Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Длинноцепочечные α,ω-диоловые жирные кислоты как индукторы Ca2+-зависимой пермеабилизации митохондрий и липосом

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Длинноцепочечные α,ω-диоловые жирные кислоты как индукторы Ca2+-зависимой пермеабилизации митохондрий и липосом"

На правах рукописи

Дубинин Михаил Васильевич

Длшшоцепочечиые «,о)-диоловые жирные кислоты как индукторы Са2+-зависимой пермеабилизации митохондрий и липосом

03.01.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

8 АПР 2015

Пущино- 2015

005567100

005567100

Работа выполнена на кафедре биологии и в лаборатории молекулярной биоэнергетики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Марийский государственный университет, а также в лаборатории митохондриального транспорта Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Самарцев Виктор Николаевич

кандидат биологических наук Белослудцев Константин Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Опаиасенко Вера Константиновна,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН, старший научный сотрудник лаборатории биоэнергетики фотосинтеза

кандидат биологических наук Амерханов Зариф Гарриевич, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, старший научный сотрудник лаборатории механизмов природных гипометаболических состояний

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится^.&£в 14 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д.002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН и на сайте wwvv.icb.psn.ru.

Автореферат разослан ¿2 Отр^РО.

Ученый секретарь диссертационного совета

К.6.Н.

Смолихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Митохондрии не только обеспечивают клетку АТФ и теплом, но и участвуют в гибели клеток по механизмам апоптоза и некроза (Скулачев, 2012). В качестве одного из связанных с митохондриями звеньев гибели клеток рассматривается индукция Са2+-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны для растворимых в воде веществ с молекулярной массой до 1500 Да (открытие митохондриальной поры) (Rasóla and Bernardi, 2011). Эффективными природными индукторами неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени являются свободные монокарбоновые жирные кислоты (Sultan and Sokolove, 2001а, b; Di Paola and Lorusso, 2006). Одним из путей их метаболизма является œ-окисление, приводящее к образованию а,ш-дикарбоновых (диоловых) кислот (Wanders et al., 2011). В нормальных физиологических условиях только 5 - 10% монокарбоновых жирных кислот метаболизируется по данному пути. Однако уровень а,оо-диоловых кислот в клетках печени значительно повышается при некоторых патологических состояниях (ожирение, голодание, сахарный диабет и др.), а также при различных нарушениях метаболизма монокарбоновых жирных кислот (Wanders et al., 2011).

Данные о влиянии длинноцепочечных а,со-диоловых кислот на энергетические функции митохондрий фрагментарны и противоречивы. Так было установлено, что в отсутствие Са2г а,га-тетрадекандиоловая кислота (ТДК) стимулирует дыхание изолированных митохондрий печени без снижения мембранного потенциала (Маркова и др., 1999). В отличие от этого действие на митохондрии печени неметаболизирующегося аналога длинноцепочечных а,со-диоловых кислот MEDICA16 приводит как к стимуляции дыхания, так и к снижению мембранного потенциала (Hermesh et al., 1998). В присутствии Са2+ способность MEDICA16 снижать мембранный потенциал устраняется ЦсА, что рассматривается авторами как свидетельство способности MEDICA16 индуцировать неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий (Hermesh et al., 1998; Samovski et al., 2010). Интересно предположить, что природные а,со-диоловые кислоты так же эффективно, как насыщенные монокарбоновые жирные кислоты, способны индуцировать неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий и выход белков - индукторов клеточной гибели, в частности, цитохрома с, из органелл. В этом случае накопление а,со-диоловых кислот в клетках печени можно было бы рассматривать как один из факторов их гибели.

Цель работы: выяснение механизма циклоспорин А-нечувствительной Са2+-зависимой пермеабилизации (открытия поры) внутренней мембраны

митохондрий печени, индуцированной а,со-диоловыми кислотами, путей регуляции этого процесса и оценка его возможной роли в выходе из органелл цитохрома с.

Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:

1. Рассмотреть эффекты а,ю-диоловых кислот и, в частности, а,со-гексадекацдиоловой кислоты (ГДК) как индукторов неспецифической пермеабилизации внутренней мембраны митохондрий печени, нагруженных ионами кальция и стронция в присутствии и отсутствии циклоспорина А.

2. Определить основные условия, необходимые для индукции ГДК/Са зависимой неснецифической поры во внутренней мембране митохондрий печени.

3. Оценить влияние различных модуляторов энергетических функций митохондрий, а также ионной силы среды инкубации на процесс индукции ГДК/Са2+-зависимой неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий печени.

4. Исследовать возможность выхода цитохрома с из митохондрий печени в процессе индукции поры ГДК и Са2+.

5. Оценить возможность индукции а,со-диоловыми кислотами Са2+-зависимой пермеабилизации мембраны липосом.

Научная новизна работы. Впервые выявлены особенности действия насыщенных длинноцепочечных а,м-диоловых кислот, в частности а,со-гексадекандиоловой кислоты (ГДК), на митохондрии печени как индукторов Са2+-зависимой циклоспорин А (ЦсА)-нечувствительной неспецифической пермеабилизации внутренней мембраны (открытие поры). Выявлены закономерности в ослаблении эффекта ГДК как индуктора Са2+-зависимой неспецифической поры в митохондриях печени под влиянием различных физиологических модуляторов, которые: а) вызывают деэнергизацию митохондрий (разобщители окислительного фосфорилирования); б) способны связывать ионы кальция (АТФ и АДФ); в) экранируют отрицательные поверхностные заряды на мембране, а также влияют на транспорт Са2+ в митохондриях и спермин); г) связывают свободные жирные кислоты

(бычий сывороточный альбумин (БСА)). Получены условия, при которых в процессе индукции такой поры происходит выход из митохондрий цитохрома с. Выяснено, что а,а>-диоловые кислоты способны индуцировать зависимую пермеабилизацию липосом для флуоресцентного зонда сульфородамина Б путем слияния и/или аггрегации липидных везикул.

Научно-практнческое значение работы. Полученные при выполнении диссертационной работы научные результаты имеют, прежде всего, фундаментальное биологическое значение. Они расширяют и углубляют представление о механизмах функционирования митохондрий в норме и патологии. Результаты диссертационного исследования могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в области биохимии, биоэнергетики, биофизики, клеточной патофизиологии и экспериментальной медицины, поскольку, к настоящему времени показано, что Са2+-зависимая митохоидриальная пора вовлечена в индукцию ряда патофизиологических явлений, таких как ишемия, нейродегенеративные заболевания, диабет и другие. Кроме того, известно, что уровень а,ю-диоловых кислот в клетках печени значительно повышается при некоторых патологических явлениях (ожирение, голодание, сахарный диабет и др.).

Основные научные положения, выносимые на защиту.

1. Свободные длинноцепочечные а,со-диоловые кислоты (среди них наиболее эффективно ГДК) способны индуцировать Са2+-зависимую циклоспорин А-нечувствительную неспецифическую пермеабилизацию внутренней мембраны (открытие поры) митохондрий печени и мембраны лецитиновых липосом.

2. Действие ГДК как индуктора Са2+-зависимой неспецифической поры в митохондриях печени регулируется с помощью физиологических модуляторов: АТФ, АДФ, 1У^2+, спермин, БСА.

3. Обоснованная гипотеза о том, что накопление а,<о-диоловых кислот в клетках печени может быть одним из факторов их гибели при различных патологических состояниях, связанных с нарушением метаболизма липидов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на 38-м и 39-м Конгрессах федерации европейских биохимических обществ (Санкт-Петербург, 2013 г.; Париж, 2014 г.); на IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012 г.); на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011 г. и 2013 г.); на международных конференциях молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2012 г. и 2014 г.); на 16-ой, 17-ой и 18-ой международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2012, 2013, 2014 г.); V международной научной конференции «Принципы и способы сохранения биоразнообразия» (Йошкар-Ола, 2013 г.).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009 - 2011 годы)» (№ 2.1.1/13090),

з

Федеральной целевой программы Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение 14.В37.21.0191), грантов РФФИ (№14-04-00688-а; 14-34-50380-мол_нр), государственного задания Министерства образования и науки Российской Федерации (проекты №4.8257.2013 и №1365).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 6 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, и 14 тезисов докладов региональных, всероссийских и международных научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 123 страницах, включая список литературы, иллюстрационный материал включает 36 рисунков и 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение митохоидрий из печени крыс. Митохондрии из печени белых беспородных крыс-самцов (возраст 9-12 месяцев и масса тела 220 - 260 г.) выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим удалением эндогенных жирных кислот с помощью БСА (Маркова и др., 1999). Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ ЭГТА и 5 мМ МОПС-Трис (рН 7,4). Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали БСА.

Оценка функциональных параметров митохондрий. Исследование проницаемости внутренней мембраны митохондрий для Са2+ и 8г21" проводили с помощью Са2+-селективного электрода и универсального иономера И-500 («Аквилон», Россия) в ячейке объемом 10 мл и при температуре 25°С. Набухание митохондрий регистрировали по изменению оптической плотности суспензии митохондрий (А) при длине волны 540 нм на спектрометре «КФК-3-01» («ЗОМЗ», Россия) в кювете объемом 4 мл и при температуре 25°С. Трансмембранный электрический потенциал (Л\|/) на внутренней мембране митохондрий оценивали по распределению катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+) через внутреннюю мембрану, концентрацию которого регистрировали с помощью ТФФ+-чувствительного электрода (Като е1 а1., 1979) в кювете объемом 2 мл при постоянном перемешивании и термостатировании (25°С). Потребление кислорода митохондриями оценивали с помощью кислородного электрода Кларка и полярографа ЬР-9. Среда инкубации (сахарозная) содержала 200 мМ сахарозу, 20 мМ КС1, 20 мкМ ЭГТА, 5 мМ янтарную кислоту, 10 мМ МОПС-Трис (рН 7,4). В ряде экспериментов была использована среда инкубации, которая была изотоничпа первой, но вместо сахарозы содержала 125 мМ КС1 (КС1-среда). В ячейку сразу после митохондрий (0,8 -

4

1,5 мг/мл) добавляли ротенон (2 мкМ) и, если это необходимо, 1 мкМ циклоспорин А.

Определение вышедшего из митохондрий цитохрома с. Содержание вышедшего из митохондрий цитохрома с (нмоль/мг митохондриального белка) определяли спектрометрически при длине волны 414 нм как показано в работе (Appaix et al., 2000). Концентрацию цитохрома с рассчитывали, используя предварительно полученную калибровочную кривую, в качестве стандарта использовали раствор цитохрома с в среде инкубации.

Формирование и измерение проницаемости больших однослойных липосом, загруженных сульфородамином Б. Однослойные липосомы, загруженные сульфородамином Б, получали общепринятым методом экструзии (Agafonov et al., 2003). Измерение неспецифической проницаемости липосомальной мембраны оценивалось по выходу красителя из липосом методом флуориметрии на спектрофлуориметре «Ocean Optics USB 2000». Состав буфера: 10 мМ Трис-HCl (рН 8.5), 50 мкМ ЭГТА, и 40 мМ КС1.

Акустические исследования. Влияние ГДК и Са2+ на изменение температуры фазового перехода фосфолипидных мембран было изучено с помощью ультразвукового спектрометра фиксированной длины с применением метода цифрового анализа гармонических сигналов (Kharakoz, 2007; Асташев и др., 2014).

Динамическая спектроскопия. Измерение размеров наночастиц (липосом), основанное на определении коэффициента диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализа характерного времени флуктуаций интенсивности рассеянного света, производилось методом динамического рассеяния света (ДРС) с помощью лазерного анализатора Zetasizer Nano ZS («Malvern Instruments», UK).

Статистическая обработка результатов исследований. Полученные данные были обработаны статистически с использованием /-критерия Стьюдента с помощью пакета прикладных компьютерных программ «Statistica». Для оценки значимости различий использовался уровень вероятности Р < 0,05.

Химические реактивы. В работе использовались МОПС, а,(й-додекандиоловая кислота (ДДК), а,со-теградекандиоловая кислота (ТДК), а,со-гексадекавдиоловая кислота (ГДК), рутениевый красный, олигомицин, янтарная кислота, пальмитиновая, олеиновая и линолевая кислоты, циклоспорин А, очищенный от жирных кислот БСА фракции V, Трис-ОН, хлорид тетрафенилфосфония, спермин тетрагидрохлорид, цитохром с, яичный фосфатидилхолин (лецитин), сульфородамин Б, («Sigma», США), ротенон, ЭГТА («Serva», Германия), ПЭГ молекулярной массой 35 кДа, сахароза, АТФ,

5

АДФ, 2,4- динитрофснол, КС1 («Fluka» Швейцария), СаС12, SrCI2, MgCl2 («Мегск», Германия), ДПФХ («Avantilipids, Inc.», США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение эффектов а,а)-диоловых кислот как индукторов ЦсА-нечувствительной Са2+-зависимой неспецифической пермеабилизации митохондрий печени

1.1. Влияние а,м-диоловых кислот в присутствии ЦсА на оптическую плотность суспензии митохондрий печени, нагруженных ионами кальция и стронция

Внесение к митохондриям последовательно хлорида кальция (200 мкМ) и ГДК (20 мкМ) приводит к значительному снижению оптической плотности суспензии (рис. 1, кривая в), что свидетельствует о высокоамплитудном набухании этих органелл. При этом изменения оптической плотности суспензии митохондрий не происходит при добавлении только хлорида кальция (рис. 1, кривая а) или только ГДК (рис. 1, кривая б). Предварительная инкубация митохондрий с 1 мкМ ЦсА не оказывает существенного влияния на кинетику набухания митохондрий (рис. 1, кривая г).

При замене хлорида кальция хлоридом стронция в той же концентрации ГДК в присутствии ЦсА также индуцирует набухание митохондрий.

б

гдк

Рис. 1. Влияние ионов кальция (а), ГДК (б), их совместного действия в отсутствие (в) и в присутствии (г) ЦсА на кинетику изменения оптической плотности суспензии митохондрий печени. Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 200 мкМ хлорида кальция (Са2+), 20 мкМГДК, 1 мкМЦсА.

Проведено сравнение действия ГДК как индуктора открытия поры во внутренней мембране митохондрий печени с аналогичными эффектами а,<в-

6

тетрадекандиоловой (ТДК) и а,со-додекандиоловой кислот (ДДК), имеющих в ацильной цепи соответственно на 2 и 4 атома углерода меньше, чем у ГДК. Установлено, что по мере уменьшения числа атомов углерода в ацильной цепи а,й)-диоловой кислоты ее эффективность резко снижается.

1.2. Влияние ГДК в присутствии ЦсА на способность митохондрий удерживать ионы кальция и стронция

В присутствии ЦсА митохондрии печени практически полностью поглощают Са2+ в течение 2 мин и удерживают их в матриксе как минимум 12 мин (рис. 2, кривая а). Ингибитор кальциевого унипортера - рутениевый красный (ВетагсП, 1999; Сарис и Карафоли, 2005) блокирует вход Са^+ в матрикс митохондрий (рис. 2, кривая в). Добавление 20 мкМ ГДК к суспензии митохондрий, предварительно нагруженных Са2+, приводит к резкому увеличению концентрации этих ионов, что свидетельствует о выходе их из матрикса в среду инкубации (рис. 2, кривая б). В случае добавления ГДК к митохондриям, предварительно нагруженным Бг21 , наблюдается аналогичная картина.

Рис. 2. Кинетика изменения концентрации Са2+ в суспензии митохондрий печени в присутствии рутениевого красного (а), при добавлении ГДК (б) и в отсутствие добавок (в). Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: I мкМ ЦсА (не показано), I мкМ рутениевого красного (не показано), 200 мкМ хлорида кальция (Са2+), 20 мкМ ГДК.

1.3. Влияние ГДК в присутствии ЦсА на разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий печени, нагруженных ионами кальция

Добавление Са2+ к суспензии митохондрий печени приводит к временному падению мембранного потенциала (Ду), который в течение нескольких минут восстанавливается и не изменяется как минимум 20 мин вплоть до последующего добавления ДНФ (рис. 3, кривая о). Добавление 20 мкМ ГДК после внесения Са2+ приводит к быстрому падению Д*|/ (рис 3, кривая б).

[Са2+],мкМ

1 мин.

[ТФФ*], мкМ

1,5- |

1,8

Са2*

О

а

Рис. 3. Кинетика выхода ТФФ+ из митохондрий печени при добавлении Са2+ (кривая а) и ГДК в присутствии

?

ДНФ

у

.— а 7+ • •

( Са (б). Условия эксперимента и состав

среды инкубации приведены в разделе

«Материалы и методы исследования».

Добавки: 1 мкМ ЦсА (не показано), 200

мкМ хлорида кальция (Са2+), 20 мкМ

0.3

ГДК, 100 мкМ ДНФ.

О 4—,.............——V-

0 2 4 6 8 1012141618202224 26283032

Время, мин

Полученные результаты свидетельствуют о том, что индуцированное ГДК набухание митохондрий печени, предварительно нагруженных Са2+ или Бг2+, сопровождается выходом этих ионов из матрикса, а также падением Ду. Следовательно, ГДК в присутствии Са2+ или Бг2+ в митохондриях печени индуцирует неспецифическую пермеабилизацию внутренней мембраны. ЦсА, присутствующий в среде инкубации, не ингибирует наблюдаемые процессы (рис. 1-3). Это позволяет говорить о том, что при данных условиях в митохондриях печени открывается ЦсА-нечувствительная неспецифическая пора.

2. Условия необходимые для проявления действия ГДК

2.1. Энергизация митохондрий и наличие Са2+ в матриксе как одни из необходимых условий индукции поры ГДК

Высокоамплитудное ЦсА-нечувствителыюе набухание митохондрий, индуцированное ионами кальция и ГДК, наблюдается лишь в присутствии субстратов окисления — в данном случае сукцината (рис. 4, кривая б). При добавлении к митохондриям протонофорного разобщителя (2,4-динитрофенол в концентрации 75 мкМ, оптимальной для его действия) ГДК в присутствии С а2* индуцирует набухание органелл в существенно меньшей степени, несмотря на наличие сукцината в среде инкубации (рис. 4, кривая в).

В присутствии ЦсА митохондрии печени практически полностью поглощают Са2+ в течение 2 мин, последующее добавление ГДК (20 мкМ) к суспензии митохондрий приводит к резкому увеличению концентрации этих ионов, что свидетельствует об их выходе из матрикса в среду инкубации (рис. 5, кривая а). В отсутствие сукцината митохондрии не поглощают Са2+, и последующее добавление ГДК не влияет на этот процесс (рис. 5, кривая б).

Рис. 4. Кинетика изменения оптической плотности суспензии митохондрий печени, индуцированная последовательным добавлением ионов кальция и ГДК, в присутствии сукцината (а); в отсутствие сукцината и при последующем его добавлении (б); в присутствии сукцината и 2,4-динитрофенола (в). Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 1 мкМ ЦсА (не показано), 200 мкМ хлорида кальция (Са2+), 20 мкМ ГДК, 5 мМ сукцината калия (Сукцинат), 75 мкМ 2,4-динитрофенола (ДНФ).

13

Рис. 5. Кинетика изменения концентрации Са2+ в суспензии митохондрий печени при добавлении ГДК в присутствии сукцината (а); в отсутствие сукцината и при последующем его добавлении (б). Условия эксперимента и состав среды инкубшщи приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки, как в подписи к рис. 4.

1 мин

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в отсутствие субстрата окисления Са2+ не аккумулируется в матриксе митохондрий и последующее добавление ГДК не приводит к открытию поры. Необходимость присутствия ионов кальция в матриксе органелл для индукции поры ГДК подтверждена в экспериментах с рутениевым красным, ингибитором кальциевого унипортера митохондрий (рис. 6). Следовательно, одним из основных условий индукции ионами кальция и ГДК открытия поры в митохондриях печени является энергизация органелл, способствующая транспорту Са2+ в матрикс.

б

в

РК Ф<

Рис. 6. Влияние рутениевого красного на кинетику изменения оптической плотности суспензии митохондрий печени. Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 1 мкМ ЦсА (не показано), 200 мкМ хлорида кальция (Саг+), 20 мкМ ГДК, 1 мкМ рутениевого красного (РК). Кривая а - РК (1 мкМ) был добавлен в среду инкубации до внесения митохондрий.

о

Ж J

5 1 мин.

2.2. Влияние высокомолекулярных ПЭГ на пермеабилизацию митохондрий, индуцированную ГДК и ионами кальция

Внесение ПЭГ (МА=35 кДа) к митохондриям при условии индукции циклоспорин А-чувствительной поры с помощью Са2+ и неорганического фосфата (Фн) приводит к существенному сокращению объема матрикса органелл (рис. 7, кривая а), что рассматривается как свидетельство наличия открытой поры (Sultan and Sokolove, 2001а). В отличие от этого добавление ПЭГ к митохондриям при условии индукции ГДК Са2+-зависимой ЦсА-нечувствитеяьной поры не вызывает изменения оптической плотности (рис. 7, кривая б).

Исходя из этих данных, можно было бы предположить, что ГДК-индуцированная ЦсА-нечувствительная пора способна самопроизвольно закрываться. Однако нельзя полностью исключить и то, что размер образуемой поры достаточно велик, и молекулы ПЭГ проходят в матрикс митохондрий, не влияя при этом на его объем.

Са2*

Рис. 7. Сравнение эффектов ПЭГ (МА=35 кДа) на кинетику изменения оптической плотности суспензии мнтохондрий печени при индукции поры Ф„ и Са2+ (а) и при действии ГДК (б). Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 1 мкМ ЦсА, 200 мкМ хлорида кальция (Са2+) 1 мМ Ф„, 20 мкМ ГДК, 2,5 мМ полиэтиленгликоля (ПЭГ).

3. Влияние некоторых физиологических модуляторов на процесс индукции поры ионами кальция и ГДК

Ненасыщенные жирные кислоты (олеиновая и линолевая кислоты), ингибируют набухание митохондрий, индуцированное последующим добавлением Са2+ и ГДК (рис. 8). По-видимому, способность ненасыщенных жирных кислот, в данном случае олеиновой и линолевой, ингибировать индуцированное ГДК открытие поры в присутствии ЦсА и хлорида кальция также обусловлена деэнергнзацией органелл, препятствующей транспорту Са2+ в матрикс.

Рис. 8. Изменение оптической плотности суспензии митохондрий печени, индуцированное последовательным добавлением ионов кальция и ГДК в присутствии олеиновой кислоты (а), линолевой кислоты (б) и в отсутствии добавок (в). Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 1 мкМ ЦсА (не показано), 200 мкМ хлорида кальция (Са24), 20 мкМ ГДК, 40 мкМ олеиновой кислоты (ОК), 40 мкМ линолевой кислоты (ЛК).

1 мин

20 мкМ ГДК индуцирует высокоамплитудное набухание митохондрий в присутствии 50 мкМ Са2+ (рис. 9, кривая в). АТФ в концентрации 2 мМ полностью ингибирует высокоамилитудное набухание митохондрий, индуцированное добавлением 50 мкМ хлорида кальция и ГДК (рис. 9, кривая а). Анатогичным действием обладает и АДФ в той же концентрации (рис. 9 кривая б).

а

АТФ ГДК

* 4-

Са2*

Рис. 9. Кинетика изменения оптической плотности суспензии митохондрий печени, индуцированного ионами кальция и ГДК, в присутствии АТФ (а), АДФ (б) и в их отсутствие (в). Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 1 мкМ ЦсА (не показано), 2 мкг/мл олигомицин (не показало), 2 мМ АТФ, 2 мМ АДФ, 50 мкМ хлорида кальция (Са2+) и 20 мкМ ГДК.

Известно, что нукпеотиды способны связывать Са"+ (Di Stefano and Neuman, 1953). Следовательно, одним из возможных механизмов ингибирующего действия АТФ как физиологического модулятора на индуцированное Са2+ и ГДК открытие неспецифической поры в митохондриях печени может быть связывание ионов кальция.

Хлорид магния и спермин ингибируют набухание митохондрий, индуцированное последовательным добавлением 200 мкМ Са2+ и 20 мкМ ГДК (рис. 10).

Рис. 10. Кинетика изменения оптической плотности суспензии митохондрий печени, индуцированная последовательным добавлением хлорида кальция и ГДК, в присутствии сукцината (а); сукцината и ионов магния (б); сукцината и спермина (в). Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 1 мкМ ЦсА (не показано), 200 мкМ хлорида кальция (Са2+), 20 мкМ ГДК, 3 мМ хлорида магния (Мя24), 1 мМ спермина.

S3.

< 1 мин

По-видимому, подавление открытия поры ионами магния и спермином связано с их способностью экранировать отрицательные поверхностные заряды на внутренней мембране митохондрий, в том числе, образованные карбоксильными группами ГДК.

БСА ингибирует набухание митохондрий, индуцированное Са2+ и ГДК. Однако при одинаковом молярном соотношении БСА/жирная кислота эффект БСА гораздо менее выражен в случае индукции поры ГДК, чем пальмитиновой кислотой (рис. 11).

Рис. 11. Зависимость амплитуды набухания митохондрий печени (в % от максимальной) от молярного соотношения БСА/жирная кислота (ЖК). Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 1 мкМ ЦсА, 200 мкМ хлорида кальция; 20 мкМ ГДК, 40 мкМ пальмитиновой кислоты (Пальм), 4, 8 и 17 мкМ БСА. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего (и = 3).

О 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0,6 0.7 0.8 0.9

[ЕСАИХК.]

Как известно, БСЛ на порядок хуже связывает а,ю-диоловые кислоты, чем их монокарбоновые аналоги (Tonsgard and Meredith, 1991). Следовательно, наблюдаемое нами различие в ингибирующем действии БСА может быть связано с тем, что БСЛ имеет более низкое сродство к ГДК, чем к пальмитиновой кислоте.

4. Влияние ионной силы среды инкубации на процесс индукции ГДК и Са2+ неспецифической поры в митохондриях печеин

При замене сахарозной среды инкубации KCl-средой небольшое снижение оптической плотности суспензии митохондрий наблюдается уже при внесении Са2+, и в этом случае последующее добавление ГДК приводит к существенному снижению оптической плотности суспензии (рис. 12, кривая б). В случае инкубации органелл в сахарозной среде, снижение оптической плотности суспензии органелл наблюдается лишь после последовательного добавления Са2+ и ГДК (рис. 12, кривая а). Следует отметить, что амплитуда набухания органелл, индуцированная Са2+ и ГДК, больше при их инкубации в сахарозной среде, чем в KCl-среде. Мы предполагаем, что снижение амплитуды набухания при индукции проницаемости митохондрий, инкубируемых в KCl-среде, может быть связано с экранированием отрицательных поверхностных зарядов на внутренней мембране митохондрий (Wojtczak and Nalecz, 1979).

Рисунок 12. Кинетика изменения оптической плотности суспензии митохондрий печени в сахарозной (а) и КС1- (б) средах инкубации при добавлении только Са2+ (пунктирная линия) и Са2+ и ГДК (сплошная линия). Условия эксперимента и состав сред инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 1 мкМ ЦсА (не показано), 200 мкМ хлорида кальция (Са2+), 20 мкМ ГДК.

Митохондрии печени, инкубируемые в сахарозной среде в присутствии 1 мкМ ЦсА, способны поглощать добавленный Са2+ в течение 2 минут и удерживать его в матриксе как минимум 16 минут (рис. 13, кривая а). При этих условиях добавление 20 мкМ ГДК приводит к быстрому выходу Са2+ из матрикса (рис. 13, кривая б). При замене сахарозной среды КС1-средой митохондрии печени удерживают большую часть добавленного Са2+ в матриксе

не более 4 минут, однако более полный выход Са2+ происходит только при последующем добавлении 20 мкМ ГДК (рис. 13, кривая в). В этих условиях добавление ГДК в той же концентрации через 2 мин после внесения Са2+ приводит к быстрому выходу этих ионов из матрикса (рис. 13, кривая г).

Рис. 13. Индуцированный ГДК выход Са2+ из митохондрий печени в сахарозной (кривые а и б) и КС1- (кривые в и г) средах инкубации. Условия эксперимента и состав сред инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования» и в подписи». Добавки: 1 мкМ ЦсА (не показано), 200 мкМ хлорида кальция (Са2+), 20 мкМ ГДК. Кривая а - без ГДК; кривые б иг- ГДК добавлен ю 12 14 16 18 го 22 через 3 мин после Са2+; кривая в - ГДК Время, мин добавлен через 17 мин после Са2+.

Как было показано на рис 3 (кривая б), добавление 20 мкМ ГДК после внесения Са2+ приводит к быстрому падению Ду. При инкубации митохондрий в КС1-среде Ау, сниженный после внесения Са2+, повышается в меньшей степени и затем снова снижается. В этом случае добавление ГДК после внесения Са2+ также приводит к быстрому падению Дополученные результаты свидетельствуют о том, что при инкубации митохондрий печени в сахарозной среде выход Са2' из митохондрий (рис. 13, кривая б) и падение Д\|/ наблюдаются только при добавлении ГДК и сопровождаются набуханием органелл (рис. 12. кривая а). В отличие от этого при инкубации митохондрий в КС1-среде выход Са24" (рис. 13, кривая в) и падение Ду происходят в отсутствие ГДК, но только в присутствии этой жирной кислоты наблюдается набухание органелл (рис. 12, кривая 6). Мы полагаем, что при инкубации митохондрий в КС1-среде выход Са2+ и падение Ду, не связанные с действием ГДК, вызваны индукцией проницаемости внутренней мембраны органелл для Са2+ и К+.

5. Индукция ГДК и Са2+ неспецифической пермеабилизации митохондрий приводит к выходу цитохрома с из митохондрий

В процессе инкубации интактных митохондрий в сахарозной среде наблюдается выход цитохрома с в среду инкубации. Добавление только Са2+ или только ГДК существенно не влияют на количество вышедшего из митохондрий цитохрома с (рис. 14). Полученные данные согласуются с известными из литературных источников, свидетельствующими о том, что выход цитохрома с может происходить в процессе инкубации энергизованных

100

ГС

с & 80

д 60

g

s 40

а

о* 20

5

БД.

Са2* ГДК Са2*+ГДК

путем окисления сукцината митохондрии печени и в отсутствие индукции неспецифической проницаемости, без существенного набухания матрикса (Crouser et al., 2003). Выход цитохрома с из митохондрий печени существенно усиливается в присутствии одновременно Са2+ и ГДК, т.е. при условии индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны в высокопроводящем состоянии, приводящей к набуханию органелл (рис. 14).

Рис. 14. Сравнение количества вышедшего из митохондрий печени цитохрома с (Цит с) при условии их инкубации в отсутствии (без добавок, Б.д.) и в присутствии: 200 мкМ хлорида кальция (Са2+), 20 мкМ ГДК (ГДК), 200 мкМ хлорида кальция и 20 мкМ ГДК (Са2 ' + ГДК). Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего (п = 3). *- различия между опытом (Са2++ГДК) и контролем (Б.д.) статистически значимы, р < 0,001 (критерий Стьюдента).

Исходя из того, что при индукции поры ГДК и ионами кальция наблюдается выход цитохрома с, накопление а,со-диоловых кислот в клетках печени может рассматриваться как один из факторов их гибели при различных патологических состояниях, связанных с нарушением метаболизма липидов.

6. Индукция а,о>-диоловыми кислотами Са2+-зависимон пермеабилизации липосом

ГДК в присутствии Са2+ способна индуцировать проницаемость липосом для флуоресцентного зонда сульфородамина Б (СрБ) (рис. 15, кривая в). Более короткоцепочечная ТДК менее эффективна, чем ГДК, как индуктор проницаемости липосом для СрБ (рис. 15, кривая а).

Рис. 15. Выход сульфородамина Б (СрБ) из однослойных липосом индуцированный ионами кальция (б), ГДК в присутствии ионов кальция (в) и ТДК в присутствии ионов кальция (а). Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы исследования». Добавки: 50 мкМ ГДК; 400 мкМ ТДК; 1 мМ хлорида кальция (Са2+); 0.1%ТХ-100.

1,5

Э * 5 6 7 Время, мин

Нами предположено, что ГДК/Са2+-индуцированная пермеабилизация липоеом может быть обусловлена разрушением части везикул, поскольку рабочая концентрация ГДК достаточно высока. Мы исследовали влияние ГДК и Са21 на размер липоеом методом динамического рассеяния света. Как видно на рис. 16, средний гидродинамический диаметр контрольных липоеом при данных условиях составляет порядка 140 нм. Добавление ГДК к суспензии липоеом не приводит к изменению среднего размера везикул. Однако последующее добавление Са2+ приводит к существенному (до 520 нм) увеличению гидродинамического диаметра липоеом.

Рис. 16. Интенсивность распределения липоеом по размерам измеренная методом динамического светорассеяния. Условия эксперимента и состав среды инкубации приведены в разделе «Материалы и методы /\ I 1 исследования». Точечная линия, липосомы (50 ( V I I мкМ лецитина). Пунктирная линия, липосомы / \ / | мкМ лецитина)+75 мкМ ГДК. Сплошная

линия, липосомы (50 мкМ лецитина) +75 мкМ

~~ ГДК+1 мМ Са2+.

Диаметр, нм

Полученные результаты можно рассматривать как свидетельство того, что ГДК в присутствии Са2+ способна индуцировать пермеабилизацию липоеом для флуоресцентного зонда СрБ путем слияния и/или агрегации везикул.

Нами предположено, что описанный механизм формирования липидной поры при участии Са2т и ГДК реализуется и в митохондриях печени. Вероятно, ГДК в присутствии Са2+ способна вызывать слияние внешней и внутренней мембран митохондрий, результатом чего может быть образование поры слияния. Это, в свою очередь, приводит к набуханию митохондрий. Такое слияние внешней и внутренней митохондриальных мембран в присутствии ГДК и Са2+, как предполагается, может происходить в зоне контактных сайтов митохондрий, где есть естественное сближение двух мембран.

ВЫВОДЫ

1. а,оз-Диоловые кислоты (среди них наиболее эффективно а,м-гексадекандиоловая кислота (ГДК)) в митохондриях печени, нагруженных ионами кальция или стронция, способны индуцировать неспецифическую пермеабилизацию внутренней мембраны митохондрий по механизму, нечувствительному к циклоспорину А (ЦсА).

2. Основным условием индукции ГДК/Са21" -зависимой поры во внутренней мембране митохондрий печени является осуществление эффективного транспорта Ca в матрикс с помощью кальциевого унипортера, а также энергизация органелл, способствующая этому транспорту.

3. Действие ГДК как индуктора Са^'-зависимой ЦсА-нечувствительной неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий печени ослабляется следующими модуляторами энергетических функций митохондрий: АТФ и АДФ при условии связывания Са2+; спермином и Mg2', способными экранировать отрицательные поверхностные заряды на мембране; бычьим сывороточным альбумином, способным связывать свободные жирные кислоты.

4. ГДК эффективно индуцирует Са2+-зависимую ЦсА-нечувствительную пермеабилизацию внутренней мембраны митохондрий печени, инкубируемых как в сахарозной среде, так и в КС1-среде.

5. При индукции ГДК/Са2+-зависимой неспецифической поры происходит выход из митохондрий цитохрома с.

6. ГДК индуцирует Са2+-зависимую пермеабилизацию липосом. Такое действие ГДК сопровождается слиянием и (или) агрегацией везикул.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Рыбакова С.Р., Дубинин М.В., Самарцев В.Н. Особенности активации свободного окисления в митохондриях печени а,ю-тетрадекандиоловой кислотой // Биологические мембраны. - 2013. - Т. 30. - № 1. - С. 30-39.

2. Дубинин М.В., Адакеева С.И., Самарцев В.Н. Длинноцепочечные а,ю-диоловые кислоты как индукторы циклоспорин А-нечувствительной неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени, нагруженных ионами кальция или стронция // Биохимия. - 2013. — Т. 78. - Вып. 4.-С. 533-540.

3. Дубинин М.В., Ведерников A.A., Адакеева С.И., Хорошавина Е.И., Самарцев В.Н. Физиологические модуляторы циклоспорин А-нечувствительной неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени, индуцированной ионами кальция и а,со-гексадекандиоловой кислотой // Биологические мембраны. - 2013. -Т. 30. - № 5-6. - С. 364-371.

4. Дубинин М.В., Ведерников A.A., Хорошавина Е.И., Самарцев В.Н. Индукция а,ш-гексадекандиоловой кислотой кальций-зависимой циклоспорин А-нечувствительной неспецифической проницаемости внутренней мембраны

митохондрий печени и освобождения цитохрома С в средах различной ионной силы // Биохимия. - 2014. - Т. 79. - Вып. 6. - С. 726-733.

5. Dubinin M.V., Samartsev V.N., Astashev М.Е., Kazakov A.S., Belosludtsev K.N. A permeability transition in liver mitochondria and liposomes induced by a,co-dioic acids and Ca2+ // European Biophysics Journal. - 2014. - V.43. - №10. - P. 565-572.

6. Белослудцев K.H., Белослудцева H.B., Дубинин M.B., Гудков C.B., Пеньков

H.В., Самарцев В.Н. Влияние спермина на Са2+-зависимую проницаемость митохондрий и липосом, индуцированную пальмитиновой и а,со-гексадекандиоловой кислотами // Биофизика. - 2014. - Т. 59. - Вып. 5. - С. 895901.

Тезисы:

I. Дубинин М.В., Адакеева С.И., Иванова А.Е., Самарцев В.Н. Индукция а,со — гексадекандиоловой кислотой циклоспорин А - нечувствительной поры во внутренней мембране митохондрий печени, нагруженных ионами двухвалентных металлов // Биология — наука XXI века. 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 16 — 21 апреля 2012 г.): сборник тезисов. - Пущино, 2012. - С. 175-176.

2. Дубинин М.В., Адакеева С.И., Иванова А.Е., Самарцев В.Н. а,ю-Гексадекандиоловая кислота индуцирует неспецифическую Са2*-зависимую ЦсА-нечувствительную проницаемость митохондрий печени // Актуальные проблемы экологии, биологии и химии: материалы конференции по итогам НИР БХФ за 2011 г. - Йошкар-Ола: Map. гос. ун-т, 2012. - Вып. 3. - С. 57-58.

3. Дубинин М.В., Адакеева С.И., Иванова А.Е., Самарцев В.Н. Индукция а,ш-дикарбоновыми жирными кислотами неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий // IV Съезд биофизиков России 20-26 августа 2012 г. Симпозиум I «Новые тенденции и методы в биофизике»: материалы докладов. - Нижний Новгород, 2012. - С. 95.

4. Дубинин М.В., Адакеева С.И., Хорошавина Е.И., Самарцев В.Н. Изучение механизмов циклоспорин А-нечувствителыюй кальций-зависимой индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени длинноцепочечными а,го-диоловыми кислотами // Международная конференция молодых ученых. 22-24 октября 2012 г. «Экспериментальная и теоретическая биофизика ' 12»: сборник тезисов. - Пущино, 2012. - С. 84.

5. Дубинин М.В., Адакеева С.И., Ведерников A.A., Хорошавина Е.И., Самарцев В.Н. а,ш-Диоловые кислоты в митохондриях печени индуцируют неспецифическую проницаемость внутренней мембраны и выход цитохрома С // Актуальные проблемы экологии, биологии и химии: материалы

Республиканской научно-практической конференции. - Йошкар-Ола: Map. гос. ун-т, 2013.-Вып. 4.-С. 14-18.

6. Дубинин М.В., Ведерников А.А., Адакеева С.И., Хорошавина Е.И., Самарцев В.Н. Влияние ионной силы среды инкубации на выход цитохрома с из митохондрий печени при условии открытия поры во внутренней мембране а,со-гексадекаидиоловой кислотой // Биология - наука XXI века. 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 21 -26 апреля 2013 г.): сборник тезисов. - Пущино, 2013.-С. 116.

7. Дубинин М.В., Ведерников А.А., Адакеева С.И., Хорошавина Е.И., Самарцев В.Н. Физиологические модуляторы циклоспорин А-нечувствительной неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени, индуцированной ионами кальция и а,со-гексадекандиоловой кислотой // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: международная конференция (Пущино, 27-30 мая 2013 г.): сборник статей. - Пущино, 2013. - Т. 2. - С. 666670.

8. Dubinin M.V., Khoroshavina E.I., Vedernikov А.А., Adakeeva S.I., Samartsev V.N. Induction of non-selective permeability of the inner membrane of rat liver mitochondria by a,co-dicarboxylic acids // FEBS Journal. - 2013. - V. 280 (Suppl. 1). - P. 252-253.

9. Dubinin M.V., Vedernikov A.A., Khoroshavina E.I., Adakeeva S.I., Samartsev V.N. The effect of ionic strength of incubation medium on the cytochrome с release from liver mitochondria under conditions of the pore opening by a,co-hexadecanedioic acid // FEBS Journal. - 2013. - V. 280 (Suppl. 1). - P. 255.

10. Самарцев В. H., Дубинин М. В., Ведерников А. А., Адакеева С. И., Хорошавина Е. И. Взаимодействие свободных жирных кислот с митохондриями печени животных: Механизмы и физиологическое значение // Принципы и способы сохранения биоразнообразия: материалы V Международной научной конференции: в 2 ч. / Map. гос. ун-т. - Йошкар-Ола, 2013. - Часть II. С. 47-52.

11. Дубинин М.В., Самарцев В.Н., Асташев М.Е., Казаков А.С., Белослудцев К.Н. Индукция Са2,-зависимой проницаемости липосом а,со-гексадекандиоловой кислотой // Биология - наука XXI века. 18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 21 -25 апреля 2014 г.): сборник тезисов. - Пущино, 2014.-С. 91.

12. Dubinin M.V., Samartsev V.N., Belosludtsev K.N. Membrane Fusion Induced by a,<B-Dioic Acids and Ca2+ as a Mechanism of Cyclosporin A-Insensitive Permeability Transition in Liver Mitochondria // Young Scientists Forum. Abstract book. - 2014. -Paris. - P. 27.

13. Dubinin M.V., Samartsev V.N., Belosludtsev K.N. Ca2~-dcpendent fusion pore induced by a,co-dioic acids as a possible mechanism of the mitochondrial permeability transition // FEBS Journal. - 2014. - V. 281 (Suppl. 1). - P. 344.

14. Дубинин M.B., Хорошавина Е.И., Ведерников A.A., Адакеева С.И., Юсупов Н.В., Самарцев В.Н. Вляние малоната и неорганического фосфата на циклоспорин А - нечувствительную Са2+-зависимую неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий печени, индуцированную а,й)-диоловыми кислотами // Международная конференция молодых ученых. 27-29 октября 2014 г. «Экспериментальная и теоретическая биофизика '14»: сборник тезисов. - Пущино, 2014. - С. 154.

Список сокращений

АДФ - аденозин-5'-дифосфат;

АТФ - аденозин-5'-трифосфат;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ГДК - а,со- Гексадекавдиоловая кислота;

ДДК - а,со- Додекандиоловая кислота;

ДНФ - 2,4-динитрофенол;

ДПФХ - дипальмитоил фосфатвдилхолин;

МОПС - 3-[М-Морфолино]пропансульфоновая кислота, буфер;

Пальм — пальмитиновая кислота;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

СрБ - сульфородамин Б;

ТДК - а,и- Тетрадекандиоловая кислота;

Трис-ОН — трис-(гидроксиметил)аминометан;

ТФФ+ - катион тетрафенилфосфония;

ТХ-100-тритон Х-100;

Ф„ - фосфат неорганический;

ЦсА — циклоспорин А.

ЭГТА - этиленгликоль - бис - (2-аминоэтиловый эфир) - N, N, N', N' - тетрауксусная кислота;

Д*Р— разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий.

Подписано в печать:

19.03.2015

Заказ № 10628 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru