Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфолипаза А2 группы IIA как маркёр миксомы сердца человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Фосфолипаза А2 группы IIA как маркёр миксомы сердца человека"

На правах рукописи

Хаспсков Георгий Леонидович

ФОСФОЛИПАЗА А2 ГРУППЫ ПА КАК МАРКЁР МИКСОМЫ СЕРДЦА ЧЕЛОВЕКА

03.00.25. - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

О 5 ДЕК 2008

003454245

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии НИИ Экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Скамров Андрей Викторович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Прасолов Владимир Сергеевич доктор медицинских наук, профессор, Мазуров Алексей Владимирович Ведущая организация:

ФГУ НИИ Биомедицинской химии им В Н. Ореховича РАМН Защита состоится

«/ЛшяЯЪл 2008г. в/^.Д^часов на заседании диссертационного совета Д.208 073 01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий по адресу. 121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д.15а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий

Автореферат разослан « » ноября 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Синицын В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Опухолевое поражение сердца представляет собой редкую и вследствие этого до сих пор недостаточно изученную область клинической медицины. В течение длительного времени опухоли сердца выявлялись преимущественно при вскрытиях или как случайная находка при торакальных и кардиохирурги-ческих вмешательствах.

В настоящее время частота обнаружения у пациентов сердечных новообразований с каждым годом растёт, что напрямую связано с улучшением дооперацион-ной диагностики вследствие использования новейших методов обследования и высокой квалификации персонала [Петровский и Нечаенко, 1992; Петровский и др., 1997]. Широко применяются в клинической практике одно- и двухмерная эхокар-диография (в частности, двухмерная трансэзофагеальная эхокардиография), позволяющая не только распознавать, но и определять точную локализацию сердечного новообразования. Всё в большей мере используется потенциал различных вариантов томографического обследования пациентов.

Обнаружение внутрисердечного образования любой природы, как доброкачественной, так и злокачественной, требует безотлагательной резекции в ходе кардиохирургической операции. Среди всего разнообразия опухолей сердца наиболее распространённой является миксома сердца, составляющая до 90 % от общего числа зарегистрированных в клинической практике случаев [Нечаенко и др., 1994; Петровский и др., 1997; Roberts, 1997; Perchinsky et al., 1997]. Точное определение диагноза по материалу удалённой в ходе операци опухоли имеет принципиальное значение, так как в случае типирования удаленной опухоли как миксомы (с доброкачественным течением) послеоперационный прогноз для пациента является оптимистическим, чего нельзя сказать о других типах опухолей сердца, многие из которых отличаются злокачественной природой и высокой склонностью к возникновению повторного неопластического процесса. Как отмечалось в статье ведущих специалистов по вопросам патологоанатомической диагностики опухолей сердца A.Burke и др. [Burke et al., 1996], поскольку

в абсолютном большинстве случаев (до 90 %) в качестве первичных опухолей сердца встречаются миксомы сердца, то у специалистов, проводящих диагностику по материалу удалённой опухоли, существует стойкое предубеждение, что диагностируемой опухолью должна оказаться миксома. Поэтому в случае затруднений или сомнений в определении типа опухоли, патологоанатом склонен остановиться на диагнозе «миксома сердца». Авторы сообщения предупреждают об опасности вынесения ошибочного решения в особенности, в затруднительных случаях, при неясной, осложнённой гистологической структуре. Таким образом, развитие и совершенствование методов диагностики опухолей сердца весьма актуально в настоящее время. Среди способов решения этой задачи наиболее перспективным является поиск молекулярных и иммуногистохимических онкомар-кёров опухолей сердца человека, особенно миксомы сердца. Использование маркёров при послеоперационном патологоанатомическом анализе в затруднительных случаях поможет подтвердить или опровергнуть диагноз «миксома сердца».

Цель исследования Провести поиск молекулярных и иммуногистохимических онкомаркёров миксомы сердца человека, которые могут быть применены в ходе послеоперационного патологоанатомического исследования.

Задачи исследования

1. Провести анализ экспрессии генов в образцах миксомы сердца человека с применением транскрипционных матриц. Сравнить полученные картины экспрессии генов в миксомах сердца и в других тканях для выявления потенциальных онкомаркёров.

2. Проверить выбранный онкомаркёр на соответствие критериям специфичности и воспроизводимости с использованием метода ОТ-ПЦР анализа.

3. Охарактеризовать экспрессию онкомаркёра в первичных опухолях сердца и нормальных тканях с использованием методов Нозерн-гибридизации, иммуноблотгинга, иммуногистохимического выявления белкового антигена на гистологических срезах.

4. Предложить способ послеоперационной диагностики миксом сердца с использованием охарактеризованного онкомаркёра.

Научная новизна исследования

В представленном исследовании впервые обнаружена гиперэкспрессия фосфолипазы А2 группы IIA (PLA2G2A) на уровне мРНК и белка в миксомах сердца человека. Показано, что гиперэкспрессия фосфолипазы А2 группы IIA (PLA2G2A) отличает миксому сердца от других первичных опухолей сердца.

В процессе выполнения работы постадийно пройден путь от анализа профиля экспрессии генов в опухоли до ИГХ-маркёра. По результатам анализа профиля экспрессии с использованием транскрипционных матриц выявлена группа генов — потенциальных онкомаркёров миксомы сердца, которая включала как ранее не известные маркерные белки — фосфолипидтранспортный белок (PLTP), фосфолипаза А2 группы IIA (PLA2G2A), аннексии A3 (ANXA3), тканевой ингибитор металлопротеиназ 1 (TIMP1), секреторный ингибитор лейкоцитарной протеазы (SLPI), фибромодулин (FMOD), остеопонтин (SPP), ростовой фактор меланома ингибирующей активности (MIA), ростовой фактор SOX 9 (SOX 9), так и недавно выявленный онкомаркёр миксомы сердца кальре-тинин (CALB 2).

Из общей группы по результатам гибридизационных экспериментов заметно выделялся ген, кодирующий мРНК фосфолипазы А2 группы ILA (PLA2G2A). С использованием широкого набора современных методов показано, что уровень экспрессии фосфолипазы в миксомах превышает уровень экс-пресии в других опухолях сердца и нормальных тканях более, чем в 10 раз.

Обнаруженные факты позволяют предположить связь гиперэкспрессии фосфолипазы А2 группы IIA (PLA2G2A) в развитии спектра клинических симптомов, характерного для пациентов, страдающих только этой опухолью. К таким симптомам относятся признаки ревматоидных заболеваний, включая артралгию, миалгию и миозит, приступы повышения температуры, нефрит с эритроцитурией и протеинурией, а также повышение в крови уровня концентрации целого набора медиаторов воспаления, к которым относятся ИЛ-6, С-реактивный белок и другие белки. Причём эти показатели крови быстро приходят в норму после резекции опухоли, являющейся источником фосфолипазы А2 группы IIA.

Практическая значимость работы

Был разработан и предложен способ послеоперационной дифференциальной патогистологической диагностики миксом сердца с использованием антител к охарактеризованному, сильно выраженному и специфичному иммуноги-стохимическому онкомаркёру — фосфолилазе А2 группы НА, что легло в основу патентного изобретения 1Ш2271008. Назначение предлагаемого способа — отличить миксому сердца от других первичных опухолей сердца и способствовать установлению правильного диагноза в случае затруднений с титрованием опухоли. Прогностическая значимость — способ послеоперационной идентификации наиболее часто встречающейся первичной опухоли сердца с доброкачественным течением и низким процентом рецидивирования (исключение— около 10% случаев наследственной формы заболевания, миксомного синдрома), а также способ проверки тканей эмболов неясного генеза на возможную принадлежность к ранее не диагностированной миксоме сердца.

Показано, что в качестве альтернативных диагностических методов выявления фосфолипазы А2 группы НА во внутрисердечных образованиях можно также использовать иммуноблоттинг или метод ОТ-ПЦР.

Внедрение результатов исследования в практику

Предложенный способ дифференциальной диагностики миксом сердца может быть использован в повседневной практической деятельности патолого-анатомических отделений, в работе медицинских центров кардиохирургическо-го и онкологического профиля.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных результатов, обсуждения результатов исследования, выводов и списка использованной литературы, который включает 289 источников. Работа иллюстрирована 5 таблицами, 8 рисунками, включающими 7 электрофореграмм с нуклеиновыми кислотами (ДНК, РНК), 1 электрофореграмму с белками, 8 радиоавтографических отпечатков, 2 хемилюминесцентных отпечатка и 9 микрофотографий.

Апробация работы

Результаты работы доложены на научной конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины», посвященной 40-летнему юбилею МБФ РГМУ МЗ РФ (Москва, РГМУ, 20-21 ноября, 2003 г.), на всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, ВМА, 8-9 апреля, 2004 г.), на межлабораторной научной конференции по белковым маркёрам мик-сомы сердца человека НИИ Экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий» 13 мая 2004 г., на межлабораторной научной конференции НИИ Экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий» 7 ноября 2008 г. и были рекомендованы к защите. Публикаций по теме диссертации 4, включая 1 патент Российской Федерации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования явились первичные опухоли сердца, удалённые в ходе хирургических операций, проведённых в Российском научном центре хирургии РАМН им. акад. Б.В. Петровского. В каждом случае диагноз подтверждался в ходе послеоперационного гистологического исследования. Возраст пациентов находился в диапазоне от 7 до 76 лет, женщин— 10, мужчин— 3. В общем списке опухолей сердца всего было проанализировано 8 образцов миксомы, 2 образца мезенхимомы, по одному образцу липомы, нев-рилеммомы и папиллярной фиброэластомы. Внешне нормальный аутопсийный материал сердца, аорты, толстого и тонкого кишечника был получен в ходе по-стмортальных патологоанатомических исследований. Для выделения лейкоцитов переферической крови выполнялась технологическая процедура на основе известных методических протоколов [БатЬгоок ег а1., 1989; ЗйгШ й а1., 1996].

РНК из тканей выделялась при помощи модифицированной методики с использованием закисленной смеси фенол-хлороформа-гуанидинтиоцианата [8катгоу е1 а1., 2004]. Гибридизация с кДНК-матрицами, обработка результатов гибридизационных экспериментов, проведённых на матрицах, а также обратная

транскрипция, совмещённая с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР), Но-зерн-гибридизация и приготовление белковых гомогенатов проводились в соответствии с описанными ранее методиками и рекомендациями фирмы-производителя кДНК-матриц [Sambrook et al., 1989; Skamrov et al., 2004].

Последовательность олигонуклеотидных праймеров для ПЦР (табл. 1), как и олигонуклеотидных антисенс-зондов для Нозерн-гибридизации, выбиралась при помощи программы «ОН 99» («Техноген», Россия). Для первой серии ОТ-ПЦР экспериментов по выявлению мРНК PLA2G2A использовались прайме-ры ФЛА-1, для второй — ФЛА-2, а для выявления G APD использовались прай-меры ГФД-1 (табл. 1). Для Нозерн-гибридизации с целью выявления матричной РНК PLA2G2A использовался олигонуклеотид с последовательностью нуклеоти-дов: CAG ТСА TGA GTG АСА CAG CAG CGA ТСС GTT GCA ТСС TTG (GenBank NM 000300); а для цитоскелетного ß-актина, АСТВ,— GAC GAC GAG CGC GGC GAT АТС АТС АТС (GenBank NM_001101).

Таблица 1

Праймеры для ОТ-ПЦР анализа

Праймеры Символ гена GenBank код Прямой праймер Обратный праймер Длина

ФЛА-1 PLA2G2A NM_000300 TATGTTAACAAT GAATGGGCAACC AGTG GTTTGCATGA GTGAAGCATG GATTGG 303

ФЛА-2 PLA2G2A NM_000300 GAAGCCGCACTC AGTTATGGCTTC GCCAAGGAA CTTGGTTAGG GTAGG _j 416

ГФД-1 GAPD Х01677 ACCACAGTCCAT GCCATCAC ТССАССАССС TGTTGCTGTA 452

Процедуры полиакриламидного градиентного гель-электрофореза в невос-станавливагощих условиях с последующим переносом белка на нитроцеллюлозную мембрану осуществлялись в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя («Bio-Rad», США) и на основе ранее опубликованных протоколов [Hurt-Camejo et al., 1997]. Проведение электрофореза в невосстанавливающих условиях существенно, поскольку после электрофореза с меркаптоэтанолом использование в данной работе моноклональные антитела не реагировали с фосфолипазой. Иммунофер-

ментное выявление белков на мембране выполнялось при помощи коммерческих

6

мышиных моноклональных антител против PLA2G2A («Upstate Biotechnology Inc.», США, кат. № 05-143) и хемилюминисцентного набора «ECL gene detection system» фирмы «Amersham», Великобритания.

Для проведения гистологического исследования с окрашиванием гематоксилином и эозином ткани заключались в блоки из парафина с последующим изготовлением срезов.

По рекомендации фирмы-изготовителя моноклональных антител к PLA2G2A для иммуногистохимического анализа использовались криомикротом-ные срезы (толщина 7 мкм, которые хранились до использования при -70 °С). В качестве первичных антител при иммуногистохимическом исследовании использовались те же моноклональные антитела, что и в процедуре иммуноблоттин-га. Первичные антитела выявляли с помощью биотинилированных лошадиных вторичных антител и авидин-биотин-пероксидазного комплекса («Vector Laboratories», США). Визуализацию пероксидазной активности проводили с помощью 3,3'-диаминобензидина, после чего препараты докрашивали гематоксилином и заключали в полимерную среду на водной основе. Наличие PLA2G2A выявлялось по характерному коричневому окрашиванию.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ экспрессии генов миксомы сердца человека с использованием транскрипционных матриц

Метод транскрипционных матриц (генных чипов) состоит в гибридизации меченой комплиментарной копии информационной РНК, полученой из исследуемой РНК, с мембраной, содержащей матрицу ген-специфичных зондов. Как правило, размер матрицы составляет от 1000 до 30000 генов. Метод гибридизации РНК с транскрипционными матрицами позволяет в одном опыте измерить уровень экспрессии большого (как правило более 1000) числа генов в исследуемом образце.

Радиоактивно меченная кДНК, синтезированная на суммарной РНК из индивидуальных миксом сердца, гибридизовалась с матрицами Atlas™ (Clontech, USA): Cardiovascular Atlas™ Array, Cancer 1.2 Atlas™ Array,

Human 1.2 II Atlas™ Array. С учётом частичного перекрывания наборов генных зондов на разных Atlas™ Array матрицах, всего проанализирован уровень экспрессии 2051 индивидуального гена человека.

На рисунке 1 приведена картина гибридизации образцов миксомы и нормальных тканей с генной матрицей Cardiovascular Atlas™ Array. Большой объём данных, получаемых в одном опыте, не позволяет провести полный анализ картины экспрессии (транскрипционного профиля) с использованием только визуального сравнения картин гибридизации, а требует анализа численных значений интенсивностей гибридизационных сигналов. Тем не менее, некоторые особенности картины экспрессии можно заметить и при визуальном анализе. Примечательно, что общий вид картины гибридизации не изменяется от миксомы к миксоме (не показано) и отличается от картины гибридизации для других проанализированных тканей (рис. 1). Таким образом, можно сделать вывод о том, что миксомы сердца имеют характерный транскрипционный профиль.

а б

в

PLA2G2A PLTP FN1

I

• •• MM*«tf

наш инииПммК

Рисунок 1. Транскрипционные профили миксомы сердца (образец № 1, а), сердца (б), аорты (в) и лейкоцитов крови (г).

Транскрипционная матрица — Cardiovascular Atlas м Array. Подписаны и выделены сигналы от мРНК с высоким уровнем экспрессии в миксоме.

При внимательном анализе профилей обнаруживаются полезные для практического применения закономерности. В частности, обращает на себя внимание группа генов, экспрессия которых всегда увеличена в миксоме по сравнению с другими тканями. Такие гены могут служить транскрипционными маркёрами миксом сердца, т.к. высокий уровень их экспрессии отличает миксомы сердца от других нормальных и опухолевых тканей. Результатом статистического анализа профилей с использованием описанного подхода было выделение группы ге-нов-кандитатов в экспрессионные маркёры миксомы сердца. Подробно анализ сравнения профилей экспрессии описан в нашей работе [Skamrov et al., 2004]. В группу генов-кандитатов вошли гены, кодирующие следующие белки: секреторный ингибитор лейкоцитарной протеазы (SLPI), фибромодулин (FMOD), остео-понтин (SPP), аннексии A3 (ANXA 3), ростовой фактор меланома ингибирую-щей активности (MIA), ростовой фактор SOX9 (SOX 9), кальретинин (CALB 2), фосфолипаза А2 группы IIA (PLA2G2A), фосфолипидтранспортный белок (PLTP), тканевой ингибитор металлопротеиназы 1 (TIMP1). На рисунке I приведены данные, иллюстрирующие разницу в уровнях экспрессии трёх генов (PLA2G2A, PLTP, TIMP1), вошедших в группу, а также гена, кодирующего фиб-ронектин 1 (FN 1), в миксоме (рис. 1, а) и нормальных тканях— сердце (рис. 1, б), аорте (рис. 1, в), крови (рис. 1 г).

Ген фосфолипазы А2 группы IIA (PLA2G2A) выделяется среди всех отобранных генов-кандитатов даже при визуальном анализе картин гибридизации:

— интенсивность сигнала гибридизации опухолевой РНК с PLA2G2A-пробой является одной из самых высоких среди всех сигналов на матрице, и это свойство сохраняется для миксом, полученных в операционном материале от разных пациентов;

— при гибридизации РНК из нормальных тканей сигнал с PLA2G2A-npo6oñ либо не виден (рис. 1 б, г), либо слабо отличается от фона (рис. 1 в).

В случае других трёх генов (PLTP, TIMP 1, FN 1), необходимо отметить меньшую интенсивность сигналов в миксомах, кроме того для FN 1-пробы близкий по интенсивности сигнал наблюдается при гибридизации с РНК из аорты

9

(ср. рис. 1 а, в). Надо сказать, что в дальнейшем помимо аорты обнаружился высокий уровень экспрессии фибронектина в других нормальных тканях (лёгкое, печень), что привело к исключению этого гена из списка транскрипционных онко-маркёров миксомы сердца из-за недостаточной опухолеспецифичности (подробнее см. [Зкатгоу е1 а1., 2004]).

Таким образом, поиск генов-кандидатов в транскрипционные маркеры миксом сердца с использованием кДНК-матриц выявил ген РЬА2С2А как наиболее перспективный, т.к. обнаруженная гиперэкспрессия этого гена в опухоли позволяет надеяться на технически доступную и надёжную детекцию продуктов гена стандартными молекулярнобиологическими, биохимическими и им-муногистохимическими методами, а отсутствие или низкий уровень экспрессии в других тканях позволит проводить дифференциальную диагностику между миксомой и другими опухолями сердца.

Анализ экспрессии гена РЬА2С2А в опухолях сердца и нормальных тканях методом ОТ-ПЦР

Следующим этапом тестирования РЬА2С2А как потенциального транскрипционного маркёра миксомы сердца человека стала проверка при помощи полимеразной цепной реакции, совмещённой с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР анализ).

Для корректной характеристики изучаемого маркёра необходимо сравнить экспрессию гена-кандидата в миксомах и во всех других опухолях сердца. Однако сбор образцов для такого анализа представляется практически неразрешимой задачей из-за редкой встречаемости опухолей сердца, т.к. в отличие от самой распространённой опухоли сердца — миксомы, все другие первичные опухоли сердца встречаются реже, как минимум, в 8-10 раз. Тем не менее, сравнение уровня экспрессии в широком наборе нормальных тканей и их опухолей (включая все собранные образцы опухолей сердца) позволяет получить представление о распространённости и уровне экспрессии гена РЬА202А в нормальных и патологически изменённых тканях, что обеспечивает косвенную оценку специфичности фосфолипазы как маркёра.

Проводилось две серии экспериментов с двумя разными парами праймеров к РЬА202А. В первой серии ОТ-ПЦР с использованием пары праймеров ФЛА-1 (таблица 1) проводили анализ на трёх независимых образцах РНК из миксом сердца и 15 образцах РНК из нормальных тканей (рис. 2). Во второй серии ОТ-ПЦР с использованием пары праймеров ФЛА-2 (таблица 1) к набору нормальных тканей были добавлены доступные для ОТ-ПЦР анализа ткани опухолей сердца— анализировали 11 независимых образцов РНК из разных видов опухолей сердца и 4 образца РНК из нормальных тканей (рис. 3).

Пригодность приготовления образцов кДНК для ОТ-ПЦР анализа контролировали амплификацией с праймерами ГФД-1 (таблица 1) к мРНК гена «домашнего хозяйства» глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (вАРО).

ОТ-ПЦР анализ экспрессии гена РЬА2С2А проводили в два этапа. На предварительном этапе выбирали число циклов ПЦР, при котором полоса,

С' М 1 23456789 10 11 1213 14 15 16 17 18 19

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 М

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19

шщщт

Рисунок 2. Сравнение уровня экспрессии гена PLA2G2A в миксоме и нормальных тканях методом ОТ-ПЦР (первая серия).

Выявление ампликона мРНК PLA2G2 после 20 циклов(ст) и 24 циклов (б) ПЦР (праймеры — ФЛА-i, размер ампликона — 303 п.н );

в — 26 циклов амплификации с праймерами для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (размер ампликона — 452 п.н ).

1— контрольный образец без добавления РНК; 2— миксома обр. №1; 3 — миксома обр. №2; 4— миксома обр. №3; 5 — сердце; 6 — аорта; 7— кровь; 8 — головной мозг; 9 — селезёнка; 10 — лёгкое; 11 — почки; 12 — печень; 13 — тонкий кишечник; 14—скелетная мускулатура; 15—поджелудочная железа; 16—желудок; 17— толстый кишечник; 18— костный мозг; 19— кожа; М — 100-нуклеотидный ДНК-маркёр молекулярной массы (Fermentas, Литва), размерность — пары нуклеотидов.

соответствующая ампликону РЬА2Б2А в миксомном образце № 3, отчётливо видна на геле (выбранное число циклов — 20). На втором этапе проводилась амплификация всех анализируемых кДНК с выбранным на первом этапе числом циклов. Аликвоты реакционных смесей отбирались и анализировались с помощью гель-электрофореза (рис. 2-3 — а). С остатками реакционных смесей проводили 4 дополнительных цикла ПЦР, и продукты также анализировали гель-электрофорезом (рис. 2-3 — б).

В первой серии ОТ-ПЦР проводился анализ трёх образцов миксомы и панели нормальных тканей человека, включавшей сердце, аорту, кровь, головной мозг, селезёнку, лёгкое, почки, печень, тонкий кишечник, скелетную мускулатуру, поджелудочную железу, желудок, толстый кишечник, костный мозг и кожу. Результаты анализа приведены на рис. 2. Как видно из рисунка, после 20 циклов ПЦР полоса, соответствующая ампликону РЬА202А, наблюдается только в мик-сомных образцах (рис. 2 а, треки 2-4). Дополнительные циклы ПЦР позволяют повысить чувствительность обнаружения мРНК, и после 24 циклов ампликон выявляется в нормальном сердце, аорте, тонком кишечнике и толстом кишечнике (рис. 2 б, треки 5, 6, 13, 17). Примечательно, что интенсивности появившихся полос не выше интенсивностей полос в миксомных образцах, выявляемых после 20 циклов ПЦР, что позволяет грубо оценить разницу в уровнях экспрессии как не менее, чем десятикратную.

На рисунке 3 представлен результат второй серии ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена РЬА202А в группе опухолей сердца, включавшей 8 разных образцов миксомы сердца, 2 независимых образца мезенхимомы сердца и один образец липомы сердца, который подтвердил оценку степени различия в уровне экспрессии фосфо-липазы в миксомах по сравнению с другими опухолями сердца и нормальными тканями. При ОТ-ПЦР анализе РНК из неврилеммомы сердца сигнал РЬАЮ2А отсутствовал после 24 циклов ПЦР (данные не приведены).

Более убедительным было бы применение не одного, а нескольких транскрипционных (молекулярных) онкомаркёров при условии их определения методом ОТ-ПЦР в одном и том же анализируемом опухолевом образце, что делает крайне малой вероятность совпадения сигналов с другими опухолями и тканями,

12

" М I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

500 - ШШ

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 1213 14 15 16

500

в

500

М 1 2 3 4 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16

Рисунок 3. Сравнение уровня экспрессии гена PLA2G2A в миксоме, нормальных тканях и опухолях сердца, отличных от миксомы, методом ОТ-ПЦР (вторая серия).

Выявление ампликона мРНК PLA2G2A после 20 циклов^ и 24 циклов (б) ПЦР (праймеры — ФЛА-2, размер ампликона — 416 п.н );

в— 26 циклов амплификации с праймерами для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (размер ампликона — 452 п.н ).

1— контрольный образец без добавления РНК; 2— миксома обр. №1; 3 — миксома обр. №2; 4 — миксома обр. №3; 5 — миксома обр. №4; 6 — миксома обр. №9; 7 — миксома обр. №11; 8 — миксома обр. №12; 9 — миксома обр. №13; 10 — мезенхимома обр. №10; 11 — мезенхимома обр. №15; 12 — липома обр. №16; 13 — сердце; 14— аорта; 15— толстый кишечник; 16— тонкий кишечник; М — 100-нуклеотидный ДНК-маркёр молекулярной массы (Fermentas, Литва), размерность — пары нуклеотидов.

в том числе и с оказавшимися недоступными для настоящего исследования. В способе диагностики миксом сердца, запатентованном с участием группы авторов из нашей лаборатории, предложена процедура выявления в ткани опухоли сердца 6 транскрипционных (молекулярных) онкомаркёров с методикой нормализации получаемых сигналов [Бибилашвили и др., 2005].

Визуализация матричной РНК фосфолипазы А2 группы IIA в образцах суммарной РНК опухолей сердца методом Нозерн-гибридизации

Ни метод гибридизации на транскрипционных матрицах, ни ОТ-ПЦР анализ не позволяют прямо оценить целостность и полноразмерность анализируемой мРНК фосфолипазы А2 группы ПА в клетке. Для решения этой задачи

6.

РМ 1 2 3 4 5 6 7 8 9

* у 4 - *

Рисунок 4. Идентификация мРНК PLA2G2A с помощью Нозерн-гибридизации.

а — Нозерн-гибридизация с пробой на PLA2G2A, сигнал на уровне фрагмента длиной около 1000 нуклеотидов; б— Нозерн-гибридизация с пробой на цитоскелетный Р-актин для контроля равномерности нанесения РНК в треки электрофореза; в — фотография денатурирующего гель-электрофореза образцов суммарной РНК из опухолей сердца, подтверждающая необходимое качество препаратов суммарной РНК. 1 — миксома обр. № 1; 2 — миксома обр. №2; 3 — миксома обр. № 3; 4 — миксома обр. № 9; 5 — миксома обр. № 11; 6 — миксома обр. № 12; 7 — миксома обр. № 13; 8 — мезенхимома обр. № 10; 9 — мезенхимома обр. № 15; М — РНК-маркёр молекулярной массы (Fermentas, Литва), размерность — нуклеотиды.

14

был использован метод Нозерн-гибридизации с применением радиоактивно меченного олигонуклеотидного антисенс-зонда.

Как видно из рисунка 4 а, гибридизационный сигнал обнаруживается только в образцах РНК из миксом сердца (рис. 4 а, треки 1-7), причём во всех без исключения, но не проявляется ни в одном из образцов РНК из мезенхимом сердца (рис. 4 а, треки 8, 9) даже при длительных сроках экспозиции. Выявляемая РНК располагается в области молекул РНК длинной около 1000 нуклеотидов (длинна мРНК, кодирующей РЬА2С2А (СепВапк ЫМ_000300), — 997 нуклеотидов) в виде чёткой полосы, что свидетельствует о полноразмерно-сти мРНК РЬА2й2А в миксомах сердца. Результат соответствует ранее полученным данным по выявлению мРНК, кодирующей РЬА202А, при помощи Нозерн-гибридизации [Нааратакл е1 а!., 1997].

а. в.

РМ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 РМ1234 5 678 9

В контрольном опыте, для подтверждения равномерности нанесения образцов РНК в треки проводили гибридизацию того же фильтра с радиоактивно меченной пробой на цитоскелетный Р-актин. Этот ген входит в семейство генов «домашнего хозяйства». Как и ожидалось, из рисунка 4 б видно, что интенсивность сигналов в гибридизации с зондом к [i-актину, в образцах РЖ из миксом (треки 1-7) и мезенхимом (треки 8, 9) сердца одинакова. Сигналы находятся на ожидаемом уровне, в области молекул РНК длиной около 1900 нуклеотидов (длина мРНК, кодирующей Р-актин (GenBank NM_001101), — 1852 нуклеотида).

Примечательно, что в миксомных образцах оказались близкими интенсивности сигналов для PLA2G2A и цитоскелетного Р-актина, известного как высокоэкспрессирующийся белок «домашнего хозяйства» [Spanakis et al., 1993; Hsiao et al., 2001] (на рис. 4 а и рис. 4 б, треки 1-7). Это свидетельствует о высоком уровне экспрессии мРНК гена PLA2G2A в опухоли. Важно отметить, что экспозиция, условия введения радиоактивной метки в олигонуклео-тиды и гибридизации на одной и той же мембране были одинаковыми, а величины удельной радиоактивности и количество вносимых зондов близкими (300-350 тыс. распадов на пмоль олигонуклеотида, по 10 пмоль каждого) .

Анализ экспрессии PLA2G2A при помощи иммуноблоттинга

Результаты выявления PLA2G2A в белковых гомогенатах приведены на рисунке 5. Иммуноблоттинг проводился в невосстанавливающнх условиях, поскольку после ПААГ-электрофореза с меркаптоэтанолом имеющиеся монокло-нальные антитела не реагировали с белком PLA2G2A. Как видно из рисунка, чёткие яркие полосы наблюдаются в каждом без исключения треке с гомогена-тами из миксом (рис. 5 б, треки 5-11). Отсутствуют сигналы в других исследованных опухолях сердца (мезенхимомах— рис. 5 б, треки 12, 13; липоме — рис. 5 б, трек 14), за исключением очень слабого сигнала в одном из двух треков с гомогенатом мезенхимомы, образец №10 (рис. 5 б, трек 13). Практически нет сигналов в треках с гомогенатами из нормальных тканей (сердце, аорта, тонкий кишечник, толстый кишечник: рис. 5 б, треки 1-4). Различимы лишь

очень слабые полосы в треках с гомогенатами тонкого и толстого кишечника (рис. 5 б, треки 3 и 4), где, как известно [Ыутап е1 а1., 2000; Yoshikawa е1 а1., 2001; вы й а1., 2004], белок синтезируется на относительно высоком уровне в нормальном организме.

Наблюдаемые полосы (после разделения гомогената в ходе ПААГ-электрофореза) находились в области миграции белков с молекулярным весом около 14кДа, что соответствует литературным данным по подвижности РЬА2С2А, выявляемой с использованием иммуноблоттинга [НиП-Сате^ е1 а!., 1997].

Рисунок 5. Идентификация РЬА2С2А в белковых гомогенатах опухолей сердца и гомогенатах нормальных тканей с помощью иммуноблоттинга.

а — картина параллельного полиакриламидного гель-электрофореза, окрашенного красителем «Кумасси 0250»; б — выявление РЬА2в2А при помощи моноклональных антител после гель-электрофореза и переноса на мембрану, сигнал соответствует белку с молекулярной массой около 14 кДа;

1 — сердце; 2 — аорта; 3 — тонкий кишечник; 4 — толстый кишечник; 5 — миксома обр. №2; 6 — миксома обр. №3; 7— миксома обр. №4; 8 — миксома обр. №9; 9 — миксома обр. №11; 10 — миксома обр. №12; 11 — миксома обр. №13; 12 — мезенхимома обр. №15; 13 — мезенхимома обр. №10; 14 — липома обр. №16; М — смесь маркерных белков с известной молекулярной массой, выраженной в кДа.

Для сравнительной оценки уровня содержания белка РЬА2С2А в миксоме сердца было проведено сопоставление при помощи иммуноблоттинга сигналов в разведениях гомогенатов одного из образцов миксомы (образец № 2), а также сигналов в не разведённых гомогенатах нормальных тонкого и толстого кишечника. Таким образом, сравнивали опухоль с органами

с повышенным содержанием изучаемого белка в норме. Была выявлена не менее, чем в 10-50 раз повышенная экспрессия РЬА2в2А в миксоме сердца по сравнению с нормальными тканями тонкого кишечника и толстого кишечника.

Иммуногистохимический анализ экспрессии РЬА2в2А на срезах опухолей сердца.

Для выявления белкового антигена РЬА202А в тканях опухолей сердца был применён метод ИГХ-анализа белка на тканевых срезах. На рисунке 6 показаны результаты такого анализа образцов миксомы сердца (образцы 2, 11, 12, 13), мезенхимомы (образец 10), неврилеммомы (образец 24) с применением тех же моноклональных антител к РЬА202А, что использовались в иммуноблоттинге. Миксомы в этих случаях имели характерное гистологическое строение и представляли собой опухоли со скудным содержанием клеток и большим количеством внеклеточного матрикса (на рис. 6 а в качестве примера приведён срез миксомы 2 после окраски гематоксилином и эозином). Цитоплазма клеток эозинофильна, границы клеток зачастую плохо различимы, так как клетки оказываются тесно связанными, как бы «вплетёнными», в волокнистый компонент внеклеточного матрикса. Клетки опухоли располагаются поодиночке, небольшими скоплениями или тяжами. Среди одиночных клеток встречаются многоядерные клетки с крупными нормохромными ядрами эллипсоидной формы. Чаще клетки имеют веретенообразную форму и изредка — звёздчатую.

В ткани миксомы выявляются кольцеобразные структуры (лакуны), ограниченные волокнистым, по-видимому, коллагеновым компонентом, внутренняя поверхность которых иногда выстлана уплощёнными клетками. Лакуны имеют свободный просвет, либо внутреннее пространство лакуны заполнено скоплением клеток без отчетливых межклеточных границ.

а

г .

-Л- ■■

б в

' - Ш'

V / '

' Г «

•» «

"■«к

. Л ' * ■ ,* {', • .

« £» ? >

V • »

■г.

1 V >2

у

/ ^ 3 / • I * и »*

Рисунок 6. Иммуногистохимическое выявление РЬА2в2А на криосрезах миксомы, мезенхимомы и неврилеммомы сердца.

а — общая картина среза образца № 2 миксомы, парафиновый срез, окраска гематоксилином и эозином. х200; б — высокая экспрессия РЬА202А в образце № 11 миксомы. х200; в — отсутствие экспрессии РЬА202А в контрольном образце № 11 миксомы. х200; г— отсутствие экспрессии РЬА2С2А в клетках очагового лимфоцитарного инфильтрата в образце №2 миксомы. х400; д — отсутствие экспрессии РЬА2в2А в образце № 10 мезенхимомы. х200; е — отсутствие экспрессии РЬА2в2А в образце № 24 неврилеммомы. х200; ж— высокая экспрессия РЬА202А в образце № 12 миксомы. х200; з— высокая экспрессия РЬА202А в образце № 13 миксомы. х200; и— высокая экспрессия РЬА202А в образце № 2 миксомы. *200. — криосрезы, подкрашивание гематоксилином.

При микроскопическом исследовании видно, что миксомы отличаются большим разнообразием гистологических структур (рис. 6, а, б, г, ж, з, и). Например, лакуны миксомы № 11 внутри заполнены клетками с крупноячеистой внутренней структурой без чётких границ и гиперхромными ядрами неправильной формы, сконцентрированными в центре просвета лакуны (рис. 6, б), а для матрикса миксомы № 12 (рис. 6, ж) характерны плотные волокнистые участки, в которых распределены компактные лакуны, плотно заполненные клеточным содержимым без свободных просветов. Напротив, матрикс миксомы № 13 (рис. 6, з) представлен тонкими волокнами и большим количеством межуточного вещества, в котором расположены мелкие лакуны с малым количеством клеток в центре или со свободным просветом. Клеточные тяжи, в составе которых иногда наблюдаются веретенообразные клетки, можно видеть на срезе миксомы № 2 (рис. 6, и).

Результаты иммуногистохимического окрашивания срезов разных образцов миксом сердца приведены на рисунке 6 (б, г, ж, з, и). Как видно из рисунка, интенсивное специфическое окрашивание воспроизводимо развивается во всех образцах миксом, независимо от гистологических особенностей опухоли. Обычно при обсуждении чувствительности выявления белкового маркёра на срезах опухолевой ткани применяют системы условной оценки в баллах (или в количестве знаков «плюс») доли окрашиваемых клеток от их общего числа в сочетании со степенью интенсивности окрашивания [Петров и Райхлин, 2004]. В данном случае, в силу тотального и очень интенсивного, устойчивого характера специфического иммуногистохимического окрашивания срезов опухолей, нет оснований для применения подобной системы.

Благодаря особенностям аминокислотного состава, фосфолипаза А2 группы IIA при физиологических условиях заряжена положительно, что предопределяет её высокое сродство к кислым гликозаминогликанам и коллагенновым волокнам [Sartipy et al., 1996; Romano et al., 1998; Buckland and Wilton, 2000]. Этими компонентами очень богата ткань миксомы [Петровский и др., 1997; Захарова и др., 2003; Tanimura et al., 1988], что и приводит к положительной иммуногистохимической реакции внеклеточного матрикса,

19

продемонстрированной нами. Однако самое интенсивное окрашивание развивается внутри клеток миксомы, где происходит синтез фермента и его накопление до этапа секреции в окружающий внеклеточный матрикс. Аналогичным образом окрашиваются клетки Панета в области крипт тонкого кишечника и их секрет, который в этом случае поступает в свободный просвет кишечника [Nyman et al., 2000; Yoshikawa et al., 2001]. Наиболее интенсивно окрашенные клетки в ткани миксомы находятся в клеточных тяжах и внутри лакунарных структур. Видимо, можно связать это наблюдение с аномальным, патологически видоизменённым, процессом закладки и роста сосудов внутри ткали опухоли. Об активном протекании такого процесса свидетельствует обнаруженный ранее высокий уровень экспрессии VEGF и рецепторов к этому фактору и, как следствие, способность к автономному и непрекращающемуся процессу ангиогенеза. Н. Sakamoto и соавторы делают вывод о наличии в миксоме сердца VEGF-аутокршщой системы [Sakamoto et al., 2004]. Возможног на срезах разных образцов миксомы мы можем проследить разные стадии такого патологического ангиогенеза по разному состоянию кольцевых лакунарных структур — от плотно заполненных клетками лакун, до заполненных остатками клеточной массы или эритроцитами крови и, в итоге, иногда наблюдаются лакуны со свободным просветом. По-видимому, из этих же лакун происходит выселение лейкоцитов крови, которые в форме инфильтратов, разнообразных по микроскопическому виду, практически всегда можно обнаружить в ткани опухоли [Захарова и др., 2003; Рогов и др., 2003; Burke et al., 1996; Shiraishi et al., 2006]. Микрофотография инфильтрата в виде скопления лимфоцитов в ткани образца №2 миксомы сердца представлена на рисунке 6, г. Выселившиеся в ткань опухоли макрофаги часто наблюдаются в виде гемосидерофагов, наполненных продуктами переработки эритроцитов. Эритроциты попадают в ткань в результате кровоизлияний, источником которых являются те же лакунарные структуры — патологически видоизменённые сосуды. Часть лимфоцитов под действием микроокружения в миксоме сердца может дифференцироваться в плазмоциты, которые в этом случае активно продуцируют гаммаглобулины, что характерно примерно для

20

13 % случаев обнаружения опухолей [Петровский и др., 1997]. Как представляется, РЬА202А в силу особенностей своего функционирования и крайне высокого содержания в ткани миксомы принадлежит не последняя роль в регуляции внутриклеточных процессов и состояния лейкоцитов в ткани опухоли, а также, возможно, и в развитии опухоли в целом.

При ИГХ-анализе других опухолей сердца: мезенхимомы (рис. 6 д), нев-рилеммомы (рис. 6 е), папиллярной фиброэластомы (данные не приведены) окрашивание не развивалось ни в опытах с добавлением моноклоналыгых антител к РЬА2С:2А, ни в контрольных опытах. Отсутствие специфического ИГХ-окрашивания на РЬА2С2А было выявлено и для внутреннего содержимого внутрисердечных тромбов. ИГХ-анализ липомы не проводился из-за невозможности изготовления криосрезов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя результаты изучения опухолей сердца, легко проследить, что разными независимыми методами исследования (см. таблицу 2) была показана специфичная для всех протестированных образцов миксомы сердца экспрессия гена РЬА202А на очень высоком уровне.

Собранные факты позволяют утверждать, что миксома сердца человека обладает сильновыраженным положительным иммунофенотипом по РЬА202А (100 % случаев), являющимся уникальным для первичных опухолей сердца. Идентификация белкового онкомаркёра на гистологическом срезе проводится с использованием стандартной иммуногистохимической методики.

Выполненная работа даёт основание предложить фосфолипазу А2 группы ПА в качестве маркёра для послеоперационной ИГХ-диагностики по единственному белковому антигену, что позволяет сделать вывод «миксома— не миксома» вне зависимости от конкретных морфологических особенностей ткани удалённой опухоли или опухолевого эмбола.

Результаты изучения содержания матричной РНК и белка фосфолипазы

А2 группы НА в опухолях сердца разными методами

Наименование и номер образца опухоли ОТ-ПЦР анализ мРНК Нозерн-гибридизация Иммуноблоттинг Иммуногисто-химическое окрашивание

Миксома, № 1 Выявлено Выявлено Не проводилось Не проводилось

Миксома, № 2 Выявлено Выявлено Выявлено Выявлено

Миксома, № 3 Выявлено Выявлено Выявлено Выявлено

Миксома, № 4 Выявлено Не проводилось Выявлено Выявлено

Миксома, № 9 Выявлено Выявлено Выявлено Выявлено

Миксома, № 11 Выявлено Выявлено Выявлено Выявлено

Миксома, № 12 Выявлено Выявлено Выявлено Выявлено

Миксома, № 13 Выявлено Выявлено Выявлено Выявлено

Мезенхимома, №10 Отсутствует Отсутствует Отсутствует Отсутствует

Мезенхимома, №15 Отсутствует Отсутствует Отсутствует Отсутствует

Липома, № 16 Отсутствует Не проводилось Отсутствует Не проводилось

Папиллярная фиброэластома, №21 Не проводилось Не проводилось Не проводилось Отсутствует

Неврилеммома, №24 Отсутствует Не проводилось Не проводилось Отсутствует

ВЫВОДЫ:

1. Анализ профиля экспрессии генов в миксоме сердца человека с использованием технологии генных (транскрипционных) матриц позволил выделить группу генов — потенциальных маркеров опухоли. В эту группу вошли гены, кодирующие фосфолипазу А2 группы IIA (PLA2G2A), фосфолипидтранспорт-ный белок (PLTP), аннексии A3 (ANXA 3), тканевой ингибитор металлопро-теиназ 1 (TIMP 1), секреторный ингибитор лейкоцитарной прогеазы (SLPI), фибромодулин (FMOD), остеопонтин (SPP), ростовой фактор меланома-ингибирующей активности (MIA), ростовой фактор SOX 9 (SOX9), кальрети-нин (CALB2).

2. Методами ОТ-ПЦР, Нозерн-гибридизации, иммуноблоттинга и имму-ногистохимического окрашивания криосрезов опухолей показана гиперэкспрессия фосфолипазы А2 группы IIA в миксомах сердца человека. Показано, что уровень экспрессии PLA2G2A в миксомах не менее, чем в десять раз выше, чем в других опухолях сердца и нормальных тканях.

3. Предложен способ диагностики, сущность которого состоит в том, что определяют иммунофенотип удалённой опухоли по фосфолипазе А2 группы НА, и при положительном иммунофенотипе опухоль диагностируют как миксому сердца.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хаспеков Г.Л., Шереметьева Г.Ф., Скамров A.B., Нечаенко М.А., Винницкий Л.И., Власик Т.Н., Горюнова Л.Е., Руткевич Н.М., Пекло М.М., Биби-лашвили Р.Ш. Фосфолипаза А2 группы ILA. как ранее неизвестный иммуноги-стохимический маркер миксомы сердца человека // Архив патологии. — 2008. —№2, —С. 31-36.

2. Патент 2271008 Российская Федерация, МПК G01N33/53; G01N33/68. Способ диагностики миксом сердца / Р.Ш. Бибилашвили, Л.И. Винницкий., Л.Е. Горюнова, Д.А. Ковалевский, М.А. Нечаенко, М.М. Пекло, A.B. Скамров,

Е.С. Феоктистова, Г.Л. Хаспеков, Г.Ф. Шереметьева. — 2004119392/15; Заявлено 29.06.04; Опубл. 27.02.06, Бюл. 6.

3. Skamrov A.V., Nechaenko М.А., Goryunova L.E., Feoktistova E.S., Khaspekov G.L., Kovalevsky D.A., Vinnitsky L.I., Sheremeteva G.F., Beabealash-villi R.Sh. Gene expression analysis to identify mRNA markers of cardiac myxoma // J. Mol. Cell. Cardiol. — 2004. — V.37. — P. 717-733.

4. Хаспеков Г.Л., Горюнова Л.Е., Скамров A.B., Феоктистова Е.С., Ковалевский Д.А., Нечаенко М.А., Шереметьева Г.Ф. Винницкий Л.И., Бибилашви-ли Р.Ш. // Сборник тезисов научной конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины», посвященной 40-летнему юбилею МБФ РГМУ МЗ РФ — Москва, 20-21 ноября 2003. — С. 98.

Подписано в печать 13.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1179 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хаспеков, Георгий Леонидович

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3.1. Новое направление в современной кардиологии — ьсардиоонкология.

3.1.1. Область исследований в кардиоонкологии.

3.1.2. Классификация внутрисердечных образований.

3.1.3. Злокачественные новообразования.

3.1.4. Доброкачественные опухоли сердца.

3.2. Миксома сердца — наиболее распространённая опухоль сердца.

3.2.1. История обнаружения и изучения миксомы сердца.

3.2.2. Спорадическая и семейные формы миксомы сердца. Миксомный синдром, или комплекс Карий.

3.2.3. Распространённость миксомы сердца.

3.2.4. Клиническая характеристика и методы обследования больных с миксомой сердца.

3.2.4.1. Основные клинические синдромы.

3.2.4.2. Особенности физикалъного обследования.

3.2.4.3. Особенности инструментальных методов обследования.

3.2.4.4. Лечебная тактика и клинический прогноз.

3.2.5. Характеристика внешнего и внутреннего строения миксомы сердца.

3.2.5.1. Внешнее строение.

3.2.5.2. Данные светооптической микроскопии.

3.2.5.3. Электронная микроскопия миксомы сердца.

3.2.5.4. Морфология клеток миксомы сердца е культуре.

3.2.5.5. Случаи затруднений в постановке днагноза по гистологической картине среза опухоли сердца.

3.3. Молекулярные и иммупогистохимичсские исследования миксомы сердца.

3.3.1. Белковые продукты морфорегуляторных генов (онкогенов, цитокипон и транскрипционных факторов).

3.3.2. Белки, вовлеченные в ангиогенез и ремодотирование.

3.3.3. Белки, специфичные для эндотелия.

3.3.4. Белки сократимых тканей, компоненты цитоскелета, цитокератины.

3.3.5. Нейроспецифические белки.

3.3.6. Иммуногпстохимическик маркёры, отличающие миксому от других опухолей сердца.

3.3.7. Гипотезы возникновения и развития миксомы сердца как индивидуального заболевания (этпопатогенез).

3.4. Современные подходы к поиску новых тканевых опухолевых маркёров в онкологии.

3.4.1. Выявление следов исходной тканеспецифпческой дифференцировки клеток опухоли.

3.4.2. Изучение белкового состава опухолевой ткани (молекулярного фенотипа).

3.4.3. Применение методов так называемой «обратной генетики».

3.4.3.1. Технологии скрининга библиотек комплиментарной ДНК, дифферент!иального дисплея, вычитательной гибридизации с супрессией амплификации.

3.4.3.2. Различные варианты применения ДНК-со держащих матриц (транскрипционные матрицы, ДНК-чипы).

3.5. Значение определения онкомаркёров в клинической практике.

3.5.1. Установление типа удалённой опухоли, планирование и прогноз применяемой терапии.

3.5.2. Установление источника опухолевых эмболов.

3.6. Необходимость поиска информативного онкомаркёра для диагностики миксомы сердца.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Материалы и реактивы.

4.2. Выделение РНК.

4.2.1. Выделение лейкоцитов из цельной крови.

4.2.2. Выделение РНК из образцов тканей и осадка лейкоцитов.

4.3. Экспрессионный анализ на транскрипционных матрицах.

4.3.1. Изготовление радиактивно меченной пробы на основе суммарной РНК.

4.3.2. Гибридизация радиоактивно меченных кДПК с транскрипционными матрицами.

4.4. ОТ-ПЦР анализ.

4.4.1. Реакция обратной транскрипции.

4.4.2. Полимеразная цепная реакция.

4.4.3. Электрофорез фрагментов амплифнцированпой ДНК в агарозном геле.

4.5. Нозерн-блот анализ.

4.5.1. Электрофорез РНК в агарозном геле с денатурацией глиоксалем.

4.5.2. Элсктроблоттинг РНК.

4.5.3. Внесение радиоактивной метки в 5'-конец олигонуклеотида.

4.5.4. Нозерн-гибридизация.

4.6. Вестерн-блот анализ.

4.6.1. Выделение белков из тканей путём гомогенизации.

4.6.2. Разделение белков электрофорезом в ПААГ.

4.6.3. Электроблоттинг белков.

4.6.4. Всстерп-блот анализ.

4.7. Иммуногистохимический анализ.

4.7.1. Изготовление ерезов на криомикротоме.

4.7.2. Иммуногистохимическое выявление PLA2G2A.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5.1. Анализ экспрессии генов миксомы сердца человека при помощи транскрипционных матриц кДНК-гибридизационных фильтров).

5.2. Анализ экспрессии гена PLA2G2A в опухолях сердца и нормальных тканях при помощи ОТ-ПЦР.

5.3. Визуализация матричной РНК фосфолипазы А2 группы IIA в образцах суммарной РНК опухолей сердца при помощи Нозерн-гибридизации.

5.4. Изучение экспрессии фосфолипазы А2 группы НА в опухолях сердца на уровне белка.

5.4.1. Вестерн-блот анализ экспрессии PLA2G2A (иммуноблоттинг).

5.4.2. Оценка уровня экспрессии PLA2G2A в миксоме сердца по сравнению с нормальными тканями при помощи Вестерн-блот анализа с последовательным разведением.

5.4.3. Иммуногистохимический анализ экспрессии PLA2G2A на срезах опухолей сердца.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фосфолипаза А2 группы IIA как маркёр миксомы сердца человека"

Кардиоонкология - это область медицинской науки, предметом изучения которой являются опухоли сердца. Окончательно сформировавшись в качестве самостоятельного направления медицины относительно недавно, кардиоонкология прошла в своём развитии существенные, принципиальные этапы - от первоначального отрицания самой возможности неопластпческого процесса в сердце через описание отдельных секционных наблюдений до прижизненного распознавания п успешного хирургического лечения.

Среди всего разнообразия опухолей, встречающихся в сердце, наиболее распространённой опухолью (до 90% от общего числа зарегистрированных в клинической практике случаев) является миксома сердца [Нечаенко и др., 1994; Петровский п др., 1997; Roberts, 1997; Perchinsky et al., 1997]. Хотя по своей природе эти опухоли относятся к доброкачественным, особенность их локализации внутри камер сердца с ростом в направлении свободного внутреннего пространства делает прогноз исхода у неоперировапных больных с миксомами абсолютно неудовлетворительным вследствие окклюзии отверстии клапанов и нарушения насосной функции сердца. Дополнительную угрозу жизни пациентов представляет опухолевая эмболия, которая часто наблюдается при миксо-мах сердца. Этим объясняется чрезвычайная опасность миксом сердца, что предопределяет безотлагательную хирургическую резекцию опухоли в качестве единственного адекватного метода лечения [Петровский и др., 1997].

Необходимо отметить, что обнаружение внутрисердечного образования любой природы, - как доброкачественной, так и злокачественной, — требует безотлагательной резекции в ходе кардиохирургической операции, но именно природа удаляемого внутрисердечного образования имеет определяющее значение для характера послеоперационного прогноза для пациента.

За последнее время много внимания уделено развитию п совершенствованию методов диагностики и хирургического лечения миксом сердца. Особое внимание уделялось и продолжает уделяться вопросам послеоперационной патологоа11атомической диагностики образца опухоли, удаляемого из полости сердца в ходе операции [Terracciano et al., 2000; Acebo et al., 2001; Val-Bemal, et al., 2003; Chu et al., 2004; Orlandi et al., 2006]. Точное установление диагноза «миксома сердца» имеет принципиальное значение, так как в случае выявления этой самой распространённой первичной опухоли сердца, с доброкачественным течением и, как правило, низкой частотой возникновения рецидива опухоли, послеоперационный прогноз для пациента является оптимистическим, чего нельзя сказать о других типах опухолей сердца, многие из которых отличаются злокачественной природой и высокой склонностью к возникновению рецидива. Исключение из правила — это случаи миксомы сердца, являющиеся составной частью наследственного миксомного синдрома, проявляющие высокую склонность к рецидпвированию, мультифокальному росту и обычно диагностируемые у пациентов в раннем возрасте [Нечаенко и др., 1991; Константинов и др., 1994; Carney et al., 1985; Vidaillet et al., 1987]. Наследственные, семейные миксомы составляют 5 - 10% от общего числа всех миксом сердца.

Таким образом, необходимо проводить поиск молекулярных и иммуноги-стохимических онкомаркёров миксомы сердца человека, которые могут быть применены в ходе послеоперационного патологоапатомического анализа для подтверждения диагноза «миксома сердца», в особенности, в затруднительных случаях, при неясной картине и взаимной диагностической путанице между миксомами и другими опухолями сердца [Pucci et al., 1996; Hishitani et al., 2001; Milicic et al., 2007].

В итоге были сформулированы следующие цели и задачи предпринятой исследовательской работы.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью работы является поиск молекулярных и пммуногистохимических онкомаркёров миксомы сердца человека, которые могут быть применены в ходе послеоперационного патологоанатомического исследования.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ

1. Провести анализ экспрессии генов в образцах миксомы сердца человека с применением транскрипционных матриц. Сравнить полученные картины экспрессии генов в миксомах сердца и в других тканях для выявления потенциальных опкомаркёров.

2. Проверить выбранный онкомаркёр на соответствие критериям специфичности и воспроизводимости с использованием метода ОТ-ПЦР аналиЗа. Охарактеризовать экспрессию онкомаркёра в первичных опухолях сердца и нормальных тканях с использованием методов Нозерн-гибридизации, иммуноблоттинга, иммуногистохимического выявления белкового антигена на гистологических срезах.

4. Предложить способ послеоперационной диагностики миксом сердца с использованием охарактеризованного онкомаркёра.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. НОВОЕ НАПРАВЛЕНИЕ В СОВРЕМЕННОЙ КАРДИОЛОГИИ

КАРДИООНКОЛОГИЯ

3.1.1. Область исследований в кардиоонкологии

Предметом изучения и разработки научно-практических подходов к диагностике и лечению в кардиоонкологии являются опухолевые образования сердца. Опухолевое поражение сердца представляет собой редкую и вследствие этого до сих пор недостаточно изученную область клинической медицины. В течение длительного времени опухоли сердца выявлялись преимущественно при вскрытиях или как случайная находка при торакальных и кардиохирургических вмешательствах.

Первое секционное описание опухоли, как полагают, принадлежит итальянскому врачу, жившему в Средние века, M.R. Columbus, который при вскрытии трупа кардинала Gambrera обнаружил «опухолевидный внутриполостной полип в левом желудочке сердца» и описал свою находку в 1559 году. Позже случаи секционного обнаружения внутрисердечных опухолей описывали Malpighi в 1666 и Morgagni в 1762 годах, а в 1809 году Von Bums дал первое точное описание неопластического новообразования левого предсердия. Таким образом был полностью опровергнут тезис, высказанный в 1783 году De Senac, что «сердце - благороднейший орган, который не может поражаться первичной неоплазмой» [цитируется по Петровский и др., 1997].

В настоящее время частота обнаружения у пациентов сердечных новообразований с каждым годом растёт, что напрямую связано с применением результатов научно - технического прогресса, улучшением дооперационной диагностики [Петровский и Нечаенко, 1992] вследствие использования новейших методов обследования п высокой квалификации персонала. Широко применяется в клинической практике одно- и двухмерная эхокардиографня (в частности, двухмерная трансэзофагеальная эхокардиографня), позволяющая не только распознавать, но и определять точную локализацию сердечного новообразования. Всё в большей мере используется потенциал различных вариантов томографического обследования пациентов.

Появилась возможность рассматривать большую часть новообразовании сердца при условии их своевременного прижизненного распознавания как потенциально излечимые заболевания. Хирургическое лечение опухолей приводит в одних случаях (большинство доброкачественных опухолей) к полному выздоровлению, а в других (со злокачественными новообразованиями) - к продлению жизни пациентов.

В 1988 году академик Б.В. Петровский отмечал, что кардиоонкология -это новое направление в хирургии; «новая, развивающаяся область современной медицины, где ещё предстоит очень многое сделать специалистам и где не последняя роль отводится хирургам» [Петровский, 1988].

На современном этапе развития медицинской науки отечественными и зарубежными учёными отмечается большое значение кооперации практикующих врачей, молекулярных биологов, специалистов по компьютерным технологиям, инженеров-конструкторов приборов, гистологов и патологоанатомов для достижения успешных результатов в лечении пациентов, в том числе и онкологических, и кардиоопкологичеекпх. Целью должно быть продвижение результатов фундаментальных и прикладных исследований и научных разработок в практику для формирования персонализированного подхода в лечении пациентов [Меньшиков, 2006; Hood et al., 2004; Dictel & Sers, 2006].

3.1.2. Классификация внутрисердечных образований

Всеобщая номенклатура опухолей человека, впервые изданная в 1959 году Всемирной Организацией Здравоохранения, послужила основанием для создания органных классификаций неоплазм. Современной международной классификацией онколологичеекпх заболевании является «Международная Классификация Болезней - Онкология - версия 3» (ICD-0-3) в редакции от 2000 года [Bemian, 2004]. Согласно этой классификации предмет настоящего исследования - миксома сердца - кодируется как С38.0, М8840/0. Однако отмечается, что до настоящего времени не разработан окончательный «совершенный» вариант классификаций новообразований сердца, который удовлетворял бы клиницистов и патологоанатомов. Это обусловлено редкостью опухолей сердца, сложностью их морфологической верификации, неясностью гистогенеза, а также полиморфизмом клинического течения заболевания [Петровский и др., 1997; Бокерия и др., 2003].

В клинической практике принято различать первичные и вторичные новообразования сердца. Первичные опухоли сердца бывают как доброкачественными, так и злокачественными. Вторичные новообразования в основном имеют злокачественный рост, обусловленный метастазированием или прорастанием опухоли в сердце из соседних органов.

Из классификации, предложенных зарубежными специалистами, наиболее часто кардиохирургами и онкологами пспольустся вариант, разработанный в 1987 году I.R. Dein и W.H. Frist [цитируется по Бокерия и др., 2003]. Согласно данной классификации все новообразования сердца подразделяются на:

• миксомы, локализующиеся как в правых, так и в левых отделах сердца

• доброкачественные немиксоматозные опухоли

• злокачественные новообразования, которые бывают как первичными, так и вторичными

В 1988 году академик Б.В. Петровский предложил классификацию первичных опухолей сердца в зависимости от вида опухоли и частоты встречаемости той или иной категории новообразований [Петровский, 1988] (таблица 1).

Таблица 1

Классификация первичных опухолей сердца с процентной частотой встречаемости среди общего числа (По Петровскому Б.В., 1988 г.)

Доброкачественный рост (75%) Злокачественный рост (25%)

Тип опухоли % Тип опухоли %

Миксома Рабдомиома Фиброма Л Липома Папиллярная фиброэластома Гемангиома Мезотелиома атрио-/ вентрикулярного узла Тератома Невринома J 75-80 10 10 Саркомы: ангиосаркомы рабдомиосаркомы фибросаркомы Злокачественная тератома Диссеминирующая лпмфома > Другие виды сарком 35 25 10 30

Всего доброкачественных 100 Всего злокачественных 100

Встречаются также образования, не имеющие опухолевой структуры, но проявляющиеся как истинные опухоли сердца доброкачественной природы. Данная категория поражений сердца, согласно JI.B. Шхвацабая, была отнесена к ложным новообразованиям (псевдоопухоли) сердца [Шхвацабая, 1984]. Чаще всего это организованные тромбы, воспалительные явления (абсцессы, гранулёмы, гуммы), конгломераты кальция, паразитарные поражения и эхинококковые кисты, врождённые сердечные аномалии пли инородные тела, имеющие опухолевидную конфигурацию и дающие сходную с бластомами клиническую картину. Таким образом, в клиническом аспекте опухоли сердца можно подразделить на истинные (могут быть доброкачественными и злокачественными) и ложные, то есть псевдоопухоли. В соответствии с этими наблюдениями в 1991 году академиком В.И. Бураковским совместно с Г.А. Косачём и В.Э. Кавсадзе [Бокерия и др., 2003] была предложена клинико-анатомнческая классификация новообразований сердца (таблица 2).

Таблица 2.

Клинико-анатомнческая классификация новообразований сердца (По Бураковскому В.И., Косачу Г.А., Кавсадзе В.Э., 1991 г.)

Категория опухоли Вид опухоли

I. Доброкачественные 1. Миксомы 2. Немиксоматозные опухоли

П. Злокачественные 1. Первичные 2. Вторичные (метастатические)

III. Псевдоопухоли 1. Организованные тромбы 2. Воспалительные процессы (абсцессы, гранулемы, гуммы) 3. Конгломераты (участки) кальциноза 4. Эхинококковые кисты и другие паразитарные болезни 5. Врождённые аномалии сердца, имитирующие опухоли

IV. Экстракардиальные опухоли перикарда и средостения, сдавливающие сердце 1. Доброкачественные неоплазмы 2. Злокачественные опухоли а) первичные б) вторичные

Необходимо отметить, что в соответствии с постоянно обновляющимися и вновь поступающими данными к псевдоопухолями, видимо, следует относить и обнаруживаемые в полости сердца агломерации патогенных грибов [Vricella ct al., 2003].

3.1.3. Злокачественные новообразования

Злокачественные опухоли сердца подразделяются на первичные и вторичные, или метастатические. Первичные злокачественные опухоли сердца на аутопсии выявляются намного чаще, чем при клинических исследованиях -частота выявления первичных п метастатических сердечных новообразований от общего числа вскрытий колеблется в пределах 0,017 - 0,1% и 0,6 - 6,4% соответственно [Петровский, 1988; Reyncn, 1996].

Согласно клиническим обследованиям, проведённым P. Blondeau в 1990 году на 533 пациентах с опухолями сердца, первичных злокачественных неоплазм было выявлено 10% от общего числа новообразовании [Blondeau, 1990]. В анатомических исследованиях Н.А. McAllister в 1978 году (общее число аутопсий - 533) первичные злокачественные опухоли были выявлены в 23% случаев [Chahinian et al., 2000].

Согласно накопленным данным отечественных и зарубежных авторов вторичыс опухоли сердца встречаются в 10-40 раз чаще, чем первичные новообразования, возникая у 0,3 — 10,9% от общего числа онкологических больных [Шхвацабая, 1984; Araoz et al., 1999]. Вторичные новообразования развиваются вследствие метастазирования по кровеносным или лимфатическим путям, а также в результате прямого прорастания в сердце злокачественной опухоли из соседних органов (особенно характерно для случаев рака пищевода и лёгких). Морфология п прогноз развития такого новообразования определяется основным онкологическим заболеванием.

Коллектив авторов под руководством J1.B. Шхвацабая при анализе 3327 аутопсий выявил наличие метастазов в сердце в 170 случаях со значительным колебанием частоты метастазирования в зависимости от локализации первичной опухоли. Так, в частности, при раке лёгкого метастазы в сердце наблюдались у 40% больных, неоплазии клеток крови - у 12,5%, раке молочной железы-у 10,8%, мелаиоме - у 8,3%, раке желудочно-кишечного тракта - у 4,6%, раке почки - у 4,2%, саркоме мягких тканей и кости - у 3,8% [Шхвацабая, 1983].

Среди первичных злокачественных новообразований сердца преобладают различные виды сарком, охватывая в совокупности до 70% всех первичных злокачественных опухолей сердца. Саркомы могут исходить из любого клеточного элемента сердца, что и предопределяет разнообразие их морфологической картины и сложность гистологической идентификации. Чаще всего встречаются ан-гиосаркомы, рабдомпосаркомы, фибросаркомы и липосаркомы. Большое количество таких опухолей попадает в групп)' примитивных, или недифференцированных, сарком. Из литературы известны описания и других более редко встречающихся видов сарком сердца: нспросаркомы, лимфосаркомы, лейомиосарко-мы, миксосаркомы, остеосаркомы, хондросаркомы, синовиальные саркомы и другие [Петровский и др., 1997; Бокерпя и др., 2003; Burke et al., 1992; Araoz et al., 1999; Donsbeck et al., 1999; Grebenc et al., 2000; Devbhandari et al., 2007].

По сравнению с новообразованиями сердца и перикарда метастатического происхождения первичные саркомы сердца имеют локальный агрессивный рост в одну или более камеры сердца и чаще всего поражают правые отделы. Эти опухоли отличаются быстрым пнвазивным прорастанием всех слоев сердца, а также обширным метастазированием в лёгкие, средостение, трахеобрахиальные и забрюшинные лимфатические узлы, надпочечники, головной мозг. К моменту установления клинического диагноза саркомы сердца в 26 — 80% случаев уже имеются метастазы [Шхвацабая, 1984; Петровский и др., 1997; Silverman, 1980; Araoz et al., 1999; Grebenc et al., 2000; Devbhandari et al., 2007].

Саркомы сердца (как п вторичные злокачественные опухоли) могут вызывать окклюзию клапанных отверстий и выходых отделов желудочков сердца, сдавливать или прорастать в коронарные сосуды, крупные артерии и вены, сдавливать сердечные камеры [Шхвацабая, 1984; Chahinian et al., 2000]. Как следствие, наиболее характерным клиническим проявлением злокачественного поражения сердца является быстрое развитие застойной сердечной недостаточности у больных с данной патологией, проявляющееся в виде одышки, цианоза, кашля с кровохарканьем, недостагочпости по большому кругу кровообращения с развитием периферических отёков.

Прогноз при саркомах сердца в случае отсутствия квалифицированной кардиохирургической помощи плохой. Преобладающее большинство больных умирают в течение года или двух после появления симп гомов заболевания.

3.1.4. Доброкачественные опухоли сердца

Доброкачественные опухоли сердца - это наиболее часто выявляемый морфологический тип опухолей среди всех первичных новообразований сердца. Такие опухолп составляют 60-75% от числа всех первичных неоплазм сердца. В клинической практике отечественных специалистов частота регистрации первичных доброкачественных (именно доброкачественных, а не всех первичных) опухолей составляет 83 - 96% случаев [Нечаепко и др., 1994; Петровский и др., 1997; Chahinian et al., 2000].

В литературных источниках не было обнаружено понятия «вторичные доброкачественные опухолп сердца», хотя по смыслу к ним можно отнести эмболию фрагментами доброкачественной опухоли (для примера, миксомы сердца) в систему коронарных артерий, что зачастую приводит к тяжёлым осложнениям в виде инфаркта миокарда [Yilmaz et al., 2003; В rami el al., 2005; Yavuz et al., 2005; Sankar et al., 2006]. Эмболизация в систему сонных артерий может привести к инсульту головного мозга [Mattle et al., 1995; Hirudayaraj et al., 2004; Herbst et al., 2005].

Миксома сердца - наиболее часто встречающаяся гистологически доброкачественная внутриполосшая опухоль. На неё приходится 24 — 50% всех первичных новообразований сердца, выявляемых при аутопсиях, тогда как в условиях клиники частота обнаружения достигает 96% [Петровский и др., 1997; Chahinian et al., 2000; Кип et al., 2007]. Детальному рассмотрению миксомы как предмету настоящего исследования будет посвящен материал, изложенный ниже.

Помимо миксомы сердца существует целый ряд других доброкачественных новообразований сердца, которые некоторые авторы выделяют в отдельную категорию немикеоматозных доброкачественных опухолей сердца. К таковым относятся нижеописанные: рабдомиомы, фибромы, липомы, папиллярные фпброэластомы, гемангиомы, неврпномы и другие [Петровский и др., 1997; Бо-керия и др., 2003; Chahinian et al., 2000; Araoz et al., 2000; Grebenc et al., 2000; Reardon & Smythe, 2003].

Папиллярная фиброэластома - доброкачественное внутриполостное образование, исходящее из эндокарда и имеющая, как правило, ворсинчатую структуру. Обычно данная опухоль регистрируется у взрослых пацпептов (55% старше 60 лет) при отсутствии корреляции частоты встречаемости с полом. Этой опухолью может поражаться любой отдел сердца, но наиболее часто -хордальнып аппарат и створки клапанов, где локализуется более 3/4 всех фиб-роэластом сердца [Петровский и др., 1997; Grinda et al., 1999]. Папиллярная фиброэластома - это редкая опухоль, составляющая по последним зарубежным данным около 1% [Perchinsky et al., 1997; Кип et al., 2007] (no другим зарубежным источникам до 10% [Araoz et al., 2000]), a no данным отечественных авторов 0,7% [Петровский и др., 1997] и 1,25% [Бокерия и др., 2003] от общего числа всех первичных новообразований сердца.

Гистологически опухоль образована эластическими и коллагеновыми волокнами, гладкомышечными клетками, расположенными в матриксе из кислых гликозаминогликанов, которые окружены гнперплазированными эндокарди-альными клетками, постепенно переходящими в неизменённый эндотелий [Grinda etal., 1999].

Зачастую папиллярная фиброэластома протекает бессимптомно и обнаруживается случайно при аутопсии или на операции. Однако имеются наблюдения, в которых она служит непосредственной причиной клапанной дисфункции, эмболического синдрома или внезапной смерти [Петровский и др., 1997; Grinda etal., 1999].

Рабдомиома сердца - доброкачественная внутримышечная опухоль, находящаяся, по мнению большинства авторов, на первом месте по частоте встречаемости среди немикеоматозных доброкачественных опухолей сердца, составляя от 3,3% до 20% от всех первичных новообразований сердца [Нечаенко и др., 1990; Chahinian et al., 2000]. В 85 - 97,2% случаев она встречается у детей в младенческом и раннем детском возрасте (до 15 лет). Опухоль может развиваться в любом отделе сердца за исключением его клапанного аппарата и в 92% случаев носит множественный характер. Множественные рабдомиомы обычно поражают межжелудочковую перегородку и свободные стенки желудочков сердца. Солитарная разновидность опухоли, как правило, обнаруживается в области верхушки сердца [Петровский и др., 1997; Chahinian et al., 2000].

Необходимо отметить, что у половины всех больных рабдомиома сердца является одним из проявлении аутосомно - доминантного синдрома известного как болезнь Бурневнля - Приигла, сопровождающейся туберозным склерозом, поражением центральной нервной системы п другими симптомами [Петровский и др., 1997; Grebenc et al., 2000].

Рабдомиомы представляют собой полиморфные узловые образования белесоватого или коричневого цвета в отличие от окружающего миокарда, от которого не отделены какой-либо границей. Гистологическая структура рабдомиомы имеет ячеистое строение, обусловленное характерным размещением многочисленных полиморфных клеток, среди которых встречаются крупные «паукообразные» клетки с центрально расположенным округлым ядром и длинными отростками, содержащими миофибриллы [Нечаенко и др., 1990; Silverman, 1980; Grebenc et al., 2000].

Высгупая в просвет камер сердца, рабдомиомы могут нарушать внутрисер-дечпую гемодинамику, вызывать клинические симптомы стеноза и окклюзии ат-риовентрикулярных отверстий. Наличие узлов опухоли в межжелудочковой перегородке может вызывать нарушения проводимости, аритмию и приступы фибрилляции желудочков сердца. Без хирургической помощи перечисленные патологические явления становятся наиболее частыми причинами внезапной смерти больного. Прогноз при рабдомиомах без оперативного вмешательства очень плохой — более половины детей умирают в течение первого года жизни, а периода полового созревания достигают всего 2,8% [Петровский и др., 1997].

Фиброма сердца - доброкачественная соединительнотканная внутримышечная опухоль, происходящая из фпбробластов. Она наблюдается в 0,15-7,25% случаев всех первичных новообразований сердца. Фибромой могут поражаться любые отделы сердца, но наиболее часто желудочки или межжелудочковая перегородка. В половине случаев опухоль имеет внутриполостпой характер роста. Фиброма может быть обнаружена в любом возрасте у пациентов обоего пола, но в 70% случаев её выявляют у пациентов в возрасте до 10 лет. Эта опухоль является второй по частоте встречаемости опухолью сердца у детей после рабдомно-мы [Петровский и др., 1997; Burke et al., 1994; Araoz et al., 2000].

Визуально обычно опухоль представляет собой солитарное образование плотной консистенции, ссровато-белого цвета, до 10 сантиметров в диаметре. Опухоль не имеет капсулы, отличается инвазивпым ростом. Гистологическая структура представлена пролиферирующими фибробластами, продуцирующими коллагеновые волокна. Центральная часть таких опухолей, как правило, состоит из гпалинизированной фиброзной ткани с множественными очагами кис-тозной дегенерации и кальцификации, а по их периферии находятся веретенообразные клетки, лежащие между разнонаправленными пучками коллагеновых волокон [Burke et al., 1994; Grebenc et al., 2000].

Фибромы сердца отличаются медленным ростом. Прогноз течения заболевания зависит от величины и расположения опухоли. Опухоли могут быть причиной застойной сердечной недостаточности и часто, вовлекая в патологический процесс проводящую систему сердца, могут приводить к нарушениям ритхма и проводимости [Петровский и др., 1997; Burke et al., 1994].

Липома сердца — доброкачественная опухоль сердца, состоящая из жировой ткани, с хорошо развитой капсулой. По зарубежным данным лппома составляет около 8,4% всех новообразований сердца [Mullen et al., 1995; Chahinian et al., 2000], а по отечественным - 0,7% [Петровский и др., 1997]. В большинстве случаев эта опухоль, исходя из субэндокардиального слоя, имеет внутриполостпой характер роста, но реже может располагаться внутримиокардпальпо или эпикардиально. Встречаясь независимо от пола, наиболее часто липома представляет собой солптарное образование, которое может локализоваться в различных отделах сердца, преимущественно в левом желудочке пли правом предсердии. Существует возможность вовлечения митрального клапана в опухолевый процесс.

Микроскопически типичные липомы построены, в основном, из зрелых жировых клеток, находящихся в различном соотношении с участками фиброзной и миксоидпой «соединительной» ткани, кровеносными сосудами. При внутримышечном росте в липомах можно выявить различное количество мио-кардиальпглх клеток, что осложняет морфологическую диагностику. Капсула липомы имеет фиброзную структуру [Mullen et al., 1995; Grebenc et al., 2000].

Особо следует отметить так называемую липоматозную гипертрофию межпредсердпой перегородки, которая является скорее гиперплазией первичной жировой ткани, чем истинной опухолью [Петровский и др., 1997; Araoz et al., 2000; Grebenc et al., 2000]. Представляет собой непнкапсулировапную массу бурой жировой ткани, расположенную под эндокардом межпредсерднон перегородки со стороны правого предсердия. Образование зачастую располагается в области овальной ямки и распространяется на область предсерд-но-желудочкового (атриовентрикулярного) узла. Как следствие, клиника характеризуется наджелудочковой тахиаритмией.

Обычно липомы и липоматозная гипертрофия межпредсердпой перегородки развиваются бессимптомно. Однако около трети больных с этой патологией умирают внезапно - вследствие длительных приступов аритмии [Петровский и др., 1997].

Гемангиома сердца - доброкачественная сосудистая опухоль, составляющая согласно данным одних зарубежных исследователей примерно 2,8% всех новообразований сердца [Chahinian et al., 2000], а по другим данным гемангио-хмы составляют около 5 - 10% среди всех доброкачественных опухолей сердца [Grebenc et al., 2000]. Встречается у больных обоего пола, во всех возрастных группах, но чаще у взрослых. Опухоль имеет внутриполостной, внутримышечный и эпикардиальный характер роста, может развиться в любом отделе сердца

Петровский и др., 1997]. Отмечено, что субэндокардиальная локализация опухоли преобладает в правых отделах сердца [Grenadier et al., 1989].

По гистологическому строению гемангиомы могут быть кавернозными, венозными, артериовенозными, артериолярными и капиллярными. Эндокарди-альные гемангиомы обычно капиллярные или смешанные кавернозно-капиллярные, могут включать мпксоиднуго строму. Внутримышечные могут быть всех типов, обычно содержат жир, фиброзную ткань [Grebenc et al., 2000; Langer et al., 2006]. Клиническая картина заболевания и его прогноз зависят от локализации опухоли и её размера.

Неврилеммома сердца (шваннома) - доброкачественная опухоль, гистогс-нетически связанная с оболочками нервов. Чаще развиваются у пациентов женского пола вне зависимости от возраста. Опухолевый процесс наиболее часто наблюдается в области правого или левого предсердия, реже оказывается вовлечённым левый желудочек. От локализации и размера опухоли зависит клинический прогноз течения заболевания.

Микроскопически обнаруживаются переплетающиеся пучкп клеток с ба-зофильной цитоплазмой и овальными или вытянутыми ядрами, которые заключены в нежно-волокнистую сеть аргирофильных и коллагеповых волокон. Кле-точно-волокпистые пучки формируют вытянутые ритмичные структуры в виде «завихрений», «палисадных» структур. Выявляются тельца Верокаи. В опухоли может обнаруживаться большое количество полнокровных тонкостенных сосудов и кист, заполненных слизеподобным содержимым [Петровский и др., 1997; Betancourt et al., 1979].

К первичным доброкачественным новообразованиям сердца также относятся, помимо уже обсуждённых, мезотелиома предсердно-желудочкового узла, тератома, зернисто-клеточная опухоль, лейомиома, лимфангпома, нейрофиброма [Петровский и др., 1997; Silverman, 1980; Сох et al., 1983; Chahinian et al., 2000].

3.2. МИКСОМА СЕРДЦА - НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЁННАЯ

ОПУХОЛЬ СЕРДЦА

3.2.1. История обнаружения и изучения миксомы сердца

Впервые серию из шести образований в левом предсердии, которые по приведённому описанию по современным представлениям следовало бы отнести к миксомам, дал в 1845 году английский врач King. Аналогичные описания приводились также в работах Torell в 1907 году и Husten в 1922 году [цитируется по Захарова и др., 2003].

Первое успешное хирургическое удаление миксомы левого предсердия было выполнено Crafoord в 1954 году в Швеции, затем Кау в США в 1959 году успешно провёл операцию по поводу миксомы левого желудочка [Silverman, 1980; Reardon & Smythe, 2003].

В нашей стране первое успешное удаление тератомы миокарда осуществлено С.Л. Либовым (1959), а внутрипредсердных опухолей - Б.В. Петровским (1963) и С.А. Колесниковым (1963) [Петровский и Нечаенко, 1992]. Соблюдение разработанных методов проведения кардиохирургпческих операций позволило клиницистам крупных кардпохирургических центров добиться практически полной ликвидации госпитальной легальности за последние годы практики хирургического лечения больных с миксомами сердца.

К 1964 году в мире было успешно проведено более 60 операций по удалению миксом сердца, локализованных в предсердиях [Reardon & Smythe, 2003]. Это обусловило увеличение объёма материала для изучения и его качественное изменение, то есть преимущественное накопление биопсийного материала по сравнению с исключительно аутопсийным, доступным ранее.

Изначально существовала точка зрения, что миксома представляет собой ослизннвшийся организованный внутрисердечный тромб, что обуславливалось слизистой консистенцией опухоли [Salyer et al., 1975; Symbas et al., 1976; Silverman, 1980]. Однако с внедрением в практику наряду с традиционными гистологическими методами иммуногистохимических технологий, молекулярно-генетических методов анализа, у абсолютного большинства специалистов не вызывает сомнения опухолевая природа миксомы сердца. В настоящее время превалирующей гипотезой является гипотеза происхождения опухоли из мезенхи-мальных клеток без указаппя конкретного источника. В то же время непрерывно поступают сообщения исследовательских групп (в деталях будет обсуждено далее), в которых авторы пытаются такой источник опухолевых клеток идентифицировать [Захарова и др., 2003; Pucci et al., 2000; Terracciano et al., 2000; Acebo et al., 2001; Kodama et al., 2002; Sakamoto et al., 2004b; Orlandi et al, 2006].

3.2.2. Спорадическая и семейные формы миксомы сердца. Миксомный синдром, или комплекс Карни

В подавляющем большинстве случаев миксома сердца представлена так называемыми спорадическими миксомами, которые, поражая, как правило, левое предсердие, чаще встречаются у женщин, чем у мужчин, обычно после 40 лет. Особенностями спорадической формы являются уницентрическое происхождение опухоли (обычно из области овальной ямки на межпредсердпой перегородке), отсутствие рецидивов миксом после их удаления, а таюке отсутствие наследственного характера заболевания.

В 1960 году R.H. Fankenfeld и соавторы [Frankenfeld et al., 1960] впервые описали сочетание мпксом с пятнистой пигментацией кожи. В начале 1980-х годов появились работы, в которых обсуждалась возможность сочетания миксом сердца с лентигинозом, обилием веснушек, фиброаденомами молочных желёз, эндокринными и периферическими опухолями. Различные сочетания симптомов обозначались в виде аббревиатуры как NAME- или LAMB-синдромы [Atherton et al., 1980; Rhodes et al., 1984]. NAME расшифровывается N - певусы, A - предсердная (atrial) миксома, M - миксоидный (myxoid) нейрофиброматоз, Е - веснушки (ephelides). LAMB расшифровывается L — лентиго, А — предсердная (atrial) миксома, М — миксомы кожи и слизистых оболочек (mucocutaneus), В - голубые (blue) невусы [Мухин и др., 2006]. В 1985 году J. Carney и соавторы объединили миксому сердца, а также пятнистую пигментацию кожи, нарушения функции эндокринных органов и экстракардиаль-ные опухоли в единый симптомокомплекс, названный позднее A. Vidaillet и соавторами [Carney et al., 1985; Vidaillet et al., 1987] «миксомным синдромом» с частотой встречаемости в 5 - 10% от общего числа миксом, а среди больных детского возраста 23%.

Миксомиын синдром регистрируется с одинаковой частотой у больных женского и мужского пола в возрасте, как правило, до 40 лет. В таких случаях миксомы отличаются первичной множественностью (44-53%), мультицентри-ческим (45%) и экстрасептальным (33%) происхождением, высокой частотой повторного возникновения опухоли после её удаления (17—21%), наследственным характером заболевания (14-25%). Со стороны биохимических показателей отмечается повышенная концентрация в крови адренокортикотропного гормона, кортизола, повышение суточной экскреции 11-оксикортикостероидов (43,3%), регистрируется повышение уровня концентрации ренина, ангиотензи-на 11, альдостерона (40%) [Печаенко и др., 1991; Константинов и др., 1994; Константинов и др., 1999; Рогов и др., 2004].

Комплекс Карни (миксомный сппдром) наследуется по аутосомно-доминантному типу [Casey et al., 2000]. С использованием стратегии позиционного клонирования были найдены два хромосомных локуса, ассоциированных с заболеванием: 2р\6 и 17^22-24. В настоящее время ген-кандидат в локусе 2р\6 остаётся неизвестным, а в локусе 17^22-24 у примерно половины пациентов с миксомным синдромом были обнаружены мутации в гене регуляторной субъединицы al цикло-АМФ-зависимоп протеппкппазы A (PRKAR1A). По предположению L. Kirschner и соавторов [Kirschncr ct al., 2000] PRKAR1A является опухолевым супрессором, так как в ткани опухолей при мпксомном синдроме показана потеря нормального аллеля. К настоящему времени описаны 39 разных мутаций в кодирующей белок части гена [Wilkes et al., 2005]. Их список включает замены нуклеотидов, короткие делеции (длиной 1-4 нуклеотида, одна ранее неизвестная двухнуклсотпдая делеция в экзоне 3 была обнаружена нашим научным коллективом [Скамров п др., 2003]), короткие вставки (1-2 нуклеотида). В результате таких мутаций происходят сдвиги рамки считывания и замены смысловых триплетов на стоп-кодоны. В целом мутации равномерно распределены вдоль кодирующей последовательности, а также в редких случаях (4 мутации) встречаются в областях нитронов, примыкающих к экзонам, что предположительно нарушает процесс посттранскрипциониого созревания РНК (сплайсинга).

Недавно появились работы, в которых обсуждается роль других возможных генов-капдпдатов, как предполагают, вовлечённых в развитие миксомного синдрома [Veugelers et al., 2004; Stratakis et al., 2004].

3.2.3. РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ МИКСОМЫ СЕРДЦА

Миксомы занимают лидирующее положение среди всех первичных опухолей сердца по частоте встречаемости у взрослых пациентов, составляя по данным отечественных авторов до 90% процентов от их общего числа [Нечаен-ко и др., 1994; Петровский и др., 1997; Бокерия и др., 2003]. Западные исследователи приводят соответствующие данные в диапазоне 50 - 80 % [Harken et al., 1972; Roberts, 1997; Perchinsky et al., 1997; Araoz et al., 2000].

Из обобщенных американскими клиницистами данных 25 групп исследователей, которые занимались обследованием и оперативным лечением суммарно 1195 пациентов, следует, что 796 (67%) были женщинами и 399 (33%) были мужчинами [Yoon el а!. 2002]. Таким образом, соотношение два к одному, видимо, отражает реальное распределение встречаемости миксомы сердца по полу в западных странах. Возраст пациентов распределился в диапазоне o r 2,5 до 97 лет.

В сообщениях отечественных учёных соотношение групп пациентов женского и мужского пола составляет около трёх к одному по данным авторов из РНЦХ им. академика Б.В. Петровского [Петровский и др., 1997; Рогов и др., 2003]. По данным этих же авторов возраст больных с миксомамп сердца колебался в пределах от 10 до 69 лет, а по данным коллектива авторов ИССХ АМН Украины от 7 до 72 лет [Захарова и др., 2003] при соотношении между пациентами женского н мужского пола 2,8 : 1.

При сборе статистических данных по встречаемости миксом сердца у пациентов ювенильной возрастной категории следует особое внимаппе уделять случаям выявления наследственного миксомпого синдрома (комплекса Карни), поскольку обнаружение опухоли как симптома этой наследственной патологии особенно характерно для пациентов именно указанного периода жизни, что необходимо учитывать [Константинов и др., 2007].

Миксомы сердца с различной частотой встречаются во всех отделах сердца. По данным коллектива из РНЦХ им. академика Б.В. Петровского подавляющее большинство этих опухолей обнаруживали в левом предсердии (82,8%), значительно меньше - в правом (9,9%). Очень редко миксомы сердца наблюдали в других точках локализации: в правом желудочке (2,5%), на митральном клапане (1,6%), в левом желудочке (0,8%), на трикуспидальном клапане (0,8%), аутохронный рост в обоих предсердиях (1,6%). Опухоли имели короткую ножку, фиксированную на узком пли широком основании (0,5-2 сантиметра) к межпредсердной перегородке преимущественно в области овальной ямки. Экстрасептальная фиксация наблюдалась в 10-25% случаев [Петровский и др., 1997].

В 1972 году B.G. Harken и соавторы постулировали так называемое «правило 75», согласно которому 75% всех новообразований составляют миксомы, 75% всех миксом располагается в левом предсердии, среди которых 75% миксом локализуются в фиброзной части межпредсердной перегородки (овальное окно) и 75% этих опухолей имеют ножку в месте прикрепления [Harken et al., 1972].

3.2.4. Клиническая характеристика и методы обследования больных с миксомой сердца

3.2.4.1. Основные клинические синдромы

Основные клинические проявления, наблюдаемые при миксоме сердца, в настоящее время принято группировать в три основных синдрома, один из которых обычно является преобладающим: обструктивный (механическое сопротивление кровотоку), эмболический (фрагментация опухоли с последующим переносом фрагментов по кровеносной системе), общеклинический (реакция организма на опухоль) [Петровский и др., 1997; Мухин и др., 2006; Pinede et al., 2001; Acebo et al., 2003; Scott et al., 2003].

Отражением обструктивного синдрома следует признать такое часто встречающееся клиническое проявление заболевания, как застойную сердечную недостаточность (регистрируется в 33-96% случаев) [Петровский и Неча-еико, 1992]. У пациентов с миксомоп левого предсердия регистрируются симптомы, характерные для порока митрального клапана с преобладанием стеноза: диспноэ, ортопноэ, приступы одышки в ночное время, острый отёк лёгких, кашель, боли в области грудной клетки [Приходько и др., 1985]. При локализации опухоли в правом предсердии наблюдаются симптомы правожелудочковой недостаточности: периферические отёки, асцит, гепатомсгалия, слабость, повышенная утомляемость.

По наблюдениям академика Б.В. Петровского и соавторов эмболический синдром, отмеченный в 17,8% случаев, имеет характерные особенности. Так синдром возникал у больных с миксомами сердца на фоне синусного ритма, предшествуя на 1 - 15 месяцев появлению других клинических признаков заболевания (54,2%). Больные относились к молодому и среднему возрасту (11-55 лет). Провоцирующим моментом в возникновении эмболического синдрома является физическая нагрузка — бег, прыжки, резкие движения [Петровский и др., 1997].

При локализации миксомы в левых отделах сердца регистрируется эмболия в системный артериальный кровоток с поражением сосудов головного мозга, сердца, почек, селезёнки и области верхних п нижних конечностей [Grebenc et al., 2002; Garcia-F-Villalta et al., 2002; Val-Bemal, et al., 2003; Himdayaraj et al., 2004]. Иногда при поступлении пациентов с транзиторной пшемической болезнью сердца, инфарктом миокарда или инсультом головного мозга методами эхокардиогра-фии выявляется наличие миксомы, расположенной в левом предсердии и являющейся источником эмболизацпи [Mattle et al., 1995; Yilrnaz et al., 2003; Braun et al., 2005; Herbst et al., 2005; Sankar et al., 2006]. Следы миксомы сердца в виде множественной эмболизации головного мозга были выявлены через пять лет после успешной резекции опухоли [Oguz et al., 2001]. Описан случай частичной обтурации брюшной аорты в области ответвления почечных артерий целой миксомной опухолью, отсепарировавшейся от стенки левого отдела сердца без возможности точно установить исходную локализацию [Fang et al., 2004]. Множественные системные эмболии мо 17т имитировать васкулиты и инфекционные эндокардиты [Buchanan et al., 1979; Fitzpatrick et al., 1986; Garcia-F-Villalta et al., 2002]. В эмболиза-цию может быть вовлечена не только ткань самой опухоли, но и тромботические массы, часто покрывающие поверхность опухоли [Reynen, 1995; Perchinsky et al., 1997; Yilmaz et al., 2003; Sankar et al., 2006].

При локализации миксомы в правых отделах сердца происходит эмболн-зация лёгких через лёгочные артерии, что приводит к лёгочной гипертензии, явлению плеврального выпога, а в исключительных случаях и к кашлю с кровянистой мокротой [Symbas et al., 1976; McCoskey et al., 2000; Facila-Rubio et al., 2003]. Часто при аускультации прослушиваются мурлыкающие звуки, что подтверждает наличие лёгочной гипертензии, правосторонней сердечной недостаточности и лёгочной тромбоэмболии.

Обязательное патологогистологическое изучение материала эмбола после его удаления имеет определяющее значение в установлении правильного диагноза опухоли сердца [Jardine et al., 1997; Garcia-F-Villalta et al., 2002; Val-Bernal, et al., 2003; Hirudayaraj et al., 2004].

По наблюдениям коллектива исследователей под руководством академика Б.В. Петровского общеклпническпй синдром выявляется более, чем у 50% пациентов с миксомой сердца [Петровский и др., 1997], что обусловлено неспецифической реакцией организма больного на опухоль. Наблюдаются субфеб-рильная температура (53-72,7%), похудание (21-36%), генерализованная арт-ралгпя и/илп миалгия (23,5-35,2%), увеличение СОЭ (19-69%), гемолитическая анемия (24-44%), диспро геинемия (8-48%), лейкоцитоз (26-39%), повышение содержания фибриногена (60,6%), положительная проба на С-реактивный белок (42,4%), гипергаммаглобулпнемия (13,3%), а в отдельных наблюдениях - тром-боцитопения, полицитсмия [Петровский и др., 1997]. Диагностическая значимость этих признаков сильно ограничена всвязи с их неспецифичностью и непостоянством, поэтому их следует рассматривать только в сочетании с другими клиническими проявлениями. Указанным коллективом авторов были обнаружены изменения в крови пациентов с миксомой сердца — повышенное содержание онкологических маркёров СА-19-9 и/или СА-72-4 (49%), проколлагена (44,4%), пролактина (29,8%) [Петровский и др., 1997; Константинов и др., 1994; Константинов и др., 1999].

Общими проявлениями наличия миксомы следует признать часто встречающиеся аритмии различного характера, приступы головокружения и синкопе. Отличительным признаком при миксоме сердца является зависимость выраженности и манифестации этих нарушений от положения тела пациента.

3.2.4.2. Особенности физикалъного обследования

При физикалыюм обследовании следует обратить внимание на аускульта-тивную картину, также часто характеризующуюся изменчивостью в зависимости от позиции тела больного. При локализации опухоли в предсердиях отмечается наличие раннего диастолического тона, возникающего в результате прола-бирования опухоли и столкновения её с фиброзным кольцом митрального или трикусппдального клапана, либо со стенкой соответствующего желудочка [Петровский и Нечаенко, 1992; Goswami et al., 1998; Nardi et al., 2000; Harada et al., 2001]. Иногда отмечаются систолический шум в проекции соответствующего клапана, вызванный регургитацией крови через клапан, и ещё реже своеобразный систоло-диастолический шум, образующийся в результате тренпя опухоли об эндокард, получивший название «шум трепня эндокарда» [Петровский и др., 1997; Goswami et al., 1998].

Клинические проявления миксомы и других первичных опухолей сердца чрезвычайно полиморфны и непатогномоничны для этой патологии. Диапазон пх колеблется от бессимптомного течения заболевания до сочетания различных описанных синдромов. Это объясняет ситуацию, при которой выявление первичных опухолей сердца в клиппке до сих пор представляет собой большую сложность. Врачам, специалистам различного профиля необходимо проявлять клиническую настороженность в интерпретации данных анамнеза заболевания и некоторых его физикальпых признаков» [Петровский и др., 1997].

Необходимо обращать внимание на следующие особенности:

• отсутствие чёткого ревматического анамнеза или данных, свидетельствующих о наличии врождённого порока сердца в детском возрасте

• зависимость одышки, нарушений ритма, приступов головокружения или синкопе, аускультативной картины от положения тела пациента

• наличие эмболического синдрома на фоне синусного ритма

• резистентность декомпенсации кровообращения к лекарственной терапии и быстрое её прогрессирование

• наличие лёгочной гипертензнп, отличающейся нетипичным течением

3.2.4.3. Особенности инструментальных методов обследования

Диагностические возможности рутинных инструментальных методов исследования, таких как электрокардиография, фонокардиография и рентгенография, ограничены при миксомах и других внутрпполостпых новообразованиях сердца, поскольку для них непатогпомоничны. Электро- и фонокардиография, как правило, отражают гемодинамические изменения, возникающие в преобладающем большинстве случаев при опухолях больших размеров. Возможно отсутствие регистрации каких-либо изменений при этих методах обследования, что ещё более усложняет диагностику миксомы сердца. Рентгенологическое исследование больных миксомой сердца также малоинформативно, что может объясняться малыми размерами опухоли или сходством регистрируемых признаков с таковыми при пороках сердца [Петровский и др., 1997]. При миксомах на рентгенограмме обычно регистрируются увеличение размеров сердца или отдельных его камер, неправильный контур сердечной тени, признаки застоя в малом круге кровообращения [Grebenc et al., 2000; Grebenc et al., 2002; Tay et al, 2002; Chen et al., 2003]. Несмотря на недостаточную информативность рутинных методов исследования, нельзя пренебрегать ими, особенно на догоспитальном этапе.

Возможности методов компьютерной и магнитно-резонансной томографии охватывают топическую диагностику опухолей сердца, оценку их размеров (от 1 сантиметра и более), определение места фиксации. В целях верификации диагноза необходимо сопоставлять получаемые данные с данными эхокардио-графии, используя эти методы параллельно и взаимодополняюще [Рабкпн и др., 1991; Петровский и др., 1997; Araoz et al., 2000]. В частности, «компьютерная томография адекватно отражает морфологию, локализацию и параметры опухоли сердца, выгодно отличаясь от эхокардиографпи охватом перикарда, больших сосудов и других структур, позволяя специалисту по диагностике проводить поиск ассоциированных внесердечпых осложнений, включая метастазы» [Grebenc et al., 2000]. В дополнение, коронарная ангиография с рентгеноконтра-стными веществами при миксомах сердца используется очень активно как диагностическая процедура в условиях стационара, выявляя систему васкуляриза-ции опухоли [Петросян и Богомолова, 1983; Krishnamoorthy & Rao, 2001; Тау et al., 2002; Luciani et al., 2005; Rahmanian et al., 2007]. Сравнительно недавно при обследованиях на наличие внутри сердечных опухолей начали использовать метод радионуклидной ангиокардиографии с введением в кровоток пациентов веществ, меченных радиоактивными изотопами [Петровский и Нечаенко, 1992; Pohost et al., 1977; Silverman, 1980; Chahinian et al., 2000].

Эхокарднография является высокоэффективным нспнвазивиым методом диагностики при миксоме сердца, обладающим высокой степенью надёжности и хорошей разрешающей способностью [Goswami et al., 1998]. Этот метод, особенно его вариант - двухмерная эхокардиография, необходимо признать методом выбора в диагностике внутрисердечных образований благодаря надёжности, безопасности п простоте проведения исследования, позволяющего поставить правильный диагноз даже в амбулаторных условиях [Петровский п др., 1997]. Таким образом регистрируют в реальном масштабе времени размер (от 0,5 сантиметра и более) и форму новообразования, его подвижность и соотношение с клапанным аппаратом, а также визуализируют все камеры сердца. Допплер-эхокардиография позволяет оценить качественные и количественные характеристики гемодинамическпх параметров внутрисердечного кровотока [Goswami et al., 1998].

S. Effert и E. Domaning в 1959 году впервые успешно применили одномерное эхокардиографическое исследование для диагностики миксомы левого предсердия [цитируется по Константинов и др., 1986]. С тех пор этот метод и его усовершенствованные варианты доказали свою высокую надёжность и информативность как в условиях стационара, так и в поликлинической практике [Константинов и др., 1978; Buchanan et al., 1979]. Развитие этого диагностического направления позволило отказаться от массового применения инвазивных методов исследования, связанных с катетеризацией и зондированием камер сердца [Петровский и др., 1997; Perchinsky et al., 1997].

A.I. Obeid и соавторы провели сравнение параметров эффективности трансторакального и трапсэзофагеальпого исследовании в диагностике миксом предсердий, где встречаемость опухоли самая высокая. В итоге установлено, что двухлучевое трансэзофагеальное эхокардиографическое исследование имеет наилучшую разрешающую способность и диагностическую аккуратность в обнаружении и определении природы опухолей предсердий [Obeid et al., 1989]. Эги выводы нашли подтверждение в дальнейшей медицинской практике [Петровский и др., 1997; Salmon et al., 1991; Harada et al., 2001; Chen et al., 2003].

Поскольку возможны трудности в получении и интерпретации данных инструментальных методов обследования пациентов, необходимо анализировать картину заболевания во всех деталях, не упуская клинические данные и особенности анамнеза [Петровский и др., 1997].

3.2.4.4. Лечебная тактика и клинический прогноз

Тактикой выбора при лечении больных с мпксомой сердца является безотлагательное хирургическое вмешательство с целыо максимально полной резекции опухоли [Петровский и др., 1997; Бокерия и др., 2003; Roberts, 1997; Rahmanian et al., 2007]. Однако в особом случае, например, при срастании массивной опухоли со створкой митрального клапана, в качестве лечебного подхода можег быть выбрана частичная резекция миксомы левого предсердия с послеоперационным монигориигом состояния пациента. Послеоперационное наблюдение, несомненно, является обязательным требованием в лечении мпксомы независимо от особенностей персонального характера заболевания [С1ш et al., 2004].

Обычно при вовлечении клапанов сердца в опухолевый процесс или при локализации массивной опухолп па клапане сердца производят резекцию опухоли вместе с клапаном с последующей восстановительной пластикой и, при необходимости, протезированием этого клапана [Choi et al., 2001]. При ограниченном опухолевом поражении производят наложение швов на поверхность листка клапана после резекции опухоли [Chen et al., 2003].

Касательно дискуссии о степени злокачественности миксомы сердца, преобладающая точка зрения совпадает с мнением J.W. На и соавторов: «Хотя в ряде сообщений высказывается предположение, что миксома может иметь злокачественную составляющую, выражающуюся в местном инвазировании межпредсердпой перегородки, рецидивировании или метастазировании, тем не менее, опухоль обычно рассматривается как доброкачественная сердечная опухоль с благоприятным долговременным прогнозом после хирургической операции» [На et al., 1999]. Такой же точки зрения придерживался и другой коллектив известных специалистов по опухолям сердца из США [Burke et al., 1996]. В отечественной работе отмечается, что «так называемые «злокачественные мпксомы сердца» при повторном исследовании оказываются либо иными злокачественными новообразованиями сердца, либо метастазами экстракарднальпых злокачественных опухолей, обладающих выраженным миксоматозом стромы» [Рогов, 2003]. Практически такое же мнение о случаях рецидивированпя опухолп представлено в недавней работе 2005 года I. Moyssakis и соавторов [Moyssakis et al., 2005].

3.2.5. Характеристика внешнего и внутреннего строения миксомы сердца

3.2.5.1. Внешнее строение

Миксомы, локализуясь в полости сердца, выступают в просвет камер сердца от эндокарда. Встречаются миксомы округлой (гладкой) или полипоидной (сосочковндной) формы. Часто находятся на ножке, реже сидячие. Консистенция опухолей обычно студенистая, в виде более или менее плотного желе [Петровский и др., 1997; Нечаенко и др., 1994; На et al., 1999; Araoz ct al., 2000; Grebenc et al., 2002].

У гладких плотных миксом поверхность покрыта хорошо выраженной плотной капсулой, а у мягких сосочковидных наружная капсула тонкая, плохо выраженная. Поверхность опухоли зачастую покрыта тромбами [Петровский и Нечаенко, 1992; Reynen, 1995; Grebenc et al., 2000; Parissis et al., 2005; Orlandi et al., 2005].

Подвижность мпксом зависит от их плотности, варьирует в зависимости от содержания коллагена, площади прикрепления и длины выступающей части. В отличие от сосочковидных мпксом, гладкие миксомы па ножках практически не проявляют наклонное гей к внезапному произвольному разрушению на фрагменты [Acebo et al., 2003; Sankar et al., 2006].

По окраске встречаются миксомы белые, серо-бслыс, желтоватые или коричневатые, что определяется наличием, величиной п давностью кровоизлияний в ткани опухоли. На разрезе окраска опухоли пестрая, с варьирующими по размеру очагами кровоизлияний и склерозирования [Петровский и др., 1997; Fcldman et al., 1977; Reynen, 1995].

В среднем размеры миксом варьируют от 1 до 15см в диаметре, в основном составляя в размере около 5 - 6см. Вес удалённых миксом обычно находится в диапазоне от 8 до 175 граммов, в среднем обычно 40 - 60 граммов [Мухин и др., 2006].

3.2.5.2. Данные светооптической микроскопии

Типичная гистологическая картина миксомы миокарда включает в себя несколько характерных признаков. В жслатпнозном матрпкее неравномерно распределены относительно малочисленные клетки опухоли преимущественно округлой или немного вытянутой формы с нечётко выраженными контурами, со светлой базофильной цитоплазмой и небольшими округлыми ядрами, расположенными эксцентрично. В некоторых работах зарубежных авторов отмечастся гетерогенность клеточной популяции - сочетание в ткани одной и той же миксомы небольших одноядерных клеток и крупных многоядерных, содержащих от двух до семи ядер [Hemachandrana et al, 2003; Li et al., 2003; Orlandi et al., 2006] (в работах отечественных авторов упоминаний о таких наблюдениях не встречалось). Клетки располагаются поодиночке, парами или небольшими скоплениями, формируют однослойные и многослойные кольцевые структуры, окружающие группы клеток, а также заполненные мукополисахарпдпым веществом, эритроцитами или со свободным просветом [Нечаенко и др., 1991; Петровский п др., 1997; Руденко и Захарова, 2001; Farrell et al., 1996; Grebenc et al., 2000; Chen et al., 2003].

По виду кольцевые структуры напоминают сосудистые почки и сосуды синусоидного типа. Некоторые авторы применительно к этим структурам используют термин синцитий [Захарова и др., 2003; Burke et al., 1996; Terracciano et al., 2000]. По мнению исследователей, помимо кольцевых структур синцитии на гистологических срезах иногда могут принимать вид так называемой «картины полосы скошенной травы», или, в другом варианте описания, вид «упорядоченных тандемных структур» [Захарова п др., 2003; Fine et al., 1968; Pinedc et al., 2001]. Полости каналов, как и поверхность миксомы, выстилаются эндоте-лиоподобными клетками. Поверхность опухоли также может быть выстлана несколькими слоями опухолевых клеток. Сосуды артериального типа с резко утолщенной стенкой и суженными просветами наблюдаются в «ножке» опухоли, где также отмечается большое число гладкомышечных элементов [Нечаенко и др., 1991; Руденко и Захарова, 2001; Goldman et al., 1987].

Обычно опухолевые клетки не проникают глубже эндокарда за исключением единичных зарегистрированных наблюдений [Нечаенко и др., 1994; Рогов п др., 2003; Goldman et al., 1987]. В качестве характерного гистологического признака миксомы сердца отмечается наличие клеток веретенообразной формы, а также более редких звёздчатых и паукообразных. Зачастую регистрируются очаговые и диффузные лейкоцитарные инфильтрации, состоящие из лимфоид-ных клеток с примесью плазматических [Goldman et al., 1987; Burke et al., 1996;

Grebenc et al., 2002; Chen et al., 2003]. Мелкозернистый зозпнофильный матрикс опухоли содержит тонкие пучки коллагеновых и ретикулиновых волокон (выявляются окрашиванием пикрофуксином по Ban Гизону и серебрением по Го-мори), а также богат гликопротспдами и кислыми гликозаминоглнканами, выявляемыми специальными методами гистологического окрашивания: ШИК-рсакция, с альциановым синим, явление метахромазии с толуидиновым синим [Петровский и др., 1997; Захарова и др., 2003: Goldman et al., 1987].

Мнтотическая активность клеток краппе низкая, что позволяет аргументировано квалифицировать миксому сердца как доброкачественную опухоль. Лишь в одной отечественной работе сообщается о редких фактах выявления иммуногистохимическим методом одного-шестп митозов на 2000 клеток миксомы в гистологических образцах [Захарова и др., 2003]. В других сообщениях при гистологических исследованиях 97 [Нечаенко и др., 1994] и 168 [Рогов и др., 2003] случаев миксомы сердца митозы не были обнаружены ни в одном наблюдении. В работе Е. Accbo и соавторов говорится об обнаружении при помощи световой микроскопии 1 - 3 митозов примерно на 6000 клеток в 8 миксо-мах из 37 проанализированных [Accbo et al., 2003].

О доброкачественности миксомы свидетельствует и низкая скорость роста опухоли, измеренная при помощи эхокардиографии задолго до хирургической операции в ряде исключительных случаев заболевания [Malekzadeh & Roberts, 1989; Iga et al., 1997]. Усреднённая скорость роста миксомы у нескольких пациентов была оценена как 1,8 сантиметров в диаметре в год.

Часто в строме опухоли выявляются многочисленные вторичные изменения, которые могут несколько усложнять морфологическую диагностику. Такие как множественные диффузные или очаговые кровоизлпяппя с наличием в них гемосидерина и гемосидерофагов (их появление связывают с нарушениями целостности кольцевых сипусоидпых структур с кровью), очаги скопления фибрина, склероза и сидерофиброзпые узелки, в которых встречаются участки обызвествления, хрящевой и костной метаплазии [Рогов и др., 2003; Stevens et al., 2003]. Зачастую отмечаются тельца Гамна - Ганди, представляющие собой обызвествлённьте фибриновые волокна [Grebenc et al., 2002]. Выраженные вторичные изменения, связанные с кальцифпкацией зарегистрированы в 56% наблюдений, описанных в работе M.L. Grebenc с соавторами, а случаи оссифика-ции составили 10% от общего числа в другом исследовании [Acebo et al., 2003]. Отечественные авторы приводят ту же величину 10% для случаев оссификацпи миксомы [Петровский п Нечаеико, 1992].

В 1—3% случаев миксомы сердца в теле опухоли выявляются железисто-подобные структуры, образованные одним слоем столбчатых эпителиоподоб-ньтх клеток, выделяющихся интенсивно-эозипофильной цитоплазмой, богатой гликопротеинамн. Примерно с такой же частотой встречаются в миксомах очаги экстрамедуллярного кроветворения с клеточными элементами различной степени зрелости [Рудепко и Захарова, 2001; Terracciano et al., 2000; Den Bakker et al., 2005; Orlandi et al, 2006].

3.2.5.3. Электронная микроскопия миксомы cepdifa

В недавней работе, выполненной К.А. Роговым и соавторами [Рогов и др., 2003] приводятся результаты ультраструктурных исследований, выполненных па обширном биопсийном материале. «При электронно-микроскопическом исследовании 82 миксом сердца в мелкозернистом пли хлопьевидном матриксе поодиночке или небольшими группами располагались миксомньте клетки с обильной цитоплазмой, мелкими овальными митохондриями, хорошо развитым пластинчатым комплексом и эндоплазматическим ретикулумом. Ядра мпксом-ных клеток имели округлые или полигональные очертания с небольшими инвагинациями. Хроматин был равномерно распределён по всей площади ядра, в некоторых наблюдениях отмечены маргппация хроматина и формирование 1 -2 ядрышек. В цитоплазме миксомпых клеток определялось небольшое количество микрофпламентов, расположенных хаотично или в виде тонких, разнонаправленных пучков. Промежуточные филаменты выявлены в единичных клетках и в крайне незначительном количестве.»

В этой же работе отмечались признаки повышенной секреторной активности клеток миксомы. В них выявляли хорошо развитый комплекс Гольджи, эндоплазматический ретикулум, в том числе и шероховатый. Просветы некоторых канальцев были заполнены электронно-плотными секреторными гранулами, что позволило авторам сделать вывод о подтверждении известных данных об интенсивной продукции гликопротеидов и кислых гликозаминогликапов миксомными клетками [Рогов и др., 2003]. В работах зарубежных авторов сообщалось об аналогичных наблюдениях [Feldman et al., 1977; Goldman et al., 1987].

Отмечены ультраструктурные признаки эндотелиальной дифференциров-ки миксомных клеток, которые, однако, не достигают стадии зрелых эндоте-лиоцитов [Orlandi et al., 2006]. Другие исследователи помимо таких клеток отмечали наличие видоизменённых гладкомышечных клеток п других клеток опухоли, не поддающихся однозначной классификации по признаку дпфферен-цировкн [Tanimura et al., 1988]. У поверхности клеток наблюдали микропино-цитозные везикулы, а также тельца Вейбеля - Палладе, содержание которых варьировало. На поверхности клеток присутствовали цитоплазматические отростки, которые зачастую формировали пальцевидые интердпгптации между соседними клетками [Goldman et al., 1987; Tanimura et al., L988; Kodarna et al., 2002]. Некоторые близко расположенные клетки формировали щелевпдпые контакты (иногда с заметным межклеточным пространством) и десмосомы, что хорошо проиллюстрировано на электроппомпкроекопических фотоснимках [Tanimura et al., 1988].

Хотя в некоторых исследованиях не было обнаружено базальных мембран и многоядерных клеток в структуре ткани опухоли [Feldman et al., 1977], в других, более поздних, сообщениях такие факты подтверждены приведёнными в статьях электронными микрофотографиями [Goldman et al., 1987; Tanimura et al., 1988; Kodama ct al., 2002].

3.2.5.4. Морфология клеток миксомы сердца в культуре

В изначальной первичной культуре миксомпых клеток по данным A. Orlandi и соавторов отмечалось наличие двух основных морфологических типов: крупных округлых клеток, богатых цитоплазмой, и отростчатых, вытянутых, напоминающих фибробласты [Orlandi et al., 2006].

Электронпомикроскопическое исследование показало, что микс01мные клетки, растущие в культуре прикреплёнными к подложке, имеют тонкие протяжённые цитоплазматические отростки и множество хаотично расположенных микровыростов на верхней поверхности клетки [Tanimura et al., 1988]. Такие же микровыросты отмечены в наблюдениях Н. Kodama и соавторов [Kodama et al., 2002].

После десяти дней культивирования и 2 — 3 пассажей в культуре преобладают отростчатые клетки полигональной формы, зачастую формирующие сетчатые структуры за счёт межклеточных контактов. Никаких признаков эндоте-лиальноп или гладкомышечной дифференцпровки у культивируемых миксом-ных клеток не отмечено. Позже клетки в культуре постепенно перестают расти и погибают [Tanimura et al., 1988].

При культивировании миксомных клеток в присутствии кровяного тромба большинство клеток деградирует и исчезает при высеве, однако часть выживает, покрывая поверхность тромба. Тем не менее, через некоторое время и эти клетки проходят путём деградации и гибели [Tanimura et al., 1988].

3.2.5.5. Случаи затруднений в постановке диагноза по гистологической картине среза опухоли сердца

Существуют осложнения, затрудняющие диагностику миксомы по гистологической картине среза - кальцификация, оссификация, геморрагия, сидерофиб-роз, фиброз н др. [Hwang et al., 1991; Grebenc et al., 2002; Sugeng et al., 2004].

Сложности с установлением окончательного диагноза отражаются в формулировках послеоперационных патогистологических заключений: «злокачественное перерождение железистых структур в сердечной мпксоме» [Eckhardt et al., 2003] или «мнксома с очагами атипичных клеток» [Hishitani et al.; 2001]. В последнем случае, после возникновения через год у больного в сердце множественных повторных опухолей, послеоперационный гистологический материал был подвергнут переоценке. Диагноз был изменён на «фибросаркома с миксо-идным перерождением». Это иллюстрация того, что часть иемиксомных опухолей сердца может проходить в своём развитии стадию миксоматозного перерождения сгромы (миксоматоз) и характеризоваться выраженными батриоидны-ми чертами. В таких сообщениях говорится о лейомноме, липосаркоме, хондро-саркоме и вторичных опухолях сердца [Hammond el al., 1976; Thomas et al., 1980; Pucci et al., 1996; Wong et al., 2002]. Примерно 20 лет назад даже появился термин «миксоидные имитаторы» (myxoid imitators) [Attum et al., 1987], который п сейчас используется по отношению к сложным в диагностическом плане внутрисердечным опухолям [Stevens et al., 2003].

Специалисты, опубликовавшие много работ по структуре опухолей сердца в ведущих медицинских журналах, подчёркивают, что в случаях так называемых «злокачественных миксом», следует прикладывать усилия для установления истинного диагноза злокачественной опухоли сердца, который скрывается за этим понятием [Burke et al., 1996]. В недавно описанном случае [Milicic et al., 2007] опухоль, первично диагностированная после резекции как миксома, дала быстрый рецидив в сердце, эмболию в нижнюю конечность и окончательно диагностирована по патологогистологическому анализу эмбола как разновидность саркомы - злокачественная фиброзная гистиоцитома.

Видоизменённые организованные кровяные тромбы иногда вызывают затруднения н взаимную путаницу с осложнёнными мпксомами в диагностике принадлежности и природы внутрисердечного образования [Hesse et al., 2006; Pillai et al., 2005; Dhawan et al., 2004; Mahdhaoui et al., 2004].

Диагностика и тппирование ткани обнаруженного в периферических тканях эмбола, а вместе с этим и опухоли или тромба - источника в полости сердца, может представлять серьёзную задачу для патологоанатома [Dogan et al., 2007]. Известен пример, когда эмболизация лёгких опухолевой тканью миксомы сердца была ошибочно диагностирована как тромбоэмболия, что через полгода привело к потере пациента в результате повторной множественной эмбо-лизацип лёгких (ставшей причиной острой легочной недостаточности) на фоне терапии варфарином [Jardinc et al., 1997].

Установлению правильного диагноза в таких случаях способствует тщательное изучение всех деталей гистологической картины и применение дополнительных методов гистохимического и имхмуногистохимического анализа ткани извлечённого образования на гликопротеины и характерные белковые тканевые маркёры (иммуногистохимические маркёры) [Ncgishi et al., 2003; Tcrracciano et al., 2000; Val-Bernal, et al., 2003; Dogan et al., 2007].

3.3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКСОМЫ СЕРДЦА

3.3.1. Белковые продукты морфорегуляторных генов (онкогенов, цитокинов и транскрипционных факторов)

Одним из первых обнаруженных белков, характерных для ткани миксомы сердца, стал хорошо изученный цитокин - интерлепкин-6 (ИЛ-6). В работах японских исследователей продемонстрирован заметный уровень экспрессии ИЛ-6 в ткани опухоли [Hirano et al., 1987; Mochizuki et al., 1998; Shiraishi et al., 2006], однако в некоторых работах говорится о выявлении ИЛ-6 лишь в 75 -80% изученных миксом сердца [Kanda et al., 1994; Acebo et al., 2003]. В работах ряда авторов из Японии [Mochizulci et al., 1998; Negishi et al., 2003; Shiraishi et al., 2006] ИЛ-6 использован в качестве иммуногистохимического маркёра, подтверждающего наряду с гистологическими признаками правильность определения исследуемой опухоли как миксомьт сердца.

Поскольку ИЛ-6 является сскретируемым белком, вполне логичным оказалось его обнаружение в повышенной концентрации в крови у значительной части пациентов с миксомой сердца [Mochizuki et al., 1998; Hovels-Gurich et al., 1999], хотя и не у всех — у одного из трёх в работе М. Jourdan и соавторов [Jourdan et al., 1990], и примерно у половины (53,8%) из 13 пациентов в работе Н. Yolcomuro и соавторов [Yolcomuro et al., 2007]. Была предложена гипотеза, что ИЛ-6 (видимо, вместе с другими веществами, синтезируемыми опухолью) вносит свой вклад в формирование наблюдаемых у пациентов признаков, составляющих общеклиническпй синдром [Hirano et al., 1987; Jourdan et al., 1990; Mochizuki et al., 1998; Hovels-Gurich et al., 1999; Yokomuro et al., 2007].

Необходимо отметить, что HJ1-6 в здоровом организме синтезируется клетками кровеносных сосудов, включая эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудистой стенки, а также клетками лимфоидного и моиоцигарного рядов дифференцировки [Tartour ct al., 1994; Yamagiwa et al., 2004]. Многие онкологические новообразования характеризуются экспрессией ИЛ-6. Например, новообразования лимфоидного и эпителиального происхождения — такие, как множественные миеломы, холангиокарциномы и карциномы шейки матки [Hirano et al., 1987; Tartour et al., 1994; Yamagiwa et al., 2004].

При изучении клеток миксомы сердца в культуре (два образца исходной опухоли) наряду с высокой концентрацией в культуральной среде интерлейки-на-6 была продемонстрирована высокая концентрация интерлейкина-8, онкогена Gro-a, вазоактнвного полипептида эндотелии-1, а также отсутствие грануло-цит-стимулирующего фактора роста, факторов роста стволовых клеток и гепа-тоцитов [Sakamoto et al., 2004b].

Другими обнаруженными белками лейкоцитарных клеток в миксомс оказались CD4 и CD8 в сочетании с CD3, характерные для высокодифференциро-ванных Т-лимфоцитов (в небольшом количестве были обнаружены CD20 — маркёр В-лимфоцитов и CD57 — маркёр естественных киллеров), а также HLA-DR, -DP, характерные для лимфоцитов и макрофагов [Muller et al., 1987; Li et al., 2003]. Этот факт легко объяснить, вспомнив, что обычно ткань опухоли содержит хорошо наблюдаемые под микроскопом лейкоцитарные инфильтраты и отдельные мононуклеарные клетки [Захарова и др., 2003; Goldman et al., 1987; Shiraishi et al., 2006].

В работе S.K. Suvarna и J.A. Royds пролиферативный и метастатический потенциал миксомы на примере девяти опухолей оценивали путём иммуноги-стохимического анализа белков - продуктов генов клеточного цикла, онкогенов и гснов-супрессоров опухолевого роста: nm23, р53, MIB1, PCNA, Rb-1, Bcl-2 [Suvarna & Royds, 1996]. Из всех проанализированных белков устойчивый уровень экспрессии во всех образцах опухоли был показан только для одного белка — пт23, отсутствие которого коррелирует с высоким метастатическим потенциалом опухолей. Неравномерная картина экспрееепи от полного отсутствия до среднего и изредка выше среднего уровня, в отдельных образцах миксомы, зафиксирована для белков, кодируемых MIB1, PCNA, Rb-1, а экспрессия Вс1-2 отмечена лишь в двух случаях. Во всех образцах наблюдалась полное отсутствие экспрессии гена р53 (другие авторы приводят в своей работе тот же результат [Li et al., 2003]). Наличие белкового продукта этого гена в опухоли свидетельствует о высокой степени злокачественности. Аналогичные результаты по экспрессии Ki67 (ядерный белок, взаимодействующий с MIBl), М1В1, PCNA получены другими группами исследователей [Захарова и др., 2003; Kono et al., 2000; Li et al., 2003; Orlandi et al., 2006].

Пристальное внимание было уделено поиску в миксоме сердца протоон-когена c-kit (CD 117, или KIT), гиперэкспресспя которого имеет ключевое значение в развитии злокачественной стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта. Тем не менее, следов CD117 в миксоме обнаружено не было [Acebo et al., 2001; Orlandi et al., 2006].

Недавнее открытие тканеспецпфических транскрипционных факторов, вовлеченных в тканевой морфогенез позволяет лучше понимать процессы, лежащие в основе специфической клеточной дифференцировки и формирования такого сложного органа, как сердце [Srivastava, 2006]. В частности, показано, что кардпобласты формируются в результате последовательной экспрессии Nkx2.5/Csx гена и, возможно, какого-либо пз факторов Hop, Tbxl и FoxHl, а затем образуют мышечные трубки в присутствии MEF2. Группа японских ученых во главе с Н. Kodama провела исследование экспрессии ряда транскрипционных факторов в миксомах сердца человека [Kodama et al., 2002]. Основным методом исследования стал иммуногистохимическпй анализ в сочетании с методами гибридизации in situ, ОТ-Г1ЦР и электронной микроскопии. Предметом исследования явились кардиомиоцит-специфические транскрипционные факторы Nkx2.5/Csx, GATA-4, MEF2 и eHAND. Nkx2.5/Csx необходим для образования камер сердца в ходе органогенеза, GATA-4, MEF2 и eHAND необходимы для закладки и правильного развития миокарда. Иммуногистохимическпй анализ выявил позитивные сигналы для всех исследуемых белков с интенсивностью, варьирующей от слабой до сильной. Выявление экспрессии MEF2 во всех исследованных опухолях, по мнению авторов, свидетельствует о мпогенном пути дифференцировки клеток миксомы. Как показал ОТ-ПЦР анализ, клетки миксомы экспрессировали Nkx2.5/Csx, GATA-4, MEF2 и eHAND также и па уровне мРНК. Однако было выявлено полное отсутствие трапскрипта гена MLC-2v, который появляется на конечных стадиях дифференцировки сердечной мышцы. Такая картина экспрессии транскрипционных факторов, по мнению Н. Kodama и соавторов, свидетельствует о незрелости миксомной ткани и близости её к мезепхпмальпым кардиомиогенным клеткам-предшественникам.

Группой исследователей во главе с Д. Orlandi методом ОТ-ПЦР показано наличие во всех проанализированных мнксомах таких важных факторов кар-диомиогенной дифференцировки, как Sox9 и Notch 1, а в некоторых - SMAD6 и NFATcI, при полном отсутствии ЕгЬВЗ п WT1 [Orlandi et al., 2006]. Эти результаты относительно экспрессии мРНК фактора Sox9 в мпксоме сердца полностью подтвердили данные, полученные ранее в нашей лаборатории тем же методом [Slcamrov et al., 2004].

3.3.2. Белки, вовлечённые в ангиогенез и ремоделирование

В работе Т. Zhang и соавторов, посвященной изучению закономерностей ан-гногенеза в ткани миксомы, ставилась задача выяснить существует ли корреляция между экспрессией моноцитарного хемотактического фактора (МСР-1), тимидин-фосфорилазы (TPh) и параметрами процесса васкуляризации в ткани опухоли [Zhang et al., 2003]. Известно, что МСР-1 может вызывать внутриопухолевую инфильтрацию макрофагами, что в свою очередь стимулирует внутриопухолевый ангиогенез через продукцию факторов апгпогснеза, таких как фактор роста фиб-робластов, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), TPh, фактор некроза опухолей и интерлейкин-8. МСР-1 напрямую индуцирует хемотаксис эндоте-лиоцитов, как это демонстрируется детекцией химокинового рецептора-2 (CCR2), являющегося рецептором для МСР-1. Эти факты предполагают участие МСР-1 в опухолевом ангиогенезе через привлечение макрофагов и прямую хемотактическую стимуляцию эндотелиоцптов. С другой стороны, было показано, что TPh является ангиогенньтм ферментом, идентичным эндотелиалыюму клеточному ростовому фактору тромбоцитарпого происхождения.

Парафиновые срезы, полученные из 17 удалённых миксом сердца были исследованы иммуногистохпмически с целью выявления МСР-1, CCR2, TPh, CD31. CD68. Параллельно вёлся подсчёт мпкрососудов в ткани опухоли, под-счптывалось количество макрофагов и анализировался размер опухоли. Методами иммуногистохимии было обнаружено, что МСР-1 и TPh экспрессируются в клетках, специфических для опухоли, а также в клетках инфильтратов. МСР-1-позитивные инфильтрирующие клетки выявлялись по всей площади среза опухоли. Степень позитивных инфильтрирующих клеток возрастала в областях неоваскуляризации. Распределение CD-68-позитивных клеток практически совпадало с распределением МСР-1-позитивных клеток, что наводит на мысль о преимущественной экспрессии МСР-1 макрофагами. Пять миксом (29,4%) продемонстрировали особо высокий уровень экспрессии МСР-1.

Химокиновый рецептор-2 (CCR2) повышенно экспрессируется в стро-мальных инфильтрирующих клетках во всех мпксомах и иногда в эндотелиаль-ных клетках. Главным источником МСР-1, TPh и CCR2 в строме опухоли, по мнению Т. Zhang и соавторов, оказались макрофаги, поскольку области позитивного окрашивания па указанные антигены совпадали практически во всех миксомах. Результаты статистического обсчёта показали, что повышенное количество МСР-1-позитивных п TPh-позитивных клеток в опухоли коррелирует с повышенным числом микрососудов в ткани опухоли. Исходя из полученных данных, авторы делают вывод, что выявляемые в миксомах сердца МСР-1, TPh и, как было показано ранее, сосудистый эндотелиальный фактор роста являются важными ангиогенными факторами, сопровождающими рост опухоли, особенно на её начальных стадиях [Zhang et al., 2003].

Принципиально важным для протекания ангиогенеза химокииом является упомянутый сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Ранее была отмечена устойчивая способность клеток миксомы синтезировать этот химокин

Kono et al., 2000]. Позднее соответствующие рецепторы этого фактора также были выявлены иммуногистохимпчесюши методами в миксоме, а их функционирование проверено физиологическим тестированием в культуре. На основании этих наблюдений был сделан вывод о способное ги клеток ткапп миксомы к независимому от внешних стимулов процессу ангиогенеза, поддерживаемому системой замкнутой на себя, аутокрипной экспрессии VEGF [Sakamoto et al., 2004а]. В крови пациентки, страдающей повторными рецидивами миксомы сердца, до очередной (шестой по счёту) операции обнаружен двухкратный уровень VEGF по сравнению с усреднённым уровнем в крови здоровых добровольцев [Bennett et al., 2001]. После операции уровень снизился до нижних показателей в диапазоне нормальных значений.

Системе внутри тканевого ремоделировапия в миксоме сердца уделено особое внимание в исследовании группы специалистов из Италии [Orlandi et al., 2005]. Методами иммуногистохимии, иммуноблоттинга, ОТ-ПЦР, зимографпи в геле и in situ была изучена экспрессия металлопротеииаз ММР-1, ММР-2, ММР-3, ММР-9, МТ1-ММР п их естественных тканевых ингибиторов TIMP-2 и TIMP-4 в серии образцов миксом сердца, образовывавших до хирургической резекции эм-болы и ие образовывавших. По результатам сделан вывод - в миксомах, предрасположенных к эмболпзации, повышена экспрессия ММР-2, ММР-9, МТ1-ММР и TIMP-2, а экспрессия TIMP-4 вообще в миксомс отсутствует.

В более поздней работе этой же группы с помощью ОТ-ПЦР документирована экспрессия ингибитора металлопротеииаз TIMP-1 во всех образцах серии мпксом сердца [Orlandi et al., 2006], что подтверждает такие же данные для TIMP-1, полученные ранее в пашей лаборатории [Skamrov et al., 2004].

3.3.3. Белки, специфичные для эндотелия

В 80-90-х годах XX века были проведены исследования по выявлению эп-дотелиальных маркёров в ткани миксомы сердца. В нескольких работах было документировано наличие CD31, CD34, факторов Villa и ХШа системы свёртывания крови, тромбомодулина, а также эндотелиального углеводого антигена первого типа, родственного антигену морского ежа, Ulex europaeus (UEA-1)

Boxer, 1984; Goldman et al., 1987; Muller at al., 1987; Tanimura et al, L988; Cursehellas el al., 199L; Krikler et al., 1992; Iwa & Yutani, L993; Deshpande et al., 1996; Berrutti & Silverman, 1996; Farrell et al., 1996; Pucci et al., 2000; Kono et al., 2000; Acebo et al., 2001; Orlandi et al., 2006]. Первые публикации об обнаружении фактора Villa в ткани миксомы относятся к 1981 году [Morales et al., 1981], а UEA-1 к 1986 году [Landon, 1986]. Позже появлялись сведеппя и об остальных эндотелиальных маркёрах. За многолетний срок изучения экспрессии этих антигенов накопились данные с большим разбросом - от отсутствия какого-либо ИГХ сигнала до регистрации его высокого уровня [Рогов, 2003]. В большинстве наблюдений отмечалась разнородность распределения маркёров между клетками эндотелиалыюй выстилки лаку и и клетками стромы опухоли: внутренние клетки были иммунопозитивны по антигенам CD34, фактору Villa, а клетки стромы и слоистых стенок лакун — по антигенам CD31, фактору ХШа. Напротив, тромбо-модулин и UEA-1 примерно равномерно распределены в ткапп опухоли.

Группой авторов из института сердечно-сосудистой хирургии АМН Ук-раппы на обширном анатомическом материале миксомы сердца был проведён подробный иммуногистохнмический анализ экспрессии ряда белков. Среди них особое внимание было у/<елено CD31, CD34, CD 143 и виментину. По мнению авторов, одновременное выявление четырёх белков в опухоли сердца позволяло определить её как миксому, а на основе наличия или отсутствия CD143 позитивных клеток на поверхности миксомы был сделан вывод о разной природе и происхождении опухолевых клеток покровного слоя разных типов миксомы [Захарова и др., 2003].

Учитывая желеобразную консистенцию миксомы, становится понятным интерес исследователей к содержанию в опухоли таких секре тируемых белков слизистых оболочек, как муцины. В работе Р.Н. Chu и соавторов показана выраженная экспрессия белков муцинового семейства - MUC1, MUC2 и MUC5AC [Chu et al., 2004] в миксомах сердца.

3.3.4. Белки сократимых тканей, компоненты цитоскелета, цитокератины

Особое положение занимают миксомы, содержащие r своём составе железистый компонент, и составляющие, напомним, до 3% от общего числа случаев. Клетки, прошедшпе в составе опухоли путь дифференцировки до железистого эпителия, содержат широкий спектр характерных иммуногпстохимиче-ских маркёров, включая раковоэмбриональный антиген (СЕА), эпителиальный мембранный антиген, разнообразные цитокератины (СК7, СК20, Cam 5.2), р53 и другие, по это, ещё раз отметим, - исключение [Goldman et al., 1987; Johansson, 1989; Krikler et al., 1992; Deshpande et al., 1996; Pucci et al., 2003; Den Bakker et al., 2005]. В силу необычного для большинства миксом набора ИГХ-маркёров в опухолях с железистым компонентом, особую трудность представляет онкотипирование эмболов, происходящих от миксом с железистым компонентом [Moiyadi et al., 2007].

Противоречивые сведеппя представлены в литературе по выявлению ци-тоскелетных белков виментина и дссмина, сократительного белка — гладкомы-шечного актина, белка мышечной ткани — миоглобина. Некоторые авторы сообщали о выявлении этих маркёров в тканях части проанализированных опухолей, а другие - об отсутствии [Boxer, 1984; Curschellas et al., 1991; Krikler et al., 1992; Kanda et al., 1994; Pucci et al., 2000; Acebo et al., 2001; Orlandi et al., 2006]. В последнее время преобладает мнение, что виментин равномерно распределён в миксомах сердца, гладкомышечный актин выявляется фокально, а десмин в ткани среднестатистической миксомы сердца, не содержащей железистых клеток, в больших количествах не экспрессируется. В таких миксомах также пет экспрессии цитокератинов и раковоэмбрионального антигена [Захарова и др., 2003; Johansson et al., 1989; Orlandi et al., 2006].

3.3.5. Нейроспецифические белки

В 1992 году с небольшим перерывом появились сообщения двух разных групп английских исследователей, в которых сообщалось об обнаружении нейроэндокринных маркёров в мпксомах сердца. Если в работе J. Nolan сообщалось об обнаружении в единичном образце миксомы сердца белкового продукта гена 9.5 (PGP 9.5), нейрон-специфической енолазы (NSE) в сочетании с уже известными, характерными для миксомы, белками — виментином и фактором свёртываппя Villa [Nolan et al., 1992]. To в работе D.M. Krikler и соавторов на серии образцов миксом сердца из 24 штук линия маркёров нервной ткани была расширена с добавлением синаптофизина и белка S-100, а в качестве известных маркёров миксомы были использованы гладкомышечнын а-актнн и опять же фактор свёртывания Villa [Krikler et al., 1992]. В этой работе сообщалось об иммуногистохимическом выявлении PGP 9.5 в 18 случаях (75%), S-100 - 16 (67%), NSE - 12 (50%>), причём в этих 50% случаев одновременно выявлялись все три белка: PGP 9.5, S-100, NSE. Среди этой группы, составляющей половину от общего числа, в 7 образцах миксомы (29% or общего количества) был обнаружен синаптофизин. В результате авторы высказывали предположение о нейрогенном происхождении миксомы сердца и возможном синтезе клетками миксомы биоактивных пептидов.

Позже эти данные перепроверялись многими группами. Белок S-100 и фермент NSE регистрировались не однозначно: от выявления единичных случаев [Kanda et al., 1994; Acebo et al., 2001], выявления примерно в половине образцов [Curschellas et al., 1991; Deshpande et al., 1996], до выявления в большинстве образцов [Berrutti & Silverman, 1996; Pucci et al., 2000].

A. Pucci с соавторами воспроизвели иммуногистохпмическпй анализ трёх белков PGP 9.5, S-100, NSE па серии из 53 образцов миксомы сердца [Pucci et al., 2000]. В итоге PGP 9.5 - 50 случаев (94%,), S-100 - 47 (89%), NSE - 30 (57%), что практически подтверждает предыдущий результат англичан. Вновь высказывается мнение о нейрогенном пути дифференцировки клеток стромы миксомы. Но ни слова не сказано о синаптофизине, а позже констатируется, что в миксомах с железистым компонентом этот белок отсутствует [Pucci et al., 2003]. Не удалось выявить в миксомах и другие пейроэндокринные белки: хро-могранин А, хромогранин В, - и секреторные пептиды: предсердный натрийуретический пептид, кальцитонин-ген-связаиный пептид, вазоактивный кишечный пептид [Pucci el al., 2000]. Ранее хромогранин А и кислый фибриллярный глиальный белок не удалось обнаружить Е. Curschellas и соавторам ни в одной миксоме из 11 проанализированных [Curschellas et al., 1991].

В целом, гипотеза нейрогенного происхождения к 2000 году выглядела не очень целостно и убедительно, но к этому моменту дошла очередь до проверки экспрессии в миксоме сердца нейроспецифического белка кальретинина (каль-байдин-2). Здесь исследователи получили картину практически стопроцентной экспрессии белка во всех проанализированных мнксомах сердца [Terracciano et al., 2000; Accbo et al., 2001; Li et al., 2003], что стало доводом в поддержку нейрогенного происхождения опухоли из элементов кардиальпой субэндотелпаль-ной сенсорной нервной системы. Надо заметить, что в недавней работе А. Orlandi и соавторов пммуногистохимическим методом кальретинпн был выявлен в 26 случаях (86,7%) пз 30, а методом ОТ-ПЦР в 8 случаях из 8 (100%) [Orlandi et al., 2006]. В нашей работе кальретинии тоже выявлялся с помощью ОТ-ПЦР в 100% проанализированных случаев (4 образца) [Skamrov et al., 2004].

В норме кальретинии, принадлежащий к семейству белков, содержащих EF-петлевой захват для связывания йонов кальция, синтезируется клетками нервной системы, гландулоци тами и клетками Сертоли семенников, эпителием яичников, лаброцитами соединительной ткани, а также встречается в таких опухолях, как невринома, злокачественная мезотелнома, амелобласгома, не-оплазии матки и других [Doglioni et al., 1996; Leers et al., 1998; Fine et al., 2004; Alaeddini et al., 2008].

3.3.6. Иммуногистохимические маркёры, отличающие миксому от других опухолей сердца

Помимо представленности практически во всех миксомах, кальретинии в работе L.M. Terracciano и соавторов оказался белковым маркёром, относительно специфичным именно для миксомы сердца, то есть пе был выявлен в папиллярной фиброэластоме и миксоме челюстного сустава, с которыми проводилось сравнение [Terracciano et al., 2000].

Важным оказалось обнаружение кальретинина в эмболах миксомы сердца, извлечённых из церебральных, коронарных и почечных артерий. Это позволило авторам рекомендовать кальретишш в качестве ИГХ-маркёра в случае затруднения в выборе правильного диагноза между организованным кровяным тромбоэмболом и эмболом мпксомы сердца [Terracciano et al., 2000]. Рекомендация была реализована па практике при уточнении источника эмболизации конечностей трёх пациентов [Val-Bernal, ct al., 2003]. В одном случае произошла тромбоэмболия, а в двух других эмболизацпя фрагментами миксомы сердца.

Другим ИГХ-маркёром, активно используемым сейчас для уточнения диагноза миксома сердца, является пнтерлейкип-6 [Mochizuki et al., 1998; Shiraishi et al., 2006]. Вместе с кальретипипом эти белкп составляют пару ИГХ-маркёров, которую рекомендуют для подтверждения диагноза «мпксома сердца» [Kuon et al., 2004]. При этом необходимо не забывать, что существуют опухоли, например неоплазии матки, экспрессирующие эти белки, что при наличии метастазов в сердце и неясности с установлением первичного очага роста новообразования может усложнять диагностику.

В другом варианте решения задачи диагностического выбора типа эмбола между тромбом и миксомой, в качестве дополнительных дифференциальных ИГХ-маркёров использовались виментин и гладкомышечнып а-актин при регистрации отрицательного иммунофенотипа по кальретинину [Dogan et al., 2007]. В результате в полости левого предсердия был диагностирован организованный кровяной тромб с высокой степенью миксоматозного перерождения стромы, явившийся источником эмболизации левой нижней конечности.

А в случае тонкоигольной биопсии внутриполостной опухоли сердца, когда для уточнения диагноза был применён ИГХ-анализ биоптата на UEA-1 антиген, специалисты по иммуногистохимии рекомендовали авторам работы в будущем применять описанное в миксоме сердца сочетание маркерных белков CD31, CD34 и фактора свёртываемости крови XHIa [Layfield et al., 1996; Silverman et al., 1996].

Украинские специалисты рекомендуют для установления принадлежности опухоли к микомам сердца использовать сочетание ИГХ-маркёров: вимен-тина, CD31, CD34, CD 143 [Захарова и др., 2003].

3.3.7. Гипотезы возникновения и развития миксомы сердца как индивидуального заболевания (этиопатогенез)

Выявляемые иммуногистохимическими и другими методами белковые маркёры явились в сочетании с другими данными практических наблюдении основанием для построения нескольких гипотез возникновения и развития (опухолевого гистогенеза) миксомы сердца человека.

Исторически первой была гипотеза происхождения миксом сердца из организованных внутрисердечных тромбов, прошедших стадию миксоматозного перерождения [Salyer et al., 1975]. В своё время проводились эксперименты па собаках для проверки развития тромбов в полости сердца и их возможного перерождения в миксому [Syrabas et al., 1976]. Гипотеза не выдержала проверки обнаруженными экспериментальными данными и в настоящее время представляет скорее исторический интерес, хотя ещё не так давно упоминалась в статьях [Bcrrutti & Silverman, 1996; Layfield et al., 1996; Oguz et al., 2001].

Согласно другой точки зрения миксомы сердца происходят от сохранившихся в сердце со времени внутриутробного развития эмбриональных зачатков, то есть являются тератомами или гамартомами. На эту мысль наводят исследователей электронномикроскопические и другие морфологические данные, и, в дополнение, факт обнаружения в части опухолей железистых структур, которые трактуются как возможные остатки фрагментов первичной кишечной трубки, попавшие в сердце в ходе индивидуального органогенеза [Рогов и др., 2003; Pucci et al., 2003; Den Baklcer et al., 2005]. В то же время, в качестве доказательств ограниченности данной гипотезы приводятся данные об отсутствии в миксомах следов развития эмбриональных зачатков другой природы, помимо железистой, кроветворной или остеогениой.

Согласно превалирующей в настоящее время точке зрения на гистогенез миксомы считается, что опухоль развивается из находящихся в субэндотелиальном слое сердца взрослого человека полипотентных мезеихимальпых клеток, развивающихся в опухоли в самых разных направлениях, но не доходящих до конечных стадий дифферепцировки. 'Гак, например, при рассмотрении эндо-телпальных маркёров говорится о развитии в направлении эндотелиальной ветви дифференцировки [Захарова и др., 2003; Farrell et al., 1996; Acebo et al., 2001; Sakamoto et al., 2004b; Chu et al., 2004], маркёров сократимых тканей — о мио-генной линии дифференцировки [Kodama et al., 2002], нейроспецифических маркёров - о нейрогенноп [Terracciano et al., 2000; Pucci et al., 2000]. При выявлении в ткани опухоли, наряду с эндотелнальными маркёрами, фактора свёртываемости XHIa, характерного для дендроцитов и депдрофагов, даже высказывалась точка зрения о взаимосвязанном развитии клеток опухоли в направлении эндотелиального и макрофагального ростков [Bcrrutti & Silverman, 1996].

Существуют и серьёзные возражения против окончательного принятия какой-либо теории (гипотезы) развития миксомы сердца как полностью доказанной. Прослеживается неоднозначность определения маркёров различной гистогенетической принадлежности разными группами исследователей: от выявления много и по всему объёму ткани опухоли (высокопредставленный маркёр с высокой чувствительностью), до умеренного и слабого мозаичного выявления в части образцов (низкопредставлснный маркёр с низкой чувствительностью). Часто список маркёров определённой тканевой принадлежности остаётся весьма узким. В качестве примера можно вспомнить многолетние и в основном тщетные усилия по поиску большого списка непроспсцифических маркёров.

Подытоживая, согласно преобладающей в настоящий момент точке зрения, по современной международной классификации онколологических заболеваний, которой является «Международная Классификация Болезней - Онкология - версия 3» (ICD-0-3), миксома отнесена к опухолям мезенхимального происхождения [Berman, 2004].

Остаётся дискуссионным вопрос о том, что является первопричиной развития миксомы в полости сердца. По мнению Y. Li и соавторов таковой причиной может быть герпес-вирусная инфекция эндокарда и субэндокарда. Следы присутствия вируса HSV-1 они обнаружили пммупогпстохимическими методами в большом количестве проанализированных мнксом сердца (в 12 из 17), хотя приведённые данные по выявлению вирусной Д11К с помощью ПЦР выглядели не совсем убедительно [Li et al., 2003].

Ещё в 1992 году высказывалась мысль, что миксома может быть реакцией субэндотелиальных клеток сердца на гравмагичыое вмешательство во время хирургической операции. В сообщении J. Nolan и соавторов говорилось о пунк-тировании мсжпрсдссрдной перегородки в области овальной ямки (проводилась эндоскопическая баллонная днлятация отверстия митрального клапана) и обнаружении в этом месте через 13 месяцев миксомы сердца во время эхокар-диографического обследования [Nolan et al., 1992]. В литературе можно найти и другие сообщения об обнаружении миксом после проведённых хирургических вмешательств па сердце [Roudaul et al., 1987; Marinissen et al., 1987; Pillai et al., 2005; Karlof et al. 2006], поэюму версия развития опухоли как реакции организма на травму выдвигалась специалистами [Nolan et al., 1992; Suvarna & Royds, 1996]. Вероятно, развитие опухоли должно рассматриваться не просто как реактивный воспалительный процесс в ответ на травму, а как возникновение вследствие травмы клетки или группы клеток - источника последующего опухолевого процесса.

Является ли появление миксомы в полости сердца через некоторое время после кардиохирургической операции случайным совпадением, возможным упущением во время первой операции (возможность такого развития событий обсуждается V.D. Kollias и соавторами [Kollias et al, 2004]) или систематическим следствием, видимо, должно стать предметом отдельного исследования.

3.4. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ

К ПОИСКУ НОВЫХ ТКАНЕВЫХ ОПУХОЛЕВЫХ МАРКЁРОВ

В ОНКОЛОГИИ

3.4.1. Выявление следов исходной тканеспецифической дифференцировки клеток опухоли

Развитие иммунологических методов исследования и, в частности, гибрп-домной технологии в 60 - 70-х годах прошлого века позволило существенно продвинуться в изучении антигенного фенотипа солидных новообразований человека. Появилась возможность классифицировать антигены, экспрессируемые опухолевыми клетками. Для этого использовались обширные панели из поликлональ-ных и моноклопальных антител к тканеспецифическим и цитоспецифическим антигенам, белковым продуктам внутриклеточных онкогенов, компонентам внеклеточного матрикса. По мнению К.М. Пожарисского точный и своевременный им-муногистохнмпческий анализ имеет определяющее значение для установления правильного диагноза, определения прогноза течения и химпотерапевтической тактики в лечении онкологических больных [Пожарисский и Леенман, 2000; Петров и Райхлин, 2004].

На протяжении многолетних исследований находили и отрабатывали оптимальные условия применения схем иммуногистохимического анализа на образцах тканей с целью дифференциальной гистогенетической диагностики опухолей человека. Так Р.Т. Райхлин и С.В. Петров в своих работах [Райхлин и Петров, 1997; Петров и др., 1998; Петров и Райхлин, 2004] приводят описание, отработанной ими на основе собственной многолетней практической деятельности и литературных данных, поэтапной схемы типирования злокачественных новообразований путём выяснения их тканевого происхождения и дальнейшего уточнения цитоспецифических и оргапоспецифическпх иммуногистохимиче-екпх признаков опухоли. Полное определение типа опухоли может включать до трёх этапов проведения иммуногистохимического выявления одного или нескольких антигенов в ткани опухоли на каждом этапе.

Возможно также одномоментное применение с самого начала максимально широкой панели антител [Петров и Райхлин, 2004; Leers et al., 1998; Hayato et al., 2006], но в этом случае идёг непродуктивная растрата большого количества антител на отсутствующие в опухоли антигены при некоторой экономии времени. При последовательной поэтапной схеме экономнее расходуются антитела, но трудозатраты и временные затраты вышеВ качестве примера и наиболее хорошо изученного объекта иммупоги-стохпмических исследований можно сослаться на группу опухолевых заболеваний предстательной железы. Наряду с гистологическими методами исследования биоптатов простаты, давно применяется иммуногистохимиче-ский анализ на наличие простатспецифического антигена (ПСА). Большинство опухолевых клеток рака простаты зкспрессируют ПСА. Иммуногисго-химическое выявление ПСА в метастазах рака предстательной железы позволяет определить их природу. Очень важно, что п в крови больных раком простаты повышается уровень ПСА. Обязательный профилактический тест на ежегодное определение уровня ПСА в крови .мужчин старше порогового возраста 50 лет рекомендован в системе здравоохранения США [Бабиченко и др., 2003; Петров и Райхлин, 2004; Пожарисский и др., 2005; Uhlen et al., 2005; American cancer society, 2007].

Современным методическим подходом в поиске иммуногистохимиче-ских маркёров новообразований является скрининг панелей антител с использованием стёкол, содержащих наборы срезов разнообразных опухолей, которые получили название матриц тканевых срезов. Количество срезов микроскопического размера (до 2 мм в диаметре, после тоикоигольной биопсии), расположенных на одном стекле может достигать 500 - 1000 штук, что делает процедуру скрининга экономной и высокопроизводительной [Kononen et al., 1998; Kallioniemi et al., 2001; Uhlcn et al. 2005].

3.4.2. Изучение белкового состава опухолевой ткани (молекулярного фенотппа)

В последнее время бурно развиваются методы анализа белкового состава тканей и клеток в норме и при патологии. Данное направление научных исследований получило обобщённое наименование «протеомика», происходящего от понятия «протеом». Под «протеомом» понимают совокупность всех белков, присутствующих в ткани, клетках или каких-либо других изучаемых объектах [Wittmann-Liebold el al., 2006].

Центральным звеном в наиболее распространённых вариантах протеом-ного анализа является получение геля, содержащего белки после двухмерного электрофореза. Белки распределяются в виде пятен, составляющих характерную для изучаемого объекта картину в плоскости геля, то есть в двухмерной системе координат. При сравнении таких картин выявляю г белковые пятна, характеризующие изучаемый объект или отличающие его от других в серии сопоставляемых объектов. На следующем этапе производится идентификация выявленных белковых пятен при помощи какого-либо варианта масс-спектроскопического анализа или частичного белкового секвснирования [Celis & Gromov, 2003; Rifai et al., 2006].

Полученная таким образом картина отличий тканей по белкам может применяться для решения широкого круга исследовательских и диагностических задач, таких как вопросы развития и дифференцировки клеток, индивидуальный эмбриогенез и поетиатальное развитие, возникновение и развитие онкологических и нейродегенеративпых заболеваний и так далее [Wittmann-Liebold et al., 2006; Rifai et al., 2006; Goldknopf, 2008].

3.4.3. Применение методов так называемой «обратной генетики»

3.4.3.1. Технологии скрининга библиотек комплиментарной ДНК, дифференциального дисплея, вычитательной гибридизации с супрессией амплификации

Вышеописанные методы поиска белков, являющихся маркёрами, или отличительными признаками каких-либо опухолевых заболеваний относятся к так называемой группе «прямых» методов поиска. Такими методами изучается непосредственно сам белковый состав ткани опухоли. Методами так называемой «обратной генетики» выявляются отличительные черты опухоли на уровне нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Уже после выявления таких характерных нуклеотидных последовательностей задаются вопросом о том, что они кодируют и каково их функциональное проявление. Принципы подхода «обратной генетики» были обобщены в статье S.H. Orkin в 1986 году [Orkin, 1986].

В рамках онкологических исследований изначально создавались библиотеки комплиментарной ДНК на основе матричной РЫК из разных опухолей. Все клонированные последовательности в библиотеках кДНК из разных опухолей подвергали секвенированию и прямому сравнению друг с другом. Находили характерные отличительные последовательности для каждой опухоли и, как правило, устанавливали закодированные этими последовательностями белки. Этот подход получил название метода последовательного анализа генетической экспрессии [Velculescu et al., 1995; Boon et al., 2002].

Другими методами на полиакриламидном геле выборочно выявлялись некоторые экспрессирующнеся последовательности из всей совокупности матричной РНК в каждой изучаемой опухоли. Выявленные характерные РНК, представляющие интерес, подвергали дальнейшему угл\ блёпному изучению. В зависимости от конкретных деталей и особенностей эти методы получили названия: сравнения транскрипционных паттернов [Chcnchik et al., 1993а; Chenchik et al., 1993b], метод репрезентативного дифференциального анализа [Lisitsyn & Wigler, 1993], метод дифференциального дисплея [Liang & Pardee, 1992; Liang et al., 1993; Bai ct al., 2007].

Особенностью метода вычитательной гибридизации с супрессией амплификации является создание библиотеки кДНК, обогащённой путём специальных приёмов уникальными, малопредставленными последовательностями мРНК. Именно в этой субфракции мРНК содержится больше последовательностей, интересующих исследователей, а их доступность в результате применения метода существенно повышается [Лукьянов и др., 1994; Gurskaya et al., 1996; Diatchenko et al., 1996; Lukyanov et al., 1997; Bangui- et al. 2002].

Перечисленными методами были выявлены молекулярные и ИГХ-маркёры для следующих опухолей: ген маммаглобпна 1 для рака молочной железы [Watson & Fleming, 1994; Watson & Fleming, 1996; Fleming & Watson, 2000], новые маркёры для опухолей простаты [Bai et al., 2007], маркёры карциномы мочевого пузыря [Wang et al., 2006] и карциномы лёгких [Bangur et al., 2002]. Список можно было бы продолжать практически до бесконечности, поскольку поток сообщений по этой тематике идёт безостановочно.

3.4.3.2. Различные варианты применения ДНК-содержащнх матриц (транскрипционные матрицы, ДНК-чипы)

В результате успешной реализации проектов по полному секвенирова-нию геномов самых разнообразных живых организмов и, в первую очередь, человека появилась прппцпппальпая возможность создания технологии «ДПК-чппов», которые всё шире применяются в фундаментальных и прикладных медицинских исследованиях, включая изучение опухолей [Ramaswamy & Golub, 2002; Macoska, 2002]. ДНК-чип представляет собой фрагмент твёрдой подложки, на который последовательно нанесены в виде точек закреплённые препараты, содержащие одинаковые, уникальные по последовательности фрагменты ДНК [Duggan et al., 1999; Cole et al., 1999]. В качестве фрагментов ДНК могут быть использованы олигонуклеотиды, соответствующие, в идеале, всем отсеквенированным последовательностям генома, а могут быть использованы фрагменты клонированной кДНК, наработанные в лабораторных условиях в больших количествах при помощи по-лимеразной цепной реакции. В первом случае речь идёт об олигонуклео-тидных ДНК-чипах, а во втором - о транскрипционных матрицах (кДНК матрицах). Для олигонуклеотидов в качестве подложки обычно используется специально обработанное стекло, а для фрагментов кДНК — специальный синтетический материал па основе пластика или нейлона [Duggan et al.,

1999; Macoska, 2002]. На рынке бномедицннскпх препаратов доступны самые разные варианты ДНК-чипов, а в литературе имеются разнообразные описания их самостоятельного изготовления в лабораторных условиях. Использование, а тем более изготовление, ДНК-чипов в исследовательской практике предполагает наличие сложной, роботизированной аппаратуры, а также высококвалифицированного персонала [Yang et al., 1999; Mali et al., 2004].

Применение технологии экспрессионного анализа заключается в выявлении максимально большого количества РНК и, следовательно, генов (в идеальном случае — всех, но особый интерес представляют функционально значимые и выделяющиеся), которые экспресснруются в изучаемой опухоли. Для этого на основе выделенной из образца РНК получают меченную кДНК (используется флуоресцентная или радиоактивная метка [Yang et al., 1999; Wellmann et al., 2000]) и проводят гибридизацию с ДНК на ДНК-чипе. По выявленным гибри-дизационным сигналам идентифицируют экспрессирующисся в опухоли гены, а по интенсивности гибридизационного сигнала оценивают уровень экспрессии каждого гена [Ramaswamy & Golub, 2002; Macoska, 2002].

В качестве дальнейших методов анализа генов, изменяющих свою экспрессию по результатам гибридизации па ДНК-чипах, обычно используются такие методы исследования РНК, как разные модификации количественной по-лимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, Нозерн-блоттинг анализа и другие [Sallinen et al., 2000; Ding et al., 2007]. Экспрессия па уровне белковых продуктов генов исследуется при помощи иммуноблогпшга и других методов выявления белка антителами [Moch et al., 1999; Wellmann et al., 2000; Ramnarain et al., 2006]. Физиологические эффекты выявленных изменений экспрессии генов проверяются на природных или искусственно созданных живых объектах, таких как культуры клеток и тканей (в том числе трансфецированные рекомбинантными плазмидамп), линии мутантпых живых организмов, трансгенные животные и так далее [Yang et al., 1999; Ramnarain et al., 2006].

Постоянно пополняющийся список обьектов онкологических исследований, изучаемых при помощи ДНК-чип технологии, включает в себя такие заболевания, как глиома нервной ткани [Sallinen et al., 2000; Ramnarain et al., 2006], неоплазии клеток крови [Wellmann et al., 2000], рак молочной железы [Yang et al., 1999], рак почки [Moch et al., 1999], рак мочевого пузыря [Modlich et al., 2004] и другие.

Если перед исследователями стоит задача наиболее полной характеристики экспрессии генов в изучаемой опухоли, то тогда параллельно пли последовательно применяется несколько методов анализа дифференциально экспресси-рующихся генов с целью максимального выявления всех потенциально значимых [Yang et al., 1999, Sallinen et al., 2000; Bangur et al., 2002]. Даже применение разных по принципу изготовления ДНК-чпгюв к изучению одних и тех же объектов даёт в итоге сильно отличающиеся наборы выявленных генов, поэтому для достоверности результата необходимо подтверждать его максимально доступным числом методов [Modlich et al., 2004; Mah et al., 2004].

3.5. ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОНКОМАРКЁРОВ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

3.5.1. Установление типа удалённой опухоли, планирование и прогноз применяемой терапии

Установление точного, достоверного диагноза в максимально короткие сроки имеет определяющее значение для успешного лечения пациентов, в том числе и страдающих онкозаболеваниями. Наряду с морфогистологическпм подходом в онкодиагностике, успешно применяемым в качестве «золотого стандарта» уже не один век, иммуногпсгохпмические методы прочно вошли в рутинную практику пагологоанатомических лабораторий. В настоящее время происходит процесс активного внедрения молекулярнобиологичсских технологий. Среди молекулярнобиологичсских методов, которые всё шире внедряются в качестве методов повседневных исследований, можно упомянуть разные варианты полимеразной цепной реакции, технологии блоттппг-анализов, ДНКчип технологии. Эги технологии позволяют находить и применять в повседневной диагностике новые специфические, информативные ИГХ-маркёры, разрабатывать новые экономичные и рациональные алгоритмы применения антител для выявления ИГХ-маркёров и установления диагноза. Одним из заметных достижений стало обнаружение методами «обратной генетики» нового высокоспецифичного и высокоэкспрессирующегося ИГХ-маркёра злокачественной опухоли простаты - а-метилацил-коэнзим А рацемазы, что было положительно отмечено отечественными и зарубежными специалистами [Пожарисский и др., 2005; Merseburger et al., 2006; Pollack, 2007]. Новые алгоритмы в диагностике предлагаются после установления соответствия между морфологическими характеристиками и молекулярными маркёрами, например, неоплазий крови и неоплазий простаты [Jaffe et al., 1999; Cole et al., 1999; Singh et al., 2002].

В удачном случае можно перейти от выявления ИГХ-маркёра на срезах к его поиску в биологических жидкостях организма, в частности, в крови. В этом конкретном случае речь идёт о поиске в крови пациентов серологического маркёра. Таким образом, исследователи проходят путь от послеоперационной диагностики по материалу удалённой опухоли к дооперацпонной по серологическому анализу. Примером может служить упоминавшийся ранее белок маммаг-лобин 1, определяемый не только как иммуногистохимический, но и как серологический маркёр при неоплазии молочной железы [Zehentner et al., 2004; Bernstein et al., 2005].

По результатам ДНК-чип анализа экспрессии генов разрабатываются подходы для оптимизации выбора лекарств в курсе химиотерапии, а также с целыо прогнозировать результаты лечения и исход заболевания [Modlich et al., 2004; Minna et al., 2007].

3.5.2. Установление источника опухолевых эмболов

Важное направление в онкодиагностпке - это диагностика рака с неустановленным первичным очагом [Савёлов и др., 2006; Dennis et al., 2002]. Ставится задача по установлению природы опухоли и выяснению её тканевого происхождения при обнаружении только очагов метастатического роста. ДНК-чип технологии применялись к решепшо этой задачи путём сопоставления картины экспрессии генов и тканевого происхождения разных опухолей, а также изучения ранее найденных и охарактеризованных пар опухоль - очаг метастатического роста. По выявленным закономерностям в картине экспрессии генов с высокой степенью достоверности (что достигается применением методов математического биоинформационного анализа) предполагается установление ткани - источника опухоли [Ramaswamy et al., 2001; Dennis et al., 2005].

3.6. НЕОБХОДИМОСТЬ ПОИСКА ИНФОРМАТИВНОГО ОНКОМАРКЁРА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ МИКСОМЫ СЕРДЦА

Как отмечалось в статье ведущих специалистов по вопросам патолого-анатомической диагностики опухолей сердца A. Burke и др. [Burke et al., 1996], поскольку в абсолютном большинстве случаев (до 90%) [Нечаенко и др., 1994; Петровский и др., 1997; Roberts, 1997; Perchinsky et al., 1997] в качестве первичных опухолей сердца встречаются миксомы сердца, то у специалистов, проводящих диагностику по материалу удалённой опухоли, существует стойкое предубеждение, что диагностируемой опухолью должна оказаться миксома. Поэтому в случае затруднений или сомнений в определении типа опухоли, патологоанатом склонен остановиться на диагнозе «миксома сердца». Авторы сообщения предупреждают об опасности вынесения такого ошибочного решения и обращают внимание па характерные гистологические особенности строения миксомы сердца, однозначно отличающие её от всех других первичных опухолей сердца.

Поскольку существуют случаи опухолей с атипичной микроскопической структурой и с различными морфологическими вариантами осложнений, появляющимися в ходе развития опухоли, то нередко встречаются затруднительные ситуации из-за взаимной путаницы в выставляемом диагнозе типа опухоли (а также в диагностическом выборе между опухолью и организованным кровяным тромбом) [Hishitani et al., 2001; Hesse et al., 2006; Dogan et al., 2007; Milicic ct al.,

2007]. Для принятия правильного диагностического решения именно в таких случаях необходимо иметь средства однозначной идентификации типа удалённого внутрпссрдечного образования. Необходимо проводить поиск молекулярных и пммуногистохимических онкомаркёров мпксомы сердца человека (как наиболее распространённой первичной опухолп сердца), которые могут быть применены в ходе послеоперационного патологоанатомического исследования для подтверждения диагноза «миксома сердца» в затруднительных случаях. Поиск аналогичных маркёров для других типов опухолей сердца представляется гораздо более сложной задачей, несмотря па её актуальность, из-за меньшей примерно в 10 раз встречаемости других типов первичных опухолей сердца. Таким образом, целью исследования стал попек онкомаркёров или, как минимум, одного информативного онкомаркёра мпксомы сердца человека.

В литературе в 2004 году высказывалось мнение, что до сих пор нет тканевого онкомаркёра, однозначно определяющего мпксому сердца, что затрудняет диагностику [Chu et al., 2004]. В то же время группой авторов в качестве такого ИГХ-маркёра в 2000 году был предложен кальретинин, который применялся как для диагностики самих миксом сердца, так и для решения задач выбора правильного диагноза между «миксома» и «тромб» для обнаруженных в конечностях тканевых эмболов [Terracciano et al., 2000; Acebo et al., 2001; Val-Bernal, et al., 2003]. Однако обращает на себя внимание фокальный характер экспрессии кальретинина при его иммуногистохимическом выявлении в ткани опухоли и не абсолютная, хотя очень высокая (до 87% по последним данным, а не 100%) по более ранним), встречаемость в образцах миксомы сердца [Terracciano et al., 2000; Orlandi et al., 2006]. По данным исследователей из нашей лаборатории, изложенным в статье [Skamrov et al., 2004], кальретинин экс-прессируется на низком уровне. Это свидетельствует о возможных проблемах в идентификации его методами иммуногистохимии, при применении которых низкоэкспресспрующиеся и/или фокально экспрессирующиеся белки могут остаться невыявленпыми в силу недостаточной чувствительности метода. То же самое можно сформулировать применительно к экспрессии в миксомах сердца

ИЛ-6, который иногда удавалось выявить не во всех образцах опухолей, а лишь в 75-80% изученных миксом сердца [Kanda et al., 1994; Acebo et al., 2003].

Что касается рекомендации использовать сочетание ИГХ-маркёров - вименти-на, CD31, CD34, CD143 [Захарова и др., 2003], - для установления принадлежности опухоли к микомам сердца, то необходимо учитывать, что помимо трудоёмкости такого ИГХ-анализа CD 143 определяется только в сильно ограниченном числе клеток и не во всех типах миксом сердца, а остальные три белка можно выявить на высоком уровне практически в любой богато васкуляризированной ткани, что свидетельствует об отсутствии необходимой опухолеспецифичности.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1. МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Использовали глицерин, додецилсульфат натрия (SDS), формальдегид, поверхностно-активное вещество «Tween 20ш», Трис TRIZMA Base™, Трис Sigma 7-9™, персульфат аммония, 3,3'-диаминобензидинтетрахлорид, (3-меркаптоэтапол, фикол, поливииилпирролидои, суммарная дрожжевая РНК, ДНК из молок сельди, леупептин, фенилметанеульфонилфлуорид (PMSF), лизоцим, соевый ингибитор трипсина, карбоангидраза, овальбумин, Р-галактозидаза производства фирмы «Sigma», США. Этилендиаминтетра-ацетат (ЭДТА), гндрофосфаг натрия, дигидрофосфат натрия, формамид, гли-оксаль, пирофосфорная кислота, гепарин, димстилсульфоксид, дитиотреитол (DTT), акриламид, N,N,-мeтнлeнбиcaкpилaмид, гуанидинтиоцианат, роданид аммония, краситель «Понсо С», бромистый этидий, стандартные буферные растворы для тестирования рН-метра производства фирмы «Fluka», Швейцария. Использовались рекомбинантпый человеческий интерлепкип-2 «Proleukin» («Celus», США), водорастворимая среда для заключения гистологических срезов «Mowiol» («Aldrich», США), агароза LE («Ambion», США), бычий сывороточный альбумин (фракция V) («Boehringer Mannheim», ФРГ), фетальная сыворотка крупного рогатого скота («Flow Laboratories», Великобритания). В качестве маркёров для агарозных электрофорезов использовались маркёр длины ДНК «GeneRuler lOObp DNA Ladder™», маркёр длины РНК «High Range RNA Ladder™» производства фирмы «Fermentas», Литва. Использовались глицин, краситель бромфеноловый синий, краситель ксиленцианол, краситель «Кумасси брилиантовый синий G250» производства фирмы «Serva», ФРГ, а также ]М,М,М',М'-тетраметилэтилендиамин (TEMED), нитроцеллюлозная мембрана «Hybond С», нейлоновая мембрана

Hybond N+», смола для гель-фильтрации «Sephadex G-50» производства фирмы «Amersham Pharmacia Biotech», Швеция. Для пммуногистохимиче-ского анализа использовались предметные и покровные стёкла «CML Lames» производства фирмы «CML», Франция.

Остальные использованные реактивы были произведены объединением «Союзреактив» (Россия) квалификации о.с.ч. или х.ч.

Использовалось электрофоретическое и гибридизацноиное оборудование производства фирм «Bio-Rad» (США), «Hybaid» (Великобритания), «Biometra» (ФРГ), «LKB» (Швеция). Для изготовления срезов использовался криомпкротом «Lcica» («Leica Microsystems», ФРГ). Использовались расходные одноразовые пластиковые изделия производства «Coming Costar» (США), «Eppendorf GmbH», «Sarstedt GmbH» (ФРГ), ООО «Биопол», СанктПетербургского объединения «Медполимер» (Россия).

Образцы опухолей сердца были предоставлены после срочного патоло-гоанатомического анализа сотрудниками отделения патологической анатомии Российского научного центра хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН (сведения об образцах опухолей приведены в табл. 3). Диагностика типа удалённой опухоли сердца проводилась сотрудниками того же отделения на основе макроскопического и микроскопического анализа, включавшего гистологический анализ с окрашиванием срезов опухолей гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, ШИК-реакцией. Часть образца опухолевой ткани использовалась для приготовления срезов на криомикротоме. Для выделения белков или РНК образцы опухолевой ткани замораживались в жидком азоте (каждый отдельно) не позднее, чем через 2 часа после операции, и хранились при —70 "С.

Образцы нормальных тканей были получены из внешне нормального ау-топспйного материала после срочных вскрытий вследствие внезапной смерти не позднее 4-6 часов после регистрации) из-за травмы - бытовой, производственной или автомобильной. Образцы тканей замораживались в жидком азоте, хранились при -70 °С до выделения белков пли РНК. Суммировались образцы одного вида тканей от нескольких случаев в возрастном диапазоне 25 - 65 лет с примерно равным распределением по мужскому и женскому полу. Суммарные лейкоциты выделяли из 200 мл донорской крови, полученной от здорового донора 38 лег, мужского пола.

Таблица 3

Информация об образцах опухолей сердца

Номер образца Пол Возраст, лет Локализация Размер, см Гистологическое заключение

1 жен. 71 Левое предсердие 6,7x3,0x3,0 Миксома

2 жен. 76 Левое предсердие 7,0x5,0x2,0 Миксома

3 жен. 25 Левое предсердие 4,0x4,0x5,0 Миксома

4 жен. 52 Левое предсердие 2,0x2,0x2,0 Миксома

9 жен. 41 Левое предсердие 7,0x5,0 Миксома

11 жен. 59 Правое предсердие 9,0x5,0 Миксома

12 жен. 53 Левое предсердие 3,5x2,6x2,4 Миксома

13 жен. 59 Левое предсердие 7,0x3,0x4,0 Миксома

10 муж. 7 Левый желудочек 6,0x4,0x3,0 Мезепхимома

15 муж. 13 Левое предсердие 2,5x1,0x0,5 Мезенхимома

16 жен. 42 Левый желудочек 10,0x10,0 Липома

24 жен. 18 Левый желудочек 4,4x3,0 Неврилеммома

На первом этапе анализа экспрееии генов на уровне РНК использовали экспрессионные матрицы «Atlas™» («Clontech», США). В работе использовались три вида этих матриц: - «Cardiovascular Atlas™ Array» содержит генные зонды для определения уровня экспрессии 588 индивидуальных генов человека, -«Cancer 1.2 Atlas™ Array» — 1176 генов - «Human 1.2 II Atlas™ Array» — 1176 генов.

Полные списки генных зондов доступны по электронному адресу www.clontech.com. С учетом частичного перекрывания наборов генных зондов на разных Atlas™ Array матрицах, всего проанализирован уровень экспрессии 2051 индивидуального гена человека.

Радиоавтографию и хсмилюминесцентную детекцию проводили с использованием рентгеновской плёнки «Primax RTG-В» (ФРГ). Для проявления и фиксирования изображения на рентгеновских снимках использовали фотографические материалы фирмы «Kodak» (США). Синтез олигонуклеотидов был выполнен в компании «Синтол», Россия.

4.2. ВЫДЕЛЕНИЕ РНК

4.2Л. Выделение лейкоцитов из цельной крови

Кровь, около 200 мл, собирали в завинчиваемые полипропиленовые пробирки на 50 мл с цитратом иатрия, рН 7,45 (конечная концентрация после смешивания с кровью — 0,38%) и перерабатывали через 2 — 3 часа после момента отбора.

Процедура выполнялась, как описано в методических руководствах [Sambrook et al., 1989; Strutt et al., 1996]. Плазма отделялась от форменных элементов центрифугированием на центрифуге Т.Т-6 («Весктап», США): 1400 оборотов в минуту, 30 минут, после чего плазма отбрасывалась. Оставшаяся клеточная суспензия лизировалась избытком охлаждённого при 4 °С буфера для лизиса эритроцитов (хлорид аммония - 155 мМ, бикарбонат калия, рН 7,4, — 10 мМ, ЭДТА - 1 мМ). Нелизированные лейкоциты и часть эритроцитов осаждались центрифугированием на центрифуге TJ-6

Весктап», США): 1400 оборотов в минуту, 15 минут. Процедура лизиса повторялась с ресуспендированием клеточного осадка в буфере для лизиса эритроцитов и последующим центрифугированием. Полученный осадок лейкоцитов промывался аналогичным образом в однократном солевом фосфатном буфере Дульбекко, рН 7,4 с добавлсием ЭДТА состава: гидрофосфат калия 0,20 г/л, хлорид калия 0,20 г/л, хлорид натрия 8,00 г/л, дигидрофосфат натрия 1,15 г/л, ЭДТА - 0,1 мМ. Лейкоциты замораживались в жидком азоте и хранились при -70 "С до выделения РНК.

4.2.2. Выделение РНК из образцов тканей и осадка лейкоцитов

Образцы тканей и осадок суммарных лейкоцитов, каждый массой 0,5-2 грамма, после хранения при -70 °С помещали в 10 мл гомогепизаци-онного буфера: гуанидинтпоцианат - 2,7 М, роданид аммония - 1,3 М, ацетат натрия, рН 4,0 - 0,1 М, ЭДТА - 5 мМ. Обрабатывали в течение 0,51 минуты при помощи роторного гомогенизатора «Ultraturrax™ Т 25 basic» («1КА Labortechnik GmbH», ФРГ), охлаждали во льду. К гомогенизированным образцам добавляли 23 мл фенольной смеси: фенол - 60%, глицерин - 8%, ацетат натрия, рН 4,0 - 0,1 М, образцы встряхивали и добавляли 7 мл хлороформа, при этом образовывалась водная фаза. После центрифугирования отбирали водную фазу, нуклеиновые кислоты осаждали добавлением 16 мл изопропанола и дважды промывали полученные осадки 80%) этанолом.

Осадки нуклеиновых кислот растворяли в 3,3 мл буфера для обработки ДНКазой: ТрисНС1, рН 7,0 - 20 мМ, MgCl2 - ЮмМ, СаС12 - 0,5 мМ, DTT-10 мМ, глицерин - 5%, ЭДТА - 50 мкМ. Добавляли ДНКазу I («Dnasc 1, Rnase-free», Roche Diagnostics GmbH, ФРГ) до концентрации 10 ед./мл, ингибитор РНКазы (любезно предоставлен Я.Г. Гурским, лаборатория генной инженерии НИИЭК РКНПК) до концентрации 30 мкг/мл, экзонуклеазу («Exonuclease 1» «Amcrsham Pharmacia Biotech», Швеция) до концентрации 4 ед./мл и инкубировали реакционную смесь при 37 °С в течение 15 минут. После инкубации добавляли концентрированный гомогенизационнып буфер: гуанидинтиоцианат - 4,05 М, роданид аммония - 2,0 М, ацегат натрия, рН 4,0 -0,15М, ЭДТА - 7,5 мМ. К образцам добавляли 23 мл фспольной смеси (состав см. выше), 7 мл хлороформа. После центрифугирования отбирали водную фазу, РНК осаждали добавлением 16 мл изопропанола и дважды промывали полученные осадки 80% этанолом.

Осадок РНК растворяли в 10 мл деионизованной воды, добавляли ацетат натрия, рН 5,5 до концентрации 0,3 М. РНК осаждали добавлением 2,5 объёмов 96% этанола и дважды промывали полученные осадки 80% этанолом.

Осадки РНК растворяли в минимальном количестве (100-200 мкл) деионизованной воды и концентрацию РНК в водном растворе определяли спектрофотометрически. Водные растворы РНК хранили при -70 °С. Выделенная РНК использовалась при проведении экспрессионного анализа на транскрипционных матрицах, ОТ-ПЦР анализа, Нозерн-блот анализа.

4.3. ЭКСПРЕССИОННЫЙ АНАЛИЗ НА ТРАНСКРИПЦИОННЫХ МАТРИЦАХ

4.3.1. Изготовление радиактивно меченной пробы на основе суммарной РНК

Радиоактивно меченная кДНК была получена из 2 мкг суммарной РНК каждого исследуемого образца при помощи 100 единиц обратной транскип

Т VI тазы «PowerScript Reverse Transcriptase 1 » («Clontech», США) внесением 35 мкКи [а-32Р] dATP (10 мКи/мл, 3000 Ки/ммоль, ФГУП «Физико-энергетический институт», г. Обнинск, Россия). В качестве праймеров использовали смесь олигоиуклеотпдов «CDS Primer Mix», «Atlas риге total RNA labeling system» («Clontech», США) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Реакцию проводили при 42 °С в течение 60 минут в 10 мкл реакционной смеси: 50 мМ Трис НС1, рН 8,3, 75 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 5 мМ DTT, 0,5 мМ каждого из трёх природных дезоксинуклеотидтрифосфатов, dCTP, dGTP, dTTP ii 5 micM dATP. После реакции радиоактивно меченную кДНК очищали как описано в методическом руководстве [Sambrook et al., 1989] при помощи гель-фильтрацип па мпкроколоике с «Sephadex G-50» («Amersham Pharmacia Biotech», Швеция), обрабатывали денатурирующим раствором (гидроксид натрия - 100 мМ, ЭДТА - 10 мМ), смешивали с 1/40 объёма раствора «Human Cot-1 DNA™» («Life Technologies», США) с концентрацией 1 мг/мл. Реакционную смесь нейтрализовали добавлением фосфатного буфера, рН 7,0, до конечной концентрации 50 мМ. Радиоактивно меченную кДНК пробу хранили при -20 °С и использовали в течение 1 - 3 дней для гибридизации с транскрипционными матрицами.

4.3.2. Гибридизация радиоактивно меченных кДНК с транскрипционными матрицами

Предгибридизацию и гибридизацию проводили с использованием комплекта оборудования «Amersham hybridization oven/shaker» («Amersham Pharmacia Biotech», Швеция) при температуре 42 °C.

Транскрипционная матрица предгнбридизовалась 4 часа в буфере: фосфат натрия, рН 7,5 - 60 мМ, NaCl - 900 мМ, формамид - 50%, поливинилпирроли-дон - 0,1%, фикол - 0,1%, бычий сывороточный альбумин - 0,1%, ЭДТА -6 мМ, гепарин - 2 мг/мл, SDS - 0,2%, 500 мкг/мл денатурированной ДНК из молок сельди.

Радиоактивно меченная кДНК проба вносилась в гнбридизационную смесь и проводилась инкубация в течение 14 часов.

После гибридизации мембрана отмывалась два раза по 20 минут при 42 "С в буфере содержащем: фосфат натрия, рН 7,5 - 20 мМ, NaCl - 300 мМ, ЭДТА -2 мМ, SDS - 1% . Затем - два раза по 20 минут в том же буфере при 65 °С.

Окончательно мембрана отмывалась два раза по 20 минут при 65 °С в буфере: фосфат натрия, рН 7,5 - 2 мМ, NaCl - 30 мМ, ЭДТА - 0,2 мМ, SDS - 0,5%.

После отмывки нейлоновая мембрана (транскрипционная матрица) заключалась в полиэтиленовый пакет и экспонировалась в кассете с экраном фосфоримэджера в течение 1 - 5 дней. Гибридизационные сигналы считыва-лись с экрана при помощи сканера «Phosphorimager SI system» («Molecular Dynamics», США). Обработка полученной картины гибридизационных сигналов производилась при помощи пакета программ «Atlaslmage 1.5 software» («Clontech», США).

4.4 ОТ-ПЦР АНАЛИЗ

4.4Л. Реакция обратной транскрипции

Для синтеза к ДНК на матрице суммарной РНК из исследуемых образцов использовали в качестве праймеров девятичлснные олпгонуклеотиды со случайной последовательностью. В реакцию вносили 2 мкг тотальной РНК, 2,5 мкМ праймерной смеси, 50 мМ Трис НС1, рН 8,3, 75 мМ КС1, 5 мМ MgCb, 1 мМ каждого из четырёх природных дезоксинуклеотидтрифосфатов, 5 мМ DTT, 200 единиц обратной транскиптазы «PowcrScript Reverse Transcriptase™» («Clontech», США). Реакционные образцы инкубировались в течение 1 часа при 42 °С, затем в пробирку добавляли 1 80 мкл буфера ТЕ (Трис НС1, рН 8,0 - 20 мМ, ЭДТА - 1 мМ), и кДНК хранилась при -20 °С до использования в ПЦР.

4.4.2. Полимсразная цепная реакция

Аликвота кДНК 1 мкл использовалась для проведения ПЦР в реакции объёмом 20 мкл. В реакцию добавляли буфер для проведения ПЦР фирмы «Clontech» («AdvanTaq PCR reaction buffer™»), четыре природных дезокси-нуклеотидтрифосфата до 100 мкМ каждого, по 2 пмоль каждого из ген-специфичных прямого и обратного праймеров (последоагельность праймеров см. табл. 4), 5 сд. «AdvanTaq DNA polymerase™» («Clontech», США). ПЦР проводилась в амплификаторе «PCR Express» («Hybaid», Великобритания) по программе: 94°С - 20 секунд, 57°С - 30 секунд, 72°С - 45 секунд.

Последовательность олигонуклеотидных праймсров для Г1ЦР (табл. 4), как и олигонуклеотидных антисенс-зондов для Нозерн-гнбридизации (см. ниже), выбиралась при помощи программы «ОП99» («Техпоген», Россия).

При амплифнцикации с праймерами для гена GAPD число циклов было одинаковым для всех образцов: 26 в первой серии ОТ-11ЦР экспериментов и 30 - во второй. Анализ продуков реакции электрофорезом в агарозном геле показал, что во всех проанализированных образцах наблюдается отчётливо видимая полоса примерно одинаковой интенсивности, что было критерием пригодности кДНК для ОТ-ПЦР анализа.

Таблица 4

Праймеры для ОТ-ПЦР анализа

Наименование пары прайме-ров Символ гена GenBank код Прямой прай-мер Обратный нраймер Длина амплп кона

ФЛА-1 PLA2G2A NM000300 TATGTT А А С A AT GAATGGGCAAC CAGTG GTTTGCATGAGTG AAGCATGGATTGG 303

ФЛА-2 PLA2G2A NM000300 GAAGCCGCACTC AGTTATG G СТТС GCCAAGGAACTTG GTTAGGGTAGG 416

ГФД-1 GAPD Х01677 ACCACAGTCCAT GCCATCAC TCCACCACCCTGTT GCTGTA 452

Сравнение уровня экспрессии гена PLA2G2A в миксомах и нормальных тканях проводили в два этапа. На первом этапе кДНК из миксомы сердца (образец № 2) использовали для ПЦР-амплификации кДНК PLA2G2A с числом циклов 18, 20, 24 и 26. Анализ продуков реакции электрофорезом в агарозном геле показал, что число циклов при котором отчетливо виден ампликон (амплифи-цируемый фрагмент кДНК гена) PLA2G2A равно 20.

На втором этапе кДНК пз всех анализируемых образцов (миксомы сердца и нормальные ткани) амплифицировались с праймерами для PLA2G2A с числом циклов 20 и 24. Затем продукты реакции были проанализированы электрофорезом. По интенсивности полос в разных треках можно сделать вывод об уровне экспрессии PLA2G2A в разных тканях. Анализ продуктов реакции после 24 циклов амплификации позволял грубо оценить разницу в уровне экспрессии фосфолппазы в миксомах и других тканях, т.к. 4 дополнительных цикла приводят к приблизительно десятикратному увеличению количества ампли-кона PLA2G2A в анализируемом образце.Для проверки воспроизводимости каждый эксперимент по ОТ-ПЦР анализу был повторён с тремя независимо приготовленными препаратами кДНК.

4.4.3. Электрофорез фрагментов амплифицированной ДНК в агарозном геле

Разделение и идентификацию фрагментов амплифицированной ДНК осуществляли при помощи электрофореза в 2,0% агарозном геле в трис-ацетатном буфере: Трпе-ацетат, рН 7,5 - 40 мМ, ЭДТА - 2 мМ. Для окрашивания ДНК в ходе электрофореза в буфер добавлялся бромистый этидий в концентрации 0,5 мкг/мл. Образцы ДНК в лунки агарозного геля вносились в буфере: глицерин - 5%, Трис-ацетат, рН 7,5 - 40 мМ, ЭДТА - 2 мМ, краситель «Понсо С» - 0,05%. Для определения размеров ампликонов использовался маркёр длин фрагментов ДНК « GeneRuler 100bp DNA Ladder™ » («Fermentas», Литва). После электрофореза гель фотографировали на системе фотодокументирования в цифровом формате.

4.5. НОЗЕРН-БЛОТ АНАЛИЗ

4.5.1. Электрофорез РНК в агарозном геле с денатурацией глиокеалем

Разделение образцов суммарной РНК из исследуемых тканей производили при помощи электрофореза в 1% агарозе в фосфатном буфере (фосфат натрия, рН 7,0 - 20 мМ) после предварительной денатурации РНК глиокеалем. Для этого 5 мкг РНК инкубировали при 50 °С в течение 1 часа в 20 - 30 мкл смеси следующего состава: DMSO - 53,3%, глиоксаль - 7,3%, фосфат натрия, piI 7,0 — 10 мМ. По окончании реакции в охлаждённые при комнатной температуре образцы вносили 1/10 объёма буфера для нанесения: глицерин — 50%, фосфат натрия, рН 7,0 - 20 мМ, бромфеноловый синий - 0,03%, ксилепцнанол -0,03%. Образцы вносили в лунки геля и электрофорез проводили с визуальным контролем перемещения красителей, добавленных в образцы РНК. Для определения размеров тестируемых мРНК использовался маркёр длин фрагментов РНК «High Range RNA Ladder™» («Fermcntas», Литва). После электрофореза гель отмывали 50 мМ гидрокепдом натрия, затем 100 мМ Трис НС1, рН 7,6 с 0,5 мкг/мл бромистого этидия до состояния хорошей видимости РНК в ультрафиолетовом свете с длиной волны 260 нм, после чего гель фотографировали. Гель с фракционированной после электрофореза РНК использовался для элек-троблоттинга.

4.5.2. Электроблоттинг РНК

Для электропереноса РНК из агарозного геля на положительно заряженную нейлоновую мембрану «Hybond N+» («Amersham Pharmacia Biotech», Швеция) использовался прибор «Fastblot ВЗЗ» («Biometra», ФРГ). Агарозный гель после фотографирования вымачивался 1 час в 10 мМ растворе гидроксида натрия, в котором проводился электроперенос. На углеродно-пластиковую пластину прибора, являющуюся анодом, стопкой укладывали 2-3 листа фильтровалыюп бумаги, вырезанные по размеру геля, затем нейлоновую мембрану, на неё гель, сверху снова 2-3 листа фильтровальной бумаги. Фильтровальная бумага и мембрана вымачивались в рабочем растворе для переноса. Собранную мокрую стопку сверху прижимали крышкой прибора с катодом и придавливали грузом.

Процесс электроблоттинга проводили.в течение 1 часа 20 минут при напряжении 20 В при охлаждении до температуры 4 "С при помощи водяного циркуляционного термостата «2219 Multitemp II Thermostatic Circulator™» («LKB», Швеция). После электроблоттинга мембрану промывали и хранили в 50 мМ Трпс НС1, рН 7,6, при температуре 4 °С до гибридизации с радиоактивно меченным олигонуклеотидным зондом (Нозерп-гибридизация).

4.5.3. Внесение радиоактивной метки в 5'-конец олигонуклеотида

В качестве источника радиоактивного изотопа фосфора 32 использовался препарат [у- "Р] АТР (10 мКп/мл, 3000 Ки/ммоль, ФГУП «Физико-энергетический институт», г. Обнинск, Россия). Для Нозери-гибридизации с целью выявления матричной РНК PLA2G2A использовался олигонуклеотид с последовательностью нуклеогидов: CAG ТСА TGA GTG АСА CAG CAG CGA ТСС GTT GCA ТСС TTG (GenBank NM000300); а для цитоскелетного Р-актина, АСТВ, - GAC GAC GAG CGC GGC GAT АТС АТС АТС (GenBanlc NM 001101). Для получения 20 пмоль меченного по 5'-концу олигонуклео-тидного зонда в реакционную смесь, содержащую олигонуклеотид, глицин NaOH, рН 9,5 - 20 мМ, MgCl2 - 10 мМ. (3-меркаптоэтанол - 10 мМ, вносили 30 мкКи [у-32Р] АТР и 10 единиц полпиуклеотидкиназы фага Т4, «Т4 polynucleotide kinase (cloned)» («Amersham Pharmacia Biotech», Швеция). Реакцию проводили при 37 "С в течение 30 минут, останавливали прогреванием при 93 °С в течение 3 минут. Радиоактивно меченный олигонуклеотид очищали как описано в методическом руководстве [Sambrook et al., 1989] при помощи гель-фильтрации на микроколопке с «Sephadcx G-50» («Amersham

Pharmacia Biotech», Швеция). Для гибридизации с РНК, иммобилизованной на нейлоновой мембране, использовались зонды с удельной радиоактивностью не менее 300 тыс. распадов на пмоль олигонуклеотида, что проверяли измерением по Черенкову на счётчике радиоактивности. Радиоактивно меченную олигонуклеотидную пробу хранили при -20 "С и использовали в течение 1—3 дней для гибридизации с Нозерн-блотом.

4.5.4. Нозерн-гибрпдпзацпя

Гибридизация поводилась при температуре 42 °С с использованием комплекта оборудования «Mini Oven МК II» («Hybaid», Великобритания). Мембрана с иммобилизованной РНК предгнбрпдизовалась 60 минут в буфере: фосфат натрия, рН 7,5 - 250 мМ, NaCl - 250 мМ, ппрофосфорная кислота - 0,1%, ЭДТА - 25 мМ, гепарин - 1 мг/мл, SDS - 2%, 100 мкг/мл денатурированной суммарной дрожжевой РНК. Гибридизация проводилась в течение 14 часов в свежей порции буфера того же состава с добавлением 10 пмоль радиоактивно меченного олигонуклеотидного зонда.

По окончании, мембрану промывали при температуре 42 °С в трёх сменах промывочного буфера: фосфат натрия, рН 7,5 - 40 мМ, NaCl - 600 мМ, ЭДТА -4 мМ, SDS - 0,5%, после чего промывали в фосфатном буфере (фосфат натрия, рН 7,0 — 40 мМ) при комнатной температуре.

Гибридизацнонныс сигналы выявляли при помощи радиоавтографии или при помощи системы «Phosphorimager SI system» («Molecular Dynamics», США).

4.6. ВЕСТЕРН-БЛОТ АНАЛИЗ

4.6.1. Выделение белков из тканей путём гомогенизации

Для приготовления белковых гомогенато к ткани добавляли примерно 1,6 объёмных частей гомогенизационного буфера: Трис НС1, рН 7,5 - 100 мМ, глицерин - 15%, ЭДТА - 0,2 мМ, дитиотреитол (DTT) - 1 мМ, леупептнн

10 мкг/мл, фенилметансульфоннлфлуорид (PMSF) - 1 мМ. Гомогенизация ткани проводилась при помощи роторного гомогенизатора «Ultraturrax™ Т 25 basic» («1КА Labortechnilc GmbH», ФРГ) на льду. После гомогенизации к белковым смесям добавляли MgCb до конечной концентрации 5 мМ, СаС12 до 0,5 мМ и производили обработку ДНКазой I 40 ед./мл, «Pancreatic deoxyribonuclease (Dnase 1)» («Amersham Pharmacia Biotech», Швеция) в течение 15 минут при температуре 4 °С. Добавляли 4х буфер Лэмли до достижения конечной однократной концентрации в смеси с гомогепатом ткани. Состав однократного буфера Лэмли: Трпс НС1, рН 6,8 - 62,5 мМ, додецилсульфат натрия (SDS) - 2%, глицерин - 10%, бромфеноловый синий - 0,1 %.

Смесь прогревали при 95 °С в течение 15 минут. После охлаждения до комнатной температуры гомогенат освобождали от дебриса. Концентрацию белка измеряли по Брэдфорду в каждом образце гомогепата ткани с использованием набора реактивов «Bio-Rad Protein Assay Kit II» («Bio-Rad», США) в соответствии с протоколом, прилагающимся к набору.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Хаспеков, Георгий Леонидович

7. ВЫВОДЫ

1. Анализ профиля экспрессии генов в миксоме сердца человека с использованием технологии генных (транскрипционных) матриц позволил выделить группу генов - потенциальных маркёров опухоли. В эту группу вошли гены, кодирующие фосфолипазу А2 группы IIA (PLA2G2A), фосфолипидтранспорт-ный белок (PLTP), аннексии A3 (ANXA 3), тканевой ингибитор металлопро-тенназ 1 (TIMP 1), секреторный ингибитор лейкоцитарной протеазы (SLPI), фибромодулин (FMOD), остеопоитин (SPP), ростовой факгор меланома-ингибирующей активности (МТА), ростовой фактор SOX 9 (SOX9), кальрети-нин (CALB2).

2. Методами ОТ-ПЦР, Нозерн-гибридизации, иммупоблоттинга и иммуногистохимического окрашивания криосрезов опухолей показана гиперэкспрессия фосфолипазы А2 группы I1A в миксомах сердца человека. Показано, что уровень экспрессии PLA2G2A в миксомах не менее, чем в десять раз выше, чем в других опухолях сердца и нормальных тканях.

3. Предложен способ диагностики, сущность которого состоит в том, что определяют иммунофенотип удалённой опухоли по фосфолипазе А2 группы IIA, и при положительном иммунофенотипе опухоль диагностируют как мик-сому сердца.

5.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя результаты изучения опухолей сердца, легко проследить, что разными независимыми методами исследования (см. таблицу 5) была показана специфичная для всех протестированных образцов миксомы сердца экспрессия гена PLA2G2A на очень высоком уровне.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хаспеков, Георгий Леонидович, Москва

1. Бабиченко И.И., Бормотин А.В., Говоров А.В., Гундорова Л.В., Пушкарь Д.Ю. Сывороточный и тканевой простатспецифический антиген при различных стадиях онкогенеза предстательной железы человека//Рус. мед. жур. 2003. - № 8 - С. 460-463.

2. Бибилашвили Р.Ш., Винницкий Л.И., Горюнова Л.Е., Ковалевский Д.А., Нечаенко М.А., Скамров А.В., Феоктистова Е.С., Хаспеков Г.Л., Шереметьева Г.Ф. Патент на изобретение 1Ш2261446//Бюллетсиь ФГУ ФИГ1С «Изобретения. Полезные модели» 2005. -№ 27

3. Бокерия Л.А., Малашенков А.И., Кавсадзе В.Э., Серов Р.А. Кардио-онкология. М.: Издательство НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2003.-254 с.

4. Захарова В.П., Руденко Е.В., Галахин К.А., Буле P.M. Миксомы сердца (морфологические аспекты). Киев: Книга плюс, 2003. — 142 с.

5. Константинов Б.А., Бобков В.В., Таричко Ю.В., Бунчук Н.В., Нечаенко М.А. Эхографическая диагностика мпксомы левого предсер-дия//Клиническая медицина. 1978. - № 1 - С. 111-116.

6. Константинов Б.А., Князева Г.Д., Рабкин И.Х., Черепеннн Л.П., Нечаенко М.А., Бобков В.В., Рогов К.А., Матков O.K. Клинические идиагностические аспекты миксом сердца//Клиническая медицина. -1986.-№2-С. 63-70.

7. Константинов Б.А., Нечаенко М.А., Винницкий Л.И., Кабанова С.А. Миксомный синдром//Вестник РАМН. 1994. - № 5 - С. 48-52.

8. Константинов Б.А., Нечаенко М.А., Винницкий Л.И., Черепенин Л.П., Шереметьева Г.Ф., Кабанова С.А. Диагностические и прогностические аспекты миксомпого синдрома//Клиническая медицина. — 1999.-№ 1-С. 22-25.

9. Константинов Б.А., Нечаенко М.А., Кузнецова Л.М., Винницкий Л.И., Шереметьева Г.Ф., Ховрин В.В., Домбровская А.В. Клинико-диагностические и хирургические аспекты объёмных образований сердца у детей и подростков//Хирургия. 2007. - № 4 - С. 4-8.

10. Кушлинский Н.Е. Возможности, неудачи и перспективы исследования опухолевых маркёров в современной онкологической клинике. Часть 1//Клин. лаб. дпагн. 1999а. - № 3 - С. 24-32.

11. Кушлинский Н.Е. Возможности, неудачи и перспективы исследования опухолевых маркёров в современной онкологической клинике. Часть 2//Клин. лаб. диагн. 19996. - № 4 - С. 25-32.

12. Лукьянов С.А., Гурская Н.Г., Лукьянов К.А., Тарабыкин B.C., Свердлов Е.Д. Высокоэффективная вычитающая гибридизация кДНК//Биоорг. хим. 1994. - № 6 - С. 701-703.

13. Меньшиков В.В. Молекулярно-биологические исследования в клинической лабораторной диагностике: возможности и пробле-мы//Клип. лаб. диагн. 2006. - № 3 - С. 23-32.

14. Муратова У.З., Борников В.Т., Абдукаюмова А.Х., Саатов Т.С. Активность фосфолипазы Ао в тромбоцитах человека. Выделение иочистка фермента//Биохимия. 1991. - Т.56. - № 2 - С. 320-325.

15. Мухин Н.А., Моисеев С.В., Фомин В.В. Опухоли сердца/Болезни сердца: Руководство для врачей; под ред. Р.Г. Огановой, И.Г. Фоминой М.: Литтерра, 2006.-С. 1106-1115.

16. Нечаенко М.А., Черепенин Л.П., Шереметьева Г.Ф., Бобков В.В., Овчинников В.И. Прижизненная диагностика и успешное хирургическое лечение рабдомиомы сердца//Кардиологпя. — 1990. — № 6 — С. 115-118.

17. Нечаенко М.А., Черепенин Л.П., Шереметьева Г.Ф., Маховко В.А., Антонов М.В. О семейных миксомах сердца//Клиническая медицина. 1991. -№ 6-С. 38-41.

18. Нечаенко М.А., Шереметьева Г.Ф., Князева Г.Д., Рогов К.А., Антонов М.В. Первичные опухоли сердца//Хирургия. 1994. - № 6 — С. 8-13.

19. Петров С.В., Балатенко II.В., Козырева Н.Ф., Винокурова Г.И., Ма-знтова Ф.М., Хасанов Р.Ш., Райхлин Н.Т. Фундаментальные и прикладные аспекты иммуногистохимической диагностики опухолей человека/Казанский мед. жур. 1998. - № 2 - С. 114-119.

20. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань: Титул, 2004. — 456 с.

21. Петровский Б.В. Кардиоонкология новая глава современной хи-рургин//Грудная хирургия. - 1988. - № 6 - С. 5-10.

22. Петровский Б.В., Нечаенко М.А. Опухоли ссрдца/Болезни сердца и сосудов: Руководство для врачей; под ред. Е.И. Чазова М.: Медицина, 1992. - Т.2. - С. 382 - 404.

23. Петровский Б.В., Константинов Б.А., Нечаенко М.А. Первичные опухоли сердца. М.: Медицина, 1997. - 152 с.

24. Петросян Ю.С., Богомолова М.П. Ангиокардиографическая симптоматика и нарушения гемодинамики при миксомах сердца/Кардиология. 1983. - № 8 - С. 47-51.

25. Пожарисский К.М., Леенман Е.Е Значение пммупогнстохимических методик для определения характера лечения п прогноза опухолевых заболеваний//Архив патологии. 2000. - № 5 - С. 3-1J.

26. Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., Арзуманов А.А. Успехи в морфологической диагностике рака предстательной железы: а-метилацил-коэнзим А рацемаза новый маркёр злокачественной трансформации клеток//Архив патологии. — 2005. — № 5 - С. 15—19.

27. Прнходько B.C., Чугаенко Е.С., Бугара Н.В. Клиника и диагностика миксомы левого предсердия у детей//Кардиология. 1985. - №3 -С. 107-108.

28. Рабкин И.Х., Овчинников В.И., Юдпп АЛ., Нечаенко М.А. Возможности компьютерной томографии в распознавании новообразований сердца//Советская медицина. 1991. - № 5 - С. 8-10.

29. Райхлин Н.Т., Петров С.В. Основные этапы пммупогистохимиче-ской диагностики опухолей человека//Архив патологии. — 1997. -№ 4 — С. 14-19.

30. Рогов К.А. Миксома сердца//Архпв патологии. 2003. — №4 -С. 60-63.

31. Рогов К.А., Шереметьева Г.Ф., Нечаспко М.А. Представление о гистогенезе миксомы сердца в свете её гистологических н ультраструктурных особенностей//Архив патологии. 2003. - № 3 - С. 20-24.

32. Рогов К.А., Шереметьева Г.Ф., Нечаенко М.А. Семейная миксома сердца с метахроппым множественным ростом//Архив патологии. — 2004. № 4 - С. 41—44.

33. Рудснко Е.В., Захарова В.П. Морфология и гистогенез миксом серд-ца//Опкологня. 2001. - Т.З. - № 1 - С. 19-22.

34. Савёлов Н.А., Пстровпчсв Н.Н., Анурова О.А., Павловская А.И., Та-тосян А.Г. Иммуногпстохимическая диагностика метастазов злокачественных мелкокруглоклеточных опухолей без выявления первичного очага//Архив патологии. 2006. - № 2 - С. 16-19.

35. Шхвацабая Л.В. Диагностика вторичного опухолевого поражения ссрдца//Клиническая медицина. 1983. - № 11 - С. 61-65.

36. Шхвацабая Л.В. Первичные и вторичные опухоли серд-ца//Кардиология. 1984. - № 1 - С. 112-116.

37. Acebo Е., Val-Bernal J.F., Gomez-Roman J.J. Prichard's structures of the fossa ovalis are not histogenetically related to cardiac myxoma//Histopathol. 2001. - V.39. - P. 529-535.

38. Acebo E., Val-Bernal J.F., Gomez-Roman J.J., Revuelta J.M. Clinicopa-thologic study and DNA analysis of 37 cardiac myxomas, a 28-year ex-perience//Chest 2003. -V. 123. - P. 1379-1385.

39. Alaeddini M., Ethemad-Moghadam S., Baghaii F. Comparative expression of calretinin in selected odontogenic tumours: a possible relationship to histogenesis//Histopathol. 2008. - V.52. - P. 299-304.

40. American cancer society/Cancer facts and figures 2007. American Cancer Society, Inc., Atlanta, 2007. - P. 56.

41. Araoz P.A., Ecklund H.E., Welch T.J., Breen J.F. CT and MR imaging of primary cardiac malignancies//Radiograph. 1999. - V.19. -P 1421-1434.

42. Araoz P.A., Mulvagh S.L., Tazelaar H.D., Julsrud P.R., Breen J.F. CT and MR imaging of benign primary cardiac neoplasms with echocardio-graphic correlation//Radiograph. 2000. - V.20. - P 1303-1319.

43. Atherton D.J., Pitcher D.W., Wells R.S., MacDonald D.M. A syndrome of various cutaneous pigmented lesions, myxoid ncurofibromata and atrial myxoma: the NAME syndrome//Br. J. Dermatol. 1980. -V. 103.-P. 421-429.

44. Attum A.A., Johnson G.S., Masri Z., Girardet R., Lansing A.M. Malignant clinical behaviour of cardiac myxoma and "myxoid imitators"//Ann. Thorac. Surg. 1987. - V.44. - P. 217-222.

45. Bennett K.R., Gu J.W., Adair Т.Н., Heath B.J., Miss J. Elevated plasma concentration of vascular endothelial growth factor in cardiac myxoma//J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2001. - V. 122. - P. 193-194.

46. Berman J.J. Tumor classification: molecular analysis meet Aris-totle//BMC Journals: Plos BMC Cancer 2004. -4:10.

47. Bernstein J.L., Godbold J.H., Raptis G., Watson M.A., Levinson В., Aaronson S.A., Fleming T.P. Identification of mammaglobin as a novel serum marker for breast cancer//Clin. Cancer Res. 2005. - V. 11. - P. 6528-6535.

48. Berrutti L., Silverman J.S. Cardiac myxoma is reach in factor XHIa positive dendrophages: immunohistochemical study of four cases//Histopathol. 1996. - V.28. - P. 529-535.

49. Betancourt В., Defendini E.A., Johnson C., De Jesus M., Pavia-Villamil A., Cruz A.D., Medina J.C. Sever right ventricular outflow truct obstruction caused by an intracavitary cardiac neurilcmoma//Chest 1979. -V.75. - P. 522-524.

50. Blondeau P. Primary cardiac tumors — french studies of 533 cases//Thorac. Cardiovasc. Surg. 1990. - V.38. - Suppl. 2. - P. 192195.

51. Bock Axelsen J., Lotem J., Sachs L., Domany E. Genes overexpressed in different human solid cancers exhibit different tissue-specific expression profiles//Proc. Nat. Acad. Science 2007. - V. 104. - P. 13 122-13127.

52. Boxer M.E. Cardiac myxoma: an immunoperoxidase study of histogene-sis//Histopathol. 1984. - V.8. - P. 861-872.

53. Braun S., Schrotter H., Reynen K., Schwencke C., Strasser R.H. Myocardial infarction as complication of left atrial myxoma//Intern. J. Cardiol. 2005. - V.101. - P. 115-121.

54. Buchanan R.C., Cairns J.A., Kraag G., Robinson J.G. Left atrial myxoma mimicking vasculitis: echocardiographic diagnosis//Canad. Med. Assoc. J. 1979,-V. 120.-P. 1540-1542.

55. Buckland A.G., Wilton D.C. The antibacterial properties of secreted phospholipases A2//Bioch. Bioph. Acta 2000. - V. 1488. - P. 71-82.

56. Burke A., Virmani R., Reynen K., Daniel W.G., Kairemo K.J., Blom-qvist C.P. More on cardiac myxoma//Ncw Eng. J. Med. 1996. — V. 335.-P. 1462-1464.

57. Burke A.P., Cowan D., Virmani R. Primary sarcomas of the heart//Cancer — 1992. V.69. - P. 387-395.

58. Burke A.P., Rosado-de Christenson M., Templeton P.A., Virmani R. Cardac fibroma: clinicopathologic correlates and surgical treatment//J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1994. - V. 108. - P. 862-870.

59. Carney J.A., Gordon H., Carpenter P.C., Shenoy B.V., Go V.L. The complex of myxomas, spotty pigmentation, and endocrine overactiv-ity//Medicine 1985. - V.64. - P. 270-283.

60. Celis J., Gromov P. Proteomics in translational cancer research: toward an integrated approach//Cancer Cell 2003. - V.3. - P. 9-15.

61. Chahinian A.P., Gutstein D.E., Fuster V. Tumors of the heart and great vessels/Cancer medicine, fifth edition; Holland J.F. & Frei E. eds. -B.C. Decker Inc., London, 2000. P. 1319-1321.

62. Chen M.Y., Wang J.H., Chao S.F., Hsu Y.H., Wu D.C., Lai C.P. Cardiac myxoma originating from the anterior mitral leaflet//Jpn. Heart J. 2003. V.44. - P. 429-434.

63. Chenchik A.A., Diachenko L.B., Beabealashvilli R.Sh. Analysis of poly(A)+ RNA patterns in human tissues//FEBS Lett. 1993a. - V.321. -P. 98-101.

64. Chenchik A.A., Diachenko L.B., Beabealashvilli R.Sh. Application of poly(A) RNA patterns method for searching of differentially expressed genes//FEBS Lett. 1993b. -V.324. - P. 136-139.

65. Choi B.W., Ryu S.J., Chang B.C., Choe K.O. Myxoma attached to both atrial and ventricular sides of the mitral valve: report of a case and review of 31 cases of mitral myxoma//Intern. J. Cardiovasc. Imaging — 2001. V.17.-P. 411-416.

66. Chu P.H., Jung S.M., Yeh C.H., Yeh T.S., Wang C.L. Mucin gene expression in cardiac myxoma//Int. J. Clin. Pract. 2004. - V.58. -P. 306-309.

67. Cole K.A., Krizman D.B., Emmert-Buck M.R. The genetics of cancer a 3D model//Nature Genet. - 1999. - Suppl. 1. - V.21. - P. 38-41.

68. Cox J.N., Friedli В., Mechmeche R., Ben Ismail M., Oberhaensli I., Faidutti B. Teratoma of the heart, a case report and review of the litera-ture//Virch. Arch. 1983. - V.402. - P. 163-174.

69. Curschellas E., Toia D., Borner M., Mihatsch M.J., Gudat F. Cardiac myxomas: immunohistochemical study of benign and malignant vari-ants//Virch. Arch. 1991. - V.418. - P. 485-491.

70. Deininger M., Buchdunger E., Druker B.J. The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia //Blood 2005. -V. 105.-P. 2640-2653.

71. Den Bakker M.A., Dinjens W.N., Bekkcrs J.A. Cardiac myxoma with atypical glandular component, report of a case//Histopathol. 2005. -V.48. - P. 200-219.

72. Dennis E.A., Rhee S.G., Billah M.M., Hannun Y.A. Role of phospholi-pases in generating lipid second messengers in signal transduc-tion//FASEB J. 1991. -V.5. - P. 2068-2077.

73. Dennis J.L., Vass J.K., Wit E.C., Keith W.N., Oien K.A. Identification from public data of molecular markers of adenocarcinoma characteristic of the site of origm//Cancer Res. 2002. - V.62. - P. 5999-6005.

74. Deshpande A., Vcnugopal P., Kumar A.S., Chopra P. Phenotypic characterization of cellular components of cardiac myxoma: a light microscopy and immunohistochemisty study//Hum. Pathol. 1996. - V.27. - P. 1056-1059.

75. Devbhandari M.P., Mcraj S., Jones M.T., Kadir I., Bridgewater B. Primary cardiac sarcoma: reports of two cases and a review of current litera-ture//BMC Journals: J. Cardiothorac. Surg. 2007. - 2:34.

76. Dhawan S., Так Т. Left atrial mass: thrombus mimicking myxoma//Echocardiogr. 2004. - V.21. - P. 621-623.

77. Dietel M., Sers C. Personalized medicine and development of targeted therapies: the upcoming challenge for diagnostic molecular pathol-ogy//Virch. Arch. 2006. - V.448. - P. 744-755.

78. Ding Y., Xu L., Jovanovich B.D., Helenowski I.B., Kelly D.L., Catalona W.J., Yang X.J., Pins M., Bergan R.C. The methodology used to measure differential gene expression affects the outcome//J. Biomolec. Techn. -2007.-V.18.-P. 321-330.

79. Dogan R., Dogan O.F., Duman U., Duvan 1., Terzioglu A., Firat P. Myxoid tissue fragments in femoral embolectomy material: cardiac myxoma versus myxoid thrombus a diagnostic dilemma//Anadolu Kardiyol. Derg. - 2007. - V.7. - P. 105-106.

80. Doglioni C., Dei A.P., Laurino L., Iuzzolino P., Chiarelli C., Celio M.R., Viale G. Calretinin: a novel immunochistochcmical marker for meso-thelioma//Am. J. Surg. Pathol. 1996. - V.20. - P. 1037-1046.

81. Donsbeck A.V., Ranchere D., Coindre J.M., Lc Gall F., Cordier J.F., Loire R. Primary cardiac sarcomas: an immunohistochemical and grading study with long-term follow-up of 24 cases//Histopathol. 1999. -V.34.-P. 295-304.

82. Duggan D.J., Bittner M., Chen Y., Meltzcr P. Trent J.M. Expression profiling using eDNA microarrays//Nature Genet. 1999. - Suppl. 1. -V.21. - P. 10-14.

83. Eckhardt B.P., Dommann-Scherrer C.C., Stuckmann G., Zollikofer C.L., Wentz K.U. Giant cardiac myxoma with malignant transformed glandular structures//Eur. Radiol. 2003. - V. 13. - P. 2099-2102.

84. Elinder L.S., Dumitrescu A., Larsson P., Hedin U., Frostegard J., Claes-son H.E. Expression of phospholipase A2 isoforms in human normal and atherosclerotic arterial wall//Artherioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. -V. 17. - P. 2257-2263.

85. Facila-Rubio L., Nunez-Villota .Т.Е., Losada-Casarcs A., Otero-Coto E., Marin-Pardo J., Ferreres-Franco J., Chorro-Gasco F.J. Hemoptysis as an unusual manifestation of right' atrial myxoma//Intern. J. Cardiol. -2003.-V.87.-P. 103-105.

86. Fang B.R., Chang C.P., Cheng C.W., Yang N.I., Shieh M.C., Lee N. Total detachment of cardiac myxoma causing saddle embolization and mimicking aortic dissection//Jpn. Heart J. 2004. - V.45. - P. 359-363.

87. Farrell D.J., Bulmer E., Angus В., Ashcroft T. Tmmunohistochemical expression of endothelial markers in left atrial myxomas: a study of six cases//Histopathol. 1996. - V.28. - P. 147-151.

88. Feldman P., Horvath E., Kovacs K. An ultrastructural study of seven cardiac myxomas//Cancer 1977. - V.40. - P. 2216-2232.

89. Fine G., Morales A., Horn R.C. Cardiac myxoma, a morphologic and histogenetic appraisal//Cancer 1968. - V.22. - P. 1156-1162.

90. Fine S.W., McClain S.A., Li M. immunochistochemical staining for cal-retinin is useful for differentiating schwannomas from neurofibro-mas//Am. J. Clin. Pathol. 2004. - V. 122. - P. 552-559.

91. Fitzpatrick A.P., Lanham J.G., Doyle D.V. Cardiac tumours simulating collagen vascular disease//Br. Heart J. 1986. - V.55. - P. 592-595.

92. Fleming T.P., Watson M.A. Mammaglobin, a brcast-specific gene, and its utility as a marker for breast cancer//Ann. New York Acad. Science -2000. -V.923.- P. 78-89.

93. Frankenfeld R.H., Watters C.H., Steiner R.C. Bilateral myxomas of the heart//Ann. Int. Med. 1960. - V.53. - P. 827-838.

94. Garcia-F-Villalta M.J., Sanz-Sanchez Т., Aragues M., Blasco A., Fraga J., Garsia-Diez A. Cutaneous embolization of cardiac myxoma//Br. J. Derm. 2002. - V. 147. - P. 379-382.

95. Gendaszewska-Darmach E. Lysophosphatidic acid, cyclic phosphatidic acid and autotoxin as promising targets in therapies of cancer and other dis-eases//Acta Bioclnmica Pol. 2008. - V.55. - P. 227-240.

96. Goetzl E.J., An S., Smith W.A. Specificity of expression and effects of eicosanoid mediators in normal physiology and human diseases//FASEB J.- 1995.-V.9.-P. 1051-1058.

97. Goldknopf I. Blood-based proteomics for personalized medicine: examples from neurodegenerative disease//Expert Rev. Proteomics 2008. -V.5.-P. 1-8.

98. Goldman B.I., Fridman C., Harpaz N., Ryan S.F., Loitennan D. Glandular cardiac myxomas, histologic, immunohistochemical, and ultrastructural evidence of epithelial differentiation//Cancer 1987. - V.59. - P. 1767-1775.

99. Goswami K.C., Shrivastava S., Bahl V.K., Saxena A., Manchanda S.C., Wasir H.S. Cardiac myxomas: clinical and echocardiographic pro-file//Intem. J. Cardiol. 1998. - V.63. - P. 251-259.

100. Graff J.R., Konicek B.W., Deddens J.A., Chedid M., Hurst B.M., Colli-gan В., Neubauer B.L., Carter H.W., Carter J.H. Expression of group IIA secretory phospholipase A2 increases with prostate tumor gradc//Clin. Cancer Res. 2001. - V.7. - P. 3857-3861.

101. Grebenc M.L., Rosado de Christenson M.L., Burke A.P., Green C.E., Galvin J.R. Primary cardiac and pericardial neoplasms: radiologic-pathologic corre 1 ation//Radiograph. 2000. - V.20. - P 1073-1103.

102. Grebenc M.L., Rosado de Christenson M.L., Green C.E., Burke A.P., Galvin J.R. Cardiac myxoma: imaging features in 83 pa-tients//Radiograph. 2002. - V.22. - P 673-689.

103. Grenadier E., Margulis Т., Palant A., Safadi Т., Merin G. Huge cavernous hemangioma of the heart: a completely evaluated case report and review of the literature//Am. Heart J. 1989. - V.l 17. - P. 479-487.

104. Gronroos J.M., Forsstrom J.J., Irjala K., Nevalainen T.J. Phospholi-pases A2, C-reactive protein and white blood cell count in the diagnosis of acute appendicitis//Clin. Chem. 1994. - V.40. - P. 17571760.

105. Haapamaki M.M., Gronroos J.M., Nurmi H., Alanen K., Kallajoki M., Nevalainen T.J. Gene expression of group II pliospholipase A2 in intestine in ulcerative colitis//Gut 1997. - V.40. - P. 95-101.

106. Hackeng T.M., Mounier C.M., Bon C., Dowson P.E., Griffin J.H., Kent S.B. Total chemical synthesis of enzymatically active human type II secretory phospholipase A2//Proc. Nat. Acad. Science 1997. - V.94. - P. 7845-7850.

107. Hammond G.L., Strong W.W., Cohen L.S., Silverman M., Garnet R., Li Volsi V.A., Cornog J.L. Chondrosarcoma simulating malignant atrial myxoma//J. Tliorac. Cardiovasc. Surg. 1976. - V.72. -P. 575-580.

108. Harada Т., Ohtaki E., Sumiyoshi Т., Hosoda S. Successful three-dimensional reconstruction using transesophageal echocardiography in a patient with a left atrial myxoma//Jpn. Heart J. 2001. - V.42. - P. 789-792.

109. Harken B.G., Fuchs J.S., Sabiston D.C. Atrial myxoma: an evaluation of clinical and laboratory manifestations//Ann. Thorac. Surg. — 1972. — V.10.-P. 65-74.

110. Hayato I., Sawako K., Hideaki Y., Yoichi N. Systematic immunohisto-chemical profiling of 378 brain tumors with 37 antibodies using tissue mi-croarray technology//ActaNeuropathol. -2006. V.lll.-P. 475-482.

111. Hcmachandrana M., Kakkara N., Khandelwalb N. Giant-cell-rich myxoma of right atrium, an ultrastructural analysis/VCardiovascular Pathology 2003. - V. 12. - P. 287-289.

112. Herbst M., Wattjes M.P., Urbach H., Inhetvin-Hutter C., Becker D., Klockgether Т., Hartmann A. Cerebral embolism from left atrial myxoma leading to cerebral and retinal aneurysms: a case report//J. Neu-roradiol. 2005. - V.26. - P. 666-669.

113. Hesse В., Murphy R.T., Myles J., Huang J., Sabik E.M. Left atrial appendage thrombus mimicking atrial myxoma//Circulation 2006. -V.I 13.-P. e456-e457.

114. Hirudayaraj P., Arya В., Suvarna S.K., Payne G., Palaniswamy A. Myxomatous meningeal tumour: a case of "metastatic" cardiac myxoma//Intern. J. Cardiol. 2004. - V.96. - P. 471-473.

115. Hishitani Т., Ogawa K., Hoshino K., Kido S., Nakamura Y., Ogawa Y. Malignant fibrosarcoma with features of myxoma//Pcdiatr. Cardiol. — 2001. V.22. - P. 258-259.

116. Hood L., Heath J.R., Phelps M.E., Lin B. Systems biology and new technologies enable predictive and preventative medicine//Science — 2004. — V.306.-P. 640-643.

117. Hwang J.J., Lien W.P., Kuan P., Hung C.R., How S.W. Atypical myxoma//Chest 1991. - V.100. - P. 550-551.

118. Iga К., Izumi С., Konishi Т. Rapid growth of a left atrial myxoma. Serial two-dimensional echocardiographic observation over eighteen months //Intern. J. Cardiol. 1997. - V.61. - P. 85-87.

119. Iwa N., Yutani C. Cytology of cardiac myxomas: presence of Ulex eu-ropaeus agglutinin-1 (UEA-1) lectin by immunoperoxidase stain-ing//Diagn. Cytopathol. 1993. - V.9. - P. 661-664.

120. Jafle E.S. Hematopathology: integration of morphologic features and biologic markers for diagnosis/Mod. Pathol. 1999. - V.12. - P. 109-115.

121. Jamal O.S., Conaghan P.G., Cunningham A.M., Brooks P.M., Munro V.F., Scott K.F. Increased expression of human type IIA secretory phos-pholipase A2 antigen in arthritic synovium//Ann. Rheum. Dis. 1998. -V.57.-P. 550-558.

122. Jardine D.L., Lamont D.L. Right atrial myxoma mistaken for recurrent pulmonary thromboembolism//Heart 1997. - V.78. - P. 512-514.

123. Johansson L. Histogenesis of cardiac myxomas. An immunohistochemi-cal study of 19 cases, including one with glandular structures, and review of the literature//Arch. Pathol. Lab. Med. 1989. - V.l 13. - P. 735-741.

124. Jourdan M., Bataille R., Seguin J., Zhang X.G., Chaptal P.A., Klein B. Constitutive production of interleukin-6 and immunologic features in cardiac myxomas//Arth. Rheumat. 1990. - V.33. - P. 398-402.

125. Kallajoki M., Alanen K.A., Nevalainen M., Nevalainen T.J. Group II phospholipase A2 in human male reproductive organs and genital tu-mors//Prostate 1998. - V.35. - P. 263-272.

126. Kallioniemi O.P., Wagner U., Kononen J., Sauter G. Tissue microarray technology for high-throughput molecular profiling of cancer//Hum. Mol. Genet. -2001. V. 10. -P. 657-662.

127. Kanda Т., Umeyama S., Sasaki A., Nakazato Y., Morishita Y., Imai S., Suzuki Т., Murata K. Interleukin-6 and cardiac myxoma//Am. J. Cardiol. 1994.-V.74.-P. 965-967.

128. Karlof E., Salzberg S.P., Anyanwu A.C., Steinbock В., Filsoufi F. How fast does an atrial myxoma grow?//Ann. Thorac. Surg. 2006. — V.82. — P. 1510-1512.

129. Kodama H., Hirotani Т., Suzuki Y., Ogawa S., Yamazaki K. Cardiomyo-genc differentiation in cardiac myxoma expressing lineage-specific transcription factors//Am. J. Pathol. 2002. - V.161. - P. 381-389.

130. Koduri R.S., Gronroos J.A., Laine V.J., Le Calvez C., Lambeau G., Nevalaincn T.J., Gelb M.H. Bactericidal properties of human and murine groups I, II, V, X and XII secreted phospholipases A2//J. Biol. Chem. -2002. V.277. - P. 5849-5857.

131. Kollias V.D., Theodoropoulos S.P., Yacoub M.H. Right atrial appendage myxoma following recent coronary artery bypass grafting//lnteract. Car-diovasc. Thorac. Surg. 2004. - V.3. - P. 195-197.

132. Копо Т., Koide N., Hama Y., Kitahara H., Nakano H., Suzuki J., Izobe M., Amano J. Expression of vascular endothelial growth factor and an-giogenesis in cardiac myxoma: a study of fifteen patients//! Thorac. Cardiovasc. Surg. -2000. V. 119.-P. 101-107.

133. Kononen J., Bubendorf L., Kallioniemi A., Barlund M., Schraml P., Leighton S., Torhorst J., Mihatsch M., Sauter G., Kallioniemi O.P. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens/mature Med. 1998. - V.4. - P. 844-847.

134. Kramer R.M., Hession C., Johansen В., Hayes G., McGray P., Chou E.P., Tizard R., Pepinsky R.B. Stmcture and properties of a human non-pancreatic phospholipase A2//J. Biol. Chem. 1989. - V.264. - P. 5768-5775.

135. Kuon E., Kreplin M., Weiss W., Dahm J.B. The challenge presented by right atrial myxoma//Herz 2004. - V.29. - P. 702-709.

136. Landon G. Cardiac myxomas: an immunohistochemical study using endothelial, histiocytic, and smooth-muscle cell markers//Arch. Pathol. Lab. Med. 1986,-V.l 10.-P. 116-120.

137. Langer C., Korfer J., Peterschroder A., Faber L., Beerbaum P., Scholtz W., Raute-Krcinsen U., Fricke E., Korfer R., Horstkotte D. Right atrial hemangioma in modern cardiac imaging//Clin. Res. Cardiol. 2006. -V.95.- P. 482-487.

138. Laye J.P., Gill J.H. Phospholipase A2 expression in tumors: a target for therapeutic intervention?//Drug Discov. Today 2003. - V.8. - P. 710716.

139. Layfield L.J., Dodd L.G. Fine-needle aspiration of a primary right atrial myxoma//Diagn. Cytopathol. 1996. - V.14. - P. 162-164.

140. Leers M.P.G., Aarts M.M.G., Thcunissen P.H.M.H. E-cadherin and cal-retinin: a useful combination of immunocheical markers for differentiation between mesothelioma and metastatic adenocarcinoma//Histopathol. 1998.-V.32.-P. 209-216.

141. Li Y., Pan Z., Ji Y., Genta R., Sheppard M., Jeffries D.J., Archard L.C., Zhang H. Herpes Simplex Virus Type 1 Infection Associated with Atrial Myxoma//Am. J. Pathol. 2003. - V.163. - P. 2407-2412.

142. Liang P., Averboukh L., Pardee A.B. Distribution and cloning of eu-karyotic mRNAs by means of differential display: refinements and opti-mization//Nucl. Acids Res. 1993. - V.21. - P. 3269-3275.

143. Liang P., Pardee A.B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain rcaction//Science 1992. - V.257. -P. 967-971.

144. Lisitsyn N., Wigler M. Cloning the differences between two complex ge-nomes//Science 1993. - V.259. - P. 946-951.

145. Luciani L., Anselmi A., Piscitelli M., Possati G. Neovascularization of left atrial myxoma//Eur. J. Cardiothor. Surg. 2005. - V.28. -P 642-642.

146. Lukyanov K., Diatchenko L., Chenchik A., Nanisetti A., Siebert P.D., Usman N., Matz M., Lukyanov S. Construction of cDNA libraries from small amounts of total RNA using the suppression PCR ef-fect//Bioch. Bioph. Res. Comm.- 1997. V.230. - P. 285-288.

147. Macoska J.A. The progressing clinical utility of DNA microarrays//CA Cancer J. Clin. 2002. - V.52. - P. 50-59.

148. Mah N., Thelin A., Lu Т., Nikolaus S„ Kuhbacher Т., Gurbuz Y., Eickhoff H„ Kloppel G., Lehrach H„ Mellgard В., Costello C.M., Schreiber S. A comparison of oligonucleotide and cDNA microarray systems//Physiol. Genomics 2004. - V.16. - P. 361-370.

149. Malekzadeh S., Roberts W.C. Growth rate of left atrial myxoma//Am. J. Cardiol. 1989,- V.64. - P. 1075-1076.

150. Marinissen K.I., Essed C., Groot C., Schelling A., Hagemeijer F. Growth rate of left atrial myxoma. Development of a symptomatic left atrial myxoma less than two years after coronary artery bypass grafting//Chest 1987. - V.92. - N.5. - P. 941-942.

151. Masuda S., Murakami M., Ishikawa Y., Ishii Т. Kudo I. Diverse cellular localization of secretory phospholipases A2 enzymes in several human tissues//Bioch. Bioph. Acta 2005. - V. 1736. - P. 200-210.

152. Masuda S., Murakami M., Matsumoto S., Eguchi N., Urade Y., Lambeau Ст., Gelb M.H., Ishikawa Y., Ishii Т., Kudo I. Localization of various secretory phospholipases A2 enzymes in male reproductive organs//Bioch. Bioph. Acta-2004.-V.1686,-P. 61-76.

153. Mattle H.P., Maurer D., Sturzenegger M., Ozdoba C., Baumgartner R.W., Schroth G. Cardiac myxoma: a long term study//J. Neurol. 1995. -V.242.-P. 689-694.

154. McCoskey E.H., Mehta J.B., Krishnan K., Roy T.M. Right atrial myxoma with extracardiac manifestations//Chest 2000. - V. 118. — P. 547-549.

155. Mcrseburger A.S., Anastasiadis A.G., Hennenlotter J., Schilling D., Simon P., Machtens S.A., Serth J., Stenzl A., Kuszyk M.A. Tissue microarrays: application in urological cancer research//World J. Urol. -2006.-V.24.-P. 579-584.

156. Milicic D., Juretic A., Bulum A., Saric N., Bisof V., Jelic 1., Jelasic D. Primary malignant fibrous histiocytoma of the heart with skelelal muscles metastases//.!. Card. Surg. 2007. - V.22. - P. 513-516.

157. Minami Т., Tojo H., Shinomura Y., Matzuzawa Y., Okamoto M. Increased group II phospholipase A2 in colonic mucosa of patients with Cron's disease and ulcerative colitis//Gut- 1994.-V.35.-P. 1593-1598.

158. Minna J.D., Girard L., Xie Y. Tumor mRNA expression profiles predict responses to chemotherapy//.! Clin. Oncol. 2007. - V.25. -P. 4329-4336.

159. Mochizuki Y., Okamura Y., Iida H., Mori H., Shimada K. Interleukin-6 and "complex" cardiac myxoma//Ann. Thorac. Surg. 1998. - V.66. -P. 931-933.

160. Moiyadi A.V., Moiyadi A.A., Sampath S., Kalpana S.R., Mahadevan A., Shankar S.K., Srikanth S.G. Intracranial metastasis from a glandularvariant of atrial myxoma//Acta Neurochir. (Wien) 2007. - V.149. -P. 1157-1162.

161. Morales A.R., Fine G., Castro A., Nadji M. Cardiac myxoma (endocar-dioma) an immunocytochemical assessment of histogenesis//Hum. Pathol. 1981,- V. 12. -P. 896-899.

162. Moyssakis I., Anastasiadis G., Papadopoulos D., Margos P, Votteas V. Second recurrence of cardiac myxoma in a young patient. A case re-port//Intern. J. Cardiol. 2005. - V. 101. - P. 501-502.

163. Mullen J.C., Schipper S.A., Sett S.S., Trusler G.A. Right atrial li-poma//Ann. Thorac. Surg. 1995. - V.59. - P. 1239-1241.

164. Muller G.A., Klyscz C., Markovic-Lipkovski J., Seipel L., Waller H.D. Phenotypical heterogeneity of cardiac myxomas//Klin. Wochenschr. -1987.-V.65.-P. 912-919.

165. Nardi C., De Carlo M., Milano A., Bortolotti U. Neovascularization of left atrial myxoma//Eur. J. Cardiothor. Surg. 2000. - V.17. -P 338-338.

166. Nevalainen T.J., Haapamaki M.M., Gronroos J.M. Roles of secretory phospholipases A2 in inflammatory diseases and trauma//Bioch. Bioph. Acta 2000. - V. 1488. - P. 83-90.

167. Nyman K.M., Ojala P., Laine V.J., Nevalainen T.J. Distribution of group II phospholipase A2 protein and mRNA in rat tissues//.T. Histochem. Cy-tochem. 2000. - V.48. - P. 1469-1477.

168. Obeid A.I., Marvasti M., Parker F., Rosenberg J. Comparison of transthoracic and transesophageal echocardiography in diagnosis of left atrial myxoma//Am. J. Cardiol. 1989. - V.83. - P. 1006-1008.

169. Oguz K.K., Firat M.M., Cila A. Fusiform aneurysms detected 5 years after removal of an atrial myxoma//Neuroradiol. 2001. - V.43. -P. 990-992.

170. Orkin S.H. Reverse genetics and human disease//Cell 1986. - V.47. -P. 845-850.

171. Orlandi A., Ciucci A., Ferlosio A., Genta R., Spagnoli L.G., Gabbiani G. Cardiac myxoma cells exhibit embryonic endocardial stem cell features//! Pathol. 2006. - V.209. - P. 231-239.

172. Orlandi A., Ciucci A., Ferlosio A., Pellegrino A., Chiariello L., Spagnoli L.G. Increased expression and activity of matrix metalloproteinases characterize embolic cardiac myxomas//Am. J. Pathol. 2005. - V.166. -P. 1619-1628.

173. Parissis J.T., Zezas S., Sfiras N., Kastellanos S. An atypical left atrial myxoma causing intracavitary pressure gradient and typical diastolic transmitral flow of severe mitral stenosis//Intern. J. Cardiol. 2005. -V.102.-P. 165-167.

174. Perchinsky M.J., Liechtenstein S.V., Tyers F.O. Primary cardiac tumors, forty years' experience with 71 patients//Cancer 1997. - V.79. -P. 1809-1815.

175. Pfammatter J.P., Iff Т., Schupbach P. Imitation of a chronic recurrent inflammatory illness by a cardiac myxoma//Eur. J. Pediatr. 1996. -V.155.-P. 637-639.

176. Pillai J.B., Feindel C.M., Butany J., Murphy P. A diagnostic challenge -an unusual right atrial mass, 12 years following atrial septal defect sur-gery//Interact. Cardiovasc. Thorac. Surg. 2005. - V.4. - P. 285-286.

177. Pinede L., Duhaut P., Loire R. Clinical presentation of left arial cardiac myxoma, a series of 1 12 consecutive cases//Medicine — 2001. — V.80. — P. 159-172.

178. Pohost G.M., Pastore J.O., McKusick K.A., Chiotcllis P.N., Kapellakis G.Z., Myers G.S., Dinsmore R.E., Block P.C. Detection of left atrial myxoma by gated radionuclide cardiac imaging//Circulation 1977. -V.55.-P. 88-92.

179. Pollack J.R. A perspective of DNA microarrays in pathology research and practice//Am. J. Pathol. 2007. - V. 171. - P. 375-385.

180. Pucci A., Bartoloni G., Tessitore E., Carney J.A., Papotti M. Cytokeratin profile and neuroendocrine cells in the glandular component of cardiac myxoma//Virch. Arch. 2003. - V.443. - P. 618-624.

181. Pucci A., Gagliardotto P., Papandrea C., Di Rosa E., Morello M., Di Summa M., Mollo F. An unusual myxoid leiomyosarcoma of the heart//Arch. Pathol. Lab. Med. 1996. - V. 120. - P. 583-586.

182. Pucci A., Gagliardotto P., Zanini C., Pansini S., Di Summa M., Mollo F. Histopathological and clinical characterization of cardiac myxoma: review of 53 cases from a single institution//Am. Heart J. 2000. -V.140.-P. 134-138.

183. Qu X.D., Lloyd K.C., Walsh J.H., Lehrer R.I. Secretion of type II phos-pholipase A2 and cryptdin by rat small intestinal Paneth cells//Infect. Immun. 2003. - V.64. - P. 5161-5165.

184. Ramaswamy S., Golub T.R. DNA microarrays in clinical oncology//J. Clin. Oncol. 2002. - V.20. - P. 1932-1941.

185. Reardon M.J., Smythe W.R. Cardiac neoplasms/Cardiac surgery in the adult; Edmunds L.H. & Cohn L.H. eds. McGraw-Hill professional, New York, 2003. - P. 1373-1400.

186. Reynen K. Cardiac myxomas//New Eng. J. Med. 1995. - V.333. -P. 1610-1617.

187. Reynen К. Frequency of primary tumors of the heart//Am. J. Cardiol. -1996.-V.77.-P. 107-107.

188. Rhodes A.R., Silverman R.A., Harrist T.J., Perez-Atayde A.R. Mucocutaneous lentigines, cardiomucocutaneous myxomas, and multiple blue nevi: the LAMB syndrome//J. Am. Acad. Dermatol. 1984. - V.10. -P. 72-82.

189. Rifai N., Gillette M., Carr S. Protein biomarker discovery and validation: the long and uncertain path to clinical utility//Nature Biotechnol. — 2006. V.24.-P. 971-983.

190. Roberts W.C. Primary and secondary neoplasms of the heart//Am. J. Cardiol. 1997,- V.80. - P. 671-681.

191. Romano M., Romano E., Bjorkemd S., Hurt-Camejo E. Ultrastructural localization of secretory type II phospholipase A2 in atherosclerotic and nonatherosclerotic regions of human arteries//Artherioscler. Thromb. Vase. Biol. 1998. - V.18. - P. 519-525.

192. Roudaut R., Gosse P., Dallocchio M. Rapid growth of a left atrial myxoma shown by echocardiography//Br. Heart J. 1987. - V.58. -P. 413-416.

193. Rubin M.A., Zhou M., Dhanasekaran S.M., Varambally S., Barrette T.R., Sanda M.G., Pienta K.J., Ghosh D., Chinnaiyan A.M. a-methylacyl coenzyme A racemase as a tissue biomarker for prostate cancer//JAMA -2002. V.287. - P. 1662-1670.

194. Salmon K., Decoodt P., Capon A. Detection of left atrial myxoma by systematic transesophageal echocardiography in stroke//Am. Heart J. -1991.-V.122.-P. 580-581.

195. Salyer W.R., Page D.L., Hutchins G.M. The development of cardiac myxomas and papillary endocardial lesions from mural thrombus//Am. Heart J. 1975. - V.89. - P. 4-12.

196. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Second edition Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989.

197. Sankar N.M., Vaidyanatlian R.K., Prasad G.N., Cherian K.M., Butany J. Left atrial myxoma presenting as acute inferior wall infarction — a case report//! Cardiol. Surg. 2006. - V.21. - P. 478-480.

198. Sartipy P., Johansen В., Camejo G., Rosengren В., Bondjcrs G., Hurt-Camejo E. Binding of human phospholipase A2 type II to proteoglycans//! Biol. Chem. 1996. - V.271. - P. 26307-26314.

199. Scott N., Veinot J.P., Chan K.L. Symptoms in cardiac myxoma//Chest -2003. -V. 124. P. 2408-2408.

200. Sencgas-Balas F., Balas D., Verger R., de Caro A., Figarella C., Ferrato

201. F., Lechene P., Bertrand C., Ribet A. Imraunohistochemical localization of intestinal phospholipase A2 in rat Paneth cells//Histochem. 1984. -V.81.-P. 581-584.

202. Silverman J.S., Berrutti L., Dodd L.G., Layfield L.J. Cardiac myxoma immunohistochemistry: value of CD34, CD31 and factor XITIa stain-ing//Diagn. Cytopathol. 1996. - V.15. - P. 455-456.

203. Silverman N.A. Primary cardiac tumors//Ann. Surg. 1980. - V.191. -P. 127-138.

204. Six D.A., Dennis E.A. The expanding superfamily of phospholipase A2 enzymes: classification and characterization//Bioch. Bioph. Acta 2000. -V.1488.-P. 1-19.

205. Skamrov A.V., Nechaenko M.A., Goryunova L.E., Feoktistova E.S., Khaspekov G.L., Kovalevsky D.A., Vinnitsky L.I., Sheremeteva

206. G.F., Bebealashvilli R.Sh. Gene expression analysis to identify mRNA markers of cardiac myxoma//.!. Mol. Cell. Cardiol. 2004. -V.37. - P. 717-733.

207. Spanakis E. Problems related to the interpretation of autoradiographic data on gene expression using common constitutive transcripts as con-trols//Nucleic Acids Res. 1993. - V.21. - P. 3809-3819.

208. Srivastava D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis//Cell 2006. - V.126. - P. 1037-1048.

209. Nagai R., Basson C.T., Veugelers M., McDermott D.A. Mutation of perinatal myosin heavy chain//New Engl. J. Med. 2004. - V.351. -P. 2556-2558.

210. Strutt В., Khalil W., Killinger D. Growth and differentiation of human adipose stromal cells in culture/Human cell culture protocols; Jones G.E. editor. Humana Press, New Jersey, 1996. - P. 41-45.

211. Sugeng L., Sahoo S., Lang R.M. Atypical cardiac myxomas //Echocardiogr. 2004. - V.21. - P. 43-47.

212. Suvarna S.K., Royds J.A. The nature of the cardiac myxoma//Intern. J. Cardiol. 1996. - V.57. - P. 211-216.

213. Symbas P.N., Hatcher C.R., Gravanis M.B. Myxoma of the heart: clinical and experimental observations//Ann. Surg. 1976. - V.183.-P. 470-474.

214. Tanimura A., Kitazono M., Nagayama K., Tanaka S., Kosuga K. Cardiac myxoma: morphologic, histochemical, and tissue culture studies//Hum. Pathol. 1988.-V. 19.-P. 316-322.

215. Tay M.H., Lay K.W., Ding Z.P., Lee C.N. An interesting case of left atrial myxoma//Singapore Med. J. 2002. - V.43. - P 367-368.

216. Thomas A.C., Mills P.G., Gibbs N.M., Davies M.J. Secondary carcinoma of left atrium simulating myxoma//Br. Heart J. 1980. -V.44. - P. 541-544.

217. Vadas P., Pruzanski W., Kim J., Fornasier V. The proinflammatory effect of intra-articular injection of soluble human and venom phospholipase A2//Am. J. Pathol. 1989. - V.134. - P. 807-811.

218. Val-Bernal J.F., Acebo E., Gomez-Roman J.J., Garijo M.F. Anticipated diagnosis of left atrial myxoma following histological investigation of limb embolectomy specimens: a report of two cases//Pathol. Intern. — 2003.-V.53.-P. 489-494.

219. Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein В., Kinzler K.W. Serial analysis of gene expression//Science 1995. - V.270. - P. 484-487.

220. Vidaillet H.J., Seward J.B., Fyke F.E., Su W.P., Tajik A.J. "Syndrome myxoma": a subset of patients with cardiac myxoma associated with pigmented skin lesions, and peripheral, and endocrine neoplasms//Br. Heart J. 1987. - V.57. - P. 247-255.

221. Vricella L.A., Khambadkone S., Yates R., Tsang V.T. Right ventricular inflow obstruction from massive fungal vegetation presenting as neonatal circulatory collapse//Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2003. - V.24. - P. 323-324.

222. Watson M.A., Fleming T.P. Isolation of differentially expressed sequence tags from human breast cancer//Cancer Res. — 1994. V.54. — P. 4598-4602.

223. Watson M.A., Fleming T.P. Mammaglobin, a mammary-specific member of uteroglobin gene family, is overexpressed in human breast cancer//Cancer Res. 1996. - V.56. - P. 860-865.

224. Wilkes D., McDermott D.A., Basson C.T. Clinical phenotypes and molecular genetic mechanisms of Carney complex//Lancet Oncol. — 2005. -V.6.-P. 501-508.

225. Wittmann-Liebold В., Graack H., Pohl T. Two-dimensional gel electrophoresis as tool for proteomics studies in combination with protein identification by mass spectrometry//Proteomics 2006. - V.6. - P. 46884703.

226. Wong S., Ng C., Wan S., Lee T.W., Wan I., Yim A., Arifi A. Giant metastatic myxoid liposarcoma causing cardiac tamponade: a case report//Jpn. J. Clin. Oncol. 2002. - V.32. - P. 480-482.

227. Yamagiwa Y., Marienfeld C., Meng F., Holcik M., Patel T. Translational regulation of X-linked inhibitor of apoptosis protein by interleukin-6: anovel mechanism of tumor cell survival//Cancer Res. 2004. - V.64. -P. 1293-1298.

228. Yamakawa Т., Ohnaka K., Tanaka S., Utsunomiya S., Kamei J., Kadonosono K. Cyclooxygenase-2 induction by lysophosphatidylcholine in cultural rat vascular smooth muscle cells: involvement of the p38MAPK pathway//Biomed. Res. 2008. - V.29. - P. 1-8.

229. Yang G.P., Ross D.T., Kuang W.W., Brown P.O., Weigel R.J. Combining SSH and cDNA microarrays for rapid identification of differentially expressed genes//Nucl. Acids Res. 1999. - V.27. -P. 1517-1523.

230. Yavuz Т., Peker O., Ocal A., Ibrisim E. Left atrial myxoma associated with acute myocardial infarction//Intern. J. Cardiovasc. Imaging -2005.-V.21.-P. 235-238.

231. Yilmaz M.B., Akin Y., Guray U., Kisacik H.L., Korkmaz S. Myocardial infarction as complication of left atrial myxoma//Intern. J. Cardiol. — 2003.-V.87.-P. 303-305.

232. Yokomuro H., Yoshihara K., Watanabe Y., Shiono N., Koyama N., Takanashi Y. The variations in the immunologic features and interleukin-6 levels for the surgical treatment of cardiac myxomas//Surg. Today -2007. V.37. - P. 750-753.

233. Yoon D.H., Roberts W.C. Sex distribution in cardiac myxomas//Am. J. Cardiol. 2002. - V.90. - P. 563-565.

234. Yoshikawa Т., Namse S., Kitagawa M., Ishiguro H., Nagahama M., Yasuda E., Semba R., Tanaka M., Nomura K., Hayakawa T. Cellular localization of group IIA phospholipase A2 in rats//J. Histochem. Cyto-chem. 2001. - V.49. - P. 777-782.290.