Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и исследование функциональных свойств фосфолипаз А2 из митохондрий и тромбоцитов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и исследование функциональных свойств фосфолипаз А2 из митохондрий и тромбоцитов"

„ V

^ л

„ 'Ъ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ-УЗБЕКИСТАН

ч -

ИНСТИТУТ Биохимии

На правах рукописи УДК: 577.152.3.31.616.005.4 МУРАТОВА Умида Замановна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ФОСФОЛИПАЗ А2 ИЗ МИТОХОНДРИЙ И ТРОМБОЦИТОВ

03.00.04 — Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

ТАШКЕНТ — 1994

Работа выполнена в Институте биохимии АН РУз.

Научный консультант: член-корреспондент АН РУз

Т. С. СААТОВ

Официальные оппоненты: академик АН РУз

А. Г. ХОЛМУРАДОВ

доктор биологических наук, профессор О. О. АБИДОВ

доктор биологических наук Ш. И. САЛИХОВ

Ведущая организация — Институт физиологии АН РУз.

Защита диссертации состоится « I? » >' 199 Ь г.

в часов на заседании специализированного совета

Д 015.16.21 в Институте биохимии АН РУз по адресу: 700143, г. Ташкент, улица проф. X. Абдуллаева, 56.

Автореферат разослан « »^гЛ^&р-З 193Уг.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН РУз.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

7л

С. А. БУРХАНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБ07Н

Актуальность проблемы. Фосфолипазная .^активность - была-об------------

наружена~пряктнческн~в1)~ё~сех клетках организма. Внутриклеточные фосфолипазы играют важную роль в метаболизме фосфодшшдоз. В норме основная их функция заключается п обновлении жирно-кислотного состава фосфолипидов, в соответствии с требованиями клетки в тех или иных физиологических условиях. При патологических состояниях эти ферменты активно вовлекаются как в компенсаторные, так и в деструктивные процессы, протекающие в клетке в ответ на повреждающие факторы.

В района исследованы фоефолипазные А^ активности в шггохонд-риях печени крысы и в тромбоцитах крови человека. Интерес к этим ферментам обусловлен тем, что функционирование митохонпрнального фермента отражается на работе важнейшей энергетической системы клетки. Имеющиеся в литературе данные показывает, что в митохондриях при определенных патологических состояниях, приводящих к истощении запасов АТ5, увеличивается поток ионов Са . Повышение уровня свободного Са^+ вызывает активации фосфолипазы А^ которая гидрояизует эндогенные фосфолипиды, что в свои очередь приводит к увеличение протонной проницаемости внутренней мембраны митохондрий и к потере окислительно-фосфорилирупцих свойств митохондрий.

В тромбоцитах крови человека этот фермент регулирует выделение арахидоновой кислоты и биосинтез эйкозаноидов, участвуя тем самым в процессах тромбогенеза. Установлено, что при патологических ситуациях, таких как ишемическая болезнь сердца, атеросклероз и других заболеваниях, увеличивается уровень эндоперок-сидов и тромбоксанов, предшественником которых является арахидо-Нозая кислота.

Несмотря на.актуальность проблемы, имеются немногочисленные сведения в этой области, что связано прежде всего с трудностью выделения и очистки данных ферментов, а также с нестабильность?; очищенного ферментного препарата. В связи с этим, необходимым этапом работы была разработка условий очистки и стабилизации ферментов.

Экспериментальные данные по определенно молекулярной пассы ферментов, р11-оптимума, чувствительности к ионам и другим катионам, субстратной специфичности отличаются не только п зави-

2 ! симости от степени чистоты ферментного препарата, но также от условий инкубации, методов тестирования фосфолипазной активности, ■ от использованных субстратов и других добавок, влияющих на протекание реакций. Подобные исследования являются научной основой для выяснения механизмов развития патологических процессов, позволяет выявить коррегирующее действие различных активаторов и ингибито -ров данных реакций с целью профилактики и лечения сердечно-сосу -дистых и других заболеваний.

Тематика диссертационной работы определялась планами важней -ших работ Института и выполнялась в рамках Общесоюзной научно-технической программы: 0.69,01.02.04.Н."Исследование механизмов взаимодействия липосом с форменными элементами крови с целью профилактики внутрисосудистых осложнений атеросклероза и ИБС? № Гос. регистрации 0.86.0009537.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методов выделения и очистки фосфолипаз А^ из митохондрий и тромбоцитов, исследование свойств ферментов как в интактном, иммобилизованном виде, так и в очищенной (свободной) форме.

В соответствии с .поставленной целью были определены следующие основные задачи:

1. Разработать-способы выделения и очистки фосфолипаз А^ из митохондрий печени крысы и тромбоцитов крови человека.

2. Исследовать свойства иммобилизованных и очищенных ферментов.

3. Изучить функциональную роль фосфолипаз в метаболизме клетки.

4. Разработать способы диагностики ИБС на основании полученных результатов. '

' Научная новизна работы. Впервые разработаны способы получения высоноочищенных препаратов фосфолипаз А<> из митохондрий и тромбоцитов на основе использованного биоспецифического адсорбента, где лнгандом служил один из оптимальных субстратов фосфолипаз- фосфа-тидидэтаноламин. .

В результате этих экспериментов получены высокоочищенные фер-ыенты, обладающие высокой удельной активностью и отличающиеся специфичностью к отдельным субстратам.

Исследованы свойства Очищенных ферментов. Очищенные фосфолипа-зы А^ обладали низкой стабильностью. В связи с этим разработаны

условия стабилизации ферментов путем их иммобилизации на биоспецифическом сорбенте. ____________ ______________________________________

-------Изучен механизм - регуляции ферментов. При использовании

селективных ингибиторов кальмоцулина показано, что эффекты ионов

опосредуется кальмодулином. При этом было обнаружено, чтог ферменты взаимодействует с кальмодулином в отсутствии ионов Са^+. Таким образом, первой стадией в механизме - регуляции' явля-

ется образование комплекса кальмодулин-фермент, последующее присоединение ионов Са**+ приводит к образованно активной формы фермента.

Установлено, что фосфолипазы проявляют избирательность не только к классу фосфолипида, но и к жирнокислотному составу молекулы гидролизуемого субстрата.

В результате исследования свойств очищенного митохондриаль-ного фермента выявлено, что этот препарат обладает трансацилазной активностью. Только очищенный фермент с высокой удельной активностью катализировал реакции обмена ацильных радикалов. Несмотря на то, что эти реакции были энергонезависимы, СоА-производные жирных кислот также служили хорошим субстратом как и свободные жирные кислоты. Исследованы условия протекания этих реакций.

Впервые при исследовании субстратной специфичности тромбоци-тарной фосфолипазы в норме и при ишемической болезни сердца было обнаружено,изменение пула свободного арахидоната. При ИБС усиливается гидролиз фосфатидилхолина.

На основании результатов исследования активности фосфолипазы в интактных тромбоцитах крови человека в норме и у больных ИБО разработан способ диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, •который может быть внедрен в_ клиническую практику.

Результаты проведенного исследования могут являться основой для развития перспективного научного направления - исследования регуляции фосфолипазной активности в клетках, с целью предотвращения и коррекции патологических процессов, приводящих к деструкции мембран и клетки в целом.

Основные положения, выносимые на защиту .

Среди основных результатов, выносящихся на защиту, следует выделить:

I. Метода выделения и очистки фосфолипаэ А^ из митохондрий печени крысы..и тромбоцитов человека.

2. Разработка способа стабилизации ферментов.

3. Исследование механизма Са - регуляции очищенных фосфолипаз

' а2,

4. Изучение специфичности ферментов к классу фосфолипида.

5. Выявление чувствительности фосфолипаз А^ к ацильному радикалу субстрата.

6. Экспериментальное исследование реакций трансацилнрования.

7. Разработка способа диагностики ИБС.

Теоретическая и практическая ценность. Основные результаты настоящей работы позволяют выявить новые стороны в механизме Са^+ - регуляции фосфолипазной А^ активности, оказывающей влияние на физиологические процессы, происходящие в клетке. Использованные в работе подходы к выделение и очистке фосфолипаз А£ из митохондрий и тромбоцитов могут служить в научно-исследовательской практике для последующих разработок методов очистки мембраносвя-занных фосфолипаз из других источников к других белковых компонентов биологических мембран.

Разработанные способы стабилизации фосфолипаз могут быть использованы для стабилизации различных ассоциированных с мембраной ферментов и белков, для стабилизации которых необходимо гидрофобное окружение. Кроме того, с помощью этого метода можно моделировать в эксперименте условия Сп уС^о , когда белковые полимеры находятся в связанном с фосфолипидами мембран состоянии.

Обнаружение субстрат-специфичных форм фосфолипаз вносит существенный вклад в классическую энэимологию, в понимание механизмов катализа на границе раздела фаз, в определение физиологической роли тех или иных фосфолипидов и их ац^льных радикалов в функционировании мембранных структур. Эти исследования создают необходимую основу для разработок методов коррекции уровня свободных жирных кислот и лизосоединений в митохондриях и тромбоцитах, что в свою очередь приводит к ингибированию процесса тромбогенеза.

Исследования Са*"+ - регуляции фосфолипаз является важным этапом работы. Прежде всего эти исследования расширяют понимание.механизмов модулирования активности мембраносвязанных фосфолипаз А^ ионами Са^+, уровень которых изменяется в органеллах и в клетках при различных условиях. Установлено, что эффекты ионов опосредованы кальмодулином. На основе исследований кальмодулиновой регуляции ферментов выявлены специфические ингибиторы фосфолипаз-

антагонисты кальмодулина. Ингибиторы кальмодулина могут бить рекомендованы и внедрены в лечебную практику в качестве фармаген -тов для коррекций-функционального состояния клетки при патологических условиях.

Изучение транеацилаэных реакций, катализируемых высокоочи-щенным препаратом митохондриальной фосфолипаэы Ag вносит вклад в фундаментальную науку о метаболизме фосфолипидов в клетке.' Эти эксперименты подтверждает наличие энергонезависимых, обратимых реакций обмена ацильных радикалов и свидетельствуют о тесной взаимосвязи процессов гидролиза и обмена ацильных групп в молекулах фосфоглицеридов, Обнаруженное свойство очищенного иитохондриаль-ного препарата катализировать обмен жирнокислотных радикалов может быть использовано для синтеза новых фосфолипидов.

Исследование активности фосфолипаз в интактных тромбоцитах и изменение соотношения активностей различных субстрат-специфичных форм фермента в норме и при патологии лежат в основе разработок ранней диагностики различных заболеваний и, в частности, ИБС.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены и доложены на: II Всесоюзной симпозиуме "Липиды биологических мемб ■ ран"(Ташкент, i960), III Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1981), 1У Всесоозном симпозиуме по биохимии липидов (Киев, 1983), III Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Ташкент, 1983), Всесоозном симпозиуме "Молекулярные механизмы регуляции энергии" (Пущино, 1984), I Конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1986), 18 Конференции FB&3 (Любляна, 1987), XII Всесоозном совещании по транспортным АТФазам (Иркутск, 1987), Всесоозном сии-позйуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1907), У1 Всесоозном иимпо • .зиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных процессов" (Петрозаводск, 1986), 35 Международной конференции по биохимии липидов (Абердин, 1994).

Публикация работ

По материалам диссертации опубликовано '¿5 научных работ. Подучено 3 авторских свидетельства.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и обсуждения (3 главы), описания материалов и методов исследования,

выводов, списка литературы, вклсчасщего 323 наименования. Объем диссертации £S*S> страница машинописного текста. Рисунков 54, таблиц 12.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы: бычий сывороточный альбумин (Koch -Light , Англия), трипсин (Sppfa , Чехословакия), рибонуклеаэа ( Fíuka, Швейцария), цитохром С тип III ( Sty та , США), тритон Х-ЮО (Shüchcrtd , ФРГ), додецилсульфат натрия (СоСо* бъоос ßcce кд , Англия), глутаровый альдегид (meteк', ФРГ), этаноламин (Сосзхимреактив), который дополнительно перегоняли, полиамид ( WceCm , ФРГ), жидкий сцинтиллятор JKC-8, кальмодулин (S/рта , США), глицин три'сгидроксиметиламинометан ( Rea na t , Венгрия), I-3-фосфатидилэтаноламин, 1-пальмитоил-2-(1-^С)-линолевая кислота, с удельной радиоактивностью 56 мкКи/мМ, I-3-фосфатицилэтано-ламин, 1-ацил-2-(1-^'Ч;)-арахидоновая кислота, с удельной радиоак-THBHocTbD 59 мкКи/мМ, I-3-фосфатидилхолин, 1-пальмитоил-2-(1-*4С)-олеиновая кислота, с удельной радиоактивностьи 57 мкКи/мМ, 1-3-фосфатидилхолин, 1-стеароил-2( 5,6,8,9,11,12,14,15-%)-арахидоно-вая кислота, с удельной радиоактивностьо 21 Ки/мМ (ú/ne7.sham t Англия) -арахидоновая кислота (fnstitute of Jsetops f Венг-

рия), / С/-жирные кислоты ("Изотоп", СССР). Неорганические соли высокой квалификации (ХЧ и ОСЧ) дополнительной очистке не подвергались. Органические растворители перед использованием очищали и перегоняли.

Определение активности фосфолипазы ко. Фосфолипазнуо активность определяли методом потенциометри^еского титрования (Гарцу-кас P.C. и др., 1978), а также использовали метод (van den ßosch

et о.í. '» 1974) с небольшой модификацией, заключавшейся в том, что гептановуо фазу (0,8 мл) отбирали и пропускали через микроколонки с силикагелем (100 мг), изготовленные из Пастеровских пипеток. Колонки промывали гептаном (0,8 мл) и объединенные элюаты помещали в флаконы с цинтилляционной жидкостью, подсчет радиоактивности производили на счетчике " Rack Beta. . , Швеция . Эта дополнительная процедура позволяет избавиться от остатков не-прореагировавшего-субстрата.

Плазму, обогащеннуо тромбоцитами и осадок тромбоцитов получали из крови человека дифференциальным центрифугированием, используя в

качестве консерванта цитратный буфер 7,5 мМ, рН-7,4 ( ß it tehhOuS Sv^A/>i£)., 1978).

Белок определяли пометоду,JLowVf ~j (1951)/

---------Экстракцию'липидов проводили по методу Fc£ck ei at- (1957).

Фосфор фракций фосфолипидов определяли после минерализации по методу t/askoisityv.E.ef аЛ. (1975). Статистические результаты обрабатывались методом оценки достоверности разности по критерии Стыодента (Ойвин И.А., i960).

Митохондрии выделяли дифференциальным центрифугированием по методу ( w<xi te m.p.*ol S'issonß, 1971). Ряд субстратов синтезирован по т uCUtrudai. {1961), фосфолипида виделени по €ton eta.t.

(1975).

Чистоту фракций с фосфолипазной активностью и определение молекулярной массы ферментов, полученных после аффинной колонки, исследовали с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата-л^-

( ¿ftemwfju, 1970).

Аффинный сорбент получали по методу Ахмеджанов Р. и др. "(1981).

РЕЗУЛЬТАТА ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение я очистка фосфолипаз ко из митохондрий печени крысы и тромбоцитов крови человека. Первый этап очистки ферментов - со-любилизация является ответственной стадией при выделении мембрано-связанного белка. В начале наших экспериментов по очистке мито-хондриальной фосфолипазы А^ мы использовали ту же процедуру coÄn-билизации, что была описана в работе ( f 1971). Затем этот

способ был существенно упрощен так, что стация делипидиэации аммиачным ацетоном и ступенчатого сульфатного осаждения была успешно заменена экстракцией мембран митохондрий I М КСС , При этом экстрагировалась практически: вся фосфолипазная активность.

При последующей хроматографии на аффинном сорбенте были получены сходные результаты. '

Предварительная процедура солюбилиэации фосфолипазы А^ из тромбоцитов также включала экстракцию I U ксс , поскольку другие испи-танпые нами способы экстракции были менее эффективны. Увеличение концентрации KCL не приводили к дополнительной экстракции ферментов. Полученные суспензии подвергали ультразвуковой обработке.

Оба фермента как фосфолипаэа из митохондрий, так и фосфолипаэа из тромбоцитов проявляли высокое сродстпо к иммобилизованному ли-ганду - фосфатидилэтаноламину, аффинного сорбента. Связывание фер-

ментов происходило при рН 9,0 в глициновом буфере (0,05 М).

Два пика'активности митохондриального фермента было получено при хроматоргафии на аффинном носителе при действии градиента рН (9,5-5,0) и градиента концентрации тритона Х-100 (0-0,1 %). Для дальнейщих исследований свойств очищенной фосфолипазы использовали первую фракцию, свободную от детергента,

В отличие от митохондриального фермента, фосфолипазная активность из тромбоцитов элюировалась более эффективно при действии Дох- А/а (0-6 мМ). При этом наблюдалось появление двух пиков активности, что, по-видимому, свидетельствует в пользу наличия двух субстрат-специфичных форм фосфолипазы к^. В своей работе ( Кчатеп , 1986) не смогли полностью разделить эти формы фермента путем гельфильтрацик, ультрацентрифугирования и хроматографии на /-АЭ-целлолозе. В табл. I и 2 суммировании данные по очистке, выходу ферментативной активности и белка фосфолипазы Ag из митохондрий и тромбоцитов.

Таблица I

Очистка фосфолипазы А^ из митохондрий печени крысы

Стадии очистки ------------ — ; Белок, , ' мг ! j Удельная ¡актив., ¡о д/мг ¡Общая активность, i ед. -¡Степень j очистки, i Раз •Выход, т /о i

I. Суспензия в- 4300 1,5 7525 I 100

2. Осаждение аце- 720 ' 8,3 6020 4,9 80

тоном •

3, Аффинная хро -

матогрофия -

I фракция 2,6 608 ' 1570 347 20

11 фракция- 5,7 727 4150 416 55

Как видно, свободная от детергента митохондриальная фосфоли-паза была очищена более, чем в 300 раз. Первый - активный пик тронбоцитарной фосфолипазы очищен в 768- и второй - 2200 раз.

Так же как и 'э случае с митохонцриальной фосфолйпазой, имеют- . ся немногочисленные публикации, связанные с выделением и очисткой тромбоцитарного. фермента. В гомогенном виде фермент был получен только из тромбоцитов крысы. В отношении же митохондриального фермента уже после наших экспериментов, был получен достаточно гомогенный фермент ( йаитап М. е1 лЛ. г 1989). Секвенировяние

—------ !Бедок ! Фоефолипазная активность _ !

ТС^иДИАи%б^б0ТКИ \йе°Л ! * * -г 0йщей|^ельналть) |

! | |нмоль/мин на |

, I ¡иг белка ;

Гомогенизация 100 100 0,04 _

Ультразвук, 27 162 0,24 . 6

экстракция

Аффинная

хроматография

I фракция 0,035 26,8 30,7 768

П фракция 0,03 66,0 88,0 2200

л''-конца очищенных ферментов позволило авторам.показать почти 100 % гомологию митохондриальной фосфолипазы с ферментом из тромбоцитов крысы, за исключением л/ -концевой аминокислоты.

В наших экспериментах фермент из митохондрий, элюируеиый градиентом рН, имел молекулярную массу - 15,000 дальтон (рис.. I). При сравнении наших данных с результатами других авторов било обнаружено, что кроме основной полосы наш препарат содержал еще высокомолекулярный компонент, примесь которого составила.не более I %. В работе ( ХШО. е* а1. , 1902) присутствует помин.;

основной полосы, низкомолекулярний компонент. Возможно, что атс, г факт послужит в дальнейшем объяснением вопроса о стабильности мента. Так как фермент, выделенный нами, был весьма не стабил! также как в работе ( \л/м<'Ье т.ё1 оА. , 1971). Тогда как в исслеао-ваниях (А^-ЬЯ/У., гЬ а1. , 1983; ил'.гЬп 7. , 1902) выцельыи.н 'фермент был стабинен. По-видимому, существую1!' какие-то тесно сь» занные с ферментом белковые модуляторы, исследование которых ецо предстоит в будущем.

Анализ высокоочищенных фракций с фосфолипазной активностью из тромбоцитов человека гель-электрофорезом в присутствии цодецил сульфата- показал, что они имеи* блнышо молекулу >иа массы-13,5 и 15 кД соответственно (рис. I). Эти эксперименты ноцгйер*-дают результаты работы { Уе.яъ А.1. и( , Хуту), с,>гл!..и. ¡¡.¡ть рым молекулярная масса изолированной фосфолипазы А^ тромеош,1.,ь била 15 кД, но отличаются от данных других авторов (7а < ь..к

'ftic.I. Электрофорез фракций с фосфоли-пазной Aj> активностью в присутствии ДДС-//а

1 - I фракция из тромбоцитов

2 - II фракция из тромбоцитов

3 - фосфолипаза Ag из митохондрий -/3 ® качестве маркеров были исполь-

' эованы: Цитохром-С-12,5 кД, Инги-^ битор трипсина-21,5 кД, овальбу -мин-43,5 кД, БСА - 68 кД J^-I^OkD • 2 -

1979; «влпйд/ fL.etat, -1980, Mcniy с те R. ¿1 а£ , 1987). Отме-ченше выше различия в оценке молекулярных масс очищенных ферментов, по-видимому, могут быть обусловлены различной степенью очистки ферментного препарата, видовой специфичностью или же наличием субстрат-специфичных форм фермента.

Таким образом, на основании полученных результатов по выделению и очистке фосфолипаз Ag из митохондрий и тромбоцитов можно заключить, что использование аффинного сорбента, содержащего в . качестве лиганда оптимальный субстрат, является наиболее эффективным способом, который позволяет не только получить высокоочищен-ные фосфолипазы, но и разделить их субстрат-специфичные формы.

Свойства фосфолипаз Ag. При исследовании активности очищенных ферментов от концентрации белка в присутствии добавок бычьего сывороточного альбумина (БСА) было показано, что БСА выпрямляет кривые зависимости от концентрации бе^ка, связывая свободные жирные кислоты-, которые действуют как ингибиторы фосфолипаз.

Изучение pH-оптимума ферментов показало, что оба фермента относятся к щелочным фосфолипазам. Причем, сырые ферментные препараты (стадия экстракции) имели более широкий диапазон активности, чем фосфолипазы, полученные после аффинной хроматографии. Обнаруженное можно объяснить наличием различных форм ферментов, которые в процессе очистки удалось разделить.

С целью стабилизации ферментов после очистки использовали метод иммобилизации на аффинном сорбенте, который оказался не только наиболее эффективным, но может быть использован как инструмент

для характеристики фермент-субстратного взаимодействия. На рис. 2 представлены результаты по стабилизации очищенных ферментов, liait -видно-,-фопфол1тпаоа~из"трс«боцитов""ч"ел"о"вёка""лучше сохраняет cbod активность при использовании данного способа. При десорбции иммобилизованных ферментов наблюдалось незначительное отщепчен'ге мирных кислот, однако количество связанного фермента после повторного использования сорбента не изменялось. По-видимому, комплекс фосфо-

й%

во 60

20

-р—q.

\

-.1-1-1-1-/ /-!-1-----

5" >0 15 2 0 ЦО çy m пи

Рис. 2. Стабилизация ферментов на биоспецифическом адсорбенте при 4° С Фосфолипаза из митохондрий - о §оефолипаза из тромбоцитов - а

липаза-фосфолипид образуется не только с исходным лигандом.но и с ер о лизопроизводныы. Возможно, что аналогичная картина имеет место в мембранах, где набло'дается низкая подвижность молекул фер-• мента. При взаимодействии фосфолипаз с аффинным сорбентом основная доля приходится на гидрофобные связи и, по-видимому, стабилизация фермента объясняется отсутствием затраты свободной анергии, обус-ловлешой потерей поступательной и вращательной энтропии ферментной глобулы при ее адсорбции. Сама же процедура сорбции и десорбции фосфолипазы с биоспецифического сорбента может рассматриваться как один из возможных механизмов модуляции активности моибранно-связанных ферментов, 2+

Са -регуляция фосфолипаз Ао. Одним из основных регуляторов

активности фосфолипаз к^ из тромбоцитов человека и митохондрий печени крысы являются ионы Са. Целый ряд процессов, таких как секреция (гормонов, нейромедиаторов и др.), изменение формы и подвижности клеток, движение хромосом и др. сопровождается изменением концентрации ионов Са^+. Поскольку фосфолипазы А2 из митохондрий и тромбоцитов проявляют высокую чувствительность к ионам Са^+ как в наших исследованиях, так и по данным литературы

, 1971; :7ехе/?,Р . еЬ аС. , 1979), возникает вопрос каким образом осуществляется регуляция активности ферментов. Так, фосфолипазы ядов змей и фермент из панкреатической железы могут прямо регулироваться ионами Са^+. Более спорным остается вопрос по отношению к внутриклеточным фосфолипазам.

Наиболее широко распространенным и обладающим наибольшим числом функций посредником в действии ионов Са^+ на клетку является кальмодулин (КМ, мгМ-16,5, ИЭТ-4,0). В связи с этим нами были изучены действие ионов Са ; кальмодулина и его антагониста хлор-•промазина на активность фосфолипаз

Известно, что концентрация ионов Са^+ при стимуляции тромбоцитов индукторами агрегации увеличивается в 3-10 раз. Нами было обнаружено увеличение активности фосфолипазы А^ в стимулированных тромбоцитах больных ишемической болезнью сердца (ИБС), которая в 3-4 раза превышала активность фермента в нормальны* тромбоцитах у доноров (рйс,-3).

Рис.3. Активность фосфолипазы Аг> в тромбоцитах челове-■ ка в норме и при середечно-сосудистой патологии. Субстрат- 2. -3-фосфатидил-этаноламин, 1-ацил-2-(1 -^С)-линолевая кислота

норма. НБС инФаркг миокарда

В тромбоцитах больных инфарктом миокарда активность фосфоли-пазы увеличивалась на порядок. Учитывая тот факт, что развитие -------тромбогенеза сопровождается иэмененйЖи в"составе основных классов фосфолипидов, обнаруженное изменение активности фосфолипазы Аз является важным показателем функционального состояния тромбоцитов. В медицинской практике этот показатель может служить тестом для диагностики тромбогенеза.

Из данных (рис. 4) следует, что гидролиз фосфатидилэтанолами-на, этерифицированного линолевой кислотой во 2-й позиции тромбоцитами доноров зависит от ионов Са^+. В то же время гидролиз этого фосфолипида в тромбоцитах больных ИБС не зависет от экзогенного Са^+, что, возможно, объясняется эффектом насыщения при высоком уровне свободного Са^+ в цитоплазме. Гидролиз экзогенного фосфатидилэтаноламина, 1-ацил-2-(1-^С)арахидонат зависит от добавок ионов Са^+ как в норме, так и при ИБС. По-видимому, этери-фицированный во 2-й позиции арахидонат является более предпочтительным субстратом и освобождений его в зависимости от концентрации ионов Са^+ имеет более широкий диапазон. Как показали наши исследования, при ЙБС гидролиз фосфатидилэтаноламина, этерифицированного арахидонатом преобладает над гидролизом фосфатидилэтаноламина, содержащего линолевую кислоту.

Гидролиз фосфатидилхолина, этерифицированного арахидонатом также был чувствителен к экзогенной добавке ионов Са*"+.как в норме, так и при ИБС (рис. 5). Кроме того,- гидролиз этого субстрата при ИБС превышал расщепление фосфатидилхолина, этерифицированного олеатом и превышал гидролиз фосфатидилэтаноламина, содержащего арахидонат.

"Наши данные свидетельствуют о тем, что при ИБС усиливается гидролиз фосфолипидов, содержащих арахидоновую кислоту, причем предпочтительному гидролизу подвергаются фосфатидилхолины, этери-фицированные арахидоновой кислотой во 2-й позиции.

В дополнение к этим экспериментам мы провели исследования по влиянию таких индукторов агрегации как АДР и тромбин. Обнаружено, что АДР (10~5 М) оказывал влияние на актинность фосфолипазы тромбоцитов только в присутствии ионов Са*"+ (I мМ) в среде инкубации. Тромбин (20 ед) в отсутствии добавки Са^+ стимулировал активность фермента в тромбоцитах в 2-3 раза. Эта активность увеличивалась на порядок при добавлении I мМ Са^". Эти эксперименты указывает на то, что как АДР, так и тромбин оказывают свое действие черва

Сз

£0

сз

ч

о

а,

о

я

с-,

л I

^

о

о

ж

и

к

ь

■ё

г1-

1-1

ь

К Са а К СаИ+Г

■Норма

ИБС

норма

Г'1

г1-

К Са^ К Са2+(1м М>

ИБС

Рис.4. Эффективность гидролиза фосфатидилэганоламинов фосфолипазой тромбоцитов человека в норме и при ИБС

а) Фосфатидилэтаноламин, этерифицированный ли-нолевой кислотой . б) Фосфатидилэтаноламин, этерифицированный ара-хидоновой кислотой

№ «о

ш

«О

к

2

о, «

£ Ь

Л &<

О

о ж

ё 1

ы

10

г1-

К Са 'Норма

2+

К Са2+ ИБС

К Са2+ норма

к Са2+(Ш) ИБС

а

б

2

А Рис.5. Эффективность гидролиза фосфатидилхолинов фосфолипаэой А<р интактных тромбоцитов доноров и'больных ИБС

а) Фосфатидилхолин, »тарифицированный олватои

б) Фосфатидилхолин, этерифицированный арахидо-новой кислотой

Са-транспортирующую систему, однако, стимулирующее действие тромбина может осуществляться и в отсутствии работы потенциалзависи-мых Са - каналов плазматической мембраны, тогда как при действии АДР, вклад этой системы существенней.

Исследование экзогенных добавок ионов КМ и хлорпромази-

на-антагониста 1Ш на интактных тромбоцитах показали, что хлорпро-мазин (0,8 мкМ) более чем на 60 % подавляет активность фосфолипа-эы А^ в тромбоцитах больных ИБС и на 33 % в тромбоцитах доноров. Предполагалось, что поскольку высокие концентрации фенотиазинов и их аналогов (психотропные соединения, обладающие также выраженной антиаритмической активностью) не оказывали действия на активность липоксигенпэы и циклооксигеназы, их эффекты реализовывались на уровне высвобождения арахидоната. Полученные нами данные позволяют считать, что ингибирование процесса агрегации тромбоцитов фенотиазинами происходит путем подавления активности фосфолипазы Аг.

1ем не менее слабый аддитивный характер стимулирования активности фосфолипазы А^ КМ и ионами Са^+ в тромбоцитах доноров предполагает и другие механизмы. В частности, действие фенотиазинов может быть опосредовано через Са ^"-транспортирующую систему, регулирующую уровень цитоплааматического Са^+. В этом случае ан -тагонисты КМ, оказывая влияние на Са**+-каналы, также могут рёали-зовывать свое действие на активность эндогенной фосфолипазы А^. В связи с этим остается 'открытым вопрос о наличие зависимости активности фосфолипаз от КМ, по крайней мере, в случае интактных клеток. Поэтому нами были проведены исследования на очищенных ферментах. .

Для стимуляции активности очищенной фосфолипазы тромбоцитов требовалось достаточно высокая концентрация ионов Са + (5 мМ и более). Чувствительность фермента к более низким концентрациям ионов Са^+ была обеспечена добавками КМ (5 мкМ, рис. 6). Причем, присутствие ЭГТА (1мМ) в бескальциевой среде инкубации снижало, но не исключало -КМ-стнмуляцис фермента , что указывает на возможность образования активного комплекса Е-КМ в отсутствии ионов Са2+.

■Подавление активности очищенной фосфолипазы наблюдалось при действии низких концентраций хлорпромазина (рис. 7). При концентрации хлорпромазина 2,4 мкМ активность очищенной фосфолипазы тром-

1__I_I-1- £

О, В 1

Рис.6. Зависимость активности фосфолипазы А^ из митохондрий и тромбоцитов от концентрации кальмодулина X - фосфолипаза из тромбоцитов. В качестве субстрата использован ¿. -З-фосфатидилхолин-1-стеароил-2-(5,6,8,9,II,12,14,15~%)арахидонил. 2 - фосфолипаза митрхондрий. В качестве субстрата использован I- З-фосфатидилэтаноламин-1-ацил-2-(1-*^С)арахидонил. Приведены.средние данные трех опытов.

боцитов снижалась на 50 %. Следовательно, эти результаты говорят о возможности подавления процессов агрегации тромбоцитов на уровне ингибирования активности фосфолипазы А£. Обнаруженное взаимодействие КМ с ферментом в бескальциевой среде в присутствии ЭГТА вносит дополнение в механизмы модуляции активности фермента КМ.

Хотя давно установленным фактом является высокая чувствительность митохондриальной фосфолипазы к ионам Са^+, остается иного вопросов относительно регуляции этой системы. Предполагалось, что стимуляция активности фосфолипазы накопленным в митохондриях Са^+ .осуществляется при участии КМ, так как трифтазин и дибукаин-анта-гонисты КМ подавляли стимулированный л/ а+ выход иа орга-нелл. Из рис. б видно, что гидролиз меченного субстрата фосфоли-пазой к% митохондрий стимулируется КМ {1,6 х 10 ^ М), следовательно', митохоидриальная фосфолипаза более чувствительна к действию КМ, чем фосфолипаза тромбоцитов.

При действии хлорпромазина (2,4 мкМ) активность митохондриальной фосфолипазы полностью подавлялась, тогда как активность фермента из тромбоцитов ингибировалась на 50 % (рис. 7). На основании наших данных можно заключить, что оба фермента является

о,8 ^в *

Рис.7. Ингибиругацее действие хлорпромазина на активность

фосфолипазы из тромбоцитов и ив митохондрий

1 - фосфолипаза из тромбоцитов, в качестве суб-

страта использован /- -З-фосфатидилхолин-1-2 -(5,6,8,9,11,12,14,15-%)арахидонил.

2 - фосфолипаза А^ митохондрий, в качестве субстра-

та использован ¿. -З-фосфатидилхолин-1-пальми -тоил-2-(1-^С)олеоил.

Приведены средние значения четырех опытов.

КМ-зависимыми, хотя нельзя исюшчить возможность того, что антагонисты КМ могут оказывать свое действие через модификацию поверхности субстрата или же посредством неспецифической блокады гидрофобного участка молекулы фермента, отвечающей за связывание с субстратом.

• Кроме экспериментов с внутриклеточными ферментами мы провели опыты с фосфолипазами ядов змей и обнаружили, что КМ (1-5 мкМ) в 2-3 раза стимулировал активность ферментов. .Тогда как для адекватной стимуляции требовались концентрации ионов Са**+ порядка 5 ыМ. и более. Среди фосфолипаэ. змеиных ядов наиболее чувствительной к Действию ингибитора КМ-хлорпромазина оказалась фосфолипаза яда эфы (IX)од-ЮО мкМ). Учитывая предположение о происхождении фосфолипаз (ядовитых секретов из внутриклеточных форм фермента), логичным представляется возможность прямой модуляции активности фосфолипаэ ядов внутриклеточными регуляторами типа КМ, цАМР, простагландинами и др.

Таким образом, суммируя полученные данные можно заключить, что первым этапом КМ-регуляции исследованных фосфолипаз является образование комплекса КМ-Е.

Субстратная специфичность фосфолипаз ко. При исследовании субстратной специфичности полученных нами после очистки фосфоли-

пазы А2 из тромбоцитов было установлено, что фракция I специфична к фосфатидилхолину, тогда как предпочтительным субстратом для второй фракции является фосфатидилэт.аноламин (рис. 8). '

Следовательно, в отличие от данных ( <ъа теп Д, />7.е/«/., 1986) использование нами аффинного сорбента позволило полностью разделить две формы фермента. В использованных условиях эксперимента обе фракции были чувствительны к ионам Са , что не согласуется с данными выше упомянутых авторов, в работе которых высокие дозы Са^+ не оказывали стимулирующего действия на фосфатидил-етаноламинспецифичнуп форму фермента.

В исследованиях количественного распределения арагидоновой кислоты в различных классах фосфолипидов тромбоцитов человека ( Кчапр.'г 1986; а&и 4 оиС , 1985) покавано,

что наибольшее количество арахидоната, этерифицированного во второй позиции, содержится в фосфатидилиноэитоле. Однако, авторы етих работ обнаружили, что 1,2-диацил-фосфатидилэтаноламин и 1,2-диацил-фосфатидилхолин, содержащие арахидоновую кислоту, являстся основными фосфолипидными пулами в образовании арахидоната при активации фосфолипазы Ад.

1С

12 12 Рис.8. Субстратная специфичность, очищенных фракций фосфолипазы из тромбоцитов человека

а) субстрат- к -3-фэсфатидилэтаноламин,

1-ацил-2-(1-14С)-арахидоновая кислота

б) субстрат- С -З-фосфатидилхолин, 1-стеароил-

2- (5,6,8,9, II, 12,14,15-%) -арахицоновая кислота

1-1 фракция, 2 - П фракция

Представляет существенный интерес выяснение вопроса какой жирнокислотный состав фосфолипида обеспечивает его предпочтительный гидролиз. Дня этого использовали фосфолипиды с различными

жирнокислотными радикалами во второй позиции. При этом мы обнаружили, что эффективность гидролиза уменьшается в ряду: арахидоно-вая кислота линолевая кислота олеиновая кислота (табл. 3). Эти данные согласуются с другими ( Ltamet R.M.etoA, 1986), где показана специфичность фермента к фосфолипидам, содержащим ара-хидонат во второй позиции.

Выяснение субстратной специфичности митохондриальной фосфолипазы необходимо для понимания процессов деградации, происходящих в поврежденных митохондриях. Нарушение окислитедьно-фосфорилирус-щих свойств митохондрий под действием продуктов гидролиза фосфо-липааы Ag описано в ряде исследований (Скулачев В.Г., 1972; СЬ&пН.ЫоЬ И85).

В связи с этим мы провели эксперименты по определение субстратной специфичности фермента. Как следует из табл. 4, оптимальным субстратом является фосфатидилэтаноламин, который лучше расщепляется как при рН 9,0, так и при рН 7,4.

f Таблица 3

Сравнительная эффективность фракций I и II фосфолипазы тромбоцитов при гидролизе фосфолйпидов с различными жирнокислотными радикалами

Жирная кислота 1 Активность фосфолипазы I . белка Ag, нмоль/мин'мг

] Фракция I | Фракция II

18 : I 1,2 ±0,1 1,7 ± 0,16

, 18 : 2 4,8 ± 0,47 12,7 t 1,1

ZO: 4 16,0 ± 1,15 23,8 ± 1,9

*

Эффективность гидролиза фосфатидилхолина была почти вдвое ниже при рН 9,0 в сравнении с фосфатидилзтаноламином и еще больше уменьшалась при рН 7,4. По эффективности гидролиза третьим субстратом был фосфатидилсерин, гидролиз которого при рН 7,4 превышал степень гидролиза фосфатидилхолина.

Эффективность гидролиза нардиолипина практически не изменялась с изменением рН среды инкубации. Преимущественный гидролиз фосфатидилэтаноламина митохондриальной фосфолипазой был отмечен и в других исследованиях, где использовали препарат митохондриальной

фосфолипазы с различной степенью очистки {'^^/a 'tí^pl,etaJt ^7J

и//**^е^о/ • , 1982).___________^_______________ ____________________'

Поскольку фосфатидилэтанолпмин был оптимальным субстратом, ш исследовали гидролиз этого субстрата с различным, жирнокислотным составом под действием очищенной митохондриальной фосфолипазы. Как видно из наших данных (табл. 5), фос{ятидилэтаноламин, содержащий линолевую кислоту, гидролизовался лучше, чем другие фосфа-тидилэтаноламины. Эти данные свидетельствуют о том, что фосфолипазы из митохондрий и тромбоцитов проявляют специфичность не только к классу гидролиэуемого фосфолипида, но и к жирнокислотиой композиции субстрата. '

Таблица 4

Субстратная специфичность очищенной фосфолипазы митохондрий печени крысы

Ф о с ф о л и п и д

!

Выделение жирной кислоты (нмоль/30 мин)_

рН 9,0

рН 7,4

Фосфатидилэтаноламин Фосфзтидилхолин Фосфатидилсерин Кардиолипин

24,0 ± 1,97 15,7 ± 1,44 5,0 ± 0,а5 3,2 ± 0,31

14,5 ± 1,25 3,5 ± 0,33 7,0 ± 0,68 3,0 ± 0,28

Таблица 5

Гидролиз фосфатидилэтаноламина с различным жирнокислот-ным составом очищенной митохондриальной фосфолипазой

Субстрат ' | Выделение жирной кислоты (нмоль/30 мин)

2-линолеоил-фосфатидилэтаноламин 20,0 ± 1,90

2-арахидонил-фосфатидилэтаноламин 7,0 ± 0,66

2-олеоил-фосфатидилэтаноламин 9,4 ± 0,76

Трансацилазные свойства фракции с фосфолипазной А? активностью из митохондрий печени крысы. Исследованная ранее идентичность отдельных фосфолипаз и трансацилаз ( Себе 197А; илнНеи^еп , 1981; £аг\?е% 7,л< , 1980; И^Соъ/Н.^оС, 1984) легла в основу напих экспериментов по изучению трансацилазных

свойств фосфолипаз. Ацилтрансферазная активность была обнаружена в митохондриях, микросомах и в плазматических мембранах ((Не^ел 2lk,»t cd- , 1972;Ыо/ Ь. ¿t аЛ , 1977). Показано, что существует внергозависимый путь обмена ацильнай группы через СоА-производ-ное жирной кислоты и энергонезависимый обмен ацильннх остатков, которые осуществляются различными ферментативными системами ( Comic , 1985). В работе (Ягужинский П.С. и др., 1988)

представлены данные, где на изолированных митохондриях при изменении тоничности среда было показано включение жирных кислот в различные классы фосфолипидов. В связи с этим нами проведены исследования трансацилазных свойств полученного после очистки фермента. Поскольку в предыдущих экспериментах в качестве субстрата мы использовали суммарную фракцию фосфолипидов и фосфатидилхолин из яичного желтка, которые могли содержать в виде примесей продукты деградации фосфолипидов, а также их плазмалогенные формы, в настоящей работе с целью получения белее корректных данных мы использовали в качестве субстрата дипальмитоилфосфатидилхолин, который практически не подвергался деградации. После проведения и остановки реакции продукты анализировали и .идентифицировали с помощью ТСХ. Последующий подсчет радиоактивности соответствующих зон показал, что степень и скорость включения меченного олеата в фосфатидилхолин в процессе очистки фермента возрастает (рис. 9). Это говорит о том, что траненцилирувщая активность ферментного препарата митохондриальной фосфолипазы также, как и гидролазная, в процессе очистки резко возрастает. рН-оптиМум реакции трансацили-рования - 9,0, то есть такойже, что и для реакций гидролиза. Оптимальная концентрация фермента в исследованных условиях составила 18 мкг. Увеличение концентрации белка приводило к уменьшении включения меченной жирной кислоты в фосфолипид. Включение метки в дипальмитоилфосфатидилхолин было линейным в первые 15 минут инкубации.

Показано, что эффективность включения меченной жирной кислоты зависит от последовательности добавок субстратов и фермента, Пре-инкубация фосфатидилхолина с меченной арахидоновой кислотой и последующая добавка фермента приводили к более эффективному включению метки в фосфолипид, чем тогда, когда проводили преинкубации фермента с арахидоновой кислотой.

При исследованиях субстратной специфичности очищенного препа-

г

Вю.У.

24 ч

Пет Эффективности трансацилирования в процессе очистки фермента

1 - контроль без фермента

2 - неочищенный фермент (ацетоновый экстракт)

3 - очищенный фермент

рата г<и?ох.оняри1льной фосфодипазы п рзакциях ?ранс1--:ляроап:тя показано, *что включение *4С-20:4 было нпиболео высоким при использовании ф^сфатицилотв! юл амина (табл. б) и составило 2в,б %. Немногим меньше было вк.юченнс зтоЯ же жирной кислоты в фосФати-дилхолин - 26,0 %, оклачени» метки в фрэкщю фосфатидилиноэитола составило - 4,6 %.

Таблица 6

Эффективность включения меченной арахидоновой кислоты в различные классы фосфолипидов

Ф о с ф о л и п и д ! Общая радиоактивность! %

I. Фосфати.дилхолин 26,0 ± 8,9'

2. Фосфатидилэтаноламин 28,6 ± 8,7

3. Фосфатидилинозитол 4,6 ± 1,1

Таким образом, изложенные выше результаты исследований указывают на то, что обе активности как трансацилазная, так и гид-ролазная тесно сцеплены. Вопрос о том,представлены ли обе активности одним ферментом или же это разные белки, остается открытым, так как очищенный ферментшй препарат не был гомогенен.

Ранее нами было показано, что ионы Са2+ стимулируют обе активности. Однако, в экспериментах с дипальмитоилфосфатидилхоли-ном в качестве одного субстрата и меченного арахидоната в качестве другого было обнаружено, что в присутствии ионов Са2+ (I мМ) включение метки подавляется на 65 %.

Для выяснения вопроса о существовании взаимосвязи между син-тетазным мультиферментным комплексом, продуцирующим ацил-СоА и ферментным препаратом из митохондрий, использующим жирную кислоту, проведены эксперименты, позволяющие определить оптимальный субстрат. Для выяснения этого вопроса изучали включение меченных СоА-олеата и олеата в молекулу фосфатидилхолина.

При добавлении меченных СоА-олеата или свободной олеиновой кислоты было обнаружено, что включение меченного предшественника происходит в основном во фракцию фосфатидилхолина. Однако, метка была обнаружена также и во фракции лизофосфатидилхолина, а также на старте в фермент-субстратном комплексе. На рио. 10 показано, что эффективность включения СоА-олеата незначительно превышает включение ^^С-олеиновой кислоты во фращию фосфатидилхолина. Причем, оптимальная концентрация в этих условиях как СоА-олеата, так и олеата равнялась 176 мкЫ. Дальнейшее увеличение концентрации меченного субстрата приводило к уменьшению включения метки, что особенно заметно в случае с СоА-олеатом. Кроме того, следует отметить, что в контрольном' варианте (то есть в отсутствие фермента) во фракции фосфатидилхолина обнаружено незначительное количество метки, которое, по-видимому, объясняется неспецифической адсорбцией и не превышает 10 % от общего количества меченного субстрата. Эти данные позволяют предположить, что трансацилазная активность митоховдриального фермента может быть независима от активности мультиферментного комплекса, продуцирующего СоА-олеат,и, следовательно, исследованный тип реакции осуществляется энергонезависимым путем.

Как указывалось выше, включение меченного предшественника происходит и во фракцию лизофосфатидилхолина, образующегося в ходе реакции. В данном случае включение меченного СоА-олеата также мало отличалось от эффективности включения ^С-олеата. А увеличение концентрации меченного субстрата приводит к ингибированию включения жирной кислоты. Относительно включения ^С-жирной кислоты в молекулу лизофосфатидилхолина могут быть различные предпо-

Рис.10. Включение меченного субстрата во фракции фосфатидилхолина

1.3 - олеат и СоА-олеат в отсутствии фермента

2.4 - то же в присутствии фермента

ложения. Можно предполагать, что лизофосфолипазнуп и фосфолипаз-нуп активности не удалось разделить и они участвуют как и микро-сомальные фосфолипазы в цикле обмена жирных кислот ( ¿аьЫ$У £.Мл 1960), или что обе активности присущи одному ферменту, который подобен фосфолипазам типа В. Не исютченй также позмс -.гюсть миграции ацильной цепи (Р1исМЬипД. &£. , 1982). Исходя из наших данных, сложно ответить определенно на эти вопросы, требушие дополнительных экспериментов.

При изучении связывания меченного субстрата с ферментом было показано, что некоторое количество меченной жирной кислоты связывается с ферментом, причем характеры зависимости связывания ^С-олеата и меченного СоА-олеата с ферментным препаратом из митохондрий от их концентрации кардинально различается. Так, с увеличением концентрации ^олеата • количество связанного с ферментом субстрата нарастает, тогда как максимальное связывание йермечта с СоА-олеатом наблюдается при концентрации 88 мкМ. При дальнейшем увеличении концентрации СоА-олеата связывание резко падает.

Проведенные эксперименты показали, что эффективность вклвчения олеиновой кислоты и СоА-олеата практически одинакова в исследованиеых условиях. Эти данные свидетельствуют об энергонезависшпсти изученных реакций. Том не менее следует отметить, что, по-видимому, сп ^¡уо СоА-олеат и олеат имеют'разные возможности вклочения в молекулу фосфолипида.

Наши данные служат еще одним подтверждением существования процессов деацилирования-реацилирования в митохондриях, которые, по-

видимому, катализируются исследованный препаратом фосфолипазы А^ из митохондрий печени крысы. Возможно, что эти процессы осуществляются по типу обратимых реакций, однако их регуляторы к настоящему времени не определены. В будущих экспериментах представляется интересным исследовать, какой из способов, энергозависимый или анергонезарнсиный, использует клетка в экстремальных условиях для обмена ацильных радикалов в молекулах фосфолипидов.

Суммируя данные этого раздела, можно заключить, что очищенный препарат митохондриальной фосфолипазы обладает как ги.дролазной, так и трансацилааной функцией, причем обе реакции протекают эффективно при одних и тех же значениях рН, имеют одинаковый оптимальный субстрат в исследованных условиях и относятся к энергонезависимым процессам.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы выделения и очистки меыбранносвязанных фосфсушпаз из митохондрий печени крысы и тромбоцитов крови человека и впервые получены высокоочищенные препараты этих ферментов. В результате очистки получены субстрат-специфичные формы ферментов.

2. Разработан способ стабилизации ферментов, основанный на иммобилизации очищенных фосфолипаз на аффинном сорбенте.

3. Изучена Са^+-регуляция фосфолипаз Аг, из митохондрий и тромбоцитов. Показано, что стимуляция ионами Са^+ опосредована кальмо-дулином. Установлено, что хлорпромаэин-антагонист кальмодулина ин-гибирует активность исследованных фосфолипаз и, следовательно, ан-тиагрегационные свойства психотропных агентов могут реализовывать-ся на уровне подавления активности фосфолипазы А^> в тромбоцитах человека.

4. Показано, что первым этапом механизма Са*"+-регуляции, фосфолипаз является образование комплекса Е-КМ (фермент-кальмодулин).

5. Выявлена специфичность очищенных фосфолипаз к классу фосфолипидов. Показано, что оба фермента наиболее эффективно гидролизу-ют фосфатидилэтаноламин.

6. Исследована специфичность фосфолипаз к ацильному радикалу гидролиэуемого субстрата. Обнаружено, что фосфолипаза А^ из митохондрий предпочтительно гидролизует фосфатидилэтаноламин, атере-фицированный липолевой кислотой во 2-й позиции, а фосфолипаза из

тромбоцитов проявляет специфичность к арахидонат содержащим фос-

фолипидам. ___ __________

----------------7. Установлено,что очищенный препарат митохонриальной фос-

фолипаэы катализирует реакции трансацилирования. Обнаружено, что при этом как жирная кислота, так и ее СоА-производное могут служить субстратами этой реакции. Доказано, что в митохондриях существует независимая система деацилирования-реацилирования.

8, Впервые обнаружено изменение соотношения активностей субстрат-специфичных форм фосфолипазы Ао в тромбоцитах человека в норме и при ИБС, и показано, что основным пулом свободного арахи-доиата при ИБС является фосфатидилхолин.

9. Впервые обнаружена высокая активность фосфолипазы А£ в ин-тактных тромбоцитах человека при ИБС. На основе полученных результатов исследований разработаны практические рекомендации способа ранней диагностики ИБС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Учитывая высокую эффективность аффинного сорбента при очистке мембранносвязанных фосфолипаз рекомендуется попользовать

его для других ферментов.

2. Поскольку активность фосфолипазы А^ является важным показателем в характеристике функционального состояния тромбоцитов, следует использовать этот показатель для диагностических целей.

3. В связи с том, что подавление агрегации тромбоцитов происходит на уровне ингибирования активности фосфолипазы А^, рекомендуется включать эти фармагенты (психотропные фенотиалигш - антагонисты кальмодулина) в комплексную терапию и профилактику ИБС. ,

4. Рекомендуется использовать разработанный способ стабилизации для других белков, функционирование которых зависит от гидрофобного окружения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Т/йчибаев М.У., Цуксимов Ф.А., Ахмедова Н., Шкинев А.В., Мир-

ходжяев У.З., Алмптов К. Т., Рахимов М.М., Танмухамеяов Б. Л.

Характеристика некоторых мембраноактивных компонентов яда //

"Биохимия". - Т. 42. - вып. 12. - 1977.

2. Ахмеджанов Р., Рахимов М.М., Мадьяров Ш.Р., Ташмухэмедов Б. А.

Способ очистки фосфолипазы А^. // Авторское свидетельство

№ 275 1311/23 04/053467.

3. Мадьяров Ш.Р., Ахмедаанов Р., Алпатов К.Т., Агзамов X., Рахимов U.M., Ташмухамедов Б,А. Действие митохондриальной фосфоли-паэы Ag на окислительное фосфорилирование иитохондрий. // II Всесоюзный симпозиум "Липиды биологических мембран", Ташкент. -1980.

4. Рахимов U.U., Ахмедаанов Р., Бабаев М.У., Мадьяров Ш.Р., Таш-мухамедов Б. А. Очистка фосфолипазы Д методом биоспецифической адсорбционной хроматографии. // Узб. биол. ж. - № 5. - 1980. -С. 7-И.

5. Рахимов U.M., Мадьяров Ш.Р., Ахмедаанов Р., Ташмухамедов Б.А. Некоторые функциональные свойства митохондриальной фосфолипазы Ag. // Ш конференция биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. - 19 81. - С. 171.

6. Ахмеджанов Р., Рахимов U.M., Мадьяров Ш.Р., Ташмухамедов Б.А.

• Способ получения адсорбента для гидрофобной хроматографии. //

Авторское свидетельство * 853990. - 1981.

7. Мадьяров Ш.Р., Рахимов М.М., Ташмухамедов Б.А. Очистка фосфолипазы Аг> из митохондрий печени крысы биоспецифической хроматографией. // Узб. биол. ж. - » 4. - 1982. - С. 5-7.

8. Рахимов М.М., Ташмухамедов Б.А. Изучение действия тироксина на фосфолипазу Ag из митохондрий печени крысы. // Узб. биол. ж. -№ 5. - 1982. - С. 9—II.

9. Мадьяров Ш.Р., Рахимов'М.М., Ташмухамедов Б.А. Изучение тран-сацилирующей функции фосфолипазы Ag из митохондрий печени крысы. // Узб. биол. ж. - № I. - 1983. - С. 7-9.

10. Роль эндогенной фосфолипазы в обновлении фосфолипидов митохондрий. // 1У Всесоюзный симпозиум по биохимии липицов. - Киев. - 1983. - С. 76-77.

11. Функциональная характеристика мембранносвязанной фосфолипазы митохондрий. // Ш Советско-Швейцарский симпозиум "Биологические кимбраньг структура и функции". - 1983. - С. 134.

12. Борншсов В., Саатов Т.С. Получение 1-пальмитоил-2 олеоил фосфат,«илхолина. // Авторское свидетельство № I20700I. - 1985.

13. Ворников В.Т. Реацилирование фосфолипидов митохондриальной фисфолипазой. // Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы регул, энер. - Цущино. - 1984.

14. Азизова H.H., Саатов Т.С. Ca-регуляции активности фосфолипазы Ag тромбоцитов в норме и при сердечно-сосудистых ¡заболеваниях.

Ii I конференция биохимиков Узбекистана. - 1986. - С. 202.

------15. Борников В. Т., Саатов Т. С. Фосфолипаза н реацилирование

фосфолипидов. // Ж. "Биохимия". Т. 52. - вып. 7. -' 1987. -

С. 1068-1071. , „ , - г

16. Sa«io~TS.,a${SOra лЛл/. Fo et о J S defin.n^ ¿«Safante oF ctiacbtdcmc aeict in thiom&ocytes upon ,'schem/g heail cftS ease//í8tb F£bS Meeting ,¿ju6tjona Ycfoifa i/>a. 7une-

rJuCy 3; p.223-2.30, /98?.

17. Саатов I. С., Аэизова H.H., Борников В.Т. Регуляция мембранной фоофолипаэн "ро^бослоз кааьиодулнном. // XII Bwopwfle

сл»е!гтнкс по транспортным АТ.аэам, - Иркутск. - 1967. - С. 3233.

18. Аэизова H.H., Саатов Т.С. Влияние липосом на функциональные параметры тромбоцитов человека. // Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов. - Алма-Ата. - 1987. - С. 81-82.

19. Саатов Т. С. Взаимосвязь системы внутриклеточных посредников в тромбоцитах человека в норме и при ишемической болезни сердца. // У1 Всесоюзный оимппяиум Толь Ц!?я.тячгс:г:гс гтутг-.^отинов и пторачных поср«иииков в регуляции форионтчтийннх процессор". -Петрозаводск. - 1907. - С. 34.

20. Лзнг-'.фп H.H., Гпгельгянс Л,И,, Очвтоя I. С. Рег,улт:,!я иоипч:*. тяьция фогфолт'пзн Ар из рзэличнмх истпчии^оя. /,/ "/',<": Ус-ССР. - Р Ii. - i9t"ü." - С. 47-48.

21. Агизаво H.H., Гвгадьгяис. АЛ., Оптоп Т,С. Влияния явльнзпу-липа и хлорпромядинп на активность фсфолипэзи Ag иэ различных источников. // Ж. ".Биохимия". - Т. 55. - 1? I. - 1990. -

' С. 17-20.

22. Горикяор В.Т.,' Абцук/и>мова М.Х., С-чятоп Г.С. [Змдол°мне и

• очистка d)fi сф"| л ¡i t¡ чзы Д., иа тромбоцитов человека, // К. "Дпн УэССР". - № 10. - 1990. - С. 50-51.

23. Саатов Т. С. Деградация экзогенных фосфолипидов в нормальных и функционально активных тромбоцитах человека. ■// Ж. "/'"" УзССР". - !." -1. - 1991. - С- 43-44.

24. Еорникоп В.!., Ао'дукосмопе Н.Х., Спатпя 'Г.С. Активность фоофа-липп.тг Д., в тромбоцит»* человек.*». Выде^чие и очисткл фррмрнтя.

X У Л О С А

Ушбу ишда каламуш жигари ва одам тромбоцитларида к^ фосфоли-пазалар тацкид килинган. Бу ферме^тларнинг уз функцияларини ба-жаришлари ишда хужайраларнинг энергетик системалари каби ифодала-нади ва бундан ташкари улар тромбогенез жараёнида иштирок этади-лар.

Фосфолипазанинг аффин хромотографияси ёрдамида тозалаш ва ферментларни(баркарорлаштириш усуллари ишлаб чикилган. фосфо-липазнинг Са^+ регуляцияси тадкик килинган. Са^+ ионлари билан стимуллаш кальмодулин билан богликлиги аникланди.

КМ ва унинг антогонисти хлорпромозин билан утказилган тажри-баларда Са^+ ионлари иштирок этмаганида КЫ-фермент комплекси хо-сил булиш имконияти курсатилган булиб, бу имконияг Са^+ нинг регуляция механизмини англашда кушилган мухим хисса хисобланади.

Хлорпромозин кг, фосфолипазанинг фаоллигини сусайтириши аникланди. Куриниб турибдики, тромбоцитлар агрегация жараёнининг психотроп финотиозинмоддалари таъсирица сусайтириш, эндоген фос-фолипазалар фаоллигини сусайтириш оркали амалга оширилади. Бу • тажрибалар асосида психотроп фармагентларнп медицина амалиётица юрак контомир касалликларини даволаш ва уларнинг профилактикаси учун куллаш мумкинлиги тугрисида тавсил бериш мумкин.

. • Тозаланган ферментларнинг субстрат хусусияти урганилган ва фосфолипазалар нафакат фосфолипаз (классига) турига, 'балки ациль радикалининг парчаланади гидролизланадиган килиши аникланган. Митохондрия фосфолипазаларининг тозаланган препоратлари асиль радикалларининг алмашиш реакциясини тезлаштириши кузатилган, ёг кислотаси, СоА - ёг кислотаси сингари бу реакциянинг субстратла-ри булиб хизмат килиши мумкинлиги курсатилган. Бу тажрибалар ми-тохондрияларда деациляция реациляция мустакил системаси мавжуд-лигидан далолат беради. Еиринчи марта инсон тромбоцитларида Аг> фосфолипазаларнинг фаолиги меъёрий холда бу ферментнинг праккон-темир хасталик холатидаги фаолигидан фарк килиши аниКланди. А^ фосфолипазаларнинг фаоллишнинг ошиши хасталик огирлашиши. билан кореляцияланиб, инфаркт холатида 10 барабар ортади. Бунда фосфо-тидил холинга хос фосфолипазаларнинг фаоллиги, асосан фосфото-цадэтанолаыинни гидролизловчи ферментлар фаоллигидан юкоридир, бу ферментнинг фаоллиги меъёрий холда катта булса хам.

Шунцай килиб, олинган натижалар А^ фосфолипазанинг сдам тром-

боцитларицаги фаоллиги мухим фуйкционал курсаткич хисоблянкяими ' курсатадилар ва бу иаълумотлар орак-кон-темир касаллинларига тахшис куйямидя фойдаланиЖши~мумкйн7 Анчкландикн тромбин каби агрегация омиллари фосфолипазалар системани аккулуляцияловчи оркали стимулланади, оширади, бу эса уя навбатида а+/Н+-сти-муллаган хужайралардан алмашиниши фаоллиги билпн богликдир. Дури-ниб турибдики, тромбоцитларца физиологии жавоби регуляциясининг фосфолипаз реакциялари фаоллашув даври билан биргаликда асосий механнзми улар»шнг Со ^-транспорт системплярн оркали рмчлгя ошя-рилади.

Uuratova Uiaida i.

Isolation and functional characetrization of Jfcospholipases A-, from mitochondria and platelets.

I

Summary. t

Rat liver and human platelet phospholipasea A2 have been stu~ died. The functioning of these enzymes is expressed in the wotk of the moat important energetic cell system and besides, they are taking part in throrabogeneeis. Methods ofr purification of the phospholipaaes by means of affinity chromatography as well as the ones for enzymatic stabilization have been developed.

Phospholipasee Ag Ca2+-regulation has been also studied. It ia established that stabilization of Ca2+ ions is intermediate by calmodulin. In experiments with calmodulin and its antagonist - chlo-ropramisine, the possibility for calmodulin-enayme complex formation has been established significant for comprehension of -regulation mechanisms by enzymes. .

Chloropromasine is discovered to inhibit phospholipaaes • activity. Consequently, the suppression of platelet aggregation by means at psychotropic phenitiedines is performed through the inhibition of endogenous phogpholipase activity. On the basis of experiments the psychotropic en2ymes can be recommended to be used in medical practice for treatment and.prophylaxis of cardiovascular diseases.

' Substrate specificity of the purified enzymes has been studied and the phospholipasea have been discovered to shovi sensitivity not only towards the class of phospholipids but also the selectivity towards the acyl radical of the substrate hydrolysed.

Purified mitochondrial phospholipase preparation has been discovered to catalyse the acyl radical exchange. It Í3 shown that both fatty acid and CoA-fatty acid can serve as the substrate in the reaction in question. These experiments is the evidence for the existence of independent deacylatio-reacylation system in mitochondria.

For the first time it has been discovered that in the human pletelets the phospholipase A- activity in the normal subjects in

quite different from the ono of the enzyme upon cardiovascular pathology ( Ischaemic heart disease). Fhospholipase A^ activity Increane correlates with the gravity of he disease and there in nr. order jncreaae in myocardial infarction.

Th" activity of phbspholipase A^ specific to the phonphati-dylohoj ine in shown higher than the one hydrolysing phoophatidyl-etiionolamijie, preferably. Though in the normal conditions the activity of the latter disappears. Thus, tllP results show that the ncti7t Ij 'if phoipholipase Ag in platelets is ?n important functional parameter and the datn can be used in the diagnostico of car-ii i ovnpiriilaT' diverse?.

It has been established that aggregation factors both of platelets and AFP stimulate the phonpholipase activity through accumulating system, vihich in its turn ia connected with the IiQ+/rr4' - exchange activation in the stimulated cells. The main mechanism of platelet physiological response regulation, the stago of phospholipaoe reaction activation included, io performed through theit Ca - transporting eyatema,

zf