Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы повреждений эритроцитов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы повреждений эритроцитов"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

- 5 МАИ

УДК 577.352.33: 577.322.23

Заводник Илья Борисович МЕХАНИЗМЫ ПОВРЕЖДЕНИЙ ЭРИТРОЦИТОВ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Минск - 1997

Работа выполнена в Институте биохимии Академии Наук Беларуси

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Рощупкин Д.И. доктор биологических наук, профессор, Мажуль В.М. доктор биологических наук, профессор, Бартош Г.

Оппонирующая организация - Институт биохимии им. А. Н. Баха

Российской Академии Наук

Защита состоится 29 апреля 1997 года в 10 30 часо! заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой стег доктора наук ( Д 01. 37. 01) в Институте фотобиологии АН Беларуа адресу : 220072, Минск, ул. Ф. Скорины, д. 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инсти' фотобиологии АН Беларуси

Автореферат разослан "26" марта 1997 года.

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций

кандидат биологических наук

Л. Ф. Кабашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации.

Плазматическая клеточная мембрана, занимающая особое место среди мембранных структур, выполняет ряд важнейших функций: барьерную, транспортную, обеспечивает контакт клетки с внешней средой, участвует в рефляции клеточного гомеостаза, определяет индивидуальность и целостность клетки. Состояние и устойчивость клеточной мембраны находятся в гесной взаимосвязи со свойствами компонентов цитоплазмы. Важнейшими направлениями современной биофизики мембран являются исследования механизмов повреждений плазматических мембран при различных воздействиях и изучение структурных элементов и взаимодействий, обеспечивающих оптимальную организацию клетки. Эти вопросы, привлекающие постоянное внимание исследователей, требуют своей дальнейшей углубленной разработки. В качестве объекта исследования молекулярных механизмов повреждений и устойчивости мембранных структур мы выбрали эритроциты человека, выполняющие в организме важнейшую функцию по транспорту дыхательных газов. Структурная организация, динамика, функции мембран эритроцитов (Конев, 1987, Lipowski, 1991, Isomaa et at., 1995, Рощупкин н соавт., 1994) и закономерности различных типов гемолиза (Черпицкий и со-авт. 1991, Butler et al., 1992) исследованы достаточно детально. В то же время общие молекулярные механизмы повреждений эритроцитов остаются во многом невыяснены.

Нами изучены реакции эритроцитарной мембраны на повреждающее действие факторов различной природы. Одновременно были исследованы закономерности и механизмы реакций окисления и аутоокислепия оксиге-моглобина, поскольку до настоящего времени во многом неизвестна роль отдельных аминокислотных остатков молекулы белка, внешних эффекторов в регуляции реакций гемоглобина с кислородом и внешними окислителями. Аутоокисление гемоглобина представляет основной источник кислородных свободных радикалов в эритроците и во многом определяет устойчивость эритроцитов (Метелица, 1984, Falcioni, 1995).

Проведение данного исследования является необходимым этапом в расшифровке молекулярных механизмов функционирования плазмати-

Условные обозначения автореферата: ГДА - гяутаровый альдегид, МДА -малоновый диальдегид, ТБГТ1 - ^бутилгидроперекись, ТБКРС - соединения, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой, НЪ - гемоглобин.

ческих мембран эритроцитов. Проблема повреждений и устойчивости эритроцитов приобретает серьезное практическое значение в связи с участившимися случаями гемолитических состояний, связанных в том числе с неблагоприятным техногенным воздействием окружающей среды на организм человека.

Связь работы с крупными научными программами, темами.

Работа выполнена в рамках Республиканских комплексных программ фундаментальных исследований: "Исследование метаболических и регуля-торных факторов, общеадаптационных и иммунных реакций, нейрохимических процессов в норме и патологии (Метаболический гомеостаз)", утвержденной постановлением Президиума АН БССР N 116 от 5.12.1990 г., и "Физико-химические механизмы функционирования биосистем как основа управления жизнедеятельностью растительных и животных организмов (Функционирование биосистем)", утвержденной Дополнением 1 к постановлению Президиума АН Беларуси N 224 от 24 ноября 1995 г.

Цель и задачи исследования. .

Цель работы - выяснить молекулярные механизмы повреждений эритроцита и его компонентов при воздействии физиологически важных эффекторов и варьировании физико-химических параметров окружения.

Для достижения цели были сформулированы и решены следующие задачи:

1. Определить критические структурные элементы эритроцитарных мембран, обеспечивающие их устойчивость к действию повреждающих факторов.

2. Изучить структурное состояние белков эритроцитарных мембран при изменениях рН, ионной силы, температуры, действии органических растворителей.

3. Изучить действие длшшоцепочечных насыщенных жирных кислот и алифатических альдегидов на состояние липидного и белкового компонентов эритроцитарной мембраны.

4. Изучить закономерности окислительных повреждений мембран эритроцитов человека на примере действия органической гидроперекиси (1 - бу-тилгидроперекись).

5. Оценить нарушения свойств мембран эритроцитов человека при патологиях, протекающих с окислительным стрессом (диабет).

6. Выяснить влияние на структуру и свойства мембран эритроцитов ковалентной модификации альдегидными продуктами перекиского окисления липидов.

7. Исследовать механизмы, регулирующие взаимодействие гемоглобина с кислородом в реакции необратимого аутоокисяения.

Научная новизна полученных результатов.

Впервые предложена концепция существования в плазматических мембранах эритроцитов человека ряда критических структурных элементов, которые обеспечивают целостность эритроцита и в наибольшей степени изменяются при действии различных повреждающих факторов.

Установлено, что механический гемолиз связан с разрывом нескольких контактов между гетеродимерами спектрина. Основной причиной лизиса эритроцитов, индуцируемого высокими (2.2 - 5.5 М) концентрациями этанола, является преимущественное нарушение нативной структуры белка полосы 3. Повреждающий эффект этанола на эритроцитарнуго мембрану в значительной мера обусловлен уменьшением диэлектрической проницаемости среды. Показано, что свободные длиппоцепочечные жирные кислоты и алифатические альдегиды, уменьшая микровязкость бислойных и ашгулярньтх липидов, ингибируют мембранную ацетилхолинэстеразу и не изменяют существенно термостабильность мембранных белков. Константа скорости реакции гемолиза, индуцируемого этими эффекторами, возрастала в ряду, метиловый эфир жирной кислоты -> жирная кислота -» алифатический альдегид. В формировании одной мембранной поры кооперативно участвуют 5 молекул эффектора (в случае пальмитиновой кислоты).

Установлено, что малоновый диальдегид нарушает нативную структуру спектрина, повышает микровязкость и осмотическую прочность мембран эритроцитов. Алкилирование плазматических мембран ацетальдегидом (как показано нами для мембран гепатоцитов) существенно уменьшает число рецепторов простагландинов Ei и Е2, не изменяя констант ассоциации с рецепторами.

Обнаружено, что индуцируемое экзогенной органической гидроперекисью окислительное повреждение эритроцитов, которое развивается по схеме: окисление внутриэритроцитарного глутатиоиа -> окисление оксиге-моглобина перекисное окисление липидов, приводит к резкой гиперполяризации мембраны и бифазным изменениям осмотической устойчивости эритроцитов.

Впервые показано, что мембранный потенциал и чувствительность к окислительному стрессу достоверно выше для эритроцитов пациентов, больных инсулинзависимой формой диабета.

Получены доказательства того, что реакция необратимого аутоокисле-ния гемоглобина включает протонирование дистального гистидина молекулы белка и сольватацию порфиринового кольца гемоглобина водой. AMP,

АДР, ATP, лиридоксаль-5-фосфат не изменяют значение энтальпии процесса оксигенации, незначительно уменьшают коэффициент Бора, увеличивают динамическую подвижность белковой глобулы гемоглобина.

Практическая значимость полученных результатов.

Установленные механизмы и закономерности процессов повреждения плазматических мембран эритроцитов расширяют существующие представления о биофизических основах функционирования мембранных структур, важны для понимания реакций клетки на различные по своей природе специфические и неспецифические воздействия. Полученные результаты могут быть использованы при разработке способов направленной коррекции и профилактики мембранных повреждений при развитии патологических состояний, экстракорпоральных процедурах, других терапевтических воздействиях.

Исследование механизмов клеточных повреждений является необходимым этапом в расшифровке последовательности событий, приводящих к лизису клеток в многочисленных ситуациях гемолитических анемий.

Экономическая значимость полученных результатов.

Полученные результаты Moiyr найти применение при разработке способов стабилизации эритроцитов в трансфузиологии, при создании искусственных кровезаменителей и систем транспорта кислорода. Результаты позволяют разработать ряд простых и высокочувствительных методик оценки состояния и устойчивости эритроцитов при различных патологиях и терапевтических воздействиях. В работе предложен простой способ фотохимического синтеза [2,3- 14С] ацетоина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту*.

1) В плазматической мембране эритроцитов человека существует ряд критических структурных элементов и взаимодействий, нарушение которых приводит к разрушению мембраны и лизису клеток и которые в наибольшей степени изменяются при действии повреждающих факторов различной природы. Такими критическими элементами являются, например, контакты между спектриновыми гетеродимерами мембранного цитокаркаса (разрушение нескольких контактов служит причиной механического гемолиза); мембранный домен белка полосы 3 (его денатурация выступает основной причиной этанол - индуцируемого лизиса клеток).

2) Окислительные повреждения эритроцитов, индуцируемые экзогенной органической гидроперекисью, приводят к росту избирательной проницаемости плазматической мембраны для потенциалобразующих ионов и, как следствие, к гиперполяризации мембраны. Окислительные процессы лежат в

основе обнаруженного нами роста мембранного потенциала эритроцитов при диабете.

3) Аутоокисление оксигемоглобит человека протекает с участием Т -конформации молекулы белка, катализируется протонированием функциональной белковой группировки и включает гидратацию гема. Скорость процесса аугоокисления возрастает при модификации гемоглобина малоновым диальдегидом. Химическая модификация дистеина 93 (5 - цепей гемоглобина облегчает процесс аутоокисления, но ингибирует окисление гемоглобина феррицианидом.

Личный вклад автора.

Автором определено направление, сформулированы задачи, выбраны объекты и методы исследования. Экспериментальный материал диссертационной работы получен при решающем участии автора. Обобщение и анализ результов проведены автором самостоятельно.

Апробация результатов диссертации.

Результаты работы были представлены и обсуждены более чем на 30 научных конференциях и симпозиумах, в том числе: I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), Ш Конгрессе Международного общества биохимических исследований алкоголизма (Хельсинки, 1986), V, VI и VII Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1984, 1988, 1991), Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987), VI Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988), V Международном конгрессе по токсикологии "Фундаментальные исследования в токсикологии" (Брайтон, 1989), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), 20 Конференции Федерации Европейских биохимических обществ (Будапешт, 1990), Всесоюзном совещании "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Лущило, 1990), 27 и 28 Ежегодных конференциях Европейской ассоциации исследований печени (Вена, 1992 и Париж, 1993), VI Конференции "Свободные радикалы: от фундаментальной науки к медицине" (Турин, 1992),, 4 Международной конференции по лазерной спектроскопии (Юувасюоля, 1992), I и II Съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994, 1996), 2 и 3 Симпозиумах "Свободные радикалы в биологии и медицине" (Лодзь, 1994. 1996), IX съезде Польского биофизического общества (Лодзь, 1995), научных семинарах Института биохимии АН Беларуси, Института биофизики Университета в Лодзи, Института физики Политехнической Академии в Познани.

Опубликованность результатов.

Результаты диссертации представлены в 50 научных публикациях, из них 29 статей в научных журналах (9 из которых опубликованы в международных журналах), 2 статьи в сборниках трудов и 19 тезисов докладов конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 9 глав (6 глав - собственные исследования), заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 475 работ. Полный объем диссертации составляет 281 страницу, включая 92 иллюстрации и 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использованы эритроциты здоровых доноров, эритроциты пациентов, страдающих инсулинзависимой формой диабета (28 пациентов) и эритроциты пациентов до и после плазмафсреза (7 пациентов) и гемодиализа (6 пациентов). Тени эритроцитов изолировали по классическому методу (Dodge et al., 1963). Гемоглобин (IIb) человека получали осмотическим лизисом эритроцитов с последующим осаждением разрушенных клеточных мембран (Benesch et al., 1972).

О микровязкости мембран эритроцитов человека судили по соотношению интенсивностей флуоресценции мономерной и эксимерной форм пирена ("Sigma", США) (Galla, Sackmann. 1974).

Активность мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы определяли как в цельных эритроцитах (гематокрит-0.02%), так и в изолированных тенях (0.035 мг белка/мл) по методу Эллмана (Ellman et al., 1961) с помощью 5,5'-дитиобис(2-нитробеюойной кислоты) ("Sigma", США) (реактива Эллмана).

Мембранный потенциал эритроцитов определяли, используя молекулярный флуоресцентный зонд 3,3'-дипропилтиадикарбоцианин иодид (Molecular Probes, Inc., США) (Schummer et al., 1978). Уровень альдегидных продуктов перекисного окисления липидов определяли с помощью тиобар-битуровой кислоты ("Sigma", США) (Stocks, Donnandy, 1971), внутриэритро-цитарного восстановленного глутатиона - с помощью реагента Эллмана (Ellrnan, 1959) в суспензии эритроцитов (гематокрит 10%) после осаждения белков трихлоруксусной кислотой.

Степень повреждения эритроцитов при действии факторов различной природы оценивали по кинетическим параметрам гемолиза, индуцируемого: 1) понижением pH среды, 2) уменьшением осмолярности среды, 3) мехшш-

ческим воздействием, 4) воздействием высоких концентраций этанола, 5) воздействием свободных длинноценочсчных жирных кислот и алифатических альдегидов. Кинетические кривые гемолиза регистрировали, определяя спектрофотометрически число разрушенных клеток через определенные промежутки времени (по количеству НЬ в надосадочной жидкости после осаждения неразрушенных клеток), либо по изменению величины интегрального светорассеяния суспензии эритроцитов.

Кислотный лизис эритроцитов индуцировали, внося 0.01 мл упакованных клеток в изотоническую среду: 0.14 М NaCl + 0.01 М цитратно-фосфатный буфер со значениями рН 2.0-3.5 (2 мл); осмотический лизис -внося 0.02 мл упакованных клеток в 2 мл гипоосмотического раствора: 0.067 М NaCl + 0.005 М К2НР04, рН 7.4; механический гемолиз - перемешивая суспензию эритроцитов (гематокрит 2.5%) в 0.2 М К-фосфашом буфере, рН 7.4, пропеллерной металлической мешалкой с частотой 12 Гц; этанол - индуцируемый гемолиз - внося 0.02 мл упакованных эритроцитов в 2 мл раствора этанола в 0.145 М NaCl + 0.005 М К-фосфатный буфер, рН 7.4; лизис в присутствии длшшоцепочечных жирных кислот и алифатических альдегидов -внося соответствующие концентрации эффекторов в суспензию эритроцитов (гематокрит 2.5% либо 0.8%) в 0.145 М NaCl + 0.005 М К2НРО4, рН 7.4.

Малоновый альдегид (МДД) получали кислотным гидролизом 1,1,3,3 -тетраметоксипропана ("Aldrich", США).

Параметры оксигенации растворов НЪ определяли спектрофотометрически (Benesch et al., 1972), используя вакуумную термостатируемую иовету-дссатуратор (Шорохов, 1974). Процесс аутоокисления оксиНЬ регистрировали, инкубируя раствор белка (2,5 х 103 М) при температуре 43 °С в равновесии с атмосферой.

Спектры поглощения регистрировали с помощью спектрофотометра "Specord М-40" ("Carl Zeiss, Jena", Германия), спектры флуоресценции -спектрофлуориметров "Aminco - Bowman" (США) и "Perkin-EImer LS-5B" (Англия). Процессы тепловой денатурации изолированных мембран эритроцитов регистрировали с помощью прецизионного сканирующего микрокалориметра ДАСМ-1М (Россия) при скорости прогрева 1 К/мин; концентрация белка в образце составляла 2.0 мг/мл. Константы скорости ассоциации молекулярного кислорода с НЬ определяли с помощью наносекундного абсорбционного спектрометра, созданного в лаборатории фотоники молекул Института молекулярной и атомной физики АН Беларуси (заведующий - докт. физ.-мат. наук Джагаров Б.М.).

Результаты представляли как средние значения 4-6 измерений и анализировали, используя параметрический критерий Стыодента.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ И ПОВРЕЖДЕНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ВНЕШНИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

1. Кислотный лизис эритроцитов. Индуцируемые изменением рН структурные переходы эритроцитарных мембран. В настоящее время во многих случаях не существует способов оценить вклад различных факторов в обеспечение устойчивости эритроцита и неизвестна точная последовательность событий, приводящих в каждом конкретном случае к лизису клеток при повреждающих воздействиях. Исследование механизмов разрушения эритроцитов позволяет получать информацию об организации мембраны, о структурных элементах и взаимодействиях, её стабилизирующих. Нами рас-смотренны закономерности протониндуцируемого гемолиза, поскольку молекулярная модель кислотного лизиса эритроцитов отсутствует (Иванов, Да-наилова, 1991).

По мере падения рН среды (в диапазоне рН 3.5 - 2.2) кажущаяся константа скорости кислотного гемолиза возрастает, а характеристическое время, необходимое для лизиса половины клеток, уменьшается. Нами не обнаружено различий в устойчивости к кислотному гемолизу эритроцитов, содержащих гемоглобин в окси-форме или мет-форме (после предварительного окисления). Вероятно, что процессы окисления внутриэритроцитарного НЬ после внесения эритроцитов в среду гемолиза не играют существенной роли в кислотном лизисе эритроцитов.

Предварительная модификация эритроцитов глутаровым диальдеги-дом, которая, как известно, ограничивает подвижность мембранных белков, предварительная тепловая денатурация спектрина в наших экспериментах уменьшали кислотную стабильность эритроцитов, в то время как сжатие эритроцитов в гиперосмотической среде, содержащей высокие концентрации ионов натрия, калия, магния, кальция или сахарозы, ингибировало кислотный гемолиз эритроцитов.

Для выяснения возможной роли структурных перестроек мембранных белков как фактора, лимитирующего скорость кислотного лизиса эритроцитов, мы исследовали методами микрокалориметрии и триптофановой флуоресценции индуцируемые изменением рН переходы эритроцитарной мембраны.

Весьма незначительные изменения рН в физиологическом диапазоне сопровождаются выраженными изменениями параметров процесса тепловой

g

денатурации мембран эритроцитов: температуры максимумов отдельных де-натурационных переходов, их числа и площади под денатурационной кривой. Используя совпадающие у различных авторов отнесения переходов кривой теплопоглощения отдельным блокам мембранных белков (Davio, Low, 1982; Manen, Low, 1988; Brandts et al, 1978, Shnyrow ct al. 1990), можно сделать заключение о том, что термостабилыюсть отдельных блоков изменяется в различной степени и в различных направлениях при варьировании рН среды. Варьирование рН среды (как и варьирование ионной силы), в первую очередь, согласно проведенным нами микрокалорическим измерениям, изменяет термостабильность мембранного блока, образуемого белками, входящими в узлы решетки цитокаркаса и места крепления цитокаркаса к мембране.

Регистрируемые нами параметры флуоресценции свидетельствуют, что основной вклад в триптофановуго флуоресценцию мембран эритроцитов при рН 7.45 вносят триптофановые остатки белков, принадлежащие к 1 классу, согласно классификации Бурштейна Э.А. (Бурштейн, 1977), (около 70%), т.е. триптофанилы, локализованные во внутренних, жестких гидрофобных участках мембраны.

Сопоставляя зависимость от рН параметров триптофановой флуоресценции и параметров процесса тепловой денатурации теней эритроцитов, мы выделили несколько структурных перестроек мембранных белков и соответствующих им переходов в мембране. Структурный переход эритроцитарной мембраны наблюдали в диапазоне значений рН 7.0-6.0, соответствующем протонированяго имидазольиых групп белков (Shinitzky, Goldman, 1967). Возможно, протонирование остатков гистидина белков мембраны служит причиной её перестройки в физиологическом диапазоне значений рН.

При значениях рН, меньших 4.5, происходит кислотная денатурация мембранных белков. Это сопровождается экспонированием триптофановых остатков этих белков в растворитель (о чем свидетельствуют падение квантового выхода и длинноволновой сдвиг спектра флуоресценции) и уменьшением калориметрической энтальпии тепловой денатурации белков мембраны.

Варьирование рН изменяет зарядовое равновесие в мембране, которое играет важную роль в поддержании структурного состояния мембранных ■ белков и в белок-белковых и белок-липидных взаимодействиях. Мы предполагаем, что структурная перестройка мембраны, связанная с денатурацией мембранных белков и начинающаяся при значениях рН, меньших 4,5, сопровождается дестабилизацией мембраны и последующим лизисом эритроцитов.

2. Осмотический лизис эритроцитов. Молекулярный механизм осмотического гемолиза (многие типы лизиса эритроцитов могут быть сведены к колоидно-осмотическому механизму) во многом требует своего выяснения. Мы рассмотрели закономерности осмотического гемолиза и определили взаимодействия, обеспечивающие стабильность эритроцитов в гипотонической среде.

Оцененная нами из линеаризованных: кинетических кривых гемолиза кажущаяся константа скорости осмотического лизиса эритроцитов уменьшается с ростом температуры "рис. 1", что соответствует установленному ранее факту уменьшения осмотической хрупкости эритроцитов с ростом температуры (Беетап ее а]., 1969; Черницкий, Воробей, 1981). Как известно, с ростом температуры происходит усиление гидрофобных взаимодействий (Эдсолл, Гатфрснд, 1986). Возрастание устойчивости эрнтроцитарных мембран к осмотическому лизису с повышением температуры в диапазоне 5-45°С может бьггь связано ростом величины гидрофобных взаимодействий, стабилизирующих липидный бислой мембраны.

> -I

Мы предполагаем, что устойчивость мембран к изотропному растяжению в гипотонической среде определяется в первую очередь лшшдным бис-лоем и в меньшей степени белковым циюкаркасом мембраны. Осмотическая стабильность эритроцитов не изменяется в достаточно широком диапазоне значений рН: 5.5 - 9.0, в то же время, как показано нами, в этом диапазоне значений рН белки мембран эритроцитов претерпевают существенные структурные перестройки.

Нами показано, что ограничение подвижности белков в плоскости мембраны в результате образования определенного

числа внутр-1- и межбелковых сшивок с помощью глутарового и малонового альдегидов существенно стабилизирует эритроциты в гипоосмотической

Рис. 1 Зависимость кажущихся констант скорости осмотического (1 и 2) и механического (3) лизиса эритроцитов человека от температуры среды гемолиза (1) и температуры предварительного прогрева эритроцитов (2 и 3).

го

ю "с

среде. Подобные сшивки препятствуют перераспределению белков в плоскости мембраны.

Представляется важным обнаруженный нами факт уменьшения осмотической стабильности эритроцитов крови пациентов после таких процедур, как экстракорпоральный гшазмаферез и гемосорбция, в ходе которых, вероятно, травмируются эритроцитарные мембраны. Изменение стабильности эритроцитарных мембран при терапевтических воздействиях следует учитывать в клинической практике.

3. Механический лизис эритроцитов. Механическая травма является основной причиной, ограничивающей время циркулирования эритроцитов в русле крови (Butler et al., 1992). В то же время, несмотря на очевидную актуальность проблемы, биофизические механизмы, приводящие к механическому разрушению эритроцитов, неизвестны (Friederichs, Mieselman, 1994). Регистрируемые нами кинетические кривые гемолиза вследствие механической травмы, которую мы моделировали быстрым перемешиванием суспензш! эр1ироцитов, представлены на рис. 2. К разрушению эритроцитов приводят напряжения, возникающие в мембране в ответ па механические деформации (в первую очередь, вероятно, деформации сдвига и изгиба) "см. рис. 2".

Рис. 2 Кинетические кривые механического лизиса эритроцитов в отсутствие (1, 2 и 2') и в присутствии 0.1 М KCl 0 (3 и 3') и 0.3 М КС! (4 и 4'). 1 - ' ^ зависимость оптической g плотности суспензии от вре-§ мени воздействия: 2 - 4 - сте-

(U

>u пень гемолиза; 2' - 4' - то же в логарифмическом виде; No и N - число неразрушенных клеток в начальный и данный момент времени, соответственно. 0.2 М К2НР04, pH 7.4,38 °С.

Изменение оптической плотности суспензии в процессе гемолиза указывает,- что механическому разрушению эритроцитов предшествует изменение формы и размеров клеток "см. рис. 2, кривая 1". Сжатие эритроцитов в гиперосмотической среде "см. рис. 2", присутствие длинноцепочечных жирных кислот, модификация мембран глутаровым альдегидом в наших экспе-

lnN/No

Ог

D/Do

Время, ч

риментах повышали механическую хрупкость эритроцитов, уменьшая, вероятно, деформируемость эритроцитарной мембраны. Неспецифическое взаимодействие с альбумином плазмы существенно стабилизирует эритроциты. Высокие концентрации сахарозы не ингибируют механического лизиса эритроцитов. Механическая прочность эритроцитов значительно уменьшается после предварительной денатурации спектрина "см. рис. 1".

Значение энергии активации механического лизиса эритроцитов, оценённое нами из температурной зависимости константы скорости гемолиза, составляет 55 + 7 кДж.'моль. Известное значение опергии связи двух епбк-триновых гетеродимеров, образующих тетрамер (Козлов, Маркин, 1986), в расчете на моль контактов димеров в теграмере, соответствует 15 кДж/моль. Учитывая определяющую роль спектрииового цитокаркаса в поддержании механической устойчивости эритроцитов (Конев, 1987) и используя полученное нами значение энергии активации, можно рассчитать, что разрыв 3 -4 связей между спектриновьши гетеродимерами приводит к механическому разрушению эритроцита. Элементарная ячейка спектринового цитокаркаса включает 5-6 таких связей (Конев, 1987), следовательно, механический лизис эритроцитов в наших условиях связан с разрушением мембраны на площади, не превышающий размеров одной элементарной ячейки белкового каркаса мембраны. Механический и осмотический лизис эритроцитов подчиняются различным закономерностям, прочность мембраны при изотропном растяжении осмотическими силами и её механическая стабильность определяются различными мембранными элементами. Механический гемолиз протекает не по коллоидно-осмотическому механизму и имеет в отличие от осмотического не липидную, а белковую природу.

4. Повреждения эритроцигарных мембран в присутствии этанола. Введение сорастворителей, в частности этанола, позволяет моделировать изменения параметров внешней среды, что мы использовали для изучения роли различных взаимодействий в поддержании нативной структуры эритроцитарной мембраны.

Методом микрокалориметрии нами обнаружен низкотемпературный сдвиг положения максимумов денатурационных переходов различных блоков мембранных белков с одновременным уменьшением площади под кривой теплопоглощения по мере роста концентрации этанола "рис. 3". Изменения вида кривых теплопоглощения отражают, вероятно, денатурационные изменения мембранных белков в присутствии этанола, модификацию белок-белковых и белок-липидных взаимодействий. Эти изменения обратимы при концентрациях этанола до 2.15 М, т. к. после удаления этанола микрокалориметрические кривые приобретают вид, соответствующий плавлению на-

тивных мембран. Изменения тепловых свойств различных блоков мембранных белков в присутствии этанола зависят от локализации белков в мембране. Помимо известного эффекта на липидный бислой (Черницкий и соавг., 1981), этанол оказывал выраженное дестабилизирующее действие на мембранный домен белка полосы 3, погруженный в липидный бислой (переход С) "см. рис. 3".

2 С, М

Рис. 3 Зависимости положения температурных максимумов (Тмах) денату-рационных переходов А (1), В (2), С (3) кривой тепленоглощеш1я мембран эритроцитов и температуры денатурации оксигемо^АЪбина (4) от концентрации этанола. 20 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7.4.

При достаточно высоких концентрациях этанола (2.2 - 5.5 М) глубокие структурные изменения мембранных белков, сопровождающиеся значительным уменьшением их термостабильности, приводят к лизису клеток, включающему несколько этапов. Как следует из регистрируемых нами кинетических кривых гемолиза, выход гемоглобина из повреждённых зтонолом клеток наступает после длительной фазы значительных изменений формы и размеров эритроцитов. Энергия активации лизиса эритроцитов этанолом, определенная нами из температурной зависимости кажущейся константы скорости гемолиза, при концентрации этанола 5.1 М равна 150 ± 20 кДж/моль. Соответствие значений энергии активации процесса этанол-индуцируемого лизиса и энергии активации процессов денатурации белков (Conejero-Lara et al., 1991) и выраженное уменьшение термостабилыюсти белка полосы 3, предшествующие гемолизу, свидетельствуют о том, что преимущественное нарушение нативной структуры мембранного белка полосы 3 играет важную роль в лизисе эритроцитов этанолом. Используя известную зависимость скорости лизиса эритроцитов от концентрации гемолитического агента (Черницкий и соавт., 1996), мы определили число молекул литическо-го агента, кооперативное взаимодействие которых с мембраной приводит к формированию одной поры. При концентрациях этанола 2.2 - 5.5 М это число равно 15. Количественные показатели стабильности белков эритроцитар-ных мембран (как и глобулярных белков) и эритроцитов в присутствии эта-

нола мы смогли представить в виде линейных функций объемной диэлектрической проницаемости среды. Этанол, изменяя объемные диэлектрические свойства среды, нарушает систему электростатических взаимодействий в мембране что, наряду с пертурбированием гидрофобных контактов и водородных связей, вносит вклад в дестабилизацию белков и мембран.

Мы предполагаем существование в эритроцитарной мембране ряда ключевых структурных элементов и взаимодействий, перестройки которых индуцируют конформационные переходы мембраны и которые преимущественно обеспечивают целостность эритроцита при различных воздействиях.

изменения структуры и стабильности мембран

ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ СВОБОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И АЛИФАТИЧЕСКИХ АЛЬДЕГИДОВ

1. Влияние свободных жирных кислот и их производных на состояние липидного и белкового компонентов мембран эритроцитов. Одним из способов регуляции функций мембран эритроцитов является неспецифическое воздействие на них жирных кислот (На§уе, 1988). Мы изучили эффекты свободных жирных кислот, уровень которых в клетке может возрастать при активации эндогенных фосфолипаз, и алифатических альдегидов, которые могут накапливаться как продукты перекисного окисления липидов, на состояние липидного и белкового компонентов эритроцитарных мембран.

Длинноцепочечные насыщенные жирные кислоты и их производные уменьшали микровязкость связанных с белками и свободных бислойных липидов мембраны, но в различной степени "рис. 4". Эффект жирных кислот и их производных возрастал с удлинением алифатической цепи. В наибольшей степени микровязкость изменяли метиловые зфиры жирных кислот, что связано меньшей полярностью эфиров.

Одновременно в присутствии свободных жирных кислот и их производных мы наблюдали ингибирование ацетилхолинэстеразы как цельных эритроцитов, так и изолированных мембран. Эффективность и тип ингиби-рования зависели от длины алифатической цепи и природы концевой группировки в молекуле ингибитора. Рассчитанные нами по методу Диксона константы ингибирования ацетилхолинэстеразы изолированных теней эритроцитов равны: в случае, например, пальмитиновой кислоты - 0.63 мМ (неконкурентный тип ингибирования), лауриновой кислоты - 0.23 мМ (смешанный тип ингибирования), лауринового альдегида - 0.55 мМ, капри-ловой кислоты - 1.20 мМ (смешанный тип ингибирования); для сравнения, в случае этанола - 540 мМ (смешанный тип ингибирования). Метиловые эфи-

ры соответствующих жирных кислот практически не ингибировали фермент. Мы предполагаем, что ингибиторы вызывают нарушения комплементарно-сти между гидрофобной поверхностью мембранных белков и их нативным липидным окружением, изменяют микровязкость и поверхностный заряд мембраны. Эти параметры, как известно, во многом определяют активность ацетилхолишстеразы мембран эритроцитов (Ott, 1985).

4 Л,

/ г 3 t 4 [Эффектор]-70, М

Рис. 4 Изменения параметра (отношение шггенсшшостей флуоресценции мономерной и зкси-мерной форм пирена), характеризующего микровязкость связанных с белками (1-5) и свободных липи-дов (Г-5') эритроцитарных мембран в присутствии каприловой кислоты (1, 1'), лауриновой кислоты (2, 2'), лауринового альдегида (3, 3'), пальмитиновой кислоты (4, 4'), метилового эфира пальмитиновой кислоты (5,5'). 0.02 М натрий-фосфатный буфер, рН7.4,18 °С.

Обнаруженное нами эффективное тушение флуоресценции АНС, связанного с мембраной, в присутствии свободных жирных кислот может свидетельствовать об увеличении общего отрицательного заряда мембраны.

Рис. 5 Процесс тепловой денатурации суспензии мембран эритроцитов в отсутствие эффекторов (1), после предварительного прогрева до 53 °С (2), в присутствии 0.2 мМ пальмитиновой кислоты (3), после модификации 2.3 мМ малонового альдегида (4). Концентрация белка в суспензии 2.5 мг/мл. 0.02 М натрий-фосфатный буфер, рН 7.4.

80 °С

Свободные жирные кислоты, их метиловые эфиры и алифатические альдегиды существенно уменьшали время вращательной корреляции спинового зонда (4-пальмитоиламидо-2,2,6,6-тетрамстилшшеридин-1 -оксила), встроенного в липидный бислон мембраны. Параметр упорядоченности 8, характеризующий регулярность молекулярной упаковки липидного бислоя, возрастал в присутствии алифатических альдегидов и жирных кислот. Метиловые эфиры жирных кислот, напротив, оказывали разуперядочивающее действие на липидный бислой мембраны, что соответствует их выраженному эффекту на параметры флуоресценции пирена "см. рис. 4".

Можно предположить, что возрастание упорядоченности липидного бислоя мембраны при одновременном увеличении подвижности ацильных цепей фосфолипидов свидетельствует о нарушении взаимодействия между липндным и белковым компонентами мембраны в присутствии жирных кислот и алифатических альдегидов. В то же время непосредственные калориметрические измерения процесса тепловой денатурации мембраны в присутствии длинноцепочечных жирных кислот и их производных показали, что даже высокие концентрации эффекторов, являющиеся литическими, лишь незначительно уменьшали термостабильность мембранного домена белка полосы 3 "рис. 5". Термостабильность периферических белков при этом не изменялась.

Таким образом, свободные насыщенные жирные кислоты и их производные пертурбируют структуру липидного бислоя и нарушают белок-лилидные взаимодействия в мембране, изменяют заряд поверхности. Следствием этого является икгнбирование активности мембранной ацетилхолин-эстеразы, выраженное уменьшение микровязкости бислойных и аннулярных липидов, эффективное тушение флуоресценции АНС, связанного с мембраной.

2. Лизис эритроцитов, индуцируемый свободными жирными кислотами и альдегидами. В настоящее время отсутствуют единые представления о механизмах литического действия жириых кислот в изоосмотической среде и их стабилизирующего действия в гипоосмотической среде (Т^егаггапс!, Ьотаа, 1991). Нами были изучены закономерности лизиса эритроцитов, индуцируемого длинно цепочными жирными кислотами и их производными. Нами обнаружено, что процессу разрушения клеток предшествует этап встраивания литического агента в мембрану, длительность которого изменяется в пределах 5-30 с (в зависимости от соотношения числа клеток и молекул эффектора). Согласно нашим расчетам эффективность гемолиза достигает регистрируемых значений при числе молекул литического агента на один эритроцит, равном ~ 107 (в случае, например, пальмитиновой кислоты).

Константа скорости реакции гемолиза возрастала в ряду: метиловый эфир жирной кислоты -> жирная кислота —> алифатический альдегид, и по мере роста числа атомов углерода в алкильной цепи молекул эффектора.

Гемолиз эритроцитов в присутствии алифатических альдегидов и насыщенных длшпгоцеиочечных жирных кислот сопровождался активацией перекисного окисления липидов. В то же время уровень внутриклеточного восстановленного глутатиона в процессе гемолиза не изменялся. Мы предполагаем, что перекисное окисления липидов не является причиной гемолиза.

Используя математическую модель лизиса эритроцитов (Чершщкий и соавт., 1996), мы рассчитали, что в случае, например, пальмитиновой кислоты с одним центром эритроцитарной мембраны кооперативно взаимодействуют 5 молекул эффектора.

Из зависимости кажущейся константы скорости гемолиза от температуры оценена энергия активации лизиса эритроцитов пальмитиновой кислотой. Она равна 210 ± 30 кДж/моль при температуре выше 27 °С. График Ар-рениуса для константы скорости гемолиза имеет излом при 27 °С. Тепловая денатурация в первую очередь спектрина (прогрез мембраны при 49 °С), приводящая к нарушению целостности цитокаркаса, резко дестабилизирует эритроцитариую мембрану к литичесхому действию жирных кислот.

Предварительный прогрев суспензии теней эритроцитов до температуры 49-53 °С сопровождается полным исчезновением перехода А на калори-метричекой кривой и уменьшением площади под кривой "см. рнс. 5", что свидетельствует о тепловой денатурации белкового блока, включающего спектрин.

Накопление в клетке свободных длшшоцепочечных жирных кислот, алифатических альдегидов, выступающих факторами старения, будет приводить, таким образом, к нарушению нативных белок -липидных взаимодействий в мембране и последующему лизису клеток.

3. Мембранный потенциал и осмотическая стабильность эритроцитов в присутсвии жирных кислот и алифатических альдегидов. Для выяснения механизма осмотической стабилизации эритроцитов насыщенными жирными кислотами и их производными мы исследовали изменения электрохимических свойств эритроцитарной мембраны, индуцируемые этими эффекторами, сопоставляя их с изменением осмотической прочности эритроцитов. В таблице 1 представлены полученные нами значения кажущихся констант скорости осмотического гемолиза и значения мембранного потенциала эритроцитов в отсутствие и в присутствии некоторых перечисленных эффекторов.

Таблица 1

Влияние свободных жирных кислот и их производных (400 мкМ) на осмотическую стабильность и мембранный потенциал эритроцитов

Эффектор Константа скорости осмотического гемолиза, мин Ингибирование осмотического гемолиза, % Мембранный потенциал, мВ

0,07 М КС! 0,07 М МаС! 0,07 М КС1 0,07 М НаС1

контроль 2,1±0,2 1,6±0,1 - - -11ДЫ ,7

пальмитиновая кислота 1,6±0,1 1,1±0,1 24±5 31±6 -23,3±3,2

лауриновый альдегид 0,8±0,1 0,5±0,1 62±5 69±6 —15,3±2,5

метиловый эфир пальмитиновой кислоты 1,8±0,2 1,0±0,1 17±2 37±6 -14,2±1,0

Кажущаяся константа скорости осмотического гемолиза выше, а степень ингибирования гемолиза свободными жирными кислотами и их производными ниже в гипоосмотической среде ионов калия по сравнению со средой иопов натрия "табл. 1". Очевидно, что протектирующее истечение ионов калия из эритроцита, которое будет выше в среде ионов натрия, вносит вклад в осмотическую стабилизацию эритроцитов. В то же время ингибирование осмотического гемолиза не коррелирует с изменением мембранного потенциала в присутствии различных эффекторов "см. табл. Г'. Жирные кислоты, но не соответствующие метиловые эфиры или алифатические альдегиды, увеличивали мембранный потенциал. Возрастание мембранного потенциала эртроцитов в присутствии пальмитиновой кислоты, содержащей заряженную карбоксильную группу, может быть объяснено, как мы предполагаем, нарушением целостности мембраны, что приводит к возрастанию её ионной проницаемости и истечению ионов калия, и ионофорными свойствами пальмитиновой кислоты. Повышение осмотической устойчивости эритроцитов в присутствии жирных кислот и их производных не может быть сведено к протектирующему предлитическому истечению ионов К+, как предполагалось ранее (котаа й а1., 1986), а определяется изменением структурного состояния и площади поверхности мембраны. Вероятно, одни и те же измене-

ния мембранной организации (пертурбирование липидного бислоя, нарушения белок-липидных контактов), индуцируемые жирными кислотами и их производными, стабилизируют мембрану в гипотонической среде, но приводят к её разрушению в среде изотонической. В то же время, как следует из наших экспериментов, различные физико-химические параметры мембраны (стабильность, текучесть, ионная проницаемость, активность мембранных белков), изменяемые в присутствии жирных кислот и их производных, могут быть непосредственно не взаимосвязаны.

4. Ковалентная модификация мембран эритроцитов альдегидами. Активация процессов перекисного окисления липидов приводит к накоплению МДА, а также ряда других алифатических альдегидов (Ез1егЬаиег е1 а1., 1991), алкогольная интоксикация сопровождается возрастанием уровня ацетальде-гида - решающего молекулярного фактора интоксикации (Островский, 1982).

Рис. 6 График Скэтчарда для связывания 3H-HTEi (а) 3Н-ПГЕ2 (б) и 3Н~ ПЛ^а, (в) с рецепторами нативных (1) и модифицированных ацетальдегидом (10"4 М) плазматических мембран гепатоцитов (3,3 мг белка/мл).

Мы изучили следствия ковалентной модификации альдегидами эри-троцитарных мембран как один из возможных механизмов окислительных повреждений клеток. Использовали концентрацию МДА, при которой количество альдегида, включенного в мембрану, соответствовало количеству МДА в мембранах эритроцитов пациентов с гемолитическими анемиями (Jain et al., 1990).

После ковалентной модификации мембран эритроцитов возрастающими концентрациями МДА тепловая денатурация кооперативных блоков мембранных белков происходила в более узком температурном интервале при одновременном уменьшении площади под калориметрической кривой "см. рис. 5". На микрокалориметрической кривой исчезает переход А, соответствующий термоденатурации спектрина.

Вероятно, образование внутри- и межбелковых сшивок МДА нарушает компактную структуру главным образом периферического белка спектрина (на это указывает уменьшение общей энтальпии процесса денатурации). Поведение белковых ансамблей становится более кооперативным. Нами также обнаружено уменьшение числа центров связывания флуоресцентного зонда АНС на эритроцитарной мембране без изменения константы ассоциации, что должно отражать изменение свойств липидного бислоя мембраны. Модификация эритроцитов МДА (1.25 мМ) приводила к ингибированшо мембранной ацетилхолинэстеразы по бесконкурентному механизму. Это связано, вероятно, с ограничением подвижности фермента, необходимой для катализа. Одновременно мы наблюдали рост осмотической прочности эритроцитов, а также возрастание микровязкости мембраны (рост анизотропии флуоресценции зонда дифенил-гексатриена). Средне- и длинноцепочечные алифатические альдегиды, напротив, увеличивали текучесть мембраны "см. рис. 4". Таким образом, модификация мембран эритроцитов альдегидными продуктами перекисного окисления липидов нарушает структуру спектрина и увеличивает микровязкость липидного бислоя мембраны.

Исследуя повреждающее действие альдегидов на мембранные структуры, мы рассмотрели эффект ацетальдегида на параметры специфического связывания простагландинов рецепторами плазматических мембран гепато-цитов. Нарушения специфического взаимодействия рецепторов с проста-глаадинами и, соответственно, транедукции клеточного сигнала служат причиной патофизиологических изменений клетки. Алкилирование плазматических мембран клеток печени ацетальдегидом существенно нарушает связывание карбонилсодержащих простаглавдинов и В2 высокоспецифическими рецепторами плазматических мембран гепатоцитов, уменьшая плотность центров связывания без изменения значения константы ассоциации, и не изменяет параметров взаимодействия простагландина Р2а, не содержащего карбонильной группы, с мембраной "рис. 6". Неферментативное неспецифическое алкилирование мембран ацетальдегидом нарушает их функциональные свойства что вносит вклад в повреждающий эффект алкогольной интоксикации, и протекает, вероятно, по общей схеме для различных типов мембран и белков.

Помимо исследованнных нами реакций неферментативного алкшшро-вания белков и мембран, ацетальдегид включается в реакцшо ацилоиновой конденсации с образованием ацетоина, катализируемую пируват-дегидрогеназным комплексом. Для изучения метаболизма ацетоина нами был разработан фотохимический способ синтеза [2,3-ЫС] ацетоина. Полученные нами данные позволили предположить, что продукты обмена ацетоина, а именно 2,3-бутандиол, включаются в атипичные диолыше липиды клеточных мембран.

ЭРИТР01 {ИТАРНАЯ МЕМБРАНЫ ПРИ ПАТОЛОГИИ (САХАРНЫЙ ДИАБЕТ). ОКИСШ4ТЕЛЬНЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ

Циркулирующие в русле крови эритроциты весьма чувствительны к окислительным воздействиям и представляют удобную модель для изучения биохимических и физиологических следствий окислительных повреждений (Clark, 198Е). Предполагают, что кислородные свободные радикалы принимают участие в клеточных повреждениях при ряде патологий, в частности при диабете (Jain et al., 1989).

ГГБГЩ,мМ

Рис. 7 Влияние г - бутил гидроперекиси па уровень ТБКРС и мембранный потенциал эритроцитов здоровых доноров и диабетических пациентов.

■ е, контроль б, диабет

тбкрс, контроль тбкрс, диабет

Мы изучили процессы, протекающие при окислительном стрессе в эритроцитах здоровых допоров и пациентов, больных I формой диабета, и оценили возможную роль окислительных повреждений эритроцитов при этой патологии. Чувствительность эритроцитов к окислительному стрессу

оценивали по накоплению в клетке соединений, реагирующих с тиобарбиту-ровой кислотой (ТБКРС), что отражает уровень стабильных альдегидных продуктов перекисного окисления липидов; по окислению внутриэритроци-тарных гемоглобина и восстановленного глутатиопа и по изменению мембранного потенциала эритроцитов после экспонирования клеток мембрано-проницаемой t - бутил гидроперекиси, которая является водорастворимым аналогом гидроперекисей липидов.

Эндогенный уровень ТБКРС, согласно нашим измерениям, был выше в эритроцитах больных диабетом (3.59 ± 1.13 нмоль/мл упакованных клеток) по сравнению с контрольными эритроцитами (2.63 ± 0.92 нмоль/мл упакованных клеток, РЮ.024). Одновременно, эритроциты больных диабетом значительно гиперполяризованы по сравнению с контрольными клетками "рис. 7". Мембранный потенциал контрольных эритроцитов составил -11.0 ± 1.7 мВ; эритроцитов диабетических пациентов -14.8 ± 1.9 мВ (Р<0.01). Воздействие на эритроциты гидроперекиси сопровождается образованием ТБКРС, окислением внутриэритроцитарного гаутатиона до дисульфидцой формы и оксиНЬ до метНЬ и значительной гиперполяризацией мембран "см. рис. 7".

Кинетические закономерности окислительного процесса, индуцируемого ТБГП в эритроцитах, свидетельствуют, что он развивается по схеме: окисление восстановлешюго глутатиона —> окисление оксигемоглобина -> перекисное окисление липидов. Скорость псроксидации липидов (образования ТБКРС) была достоверно выше в эритроцитах больных диабетом "см. рис. 7". Азид натрия эффективно ингибировал образование метНЬ и перекисиое окисление липидов мембран. Мы предполагаем, что азид натрия, взаимодействуя с Hb, ингибирует реакцию ТБГП с гемоглобином. Выраженное окислительное повреждение эритроцитров в наших экспериментах резко повышало их осмотическую прочность, что, частично, может быть объяснено образованием многочисленных внутри- и межбелковых сшивок образующимся МДА и возрастанием проницаемости мембран для ионов калия.

Возрастание мембранного потенциала после окислительного повреждения эритроцитов отражает значительный рост избирательной ионной проницаемости мембран, что в свою очередь, приводит к потере основного клеточного осмолита - ионов К+. Сопоставляя зависимости накопления ТБКРС и изменения потенциала от концентрации окислителя "см. рис. 7", можно предположить, что возрастание иошюй проницаемости не является прямым следствием пероксидации липидов. Обнаруженные нами изменения электрохимических свойств эритроцитов при развитии диабета связаны, вероятно, с окислительными процессами, нарушающими ионную проницаемость мембран и изменяющими заряд мембранной поверхности.

Вероятно, повышенная чувствительность к окислительному стрессу, накопление продуктов окисления, нарушения электрохимических свойств мембран эритроцитов, наряду с другими факторами (гликозшшроваиие белков и мембран), могут быть ответственны за развитие ряда осложнешш (в первую очередь, сосудистых), сопутствующих диабету.

РЕАКЦИИ АУТООКИСЛЕНИЯ И ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА

Повреждения эритроцита во многом определяются процессами, протекающими с участием внутриэритроцитарпого гемоглобина, в первую очередь, реакцией аутоокисления оксиНЬ. Нами изучены механизмы реакции аутоокисления гемоглобина и закономерности его равновесной оксигенации, поскольку точная последовательность молекулярных событий, приводящих к образованию метгемоглобина, энергетика этого процесса во многом остаются невыясненными.

Органические фосфаты (AMP, АДР, АТР, пиридоксаль-5-фосфат), уменьшая сродство НЬ к кислороду, не оказывали в наших экспериментах влияния на энтальпию оксигенации (оценённое нами из графика Вант-Гоффа для величины Р50 значение энтальпии процесса оксигенации - 26,5 ± 4 кДж/моль). Это указывает, что эффекторы, сдвигая конформациошюе R <-> Т равновесие в сторону Т-конформации молекул НЬ, не влияют на энергетиче-кий барьер для связывания кислорода. Одновременно эти эффекторы повышали вероятность спонтанной реакции аутоокисления и скорость окисления оксиНЬ внешними окислителями. Вероятно, процесс аутоокисления протекает с участием Т-конформации молекулы НЬ. Нами показано, что эффект нуклеозидфосфатов возрастал по мере роста числа анионных фосфатных групп (например, в ряду АМР<АДР<АТР) и существсшю не зависел от структуры нуклеозидного фрагмента.

Одновременно, методом адсорбционной спектроскопии с временным разрешением мы показали, что органические фосфаты уменьшают значение константы скорости ассоциации молекулярного кислорода с тршшгандиро-ванной молекулой гемоглобина НЬ(Ог)з, существенно увеличивая квантовый выход реакции фотодиссоциации кислорода, что отражает изменения внутримолекулярной динамики молекулы НЬ.

Коэффициент Бора в присутствии пиридоксаль-5'-фосфата незначительно уменьшается с 0.70 до 0.65, усредненное значение рК групп белка, участвующих в эффекте Бора, сдвигается с 7.3 до 7.45 "рис. 8". Столь не-

большое влияние органических фосфатов на величину эффекта Бора отражает незначительный вклад аминокислотных остатков молекулы НЬ, участвующих во взаимодействии с фосфатами (а - аминогруппа Val-1 и е -аминогруппа Lys - 82 Р цепей (Benesch et al., 1982)) в щелочной эффект Бора. Щелочному эффекту Бора соответствует возрастание константы скорости реакции ассоциации кислорода с трилигапдированным НЬ. Выраженная взаимосвязь между взаимодействием протонов и кислорода с молекулой НЬ проявляется в резком возрастании кажущихся констант скорости реакций ау-тоокисления "см. рис. 8" и окисления с уменьшением значения рН среды. Очевидно, что различные ионные группировки молекулы НЬ вносят вклад в эффект Бора и определяют процесс аутоокисления "см. рис. 8". Вероятнее всего, протонирование дистального гистидина молекулы НЬ приводит к резкому повышению эффективности процесса аутоокисления. Известно, что ди-стальньш гистидии в белках-псрсносчиках кислорода играет стабилизирующую роль, образуя водородную связь с лигандированной ионом Fe2+ молекулой кислорода (Perutz et al., 1987).

lgPso l.l\

Рис. 8 Зависимость от рН параметров взаимодействия НЬ человека (2.5* 10 "5 М) с кислородом в отсутствие (1, Г, 3) и в присутствии 0.7 мМ пиридоксаль-5'-фосфата (2, 2'); 1, 2 - величины Р50 ; Г, 2' -коэффициента Хилла (0.05 M Na-фосфатный буфер, 18° С); 3 - кажущейся константы скорости реакции аутоокисления (43° С, 0.2 M К-фосфатный буфер).

Из температурной зависимости кажущейся константы скорости реакции аутоокисления НЬ нами получено значение энергии активации этого процесса - 120 ± 15 кДж/моль. Совпадение столь высокого значения энергии активации процесса аутоокисления НЬ с известной величиной энергии активации процесса сольватации порфиринового цикла гемовых белков водой (Smith et а]., 1991), позволяет предположить участие молекул воды в процессе аутоокисления.

Реакция аутоокисления НЬ02 до метНЬ, являющаяся одновременно реакцией восстановления кислорода до супероксиданиона, представляет иуклеофильное вытеснение супероксиданиона встраивающейся молекулой

воды, подобно тому, как ранее постулировалось для миоглобииа (ТзиЬапкДо е1 а1., 1990). Протонирование нмидазольной группы дисталыгого гистидина резко увеличивает вероятность входа в гемовуго полость молекул воды. Уменьшение рН среды, значительно повышая кажущуюся константу скорости реакции аутоокисления "см. рис. 8", не влияет на величину энергии активации этого процесса. Скорость аутоокисления НЬ в наших экспериментах возрастала после модификации белка МДА и ГДА, в присутствии соединений, содержащих сульфгидрилыше группы (восстановленный глутатион, нистеин). Мы предполагаем участие соединений, содержащих 8Н-группы, в реакции аутоокисления в качестве экзогенных доноров электрона, восстанавливающих молекулу связанного кислорода с одновременной генерацией тиилышх радикалов. Химическая модификация сульфгидрильных групп Цке-93 р-цспсй также ускоряла процесс аутоокисления океиНЬ, повышала его сродство к кислороду, и ингибировала его окисление экзогенными акцепторами электронов. Вероятно, что эти доступные растворителю БН-группы НЬ включены во внутримолекулярную электро1шую цепочку, регулирующую электронную плотность на ионе железа гема.

В наших экспериментах спирты существенно уменьшали сродство НЬ к кислороду "рис. 9", нарушали кооперативиость связывания кислорода и увеличивали скорость реакции аутоокисления. Эффект спиртов возрастал по мере роста длины алифатической цепи.

Полученные нами в присутствии спиртов значения величины Р5о, характеризующей сродство НЬ к кислороду, могуг быть удовлетворительно представлены линейной функцией величины обратной диэлектрической проницаемости среды "см. рис. 9". Это можно рассматривать как подтверждение того, что основной вклад в регуляцию параметров взаимодействия НЬ с кислородом, определяемых конформационным Я Т равновесием, вносит изменение объемных диэлектрических свойств среды. Спирты как сораство-рители уменьшают диэлектрическую проницаемость среды, что стабилизирует Т-конформацию молекулы белка, подобно действию аллостерических регуляторов - органических фосфатов. Одновременно введение алифатических спиртов в качестве сорастворителей значительным образом дестабилизировало различные формы НЬ, нарушая структуру глобиновой части молекулы белка "см. рис. 10". Мы предполагаем, что дестабилизирующее действие спиртов на молекулу гемопротеина связано с разрывом гидрофобных контактов и водородных связей в нативной структуре белковой глобулы, а не с изменением объемной диэлектрической проницаемости среды.

Таким образом, изменение конформации молекулы гемоглобина и геометрии гемового кармана, протонирование дистального гистидина регу-

лируют электронную плотность иона железа, определяя тем самым параметры взаимодействия НЬ с кислородом. Органические фосфаты увеличивают динамическую подвижность белковой глобулы, что является одним из механизмов регулирования реакций гемоглобина с кислородом.

рТ.СТ. .

гч

Рис. 9 Зависимость величины Р50 гемоглобина (1 - 3) и температуры денатурации метгемоглобина (Г -3') от величины обратной диэлектрической проницаемости растворителя, изменяемой введением метанола (1,1'), этанола (2, 2') и пропанола (3, 3').

не ■/о"

' Уменьшение стабильности комплекса Fe2* - О2 в молекуле оксиНЬ, и, следовательно, возрастание скорости его аутоокисления можно объяснить: изменением геометрии Н-связи между связанной молекулой кислорода и ди-стальным гистидином; увеличением экспонированности гемового цикла во внешнее окружение; действием внешних (восстановленный глутатион) И внутренних (например, остатки шетацина) иуклеофилов. Уровень органических фосфатов (например, АТР), внутриклеточная концентрация протонов, которые определяются метаболическим статусом эритроцита, будут регулировать процессы равновесной оксигенации и необратимого окисления эри-троцитапного НЬ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Предложена и экспериментально обоснована концепция механизмов повреждений эритроцитов, основанная на постулировании существования в плазматической мембране ряда критических структурных элементов. Эти элементы обеспечивают поддержание нативной структуры мембраны, их нарушение приводит к повреждению эритроцитов.

Установлено, что при механическом воздействии разрушение эритроцита, протекающее не по коллоидно-осмотическому механизму, связано с разрывом нескольких контактов между спектриновыми гетеродимерами; повреждающий эффект этанола (2.2 - 5.5 М) на эритроциты связан с преимуще-

ственным нарушением нативной структуры мембранного домена белка полосы 3; нарушение белок - лшшдных и липид - липидных взаимодействий в мембране свободными жирными кислотами и алифатическими альдегидами служит основной причиной повреждения клеток. В формировании одной мембранной поры кооперативно участвуют 5 молекул литического агента (в случае пальмитиновой кислоты). Литическое действие жирных кислот и их производных возрастает в ряду: метиловый эфир жирной кислоты —> жирная кислота -> алифатический альдегид.

2. Показано, что окислительное повреждение эритроцитов, индуцируемое экзогенной органической гидроперекисью, развивается по схеме: окисление восстановленного глутатиона —> окисление оксигемоглобина —> иере-кисное окисление лшгадов; сопровождается гиперполяризацией мембраны и бкфазным изменением осмотической устойчивости. Повышение чувствительности эритроцитов больных сахарным диабетом к окислительному стрессу соответствует выраженному росту мембранного потенциала эритроцитов.

3. Установлено, что свободные ненасыщенные жирные кислоты эффективно уменьшают микровязкость бислойных и аннулярных липидов, выра-жешю гпперполяризуют мембрану эритроцитов, но не влияют на термостабильность периферических мембранных белков.

4. Обнаружено, что ковалентная модификация белковых и липидных компонентов мембран эритроцитов малоцовым диальдегидом в первую очередь нарушает нативную структуру спектрина, увеличивает микровязкость лшшдпого бислоя и повышает осмотическую прочность эритроцитов.

5. Механизм аутоокисления гемоглобина человека включает гидратацию порфиринового кольца и протонирование дистального гистидина. Химическая модификация цистеина 93 ß-цепей гемоглобина облегчает его ау-тоокисление, но препятствует окислению белка феррицианидом. Показано, что органические фосфаты (АТФ, АМФ, пиридоксаль-5-фосфат) изменяют кинетические параметры связывания кислорода гемоглобином, незначительно уменьшают кооперативность этого процесса и эффект Бора, не изменяя энтальпии процесса оксигенации гемоглобина.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ostrovsky Yu.M., Stepuro I.I., Artsukevich A.N., Zavodnik I.B., Konovalova N.V., Lapshina E.A. Interaction of ethanol with blood proteins // Advances in Biomedical Alcohol Research. Eds. K.O. Lindros, R. Yiikahri, K. Kuonmaa. - Oxford, New York: Pergamon Press, 1987. - P. 283-287.

2. Буко В.У.,. Заводник И.Б., Степуро И.И. Взаимодействие простаглан-дина Е2 с сывороточным альбумином человека // Биохимия - 1987. - Т, 52. -N6.-С. 891-892.

3. Заводник И.Б., Буко В.У. Влияние ацетальдегида на связывание про-стагландинов с сывороточным альбумином человека // VI Всесоюзный симпозиум "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988). - Тез. докл. - Петрозаводск, 1988.- С. 122-123.

4. Степуро И.И., Заводник И.Б. Фотодекарбоксилирование пировино-градной кислоты в водных растворах // Журнал физ. химии. - 1988. - Т. 62. -N 11.-С. 3038-3043.

5'. Заводник И.Б., Буко В.У., Островский Ю.М. Метаболизм ацетоина -продукта превращения ацетальдегида в животных тканях // Материалы Всесоюзной конференции "Медико-биологические проблемы алкоголизма" (Воронеж, 1987) - М., -1988. - С. 31-36.

6. Заводник И.Б., Степуро И.И., Островский Ю.М. Некоторые ферментативные и неферментативные пути превращения ацетальдегида // Укр. био-хим. журн. - ,1988. - Т. 60. - N 4. - С. 51-57.

7. Заводник И.Б., Буко В.У., Островский Ю.М. Метаболизм ацетоина в животных тканях // Укр. биохим. журн. - 1988. - Т. 60. - N 4. - С. 58-62.

8. Заводник И.Б., Игнатенко В.А., Кашко М.Ф., Коновалова Н.В., Опарин Д.А., Степуро И.И. Влияние альдегидов на конформацию и функциональные свойства гемоглобина человека // VI коференция по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1988). - Тез. докл. - Харьков, 1988. - С. 133.

9. Buko V.U., Zavodnik I.B. Competition between acetaldehyde and prostaglandins for hepatocyte receptors: possible mechanism of hcpatoxicity and hepatoprotection // V International congress of toxicilogy "Basic Science in Toxicology" (Brighton, 1989). - London, New York, Philadelphia: "Taylor and Francis", 1989.-P. 36.

.10. Zavodnik I.B„ Konovalova N.B. Effect of aldehydes and alcohols on the. structure and functional properties of human hemoglobin // International symposium "Molecular organization of biological structures" (Moscow, 1989) -Abstract book, V. 1.-Moscow, 1989. - P. 155.

11. Ignatenko V.A., Zavodnik I.B., Kuznetsov B.K., Stepuro I.I., Lapshina E.A. The role of free radicals in erythrocyte hemolysis induced by ultrasound// International symposium "Mechanism of acoustical bioeffects" (Pushchino, 1990). - Abstracts. - Pushchino, 1990. - P. 26.

12. Буко В.У., Заводник И.Б., Лапшина Е.Л. Взаимодействие проста-гландинов и жирных кислот с нативными и алкилированными ацстальдсгидом белками // Биохимия. - 1990. - Т. 55. - N 3. - С. 534-540.

13. Заводник И.Б., Пиледкая Т.П., Степуро И.И. Лизис эритроцитов человека, индуцируемый жирными кислотами // Весщ АН БССР, сер. б1ял. на-вук. - 1990. - N 4. - С. 68-72.

14. Степуро И.И., Заводник И.Б., Пилецкая Т.П., Арцукевич А.Н. Лизис эритроцитов человека, штудируемый алифатическими альдегидами // Биол. мембраны. - 1990. - Т. 7. - N7. - С. 742-749.

15. Zavodnik I.B., Stepuro I.I., Piletskaya T P, Aliphatic aldehydes and fatty acids-induced lysis of human erythrocytes // 20th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (Budapest, 1990). - Abstracts. - Budapest, 1990. -P. 289.

16. Buko V.U., Zavodnik I.B. Effect of acetaldehyde on binding of prostaglandins by receptors of liver plasma membranes // Alcohol and Alcoholism. - 1990. - V. 25. - N 5. - P. 483-487.

17. Заводник И.Б., Кашко М.Ф., Опарин Д.А., Степуро И.И. Влияние альдегидов на кинетику связывания кислорода с гемоглобином //Всесоюзное совещание "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Пущино, 1990). - Тезисы докл. - Минск, 1990. - С. 52.

18. Степуро И.И., Заводник И.Б. Метаболический статус эритроцита как регулятор функциональных свойств гемоглобина // Там же, С. 94.

19. Заводник И.Б. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции. Роль внутриглобулярной подвижности // Биофизика. - 1991. - Т. 36. -N 1.-С. 46-48.

20. Заводник И.Б., Пилецкая Т.П., Степуро И.И. Влияние температуры на лизис эритроцитов человека пальмитиновой кислотой // Биофизика. -1991. - Т. 36. - N 6. - С. 1056-1060.

21. Заводник И.Б., Пилецкая Т.П., Степуро И.И. Механический лизис эритроцитов человека. Стабилизация мембран белками плазмы. //Укр. био-хим. журн. - 1991. - Т. 63. - N 6. - С. 72-78.

22. Буко В.У., Заводник И.Б. Влияние ацетальдегида на связывание простагаандинов рецепторами плазматических мембран печени // Проблемы современной наркологии (Ред. Чернобровкина Т.В.). - М., 2-й МОЛГМИ, 1991.-С. 107-112.

23. Заводник И.Б., Лапшина Е.А., Степуро И.И. Структурные изменения в молекуле сывороточного альбумина, индуцируемые длшшоцепочеч-ными жирными кислотами // VII конференция по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991).-Тезисыдокл. - 1991.-С. 105-106

24. Заводиик И.Б., Пилецкая Т.П., Степуро И.И. Аутоокисление и окси-генация гемоглобина человека // Молекулярная биология.- 1991. -Т. 26. -N 2. -С. 321-327.

25. Лапшина Е.А., Заводник И.Б., Игнатенко В.А., Степуро И.И. Тер-мостабилыюеть и функциональные свойства гемоглобина человека в присутствии алифатических спиртов // Молекулярная биология. - 1992. - Т. 26. -N2.-С. 315-320.

26. Zavodnik I.B., Zavodnik L.B. Disturbance in structure of hepatocyte endoplasmatic reticulum membranes in poisoning with carbon tetrachloride // Abstracts of the 27 Meeting of the European Association for the Study of the Liver (Vienna, 1992).- J. Hepatol. - 1992. - V. 16. -Suppl.l. -P. 121.

27. Podtynchenko S.G., Zavodnik I.B., Maskevich S.A. Surface-enhanced resonance Raman study of liemin and hemoglobin absorbed on silver island films // XIII International conference on Raman spectroscopy (Wurzburg, 1992). -Additional poster abstracts. - P. 114-115.

28. Zavodnik I.B. The process of human hemoglobin autooxiaation as source of free radicals in red cells // VI Biennial Meeting "Free Radicals: From Basic Science to Medicine" (Torino, 1992. -Volume of abstracts. - Free Rad. Res. Communs. -1992. - V. 16. - Suppl. 1. - 20.6.

29. Buko V., Maltcev A., Artsukevich A., Zavodnik I., Shareyko S. Modification of the hepatocyte plasma membranes (HPM) by aldehydes in alcoholic liver injury // J. Hepatol. - 1993. -V. 18. - Suppl.l.- P. 101.

30. Лапшина E.A., Заводник И.Б. Микрокалориметрические и флуоресцентные исследования рН - индуцируемых переходов в эритроцитарных мембранах И Биол. мембраны. - 1993. - Т. 10.- N 2. - С. 170-178.

31. Podtynchenko S., Zavodnik I.B., Maskevich S.A. Surface enhanced resonance Raman spectra of erythrocytes adsorbed on silver island films // 5 European Conference on the Spectroscopy (Loutraki, 1993). - Abstracts. - Spectr. Biol. Mol.: Kluvver Academic Publishers. - 1993. - P. 235-236.

32. Zavodnik I., Lapshina L., Bryszewska M., Zaborowski A. The effect of aldehydic products of lipid peroxidation on structure of erythrocyte membranes //

- 2nd Symposium "Free Radicals in Biology and Medicine" (Lodz, 1994). -Abstracts.- P. 99.

33. Заводник И.Б., Лапшина E.A., Степуро И.И. Термостабильность эритроцитарных мембран в присутствии этанола // Биофизика. - 1994. - Т. 39. - N 3. - С. 470-474.

34. Заводник И.Б., Структура и стабильность мембран эритроцитов человека при варьировании условий внешней среды // Первый съезд Белорус-

ского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994). - Тезисы докладов. - С. 54.

35. Лапшина Е.А., Заводник И.Б., Термостабильность белков эритро-цитарных мембран при варьировании ионной силы и состава среды И Биофизика. - 1994. - Т. 39. - N 6. - С. 1015-1020.

36. Заводник И.Б., Пилецкая Т.П., Степуро И.И. Кинетика этанол-индуцируемого лизиса эритроцитов человека // Биофизика. - 1994, -Т. 39. - N 6.-С. 1033-1039.

37. Zavodnik I., Lapshina Е., Bryszewska М. The effect of aldehydic products of lipid peroxidation on structure of erythrocyte membranes // Curr. TopicsBiophys.- 1994.-V. 18.-N2.-P. 168-171.

38. Zavodnik I.B., Lapshina E.A., Bryszewska M. The structure of human erythrocyte membrane in the presence of free fatty acids ¡1 W. Mejbaum -Katzenellenbogen's Seminars. 2. Membrane Skeleton Structure and Function (Wroclaw/Karpacz, 1995) - Programme and Abstracts. - P. f 7,

39. Lapshina E.A., Zavodnik I.B. Thermostability of erythrocyte membrane proteins in varying environmental conditions // Там же, P. 8.

40. Bryszewska M., Zavodnik I. Oxidative processes in diabetes mellitus // Society for Free Radical Research. Summer Meeting (Budapest, 1995). - Program and Abstracts. - P. 61.

41. Lapshina E.A., Zavodnik I.B., Bryszewska M. Effect of free fatty acids on the structure and properties of erythrocyte membrane // Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1995. - V. 55. - P. 391-397.

42. Bryszewska M., Zavodnik I.B., Niekurzak A., Szosland K. Oxidative processes in red blood cells from normal and diabetic individuals // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1995. - V. 37. - P. 345-354.

43. Лапшина E.A., Заводник И.Б. Структурные изменения эритроци-тарных мембран в присутствии свободных жирных кислот и их производных //Биол. мембраны. - 1995. - Т. 12. -N 2. - С. 157-164.

44. Заводник И.Б., Пилецкая Т.П., Степуро И.И. Осмотический и механический лизис эритроцитов человека // Биол. мембраны. -1995. - Т. 12. -N 4. - С. 400-408.

45. Заводник И.Б., Лапшина Е.А., Брышевска М. Эффект свободных жирных кислот на состояние липидного и белкового компонентов мембран // Биол. мембраны. - 1995. - Т. 12. - N 5. - С. 516-523.

46. Buko V., Zavodnik I., Artsukevich A., Jeney A., Lapis К. A spectroscopic study of binding of prostacycline and its derivatives to proteins // Curr. Topics Biophys. - 1995. - V. 19(1). - P. 3 -7.

47. Заводник Й.Б., Лапшина Е.А. Процессы окисления гемоглобина человека//Биохимия. - 1996. - Т. 61, N 1. - С. 42 - 48.

48. Augustyniak К., Zavodnik I., Palecz D., Biyszcwska M,, The effect of oxidazing agents and diabetes mellitus on the human red blood cell membrane potential // Clin. Biochem. - 1996. - V. 29, N 3. - P. 283 - 286.

49. Zavodnik I.B., Lapshina E.A., Palecz D., Bryszewska M. The effects of palmitate on human erythrocyte membrane potential and osmotic stability // Scand. J. Clin. Lab. Invest.- V. 56, N 5. - P. 401 - 407.

50. Buko V.U., Artsukevich A., Zavodnik I.B., Maltsev A., Sushko L, Zimmerman Т., Dianzani M.U. Interactions of malondialdehyde and 4-hydroxynonenal with rat liver plasma membranes and their effect on binding of prostaglandin Ej by specific receptors.- Free Rad. Res. - 1996. - V. 25, N 5. - P. 415-420.

33

РЭЗЮМЭ Заводнж 1лья Барысав1ч

мехашзмы пашкоджанняу эрытрацытау

Кточавыя словы: эрытрацыты чалавека, мембрана, гемаглабш, ге-мо.пз, мкравязкасцъ, мембранны натэнцыял, тлушчавыя юслоты, альдэпды, аыеляльны стрэс, дыябет.

Аб'екты даследванняу; эрытрацыты чалавека, плазматычныя эрытра-цытарныя мембрага.!, гемаглабш.

Мэта працы: высветшць маиекулярныя мехашзмы пашкоджанняу эры-трацыга i яго кампанеятау над уздзеяннем ф1з!ялапчна злачных эффектарау i змяненнях ф1зжа-х1м1чных фактарау асяроддзя.

Апаратура: спектрафатометр "Specord М-40 ("Carl Zeiss, Jena", Германы)", спектрафлуарьшстр "Aminco-Bowman" (ЗША), мшракаларыметр ДАСМ-1М (Pack), нанасекундны спектраметр, ЭГ1Р - спектраметр ERS-220 (Г'ерманЬг).

Атрьшаныя вышкг. ix наивна i выкарысташге: высветлен шэраг ме-хашзмау мембранных i клетачных пашкоджанняу. Створана канцэпцыя кна-вання тэрагу ключавых элементау мембраны, забяспечваючых устоашваспъ эрытрацытау. Мехашчны гемолю звяза1ш з разбурэннем некальшх кантактау пам1Ж спектрынавым! дымерат. Тлушчавыя кклоты i альдэпды парушшоць натыуныя бялок-лшщныя узаемадзеянш, без уплыву на тзрмау стойл i в ас ць мембранных бялкоу. Мадыфкацыя мембран малонавым альдэпдам парушае структуру спектрыну. Аюсляльнае пашкоджанне эрытрацытау звязапа з гшерпалярызацыяй мембраны.

Рэакцыя аутааислення гемаглаб!пу чалавека уюпочае сальватацыю парф5рынавага цыклу вадой i праташраванпе дыстальнага пстыдыну. Ат-рыманыя вынш маюць значэнне для распрацоум спосабау карэкцьп i пра-фшактьга мембранных пашкоджанняу пры паталапчных станах, будуць ка-рысным! для стварэння штучных сктэм транспарту юслароду.

34

РЕЗЮМЕ Заводник Илья Борисович МЕХАНИЗМЫ ПОВРЕЖДЕНИЙ ЭРИТРОЦИТОВ

Ключевые слова: эритроциты человека, мембрана, гемоглобин, гемолиз, микровязкость, мембранный потенциал, свободные жирные кислоты, альдегиды, окислительный стресс, диабет.

Объекты исследования: эритроциты человека, плазматические мембраны эритроцитов и гемоглобин.

Цель настоящей работы: выяснить молекулярные механизмы повреждений эритроцита и его компонентов при воздействии физиологически важных эффекторов и варьировании физико-химических параметров окружения.

Аппаратура: спектрофотометр "Specord М 40" ("Carl Zeiss Jena", Германия), спектрофлуориметр "Aminco-Bowmaii" (CUJA), сканирующий микрокалориметр ДАСМ-1М (Россия), наносекундный абсорбционный спектрометр, ЭПР-спектрометр ERS-220 (Германия).

Полученные результаты, их новизна и применение: установлен ряд механизмов мембранных и клеточных повреждений, предложена концепция существования в мембране эритроцитов ряда ключевых структурных элементов и взаимодействий, обеспечивающих устойчивость эритроцитов. Механический гемолиз связан с разрушением нескольких контактов между ди-мсрами спектрина, Дашшоцепочечные жирные кислоты и алифатические альдегиды нарушают белок-лшшдные взаимодействия, не изменяя стабильность мембранных белков. Модификация мембран малоновым диальдегидом нарушает структуру спектрина. Окислительное повреждение эритроцитов приводит к резкой гиперполяризации мембраны. Реакция аутоокисления гемоглобина включает сольватацию порфиринового цикла водой и протониро-вание дистального гистидина. Полученные результаты могут быть использованы при разработке способов направленной коррекции и профилактики мембранных повреждений при патологических состояниях, будут полезными при создании искусственных систем транспорта кислорода.

35

SUMMARY Zavodnik Ilya Borisovich THE MECHANISMS OF ERYTHROCYTE DESTRUCTION

Key words: human erythrocytes, membranes, haemoglobin, haemolysis, microviscosity, membrane potential, fatty acids, aldehydes, oxidative stress, diabetes.

The object of the investigation: human erythrocytes, erythrocyte membrane, haemoglobin.

The aim of the work: the investigation of the molecular mechanisms of erythrocytes and their components destructions under the action of some effectors and environment parameters variations.

Equipments: spectrophotometer "Specord M-40 ("Carl Zeiss, Jena", Germany)", spectofluoremeter "Aminco-Bowman" (USA), microcalorimeter /IACM-IM (Russia), nanocesond spectrometer, EPR - spectrometer ERS-220 (Germany).

Results and innovation: a number of mechanisms of membrane and cell destructions have been drawn. The definite structural units and interactions in the erythrocyte membrane, stabilizing the cell, have been shown. Mechanical haemolysis destroys the 3-4 contacts between spectrin dimers. Long chain fatty acids and aldehydes disturb the native lipid-protein interactions without influence on membrane protein thermostability. The membrane modification by malonaldehyde destroys the spectrin structure, increase the membrane rigidity. The erythrocyte oxidative damage connect with membrane hyperpolarization. The process of haemoglobin autooxidation includes the solvatation of haeme moiety by water molecules and the protonation of distal histidine. The results can be applied to the development of the methods of correction and prevention of the membrane damages in the pathological states and to creation of the artificial oxygen carriers.