Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структурно-функциональных характеристик мембран эритроцитов при замораживании до умеренно низких температур (-30 / -70 градусов C)

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функциональных характеристик мембран эритроцитов при замораживании до умеренно низких температур (-30 / -70 градусов C)"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ' ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ И КРИОМЕЩИЦИШ

На правах рукописи

КУКУШКИН Андрей Иванович

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ ДО УМЕРЕННО НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР /-30° + -70°С /.

03.00.22 - криобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

>

Харьков - 1992

Работа выполнена в Институте проблем криобиологии и криомедицины АБ УКРАИНЫ

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор А.К. тулевскнй.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Е.А. Панков

доктор биологических наук A.M. Воротилин

Ведущая организация - Институт биохимии им. A.B. Палладина АН Украины, г. Киев.

Защита состоится " /Д, " 1992 года в " часов на

заседании специализированного совета Д 016.60.01 при Институте проблем криобиологии и криомедицины АН Украины (310015, г. Харьков, ул. Переяславская, 23 ).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ИПКиК АН Украины Автореферат разослан " -/¿> " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета Д 016.60.01 доктор медицинских наук

А.Н, Гольцев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На протяжении последних лет развитие криоконсервирования крови в нашей стране шло преимущественно по пути использования температуры жидкого азота (Аграненко В.А., 1980; Аграненко В.А., Федорова Л.И., 1983 ). Однако для практических учреждений службы крови более доступно криоконсервирование крови при умеренно низких температурах (Петров М.М.", 1985; Терехов Н.Т., 1973 ). Данный метод особенно выгоден там, где нет жидкого азота, где он дефицитен или требует для доставки длительной транспортировки. Метод криоконсервирования при умеренно низких температурах характеризуется тем, что ограждение эритроцитов производится с по- 1 мощью высоких концентраций глицерина 40 - 50% масса/объем и который можно реализовать на выпускаемых промышленностью установках, работающих на электроэнергии (рефрижераторов }(Бурдыга М.А., 1967; Буденная 0.П., 1986; И. т, 1977; Vattn'C.A. , 1973 ) .

Исследования показали, что хранение клеток в диапазоне температур -30° + -80°С возможно от нескольких месяцев до 1 - 2 лет, в зависимости от природы клеток и применяемого криопротектора. При более длительном хранении происходит деструкция клеток, что связывают с повреждением их плазматических мембран. В работах некоторых авторов ( Pt-iО.в., 1971; Wteitje^ 1974) подчеркивается, что причиной прогрессирующего гемолиза в размороженно-отмытых эритроцитах является наличие в мембранах скрытых повреждений, которые возникают в процессе замораживания-оттаивания и последующего хранения. Предполагают, что эти повреждения развиваются на молекулярном уровне в результате изменения фазового состояния липидов и бе-лок-липидных.комплексов мембраны (Белоус A.M., Бондаренко Т.П. и соавт., 1978; ГУлевский А.К., 1986) . Согласно современным представлениям наиболее существенным следствием структурных изменений скрытого характера является нарушение одной из основных функций биологической мембраны - ее барьерных свойств (ГУлевский А.К.,1987;

C.i., 1976; /VW т. , 1976) . Несмотря на важное значение нарушения проницаемости дам ионов и биомолекул в условиях низкотемпературного воздействия в настоящее время по этому вопросу имеются единичные сообщения, которые не позволяют полностью охарактеризовать структурно-функциональные изменения плазматических мембран клеток при температурах -30° + -80°С. Поэтому исследование структурно-функциональных свойств эритроцитов и, особенно, барьерных свойств их мембран для ионов и биомолекул в области умеренно низких температур представляет существенный теоретический и практи-

ческий интерес. Необходимо отметить, что в литературе отсутствуют данные о развитии латентных повреждений в процессе хранения от применяемых режимов охлаждения. Мы полагали, что решение этих вопросов позволит выяснить некоторые особенности структурных нарушений мембраны эритроцитов, приводящих к изменению ее проницаемости для ионов и биомолекул в процессе хранения в зависимости от применяемых режимов замораживания. Для выяснения механизмов криоповрежде-ний плазматических мембран происходящих при действии низких температур, целесообразно исследование мембран интактных клеток и реконструированных мембранных систем, в частности реставрированных теней эритроцитов, сохраняющих важнейшие структурно-функциональные параметры мембран: барьерную функцию, активный и пассивный перенос ионов, качественный и количественный состав мембранных белков и липидов, что позволяет использовать их в качестве адекватной модели при изучении действия замораживания на плазматические мембраны клеток (Лишко В.К., 1977; 1улевский А.К., 1986 ). Использование реставрированных теней эритроцитов в качестве модели исследования позволяет дифференцировать нарушения барьерной функции, происходящие в связи с внутриклеточными изменениями от нарушений зтих функций в результате непосредственного действия физико-химических факторов на мембрану. Это и послужило предпосылкой для проведения данного экспериментального исследования.

Цель и задачи работы. Целью работы явилось изучение особенностей структурно-функциональных перестроек мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов при замораживании и хранении в диапазоне температур -30° + -70°С и определение оптимальных условий хранения клеток в этом температурном интервале.

Б связи с этим в конкретные задачи исследования входило:

- выявить характер изменения проницаемости плазматических мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов для гемоглобина, ■^С-сахарозы и ионов К+, подвергнутых замораживанию до температур -30° 4- -70°С в растворах глицерина с последующим хранением в этих температурных условиях в течении 3-х месяцев.

- изучить состояние пассивного и активного транспорта для одновалентного катиона в эритроцитах и реставрированных теши эрит роцитов, подвергнутых замораживанию до температуры -30°С в растворах глиттерина при хранении в течении 1 месяца.

- исследовать структурные перестройки плазматических мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов по данным количествен ного и качественного состава липидов и белков после замораживания

до -30°, -50° и -70°С в растворах глицерина и последующего хранения в этих температурных условиях в течении 3-х месяцев. - разработать метод определения степени деструкции эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов подвергнутых криоконсервирова-нию в зоне умеренно низких температур по данным проницаемости.

Научная новизна. Впервые по данным проницаемости маркерных веществ показано, что хранение эритроцитов в зоне умеренно низких температур -30° + -70°С приводит к формированию в их плазматических мембранах трансмембранных дефектов разной величины по типу "сквозной поры".

Определены условия замораживания для изучения механизмов латентных повреждений при хранении эритроцитов в зоне умеренно низких температур,-

Обнаружен факт изменения количественного и качественного состава фосфолипидов мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов под защитой глицерина в концентрациях 10 - 40$ при хранении в течении 2-х месяцев при температуре -30°С. Показано, что дош сохранения состава фосфолипидов на уровне близком к исходному, необходимо использовать 20 - 40$.растворы глицерина как в случае эритроцитов так и реставрированных теней эритроцитов.

Выяснено, что модификация мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов включает изменения структурного состояния мембранных белков, прежде всего спектрин-актинового комплекса в направлении их агрегации. Установлено, что наименьшее количество агрегированных мембранных белков образуется при скорости замораживания 10°/мин до температур -30°, -50° и -70°С. Скорости охлаждения образцов 1-2°/мин приводят к значительному нарушению связей между белковыми компонентами цитоскелета.

Установлено, что низкотемпературное консервирование при умеренно низких- температурах даже под защитой эффективных концентраций глицерина (20 - 4$) приводит к выраженном}' нарушению транспортных свойств их плазматических мембран, что выражается в увеличении пассивной проницаемости для одновалентного катиона и.повы-

шения уровня его активного транспорта.

Теоретическая и практическая значимость -работы. Полученные данные обосновывают механизм криоповреждения эритроцитов в зоне умеренно низких температур, как следствия появления в их мембранах трансмемо'ранных дефектов по типу "сквозных пор" .формирующихся в результате модификации липидного бислоя и белков цитоскелета, что является вкладом в развитие теории криоповреждения клеток.

Разработан и применен в экспериментальной работе высокочувствительный метод определения степени деструкции эритроцитов подвергнутых криоконсервированию в зоне умеренно низких температур, основанный на изменениях внутриклеточного содержания и проницаемости ионоь который внедрен в практику работы низкотемпературного банка в отделе консервации Харьковской областной станции переливания крови МЗ Украины.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Хранение эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов в зоне умеренно низких температур -30° + -70°С приводит к нарушению барьерных свойств их плазматических мембран, что связано с формированием трансмембранных дефектов по типу "сквозных пор".

2. При хранении эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов под защитой глицерина в концентрациях 10 - 4СЙ при температуре -30°С происходит изменение качественного и количественного состава фосфолипидсв юс плазматических мембран.

3. При замораживании эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов до температур -30°, -50° и -70°С наблюдается модификация мембранных белков, прежде всего спектрин-актинового комплекса в направлении их агрегации.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 11 Украинском съезде гематологов и трансфу-зиологов, г. Киев, 1986 г., на Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" в г. Минске, 1988 г., на международной конференции "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедициньГ'в г. Харьков, 1988 г.

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 9 печатных работах и 1 авторском свидетельстве на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и иллюстрирована 6 таблицами и 33 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 2-х глав результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, который включает 229 источников, списка сокращений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ' ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили эритроциты донорской крови чело-века>консервированные в среде "Глюгицир", со сроком хранения при +4°С до 5 суток. Эритроциты выделяли из донорской крови путем

центрифугирования в течении 5 минут при 1500 о , 3 раза промывая физиологическим раствором на.забуференном 10 мМ трис-HCl, рН 7,4. Реставрированные тени эритроцитов получали по методу (\fjhitiam 1964 Белые тени эритроцитов выделяли из донорских эритроцитов по методу( &■ , 1971) . Гематокрит суспензии клеток из-

меряли на микрогематокритной центрифуге " Реас/осг-,^ (США).

Исследуемые эритроциты и реставрированные тени эритроцитов суспендировали 1:1 в растворах глицерина различной концентрации или 1,0 М сахарозе. Использовали концентрации глицерина 5, 10, 15, 20 и 40$, в состав всех консервирующих растворов входил дополнительно ЫаС1 в концентрации 150 мМ. После эквилибрации с криоконсервирую-цим раствором эритроциты и реставрированные тени эритроцитов помечали в полиэтиленовые ампулы объемом 1,5 мл и замораживали до различных температур от -30°С до -70°С с различными скоростями. Скорости охлаждения варьировали от 1-2°/мин до 100°/мин. Замороженные слетки затем переносили на хранение в низкотемпературные рефрижераторы и хранили в диапазоне температур от -30°С до - 70°С от не-жольких недель до 3-х месяцев. Пробы оттаивали на водяной бане 1ри температуре +40°С. После оттаивания проводили удаление криопро-?ектора из размороженной взвеси с использованием растворов сахаро-)Ы с понижающейся концентрацией. При исследовании проницаемости ¡ембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов в качест-¡е маркеров использовали: гемоглобин, ^4С-сахарозу, ионы К+. Введете в реставрированные тени эритроцитов маркера 1'1С-сахарозы осу-[ествляли добавляя его в лизирующий раствор.

После размораживания проб в надосадке суспензии определяли .онцентрацию гемоглобина спектрофотометрически по поглощения»при лине волны 410 нм, концентрацию К+ - на пламенном фотометре ПА2-1, адиоактивность меток с помощью счетчика J, -частиц " ••

¿5-7800 в сцинтилляторе IC-8. Изменения состояния белков мембран ритроцитов и реставрированных теней эритроцитов при замораживании-тогреве изучали методом электрофореза в ПААГ. Электрофорез мэмб-анных белков проводили по методу( Fa<'i-6an£s , 1971) в гра-иентных гелях ПАА 4/30 фирмы "Pharmacia? (Швеция) в буферной истеме трис-борат, рН 8,3, содержащей 0,1%-й ДДС-натрия, Гели канировали при 540 нм на денситометре "ВаеИтал CDS-2.00". Обработ-у клеток диамидом проводили по методу ( Hatsi о.*', 1977), получая атем белые тени, которые подвергались электрофорезу. Скорость *тивного транспорта определяли по Лишко В.К. и соавт.(1973)

¡гммарные липиды эритроцитов получали как описано в работе (Кейтс,

1976) . Разделение липиДного экстракта на отдельные фракции проводили методом двумерной тонкослойной хроматографии по методу (Уе&Цот/хк^ V., 1979) . Липидный фосфор определяли по методу (йа/-^^ 6. 1959) . Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента-Фишера (Бейли Н., 1962 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что большое значение в механизме криоповреждения эритроцитов и других объектов играют .кристаллизационные и рекристал-лизационные явления, что во многом оцределяется скоростью замораживания. Это особенно существенно для криоконсервирования в зоне умеренно низких температур, где вероятность рекристаллизационных процессов очень велика. Поэтому было изучено влияние различных скоростей охлаждения на сохранность барьерной функции эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов при последующем хранении в зоне умеренно низких температур. Эффективность криозащиты эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов при хранении в зоне умеренно низких температур оценивали по выходу из них маркеров: гемоглобина, ■^С-сахарозы и ионов К+,

Анализ изменения барьерных свойств мембран эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов, замороженных со скоростью 1-2°/мин до -30°С, для исследуемых маркеров в течении 1 месяца хранения при температуре -30°С показал, что основные повреждения происходят в результате замораживания до этой температуры и в первые 8 суток хранения, (рис. 1, 2).При сравнительном исследовании выхода маркеров: гемоглобина, ^С-сахарозы, ионов К4" из эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов подвергнутых замораживанию до -30°С под защитой глицерина в концентрациях 5 - 40% и последующему хранению в этих условиях было обнаружено, что реставрированные тени эритроцитов обладают значительно большей криорезистентностью чем эритроциты. Обнаруженный факт указывает на то, что биомембраны сами по себе значительно криостабильнее чем это предполагалось ранее. Их повреждение в составе эритроцитов возможно имеет "вторичную приро-ДУ"( 6лпдиб/ р , 1965; /Псгулан. Н.т, 1974; Белоус А.М., 1987 ). Закономерности изменения выхода маркеров из эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов охлажденных со скоростью 1-2°/мин до температур -40° и -70°С и подвергнутых последующему хранению в этих условиях были такие же как и при хранении исследуемых объектов при температуре -30°С.

%: во-

60

¡/0 20 Н

20-

^Н-}-5 3

Г

О 4 8 46 32 О 4 в <6 зг

Рис. 1л Выход маркеров из эритроцитов, подвергнутых замораживанию до -30 С с последующим хранением при этой температуре. Скорость охлаждения образцов 1-2 /мин. По оси абсцисс - время хранения образцов, сутки; по оси ординат - выход соответствующих маркеров из клеток, %. За 10С$ принято содержание соответствующих маркеров во внутриклеточном пространстве контрольного образца. Выход: А.- гемоглобина; Б,- ионов К . Концентрация глицерина в среде замораживания: 1.- Ъ%\ 2,- 3.- 15$; 4.- А(Ж.

8 4Ь

*ис. 2. Выход маркеров из реставрированных теней эритроцитов, подогнутых замораживанию до -30 С с последующим хранением при этой 'емпературе. Скорость охлаждения образцов 1-2 /мин. По оси абсцисс • время хранения образцов, сутки; по оси ординат - выход соответствующих маркеров из клеток, %. За 100% принято содержание соответствующих маркеров во внутриклеточном пространстве контрольного 'бразца. Выход: А.- гемоглобина; Б.- ионов К ; В.- * С-сахарозы. Ънцентрация глицерина в среде замораживания: 1.- 5%; 2.- 1С%; !.- 154.- 4$.

Результаты исследований показали, что применение 4С$ концентрации глицерина эффективно стабилизирует барьерные свойства мембран.4; :• эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов, замороженных с медленными скоростями 1-2°/мин, по отношению к крупным молекулам (гемоглобину) , однако даже при использовании относительно больших концентраций глицерина - 4С$ образование микродефектов в плазматических мембранах на этапе замораживания-оттаивания полностью не предотвращается, о чем свидетельствует достоверная потеря внутриклеточного калия, ( рис. 3 ). В тфв время при хранении в этих условиях нам не удалось обнаружить значительных изменений барьерной функции эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов, что может быть связано со способностью глицерина в используемой концентрации (4С$ ) предотвращать латентные повреждения мембран в зоне умеренно низких температур на протяжении исследуемого срока хранения.

% %

6 о - . 60

4о-

2о-

<)0

г о

8

—I— '6

—I—

8

*6

32

Рис. 3. Выход маркеров из эритроцитов при хранении в зоне умеренно низких температур. Скорость охлаждения образцов 1-2 /мин. до соответствующей температуры хранения. Среда замораживания и хранения - 40% глицерин. По оси абсцисс - время хранения образцов, сутки; по оси ординат - выход соответствующих маркеров, %. За 100% принято содержание соответствующих маркеров во внутриклеточном пространстве контрольного образца. Выход: А.- гемоглобина; Б.-ионов 1Г". Температура хранения: 1.—4СгС; 2.—7СгС.

С целью возможного накопления латентных повреждений при хранении были изучены барьерные свойства мембран эритроцитов под защитой глицерина в меньших концентрациях. При таком подходе тенденцию накопления повреждений в мембране в процессе хранения при - 30°С, -40°С и -70°С можно выявить при использовании 10 и 15$ концентрации глицерина, (рис. 1, 4 ). Однако и в этой постановке эксперимента. достоверные изменения отмечаются в течении первых 4-8 суток хранения. Совокупность экспериментальных данных свидетельствует о перспективности использования низких концентраций глицерина

при изучении механизма латентных повреждений при хранении в области умеренно низких температур в клетках замороженных с использованием медленных скоростей охлаждения. Однако высокий уровень гемолиза в цикле замораживания-оттаивания существенно усложняет исследование в этом направлении.

Аа

80

во ■

40 -

го

I.

2.

К*'

Лг-Г*'

'О 8060-

4о • 20-

~I-1-«-1-С-1—I-1-1- '-I—I—г

0 4 /2 20 32 О б /6 32

Рис. 4. Выход маркеров из эритроцитов при хранении в зоне умеренно низких температур. Скорость охлаждения образцов 1-2 /мин до соответствующей температуры хранения. Среда замораживания и хранения -15$ глицерин. По оси абсцисс - время хранения образцов, сутки; по оси ординат - выход соответствующих маркеров, %. За 10С% принято содержание соответствующих маркеров во внутриклеточном пространстве контрольного образца. Выход: А,- гемоглобина; Б,- ионов К\ Температура хранения: 1.—70 С; 2.—40 С.

Учитывая тот факт, что основные повреждения происходят в цикле замораживания-оттаивания по-видимому,связаны с воздействием физико-химических факторов, формирующихся при медленном охлаждении образцов^была изучена сохранность барьерной функции эритроцитов в цикле замораживания-оттаивания при использовании более высоких скоростей охлаждения и последующего хранения при умеренно низких температурах. При криоконсервировании эритроцитов под защитой 1Ъ% глицерина, замороженных до -70° С со скоростями 10° - ЮО^мин^ыл выявлен меньший выход маркеров, чем при криоконсервировании до этой температуры эритроцитов(замороженных с медленными скоростями охлаждения. Важной особенностью этих экспериментов является тот факт, что в процессе хранения эритроцитов,замороженных в диапазоне скоростей 10° - 100°/мин до -70°С)прослеживается зависимость накопления латентных повреждений от сроков хранения, что обосновывает оптимальные условия для изучения динамики накопления латентных повреждений, ( рис. 5 ).

Таким образом,динамика накопления латентных повреждений в мембранах эритроцитов, замороженных с медленными скоростями охлаждения 1-2°/мин, при их хранении в зоне умеренно низких температур являет-

ся в большей степени атрибутом неоптималъных режимов замораживания чем собственно хранении. Использование небольших концентраций глицерина и, в частности 15% концентрации, и скоростей охлаждения 10° - 100°/мин обосновывает оптимальные условия для изучения динамики накопления скрытых повреждений мембран эритроцитов в процессе хранения в зоне умеренно низких температур.

/о. 604020 ■

Рис. 5. Зависимость выхода гемоглобина из эритроцитов от сроков хранения при -70 С. Конечная концентрация глицерина в среде замораживания — 15%.

По оси абсцисс - время хранения образцов, сутки; по оси ординат -выход гемоглобина, %. Скорость охлаждения образцов до температуры хранения: 1.- 10°/мин; 2.- 100 /мин.

"I-1-

о Ч в '6

Совокупность данных позволила установить, что при хранении эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов в зоне умеренно низких температур наблюдается несмотря на использование глицерина в эффективных концентрациях 20 - 4С$ криодеструкция мембран, основным проявлением которых является формирование дефектов по типу "сквозной поры". Дяя оценки возможности "самозалечивания" таких дефектов был изучен уровень пассивной проницаемости после хранения, а также компенсаторные возможности ионного насоса.

Исследования показали, что замораживание-оттаивание и последующее хранение в зоне умеренно низких температур эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов приводит к увеличению пассивного входа В6Й| в деконсервационном периоде. Сопоставление данных о количественном выхода.ионов из эритроцитов и реставрирован-

ных теней эритроцитов в ходе замораживания-оттаивания и в процессе его выхода при инкубации в условиях нормотермии можно сделать вы-' вод.о частичном "самозаяечивании" микродефектов после криоконсер-вирования. В связи с этим вполне понятным становится факт активизации АТФ-зависимого транспорта в эритроциты и реставрированные тени эритроцитов. По-видимому^интенсификация работы Ка+,К+-насоса является компенсаторной реакцией клетки на увеличение пассивной проницаемости. Увеличение сроков хранения приводит к прогрессирующему увеличению общего входа, оуабаиннезависимого входа и • компенсаторного увеличения активного транспорта . Относительная стабилизация транспортных свойств плазматических мембран

реставрированных теней эритроцитов достигается при 20 - 40$ концентрации глицерина в криоконсервирующей среде, а эритроцитов при 4С$ концентрации. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что хранение эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов приводит несмотря на присутствие в среде замораживания глицерина в эффективных концентрациях к нарушению транспортных

свойств плазматических мембран. %

/60-

<г о

so-

•i i

} 2 440-

з ■

■i Ц iZO •

—I—

а

—I—

ноо

3

ц

■>в

Рис.

о 6 1Z

як

6. Оуабаиннезависимый пассивный вход ДС в эритроциты и реставрированные тени эритроцитов в средэ замораживания после хранения при -30 С. По оси абсцисс - время хранения образцов, сутки; по оси ординат - % пассивного входа icR& . За 10($ принят пассивный транспорт в контрольной пробе в присутствии глицерина соответствующей концентрации. А,- реставрированные тени эритроцитов: Б.-эритроциты. Концентрация глицерина в среде замораживания:. I.- 5%; 2.- 10%; ,3.- 2С$; 4.- 4®.

Анализ данных литературы ( № try та* И., 1971; PrlSc г- D.V., 1971;

У/сс^да-г а, 1974) позволил предположить, что в процессе охлаждения отологических объектов в их мембранах происходит образование каналов "утечки" ионов, обладающих чрезвычайно высокой проницаемостью. Довольно большое число факторов, формирующихся в процессе замораживания-оттаивания способны сами по себе и, дополняя друг друга, способствовать образованию неспецифических каналов ионной "утечки". В настоящее время установлено, что существенную роль в механизме пассивного транспорта катионов и анионов играют липиды биомембран. В то же время известно, что именно эти компоненты плазматических мембран претерпевают наибольшие изменения в процессе замораживания-оттаивания. Исходя из данных литературы и сложившихся представлений (Белоус A.M., Бондаренко В.А., 1982\ BreebtfjfSC , 1974 ) о высокой чувствительности к действию низких температур фосфолипидов мембран, был изучен состав фосфолипидов в мембранах эритроцитов и реставрированных тенях эритроцитов после замораживания-оттаивания и последующего хранения в присутствии криопротекто-ра.

Проведенные исследования показали, что эквилибрация клеток с 10 - 4С$ растворами глицерина не влияет на содержание основных классов фосфолипидов в клетках. Однако после медленного замораживания и последующего хранения при температуре -30°С под защитой 10 - 40% глицерина в мембранах эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов достоверно снижается количество фосфатидилэтанол-амина, фосфатидилхолина и фосфатидилсерина с параллельным накоплением лизоформ фосфолипидов. В тоже время количество сфингомиелина существенно не изменяется. Согласно данным ( , 1977)фосфа-

тидилятаноламин и, особенно, фосфатидилхолин играют существенную роль в регуляции пассивной проницаемости биологических мембран.

В связи с этим можно предположить, что выявленное увеличение пассивной проницаемости мембран для ионов ^^ё после замораживания-оттаивания может отчасти объясняться потерей гидрофобных свойств мембраны эритроцитов вследствие потери основных классов фосфолипидов. Для сохранения состава фосфолипидов в процессе хранения при -30°С на уровне, близком к исходному, необходимо использовать не менее 20 - 4<Ж растворы глицерина как в случае эритроцитов так и реставрированных теней эритроцитов. Нарушение фосфоли-пидного состава также может явиться одним из реальных механизмов повышения проницаемости плазматических мембран после замораживания-оттаивания для ионов и биомолекул.

Исследование механизмов криоповреждени биомембран на молекулярном уровне позволяет предположить, что они развиваются не только в результате потери части фосфолипидов^но и в результате изменений белков" мембраны и белков цитоскелета эритроцитов (1улевс-кий А.К., 1986; В>а££а$Я, 1981) .

Лдя изучения структурных изменений мембранных белков и белков цитоскелетной сети в результате охлаждения был использован методический прием, который позволил в клетке фиксировать имеющиеся нарушения мембранных белков в виде агрегатов и делать их устойчивыми при последующей обработке мембран додецилсульфатом натрия перед электрофорезом в полиакриламидном геле Ц/., 1977) . Таким методическим подходом для изучения структурных изменений возникающих в цитоскелетной белковой сети яачяется использование химических сшивающих агентов ( в,, 1985) . Одним из наиболее часто используемых в настоящее время сшивающих агентов является диамид, который фиксирует ¿Н -группы белков^отстоящих на определенном расстоянии. Использование диамида позволило оценить влияние различных скоростей охлаждения на состояние мембранных белков в составе мембраны эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов,

охлажденных до температур -30° + -70°С. Анализ полученных результатов показал, что в отсутствие сшивающего реагента диамида не было выявлено существенных различий в составе белков эритроцитарных мембран при использовании скоростей охлаждения 10°/мин и 1-2°/мин. Эксперименты позволили установить, что под влиянием указанных выше скоростей замораживания в мембранах реставрированных теней эритроцитов происходит пространственная реорганизация цитоскелетной сети клеток, проявляющаяся на электрофореграмме в виде существенного увеличения олигомерных полос белка, соответствующих сшитым формам спектрина. Принадлежность этих олигомеров к белкам спектрин-акти-нового комплекса подтверждается уменьшением содержания соответст-.вутощих полос(1 и 2\на электрофореграмме. В опытах с использованием диамида было выяснено, что наименьшее количество агрегированных мембранных белков образуется при скорости охлаждения 10°/мин до температур -30°, -50° и -70°С. Медленные скорости охлаждения приводят к значительному нарушению связей между белковыми компонентами цитоскелета - спектрина ( полосы 1 и 2) и актина ( полоса 5\ а также перераспределению материала белка полосы 3 и полосы 4.9, (рис. 7 ).

Рис. 7. Относительное содержание белковых фракций в мембранах реставрированных теней эритроцитов после различных режимов охлаждения и обработки диамидом. Объекты исследования заморожены в отсутствие криопротектора. 1,- Контроль /незамороженный образец с диамидом/; 2.—30 С /1/, в скобках скорость замораживания образцов, град/мин до конечндй температуры одлажцения; 3.—£0°С /у; 4.-—УО С /1/; 5.— —30 С /10/; 6.— —50 С /10/; У.— —70 С /10/. Обозначения белков на круговых диаграммах: 1,- олигомеры; 2.-спек-трин /полосы 1 и 2 /; 3,- полоса 3; 4,- полоса 4.1; 5,- полосы 4.2 - 4.9; 6,- полоса 5 /актин/; 7.- полоса 6 /глицеральдегид -3-фосфатдегидрогеназа/; 8.- минорные белки.

Таким образом^анализ полученных результатов показал, что при замораживании реставрированных теней эритроцитов в отсутствие криопротектора наблюдается модификация мембранных белков, заключающаяся в основном в их олигомеризации, что особенно заметно в отношении белков спектрин-актинового комплекса. В связи с обнаруженным фактом были изучены структурные перестройки цитоскелета эритроци-

тов и реставрированных теней эритроцитов в условиях криозащиты. Как видно из (рис. 8) добавление в среду замораживания глицерина в концентрации выше Ъ% предотвращает вышеописанные нарушения структуры цитоскелета, а именно уменьшает количество олигомерных форм мембранных белков даяе при использовании скоростей охлаждения 1-2®/мин, что указывает на способность криопротекторных веществ стабилизировать связи спектрина с другими компонентами цитоскелета.

Рис. 8. Относительное содержание белковых фракций в мембранах эритроцитов после различных режимов замораживания и обработки диа-мидом. Эритроциты заморожены до температуры -70 С / А, Б, В /. Концентрация глицерина в среде замораживания: А.- без криопротек-тора; Б.- 15%; В.- 40%. 1.- контроль /незамороженный образец с диа-мидом/; 2,3,4 - эритроциты заморожены со скоростью 1-2^мин; . 5,6,7 - эритроциты заморожены со скоростью 1Б /мин. Обозначения белков ка круговых диаграммах: аналогично рис. 7.

Таким образом^ анализ результатов исследований позволяет прийти к заключению, что в мембранах эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов при замораживании и последующем хранении в зоне умеренно низких температур происходит деградация части фосфолипидов, выражающаяся в нарушении количественного и качественного состава фосфолипидов и появлением лизоформ фосфолипидов, а также модификации мембранных белков, заключающейся в основном в их олигомериза-ции, что особенно заметно в отношении белков слектрин-актинового комплекса. Модификация фосфолипидного состава и белков спектрин-аятинового комплекса^по-видимому, является одним из реальных механизмов формирования трансмембранных дефектов по типу "сквозных пор" в мембранах эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов в уело виях криоповреждения при умеренно низких температурах,образование которых приводит к нарушению ионного гомеостаза клеток и?в конечном счете к лизису клеток.

выводы

1. Установлено, что замораживание эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов под защитой глицерина до умеренно низких температур -30°, -40° и -70°С и последующее хранение при этих температурах приводит к нарушешто их барьерной функции вследствие образования трансмембранных дефектов по типу "сквозных пор", что регистрируется по выходу маркеров: гемоглобина, -^С-сахарозы, ионов К+. При медленных скоростях замораживания использование высоких концентраций глицерина не предотвращает утечку ионов из клеток.

2. Определено, что оптимальными условиями замораживания эритроцитов необходимыми для изучения динамики накопления латентных повреждений мембран в процессе хранения при умеренно низкой температуре -70°С является использование 1Ъ% концентрации глицерина и скоростей замораживания 10° - 100°/мин.

3. Выяснено, что в процессе замораживания-оттаивания и последующего хранения в течении 2-х месяцев при температуре -30°С в плазматических мембранах эритроцитов и реставрированных тенях эритроцитов под защитой глицерина в концентрациях 10 - 4С$ происходит изменение качественного и количественного состава фосфолипи-дов с параллельным накоплением лизоформ фосфолипидов. Для сохранения состава фосфолипидов на уровне, близком к исходному, необходимо использовать не менее 20 - 4($ растворы глицерина как в случае эритроцитов так и реставрированных теней эритроцитов.

4. Обнаружено, что при замораживании эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов до температур -30°, -50° и -70°С. наблюдается модификация мембранных белков, прежде всего спектрин-акти-нового комплекса в направлении их агрегации. Выяснено, что наименьшее количество агрегированных мембранных белков образуется при скорости замораживания 10°/мин до температур -30°, -50° и -70°С. Скорости охлаждения образцов 1-2°/мин приводят к значительному нарушению связей между белковыми компонентами цитоскелета.

5. Установлено, что замораживание эритроцитов и реставрированных теней эритроцитов с медленными скоростями 1-2°/мин до температуры -30°С и последующее хранение при этой температуре даже под защитой эффективных концентраций глицерина 20 - 4С$ приводит к выраженному нарушению транспортных свойств их плазматических мембран, что выражается в увеличении пассивной проницаемости для одновалентного катиона и повышения уровня его активного транспорта,

6. Установлено, что при различных режимах замораживания-оттаивания и хранения в зоне умеренно низких температур реставрирован-

ные тени эритроцитов более устойчивы к действию замораживания-оттаивания чем эритроциты.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. ГУлевский А.К., Рязанцев В.В., Кукушкин А.И. Роль трансмембранного потенциала в нарушении барьерных свойств мембран эритроцитов в процессе криоконсервирования.// Бал, экспер. биол. и мед. -1985. т. 60, № 12. - С. 690 - 691.

2. 1улевский А.К., Рязанцев В.В., Кукушкин А.И. и др. Механизмы структурно-метаболических изменений криоконсервированных эритроцитов.// Тез. докл. 11 Украинского съезда гематологов и трансфузио-логов. - Киев, 1986. - С. 27 - 28.

3. Способ определения степени деструкции эритроцитов. A.C.

№ 1260952 СССР.// 1улевский А.К., Рязанцев В.В., Кукушкин А.И. -Бюл. изобр. - 1986. - № 30.

4. Бабийчук Л.А., Лоевский М.М., Рязанцев В.В., Кукушкин А.И. Пути повышения устойчивости эритроцитов к криоконсервированию.// Тез. докл. Междунар. конф. "Достижения и перспективы развития криобиологии и крломедицины". - Харьков, 1988. - С. 143.

5. Лоевский М.М., Коптелов В.А., Рязанцев В.В., Кукушкин А.И. Структурные перестройки плазматических мембран при гипотермическом и низкотемпературном хранении.// Тез. докл. Всесоюз. конф. "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов". - Минск, 1988. - С. 76.

6. Кукушкин А.И., Гулевский А.К., Лоевский М.М., Макаренко В.В. Влияние умеренно низких температур -30° + -70°С на проницаемость мембран эритроцитов.// Укр. биохим. журн. - 1988. т. 60, 13,-

С. 104 - 106.

7. Рязанцев В.В., Лоевский М.М., Кукушкин А.И. Белки мембран эритроцитов при действии умеренно низких температур.// Укр. биохим. журн. - 1990. т. 62, № 1. - С. 94 - 97.

8. Межидов С.Х., Кукушкин А.И. Влияние гемоглобина на барьерные свойства мембран эритроцитов.// Рукопись деп. в ВИНИТИ. - 1990, № 5278 - В90. деп. от 08.10.90. - 11 с.

9. Кукушкин А.И., Лоевский М.М. Фосфолипиднвй состав нативных и реставрированных эритроцитов при охлаждении до -30°С.// Рукопись деп. в ВИНИТИ. - 1990, № 5500 - В90 деп. от 29.10.90. - 13 с.

10. Кукушкин А.И., 1Улевский А.К. Транспорт в нативных

и реставрированных эритроцитах подвергнутых замораживанию и хранению при -30°С.// Рукопись деп. в ВИНИТИ. - 1990, № 6238 - В90 деп. от 13.12.90. - 11 с.

ветственный за выпуск - академик АН Украины В. И. ГР.ЩЕЖО

дписано к печати 31.03.92 г., физ. п. л. 1, учетн. изд. л. 1. Заказ 4С, тираж 1С О

тапринт ФТИНТ АН Украины, 310164, Харьков-164, пр. Ленина, 47.