мозг, кровь)

Выделение ЕЕА в культуре клеток и на мышатах-сое/

Выявление антигена ВБА

"Сэндвич"- { -вариант ТФ Й'ГА • Прямой Ш

Ретроспективная диагностика

Исследуемый материал (сыворотки крови животных)

обнаружение антител

метод инги-бнровэния ТФ ИФА непрямой Ш

Примечание: * - биопроба ставится по согласованию с Департаментом ветеринарии РФ.

ВЫВОДЫ

1. Изучены некоторые иммунобиологические свойства вируса болезни Акабане на восприимчивых мтохнш и лабораторных моделях. Определены чувствительные перевиваемые культуры клеток СУ-г и ШГК. Титр вируса в культуре клеток достигал 6,24 - 6,38 1г ШОД 50/мл, а на штата-сосках - 7,07 ШЩ 50/ыл.

2. Изучены антигенные свойства вируса болезни Акабане и отработана технология изготовления лиофшшэированного специфического сахарозо-фреонового антигена.

3. Отработана методика получения нагпЕНого культурадьного специфического антигена при .низко- и вшокоскоростном дифферен-циадьном центрифугировании с активностью в РДП 1:16-1:64 ив ТФ Ш 1:3125 - 1:78125.

4. Отработаны методы получения специфических диагностических сыворотки к вирусу болезни Акабане на овцах и КРС и ИАЖ на мышах, с активностью в ш и РСК»., непрямом МФА и ТФ ЙФА 1:8 - 1:32 и 1:16 - 1:32, 1:80 - 1:320 и 1:125 - 1: 3125.

5. Дня титрования сывороток и вируса отработана реакция нейтрализации флюоресцирующих шкробляшек и реакция непрямой имыуноф- . люоресценщш в млкрокультурах клеток СУ-1 и ПСГК, выращенных в лунках пластиковых панелей.

6. Определена чувствительность, результативность ; диагностическая ценность лабораторных штодов шелгдоваяяя - Г-СК. РдП.

РГА, иы:.!унолш;рееценгного и нмхгуноферь[ватного анализа для выявления специфических антигенов и антител к вирусу б' лезни Акабане и предложена схема лабораторных исследований, обесп .-чивахщая постановку диагноза

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны и предлогены :

- "Набор диагностических препаратов для твердофазного иммуно-ферментного анализа при болезни Акабане", на который составлена нормативно-техническая документация (Временная инструкция по изготовлению и контролю. Технические условия и Наставление по применению), утвержденная директором ВНИИВВиМ 19.07.1992.

- "Набор препаратов для ишунофшооресцентной диагностики болезни Акабане", на который составлена нормативно-техническая документация (Временная инструкция по изготовлению и контролю, Технические условия и. Наставление. по применению), утвержденная директором ВНИИВВиМ 19. 07.1992. -

- "Мэтодическне указания по лабораторной диагностике болезни 4кабане методом твердофазного иммуноферментного анализа", утвержденные директором ВНИИВВиМ-19.07.1992.

- "Методические указания по иымунофлюоресцентной диагностике болезни Акабане", утвержденные директором ВНИИВВиМ 1Я. 07.1992.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПШИКОЕАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Малахова М. С., Балашова Е. А. Морфологическая характеристика вируса'Акабане и Вопросы ветеринарной вирусологии, шкробио-логии и эпизоотологии. Тез. докл. кауч.' конф. / ВНЗИВЕиЯ -Покров, 1990. -с. 83-84.

2. Балашова Е- А. , Вгшняков И. $>., Витнна О. А. Получение специфического культурального антигена вируса Акабане // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Тез. докл. науч. конф. / ЕНИИБВиЫ. -Покров, 1990. -с. 122-123.

3. Балашова Е. А. , Вишнякоб К. Ф. Получение- имнуноасцитической жидкости к вирусу Акабане // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Тез. докл. кауч. конф. / ЕНИйВВиМ. -Шкров, 1990. -с. 122. ,

4. Е а Черных. Е. А Балашова, Я. Ф. йишяков, С. А. Вптша, С. ф. Чевелев. Изучение цитоиатйчеекого эффекта, вызжаеыого вирусом Акабане, в перевиваемой кулитуре клеток СУ-1 // Вопроси ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Материапь науч. конф. / ВШИВВиМ. -Покров, 1992. -с. 140-141.

5. Е..А. Балашова, IIФ. Вшшяков. Чувствительное« лабораторных животных и куриных эмбрионов к вирусу- Акабане /, Еопросы ветерикараой вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Материалы науч. конф. / ВНИЛВВиМ. -Покров, 1992. -с. 141.

5. Е.А. Балашова, И.Ф. Вишняков, Г. II -1урбанова. с. А. Витнна Чувствительность перевивали линий культур клеток к вирусу бо лезни Акабане // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиолог;;: и эпизоотологии. Материалы чауч. конф. / Ш1ИШШ. -Покров. -с. 142.