Ca2+-зависимая пермеабилизация фосфолипидных мембран, индуцируемая жирными кислотами

Белослудцев, Константин Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ca2+-зависимая пермеабилизация фосфолипидных мембран, индуцируемая жирными кислотами
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ca2+-зависимая пермеабилизация фосфолипидных мембран, индуцируемая жирными кислотами"

На правах рукописи

Белослудцев Константин Николаевич

Са2+-зависимая пермеабилизация фосфолипидных мембран, индуцируемая жирными кислотами: механизм, регуляция и физиологическая значимость

03.01.02-биофизика

15 ИЮЛ 2015

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино-2015

005570583

Работа выполнена в Лаборатории митохондриалыюго транспорта Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Миронова Галина Дмитриевна

до1Сгор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук,

Главный научный сотрудник лаборатории биоэнергетики

доктор биологических наук Воденеев Владимир Анатольевич

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского",

Заведующий кафедрой биофизики биологического факультета

доктор биологических наук Опанасенко Вера Константиновна

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, Старший научный сотрудник лаборатории биоэнергетики фотосинтеза

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, г. Москва

Защита состоится « » &3 2015 г. в 15-30 на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: ул. Институтская, 3, г. Пущино, 142290, Московская область.

Ведущая организация:

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: ул. Институтская, 3, г. Пущино, 142290, Московская область, и на сайте ИТЭБ РАН: http ://web. itcb.psn.ru.

•рО

Автореферат разослан « » 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, канди дат физико-математических наук

J/äetu(? j

Лапина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из основных свойств биологических мембран является избирательная проницаемость. Благодаря этому ионы и соединения, которые не переносятся специальными транспортными системами, не могут попасть внутрь клетки или внутриклеточные органеллы (Nicholls and Ferguson, 2002). Нарушение проницаемости мембран может привести к ряду последствий. С одной стороны, увеличение неспецифической проницаемости мембран может являться причиной развития тяжелых патологических процессов, приводящих к клеточной гибели (Halestrap and Richardson, 2015). С другой стороны, пермеабилизация мембран способствует проникновению в клетку различных соединений, включая макромолекулы и лекарственные вещества (Чизмаджев и др., 1981; Манниатис, 1984; Nakamura and Funakashi, 2013; Kalli et al., 2014). В настоящей работе изучен механизм индукции пермеабилизации мембран длинноцепочечными жирными кислотами.

Свободные жирные кислоты (СЖК) присутствуют во всех биологических мембранах. Они выполняют множество функций в клетке (Дятловицкая, 1998; Rustan and Drevon, 2005). Кроме участия в энергетическом метаболизме (Ленинджер, 1966; Rustan and Drevon, 2005), метаболизме липидов (Rustan and Drevon, 2005; Huang and Freter, 2015) и регуляции ряда ферментных систем (Ibarguren et al., 2014), свободные жирные кислоты, как обсуждается в данной работе, влияют на проницаемость мембран.

Изучение взаимодействия свободных жирных кислот с бислойными липидными мембранами ведётся довольно давно (Pressman and Lardy, 1956). Показано, что свободные жирные кислоты в зависимости от концентрации и структуры молекулы могут проявлять детергеноподобное (Mukerjee and Musels, 1971), пертурбирующее (Arouri and Mouritsen, 2013) и протонофорное действие (Kamp and Hamilton, 1992). Специфическое протонофорное действие жирных кислот долгое время привлекало основное внимание исследователей в области биоэнергетики (Pressman and Lardy, 1956; Skulachev, 1998; Самарцев, 2000; Мохова и Хайлова, 2005).

В последние годы все больше внимания стало уделяться проблеме неспецифического изменения проницаемости мембран, которое происходит в результате взаимодействии анионов свободных жирных кислот с Са2+ в липидном бислое мембраны. В этой связи важно отметить, что многие внутриклеточные кальциевые процессы, в том числе связанные с проницаемостью мембран, могут регулироваться жирными кислотами. Еще в конце 70-х годов прошлого века было показано, что жирные кислоты способны стимулировать образование Са2+-зависимой поры, известной как МРТ (mitochondrial permeability transition - циклоспорин A-чувствительная пора) (Hunter and Haworts, 1979). В середине 80-х годов было показано, что жирные кислоты влияют на поглощение ионов Са2+ саркоплазматическим ретикулумом и на выброс ионов Са2+ из митохондрий (Messineo et al., 1984; De Villiers and Lochner, 1986). Причем эффекты насыщенных и ненасыщенных жирных кислот были разнонаправленными (Messineo et al., 1984; Hardy et al., 2003). Стоит обратить внимание также, что современные представления о функционировании биологических мембран являются

«протеиноцентрическими». Поэтому жирные кислоты в основном рассматриваются в качестве агентов, влияющих на функционирование мембранных белков, которые и вызывают Са2+ -зависимое изменение проницаемости мембран.

Прогресс в понимании роли свободных жирных кислот в Са2+-зависимой пермеабилизации мембран связан с исследованиями, проводимыми в нашей лаборатории с середины 90-х годов прошлого века. Тогда было показано, что насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты (в основном, пальмитиновая и стеариновая кислоты) связывают ионы Са2+ со сродством, которое, на 1-2 порядка выше, чем сродство к этому иону ненасыщенных жирных кислот и других липидов. Важно отметить, что в присутствие ионов Ca + эти кислоты индуцировали ионную проводимость бислойных липидных мембран (Mironova et al., 2001).

Параллельно с этими исследованиями появились данные, что именно пальмитиновая кислота в присутствие ионов Са2+ и в отсутствие других индукторов МРТ поры способна индуцировать Са2+ -зависимую пермеабилизацию митохондрий, нечувствительную к циклоспорину A (Sultan and Sokolove, 2001). Мы предположили, что явления, наблюдаемые на БЛМ и митохондриях, одного порядка, и это позволило нам начать исследования, посвященные изучению пальмитат/Са2+-зависимой пермеабилизации фосфолипидных мембран. Актуальность данных исследований связана с тем, что пальмитиновая кислота является природным индуктором апоптоза (Sparagna et al., 2000). Поэтому есть основания полагать, что пермеабилизация митохондрий пальмитиновой кислотой и Са2+ является одним из первых этапов в реализации программы клеточной гибели.

В клетке и митохондриях содержание пальмитиновой кислоты и других свободных жирных кислот повышается вследствие активации фосфолипазы А2 при ряде заболеваний, таких как ишемия и реперфузия, диабет, нейродегенеративные заболевания и другие (Pilitsis et al., 2003; Mironova et al., 2004; Murakami et al., 2011; Dennis et al., 2011). Несмотря на интенсивные исследования этих патологических процессов в последние годы, вопросы о роли фосфолипазы А2 в клеточной патофизиологии остаются далекими от разрешения. Поскольку при активации фосфолипазы А2 происходит высвобождение свободных жирных кислот из фосфолипидов, то их последующее взаимодействие с ионами Са2+ должно индуцировать изменение проницаемости мембран. В зависимости от различных условий, эта пермеабилизация может привести как к процессам, имеющим физиологическое значение (осцилляции ионных потоков через мембрану), так и к патологическим последствиям (гибель клеток). Все это вызывает необходимость более глубокого исследования механизмов таких процессов.

Цель исследования. Целью работы являлось выяснение механизмов пермеабилизации искусственных и природных мембран, индуцированной различными жирными кислотами и ионами Са2+, изучение регуляции этой неспецифической проницаемости, а также ее роли в физиологических и патологических внутриклеточных процессах.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить возможность индукции жирными кислотами различных классов (насыщенные, ненасыщенные и дикарбоновые) и ионами Са2+ неспецифической проницаемости искусственных (липосомы) и природных фосфолипидных мембран (внутренняя мембрана митохондрий и плазматическая мембрана эритроцитов).

2. Изучить механизмы формирования неспецифической проницаемости липосомальной и митохондриальной мембран, индуцированной ионами Са2+ и жирными кислотами различных классов (насыщенные, ненасыщенные и дикарбоновые).

3. Выявить факторы регуляции пермеабилизации митохондриальной и липосомальной мембран, индуцированной пальмитиновой кислотой и Са2+: определить влияние на пальмитат/Са2+-индуцированную пермеабилизацию мембран липидного окружения, модуляторов поверхностного потенциала, агентов, связывающих Са2+ и жирную кислоту, и индукторов МРТ поры.

4. Оценить возможность выхода из митохондрий проапоптотических белков при циклоспорин А-нечувствительной пермеабилизации внутренней митохондриальной мембраны ионами Са2+и пальмитиновой кислотой.

5. Определить возможную роль пальмитат/Са2+-индуцированной митохндриальной поры в качестве неспецифической системы выброса ионов Ca2+(Sr2+) из митохондрий.

6. Исследовать возможную роль пермеабилизации митохондриальной мембраны жирными кислотами и Са2+ при активации фосфолипазы А2 в развитии глутамат-индуцированной деградации нейронов мозга.

7. Оценить вклад фосфолипазы А внешней мембраны Escherichia coli в трансформацию бактериальных клеток E.coli плазмидной ДНК; определить влияние ингибиторов фосфолипаз А2 на этот процесс.

Научная новизна. Впервые показано, что жирные кислоты различных классов (насыщенные, ненасыщенные и дикарбоновые) в присутствие ионов Са2+ способны пермеабилизовать как искусственные, так и природные мембраны. Определен механизм этой пермеабилизации: насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты в присутствие Са2+ индуцируют во внутренней митохондриальной мембране, эритроцитарной и липосомальной мембранах образование липидных пор по механизму ламеллярного фазового перехода; ненасыщенные и дикарбоновые жирные кислоты индуцируют пермеабилизацию и слияние мембран по механизмам, связанным с полиморфными фазовыми переходами и нарушением мембранной упаковки. Впервые изучены и объяснены механизмы регуляции липидной пальмитат/Са2+-индуцированной поры в митохондриях и липосомах. Предположена физиологическая роль липидной поры, индуцированной жирными кислотами и Са2+: показано функционирование поры в качестве системы неспецифического выброса ионов Са2+ из митохондрий. Показано, что ингибиторы Са2+-зависимой фосфолипазы А2 подавляют осцилляции ионных потоков через митохондриальную мембрану. Предложен механизм участия фосфолипазы Аг и липидной поры, индуцированной жирными кислотами, в глутамат-индуцированной деградации нервных клеток. Показано, что ингибиторы фосфолипаз А2 снижают эффективность трансформации

бактериальных клеток Escherichia coli, что может являться индикатором участия фосфолипазы А внешней мембраны Kcoli в механизме проникновения плазмидной ДНК в бактериальную клетку.

Научно-практическое значение работы. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах пермеабилизации липидных мембран при изменении их фазового состояния, а также возможности реализации подобного процесса в клеточных мембранах в норме и патологии. Результаты работы могут быть использованы в лекционных курсах в области биофизики, биоэнергетики, микробиологии, клеточной патофизиологии и медицины, поскольку в настоящее время показано, что жирные кислоты и митохондриальная пора вовлечены в индукцию ряда патофизиологических явлений: апоптоза, ишемии/реперфузии, нейродегенеративных заболеваний, диабета и др. Результаты настоящего исследования могут способствовать разработке новой тактики лечения таких патологий и созданию лекарственных препаратов на основе ингибиторов фосфолипаз А2 для их коррекции.

Положения, выносимые на защиту. Свободные жирные кислоты при связывании ионов Са2+ в мембране индуцируют пермеабилизацию (образование липидных пор) искусственных и природных мембран по механизмам, связанным с фазовыми переходами фосфолипидов. Образование таких пор происходит при активации Са2+-зависимой фосфолипазы А2 и может иметь важное физиологическое значение для жизнедеятельности клетки.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на FEBS Congress (Польша, 2004; Австрия, 2007), на III и IV съездах биофизиков России (Воронеж, 2004; Нижний Новгород, 2012; Ростов, 2015), на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005; 2007; 2009; 2011; 2013; 2015), на международных конференциях «Biological Motility» (2008, 2010, 2012, 2014) на конференции «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2009-2014), на международных симпозиумах «Биологические механизмы старения» (Харьков, Украина, 2010, 2012), на международных конференциях «Окислительный стресс и свободно-радикальные патологии» (Судак, 2012, 2013), «Mitochondrial Physiology» (Австрия, 2005; Франция, 2011). Материалы конференций опубликованы в виде тезисов и сборников статей.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ, из них 17 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 монография, 8 статей в сборниках и 31 тезис докладов.

Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (01-04-48551-а, 04-04-97281-наукоград_а, 09-04-01024-а, 12-04-00430-а, 15-04-03081-а, 14-34-50380-мол_нр), грантов Минобразования России (А03-2.12-727 и А04-2.12-1116), Президента РФ для молодых кандидатов наук (МК-145.2012.4), Международного научно-технического центра (№ 3301), аналитической ведомственной целевой программы "Развитие научного

потенциала высшей школы" (2009-2011 годы) (2.1.1/3840 и 2.1.1/11950), и гранта Правительства РФ (мегагрант) (договор № 14.Z50.31.0028).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 222 страницах, иллюстрирована 13 таблицами и 71 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Формирование однослойных липосом, загруженных сульфородамином Б, и измерение проницаемости липосомальной мембраны. Однослойные липосомы из разных липидов получали методом экструзии через поликарбонатную мембрану (Agafonov et al., 2003). О проницаемости липосомальных мембран судили по выходу из липосом предварительно загруженного флуоресцентного красителя сульфородамина Б (CP) с помощью спектрофлуориметра «Ocean Optics USB 2000» (длина волны возбуждения - 565 нм; длина волны флуоресценции - 586 нм). Состав буфера: 40 мМ КС1, 50 мкМ ЭГТА и 10 мМ Трис-HCl (рН 8.5). Концентрация фосфолипида в кювете составляла 35-50 мкМ.

Определение фазового состояния фосфолипидов в липосомальной мембране. Фазовое состояние фосфолипидов (дипальмитоилфосфатидил холин) в мембране липосом оценивалось методом резонансного измерения скорости и поглощения звука в ультразвуковом интерферометре фиксированной длины (Kharakoz, 2007; Асташев и др., 2014). Измерение проводилось в буфере, содержащем 40 мМ КС1, 50 мкМ ЭГТА и 10 мМ Трис-HCl (рН 8.5), и при постоянной скорости изменения температуры 0.3°С/мин.

Определение размера липосом. Размер везикул в суспензии однослойных лецитиновых липосом был определен методом динамического светорассеяния с помощью лазерного анализатора «Zetasizer Nano ZS». Состав буфера: 40 мМ КС1, 50 мкМ ЭГТА и 10 мМ Трис-HCl (рН 8.5) (25°С).

Определение ¿¡-потенциала липосом. ¿¡-потенциал липосом был вычислен исходя из электрофоретической подвижности везикул, измеренной с помощью анализатора «Zetasizer Nano ZS». Состав буфера: 40 мМ КС1, 50 мкМ ЭГТА и 10 мМ Трис-HCl (рН 8.5) (25°С).

Получение митохондрий и митопластов. Митохондрии выделяли из печени, сердца и мозга белых крыс линии Wistar общепринятым методом дифференциального центрифугирования (Belosludtsev et al., 2009; Миронова и др., 2011). Среда выделения содержала 210 мМ маннитол, 70 мМ сахарозу, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Hepes-KOH (рН 7.4). Митопласты получали путем обработки суспензии митохондрий печени крыс 2% раствором дигитонина (Ronchi et al., 2011) с последующим центрифугированием. Концентрацию белка в полученной суспензии митохондрий и митопластов определяли методом Лоури.

Оценка функциональных параметров митохондрий. Набухание митохондрий регистрировали по изменению оптической плотности

митохондриальной суспензии при длине волны 540 нм при постоянном перемешивании и термостатировании при 25°С на спектрометрической оптоволоконной оптической системе «Ocean Optics USB 2000». Среда инкубации содержала 210 мМ маннитол, 70 мМ сахарозу, 5 мМ янтарную кислоту, 5 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ротенон, 10 мМ Hepes-KOH (рН 7.4). Скорость набухания митохондрий (Vmax = АА540/мин на 1 мг белка) рассчитывали как изменение оптической плотности суспензии митохондрий в течение первых 30 с от начала высокоамплитудного набухания. Мембранный потенциал оценивали по перераспределению катионов тетрафенилфосфония (ТФФ+) через внутреннюю митохондриапьную мембрану. В этом случае среда инкубации была дополнена 1 мкМ ТФФ . Концентрация ионов ТФФ+, Са2+, К+ измерялась с помощью ион-селективных электродов. Изменения рН определяли с помощью рН-микроэлектрода; в этом случае 10 мМ Hepes в среде инкубации был заменен на 3 мМ Hepes. Изменения концентраций ТФФ+, Са2+ и рН регистрировали одномоментно с помощью многоканальной электрометрической системы Record 4 при постоянном перемешивании и термостатировании (25°С). Потребление кислорода митохондриями изучали полярографическим методом, используя респирометр высокого разрешения «Oroboros Oxygraph-2k».

Электронная микроскопия митохондрий. Пробы для электронно-микроскопического исследования митохондрий отбирались непосредственно из среды инкубации в соответствующих экспериментальных условиях и фиксировались в 2.5% растворе глутарового альдегида. После фиксации в 1% 0s04 образцы заливали в эпоксидную смолу Эпон 812. Срезы окрашивали свинцом и уранилацетатом. Препараты просматривали в электронном микроскопе Tesla BS-500 (Belosludtsev et al., 2006).

Электрофорез и иммуноблотинг цитохрома с и апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ). Фракционирование белков митохондрий проводили с помощью SDS-PAAG (12% гель) электрофореза с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрана блокировалась 2% обезжиренным молоком в PBS буфере, и затем инкубировалась со специфическими антителами к цитохрому с или АИФ (1:1000). Мембрана отмывалась и инкубировалась со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:1000). После промывки цитохром с и АИФ выявляли с помощью пероксидазной реакции (Belosludtsev et al., 2006).

Выделение эритроцитов крыс и измерение проницаемости их плазматической мембраны. Эритроциты получали из цельной крови крыс методом дифференциального центрифугирования. Среда выделения содержала 138 мМ NaCl, 2.7 мМ КС1, 10 мМ Na2HP04 и 5 мМ глюкозу (рН 7.4). Пермеабилизация плазматической мембраны эритроцитов оценивалась по выбросу из них предварительно загруженного флуоресцентного красителя CP (Belosludtsev et al., 2010). Загрузку эритроцитов CP проводили по методу гипотонического гемолиза (Ihler and Tsang, 1987; Rechsteiner, 1975).

Приготовление первичной культуры нейронов мозжечка. Приготовление первичных культур гранулярных нейронов из мозжечка 6-дневных крыс линии Wistar проводилось в соответствии с принятой ранее

методикой (Ходоров и соавт., 2001). Были использованы культуры в возрасте от одной до трех недель после посадки (6-21DIV). Эти эксперименты были выполнены совместно с д.б.н. A.M. Суриным (НИИ ОППФ РАМН).

Флуоресцентно-микроскопическне измерения. Измерения

внутриклеточной концентрации Са2+ проводили с помощью индикатора Fura-2FF. Для оценки изменений митохондриального потенциала использовали флуоресцентный зонд родамин 123. Измерения выполняли при комнатной температуре в буфере, содержащем 145 мМ NaCl, 5.4 мМ KCI, 1.8 мМ СаС12, 1 мМ MgCl2, 5 мМ D-глюкозы, 20 мМ Hepes-NaOH (рН 7.4). Регистрацию сигналов индивидуальных клеток проводили с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа «Axiovert-200» с 20х/0.75 кварцевым объективом. Изображения получали с помощью камеры «SnapCool-fx».

Культивирование клеток Escherichia coli. В работе были использованы клетки E.coli штаммов W-3110 и JW3794-1. Эксперименты проводились совместно с к.б.н. Ю.А Пуртовым (ИБК РАН). Бактерии культивировались в среде Лурия-Бертани, содержащей 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl (рН 7.5). Химическая трансформация клеток E.coli (ЮОмМ Са2+ с последующим тепловым шоком 42°С в течении 2 мин) в присутствии ингибиторов фосфолипаз А2 проводилась в соответствии с общепринятыми методиками (Yoshida and Sato, 2009). Использовалась плазмида pGEMAX185, содержащая ген устойчивости к ампициллину.

Статистическая обработка результатов. Для обсчета результатов, построения графиков и статистической обработки данных были использованы программы Microsoft Excel 2010, GraphPad Prizm 5 и Microcal Origin 8.5. Результаты представлены как среднее значение ± ошибка среднего. Статистический анализ выполняли с использованием /-критерия Стьюдента. Значимыми считались различия при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Са2+-завнснмая пермеабилизация биологических и искусственных мембран, индуцируемая жирными кислотами

1.1. Сап-зависимая пермеабилизация однослойных липосом, индуцируемая жирными кислотами

В работе исследована способность свободных длинноцепочечных жирных кислот разных классов (насыщенные, ненасыщенные, дикарбоновые) индуцировать в присутствие ионов Са2+ неспецифическую проницаемость искусственных (липосомы) и биологических мембран (внутренняя мембрана митохондрий и плазматическая мембрана эритроцитов).

На рис. 1 показан Са2+-зависимый выброс флуоресцентного красителя сульфородамина Б (CP) из лецитиновых липосом, индуцированный различными свободными жирными кислотами (СЖК) - насыщенной пальмитиновой (ПК), ненасыщенной олеиновой (ОК) и дикарбоновой а,со-гексадекандиовой (ГДК) кислотами. Видно, что кинетика выброса красителя из липосом, содержащих ПК, ГДК и ОК, различалась. ПК и Са2+ вызывали резкое увеличение флуоресценции СР. Уровень флуоресценции становился высоким

сразу же после добавления ионов Са . Следовательно, мембрана липосом становится проницаемой для СР в тот момент, когда происходит образование комплексов Са2+ с ПК. Однако после начального увеличения уровень флуоресценции СР больше не изменялся, что говорит о транзиторном характере ПК/Са2+ -зависимой пермеабилизации липосомальной мембраны.

В то же время, добавление к липосомам ГДК/Са2+ или ОК/Са2+ вызывало более медленное увеличение флуоресценции сульфородамина Б. Флуоресценция увеличивалась до стабильного уровня в течение десятков секунд (в случае ОК) или даже нескольких минут (в случае ГДК) (рис. 1).

На рис. 2 представлена зависимость выхода СР из лецитиновых липосом от концентрации ПК и ионов Са2+. В присутствии 1 мМ СаСЬ перме-абилизация липосом наблюдается уже при 15-20 мольных % кислоты от общей концентрации липида в мембране. Добавление 30 мкМ ПК к суспензии липосом вызывало полумаксимальный выброс СР при 0.1 мМ Са2+.

Важно отметить, что другие двухвалентные катионы (Ва2+, 5г2+, Мп2+) также способны индуцировать пермеабилизацию липосом,

содержащих ПК. Действие большинства катионов сравнимо с эффектом Са2+ (за исключением ионов М£2+, которые гораздо менее эффективны как индукторы пермеабилизации липосом).

180 240 300 360Т. С

Рис. 1. Са2+-зависимый выброс СР из лецитиновых липосом, индуцированный ПК (1), ОК (2) и ГДК (3). Состав среды: 40 мМ КС1, 50 мкМ ЭГТА, 10 мМ Трис-НС1 (рН 8.5).

Добавки: 1) 30 мкМ ПК и 1 мМ Са2+; 2) 30 мкМ ОК и 1 мМ Са2+; 3) 50 мкМ ГДК и 1 мМ Са2+; 0.1%ТХ-100.

[ПК]. мкМ

10 20 30 40 50 60 70 80

[Са2"]. мМ

Рис. 2. Зависимость пермеабилизации лецитиновых липосом от концентраций ПК (А) и Са2+ (Б). Состав среды как на рис. 1. Добавки: А) 5-70 мкМ ПК и 1 мМ Са2+; Б) 30 мкМ

,2+

ПК и 0.1-1 мМ Са' Аппроксимация данных была произведена функциями у=68.38+(-4.48-68.38)/(1 +е(х-|2"у5 33л/АЛ----" " «

Приведены средние значения ± ошибка средней (п=4-7). ведена функциями ') (А) и у=68.54-66.37*0.00126" (Б).

В отличие от пальмитиновой кислоты, эффективность монокарбоновых ненасыщенных и дикарбоновых насыщенных кислот в качестве индукторов Са2+ -зависимой пермеабилизации липосом сильно зависит от концентрации ионов Са2+. Как показано на рис. 3, 1 мМ СаС12 вызывал выход красителя из липосом в присутствии 15 мкМ ПК, 15 мкМ ОК и 50 мкМ ГДК. При этом в присутствии ПК эффект был значительно сильнее (44% против 28% для ОК, и 34% для ГДК). Различия в степени выхода флуоресцентного зонда увеличивались при понижении концентрации Са2+. Так, 0.1 мМ СаС12 вызывал выброс СР из пальмитат-содержащих липосом на 25%, в то время как в олеат- и ГДК-содержащих липосомах эффект ионов Са2+ в этой концентрации был близок к нулю. Таким образом, можно сделать предположение о том, что способность жирных кислот индуцировать пермеабилизацию липосом зависит от их сродства к ионам Са2+ (М1гопоуа й а1., 2001).

Рис. 3. Выброс СР из ПК- ОК- и ГДК-содержащих липосом, индуцированный 1 (штрих) или 0.1 (пустые столбцы) мМ Са2+. Добавки: 15 мкМ ПК или ОК и 50 мкМ ГДК. Приведены средние ± ошибка средней (п=4). * - различия между контролем (15 мкМ ПК и 1 мМ Са2+) и экспериментами достоверны

1 р<0.05\ #- различия

соответствующих эспериментов

с экспериментами (15 мкМ ОК и

1 мМ Са2+ или 50 мкМ ГДК и 1

Са2+) достоверны р<0.05.

Стоит отметить, что индукция СЖК/Са2+-зависимой пермеабилизации наблюдалась в липосомах, сформированных из различных фосфолипидов (лецитин, азолектин, синтетические фосфолипиды (ДЛФХ, ДМФХ, ДПФХ)), а также различных липидных смесей, включая митохондриальные липиды печени крыс.

1.2. Са2* -зависимая пермеабилизация митохондрий печени крыс, индуцируемая жирными кислотами

Как известно, при перегрузке митохондрий ионами Са2+ во внутренней мембране органелл происходит образование неспецифической поры, известной как МРТ пора. Согласно литературным данным, эта пора представляет собой белковый мегаканал, состоящий из аденилат транслокатора (или других белков-переносчиков анионов внутренней мембраны митохондрий), порина, циклофилина Д и ряда других мембранных митохондриальных белков (ВегпагсИ, 2013; ВегпагсН апс1 Б! Ыэа; 2014). Открытие этой поры ингибируется циклоспорином А (ЦсА) (Сготркт с1 а1., 1988). В настоящей работе показано, что насыщенная пальмитиновая кислота в присутствии ионов Са2+ способна индуцировать пермеабилизацию митохондрий (рис. 4). При этом наблюдается высокоамплитудное набухание митохондрий. Это набухание не ингибируется

циклоспорином А и, в отличие от набухания, связанного с открытием МРТ поры, протекает без лаг-периода. Преинкубация митохондрий с рутениевым красным, специфическим ингибитором митохондриального Са2+ унипортера, предотвращает ПК/Са2+-индуцированное набухание органелл. Это свидетельствует о том, что пермеабилизация митохондрий происходит с внутренней стороны внутренней митохондриапьной мембраны.

Рис. 4. Ультраструктура митохондрий печени крыс до (А) и после (Б) добавления ПК и Са2+ к органеллам. В) Пагтьмитат/Са2+-индуцированное набухание митохондрий в отсутствие (1) и в присутствии (2) 1 мкМ ЦсА. Состав среды: 210 мМ маннитол, 70 мМ сахароза, 5 мМ янтарная кислота, 5 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ротенон, 10 мМ Hepes-KOH (pH 7.4). Добавки 15 мкМ ПК и 30 мкМ Ca .

На рис. 5 показана зависимость скорости набухания митохондрий от концентрации индукторов ЦсА-нечувствительной поры - ПК и Са2+. Важно отметить, что добавление 5 мкМ ПК (около 12.5 нмоль ПК/мг митохондриального белка) оказывается достаточным для того, чтобы индуцировать ЦсА-нечувствительное набухание митохондрий в присутствии 30 мкМ Са2+. Согласно нашим и литературным данным (Le-Quoc and Le-Quoc, ¡989; Mironova et al., 2004), содержание свободных жирных кислот в митохондриях составляет 15-30 нмоль/мг митохондриального белка. Следовательно, даже небольшое увеличение количества пальмитиновой кислоты в митохондриях может приводить к неспецифическому изменению проницаемости митохондриальной мембраны, а превышение ее содержания в 2 раза вызовет набухание органелл, близкое по амплитуде к максимальному.

Помимо ионов Са2+, набухание митохондрий в присутствии ПК способны индуцировать также ионы Sr2+. Ионы Mg2+ не вызывают пальмитат-индуцированное набухание. Это связано с тем, что Са2+-унипортер способен транспортировать ионы Са2+ и Sr2+, но не Mg2+ (Gunter and Pfeiffer, 1990).

Т. с

[ПК], мкМ

3,0 i 2.0

% 0.5 0,0 -0,5

[Ca"], мкМ

10 20 30 4 0 50 6 0 70 80

Рис. 5. Зависимость скорости ЦсА-иечувствительиого набухания митохондрий печени крыс от концентраций ПК (А) и Са2+ (Б). Добавки: А) 5-30 мкМ ПК и 30 мкМ Са2+; Б) 15 мкМ ПК и 10-80 мкМ Са2+. Состав среды как на рис. 4, и дополнена 1 мкМ ЦсА. Приведены средние значения ± ошибка средней (п=5). Аппроксимация данных была произведена функциями y=2.14+(-0.09-2.14)/(l+e(x"9i3V341) (А) и у=1.79-1.74*0.896" (Б).

Кроме ПК, ЦсА-нечувствительное набухание митохондрий способны индуцировать и некоторые другие насыщенные жирные кислоты в присутствии Са2+ (30 мкМ). Максимальная скорость набухания наблюдается при добавлении миристиновой кислоты. В то же время, стеариновая кислота, для которой установлена очень низкая скорость флип-флоп переходов в мембране (Kampf et al., 2006), не индуцирует набухание митохондрий.

Ненасыщенная олеиновая кислота в присутствии 30 мкМ Са2+ индуцирует митохондриальное набухание с более низкой скоростью, чем ПК. Однако увеличение концентрации Са2+ до 100 мкМ приводит к тому, что скорость олеат-индуцированного ЦсА-нечувствительного набухания митохондрий существенно возрастает (рис. 6). В то же время, увеличение концентрации Са2+ до 100 мкМ не влияет на набухание митохондрий в присутствии ПК. В присутствии высоких концентраций Са2+ (от 50 мкМ и выше), способностью индуцировать высокамплитудное ЦсА-нечувствительное набухание обладает также насыщенная дикарбоновая ГДК (20 мкМ). Однако в отличие от ПК-индуцированного набухания, при ГДК/Са2+-индуцированном набухании наблюдается небольшой лаг-период (5-10 сек) (Dubinin et al., 2014).

Ж.

(

Рис. 6. Скорость ЦсА-нечувствительного набухания митохондрий печени крыс, индуцированного 1) 15 мкМ ПК и 30 мкМ Са2+; 2) 15 мкМ ПК и 100 мкМ Са2+; 3) 15 мкМ ОК и 30 мкМ Са2+; 4) 15 мкМ ОК и 100 мкМ Са2+; 5) 20 мкМ ГДК и 50 мкМ Са2+. Приведены средние значения ± ошибка средней (п=4).

1.3. Са2*-зависимая пермеабилизация плазматической мембраны эритроцитов, индуцируемая жирными кислотами

Основываясь на данных экспериментов с искусственными липидными мембранами и митохондриями, было сделано предположение об общем механизме пермеабилизации этих мембран под действием насыщенных длинноцепочечных жирных кислот в присутствии Са2+. Следовательно, можно было ожидать, что эти жирные кислоты и ионы Са2+ будут способны увеличивать проводимость любой липидной мембраны. В качестве наиболее изученного и одновременно довольно простого объекта была выбрана плазматическая мембрана эритроцитов.

Для оценки степени пермеабилизации плазматической мембраны, эритроциты были предварительно нагружены, как и липосомы, сульфородамином Б.

На рис. 7 представлена зависимость выхода СР из эритроцитов от концентрации ПК и Са2+. Можно видеть, что пальмитиновая кислота в концентрации 10 мкМ и выше индуцировала пермеабилизацию плазматической мембраны эритроцитов для СР в присутствии 500 мкМ Са2+. Максимальный уровень пермеабилизации мембраны наблюдался в присутствии 50 мкМ жирной кислоты. Выброс СР из эритроцитов в присутствии 50 мкМ ПК наблюдался уже при микромолярной концентрации Са2+. Концентрационная кривая выходит на уровень, близкий к максимальному, при концентрации ионов Са2+ около 40 мкМ.

Рис. 7. Зависимость выхода СР из эритроцитов крыс от концентраций ПК (А) и Са2+ (Б). Состав среды: 138 мМ ЫаС1,2.7 мМ КС1, 10 мМ №2НР04) 5 мМ глюкоза, рН 7.4. Добавки: А) 5-70 мкМ ПК и 0,5 мМ Са2+; Б) 50 мкМ ПК и 2-70 мкМ Са2+. Приведены средние значения ± ошибка средней (п=5). Аппроксимация данных была произведена функциями у=77.09+(-1.61 -77.09)/( 1+е(х"2232)Я77) (А) и у=77.13*х' 8б/(7.941.86+х186) (Б).

Как и в экспериментах на липосомах и митохондриях, увеличение проницаемости плазматической мембраны эритроцитов можно индуцировать другими двухвалентными катионами (Ва2+, 8г2+, Мп2+) и насыщенными жирными кислотами (стеариновая, арахиновая) (рис. 8). В то же время ненасыщенные жирные кислоты (олеиновая, линолевая) индуцировали пермеабилизацию плазматической мембраны эритроцитов при невысокой концентрации Са2+ слабее.

Проведенное исследование позволяет заключить, что насыщенная ПК в присутствии ионов Са2+ способна вызывать пермеабилизацию как искусственных, так и биологических мембран. В зависимости от объекта исследования, другие насыщенные жирные кислоты также способны индуцировать пермеабилизацию мембран. Способность насыщенных жирных кислот увеличивать проницаемость мембран зависит как от сродства кислоты к Са2+, так и от других эффектов - способности к флип-флоп переходам через липидный бислой, гидрофобности кислоты и др. (Mironova et al., 2001; Hoyrup et al., 2001; Kampf et al., 2006). Так, например, стеариновая кислота является мощным индуктором Са2+-зависимой пермеабилизации липосом и эритроцитов, но при этом не способна вызывать набухание митохондрий. И наоборот, миристиновая кислота является слабым индуктором пермеабилизации липосом и эритроцитов, но вызывает мощное высокоамплитудное митохондриальное набухание.

Рис. 8. Са2+ -зависимый выход CP из эритроцитов крыс, индуцированный пальмитиновой (С16:0), стеариновой (С18:0) и олеиновой (С18:1) кислотами. Добавки: 20 мкМ жирной кислоты и 100 мкМ СаС12. Приведены средние значения

± ошибка средней (п=5).

О4

Что касается монокарбоновых ненасыщенных и дикарбоновых насыщенных жирных кислот, то они проявляют свое действие только в присутствии довольно высоких концентраций ионов Са2+. Вероятно, это связано с тем, что они связывают ионы Са2+ с меньшим сродством (Mironova et al.,2001), чем насыщенные жирные кислоты и, кроме того, неспособны образовывать с ионом прочные комплексы (Mironova et al., 2001). В то же время, иная кинетика мембранной пермеабилизации, вызываемой ненасыщенными и дикарбоновыми кислотами, позволяет предположить, что в основе ОК(ГДК)-индуцированной проницаемости мембран лежат процессы, отличные от ПК-индуцированной пермеабилизации.

2. Механизм Са2+-зависимой пермеабилизации мембран, индуцируемой жирными кислотами

2.1. Комплексы пальмитиновой кислоты с С а2* индуцируют пермеабилизацию мембран по механизму хемотропиого лаыеллярного фазового перехода

Как показано в предыдущей главе, мембраны липосом, митохондрий и эритроцитов в присутствии ПК и ионов Са2+ становятся проницаемы для достаточно крупных молекул (сульфородамин Б (587 Да) для липосом и эритроцитов; ПЭГ-1000 для митохондрий). При рассмотрении причин этого

90 • 8. 80 " 5 70 60 ■ 50 ■ 40 30 ■ 20 10

х х

С16:0

С18:0

С18:1

явления кажется возможным, что жирная кислота в комплексе с Са2+ проявляет «детергеноподобный» эффект. В результате этого может происходить повреждение мембран и увеличение проницаемости для крупных молекул.

Для проверки этого предположения был оценен гидродинамический диаметр липосом до и после добавки ПК и Са2+ с помощью метода динамического светорассеяния. Как видно из рис. 9, добавление ПК к суспензии лецитиновых липосом не приводит к заметному изменению их размера (средний гидродинамический диаметр липосом равен 142 нм до добавки жирной кислоты, и 136 нм после добавления жирной кислоты). Последующее добавление ионов Са2+ также не приводило к изменению размера липосом (средний гидродинамический диаметр липосом в присутствии пальмитиновой кислоты и Са2+ равен 142 нм). Следовательно, разрушения (мицеллизации) липосом после добавлении к ним пальмитиновой кислоты и Са2+ не происходит. В то же время, добавление к липосомам неионного детергента тритона Х-100 приводило к появлению в системе мелких везикул диаметром 8 нм (Agafonov е1 а1., 2003).

Рис. 9. Изменение размера лецитиновых липосом, наблюдаемое при добавлении к ним ПК и Са2+. Сплошная линия: липосомы, штрих: + 30 мкМ ПК, пунктир: + 30 мкМ ПК и I мМ Са2+. Представлены типичные О, НМ кривые.

20 40 80 160 320 640

Таким образом, комплексы жирной кислоты с Са2+ в мембране не обладают «детергентоподобным» действием. Это означает, что причиной пальмитат/Са2+-зависимого выхода СР из липосом является образование в мембране липидных пор.

Как известно, жирные кислоты и Са2+ способны изменять фазовое состояние бислойных липидных мембран (Антонов и др., 1992; Иэащигеп е1 а1., 2014). Поэтому можно предположить, что в основе ПК/Са2+ -зависимой пермеабилизации липосом лежит образование липидных пор по механизму ламеллярного фазового перехода.

Чтобы проверить это предположение, с помощью метода ультразвуковой спектрометрии были оценены изменения фазового состояния липидов липосом в присутствии жирной кислоты и Са2+ (рис. 10).

На рис. 10 представлены температурные зависимости удельной скорости звука (рис. 10А) и удельного поглощения звука (рис. 10Б) суспензией однослойных липосом, состоящих из синтетического фосфолипида дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ), в отсутствие и в присутствии пальмитиновой кислоты и ионов Са2+. Резкое увеличение поглощения и снижение скорости звука в области 41°С отражает изменение фазового состояния липидов в мембране (при повышении температуры происходит

фазовый переход липидов из гель-состояния в жидко-кристаллическое). Добавление ПК к липосомам приводит к возрастанию температуры фазового перехода (ПК делает мембрану более твердой) и сильному расширению переходной области температур, что согласуется с литературными данными (1поие е1 а1., 2001). Добавление ионов Са2+ к пальмитат-содержащим липосомам устраняет изменения, вызванные жирной кислотой: величины скорости и поглощения звука при фазовом переходе липидов сдвигаются к значениям, близким для чистого фосфолипида. Это означает, что ионы взаимодействуя с анионами пальмитиновой кислоты, приводят к появлению фазы чистого ДПФХ, что является результатом латеральной фазовой сепарации смеси ДПФХ/ПК в плоскости бислоя. В данном случае представлена лишь одна фаза (фазовый переход жидкость/гель ДПФХ), поскольку температура плавления комплекса

ПК/Са2+ равна 150°С, что заметно выше нашего рабочего диапазона. Тем не менее, можно заключить, что Са2+ индуцирует латеральную фазовую сепарацию смеси на две фазы, из которых одна представлена чистым липидным компонентом, а другая - комплексами ПК с Са2+.

2 га, 3

0,8

0,7

£ 0,6

ъ 0,5

- 0,4

0,3

0,2

0,1

К) 70 Т. "С

60 70

т.'С

Рис. 10. Влияние ПК и ее комплекса с Са2+ на фазовое состояние липосом, сформированных из ДПФХ. Представлена температурная зависимость удельной скорости звука (А) и удельного поглощения звука (Б) суспензией ДПФХ-липосом. Различие между кривыми по оси ординат (А) связано с присутствием этанола, который добавлялся к суспензии липосом вместе с жирной кислотой (при используемой концентрации около 1% этанол увеличивает скорость звука, но не влияет на фазовое состояние фосфолипидов). Сплошная линия'. 4 мМ ДПФХ, штрих: 4 мМ ДПФХ + 1 мМ ПК, пунктир: 4 мМ ДПФХ + 1 мМ ПК + 0.5 мМ Са2+.

Ионы Са2+ также вызывают фазовую сепарацию и изменение степени упорядоченности мембраны лецитиновых липосом, содержащих ПК. Это было показано в настоящей работе с помощью флуоресцентного зонда лаурдана, отражающего упорядоченность мембраны в зоне гидрофильных головок фосфолипидов. Ранее Са2+-зависимая сепарация азолектиновых липосом, содержащих ПК, была продемонстрирована с применением другого зонда -нонил акридинового оранжевого (Agafonov й а1., 2007).

Таким образом, полученные данные позволили предложить модель образования гидрофильной липидной пальмитат/Са2+-индуцированной поры в липосомальной мембране по механизму ламеллярного фазового перехода (Гриценко, 2006; АдаНэпоу й а1., 2007; Белослудцев и Миронова, 2012).

Эволюция гидрофильной липидной поры в фосфолипидной мембране начинается с образования гидрофобной поры (Антонов, 2006). В нашей системе

этот этап соответствует фазовой сепарации липосомальной мембраны в присутствии ПК и Ca . Связывание Са2+ с анионами ПК приведет к фазовой сегрегации ПК/Са2+-комплексов в отдельные мембранные домены. При физиологических условиях мембранные домены, сформированные комплексами пальмитиновой кислоты с Са2+, будут находиться в гель-состоянии. При отвердевании мембранных доменов, содержащих комплексы пальмитиновой кислоты и Са2+, происходит сокращение их площади. Известно, что при отвердевании бислоя сокращение его площади может достигать 20-25% (Jacobson and Papahadjopoulos, 1975; Schmidt and Knoll, 1985; Харакоз, 2001). В результате этого внешний монослой, в котором произошла сегрегация ПК/Са2+-комплексов, окажется растянутым (в нем возрастет мембранное латеральное натяжение), а внутренний монослой окажется сжатым (произойдет увеличение силы латерального давления). Это приведет к появлению локальных дефектов в мембране, гидрофобных пор, края которых образованы углеводородными цепями липидов.

Углеводородные цепи фосфолипидов в гидрофобных порах будут обращены в водную среду, что термодинамически невыгодно. Поэтому произойдет разрыв внутреннего монослоя, после чего края монослоев по периметру разрыва сомкнутся и возникнет гидрофильная липидная пора.

Важным свойством липидных пор является то, что они способны «самозалечиваться» в результате латеральной диффузии мембранных липидов (Антонов, 2006). Восстановление целостности мембраны происходит достаточно быстро, но только тогда, когда радиус поры не превышает критической величины - для жидко-кристаллического бислоя это 9 нм (Антонов, 1998). Подобное явление мы наблюдали в экспериментах по пермеабилизации липосом от ПК и Са2+ (рис. 1). В начальный момент после добавления Са2+ к пальмитат-содержащим липосомам интенсивность флуоресценции сульфородамина Б резко увеличивается до определенного уровня, но затем не меняется. То есть, липидные пальмитат/Са2+-индуцированные поры формируются в мембране в момент образования комплексов Са2+ с жирной кислотой, некоторое количество зонда выходит наружу, после чего целостность липосомальных мембран восстанавливается.

Подобный механизм образования липидных пор описан в работах В.Ф.Антонова, изучавшего Са2+-индуцированный фазовый переход в бислойных липидных мембранах из фосфатидной кислоты (Антонов и Шевченко, 1995).

Возникает вопрос о том, возможен ли описанный механизм при пермеабилизации пальмитиновой кислотой и Са2+ биологических мембран — внутренней мембраны митохондрий и плазматической мембраны эритроцитов. Полученные в настоящей работе данные позволяют утвердительно ответить на этот вопрос. Во-первых, пермеабилизацию митохондрий и эритроцитов, как и липосом, вызывают жирные кислоты, имеющие высокое сродство к Са2+. Во-вторых, набухание митохондрий, индуцированное пальмитиновой кислотой и Са2+, не ингибируется ЦсА, что позволяет говорить о том, что это набухание не связано с открытием белковой МРТ поры. В-третьих, восстановление целостности мембраны наблюдалось не только в экспериментах на липосомах

(Agafonov et al., 2003; Belosludtsev et al., 2014), но и в экспериментах на митохондриях. Как показано в настоящей работе, после открытия ПК/Са2+-индуцированной поры (диаметр которой равен 2-3 нм (Sultan and Sokolove, 2001)) в митохондриях, она способна к самопроизвольному закрытию. При этом наблюдается восстановление мембранного потенциала, сниженного после индукции поры в митохондриях (Белослудцев, 2005). Все это позволяет говорить о том, что ПК/Са2+-индуцированная пора в митохондриях - явление липидной природы.

2.2. Олеиновая и а,со-гексадекандиовая кислоты приводят к Са' ' -зависимому

слиянию мембран липосом и митохондрий

Как было описано выше, ОК и ГДК так же, как и насыщенные жирные кислоты, способны индуцировать пермеабилизацию мембран липосом, митохондрий и эритроцитов. Однако, механизм этой индукции, вероятно, отличается от механизма пермеабилизации мембран, вызываемой ПК.

На рис. 11 представлены температурные зависимости удельной скорости звука и удельного поглощения звука в суспензии липосом, сформированных из ДПФХ, в отсутствие и присутствии олеиновой кислоты и ионов Са2+. Как видно из рисунка, добавление олеиновой кислоты приводит к понижению температуры фазового перехода. В то же время, последующее добавление Са2+ к олеат-содержащим ДПФХ-липосомам не приводит к существенным изменениям: форма кривых скорости и поглощения ультразвука оставалась такой же, какой она была в присутствии олеиновой кислоты.

Подобные результаты были получены в случае а,ш-гексадекандиовой кислоты. Добавление Са2+ к ГДК-содержащим липосомам не влияло на температуру фазового перехода ДПФХ-липосом (Dubinin et al., 2014).

2,5 2

îl.s

1 1 э

"0,5 О

0,9

0,8

РГ* 0,7

£ о 0,6

■S 0,5

0,4

< 0,3

0,2

ОД

ют.х70

«Ve70

Рис. 11. Влияние ОК и ее комплекса с Са на фазовое состояние липосом, сформированных из ДПФХ. Представлена температурная зависимость удельной скорости звука (А) и удельного поглощения звука (Б) суспензией ДПФХ-липосом. Сплошная линия: 4 мМ ДПФХ, штрих: 4 мМ ДПФХ + 1 мМ ОК, пунктир: 4 мМ ДПФХ + 1 мМ ОК + 0.5 мМ Са2+.

В связи с тем, что ОК и ГДК вызывали Са -зависимое повышение проницаемости мембран по механизму, вероятно, не связанному с ламеллярным фазовым переходом, необходимо было выяснить, не оказывают ли они в комплексе с Са2+ «детергеноподобный» эффект. Как показано на рис.

12, добавление ОК (рис. 12А) или ГДК (рис. 12Б) к суспензии лецитиновых липосом не приводило к изменению размера везикул (средний гидродинамический диаметр липосом - 142 нм; после добавления ОК и ГДК -149 и 140 нм соответственно). Однако последующее добавление Са2+ в эту систему вызывало существенное увеличение размера липосом (средний гидродинамический диаметр увеличивался в присутствии ОК до 230 нм; в присутствии ГДК - до 520 нм). Кроме того, в случае с олеиновой кислотой появлялась небольшая доля липосом, диаметр которых уменьшался (72 нм). Это говорит о том, что в присутствии олеиновой кислоты происходили динамические процессы изменения размера липосом.

А Б

Рис. 12. . Изменение размера лецитиновых липосом, наблюдаемое при добавлении к ним ОК и Са2+ (А) или ГДК и Са2+ (Б). Сплошная линия: липосомы, штрих: липосомы + 30 мкМ ОК (А) или 75 мкМ ГДК (Б), пунктир: липосомы + 30 мкМ ОК и 1 мМ Са2+ (А) или 75 мкМ ГДК и 1 мМ Са2+ (Б).

Увеличение размера лецитиновых липосом сопровождается обменом липидов между липосомами. Это было продемонстрировано методом флуоресцентно-резонансного переноса энергии с использованием липосом, меченных флуоресцентными липидами NBD-фосфатидилэтаноламином и лиссамин-родамин-В-фосфатидилэтаноламином. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что в присутствии ОК и ГДК происходит Са2+-индуцируемое слияние мембран липосом.

На сегодняшний день механизм слияния мембран достаточно хорошо изучен. Он включает в себя несколько стадий: образование сталка (перемычки), слияние прилежащих монослоев, полное слияние и деление на две мембраны (то есть, образование поры слияния) (Chernomordik and Kozlov, 2008; Roy and Sarkar, 2011). Считается, что во время слияния мембран происходят полиморфные фазовые переходы, то есть образование из бислойных мембран небислойных структур (инвертированной гексагональной фазы, кубической фазы). Стоит отметить, что форма жирных кислот, особенно ненасыщенных, благоприятствует образованию таких фаз (Funari et al., 2003; Lopez et al., 2014). Поэтому, последовательность событий можно представить так: ОК и ГДК «преобразуют» мембрану лецитиновых липосом (мембрана приобретает отрицательную спонтанную кривизну), подготавливая их тем самым к слиянию. Последующее добавление ионов Са2+ будет приводить к сближению мембран и, в дальнейшем, к их слиянию. Во время слияния мембран, бислой нестабилен,

так как происходит перестройка мембраны, появление небислойных структур, и нарушение мембранной упаковки. Все это может быть причиной выброса сульфородамина Б из липосом.

Таким образом, исходя из полученных результатов можно предположить, что ОК и ГДК в присутствии ионов Са2+ индуцируют пермеабилизацию липосом по механизму, связанному с перестройкой мембраны, формированием небислойных структур и последующим слиянием мембран. Следовательно, в данном случае также происходит фазовый переход, но в отличие от ПК, фазовый переход связан не с изменением жидкостности мембран, а с возможным появлением небислойных структур.

Исходя из того, что только высокие концентрации Са2+ стимулируют слияние мембран (Яоу апё Багкаг, 2011), становится понятным, почему в присутствие небольших концентраций этого иона ОК- и ГДК-содержащие липосомы были непроницаемы для сульфородамина Б.

В то же время, вопрос о механизме ОК/Са2+-индуцируемой пермеабилизации митохондрий является более сложным. Трудно представить, что в присутствии олеиновой кислоты и Са2+ происходит слияние митохондрий. Механизмы слияния и деления митохондрий достаточно хорошо изучены; продемонстрировано участие многих белков в этих процессах 2010). Однако, можно предположить, что олеиновая кислота в присутствии высоких концентраций Са2+ вызывает слияние внешней и внутренней мембран митохондрий, в результате чего может происходить образование «поры слияния». Это также может приводить к митохондриальному набуханию. Чтобы проверить это предположение, мы провели эксперименты митопластах -митохондриях, лишенных внешней мембраны (рис. 13).

Рис. 13. Скорость набухания митохондрий и митопластов, индуцированного 15 мкМ ПК и 100 мкМ Са2+ (штрих) или 15 мкМ ОК и 100 мкМ Са2+ (пустые) * - различия между контролем (митохондрии ПК и Са ) и экспериментами достоверны р<0.05. Приведены средние значения ± ошибка средней (п=4).

Как следует из рисунка, ОК способна индуцировать Са2+-зависимое ЦсА-нечувствительное набухание митохондрий, но не митопластов. В то же время, ПК в присутствии 100 мкМ Са2+ вызывает ЦсА-нечувствительное набухание в обоих случаях. Это говорит о том, что насыщенные жирные кислоты индуцируют открытие поры во внутренней митохондриальной мембране, которое не зависит от присутствия внешней мембраны. Однако, присутствие внешней мембраны является, по-видимому, важным фактором при индукции олеат/Са2+-зависимого ЦсА-нечувствительного набухания митохондрий. Следовательно, механизм ОК/Са2+-индуцированной пермеабилизации митохондрий может действительно быть основан на слиянии внешней и внутренней мембран.

Слияние внешней и внутренней митохондриальных мембран в присутствии олеиновой кислоты и Са2+ может происходить в зоне контактных сайтов митохондрий, где, во-первых, есть естественное сближение двух мембран, а во-вторых, происходит накопление свободных жирных кислот (Mironova et al., 2001).

Подводя итог этой части работы, можно сказать, что в зависимости от условий, практически все жирные кислоты в различной степени способны индуцировать Са2+-зависимую неспецифическую пермеабилизацию как биологических, так и искусственных мембран. Эта пермеабилизация зависит от сродства жирной кислоты к ионам Са2+. При этом механизмы, которые лежат в основе Са2+-зависимой пермеабилизации мембран, индуцированной различными классами жирных кислот, отличаются. В случае насыщенных жирных кислот может происходить образование липидных пор по механизму ламеллярного фазового перехода. В случае ненасыщенных и дикарбоновых кислот - нарушение в упаковке и перестройки мембраны (образование небислойных фаз) при слиянии мембран (полиморфный фазовый переход).

Возникает вопрос, какой механизм пермеабилизации мембран вероятнее всего может работать в условиях in vivo в клетках. На мой взгляд, более предпочтительным является образование липидных пор, индуцированных насыщенными жирными кислотами и Са2+. Во-первых, насыщенные жирные кислоты (преимущественно, ПК и стеариновая) составляют основной пул свободных жирных кислот в биологических мембранах (Mironova et al, 2004). Во-вторых, для образования липидной ПК/Са2+-индуцированной поры необходима относительно небольшая концентрация кислоты (увеличение концентрации ПК в 2 раза по сравнению с эндогенным уровнем вызывает максимальное набухание митохондрий), а также значительно меньшее количество ионов Са2+, чем требуется в случае ненасыщенных и дикарбоновых кислот. Более того, концентрация Са2+, необходимая для образования ПК/Са2+-индуцированной поры в митохондриях, гораздо ниже той, которая требуется для открытия МРТ поры в митохондриальной мембране. Что касается мембранной пермеабилизации, индуцированной ненасыщенными жирными кислотами, то она, вероятно, возможна лишь при патологических состояниях клетки, когда происходит существенное повышение внутриклеточной концентрации Са2+ и мощная активация фосфолипазы А2 (Murakami et al., 2011). Однако, нельзя отрицать возможность подобного механизма при передаче нервного импульса в синапсах (Харакоз, 2001), когда происходит слияние секреторного пузырька с пресинаптической мембраной. Появление же дикарбоновых кислот в значительном количестве в клетках является очень редким событием, имеющим место только при нарушениях метаболизма монокарбоновых жирных кислот (Tonsgard, 1986; Wanders et al., 2011).

3. Регуляция липидной пальмитат/Са2+-индуцируемой поры в

митохондриях и липосомах

Принимая во внимание липидную природу ПК/Са2+-индуцированной пермеабилизации мембран, трудно представить, что механизмы ее регуляции будут иметь какие-либо сложные особенности, характерные для регуляции

белковой MPT поры. В настоящей работе предположено, что регуляция ПК/Са2+-индуцируемой липидной поры будет осуществляться либо в результате изменения физико-химических свойств мембраны, либо с помощью хелатирующих агентов, которые связывают ионы Са2+ или жирные кислоты.

3.1. Влияние агентов, связывающих Са2+ и жирные кислоты, на образование пальмитат/Са2*-индуцируемой поры в митохондриях и липосомах Как показано на рис. 14, добавление к митохондриям ЭГТА или БСА приводит к полному ингибированию набухания митохондрий, индуцированного ПК и Са2+. Стоит отметить, что добавление ЭГТА к суспензии митохондрий печени крысы после открытия ПК/Са2+-индуцируемой поры приводит к заметному восстановлению мембранного потенциала.

АТФ также является сильным ингибитором образования ПК/Са2+-индуцированной поры в мембранах. Этот эффект, вероятно, опосредован связыванием ионов Са2+ (Kj для комплексов АТФ с Са2+ = 87 мкМ (рН 7.4) (DiStefano and Neuman, 1953)). Ингибирующее действие всех трех агентов проявляются как в экспериментах на митохондриях, так и на липосомах.

Рис. 14. Влияние ЭГТА, БСА и АТФ на набухание митохондрий печени крысы, индуцированное 15 мкМ ПК и 30 мкМ Са2+. Приведены средние значения ± ошибка средней (п=4).

контроль 1 мМ ЭГТА 2 мг/мл БСА 3 мМ АТФ

3.2. Влияние модуляторов поверхностного потенциала мембраны на образование пальмитат/Са2*-индуцируемой поры в митохондриях и липосомах

Поверхностный мембранный потенциал, который определяется присутствием в мембране ионизированных полярных групп фосфолипидов и белков (Антонов и др., 1992), является мощным фактором, влияющим на физико-химические свойства мембраны. В большинстве биологических мембран результирующий поверхностный заряд является отрицательным (Khalifat et al., 2011).

Мембранный поверхностный потенциал можно модулировать несколькими способами: 1) экранирование отрицательных зарядов мембраны неорганическими и органическими катионами (Tassani et al., 1995); 2) увеличение плотности положительных или отрицательных зарядов мембраны с помощью амфифильных заряженных молекул (Wrobel, 2008; Ng and Chu, 2013).

Таким образом, задачей этой части работы было изучение влияния модуляторов поверхностного потенциала мембран на образование

пальмитат/Са2+-индуцированной поры в лецитиновых липосомах и митохондриях печени крысы.

На рис. 15 представлены данные по влиянию ионов магния и поликатиона спермина на открытие ПК/Са2+-индуцированной поры в митохондриях и липосомах. Видно, что ионы магния и спермин ингибируют как набухание митохондрий, так и выброс флуоресцентного зонда из СР-загруженных липосом.

Ингибирование пермеабилизации наблюдалось и при изменении состава среды инкубации. В буфере, осмолярность которого поддерживалась одновалентными катионами (КС1), выброс красителя из липосом, а также амплитуда и скорость набухания митохондрий были ниже, чем в среде, осмолярность которой поддерживалась сахарами (сахароза и маннитол).

рН-оптимум ПК/Са2+ -зависимой пермеабилизации липосом лежит в щелочной области. Увеличение рН среды инкубации митохондрий с 7.0 до 7.8 также приводит к увеличению скорости ПК/Са2+-индуцированного митохондриального набухания.

контроль Мд2* спермин контроль Мд2* спермин

Рис. 15. Влияние ионов М§2+ и спермина на образование ПК/Са2+-индуцированной поры в однослойных лецитиновых липосомах (А) и митохондриях печени крысы (Б). Добавки: А) 15 мкМ ПК и 1 мМ Са2+; 100 мкМ 100 мкМ спермина. Состав буфера: 80 мМ

сахароза, 50 мкМ ЭГТА, 10 мМ Трис-НС1 (рН 8.5). Б) 15 мкМ ПК и 30 мМ Са2+; 3 мМ М§2+; 250 мкМ спермина. Состав среды как на рис. 4. * - различия между экспериментами достоверныр<0.05. Приведены средние значения ± ошибка средней (п=4-7).

Таблица 1. ¡¡-потенциал мембраны лецитиновых липосом в присутствии модуляторов поверхностного потенциала мембран.

Агент ¿¡потенциал, мВ

Липосомы (лецитин) 50 мкМ ДСН 10 мкМ ЦТАБ Липосомы (лецитин + 25% кардиолипин) -22,83 ± 0,85 -51,60 ±0,40* 29,07 ± 0,29* -54,13 ± 1,11*

Состав среды как на рис. 1. Приведены средние значения ± ошибка средней (п=4-7). * - различия между контролем (лецитиновые липосомы) и опытом достоверны, р < 0,05.

Подобные результаты были получены в серии экспериментов по влиянию заряженных амфифильных (мембранных) молекул на открытие поры. В табл. 1 представлены данные по влиянию амфифильных

заряженных соединений на ¿¡-потенциал мембраны

лецитиновых липосом, по которому можно судить о поверхностном заряде

мембраны. Анионный детергент

додецилсульфат натрия (ДСН) снижает ¿¡-потенциал липосом, в то время как катионный детергент гексадецилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) не только увеличивает потенциал, но даже меняет его знак.

Как следует из рис. 16, ЦТАБ является мощным ингибитором пальмитат/Са2+-индуцированной поры в липосомах и митохондриях. В то же время, добавление ДСН способствует индукции пальмитат/Са2+-зависимой поры в мембране.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что изменяя поверхностный заряд можно регулировать образование липидной поры в мембране. Нейтрализация (экранирование) отрицательного заряда мембраны является ингибирующим фактором при формировании в мембране липидной поры, индуцируемой жирными кислотами и Са2+. И наоборот, увеличение отрицательного заряда мембраны является стимулирующим фактором для образования поры.

Рис. 16. Влияние ДСН и ЦТАБ на выброс СР из липосом (А) и набухание митохондрий печени крыс (Б), индуцированные ПК и Са2\ А) Добавки: 15 мкМ ПК, 1 мМ Са2+, 50 мкМ ДСН, 10 мкМ ЦТАБ. Состав буфера как на рис. 1. Б) Добавки: 15 мкМ ПК и 30 мкМ Са2+, 10 мкМ ДСН, 10 мкМ ЦТАБ. Среда инкубации как на рис. 4. Приведены средние значения ¿ошибка средней (п = 4-7) * - различия между контролем и опытом достоверны,р< 0,05.

3.3. Влияние липидного окружения на образование пальмитат/Са2*-индуцированной поры в митохондриях и липосомах

Исходя из природы поры, индуцируемой жирными кислотами и Са2+, можно предположить, что одним из ее важных модуляторов будет являться липидное окружение. В этом плане большой интерес представляют такие характеристические липиды мембран, как холестерин и кардиолипин. Холестерин является известным модификатором физико-химических свойств биологических и искусственных мембран; его присутствие в мембране напрямую влияет на температуру главного фазового перехода (Антонов, 2006). Кардиолипин - фосфолипид с уникальной структурой, локализованный исключительно во внутренней митохондриальной мембране клеток эукариот (ЗсЫате е1 а1., 2000).

На рис. 17 продемонстрировано влияние липидного состава мембраны на образование в липосомах пальмитат/Са2+-индуцированной поры. Как видно из рисунка, присутствие в мембране как холестерина, так и кардиолипина (25

мольных %) приводит к увеличению пальмитат/Са2+-зависимой пермеабилизации фосфатидилхолиновых липосом.

Рис. 17. Влияние кардиолипина (25 мольных %) и холестерина (25 мольных %) на пермеабилизацию липосом, индуцированную 30 мкМ ПК и 1 мМ Са . Состав буфера как на рис. 1. Приведены средние значения ± ошибка средней (п = 6). * - различия между контролем (фосфатидилхолиновые липосомы) и опытом достоверны, р< 0,05.

Способность кардиолипина стимулировать выброс красителя из липосом можно объяснить тем, что он увеличивает отрицательный поверхностный заряд мембраны (табл. 1). Об этом говорит также то, что амфифильный катион нонил акридиновый оранжевый - агент, специфически связывающийся с кардиолипином во внутренней митохондриапьной мембране и нейтрализующий его заряд, - в микромолярных концентрациях полностью ингибирует набухание митохондрий, индуцированное ПК и Са2+ (Belosludtsev et al., 2006).

Стимулирующий эффект холестерина проявляется не только на липосомах, но и митохондриях (Белослудцева и др., 2009). Вместе с тем, эффект холестерина более сложен. Присутствие холестерина в мембране фосфатидилхолиновых липосом достоверно увеличивало степень Са2+-индуцированной сепарации ПК в липидном бислое (Белослудцева и др., 2009). Можно предположить, что холестерин в мембранах липосом и митохондрий образует вместе с ПК/Са2+-комплексами рафтоподобные структуры. Это облегчает процесс формирования липидной поры. Подобные процессы разделения смесей, содержащих холестерин и ПК с Са2+, были описаны в литературе (Arseneault and Lafleur, 2007).

3.4. Влияние модуляторов МРТ поры на образование пальмитат/Са2+-индуцируемой поры в митохондриях печени крыс

В работе изучено влияние известных модуляторов МРТ поры на процесс образования пальмитат/Са2+-индуцированной поры в митохондриях печени крысы. Известные индукторы МРТ поры (атрактилозид, тимеросал), а также классические ингибиторы МРТ поры (ЦсА, дитиотреитол) не влияли на образование митохондриапьной ПК/Са2+-индуцированной поры (рис. 18). В то же время слабое ингибирующее действие неорганического фосфата и АДФ обусловлено их способностью связывать ионы Са2+.

Таким образом, совокупность полученных данных позволяет утверждать, что пора, индуцируемая пальмитиновой кислотой и Са2+, не является частным случаем открытия МРТ поры в митохондриях. Регуляция этой поры в митохондриях и липосомах связана с механизмами, влияющими на состав и физико-химические свойства мембран.

контр Фн Атракт ТМС ЦсА АДФ ДТТ

Рис. 18. Влияние активаторов и ингибиторов МРТ поры на набухание митохондрий печени крысы, индуцированное 15 мкМ ПК и 30 мкМ Са2+ (контроль). Добавки: 1 мМ Ф„, 50 мкМ атрактилозид (Атракт), 50 мкМ тимеросал (ТМС), 1 мкМ ЦсА, 3 мМ АДФ и 2 мМ дитиотреитол (ДТТ). Среда инкубации как на рис. 4. Приведены средние значения ± ошибка средней (п = 5). *- различия между контролем и опытом достоверны, р< 0,05.

4. Физиологическая значимость митохондриальной поры, индуцируемой жирными кислотами и Са2+

Открытие митохондриальной поры может привести к различным последствиям для клетки. В настоящей главе описана возможная роль липидной поры, индуцированной жирными кислотами и Са2+, в клеточной физиологии и патофизиологии. Будет показано, что в зависимости от условий образование липидной поры может привести, с одной стороны, к транспорту ионов через митохондриальную мембрану, а с другой - к клеточной гибели.

4.1. Открытие пальмитат/Са2*-индуцируем ой поры приводит к выбросу га митохондрий проапоптотических белков

Как известно, пальмитиновая кислота является природным индуктором апоптоза (Kong and Rabkin, 2000). Индукция апоптоза пальмитиновой кислотой наблюдается в различных типах клеток, и может происходить как по каспаз-зависимому, так и каспаз-независимому пути (Ulloth et al., 2003). Многочисленными исследованиями установлено, что митохондрии являются важными участниками пальмитат-индуцированного апоптоза, поскольку это событие сопровождается увеличением неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий, падением митохондриального потенциала и выбросом проапоптотических белков - цитохрома с и апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ) (Sparagna et al., 2000; Hardy et al., 2003; Koshkin et al. 2008). Было предположено, что открытие пальмитат/Са2+-индуцированной поры может являться причиной выхода из митохондрий проапоптотических белков.

Как показано на рис. 19, при открытии ЦсА-нечувствительной ПК/Са2+-индуцированной поры в митохондриях печени крысы происходит не только набухание органелл, но и выход из них проапоптотических белков - цитохрома с и апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ).

Дополнительным свидетельством возможного вовлечения пальмитат/Са2+-индуцированной поры в механизм развития апоптоза является также тот факт, что в митохондриальных мембранах клеток линии WEHI-164, чувствительной к фактору некроза опухолей (TNF), содержание насыщенных

жирных кислот (пальмитиновой и стеариновой) более чем в 2 раза превышает содержание этих кислот в митохондриях ТТЧР-резистентных клеток линии Сб.

MX контр ПК/Са2+

супернатант

Рис. 19. ЦсА-нечувствительный выход цитохрома с и АИФ из митохондрий печени крыс, индуцированный 15 мкМ ПК и 30 мкМ Са . МХ - осадок митохондрий печени крыс (без добавок). Контр - супернатант митохондрий печени крыс (без добавок). ПК/Са -супернатант митохондрий печени крыс после добавления к ним ПК и Са2+.

Полученные данные указывают на возможное участие липидной пальмитат/Са2+-индуцированной поры в механизме пальмитат-зависимого апоптоза клеток.

4.2. Папъмитат/Сс?*-индуцируемая пора как неспецифическая система выброса ионов Са2+ из митохондрий

Как известно, МРТ пора рассматривается в литературе как неспецифическая система выхода ионов Са2+ из митохондрий (Bernardi and von Stockum, 2012). Это предположение основано на том, что МРТ пора может функционировать в 2 режимах - высоко- и низко-проводящем. Можно предположить, что липидная пальмитат/Са2+-индуцированная пора также является системой выброса Са2+ из органелл. Как было сказано выше, липидная пора способна самопроизвольно закрываться (Белослудцев, 2005). Поэтому при открытии поры может происходить резкая разгрузка митохондрий от Са2+ и деполяризация органелл, однако после того как целостность мембраны восстанавливается, происходит восстановление мембранного потенциала и митохондрии продолжат нормально функционировать.

4.2.1. Липидная пора как система выброса Са2+ в условиях добавленной пальмитиновой кислоты

На рис. 20 представлены данные, демонстрирующие неспецифический выброс иона Са2+ из органелл при открытии поры в условиях добавленной пальмитиновой кислоты.

Добавление только Са2+ (рис. 20А, кривая 1) к митохондриям печени крыс в присутствии ЦсА приводило к временному увеличению концентрации иона Са2+ в среде инкубации с последующим практически полным поглощением его митохондриями. Процесс транспорта ионов Са2+ через внутреннюю митохондриальную мембрану является энергозависимым, поэтому поглощение (_а митохондриями сопровождается деполяризациеи внутренней митохондриальной мембраны (рис. 20Б, кривая 1) и закислением среды инкубации (рис. 20В, кривая 1). Однако после того, как произошло полное поглощение ионов Са2+ митохондриями, мембранный потенциал восстанавливается практически до исходного уровня. При этом изменения митохондриального объема не происходит (рис. 20Г, кривая I).

Рис. 20. ЦсА-нечувствительные изменения концентрации Са2+ (А), ТФФ* (Б), рН среды инкубации (В) и набухание митохондрий (Г), индуцированные Са2+ (1) или ПК и Са2+ (2). Добавки: МХ (1 мг белка/мл), 65 мкМ Са2+ (1) или 30 мкМ ПК и 65 мкМ Са2+ (2) (А-В); или МХ (0.4 мг белка/мл), 15 мкМ ПК и 30 мкМ Са2+ (Г).

В то же время, в присутствии ПК наблюдается другая картина. После добавления Са+ к пальмитат-содержащим митохондриям происходило поглощение иона органеллами, однако со временем усиливался выброс иона Са2+ из митохондрий (рис. 20А, кривая 2). Это сопровождалось стойкой и продолжительной деполяризацией внутренней митохондриальной мембраны (рис. 20Б, кривая 2). В присутствии ПК после добавления Са2+ к митохондриям закисление среды инкубации было выражено слабее. При этом происходило восстановление рН среды инкубации практически до начального уровня (рис. 20В, кривая 2). Одновременно с деполяризацией, защелачиванием среды инкубации и выбросом Са2+ из митохондрий наблюдалось высокоамплитудное набухание органелл (рис. 20Г, кривая 2), что свидетельствует об открытии неспецифической поры.

Полученные данные указывают на то, что ЦсА-нечувствительная пальмитат/Са2+-индуцированная пора является системой выброса ионов из органелл. Эта система является неспецифической, поскольку при открытии поры наблюдается выравнивание и других ионных градиентов — в частности, как показано на рис. 20В, градиента ионов водорода.

4.2.2. Участие поры, индуцируемой жирными кислотами и йг21", в механизме обратимого 5г2*-индуцированного выброса ионов из митохондрий Полученные результаты позволяют предположить, что в митохондриях в определенные условиях может осуществляться циклизация ионов кальция через внутреннюю митохондриальную мембрану: вход кальция может осуществляться по Са2+ унипортеру, а выход - через кратковременно

образующиеся липидные поры, индуцированные жирными кислотами. В клетке появление свободных жирных кислот происходит при активации Са2+-зависимой фосфолипазы А2, которая в митохондриях обладает и РЬЛ/ активностью (С1озЬ еЛ. а1., 2006), то есть способна отщеплять и насыщенные жирные кислоты, локализованные в фосфолипидах по положению.

Подобным циклом с участием фосфолипазы А2 можно объяснить явление обратимого Зг2+-индуцированного выброса ионов из митохондрий (рис. 21) и колебания ионных потоков через внутреннюю мембрану митохондрий в

Рис. 21. ЦсА-нечувствительные Бг^-индуцированные изменения концентрации Эг2^ ТФФ+, К+ и скорости митохондриального дыхания в отсутствие (А, Б, В, Г) и присутствии (Д, Е, Ж, 3) ингибитора фосфолипазы А2 - ААСОСР3 (15 мкМ). Добавки: 47 нмоль Эг^/мг митохондр. белка. Среда инкубации содержала 20 мМ сахарозу, 1 мМ КС1, 1 мкМ ЦсА, 5 мМ янтарную кислоту/Трис (рН 7.3), концентрация митохондриального белка-2 мг/мл.

условиях гипотонии, которые впервые были продемонстрированы в работах A.B. Гюльханданяна, Ю.В. Евтодиенко и Э.Л. Холмухамедова.

На рис. 21 показана одновременная запись ЦсА-нечувствительных изменений внешней концентрации ионов Sr2+, К+, ТФФ+, а также скорости митохондриального дыхания после пульсовой добавки Sr2+ к митохондриям печени крыс в гипотонической среде инкубации. Как следует из рисунка, добавление Sr2* запускает спонтанные колебания скорости митохондриального дыхания (рис. 21 Г), которые сопровождаются соответствующими изменениями мембранного потенциала (рис. 21Б) и движением ионов через мембрану (рис. 21А и В). Все это говорит о том, что в данном случае происходит неспецифическое изменение проницаемости внутренней митохондриальной мембраны.

Известно, что ионы Sr2+, как и ионы Са2+, способны активировать фосфолипазу А2 (Северина и Евтодиенко, 1981; Saris, 1994). Кроме того, усиление активности фосфолипазы Aj происходит также в условиях гипотонии (Каргаполов, 1979). Таким образом, можно предположить, что наши экспериментальные условия способствуют активации фосфолипазы А2, появлению свободных жирных кислот и образованию липидной поры, вследствие чего происходит обратимый выброс ионов из митохондрий. Если это так, то ингибиторы фосфолипазы А2 будут предотвращать повышение неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны в условиях

гипотонии. На рис. 21Д-3 продемонстрирован эффект

ингибитора фосфолипазы А2 -арахидонил трифторметил кетона (AACOCF3), на Sr2+-

индуцированные изменения

ионных потоков в митохондриях печени крысы. Как видно из рисунка, ингибитор эффективно подавлял все 8г2+-индуцированные изменения в митохондриях. В присутствии других ингибиторов фосфолипазы А2 - аристолоховой кислоты и трифторперазина — результаты были похожими.

Как показано на рис. 22, добавление ПК в присутствии ингибитора фосфолипазы А2 приводило к восстановлению спонтанного обратимого выброса митохондрий. Эти

ЭО 80

[Sr3*], мкМ

50 ■

30 20 10 о

120 180 240

300 360

Т, с

Рис. 22. ПК (3) перезапускает ЦсА-нечувствительный '-индуцированный выброс Бг2+ из митохондрий печени крысы (1), заингибированный ААСОСРз (2). Добавки: 41 нмоль

Бг^/мг митохондриального белка. 1) Контроль, 2) + 15 мкМ ААСОСРз, 3) + 15 мкМ ААСОСРз + 40 мкМ ПК.

Sr¿t из результаты

подтверждают наше

предположение о том, что в основе спонтанного обратимого Бг -индуцированного выброса ионов из митохондрий лежит активация фосфолипазы А2, появление жирных кислот и образование липидных пор.

Таким образом, 8г2+-индуцированную рециклизацию ионов через митохондриальную мембрану в условиях гипотонии можно описать следующей

последовательностью событий (рис. 23). После добавки ионов Sr2+ и их быстрого поглощения митохондриями (фаза а), происходит активация фосфолипазы Аг, появление жирных кислот (в том числе, ПК) и формирование липидной ПК/Sr2*-индуцированной поры. В этот момент происходит уравновешивание

трансмембранных ионных градиентов (фаза б), отражающееся в выбросе Sr2+ и падении мембранного потенциала. Однако, так как липидная пора способна самопроизвольно

закрываться, то эта пермеабилизация сопровождается последующим

восстановлением целостности

мембраны, реполяризацией

митохондрий и обратным поглощением вышедших ионов Sr2* (фаза в).

После восстановления мембранного потенциала в ряде экспериментов наблюдалось появление последующих циклов входа и выхода ионов из митохондрий (до 2-3). Это говорит о том, что митохондрии могут перейти в осцилляторный режим. Вероятно, описанный выше процесс может являться одним из механизмов распространения кальциевых волн в клетке.

4.3. Возможная роль липидной поры в деградации нервных клеток

В зависимости от условий, открытие митохондриальной липидной поры, индуцируемой жирными кислотами и Са2+, может, с одной стороны, участвовать в регуляции Са2+ гомеостаза, а с другой - привести к клеточной гибели. Однако нарушение внутриклеточного Са2+ гомеостаза при различных стрессовых сигналах также способно привести к гибели клеток. Одним из примеров этого является деградация нервных клеток при избыточной стимуляции ионотропных рецепторов глутаматом.

Известно, что при повреждениях мозга, связанных с дефицитом кислорода (ишемия, инсульт и др.), в тканях мозга появляются зоны с нарушенным энергетическим метаболизмом. При этом происходит неконтролируемое высвобождение возбуждающего нейромедиатора центральной нервной системы - глутамата (Khodorov, 2004). Продолжительная стимуляция NMDA рецепторов глутаматом приводит к перегрузке нейронов ионами Са2+, нарушению сигнальных и энергетических процессов (Duchen, 2012). Увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ имеет двухфазный характер. Вторая фаза увеличения концентрации Са2+, так называемая «отсроченная кальциевая дисрегуляция», всегда происходит синхронно с падением митохондриального мембранного потенциала (Vergun, et al, 1999). Развитие всех этих процессов приводит к гибели нейронов.

Рис. 23. Предполагаемый механизм рециклизации ионов Бг2* с участием ЦсА-нечувствительной поры, индуцированной жирными кислотами. Объяснение фаз рециклизации в тексте.

До недавнего времени считалось, что основной причиной возникновения

отсроченной кальциевой

[Sr2+], мкМ

Sr2* Sr2" Sr2+ Sr2+

120 240 360 480 600 720

Рис. 24.

концентрации Sr2* инкубации (В),

ЦсА-нечувствительные

(А), ТФФ+ (Б), индуцированные

Т, С

изменения рН среды дробными

добавками к митохондриям мозга крыс ионов Бг2+ в отсутствие (1) и присутствии (2) ингибитора ААСОСРз (30 мкМ). Добавки: 4*200 мкМ Бг2"1".

дисрегуляции является открытие во внутренней мембране митохондрий МРТ поры. Однако в ряде исследований были обнаружены факты, поставившие под сомнение эту гипотезу (Khodorov et al., 2004). Сюда относится способность ионов Sr2+ наряду с ионами Са2+ индуцировать Са2+ дис-регуляцию, а также обратимость отсроченной Са2+ дисрегуляции (Bolshakov et al., 2008). Более того, отсроченная Са2+ дис-регуляция и митохондриальная деполяризация не всегда ингибируются циклоспорином А (Khodorov, 2004).

Все это позволило предположить, что по крайней мере начальные стадии отсроченной Са2+ дисрегуляции и митохон-дриальной деполяризации

связаны с открытием липидной поры, индуцированной жирными кислотами, которая обладает похожими свойствами.

Моделью отсроченной кальциевой дисрегуляции и митохондриальной деполя-

ризации на уровне суспензии митохондрий может являться пульсовое последовательное добавление ионов Sr2+ к митохондриям, поскольку в данном случае также происходит драматическое увеличение

концентрации Са митохондриальном

(Sr2+)

матриксе и

падение мембранного потенциала.

Как показано на рис. 24, загрузка митохондрий мозга крыс ионами 8г2+ приводит к ЦсА-нечувствительной митохондриальной деполяризации, выбросу ионов Бг2"1" из митохондрий и защелачиванию среды инкубации. Все это говорит о том, что ионы 8г2+ вызывают ЦсА-нечувствительное увеличение неспецифи-

ческой проницаемости внутренней мембраны митохондрий мозга крыс. Пермеабилизация митохондрий мозга может быть обусловлена открытием ли-пидной поры, индуцированной жирными кислотами и Бг2"1", вследствие активации Са2+ -зависимой фосфолипазы А2. Как видно из рисунка, предварительная инкубация митохондрий мозга с ингибитором фосфолипазы А2 -ААСОСРз, приводила к снижению выброса ионов 8г2+ из митохондрий по сравнению с контролем, и практически полностью устраняла защелачивание среды в условиях стронциевой перегрузки митохондрий.

На рисунке 25 представлены изменения концентрации внутриклеточного Са2+ ([Са2+]|) и митохондриального мембранного потенциала, возникающие под влиянием глутамата в культуре гранулярных нейронов мозжечка. При добавлении глутамата происходит небольшое скачкообразное увеличение [Са2+}, переходящее в умеренное кальциевое плато. Продолжительное действие

А Б

О 10 20 30 40 60 60 0 10 » 10 40 60 ВО

Т, МИН Т-

Рис. 25. Иигибирование фосфолипазы А2 (Б и Г) увеличивает латентный период отсроченной кальциевой дисрегуляции (А) и митохондриапьной деполяризации (В) гранулярных нейронах мозжечка крысы. Отсроченная кальциевая дисрегуляция и митохондриальная деполяризация индуцировалась 100 мкМ глутаматом (Glu). AACOCF3 (10 мкМ) добавляли за 1 час до начала действия Glu.

высоких концентраций глутамата вызывает вторичное повышение [Ca2+]j, которое начинается индивидуально в каждом нейроне (рис. 25А и Б). В тех нейронах, в которых возникла отсроченная кальциевая дисрегуляция, всегда отмечалась сильная синхронная вторичная митохондриальная деполяризация (рис. 25 В и Г). Из рисунков 25Б и 26 видно, что преинкубация культуры

нейронов с ингибитором фосфолипазы А2 арахидоноилтрифторметил кетоном (ААСОСРз, 10 мкМ) и последующее его присутствие во время действия глутамата отдаляли наступление отсроченной кальциевой дисрегуляции. Отметим, что существенно снижалось и число погибших клеток в присутствии ингибитора фосфолипазы А2 (количество клеток, не подвергшихся развитию отсроченной кальциевой дисрегуляции за 30 минут эксперимента в присутствии ААСОСРз увеличивалось с 9 до 31%) (рис. 26).

Я £ 1

I |

1 3

31%

□□□□ Soogl

inn

п □

DnS3§Da

□_

контроль

AACOCF.

Рис. 26. Времена наступления отсроченной кальциевой дисрегуляции в отсутствие (контроль) и в присутствии 10 мкМ ингибитора Са2+-зависимой фосфолипазы А2 ААСОСРз. Горизонтальные отрезки на отмечают среднее время наступления отсроченной кальциевой дисрегуляции в популяции нейронов. Обведены клетки, у которых через 30 минут после добавления глутамата развитие отсроченной кальциевой дисрегуляции не происходило (указано в %).

Таким образом, характер изменений внутриклеточной концентрации Са + и мембранного потенциала митохондрий при возникновении отсроченной кальциевой дисрегуляции, а также эффекты ингибиторов Са2+-зависимой фосфолипазы А2, соответствуют приведенным выше результатам, полученным на изолированных митохондриях мозга крыс (рис. 24). Следовательно, можно предположить, что начальная обратимая стадия отсроченной кальциевой дисрегуляции и митохондриальной деполяризации в нервных клетках связана с активациеи Са2+ -зависимой фосфолипазы А2 и накоплением в мембране митохондрий свободных жирных кислот. Появление жирных кислот в присутствии Са2+ приведет к формированию липидных пор, способствующих выбросу иона из митохондрий, падению митохондриального мембранного потенциала и выравниванию рН градиента между матриксом митохондрий и внешним средой, а также набуханию митохондрий. При этом нельзя исключать и тот факт, что митохондриальная деполяризация связана не только с формированием липидных пор в митохондриях, но и с тем, что образующиеся жирные кислоты (насыщенные и ненасыщенные) могут проявлять как протонофорное действие, так и ингибирование дыхательной цепи.

5. Влияние ингибиторов фосфолипаз А2 на трансформацию клеток

Escherichia coli плазмидной ДНК

В работе было рассмотрено несколько примеров, когда активация фосфолипазы А2 приводила к увеличению проницаемости мембраны митохондрий. Можно предположить, что активация любых фосфолипаз А2 ионами Са2+ будет приводить к гидролизу мембранных липидов, образованию липидных пор или простых нарушений упаковки липидного бислоя. То есть активация фосфолипазы А2 может являться универсальным механизмом пермеабилизации липидных мембран. Чтобы проверить это предположение, мы

провели исследования на бактериях Escherichia coli, внешняя мембрана которых содержит фосфолипазу A (Dekker, 2000; Bishop, 2008).

Показано, что фосфолипаза А внешней мембраны E.coli (OMPLA) активируется при различных стрессовых условиях, сопровождающихся нарушением целостности бактериальной мембраны (Dekker et al., 1999). Принято считать, что функции OMPLA сводятся к упорядочиванию и восстанавлению целостности, ассиметрии и упаковки внешней мембраны (Dekker, 2000).

С другой стороны, практически нет данных о том, что активация OMPLA при стрессовых воздействиях является именно тем фактором, который приводит к драматическим нарушениям целостности и структуры внешней бактериальной мембраны. В связи с этим в настоящей главе было изучено возможное участие фосфолипазы А внешней мембраны E.coli в трансформации бактериальной клетки плазмидной ДНК.

Как показано в таблице 2, преинкубация клеток E.coli с ингибиторами фосфолипазы А2 - бромофенацил бромидом, пальмитоил трифторметил кетоном (PACOCF3) и аристолоховой кислотой существенно снижала эффективность трансформации бактерий, индуцированной 100 мМ Са2+ с последующим тепловым шоком (42°С, 2 мин).

Таблица 2. Влияние ингибиторов фосфолипаз А2 на эффективность трансформации клеток Е.соП (\УЗ 110 и .)\¥3794-1) плазмидной ДНК.__

Ингибитор Эффективность трансформации клеток Е. coli (W3110) (N трансформантов/мкг ДНК*103) Эффективность трансформации клеток E.coli (JW3794-1) (N трансформантов/мкг ДНК*103)

Контроль (Са2+ компетентные клетки, с последующей обработкой 7.20 ±1.30 0.53 ±0.13

тепловым шоком - 2 мин)

20 мкМ РАСОСРз + Са2+

компетентные клетки с тепловым 1.01 ±0.23* 0.60 ±0.13

шоком (2 мин) 30 мкМ Аристолоховая кислота + Са2+ компетентные клетки с 1.04 ±0.21* 0.52 ±0.11

тепловым шоком (2 мин) 5 мкМ бромофенацил бромид + Са2+ компетентные клетки с 0.09 ± 0.03* 0.79 ±0.1

тепловым шоком (2 мин)

Приведены средние значения ± ошибка средней (п=3-6). * - различия между контролем и опытом достоверны,р<0.05

Для получения дополнительных доказательств возможного участия ОМРЬА в процессе трансформации был использован штамм ЕсоН (Ж3794-1), нокаутированный по гену ОМРЬА. Как видно из табл. 2, отсутствие ОМРЬА приводит к снижению эффективности процесса трансформации бактериальных клеток, а добавление ингибиторов ОМРЬА в этом случае не влияет на этот процесс.

Полученные данные свидетельствуют об участии OMPLA в трансформации бактерий E.coli плазмидной ДНК.

Изменение проницаемости внешней мембраны E.coli вследствие активации OMPLA ионами Са2+ можно объяснить несколькими механизмами. Структура мембраны может быть нарушена в результате появления различных небислойных структур (Tarakhovky et al., 1995; 1998). Также может происходить появление липидных пор различного размера. Принимая во внимание, что в составе липидов мембран E.coli преобладают именно насыщенные жирные кислоты (Cronan, 1968; de Siervo, 1969), а при различных стрессовых состояниях создаются благоприятные условия для фазовых переходов (например, как в случае трансформации), такой механизм пермеабилизации мембран действительно может существовать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, изложенные в настоящей работе, можно разделить на две части. В первой части показано, что жирные кислоты разных классов в присутствии ионов Са2+ способны в определенных условиях и в разной степени индуцировать неспецифическую проницаемость искусственных и биологических мембран (липосомы, митохондрии и плазматическая мембрана эритроцитов). Проанализированы основные закономерности этой пермеабилизации, определены механизмы, лежащие в ее основе. Выдвинута гипотеза о том, что насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты, которые связывают ионы Са2+ с высоким сродством и образуют с ним прочные комплексы, индуцируют образование в мембране липидных пор по механизму хемотропного ламеллярного фазового перехода. В то же время, в основе Са2+-зависимой пермеабилизации, индуцируемой ненасыщенными и дикарбоновыми жирными кислотами, лежат процессы, связанные, вероятно, с полиморфными фазовыми переходами, приводящими к нарушению упаковки бислоя и слиянию мембран. Показано, что в митохондриях насыщенные жирные кислоты индуцируют образование циклоспорин A-нечувствительной Са2+-зависимой поры во внутренней мембране митохондрий. Ненасыщенные жирные кислоты также способны индуцировать ЦсА-нечувствительное набухание митохондрий, однако для этого требуется высокая концентрация ионов Са2+. Пермеабилизация митохондрий, индуцированная ненасыщенными жирными кислотами и Са2+, может быть связана со слиянием внешней и внутренней мембраны митохондрий и образованием тороидной поры между ними. Кроме того, в первой части работы продемонстрированы факторы регуляции липидной поры, индуцированной пальмитиновой кислотой и Са +, в мембранах митохондрий и липосом. Показано, что регуляция поры связана с изменением физико-химических свойств мембраны, липидного окружения, или хелатированием ионов Са2+ и жирной кислоты.

Во второй части работы представлены данные, свидетельствующие о физиологической значимости липидных пор, индуцируемых жирными кислотами и Са2+. Так, образование в митохондриях поры, индуцируемой пальмитиновой кислотой и Са2+, приводит в выбросу из органелл

проапоптотических белков, что может являться индикатором её участия в механизме активации пальмитат-индуцируемого апотоза. С другой стороны, установлено, что короткоживущая липидная пора может функционировать как неспецифическая система выброса ионов Са2+ из митохондрий. Сделано предположение о том, что на клеточном уровне такой процесс может реализовываться в условиях активации Са ""-зависимых фосфолипаз А2. Представлены доказательства участия фосфолипазы А2 и липидной поры в 8г2+-индуцированном обратимом выбросе ионов из митохондрий. Также получены данные о возможной роли фосфолипазы А2 и липидной поры, индуцируемой жирными кислотами и Са2+, в деградации нервных клеток. Наконец, представлены данные, позволяющие предположить участие фосфолипазы А внешней мембраны Е.соИ в процессе трансформации бактериальных клеток плазмидной ДНК.

Таким образом, настоящая работа развивает новое представление о механизмах функционирования биологических мембран и роли жирных кислот в этих процессах. Полученные результаты могут быть использованы для разработки лекарственных препаратов, предотвращающих развитие заболеваний, связанных с дисфункцией фосфолипаз А2.

ВЫВОДЫ

1. Насыщенная пальмитиновая кислота в присутствие ионов Са2+ индуцирует образование в мембране липидных пор. В основе механизма образования пор лежит формирование комплексов Са2+ с анионами жирной кислоты в мембране и их сегрегация в отдельные твердокристаллические домены. Образование липидных пор наблюдается как в искусственных (липосомы), так и природных мембранах (внутренняя митохондриальная мембрана и плазматическая мембрана эритроцитов).

2. Монокарбоновая ненасыщенная олеиновая кислота и дикарбоновая насыщенная а,со-гексадекандиовая кислота в присутствие высоких концентраций кальция Са2+ (1 мМ) индуцируют слияние мембран липосом, что может быть причиной пермеабилизации везикул. Олеиновая кислота в присутствие высоких концентраций Са2+ (100 мкМ) индуцирует циклоспорин А-нечувствительную пермеабилизацию митохондрий в результате слияния внешней и внутренней митохондриальных мембран.

3. Представлены факторы регуляции пальмитат/Са2+-индуцированной липидной поры в митохондриях и липосомах: образование липидных пор стимулирует липидное окружение (кардиолипин, холестерин и жирные кислоты), отрицательный поверхностный заряд мембраны; образование пальмитат/Са2+-индуцированной липидной поры ингибируют агенты, связывающие ионы Са2+ и свободные жирные кислоты, а также соединения, экранирующие поверхностный мембранный потенциал; модуляторы митохондриальной циклоспорин А-чувствительной МРТ поры не влияют на открытие липидной поры в митохондриях.

4. Открытие циклоспорин А-нечувствительной пальмитат/Са2+-индуцированной поры в митохондриях приводит к выбросу из органелл

проапоптотических белков - цитохрома с (12.3 кДа) и апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ, 57кДа).

5. Циклоспорин А-нечувствительная пальмйтат/Са2+-индуцированная пора является неспецифической системой выхода ионов Ca2+(Sr2+) из митохондрий. Выдвинуто предположение об участии митохондриальной фосфолипазы Л2 и липидных пор в регуляции ионного гомеостаза.

6. Ингибитор Са2+-зависимой фосфолипазы А2 (AACOCF3) препятствует развитию неспецифической проницаемости митохондрий мозга крыс, а также развитию глутамат-индуцированной отсроченной кальциевой дисрегуляции и митохондриальной деполяризации первичной культуры гранулярных нейронов мозжечка. Выдвинута гипотеза о том, что на начальных стадиях глутамат-индуцированной деградации нервных лежит активация митохондриальной фосфолипазы А2 и открытие митохондриальной липидной поры, индуцированной Са2+ и жирными кислотами.

7. Фосфолипаза А внешней мембраны Escherichia coli участвует в проникновении плазмидной ДНК в бактериальную клетку. Ингибиторы фосфолипаз А2 (PACOCF3, аристолоховая кислота и бромофенацил бромид) подавляют трансформацию клеток Escherichia coli (штамм W3110).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора наук»

1. Belosludtsev К.. Saris N.-E., Andersson L., Belosludtseva N., Agafonov A., Sharma

A. Moshkov D.A., and Mironova G.D. On the mechanism of palmitic acid-induced apoptosis: role of pore induced by palmitic acid and Ca2+ in mitochondria. (2006) J. Bioenerg. Biomembr., 38, 113-120.

2. Mironova G.D., Belosludtsev K.N.. Belosludtseva N.V., Gritsenko E.N., Khodorov

B.I., and Saris N.-E. Mitochondrial Ca2+ cycle mediated by the palmitate-activated cyclosporine A-insensitive pore. (2007)/. Bioenerg. Biomembr., 39, 167-174.

3. Белослудцев K.H.. Белослудцева H.B., Миронова Г.Д. (2008) Роль митохондриальной пальмитатат/Са2+-активируемой поры в пальмитат- индуцируемом апоптозе. Биофизика, 53(6), 967-971.

4. Belosludtsev K.N.. Saris N.-E.L., Belosludtseva N.V., Trudovishnikov A.S., Lukyanova L.D., Mironova G.D. (2009) Physiological aspects of the mitochondrial cyclosporin A-insensitive palmitate/Ca2+-induced pore: tissue specificity, age profile and dependence on the animal adaptation to hypoxia. J. Bioenerg. Biomembr., V41(4):395-401.

5. Белослудцева H.B., Белослудцев K.H.. Агафонов A.B., Миронова Г.Д. (2009) Влияние холестерина на образование в митохондриях и липосомах пальмитатат/Са2+-активируемой поры. Биофизика, 54(3), 464-470.

6. Belosludtsev К. N.. Trudovishnikov A.S., Belosludtseva N.V., Agafonov A.V., Mironova G.D. (2010) Palmitic acid induces the opening of a Ca2+-dependent pore in the plasma membrane of red blood cells: the possible role of the pore in erythrocyte lysis J. Membr. Biol. 237(1), 9-13.

7. Теплова В.В., Белослудцев К.Н.. Белослудцева Н.В., Холмухамедов Э.Л. (2010) Митохондрии в гепатотоксичности этанола. Биофизика, 55 1038-1047.

8. Миронова Г.Д., Белослудцев К.Н.. Сурин A.M., Трудовишников А.С., Белослудцева Н.В., Пинелис В.Г. Красильникова И.А. Ходоров Б.И. (2011) Митохондриальная липидная пора в механизме глутамат-индуцируемой кальциевой дисрегуляции нейронов мозга. Биологические мембраны, 28(6), 483-494.

9. Белослудцев К.Н.. Миронова Г.Д. (2012) Митохондриальная липидная пальмитат/Са2+-индуцированная пора и её возможная роль в деградации нервных клеток. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. (3), 20-32.

10. Venediktova N., Shigaeva М., Belova S., Belosludtsev К.. Belosludtseva N., Gorbacheva O., Lezhnev E., Lukyanova L., Mironova G. (2013) Oxidative phosphorylation and ion transport in the mitochondria of two strains of rats varying in their resistance to stress and hypoxia Molecular and cellular biochemistry, 383(1-2), 261-269.

11. Belosludtsev K.N.. Belosludtseva N.V., Kondratyev M.S., Agafonov A.V., Purtov Y.A. (2014) Interaction of phospholipase A of the E. coli outer membrane with the inhibitors of eucaryotic phospholipases A2 and their effect on the Ca2+-induced permeabilization of the bacterial membrane. J. Membr. Biol. V.247(3). P.281-288

12. Асташев M.E., Белослудцев K.H.. Харакоз Д.П. (2014) Метод цифрового измерения фазо-частотной характеристики для ультразвукового спектрометра фиксированной длины. Акустический журнал. Т. 60. № 3. с. 312-319

13. Belosludtsev K.N.. Belosludtseva N.V., Agafonov A.V., Astashev M.E., Kazakov A.S., Saris N.-E.L., Mironova G.D. (2014) Ca2+-dependent permeabilization of mitochondria and liposomes by palmitic and oleic acids: a comparative study. Biochim. Biophys. Acta 1838 (10) 2600-2606.

14. Белослудцев K.H.. Белослудцева H.B., Дубинин M.B., Гудков С.В., Пеньков Н.В., Самарцев В.Н. (2014) Влияние спермина на Са2+ -зависимую проницаемость митохондрий и липосом, индуцированную пальмитиновой и а,ю-гексадекандиоловой кислотами. Биофизика т. 59 (5) с. 895-901.

15. Dubinin M.V. Samartsev V.N., Astashev М.Е., Kazakov A.S., Belosludtsev K.N. (2014) A Permeability Transition in Liver Mitochondria and Liposomes Induced by a,co-Dioic Acids and Ca2+ Eur. Biophys. У 43(10-11) 565-572.

16. Mironova G.D., Saris N.-E.L., Belosludtseva N.V., Agafonov A.V., Elantsev A.B., Belosludtsev K.N. (2015) Involvement of palmitate/Ca2+(Sr2+)-induced pores in the cycling of ions across the mitochondrial membrane Biochim. Biophys. Acta 1848 (2) 488-495.

17. Belosludtsev K.N.. Belosludtseva N.V., Agafonov A.V., Penkov N.V., Samartsev V.N., Lemasters J.J., Mironova G.D. (2015) Effect of surface-potential modulators on the opening of lipid pores in liposomal and mitochondrial inner membranes induced by palmitate and calcium ions Biochim. Biophys. Acta DOI: 10.1016/j.bbamem.2015.05.013

Монография:

18. Белослудцев K.H. и Миронова Г.Д. (2011) Митохондриальная пальмитат/Са2+-индуцированная пора: свойства и возможная роль в активации апоптоза. LAP Lambert academic publishing, Саарбрюкен.

Статьи в сборниках трудов конференций

19. Белослудцева Н.В., Белослудцев К.Н.. Миронова Г.Д. (2007). Пальмитат/Са2+-активируемая циклоспорин А-нечувствительная пора и ее возможная роль в митохондриальном кальциевом цикле. В сборнике «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино), стр. 166-168.

20. Шигаева М.И., Белослудцева Н.В., Белослудцев К.Н.. Чернохвостов Ю.В., Миронова Г.Д. (2007) Возрастные изменения в функционировании митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала и пальмитат/Са2+-активируемой поры. В сборнике «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино), стр. 202-204.

21. Белослудцева Н.В., Белослудцев К.Н.. Лукьянова Л.Д., Миронова Г.Д. (2009) Функционирование митохондриальных Са2+ -зависимых пор, отличающихся по чувствительности к циклоспорину А, в зависимости от устойчивости животного к гипоксии. В сборнике «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, стр. 565-569.

22. Миронова Г.Д., Белослудцев К.Н.. Сурин A.M., Трудовишников A.C., Белослудцева Н.В., Пинелис В.Г., Красильникова И.А., Ходоров Б.И. (2011) Митохондриальная липидная пора в механизме глутамат-индуцируемой кальциевой дерегуляции нейронов мозга. В сборнике «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», Пущино, Том 2, стр. 680-687.

23. Дубинин М.В., Белослудцев К.Н.. Белослудцева Н.В., Миронова Г.Д. (2011) Липидная пора, индуцированная жирными кислотами, как возможный механизм Sr2+-индуцированных колебаний ионных потоков. В сборнике «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», Пущино, Том 2, стр. 650-654.

24. Belosludtsev K.N.. Trudovishnikov A.S., Belosludtseva N.V., Mironova G.D.. (2012) The mitochondrial palmitate/Ca2+-induced pore as a nonspecific system of Ca2+ efflux. В сборнике «Biological motility. Fundamental and applied science», Пущино, стр. 32-35.

25. Белослудцев K.H.. Белослудцева H.B. , Кондратьев М.С., Пуртов Ю.А. (2013) Участите фосфолипазы А внешней мембраны Escherichia coli в Са2+-зависимой проницаемости бактериальных мембран. В сборнике «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», Пущино, Том 2, стр. 744-749.

26. Миронова Г. Д., Белослудцев К.Н.. Белослудцева Н.В. (2013) Участие пальмитат/Са2+-индуцированной поры в выходе Са2+ и Зг2+/Са2+-индуцированных осцилляциях ионных потоков в митохондриях печени крысы. В сборнике «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», Пущино, Том 2, стр. 701-706.

Более 30 тезисов докладов

Подписано в печать:

25.06.2015

Заказ № 10797 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Информация о работе

Белослудцев, Константин Николаевич
доктора биологических наук
Пущино, 2015
ВАК 03.01.02

Автореферат

Похожие работы