Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пермеабилизация липидного бислоя при связывании Ca2+ с насыщенными длинноцепочечными жирными кислотами: физико-химический механизм и возможность его реализации в митохондриальной мембране

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пермеабилизация липидного бислоя при связывании Ca2+ с насыщенными длинноцепочечными жирными кислотами: физико-химический механизм и возможность его реализации в митохондриальной мембране"

На правах рукописи

Гриценко Елена Николаевна

Пермеабилизация липидного бислоя при

связывании Са2+ с насыщенными длинноцепочечными жирными кислотами: физико-химический механизм и возможность его реализации в митохондриальной мембране

03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2006

Работа выполнена в Путинском государственном университете на базе Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Миронова Галина Дмитриевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна доктор биологических наук Опанасенко Вера Константиновна

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МГУ, г. Москва

Защита состоится 2006 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290 г. Пущино, Московская обл., Институтская ул., 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан « «<#* » ¿¿е&'^г^Х 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета к.ф.-м.н.

Н.Ф. Ланина

Y à fS~

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Свободные жирные кислоты (СЖК), которые присутствуют во всех биологических мембранах, выполняют несколько важных функций в клетке. Они являются строительными блоками для синтеза липидов, субстратами окислительного энергетического метаболизма и, кроме того, влияют на проницаемость мембран (Дятловицкая, 1998). Способность СЖК модулировать проницаемость мембран давно привлекала внимание биоэнергетиков, и в течение уже более полувека ведутся работы по выяснению механизмов СЖК-индуцированного изменения мембранной проницаемости. Традиционно, основные усилия исследователей были направлены на изучение разобщающего действия СЖК (Pressman and Lardy, 1956; Dedukhova et al., 1991; Skulachev, 1998a; Самарцев, 2000; Мохова и Хайлова, 2005), которое связано с их способностью переносить протоны через липидный бислой (Schonfeld and Bohnensack, 1997; Bodrova et al., 2000). Однако, в последние годы все больше внимания стало уделяться проблеме неспецифического изменения проницаемости мембран, которое индуцируется связыванием С а2" с анионами СЖК. Интерес к этой проблеме возрос после того, как в нашей лаборатории было обнаружено, что насыщенные длинноцепочечные СЖК (пальмитиновая (ПК) и стеариновая (СК) кислоты) связывают Са2+ со сродством, которое, по крайней мере, на порядок выше, чем сродство к этому иону других СЖК и липидов (Mironova et al., 2001). Более того, было показано, что процесс образования комплексов Са2+ с анионами ПК лежит, судя по всему, в основе одного из вариантов перехода проницаемости в митохондриальной мембране (Sultan and Sokolove, 2001; Agafonov et al., 2003; Mironova et al., 2004) - явления, которое, вероятно, играет важную роль в индукции запрограммированной гибели клетки (Sparagna et al., 2000; Kong and Rabkin, 2000).

ПК/Са2+-индуцируемый митохондриальный переход проницаемости (МПП) был охарактеризован как отличающийся от ранее известных вариантов перехода проницаемости сравнительно недавно (Sultan and Sokolove, 2001). Были получены данные, свидетельствующие о его физиологической значимости (Mironova et al., 2004). Актуальность данной проблемы связана с тем, что ПК/Са2+-индуцируемый МПП может играть ключевую роль в ряде физиологических и патологических процессов, когда содержание ПК в тканях значительно возрастает. Есть основания полагать, что ПК/Са2+-индуцируемый МПП ведет к апоптозу (Sparagna et al., 2000; Kong and Rabkin, 2000; Mironova et al., 2004) - в отличии от ряда других вариантов перехода проницаемости, ведущих к гибели клеток, в основном, по некротическому пути (Li et al., 2004).

Механизм ПК/Са2+-индуцируемого МПП пока неизвестен - в отличии от механизма открытия цикл«

альной поры (Zoratti and Szabo, 199

митохондри-%#§й'йЬ%ЬкК998; ^alestrap et al.,

С.Лмср£г*г iJ « ,

1 08 ^ «т/tb

2002). Существует множество модуляторов циклоспорин-чувствительной митохондриальной поры, действие которых опосредовано мембранными митохондриальными белками. В то же время, каких-либо доказательств участия белков в ПК/Са2+ -индуцируемом МПП до сих пор обнаружить не удалось. Напротив, есть все основания предполагать, что ПК/Са2+-индуцируемый МПП - это явление липидной природы , т.е. в основе него лежит процесс, протекающий в липидном бислое внутренней митохондриальной мембраны (М1'гопоуа ег а!., 2004; Белослудцев и др., 2005).

Целью настоящей работы было изучение механизма Са2+-индуцируемой пермеабилизации модельных липидных мембран, содержащих насыщенные длинноцепочечные СЖК, и оценка возможности реализации этого механизма во внутренней мембране митохондрий.

Задачи исследования

1. Исследовать, как влияет образование комплексов Са2+ с различными СЖК на ионную проводимость планарных бислойных липидных мембран (БЛМ);

2. Проверить, будет ли Са2* менять проницаемость СЖК-содержащих мембран для более крупных (по сравнению с неорганическими ионами) молекул; исследовать возможность такой неспецифической пермеабилизации на модели одноламеллярных липосом, загруженных гидрофильным флуоресцентным красителем сульфородамином Б;

3. Изучить изменения в фазовом состоянии липидного бислоя, которые могут быть индуцированы Са2+ в СЖК-содержащих липосомальных мембранах;

4. Проанализировать состав фракции СЖК митохондриальной мембраны и сыворотки крови и выяснить, как меняется жирнокислотный состав в сыворотке крови пациентов, перенесших инфаркт миокарда.

Научная новизна работы. Изучен механизм ПК/Са2^- индуцируемой пермеабилизации искусственных мембран, для чего, в частности, был разработан новый метод детекции фазовой сепарации в липидном бислое, основанный на использовании флуоресцентного мембранного зонда но-нил-акридинового оранжевого. Показано, что пермеабилизация мембран происходит за счет образования быстрозатекающих липидных пор по механизму хемотропного фазового перехода в липидном бислое.

Научно-практическое значение работы. Полученные результаты развивают представления о механизмах пермеабилизации липидных мембран при изменении их фазового состояния и возможности реализации подобного механизма в митохондриальной мембране в норме и патологии. Они могут быть использованы для исследований в области биоэнергетики, клеточной патофизиологии и медицины, поскольку в настоящее время показано, что СЖК и переход проницаемости в митохондриях вовлечены в индукцию ряда патофизиологических явлений: апопто-за, ишемии и др.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пушино, 2000); на VIII Международной конференции «Математика, компьютер, образование» (Пушино, 2001); на Всероссийском рабочем совещании «Митохондрии в патологии» (Пушино, 2001); на XIV Международном биофизическом конгрессе (Argentina, 2002); на III Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002); на Конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2002); на 6-ой и 7-ой Школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2002, 2003); на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); на Конгрессе FEBS (Poland, 2004); на Международном симпозиуме «Calcium in health and disease» (Finland, 2004); на Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003 и 2005); на 4-ой Конференции «Mitochondrial Physiology» (Austria, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на<^границах, иллюстрирована-^таблицами и-А?рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Митохондрии выделяли из печени белых крыс линии Wistar весом 250-280 г общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Концентрацию белка в суспензии митохондрий определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Ион-траиспортирующая активность СЖК изучалась путем измерения электрических характеристик БЛМ, модифицированной исследуемыми соединениями. БЛМ формировали методом Мюллера (Mueller et al., 1964) из раствора липидов следующего состава: общие липиды мозга (1.2 мг), кардиолипин (100 мкг) и жирная кислота (6 мкг) или митохонд-риальные липиды (1.2 мг) и жирная кислота (3.9 мкг). Липиды растворяли в 60 мкл n-декана. Суммарная концентрация липидов в n-декане составляла 20 мг/мл. Регистрация тока на выходе усилителя осуществлялась с помощью компьютера IBM PC/AT-486, соединенного с экспериментальной установкой через аналого-цифровой преобразователь. Опыты проводили при температуре 20-22°С. Экспериментальная кювета содержала по 4 мл 20 мМ Трис-HCl буфера (рН 8.5) в обоих отсеках.

Получение однослойных липосом, загруженных сульфородами-ном Б, и измерение их пермеабилизации. Однослойные липосомы, за-

груженные сульфородамином Б (CP), получали методом экструзии (Aga-fonov et а)., 2003). О пермеабилизации липосомальных мембран судили по выходу красителя из липосом, что регистрировалось методом флуо-риметрии на спектрофлуориметре «Kontron SFM-25» (длина волны возбуждения - 565 нм; длина волны флуоресценции - 586 нм). Состав буфера: 10 мМ Трис-HCl (pH 8.5), 50 мкМ ЭГТА и 40 мМ KCl. СЖК добавляли к образцам в виде этанольных растворов; конечная концентрация этанола в образце не превышала 1% В конце каждого эксперимента к образцу добавляли 0.1% тритон Х-100 (ТХ-100) для оценки максимального уровня флуоресценции при полном высвобождении CP во внешнюю среДУ-

Для обнаружения возможных Са2+-индуцируемых изменений в фазовом состоянии липидного бислоя ПК-содержащих липосом использовали мембранный флуоресцентный зонд нонил-акридиновый оранжевый (НАО). Флуоресценция НАО измерялась на спектрофлуориметре «Kontron SFM-25» (длина волны возбуждения - 495 нм; длина волны флуоресценции - 519 нм), исследования проводили при комнатной температуре. Краситель добавляли в буфер, содержащий 10 мМ Трис-HCl (pH 8.5), 50 мкМ ЭДТА и 40 мМ KCl.

Число и размер флуоресцирующих частиц в суспензии липосом, меченых N-родамин-фосфатидилэтаноламином, определяли с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии на конфокальном флуо-риметре Confocor (Zeiss, Jena & Evotec). Однослойные липосомы (диаметром 0.1 мкм), приготовленные из азолектина с 5% (моль/моль) N-родамин-фосфатидилэтаноламином, были получены методом экструзии (Agafonov et al., 2003). Буфер содержал 10 мМ Трис-HCl (pH 8.5), 50 мкМ ЭГТА и 40 мМ KCl. Для каждого образца, уравновешиваемого при комнатной температуре в течение 4 минут, число частиц, представленных в конфокальном объеме, и время их диффузии через этот объем определялись по усреднению 5-ти 20-секундных измерений. Корреляционная функция вычислялась с помощью специальной программы (FCS Access Fit).

Экстракцию липидов из митохондрий проводили по модифицированной методике Блайя и Дайэра (Bligh et al., 1959; Кейтс, 1975). Липиды хранили при температуре -20°С и использовали в течение 1 -3 месяцев.

Выделение фракции СЖК из липидного экстракта проводили, используя аминопропил-кремниевые колонки (Pietsch and Lorenz, 1993). Полученные фракции метилировали и анализировали методом газовой хроматографии.

Определение содержания фосфора в фосфолипидных образцах проводили по модифицированной методике Бартлета (Bartlett et al., 1959; Кейтс, 1975). Калибровочная кривая для расчета молярной концентрации фосфора строилась с использованием растворов КН2Р04.

Процентное содержание СЖК (моль СЖК/моль липидов, %) в мембранах митохондрий рассчитывали, исходя из собственных экспериментальных данных по количеству СЖК и липидов (в мкг) на 1 мг митохон-дриального белка и данных литературы по липидному составу митохонд-риальных мембран (Эаит, 1985). Данные по липидному составу митохондрий использовали для расчета средней молекулярной массы мито-хондриальных липидов, которая составила 878 Да.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ионы Са2+ вызывают неспецифическую пермеабилизацию модельных мембран, содержащих насыщенные длинноцепочечные СЖК

В работе получены результаты показывающие, что ПК и СК обладают ион-транспортирующими свойствами при их встраивании в искусственную мембрану, сформированную из различных липидов (таблица 1). Как показали наши эксперименты, добавление ПК или СК (0.3 массовых %) к митохондриальным липидам, используемым для формирования БЛМ, не влекло за собой каких-либо изменений ионной проницаемости мембраны (таблица 1). Однако, после добавления 1 мМ СаСЬ проводимость мембраны резко возрастала. Добавление КС1 еще больше увеличивало проводимость мембраны. При этом Са2+ не оказывал никакого влияния на ионную проводимость мембраны, не содержащей ПК и СК. Добавление в среду, омывающую БЛМ, ионов К+ в отсутствие Са2+ также не приводило к увеличению проводимости мембраны, модифицированной этими СЖК, т.е. образование комплекса Са2+ с ПК или СК необходимо

Таблица 1. Са2<-индуцированная проводимость БЛМ, содержащих различные СЖК*

СЖК Проводимость БЛМ, х1(Т9 См/см2

без СаС12 0.1 мМ СаС12 1 мМ СаС12 / мМ СаС12 + 100мМКС1

Без СЖК 1.0 ч-1.4 — 1.1 + 1.5 1.0 + 1.2

Пальмитиновая 4.1 -г 6.1 10.2 + 14.3 58 1 -=-61 8 407 0 - 409 0

Стеариновая 2 0-61 20 4 +30.6 — —

Миристиновая 20 + 4 1 2 0 — 41 2 0-4 1 2 0 - 4.1

Лауриновая 2 1 -5-4.1 2.1 - 4 1 2.1 -г 4.1 4.1 -т- 8.1

Олеиновая 2.0-4.1 2 0-41 2.0-10 2 6 8 - 9.4

Пальмитолеин. 2.0 -г- 4.1 2.0 + 4 1 2 0 - 4.1 2.0*4.1

Линолевая 2 0-4.1 20-4.1 2.0 - 6.1 2.0 -н 4.1

* Мембрану формировали из митохондриальных липидов. Содержание пальмитиновой (ПК) и стеариновой (СК) кислот составляло 0.3 массовых %, а всех остальных СЖК 0 5 массовых % Буфер 20 мМ Трис-НС1 (рН 8 5)

для повышения проницаемости мембран для К+. Тот факт, что добавка 100 мМ КС1 приводит к десятикратному увеличению проницаемости мембраны, говорит о том, что в модифицированной ПК или СК мембране в присутствии Са2+ появляется неселективная проводимость, которая увеличивается при повышении концентрации ионов.

В работе также была исследована способность других СЖК пермеа-билизовать мембрану в присутствии Са2+. Как видно из данных, представленных в таблице 1, Са2+ увеличивал проводимость БЛМ только тогда, когда в ее состав входила ПК или СК - то есть, те кислоты, которые связывают Са2+ с высоким сродством (Мцопоуа et а!., 2001).

Результаты этой серии экспериментов позволяют заключить, что механизм ПК/Са2+-индуцированной пермеабилизации липидного бислоя основан на образовании в мембране комплексов ПК с Са2+.

2. Добавление Са2+ к ПК(СК)-содерэкащим липосомам, загруженным СР, ведет к кратковременной пермеабилизации липосомальных мембран для СР

В эксперментах на БЛМ было установлено, что добавление Са2+ к мембране, в состав которой входит ПК или СК, ведет к увеличению проницаемости липидного бислоя для неорганических ионов. Однако, было не ясно, меняется ли при этом проницаемость мембраны для более крупных молекул, таких как СР (Мг = 580.7 Да).

А) 50 мкМ ПК + 1 мМ Са2+

Б) 1 мМ Са2+ + 50 мкМ ПК

1 2 3 Время, мин

1 2 3 Время, мин

Рис. 1. Са2+-индуцированный выход сульфородамина Б (СР) из однослойных липосом (ОЛ) (50 мкМ), содержащих ПК. Изменения концентрации СР регистрировали по изменению уровня флуоресценции. Состав среды: 10 мМ Трис-НС1 (рН 8.5), 40 мМ КС! и 50 мкМ ЭГТА.

Концентрация ПК, мкМ

Рис. 2. Концентрационные кривые эффекта ПК/Са2+-ивдуцируемой пермеа-билизации липосом. Состав среды: 10 мМ Трис-НС1 (рН 8.5), 40 мМ К.С1 и 50 мкМ ЭГТА.

А - зависимость Са2+-индуцированного выхода СР из азолектиновых липосом (50 мкМ) от концентрации добавленной к липосомам ПК. Выход СР индуцировался добавлением 1 мМ (1) или 0.! мМ (2) СаС12 Б - зависимость выхода СР из липосом (50 мкМ азолектин/50 мкМ ПК) от концентрации Са2+.

Как показано на рис. 1А, Са2+ вызывает быстрый выход части СР из ПК-содержащих липосом, после чего целостность мембран восстанавливается. Если же ПК и Са2+ добавляют к липосомам в обратном порядке, то увеличения флуоресценции не наблюдается (рис. 1Б). Связано это, вероятно, с тем, что добавление ПК в раствор, содержащий Са2+, приводит к образованию ее комплексов с ионом в растворе, что предотвращает встраивание ПК в липидный бислой.

Далее мы провели более детальные исследования этого эффекта и обнаружили следующее.

Степень пермеабилизации мембраны четко зависит как от концентрации ПК (рис. 2А), так и от концентрации Са2+ (рис. 2Б).

Са2+ индуцировал выход СР не только из ПК-содержащих, но также из СК-содержащих липосом. В то же время, липосомы, содержащие ли-нолевую кислоту, сродство которой к Са2+ невелико (\1ironova е1 а1., 2001), были нечувствительны к действию Са2+.

Проведенные нами исследования показали, что ПК/Са2+-индуцируемый выход СР из липосом имеет оптимум рН при 7.5-8.5, что соответствует полученным ранее данным о рН-огттимуме образования комплексов ПК с Са2+ (Мц-опоуэ е1 а1., 2001).

' Пермеабилизация липосом, содержащих ПК, может быть вызвана и

другими двухвалентными катионами (таблица 2). Эффекты большинства исследованных катионов сравнимы с эффектом Са2+. Однако, следует

I

I

1 7

I

Таблица 2. Пермеабилизация липосом различными двухвалентными катионами в отсутсвие и присутствии 50 мкМ ПК

Катион (1 мМ) Выход сульфородамина, % от общего количества внутри липосом

в отсутствие ПК в присутствии ПК

Ca2* 0.65 ± 0.29 74.27 ± 2.22

Ва2+ 0.45 ±0.10 74.10 + 3.65

Sr2+ 0.00 ± 0.33 47.63 ±5.18

Мп2+ 0.82 ± 0.29 71.97 + 2.13

М2+ 1.15 ±0.36 60.72 ± 3.00

Со2+ 0.93 ± 0.26 52.01 ±2.37

Mg2+ 0.00 ± 0.00 22 45 ± 3.99

* Состав среды: 10 мМ Трис-HCl (pH 8.5), 40 мМ KCl, 50 мкМ ЭГТА и липосомы (50 мкМ азолектин).

отметить, что М§2+, который, как и Са2+, является физиологически значимым ионом, был гораздо менее эффективен в смысле индукции выхода СР из липосом.

Результаты этой серии экспериментов позволяют заключить, что Са2+ индуцирует неспецифическую кратковременную пермеабилизацию ПК-содержащих мембран не только для ионов, но и для относительно крупных молекул, таких, как СР. По-видимому, речь в данном случае идет об образовании в мембране достаточно крупных разрывов, иными словами, липидных пор, которые затем быстро затекают.

3. СЖК/Са2+-индуцируемая пермеабилизация мембран происходит в

результате образования липидных пор

Эксперименты, проведенные на липосомах, свидетельствовали о том, что образование комплексов Са2+ с ПК в мембране ведет к формированию быстрозатекающих липидных пор. Однако, чтобы подтвердить это предположение, необходимо было проверить, не является ли Са2+-индуцированный выход красителя результатом разрушения части липосом. Для этого был использован метод корреляционной флуоресцентной микроскопии, с помощью которого были измерены радиус и концентрация флуоресцирующих частиц в суспензии липосом при тех же условиях, при которых проводились исследования по пермеабилизации мембран.

Результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что после добавления ПК и Са2+ по отдельности или в сочетании размер и число флуо-

Таблица 3. Радиус и концентрация флуоресцирующих частиц в суспензии однослойных липосом (ОЛ), меченых родаминфосфатидилэтаноламином (5 мольных %)*

Образец Радиус частиц, нм Концентрация частиц, нМ

0.5 мМ ОЛ 50.74 ± 1.96 19.530 ±2.147

50 мкМ ОЛ + 50 мкМ ПК 45.32 ± 8.82 0.676 + 0 096

50 мкМ ОЛ + 1 мМ Са2+ 53 10 ±3 69 0.396 ±0.037

50 мкМ ОЛ + 50 мкМ ПК + 1 мМ Са2* 45.26 ± 10.76 0.386 ± 0 073

50 мкМ ОЛ + 1 мМ Са3+ + 50 мкМ ПК 51.51 ±8.47 0.335 ±0.019

50 мкМ ОЛ + 0.1% ТХ-100 4.08 ± 0.24 504.385 ± 14.279

* Состав среды. 10 мМ Трис-HCl (рН 8 5), 40 мМ КС! и 50 мкМ ЭПГА.

ресцирующих частиц в системе существенно не меняется. Это особенно хорошо заметно на фоне эффекта ТХ-100, который приводит к мицелли-зации липосом. Таким образом, при добавлении ПК и Са2+ липосомы не разрушаются - а значит, выход краски из липосом обусловлен временным нарушением целостности липидного бислоя. Иными словами, в мембране липосом образуются поры, которые затем быстро закрываются. При этом время, в течение которого существуют поры, таково, что наружу успевает выйти лишь часть молекул СР. Количество вышедшего CP зависит, вероятно, от числа, размера и времени жизни липидных пор.

4. Механизм СЖК/Са2*-индуцируемого образования липидных пор

Наиболее вероятное предположение относительно механизма образования липидных пор состоит в том, что их появление сопряжено с изменением фазового состояния мембран. Из литературных данных известно, что Са2+ способен существенно менять фазовое состояние липидных систем, в состав которых входят отрицательно заряженные липиды. Речь может идти о разделении фаз (о фазовой сепарации), а также о сдвиге точки температурного фазового перехода. Как было показано ранее, такие изменения могут сопровождаться пермеабилизацией мембран (Braganza, 1983; Humphries, 1984).

Для исследования возможных измнений фазового состояния липидного бислоя при связывании Са2+ с анионами ПК в мембране был разработан метод детекции фазовой сепарации с использованием мембранного флуоресцентного зонда нонил-акридинового оранжевого (НАО) Как показали контрольные опыты, индикатором фазовой сепарации является

520 500

тушение флуоресценции НАО при его концентрировании в одной из образующихся фаз1.

Как видно из рис. 3, добавление Са2+ к ПК-содержащим липосомам приводит к тушению флуоресценции НАО, что свидетельствует о сепарации комплексов Са2+ с ПК в липидном бислое.

Как показали дальнейшие эксперименты, Са2+-индуцируемая фазовая сепарация ПК в липидном бислое и ПК/Са2+ -индуцируемая пермеабилизация мембраны происходят в одном и том же диапазоне концентраций ПК (рис. 4А) и Са2+ (рис. 4Б). Таким образом, можно утверждать, что между этими двумя явлениями - фазовой сепарацией и пермеабилизацией мембраны - существует прямая взаимосвязь.

Описанные выше эксперименты позволили высказать предположения о механизме образования ли-

х

5 480

460 440

я о

| 420

>.

§ 400

380

1 2+

___уса

- 1 1 -ПК

- 1 Ч—-- —

. ПК

- \+пк

>111

1

2 3 4 Время, мин.

6

Рис.3. Са -индуцированное тушение флуоресценции НАО в азолектиновых липосомах, содержащих ПК. Состав среды: 10 мМ Трис-НС1 (рН 8.5), 40 мМ К.С1 и 50 мкМ ЭЭТА. Концен фация липосом - 50 мкМ, НАО - 2 мкМ, добавляемой ПК - 50 мкМ и СаС12 -500 мкМ.

• Пермеабилизация

О Фазовая сепарация

пидных пор после добавления Са к мембране, содержащей ПК.

Связывание Са2+ с анионами ПК приводит, согласно полученным в работе данным, к фазовой сепара-

Рис. 4.

ПК/Са2" Са2+ (Б)

0 10 20 30 40 50 60 70 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Концентрация ПК, мкМ Концентрация Са2*, мМ

Зависимость эффектов Са2+-индуцируемой сепарации ПК в мембране и -индуцируемой пермеабилизации липосом от концентрации ПК (А) и

Работа выполнена совместно с к.х н. Е.А Шляпниковой (ИТЭБ РАН).

ции ПК/Са2+-комплексов в отдельные мембранные домены. При комнатной температуре эти домены будут твердыми, поскольку температура плавления чистой ПК в мембране равна примерно 63°С, а Са2+, согласно литературным данным, должен еще больше повысить эту температуру (Антонов, 1992; Харакоз, 2001).

Затвердевание жирнокислот-ных доменов в мембране будет сопровождаться сокращением их площади - за счет того, что упаковка углеводородных цепей в твердо-кристаллической фазе более компактна, чем в жидкокристаллической фазе. Следовательно, если Са2+ связывается с ПК преимущественно на наружной стороне мембраны (что и происходит, когда мы добавляем его к ли-посомам), то площадь внешнего монослоя станет меньше, чем площадь внутреннего монослоя. Внешний монослой, в котором произошла сегрегация ПК/Са2+-комплексов, окажется растянутым (то есть, в нем возрастет сила латерального натяжения), а внутренний монослой -сжатым (в нем увеличится сила латерального давления).

Таким образом, в мембране возникнет межслойный дисбаланс сил латерального давления/натяжения, и это приведет к разрыву растянутого монослоя. Углеводородные цепи липидов в месте разрыва окажутся экспонированными в водную среду, что термодинамически крайне невыгодно. Поэтому сжатый монослой также разорвется, и края монослоев по периметру разрыва сомкнутся - возникнет гидрофильная липидная пора.

Как следует из литературных данных, если радиус липидной поры не превышает некоего критического значения (для жидко-кристаллического бислоя это примерно 9 нм), то пора будет затекать, и достаточно быстро (через доли секунды) целостность мембраны восстановится (Антонов, 1998), что мы и наблюдали в экспериментах по пермеабилизации липо-сом. Стоит добавить, что в митохондриальной мембране размер пор, образующихся при ПК/Са2+ -индуцируемом МПП составляет 2-3 нм (Sultan and Sokolove, 2001).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что Са2+-индуцируемое образование быстрозатекаюших липидных пор в мембране, содержащей

Концентрация ПК, мкМ

Рис.5. Концентрационные кривые эффекта ПК/Са2+-индуцируемой пермеабилизации мембран по ПК, полученные на азолектиновых липосомах (АЛ) и липосомах, сформированных из мито-хондриальных липидов (МЛ). Состав среды: 10 мМ Трис-НС1 (рН 8.5), 40 мМ КС1 и 50 мкМ ЭГТА. Концентрация липосом: 50 мкмоль липида/мл. Выход СР индуцировался добавлением 0.1 мМ СаС12,

насыщенные длинноцепочечные СЖК, происходит по механизму хемо-тропного фазового перехода в липидном бислое.

5. Возможность образования липидных пор в митохондриальной мембране

Известно, что митохондриальные мембраны отличаются по липидно-му составу от других клеточных мембран (ВгоекетЫег с! а1., 1991). В экспериментах на БЛМ было установлено, что, когда мембрану формировали не из общих липидов мозга (данные не показаны), а из митохондри-альных липидов (таблица 1), проводимость появлялась при более низком содержании в мембране ПК или СК, а также при более низкой концентрации Са2+ в среде.

Подобная картина наблюдалась и в экспериментах по ПК/Са2+-индуцируемому выходу СР из липосом. Если для формирования липосом использовали митохондриальные липиды, выход краски был значительно выше, чем в случае формирования липосом из азолектина(рис. 5).

Следовательно, из полученных данных можно сделать вывод, что ли-пидный состав оказывает существенное влияние на степень ПК/Са2+-индуцируемой пермеабилизации мембран.

Таблица 4. Содержание СЖК в мембранах митохондрий*

Содержание СЖК

СЖК мкг/мг % (г/г) от сумм % (моль/моль) от

белка кол-ва всех СЖК сумм кол-ва липидов

Пальмитиновая 10.14 22.21 6.61

Стеариновая 10.98 26.16 6.45

Олеиновая 8.47 20.52 5.06

Линолевая 3.79 9.16 2.25

Докозановая 3.02 8.80 1.46

Арахиновая 0.40 1 14 0 20

Остальные (13) 4 89 12.01 2.53

* Цифры, приведенные в таблице, представляют собой срдение значения из

6-8 повторов.

В работе был проанализирован состав фракции СЖК из митохондри-альных мембран. Показано, что главными компонентами фракции являются пальмитиновая, стеариновая и олеиновая кислоты (таблица 4). При этом суммарное содержание ПК и СК в митохондриальных мембранах составляет, по нашей оценке, примерно 13 мольных % от общего количества липидов. Эта цифра близка к нижнему конценграционному пределу в экспериментах с липосомами (-15 мольных %) - го есть, к некоемому пороговому уровню, выше которого в присутствии Са2+ индуцируется образование липидных пор. Известно также, что Са2+, содержание ко-

400

300

200

О

g

®

■о £

100

12346678 ?

1 - здоровый человек 2-8 - больные ишемией

Рис.6. Содержание ПК в сыворотке крови пациентов с ишемической болезнью сердца

торого в клетке существенно возрастает при самых различных патологических и стрессовых ситуациях, способствует дополнительному повышению содержания СЖК в клеточных мембранах - за счет активации различных фосфолипаз

(Broekemeier and Pfeiffer, 1995). Поэтому, содержание СЖК (в основном ПК и CK) в клеточных мембранах может существенно возрастать при развитии разных патологий, и это может быть ключевым фактором для индукции ПК/Са2+-зависимого МПП, что в дальнейшем может привести к апоптозу.

Увеличение концентрации ПК и CK в сыворотке крови до значений, превышающих контрольный уровень, может быть опасным для жизни. Показано, что источником ПК-индуцируемого апоптоза и некроза может являться повышенная циркуляция ПК в крови, что наблюдается, например, при генетическом ожирении Zucker (Zhou et al., 2000).

Нами обнаружено, что свободная ПК в сыворотке здоровых людей составляет приблизительно 30% от всех жирных кислот, и что, также, как в митохондриях, ПК, CK, олеиновая и линолевая кислоты являются основными кислотами в сыворотке. Установлено, что количество этих жирных кислот значительно увеличено в крови больных с ишемическим поражением миокарда. Это может определять развитие инфаркта миокарда или быть его следствием. Одним из основных показателей развития инфаркта миокарда является, как известно, количество тропонина I в крови. Представленные на рис. 6 данные указывают на наличие прямой корреляции между количеством ПК в сыворотке крови человека и количеством тропонина 1,1 .е. степенью развития инфаркта миокарда у больных с ишемическим поражением сердца2. Аналогичные данные были получены и для CK, однако ее еффект был меньше, чем эффект ПК. Помимо содержания ПК, при ишемии в сыворотке увеличивается также и содержание олеиновой кислоты, но так как она не обладает апоптоз- и некроз-активирующим действием (Sparagna et al., 2000), то увеличение ее содержания не имеет, вероятно, значения для развития инфаркта.

Работа выполнена совместно с сотрудниками лаборатории физиологии Лионов-ского Университета (Франция)

выводы

1. Показано, что Са2+ индуцирует неспецифическую ионную проводимость БЛМ, в состав которых входят жирные кислоты, связывающие Са2+ с высоким сродством (пальмитиновая и стеариновая). Другие жирные кислоты, не обладающие этим свойством, не меняют проницаемость БЛМ в присутствии Са2'.

2. Установлено, что Са2+ индуцирует выход сульфородамина Б из однослойных липосом, содержащих длинноцепочечные насыщенные жирные кислоты. Доказано, что в основе этого эффекта лежит образование комплексов Са2+ с анионами жирной кислоты в мембране липосом, что ведет к появлению быстрозатекающих липидных пор.

3. Разработан метод детекции фазовой сепарации в липидном бислое, основанный на использовании флуоресцентного мембранного зонда нонил-акридин оранжевого.

4. Установлена взаимосвязь между двумя Са2+-индуцируемыми эффектами: фазовой сепарацией r липидном бислое и пермеабилизацией мембраны. Сделан вывод о том, что Са2+-индуцируемая пермеабили-зация ПК-содержащих липосом происходит по механизму хемо-тропного фазового перехода в липидном бислое.

5. Обосновано предположение о возможности реализации обнаруженного механизма во внутренней митохондриальной мембране. Установлено, что состав митохондриальных липидов способствует ПК/Са2+ -индуцируемой пермеабилизации мембран. Показано, что суммарное содержание пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в мембране митохондрий близко к пороговому уровню, при котором возможна Са2+-индуцируемая пермеабилизация липидного бислоя.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Лазарева А В , Лимаренко Е H , Гриценко Е H . Павлов Е В., Миронова Г.Д. (2000) Роль пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в митохондриальной мембране и их способность связывания кальция с высоким сродством. Международная конференция «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пущино), стр. 88-91.

2. Mironova G.D, Gateau-Roesch О , Levrat С., Gritsenko Е, Pavlov Е., Lazareva A.V., Limarenko Е., Rey С, Louisot Р, and Saris N.-E.L (2001) Palmitic and stearic acids bind Ca2+ with high affinity and form nonspecific channels in black-lipid membranes Possible relation to CaJ+ -activated mitochondrial pores J Bio-ener Biomembr, 33, 319-331

3. Гриценко E.H., Лимаренко E.A, Павлов E , Лазарева A.B , Gateau-Roesch О, Levrat С , Rey С , Louisot P , Saris N -h . Миронова Г Д (2001 ) Действие природных ашиваторов апоптоза - пальмитиновой и стеариновой жирных кислот - на проницаемость модельной и митохондриальной мембраны. Материалы всероссийского рабочего совещаниям Митохондрии в патологии» (Пущино), стр. 246-249.

4. Лимаренко Е., Павлов Е, Лазарева А.В., Гриценко Е Н , Gateau-Roesch О , I.evrat С., Rey С., Louisot P., Saris N.-E., Агафонов А, Миронова Г Д (2001) Модель Са2+-активируемой поры в митохондриях: роль комплексов Са2+ с пальмитиновой кислотой Тезисы конференции «Математика, компьютер, образование» (Пущино), стр. 297

5. Mironova G.D., Gateau-Roesch О, Levrat С., Gritsenko Е, Pavlov Е, Lazareva A.V., Limarenko Е., Rey С, Louisot P., and Saris N.-E.L (2001) A model of mitochondrial permeability transition pore of palmitic acid/calcium complexes. Collection of Scientific Works «Mathematics, Computer, Education» (Moscow), pp 531-537.

6. Mironova G.D., Lasareva A V., Limarenko E., Agafonov A., Gritsenko E., Belos-ludtsev K., Gateau-Roesch O., Sairis N.-E. (2002) Calcium-binding properties of palmitic and stearic acids in relation to the membrane permeabilization. XIV International Biophysics Congress (Argentina), pp 31.

7. Миронова Г Д, Лимаренко Е А , Грииенко Е Н , Агафонов А.В., Белослудцев К.Н, Лазарева А В (2002) Са2+- связывающие и порообразующие свойства пальмитиновой кислоты и их роль в открытии митохондриальной Са2+-зависимой циклоспорин А - нечувствительной поры. III съезд биохимического общества (Санкт-Петербург), стр. 253.

8. Агафонов А.В., Гриценко Е.Н., Белослудцев К Н, Миронова Г.Д. (2002) Образование пор в мембране липосом при формировании комплексов кальция с пальмитиновой кислотой в липидном бислое Ш съезд биохимического общества (Санкт-Петербург), стр. 325

9. Гриценко Е.Н., Белослудцев К.Н., Лазарева А В , Агафонов А.В. (2002) Формирование липидных пор при образовании комплексов кальция с пальмитиновой кислотой в мембране липосом. 6-я школа-конференция молодых уче-ных»Биология - наука XXI века» (Пущино), стр. 9-10.

10. Агафонов А.В., Гриценко Е.Н., Белослудцев К.Н, Ковалев А.Э., Миронова Г Д (2002) Связывание кальция с анионами пальмитиновой кислоты в мембране липосом приводит к формированию липидных пор Тезисы конференции• «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям», (Пущино), стр. 43

11. Агафонов А.В., Белослудцев К.Н., Гриценко Е.Н., Ковалев А.Э. Миронова Г.Д., Шляпникова Е.А., Харакоз Д.П. (2003) Са2+-индуцированная фазовая сегрегация пальмитиновой кислоты в липидной мембране и формирование липидной поры. Статья в сборнике Горизонты биофизики от теории к практике, ИТЭБ РАН, стр 137-141.

12. Agafonov A., Gritsenko Е., Belosludtsev К , Kovalev А , Gateau-Rocsch О , Saris N -Е., and Mironova G D (2003) A permeability transition in liposomes induced by the formation of Ca2+/palmitic acid complexes. Biochim Biophys Acta, 1609. 153-160.

13. Гриценко E.H., Лимаренко E.A., Белослудцев K.H., Лазарева А.В. (2003) Сравнение Са2+-связывающих и порообразующих свойств пальмитиновой и 2-бромопальмитиновой кислоты. 7-ая школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», стр. 59

14. Гриценко Е.Н., Миронова Г Д. (2003) Состав мигохондриальных липидов и его роль в способности комплекса ПК/Са2+ образовывать неспецифическую

пору в мембране. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино), стр 226-229.

15. Миронова Г.Д., Гриценко Е.Н., Агафонов А.В, Белослудцев К.Н., Лимаренко Е.А, Лазарева А В. (2003) Возможный механизм апопгоз-активирующего действия пальмитиновой кислоты Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино), стр. 257-259.

16. Mironova G.D., Gritsenko Е, Gateau-Roesch О., Levrat С., Agafonov A., Belos-ludtsev К., Prigent A., Muntean D, Dubois M., and Ovize M. (2004) Formation of Palmitic Acid/Ca2+ Complexes in the Mitochondria] Membrane: A Possible Role in the Cyclosporin-lnsensitive Permeability Transition J Bioener Biomembr, 36, 171-178.

17. Gritsenko E.N., Agafonov A V., Limarenko E.A , Gateau-Roesch O., Saris N.-E.L. and Mironova G.D. (2004) The effect of fatty acids on Ca2+-induced permeability of black lipid membranes and liposomes formed from different lipids. FEBS Congress (Poland), pp. 189.

18. Агафонов А В. Гриценко E H., Белослудцев K.H., Миронова Г Д. (2004) Ком-плексация кальция с жирными кислотами в липидном бислое образование липидных пор и возможное отношение к переходу проницаемости в мито-хондриальной мембране. Ill съезд биофизиков России (Воронеж), стр 175176.

19. Limarenko ЕА., Agafonov A.V., Gritsenko E.N., Belosludtsev K.N, Gateau-Roesch О., Ovize M., Mironova G.D. and Saris N -E. (2004) Ca2+-deendent pore in the mitochondrial membrane. Ca2t-binding properties of fatty acids in relation to their ability to open the cyclosporin-insensitive pore. International Symposium «Calcium in health and disease» (Finland), pp.49.

20. Белослудцев K.H. Гриценко E H , Агафонов А В , Белослудцева H В., Негода Е А., Сарис Н -Э , Миронова Г.Д (2005) Пальмитат-Са2+-активируемая мито-хокдриальная пора и ее возможная роль в активации апоптоза. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино), стр. 226-228.

21. Saris N -Е., Belosludtsev К., Gritsenko Е., Agafonov A., Ovize М., Belosludtseva N.. Gateau-Roesh О., and Mironova G.D. (2005) The permeabilisation of mitochondria and bilayer phospholipid membranes by palmitic acid and Ca2+ 4th Conference «Mitochondrial Physiology» (Austria), pp.72

Диссертационная работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ (№ 01-0448551), Минпром РФФИ (Уе 04-04-97281), гранта для молодых ученых "MAC - 2003"

(№03-04-06269) и гранта Минобразования России (№ А03-2.12-776).

к исполнению 15/02/2006 Исполнено 15/02/2006

Заказ №79 Тираж 100экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва. Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www autoreferat ru

P-43 8S

i i

i

! 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гриценко, Елена Николаевна

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Роль СЖК как модуляторов проницаемости биологических мембран

2.1.1. Разобщающее действие СЖК.

2.1.2. СЖК как модуляторы перехода проницаемости в митохондриях .;.и

2.2. Влияние СЖК и Са2+ на состояние и свойства липидного бислоя.

2.2.1. Фазовое поведение СЖК-липидных смесей.

2.2.2. Влияние СЖК на проницаемость липидных мембран.

2.2.3. Катион-индуцируемые изменения фазового состояния мембран, содержащих отрицательно-заряженные липиды.

2.2.4. Изменения проницаемости мембран при фазово-переходных процессах в липидном бислое.

3. Материалы и методы исследования.

3.1. Изучение ион-транспортирующих свойств жирных кислот, реконструированных в БЛМ.

3.2. Приготовление одноламеллярных липосом.

3.3. Приготовление липосом, загруженных сульфородамином Б.

3.4. Измерение выхода сульфородамина Б из одноламеллярных липосом

3.5. Измерение флуоресценции нонил-акридинового оранжевого в липосомальных мембранах.

3.6. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия липосом, меченых N-родамин-диацилфосфатидилэтаноламином.

3.7. Выделение митохондрий из печени крыс.

3.8. Экстракция, разделение и количественный анализ липидов из биологических объектов.

3.8.1. Экстракция липидов.

3.8.2. Выделение фракции СЖК и ее количественный анализ.

3.8.3. Определение содержания фосфора в фосфолипидных образцах

3.9. Расчет процентного содержания СЖК в митохондриальных мембранах.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Ионы Са вызывают неспецифическую пермеабилизацию мембран, содержащих насыщенные длинноцепочечные СЖК.

4.1.1. Опыты на БЛМ.

4.1.2. Опыты с липосомами.

4.2. СЖК/Са2+-индуцируемая пермеабилизация мембран происходит в результате образования липидных пор.

4.3. Механизм СЖК/Са -индуцируемого образования липидных пор.

4.3.1. СЖК/Са -индуцируемый выход сульфородамина из липосом не является следствием осмотических эффектов.

4.3.2. СЖК/Са2+-индуцируемая пермеабилизация мембраны сопряжена с фазовой сегрегацией комплексов Са2+ с СЖК.

4.3.3. СЖК/Са2+

-индуцируемое образование липидных пор происходит по механизму хемотропного фазового перехода в липидном бислое

4.3.4. Механизм СЖК/Са2+-индуцируемой пермеабилизации мембран имеет «кинетическую» природу.

4.4. Возможно ли образование липидных пор в митохондриалыюй мембране?.

4.4.1. Состав митохондриальных липидов благоприятствует СЖК/Са -индуцируемому образованию липидных пор.

4.4.2. СЖК/Са -индуцируемая пермеабилизация митохондриальных и модельных мембран: аналогии и параллели.

4.4.3. Как может работать механизм СЖК/Са2+-индуцируемой пермеабилизации митохондриальной мембраны.

4.5. Возможная роль

ПК/Са

-индуцируемого МПП при патологиях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пермеабилизация липидного бислоя при связывании Ca2+ с насыщенными длинноцепочечными жирными кислотами: физико-химический механизм и возможность его реализации в митохондриальной мембране"

Свободные жирные кислоты (СЖК), которые присутствуют во всех биологических мембранах, выполняют несколько важных функций в клетке. Они являются строительными блоками для синтеза липидов, субстратами окислительного энергетического метаболизма и, кроме того, влияют на проницаемость мембран (Дятловицкая, 1998). Способность СЖК модулировать проницаемость мембран давно привлекала внимание биоэнергетиков, и в течение уже более полувека ведутся работы по выяснению механизмов СЖК-индуцированного изменения мембранной проницаемости. Традиционно, основные усилия исследователей были направлены на изучение разобщающего действия СЖК (Pressman and Lardy, 1956; Dedukhova et al., 1991; Skulachev, 1998a; Самарцев, 2000; Мохова и Хайлова, 2005), которое связано с их способностью переносить протоны через липидный бислой (Schonfeld and Bohnensack, 1997; Bodrova et al., 2000). Однако в последние годы все больше внимания стало уделяться проблеме неспецифического изменения проницаемости мембран, которое индуцируется связыванием Са2+ с анионами СЖК. Интерес к этой проблеме возрос после того, как в нашей лаборатории было обнаружено, что насыщенные длинноцепочечные ji

СЖК (пальмитиновая (ПК) и стеариновая кислоты) связывают Са со сродством, которое, по крайней мере, на порядок выше, чем сродство к этому иону других СЖК и липидов (Mironova et al., 2001). Было показано также, что процесс образования комплексов Са2+ с анионами ПК лежит, судя по всему, в основе одного из вариантов перехода проницаемости в митохонд-риальной мембране (Sultan and Sokolove, 2001; Agafonov et al., 2003; Mironova et al., 2004) - явления, которое, вероятно, играет важную роль в индукции запрограммированной гибели клетки (Sparagna et al., 2000; Kong and Rabkin, 2000).

ПК/Са2+-индуцируемый митохондриальный переход проницаемости (МПП) был охарактеризован как отличающийся от ранее известных вариантов МПП сравнительно недавно (Sultan and Sokolove, 2001). Были получены данные, свидетельствующие о его физиологической значимости (Mi-ronova et al., 2004). Актуальность данной проблемы связана с тем, что ПК/Са -индуцируемый МПП может играть ключевую роль в ряде физиологических и патологических процессов, когда содержание ПК в тканях возрастает. Есть основания полагать, что ПК/Са -индуцируемый МПП ведет к апоптозу (Sparagna et al., 2000; Kong and Rabkin, 2000; Mironova et al., 2004) - в отличие от ряда других вариантов МПП, ведущих к гибели клеток, в основном, по некротическому пути (Li et al., 2004).

Механизм ПК/Са2+-индуцируемого МПП пока неизвестен - в отличие от механизма циклоспорин-чувствительного классического МПП, при котором, как принято считать, происходит открытие некоего белкового ме-гаканала (Zoratti and Szabo, 1995; Halestrap et al., 1998; Halestrap et al., 2002; Zoratti et al., 2005). Существует множество модуляторов циклоспорин-чувствительного МПП, действие которых опосредовано мембранными ми-тохондриальными белками. В то же время, каких-либо доказательств участия белков в ПК/Са -индуцируемом МПП до сих пор обнаружить не удал . лось. Напротив, есть все основания предполагать, что ПК/Са -индуцируемый МПП - это явление липидной природы, т.е. в основе него лежит процесс, протекающий в липидном бислое внутренней митохондри-альной мембраны (Mironova et al., 2004; Белослудцев и др., 2005).

Целью настоящей работы было изучение механизма Са -индуцируемой пермеабилизации модельных липидных мембран, содержащих насыщенные длинноцепочечные СЖК, и оценка возможности реализации этого механизма во внутренней мембране митохондрий.

В диссертации были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать, как влияет образование комплексов

Са2+ с различными

СЖК на ионную проводимость планарных бислойных липидных мембран (БЛМ);

2. Проверить, будет ли Са менять проницаемость СЖК-содержащих мембран для более крупных (по сравнению с неорганическими ионами) молекул; исследовать возможность такой неспецифической пермеабилизации на модели одноламеллярных липосом, загруженных гидрофильным флуоресцентным красителем сульфородамином Б;

3. Изучить изменения в фазовом состоянии липидного бислоя, которые могут быть индуцированы Са2+ в СЖК-содержащих липосомальных мембранах;

4. Проанализировать состав фракции СЖК митохондриальной мембраны и сыворотки крови и выяснить, как меняется жирнокислотный состав в сыворотке крови пациентов, перенесших инфаркт миокарда. Научная новизна работы.

Изучен механизм ПК/Са - индуцируемой пермеабилизации искусственных мембран, для чего, в частности, был разработан новый метод детекции фазовой сепарации в липидном бислое, основанный на использовании флуоресцентного мембранного зонда нонил-акридинового оранжевого. Показано, что пермеабилизация мембран происходит за счет образования бы-строзатекающих липидных пор по механизму хемотропного фазового перехода в липидном бислое.

Научно-практическое значение работы.

Полученные результаты развивают представления о механизмах пермеабилизации липидных мембран при изменении их фазового состояния и о возможности реализации подобного механизма в митохондриальной мембране в норме и патологии. Они могут быть использованы для исследований в области биоэнергетики, клеточной патофизиологии и медицины, поскольку в настоящее время показано, что СЖК и МПП вовлечены в индукцию ряда патофизиологических явлений: апоптоза, ишемии и др.

2. Обзор литературы

Работа посвящена выяснению одного из механизмов пермеабилизации мембран с участием СЖК и Са2+, поэтому в обзоре литературы будет рассмотрено два вопроса:

• роль СЖК как модуляторов проницаемости биологических мембран;

• влияние СЖК и Са2+ на состояние и свойства липидного бислоя;

Сначала будут рассмотрены вопросы о роли СЖК как модуляторов проницаемости биологических мембран; здесь речь пойдет, прежде всего, о биоэнергетических аспектах, т.е. о разобщающем действии СЖК на процессы энерготрансформации в сопрягающих мембранах. Также будут проанализированы вопросы об участии СЖК в Са -индуцируемом МПП и связанные с этим данные о проапоптотическом действии ПК. Затем будут рассмотрены вопросы о фазовом поведении СЖК-липидных смесей и влиянии СЖК на проницаемость мембран. В заключение будут описаны эффекты, которые оказывают двухвалентные катионы на фазовое состояние мембран, и связанные с этим изменения проницаемости липидного бислоя.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Гриценко, Елена Николаевна

5. Выводы

1. Показано, что Са2+ индуцирует неспецифическую ионную проводимость БЛМ, в состав которых входят жирные кислоты, связывающие Са2+ с высоким сродством (пальмитиновая и стеариновая). Другие жирные кислоты, не обладающие этим свойством, не меняют проницаемость БЛМ в присутствии Са2+.

2. Установлено, что Са индуцирует выход сульфородамина Б из однослойных липосом, содержащих длинноцепочечные насыщенные жирные кислоты. Доказано, что в основе этого эффекта лежит образование комплексов Са2+ с анионами жирной кислоты в мембране липосом, что ведет к появлению быстрозатекающих липидных пор.

3. Разработан метод детекции фазовой сепарации в липидном бислое, основанный на использовании флуоресцентного мембранного зонда нонил-акридин оранжевого.

4. Установлена взаимосвязь между двумя Са -индуцируемыми эффектами: фазовой сепарацией в липидном бислое и пермеабилизацией мембраны. Сделан вывод о том, что Са -индуцируемая пермеабили-зация ПК-содержащих липосом происходит по механизму хемотроп-ного фазового перехода в липидном бислое.

5. Обосновано предположение о возможности реализации обнаруженного механизма во внутренней митохондриальной мембране. Установлено, что состав митохондриальных липидов способствует ПК/Са2+-индуцируемой пермеабилизации мембран. Показано, что суммарное содержание пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в мембране митохондрий близко к пороговому уровню, при коЛ I тором возможна Са -индуцируемая пермеабилизация липидного бислоя.

5. Заключение

Итак, подведем итог данным и выводам, которые были представлены в настоящей работе.

Напомним, что данная работа началась с исследования вопроса о том, каким образом связывание

Са с СЖК в мембране может повлиять на ее проницаемость. Основанием для проведения такого рода исследований явились данные, полученные ранее в лаборатории Г.Д. Мироновой, о том, что насыщенные длинноцепочечные СЖК связывают Са2+ с высоким сродством и являются важными Са2+-связывающими компонентами митохондриальной мембраны (Mironova et al., 2001).

В настоящей работе было показано, что связывание Са2+ с насыщенными длинноцепочечными СЖК ведет к неспецифической пермеабилизации липидного бислоя. Исследования, проведенные на БЛМ и липосомах, дали четкий ответ относительно причины этой пермеабилизации: пермеабилиза-ция связана с образованием комплексов Са2+ с анионами СЖК в липидном бислое. Об этом свидетельствуют следующие данные (раздел 4.1.).

1. Пермеабилизация мембран наблюдается только в случае с насыщенными длинноцепочечными СЖК (ПК, стеариновой кислотой), которые связывают Са2+ с высоким сродством.

2. Оптимум рН для обоих процессов лежит в щелочной области, т.е. определяющим фактором для обоих процессов является концентрация де-протонированной (анионной) формы жирной кислоты.

3. Пермеабилизацию СЖК-содержащих мембран вызывает не только Са , но и другие двухвалентные катионы: Ва2+, Sr2+, Мп2+ и др. Значит, для индукции этого эффекта важно именно комплексообразование анионов жирной кислоты с каким-либо двухвалентным катионом. л.

Поняв причину СЖК/Са -индуцируемой пермеабилизации мембран, мы задались вопросом о ее природе и выяснили, что речь в данном случае идет об образовании в мембране быстрозатекающих липидных пор. Этот вывод был сделан на основе следующих фактов (раздел 4.1.2. и 4.2.).

04

1. При связывании Са^ с ПК или стеариновой кислотой мембрана становится проницаемой для достаточно крупных молекул, таких, как суль-фородамин Б. Это, в частности, позволило сразу отвергнуть предположение о том, что мы имеем дело с «катионофорным» эффектом СЖК, обусловленным их способностью переносить катионы (прежде всего, протоны) через липидный бислой.

Ч I

2. ПК/Са -индуцируемая пермеабилизация липосом, загруженных суль-фородамином, носит кратковременный характер: выход сульфородами-на (точнее, какой-то его части, если эффект немаксимальный) наблюда4ется лишь в первый момент после добавления Са к ПК-содержащим липосомам.

3. Частичный ПК/Са2+-индуцируемый выход сульфородамина из липосом не является следствием полного разрушения (мицеллизации) какой-то части липосом. Это было подтверждено специальной проверкой с привлечением метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Таким образом, было, в частности, отвергнуто предположение о возможу I ном «детергеноподобном» эффекте ПК или ее комплексов с Са .

Выяснив природу СЖК/Са -индуцируемой пермеабилизации мембран, мы поставили вопрос о ее механизме и пришли к выводу о том, что L

СЖК/Са -индуцируемое образование липидных пор связано с изменением фазового состояния мембраны. Это подтвердили эксперименты на липосо-мах, меченых НАО, в которых, в частности, было показано следующее (раздел 4.3.2.).

1. Са2+ вызывает фазовую сепарацию ПК в отдельные мембранные домены.

2. Степень фазовой сепарации, варьируемая путем изменения концентра

Ч I ции добавляемых ПК и Са , строго коррелирует со степенью пермеабилизации липосомальных мембран в тех же условиях.

Кроме того, мы показали, что СЖК/Са2+-индуцируемая пермеабилизация липосом не является следствием повышения осмотического давления внутри везикул; оказалось, что пермеабилизация может происходить и в условиях гипертонии, на фоне высокой концентрации сахарозы во внешней среде (раздел 4.3.1.)- Поэтому, наиболее вероятное объяснение полученных результатов состоит в том, что образование СЖК/Са2+-индуцируемых липидных пор происходит по механизму хемотропного фазового перехода в липидном бислое.

Как обсуждалось в разделе 4.3.3, ключевой момент в данном механизме пермеабилизации липидного бислоя - это возникновение межслой-ного дисбаланса сил латерального давления/натяжения в мембране, что является движущей силой образования липидных пор. Возникновение этого дисбаланса - результат неравновесности процессов, протекающих в системе, и весь механизм пермеабилизации носит, таким образом, кинетический характер. Это подтверждается в экспериментах по титрованию ПК-содержащих липосом малыми дозами Са2+, а также тем фактом, что степень пермеабилизации зависит от равномерности распределения ПК в мембране (раздел 4.3.4.).

Поняв механизм СЖК/Са2+-индуцируемой пермеабилизации мембран, мы попытались оценить возможность его реализации в митохондриях и представить, какую он может играть роль в физиологии клетки. Конечно, для серьезного, обоснованного ответа на эти вопросы необходимы детальные исследования, которые выходят за рамки возможностей настоящей работы. Тем не менее, некоторые принципиальные оценки могут быть даны (раздел 4.4.1., 4.4.3. и 4.5).

1. Во-первых, липидный состав митохондриальной мембраны, судя по всему, благоприятствует СЖК/Са -индуцируемому образованию липидных пор. Эффекты, полученные на мембранах из митохондриальных липидов, более выражены по сравнению с эффектами, полученными при использовании других липидных смесей.

2. Во-вторых, одними из основных СЖК в митохондриальной мембране являются ПК и стеариновая кислота, то есть, именно те жирные кислоты, которые связывают

Са2+ с высоким сродством (Mironova et al., 2001) и потенциально могут быть вовлечены в образование липидных пор по механизму хемотропного фазового перехода в липидном бислое. Результаты наших анализов, а также исследования, проведенные на митохондриях (Mironova et al., 2004), говорят о том, что суммарное содержание ПК и стеариновой кислоты в митохондриальных мембранах близко к пороговому уровню, при котором добавление Са приводит к образованию липидных пор. 3. В-третьих, как показывает анализ содержания СЖК в сыворотке крови больных, перенесших инфаркт миокарда, уровень ПК и СК коррелирует со степенью ишемического поражения сердечной ткани, существенно повышаясь при тяжелых патологиях.

Таким образом, данные настоящей работы, дополненные анализом л I параллелей между явлениями СЖК/Са -индуцируемой пермеабилизации липосом и митохондрий (раздел 4.4.2.), позволяют сделать вывод о том, что СЖК/Са2+

-индуцируемый МПП есть не что иное, как образование липидных пор во внутренней мембране митохондрий, которое происходит по механизму хемотропного фазового перехода в липидном бислое и может являться результатом развития патологических процессов в клетке.

По-видимому, тот факт, что механизм пермеабилизации мембран, рассмотренный в настоящей работе, имеет отношение именно к митохондриям, не является случайностью. Ключевое звено в данном механизме - это дисбаланс латеральных сил давления/натяжения в мембране, и здесь следует подчеркнуть, что важным фактором возникновения дисбаланса является поддержание гетерогенности в трансмембранном распределении амфи-филъных молекул в мембране. И в этом смысле СЖК - как ионогенные ам-фифильные соединения - должны играть особую роль в сопрягающих мембранах, в частности, во внутренней мембране митохондрий. При энергиза-ции сопрягающих органелл в присутствии амфифильного ионогенного соединения на их энергопреобразующих мембранах возникает - параллельно электрохимическим ионным градиентам - градиент заряженной формы этого соединения. И этот градиент может являться движущей силой кон-формационных изменений мембран - данная идея была обоснована в работах В.К. Опанасенко с сотрудниками (Opanasenko et al., 1995; 1996; Se-menova et al., 1996). В случае с СЖК и митохондриальной мембраной это выглядит следующим образом. Энергизация митохондриальной мембраны в присутствии СЖК и Са будет означать, что на матриксной стороне мембраны будут накапливаться комплексы СЖК с Са2+; в конечном счете, это приведет к возникновению дисбаланса латеральных сил в мембране. И образование липидных пор (что, по сути, является «конформационной перестройкой» липидного бислоя) - это один из путей диссипации подобного напряженного состояния мембраны.

По-видимому, механизмы подобного рода, основанные на фундаментальных физико-химических свойствах липидного бислоя, могут играть важную роль в физиологии клетки. Так, результаты настоящей работы, по сути, являются ключом к пониманию механизма проапоптотического действия ПК (Pablo and Kromer, 1999; Kong and Rabkin, 2000; Sparagna et al., 2000; Listenberger et al., 2001). Другой пример - исследования Д.П. Харако-за, в которых развиваются представления о роли фазовых переходов в механизме передачи нервного импульса в быстрых синапсах (Харакоз, 2001). То, что происходит в липидном бислое синаптической мембраны, принципиально очень похоже на то, что происходило с мембранами в наших экспериментах. Также имеет место связывание Са на одной из сторон мембраны, что, предположительно, влечет за собой отвердевание соответствующего монослоя и возникновение межслойного дисбаланса латеральных сил. Отличие состоит в том, что «способом диссипации напряженного состояния бислоя» является не пермеабилизация синаптической мембраны, а ее слияние с одной из множества секреторных везикул, заякоренных на поверхности мембраны специальными белками. Поэтому можно выразить надежду, что результаты данной работы будут также полезны для понимания общих механизмов функционирования биологических мембран.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гриценко, Елена Николаевна, Пущино

1. Абрамзон А.А., Гаев Г.М. (1979) Поверхностно-активные вещества. Справочник.

2. Андреев А.Ю., Волков Н.И., Мохова Е.Н., Скулачев В.П. (1987) Подавление карбоксиатрактилатом и аденозиндифосфатом разобщающего действия пальмитата на митохондрии скелетных мышц. Биологические мембраны, 4, 474-478.

3. Антонов В.Ф. (1982) Липиды и ионная проницаемость мембран. Москва «Наука».

4. Антонов В.Ф. (1998) Липидные поры: Стабильность и проницаемость мембран. Соросовский Образовательный журнал, 10, 10-17.

5. Антонов В.Ф., Кожомкулов Э.Т., Шевченко Е.В. (1986) Проницаемость бислойных липидных мембран при фазовом переходе. Роль межмолекулярных кальциевых мостиков. Биофизика, 31, 252-257.

6. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. (1992) Липидные мембраны при фазовых превращениях. Наука, Москва.

7. Антонов В.Ф., Шевченко Е.В. (1995) Липидные поры и стабильность клеточных мембран. Вести. РАМН, 10,48-55

8. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В., Миронова Г.Д. (2005) Возможный механизм образования и регуляции пальмитат-индуцированной циклоспорин А-нечувствительной митохондриальной поры. Биохимия, 70,7,987-994.

9. Бодрова М.Э., Маркова О.В., Мохова Е.Н., Самарцев В.Н. (1995) Участие ATP/ADP-антипортера в разобщающем действии жирных кислот в митохондриях печени. Биохимия, 60, 1349-1357.

10. Геннис P. (1997) Биомембраны: молекулярная структура и функции. Мир, Москва.

11. Дятловицкая Э.В., Безуглов В.В. (1998) Липиды как биоэффекторы. Введение. Биохимия, 63, 1, 3-5.

12. Кленчин В.А. (1993) Электротрансфекция клеток. Свойства и возможные механизмы. Биологические мембраны, 10, 5-19.

13. Корепанова Е.А., Шевченко Е.В., Кожомкулов Э.Т., Вассерман А.Н., Морозова Е.Р., Антонов В.Ф. (2000) Полимиксин В и Са2+ индуцируют флуктуации проводимости в бислойной липидной мембране из дипальмитоилфосфатидной кислоты. Биофизика, 45, 2, 276-282.

14. Левачев М.М., Мишукова Е.А., Сивкова В.Г., Скулачев В.П. (1965) Энергетический обмен голубя при самосогревании после гипотермии. Биохимия, 30, 864-874.

15. Лейкин С.Л., Глазер Р.В., Черномордик Л.В. (1986) Механизм образования пор при электрическом пробое мембран. Биологические мембраны, 3, 9, 944-951.

16. Ленинджер А. (1966) Митохондрия. Молекулярные основы структуры и функции. Мир, Москва.

17. Маркин B.C., Козлов М.М. (1984) Влияние двухвалентных катионов на температуру фазового перехода в липидных мембранах. Биофизика, 1, 65-68.

18. Мохова Е.Н., Старков А.А., Бобылева В.А. (1993) Разобщение окислительного фосфорилирования жирными кислотами в митохондриях печени и мышц. Биохимия, 58, 1513-1522.

19. Мохова Е.Н., Хайлова Л.С. (2005) Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот. Биохимия, 70, 197-202.

20. Самарцев В.Н. (2000) Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования. Биохимия, 65, 991-1005.

21. Самарцев В.Н., Маркова О.В., Зелди И.П., Смирнов А.В. (1999) Роль АДФ/АТФ и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщающем действии жирных кислот, лаурилсульфата и 2,4-динитрофенола, в митохондриях печени. Биохимия, 64, 1073-1084.

22. Скулачев В.П., Маслов С.П. (1960) Биохимия, 25, 1058-1065.

23. Харакоз Д.П. (2001) О возможной физиологической роли фазового перехода «жидкое-твердое» в биологических мембранах. Успехи биологической химии, 41, 333-364.

24. Чизмаджев Ю.А., Аракелян В.Б., Пастушенко В.Ф. (1981) Биофизика мембран. М.:Наука, 207-229.

25. Чизмаджев Ю.А., Черномордик J1.B., Пастушенко В.Ф., Абидор И.Г. (1982) Электрический пробой бислойных липидных мембран. ВИНИТИ, 161-266.

26. Agafonov A., Gritsenko Е., Belosludtsev К., Kovalev A., Gateau-Roesch О., Saris N.-E.L. and Mironova G.D. (2003) A permeability transition in liposomes induced by the formation of Ca /palmitic acid complexes. Biochim. Biophys. Acta, 1609, 2, 153-160.

27. Antonov V.F., Petrov V.V., Molnar A.A., Predvoditelev D.A. and Ivanov A.S. (1980) The appearance of single-ion channels in unmodified lipid bilayer membranes at the phase transition temperature. Nature, 283, 585586.

28. Bartlett G.R. (1959) Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem., 234, 466.

29. Beatrice M.C., Palmer J.W. and Pfeiffer D.R. (1980) The relationship between mitochondrial membrane permeability, membrane potential, and the retention of Ca2+ by mitochondria. J. Biol. Chem., 255, 8663-8671.

30. Bernardi P. (1992) Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pre by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. J. Biol. Chem., 267, 8834-8839.

31. Bernardi P. (1999) Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, and permeability transition. Physiol. Rev., 79, 1127-1155.

32. Bernardi, P., Penzo D. and Wojtczak L. (2002) Mitochondrial energy dissipation by fatty acids. Mechanisms and implications for cell death. Vitam. Horm., 65, 97-126.

33. Bisaccia F, Indiveri C. and Palmieri F. (1985) Purification of reconstitu-tively active alpha-oxoglutarate carrier from pig heart mitochondria. Bio-chim. Biophys. Acta, 810, 3, 362-9.

34. Bisaccia F, Indiveri C. and Palmieri F. (1988) Purification and reconstitution of two anion carriers from rat liver mitochondria: the dicarboxylate and the 2-oxoglutarate carrier. Biochim. Biophys. Acta, 933, 2,229-40.

35. Bisaccia F., de Palma A. and Palmieri F. (1989) Identification and purification of the tricarboxylate carrier from rat liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 977,2,171-6.

36. Bisaccia F., de Palma A. and Palmieri F. (1992) Identification and purification of the aspartate/glutamate carrier from bovine heart mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1106, 2, 291-6.

37. Bligh E.G., Dyer W.J. and Can (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. J. Biochem. Physiol, 37, 911.

38. Blume A. and Eibl H. (1979) The influence of charge on bilayer membranes. Calorimetric investigations of phosphatidic acid bilayers. Bio-chim. Biophys. Acta, 558, 1, 13-21.

39. Bodrova M., Dedukhova V., Samartsev V. and Mokhova E. (2000) Role of the ADP/ATP antiporter in fatty acid-induced uncoupling of Ca2+-loaded rat liver mitochondria. IUBMB Life, 50, 189-194.

40. Bogeim G., Hanke W. and Eibl H. (1980) Lipid phase transition in planar bilayer membrane and its effect on carrier- and pore-mediated ion transport. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 6, 3403-3407.

41. Borovyagin V.L. and Sabelnikov A.G. (1989) Lipid polymorphism of model and cellular membranes as revealed by electron microscopy. Electron Microsc. Rev., 2, 75-115.

42. Boss O., Muzzin P. and Giacobino J.P. (1998) The uncoupling proteins: a review. Eur. J. Endocrin., 139, 1-9.

43. Braganza L.F., Blott B.H., Сое T.J. and Melville D. (1984) Dye permeability at phase transitions in single and binary component phospholipids bilayers. Biochim. Biophys. Acta., 731, 2, 137-144.

44. Brand, M.D. and T.C. Esteves (2005) Physiological functions of the mitochondrial uncoupling proteins UCP2 and UCP3. Cell. Metab., 2, 2, 8593.

45. Broekemeier K.M., Schmid P.C., Schmid H.H.O. and Pfeiffer D.R. (1985) Effects of phospholipase Аг inhibitors on ruthenium red-induced1. Л I

46. Са release from mitochondria. J. Biol. Chem., 260, 105-113.

47. Carafoli E. (1987) Intracellular calcium homeostasis. Ann. Rev. Bio-chem., 56, 395-433.

48. Cevc G. and Richardsen H. (1999) Lipid vesicles and membrane fusion. Adv. Drug Deliv. Rev., 38, 207-232.

49. Crompton M. (1999) The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. Biochem. J., 341,233-249.

50. Crompton M., Ellinger H. and Costi A. (1988) Inhibition by cyclosporin A of a Ca -dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress. Biochem J., 255, 357-360.

51. Crompton M., Van Gurp M., Festjens N, van Loo S. and Vandenabeele P. (2003) Mitochondrial intermembrane proteins in cell death. Biochem. Biophys. Res. Comm., 304,487-497.

52. Cullis P.R. and de Kruijff B. (1979) Lipid polymorphism and the functional roles of lipids in biological membranes. Biochim. Biophys. Acta, 559,4, 399-420.

53. Cullis P.R. and Verkleij A.J. (1979) Modulation of membrane structureл . ^ iby Ca and dibucaine as detected by P NMR. Biochim. Biophys. Acta, 552,3,546-551.

54. Curland R.J. (1979) Binding of Ca2+ and Mg2+ to phosphatidylserine vesicles: different effects of 31P NMR shifts and relaxation times. Biochim. Biophys. Res. Comm., 88, 927-932.

55. Daum G.(1985) Lipids of mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 822, 142.

56. De Pinto V., Tommasino M., Palmieri F. and Kadenbach B. (1982) Purification of the active mitochondrial phosphate carrier by affinity chromatography with an organomercurial agarose column. FEBS Lett., 148, 1, 103-6.

57. Dedukhova V.J., Mokhova E.N., Skulachev V.P., Starkov A.A. Arrigoni-Martelli E. and Bobyleva V.A. (1991) Uncoupling effect of fatty acids on heart muscle mitochondria and submitochondrial particles. FEBS Lett., 295, 51-54.

58. DePablo M., Susin S., Jacotot E., Larocette N., Costantini P., Ravagnan L., Zamzani N. and Kroemer G. (1999) Palmitate induces apoptosis via a direct effect on mitochondria. Apoptosis, 4, 81-87.

59. Dilley R.A., Theg S.M. and Beard W.A. (1987) Membrane-proton interactions in chloroplast bioenergetics: localized proton domains. Ann. Rev. Plant Physiol., 38, 347-389.

60. Dorn I.T., Neumaier K.R. and Tampe R. (1998) Molecular recognition of histidine-tagged molecules by chelator lipids monitored by fluorescence energy transfer and correlation spectroscopy. J. Am. Chem. Soc., 20, 2753-2763.

61. Dubinsky J.M., Brustovetsky N., Pinelis V., Kristal B.S., Herman C. and Li X. (1999) The mitochondrial permeability transition: the brain's point of view. Biochem. Soc. Symp., 66, 75-84.

62. Eibl H. and Blume A. (1979) The influence of charge on phosphatidic acid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta, 553, 3, 476-488.

63. Ferguson S.J. (1985) Fully delocalised chemiosmotic or localised proton flow pathways in energy coupling? A scrutiny of experimental evidence. Biochim. Biophys. Acta, 811, 47-95.

64. Friberg H. and Wieloch T. (2002) Mitochondrial permeability transition in acute neurodegeneration. Biochimie, 84,2-3,241-50.

65. Garlid K.D., Jaburek M., Jezek P. and Varecha M. (2000) How do uncoupling proteins uncouple? Biochim. Biophys. Acta, 1459, 2-3, 383-9.

66. Gateau-Roesch O., Pavlov E., Lazareva A.V., Limarenko E.A., Levrat C., Saris N.-E.L, Louisot P. and Mironova G.D. (2000) Calcium-binding properties of the mitochondrial channel-forming hydrophobic component. J. Bioenerg. Biomembr., 32, 105-110.

67. Gremlich S., Roduit R. and Thorens B. (1997) Dexamethasone induces posttranslational degradation of GLUT2 and inhibition of insulin secretion in isolated pancreatic beta cells. Comparison with the effects of fatty acids. J. Biol. Chem., 272, 3216-3222.

68. Gunter T. and Pfeiffer D. (1990) Mechanisms by which mitochondria transport calcium. Am. J. Physiol, 258, C755-C786.

69. Gutknecht J. (1987) Proton conductance through phospholipid bilayers: water wires or weak acids? J. Bioener. Biomem., 19, 427-442.

70. Gutknecht J. (1987) Proton/hydroxide conductance through phospholipids bilayer membranes: effects of phytanic acid. Biochim. Biophys. Acta, 898, 97-108.

71. Gutknecht J. (1988) Proton conductance caused by long-chain fatty acids in phospholipids bilayer membranes. J. Membr. Biol., 106, 83-89.

72. Halestrap A., McStay G. and Clarke S. (2002) The permeability transition pore complex: another view. Biochimie, 84, 153-166.

73. Halestrap A.P., Kerr P.M., Javadon S. and Woodfield K.-Y. (1998) Elucidating the molecular mechanism of the permeability transition pore and its role in reperfusion injury of the heart. Biochim. Biophys. Acta, 1366, 79-94.

74. Halestrap A.P., Kerr P.M., Javadov S. and Woodfield K.-Y. (1998) Elucidating the molecular mechanism of the permeability transition pore and its role in reperfusion injury of the heart. Biochim. Biophys. Acta, 1366, 79-94.

75. Hamilton J.A. (1998) Fatty acid transport: difficult or easy? J. Lipid Res., 39,467-481.

76. Haraux F. (1985) Localized or delocalized protons and ATP synthesis in biomembranes. Physiol. Veg., 23,4,397-410.

77. Hauser H., Finer E.G. and Darke A. (1974) Crystalline anhydrous car-phosphatidylserine bilayers. Biochim. Biophys. Res. Comm., 76, 267.

78. Hauser H., Guyer W. and Howell K. (1979) Lateral distribution of negatively charged lipids in lecithin membranes. Clustering of fatty acids. Biochemistry, 18, 3285-91.

79. Haworth R., and Hunter D. (1979) The Ca2+-induced membrane transiy Ition in mitochondria. II. Nature of the Ca trigger site. Arch. Biochem. Biophys., 195,460-467.

80. He L., and Lemasters J. (2002) Regulated and unregulated mitochondrial permeability transition pores: a new paradigm of pore structure and func-tion4 FEBS Lett., 512, 1-7.

81. Heidelberger R., Heinemann C., Neher E. and Matthews G. (1994) Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal. Nature, 371,513-515.

82. Hoekstra D. (1982) Fluorescence method for measuring the kinetics of Ca2+-induced phase separations in phosphatidylserine-containing lipid vesicles. Biochemistry, 21, 1055-1061.

83. Hoekstra D. (1982) Role of lipid phase separations and membrane hydration in phospholipid vesicle fusion. Biochemistry, 21, 2833-2840.

84. Hunter D. and Haworth R. (1979b) The Ca2+-induced membrane transi1. Л Ition in mitochondria. III. Transitional Ca release. Arch. Biochem. Biophys., 195,468-477.

85. Hunter D. and Haworth R. (1979a) The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch. Biochem. Biophysг., 195,453-459.

86. Hunter D., Haworth R. and Southard J. (1976) Relationship between configuration, function, and permeability in calcium-treated mitochondria. J. Biol. Chem., 251, 5069-5077.

87. Indiveri C., Topazzi A. and Palmieri F. (1990) Identification and purification of the carnitine carrier from rat liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1020,1,81-6.

88. Indiveri C., Topazzi A. and Palmieri F. (1992) Identification and purification of the ornithine/citrulline carrier from rat liver mitochondria. Eur. J. Biochem., 207, 2,449-54.

89. Inoue Т., Yanagihara S., Misono Y. and Suzuki M. (2001) Effect of fatty acids on phase behavior of hydrated dipalmitoylphosphatidylcholine bi-layer: saturated versus unsaturated fatty acids. Chem. Phys. Lipids, 109, 117-133.

90. Ito Т., Ohnishi S., Ishinaga M. and Kuro M. (1975) Synthesis of a new phosphatidylserine spin-label and calcium-induced lateral phase separation in phosphatidylserine-phosphatidylcholine membranes. Biochemistry, 14, 3064-3065.

91. Jacobson K. and Papahadjopoulos D. (1975) Phase transitions and phase separations in phospholipid membranes induced by changes in temperature, pH, and concentration of bivalent cations. Biochemistry, 14, 152161.

92. Jezek P., Engstova H., Zackova M., Vercesi A.E., Costa A.D.T., Arruda P. and Garlid K.D. (1998) Fatty acid cycling mechanism and mitochondrial uncoupling proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1365, 319-327.

93. Jezek P., Modriansky M. and Garlid K.D. (1997) A structure-activity study of fatty acid interaction with mitochondrial uncoupling protein. FEBSLett., 408, 166-170.

94. Jezek P., Zackova M., Ruzicka M., Skabisova E. and Jaburek M. (2004) Mitochondrial uncoupling proteins: facts and fantasies. Physiol. Res., 53, 199-211.

95. Junge W., Hong Y.-Q., Theg S., Forster V. and Polle A. (1984) Localized protons in photosynthesis of green plants? In "Information and energy transduction in biological membranes", Alan R. Liss, Inc., 139-148.

96. Kamp F. and Hamilton J.A. (1992) pH gradients across phospholipid membranes caused by fast flip-flop of un-ionized fatty acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11367-11370.

97. Kamp F. and Hamilton J.A. (1993) Movement of fatty acids, fatty acid analogues, and bile acids across phospholipid bilayers. Biochemistry, 32, 11074-11086.

98. Kamp F., Zakim D„ Zhang F., Noy N. and Hamilton J.A. (1995) Fatty acid flip-flop in phospholipid bilayers is extremely fast. Biochemistry, 34, 11928-11937.

99. Khodorov B. (2004) Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurons. Prog. Biophys. Mol. Biol., 86, 279-351.

100. Kleinfeld A.M., Chu P. and Romero C. (1997) Transport of long-chain native fatty acids across lipid bilayer membranes indicates that transbi-layer flip-flop is rate limiting. Biochemistry, 36,46, 14146-58.

101. Knoll W., Schmidt G., Rotzer H., Henkel Т., Pfeiffer W., Sackmann E., Mittler-Neher S. and Spinke J. (1991) Lateral order in binary lipid alloys and its coupling to membrane functions. Chem. Phys. Lipids, 57, 363-74.

102. Kong J. and Rabkin S. (2000) Palmitate-induced apoptosis in cardiomyo-cytes is mediated through alterations in mitochondria: prevention by cyclosporin A. Biochim. Biophys. Acta, 1485, 45-55.

103. Korge P., Honda H.M. and Weiss J.N. (2003) Effects of fatty acids in isolated mitochondria: implications for ischemic injury and cardioprotec-tion. Am. J. Physiol. Heart С ire. Physiol, 285, 1, 259-69.

104. Kramer R. and Klingenberg M. (1977) Reconstitution of adenine nucleotide transport with purified ADP, ATP-carrier protein. FEBS Lett, 82, 2, 363-7.

105. Krasinskaya I. P., Marshansky V. N., Dragunova S. F. and Yaguzhinsky L. S. (1984) Relationships of respiratory chain and ATP-synthetase in energized mitochondria FEBS Lett, 167, 176-180.

106. Kroemer G., and Reed J. (2000) Mitochondrial control of cell death. Nat. Med., 6, 513-519.

107. Lee A.G. (1977) Analysis of the defect structure of gel-phase lipid. Biochemistry, 16, 5, 835-841.

108. Lee A.G. (1977) Lipid phase transitions and phase diagrams. Biochim. Biophys. Acta, 472, 2, 237-281.

109. Leontiadou H., Mark A.E. and Marrink S.J. (2004) Molecular Dynamics simulations of hydrophilic pores in lipid bilayers. Biophys. J., 86, 21562164.

110. Li Y., Johnson N., Capano M., Edwards M. and Crompton M. (2004) Cyclophilin-D promotes the mitochondrial permeability transition but has opposite effects on apoptosis and necrosis. Biochem. J., 383, 101109.

111. Lin C.S. and Klingenberg M. (1980) Isolation of the uncoupling protein from brown adipose tissue mitochondria. FEBS Lett, 113,2, 299-303.

112. Listenberger L., Ory D. and Schaffer J. (2001) Palmitate-induced apoptosis can occur through a ceramide-independent pathway. J. Biol. Chem., 276, 14890-14895.

113. Llinas R., Sugimori M. and Silver R.B. (1992) Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal. Science, 256, 677-679.

114. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 1, 265-275.

115. Mabrey S. and Sturtevant J.M. (1977) Biochim. Biophys. Acta 486, 444450.

116. Madge E.L., Elson E.L. and Webb W.W. (1974) Fluorescence correlation spectroscopy: II. An experimental realization. Biopolymers, 13, 29.

117. Maggio В., Sturtevant J.M. and Yu R.K. (1987) Effect of calcium ions on the thermotropic behaviour of neutral and anionic glycosphingolipids. Biochim. Biophys. Acta, 901, 173-182.

118. Matthews G. (1996) Neurotransmitter release. Annu. Rev. Neurosci., 19, 219-233.

119. McEnery M., Snowman A., Trifiletti R. and Snyder S. (1992) Isolation of the mitochondrial benzodiazepine receptor: association with the voltage-dependent anion channel and the adenine nucleotide carrier. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 3170-3174.

120. Mironova G.D., Lazareva A., Gateau-Roesch O., Tyynela J., Pavlov Y., Vanier M. and Saris N.-E.L. (1997) Oscillating Ca2+-induced channel activity obtained in BLM with a mitochondrial membrane component. J. Bioenerg. Biomembr., 29, 6, 561-569.

121. Mitchell P. (1961) Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. Nature, 191, 144-148.

122. Mokhova E.N. and Khailova L.S. (2005) Involvement of mitochondrial inner membrane anion carriers in the uncoupling effect of fatty acids. Biochemistry (Moscow), 70, 2, 159-63.

123. Mueller P., Rudin D.O., Tien H., Ti and Wescott W.C. (1964) Formation and properties of bimolecular lipid membranes. In "Recent progress in surface science". N.Y. Acad. Press, 1, 379-393.

124. Mukerjee P. and Musels K.J. (1971) Critical micelle concentration of aqueous surfactant systems. NSDS-Nat. Bur. Stand.

125. Muranushi N., Takagi N., Muranishi S. and Sezaki H. (1981) Effect of fatty acids and monoglycerides on permeability of lipid bilayer. Chem. Phys. Lipids, 28, 3,269-79.

126. Nalecz K.A., Kaminska J., Nalecz M. and Azzi A. (1992) The activity of pyruvate carrier in a reconstituted system: substrate specificity and inhibitor sensitivity. Arch. Biochem. Biophys., 297, 1, 162-8.

127. Onuki Y., Morishita M„ Chiba Y., Tokiva S. and Takayama K. (2006) Docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid induce changes in the physical properties of a lipid bilayer model membrane. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 54, 1, 68-71.

128. Opanasenko V.K., Red'ko T.P., Gubanova O.N. and Yaguzhinsky L.S. (1992) Induction of an electrogenic transfer of monovalent cations (K+, NH4+) in thylakoid membranes by N,N'-dicyclohexylcarbodiimide. FEBS Lett., 307(3), 280-282

129. Opanasenko V.K., Semenova G.A., Agafonov A.V. and Gubanova O.N.1995) Formation of membrane network structures upon chloroplast energization in the presence of local anesthetics. Biochemistry (Moscow), 60, 1569-1572.

130. Opanasenko V.K., Semenova G.A., Agafonov A.V. and Gubanova O.N.1996) Effect of ДрН indicators neutral red and 9-Aminoacridine on chloroplast ultrastructure. Biochemistry (Moscow), 61(8), 1083-1087.

131. Ortiz A. and Gomez-Fernandez J.C. (1987) A differential scanning calo-rimetry study of the interaction of free fatty acids with phospholipid membranes. Chem. Phys. Lipids, 45, 75-91.

132. Ostrander D., Sparagna G., Amoscato A., McMillin J. and Dowhan W.2001) Decreased cardiolipin synthesis corresponds with cytochrome с release in palmitate-induced cardiomyocyte apoptosis. J. Biol. Chem., 276,38061-38067.

133. Penzo D., Tagliapietra C., Colonna R., Petronilli V. and Bernardi P.2002) Effects of fatty acids on mitochondria: implications for cell death. Biochim. Biophys. Acta, 1555, 1-3, 160-5.

134. Pfeiffer D.R., Kauffmann R.F. and Lardy H.A. (1978) Effects of N-ethylmaleimide on the limited uptake of Ca , Mn , and Sr by rat liver mitochondria. J. Biol. Chem., 253,4165-4171.

135. Pfeiffer D.R., Schmid P.C., Beatrice M.C. and Schmid H.H.O. (1979) Intramitochondrial phospholipase activity and the effects of Ca plus N-ethylmaleimide on mitochondrial function. J. Biol. Chem., 254, 1148511494.

136. Pietsch A. and Lorenz R.L. (1993) Rapid separation of the major phospholipid classes on a single aminopropyl cartridge. Lipids, 28, 945-947.

137. Piper H.M., Sezer O., Schwartz P., Hutter J.F. and Spieckermann P.G. (1983) Fatty acid-membrane interactions in isolated cardiac mitochondria and erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta, 732, 1, 193-203.

138. Portis A., Newton C., Pangborn W. and Papahadjopoulos D. (1979) Studies on the mechanism of membrane fusion: evidence for an intery 1 ^ imembrane Ca -phospholipid complex, synergism with Mg , and inhibition by spectrin. Biochemistry, 18, 780.

139. Pressman B.C., and Lardy H.A. (1956) Effect of surface active agents on the latent ATPase of mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 21, 458-466.

140. Rand R.P. (1964) Mechanical Properties of the Red Cell Membrane. Ii. Viscoelastic Breakdown of the Membrane. Biophys. J., 17, 303-316.

141. Rottenberg H. (1990) Decoupling of oxidative phosphorylation and pho-tophosphorylation. Biochim. Biophys. Acta, 1018, 1-17.

142. Rousset S., Alves-Guerra M.C., Mozo J., Miroux В., Cassard-Doulcier A.M., Bouillaud F. and Ricquier D. (2004) The biology of mitochondrial uncoupling proteins. Diabetes, 53, 130-5.

143. Rustenbeck I., Munster W. and Lenzen S. (1996) Relation between ac94cumulation of phospholipase A2 reaction products and Ca release in isolated liver mitochondria. Biochim Biophys Acta, 1304,2, 129-38.

144. Samartsev V.N., Smirnov A.V., Zeldi I.P., Markova O.V., Mokhova E.N. and Skulachev V.P. (1997) Involvement of aspartate/glutamate antiporter in fatty acid-induced uncoupling of liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1319, 251-257.

145. Schmidt G. and Knoll W. (1985) Densitometric characterization of aqueous lipid dispersions. Ber. Bunsenges. Phys. Chem., 89, 36-43.

146. Schonfeld P. (1990) Does the function of adenine nucleotide translocase in fatty acid uncoupling depend on the type of mitochondria? FEBS Lett., 264, 246-248.

147. Schonfeld P. (1992) Anion permeation limits the uncoupling activity of fatty acids in mitochondria. FEBS Lett., 303, 190-192.

148. Schonfeld P. and Bohnensack R. (1997) Fatty acid-promoted mitochondrial permeability transition by membrane depolarization and biding to the ADP/ATP carrier. FEBS Lett., 420, 167-170.

149. Schonfeld P. and Struy H. (1999) Refsum disease diagnostic marker phytanic acid alters the physical state of membrane proteins of liver mitochondria. FEBS Lett., 457, 179-183.

150. Schwarz G. and Arbuzova A. (1995) Pore kinetics reflected in the de-quenching of a lipid vesicle entrapped fluorescent dye. Biochim. Biophys, Acta, 1239,51-57.

151. Schwille P. (2001) Fluorescence correlation spectroscopy and its potential for intracellular applications. Cell. Biochem. Biophys., 34, 383-408.

152. Semenova G., Agafonov A. and Opanasenko V.K. (1996) Light-induced reversible local fusions of thylakoid membranes in the presence of dibu-caine or tetracaine. Biochim. Biophys. Acta, 1285, 29-37.

153. Serpersu E., Kinosita K. and Tsong T. (1985) Reversible and irreversible modification of erythrocyte membrane permeability by electric field. Biochim. Biophys. Acta, 812, 779-785.

154. Shimabukuro M., Zhou Y., Levi M. and Unger R. (1998) Fatty acid-induced beta cell apoptosis: a link between obesity and diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2498-2502.

155. Shinohara Y., Unami A., Tashima M., Nishida H., van Dam K. and Te-rada H. (1995) Inhibitory effect of Mg2+ on the protonophoric activity of palmitic acid. Biochim. Biophys. Acta, 1228,2-3, 229-234.

156. Skulachev V.P. (1991) Fatty acid circuit as a physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation. FEBS Lett., 294, 158-162.

157. Skulachev V.P. (1998a) Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. Biochim. Biophys. Acta, 1363, 100-124.

158. Skulachev V.P. (1999) Anion carriers in fatty acid-mediated physiological uncoupling. J. Bioenerg. Biomembr., 31, 5,431-45.

159. Sparagna G., Hickson-Bick D., Buja L. and McMillin J. (2000) A metabolic role for mitochondria in palmitate-induced cardiac myocyte apoptosis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 279, 2124-2132.

160. Srivastava A., Singh A.S. and Krishnamoorthy R. (1995) Rapid transport of protons across membranes by aliphatic amines and acids. J. Phys. Chem., 99, 11302-11305.

161. Strehlow U. and Jahnig F. (1981) Electrostatic interactions at charged lipid membranes. Kinetics of the electrostatically triggered phase transition. Biochim. Biophys. Acta, 641, 301-310.

162. Sultan A. and Sokolove P. (2001a) Palmitic acid opens a novel cyclosporin A-insensitive pore in the inner mitochondrial membrane. Arch. Biochem. Biophys., 386, 31-51.

163. Sultan A. and Sokolove P. (2001b) Free fatty acid effects on mitochondrial permeability: an overview. Arch. Biochem. Biophys., 386, 52-61.

164. Tamura-Lis W., Reber E.J., Cunningham B.A., Collins J.M. and Lis L.J.1. Л I1986) Са induced phase separations in phospholipid mixtures. Chem. Phys. Lipids, 39, 119-24.

165. Trauble H. and Eibl H. (1974) Electrostatic effects on lipid phase transitions: membrane structure and ionic environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1,214-219.

166. Tsofina L.M. and Mokhova E.N. (1998) Effect of palmitic and lauric acids on the phospholipid bilayer membrane conductivity. Biosci. Rep., 18, 2,91-5.

167. Van Dijck P.V.M., van Zaelen E.J.J., van Deenen L.L.M. and de Gier J. (1976) Calorimetric behaviour of individual phospholipids classes from human and bovine erythrocyte membranes. Chem. Phys. Lipids, 17, 336343.

168. Van Dijck P.W.M., de Kruijff В., Verkleij A.J., van Deenen L.L. and de Gier J. (1978) Comparative studies on the effects of pH and Ca2+ on bi-layers of various negatively charged phospholipids and their mixtures. Biochim. Biophys. Acta, 512, 84-90.

169. Waite M., Van Deenen L., Ruigrok T. and Elbers P. (1969) Relation of mitochondrial phospholipase A activity to mitochondrial swelling. J. Lipid Res., 10, 599-608.

170. Wieckowski M. and Wojtczak L. (1998) Fatty acid-induced uncoupling of oxidative phosphorylation is partly due to opening of the mitochondrial permeability transition pore. FEBS Lett., 423, 339-342.J

171. Wieckowski M., Brdiczka D. and Wojtczak L. (2000) Long-chain fatty acids opening of the reconstituted mitochondrial permeability transition pore. FEBSLett., 484, 61-64.

172. Wieckowski M.R. and Wojtczak L. (1997) Involvement of the dicar-boxylate carrier in the protonophoric action of long-chain fatty acids in mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Comm., 232,414-417.

173. Williams R.P.J. (1985) Proton diffusion and the bioenergies of enzymes in membranes. In "The enzymes of biological membranes" (Edited by Martonosi A.N.), 4,71-109.

174. Wojtczak L. and Wieckowski M.R. (1999). The mechanisms of fatty acid-induced proton permeability of the inner mitochondrial membrane. J. Bioenerg. Biomembr., 31, 5,447-55.

175. Zhang F., Kamp F. and Hamilton J.A. (1996) Dissociation of long and very long chain fatty acids from phospholipid bilayers. Biochemistry, 35, 16055-16060.

176. Zhou Y.T., Grayburn P., Karim A., Shimabukuro M., Higa M., Baetens D., Orci L. and Unger R.H. (2000) Lipotoxic heart disease in obese rats: implications for human obesity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 17841789.

177. Zoratti M. and Szabo I. (1995) Mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta, 1241, 139-176.

178. Zoratti M., Szabo I. and De Marchi U. (2005) Mitochondrial permeability transitions: how many doors to the house? Biochim. Biophys. Acta, 1706, 40-52.