Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические изменения в мембранах при гипотермии и зимней спячке

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические изменения в мембранах при гипотермии и зимней спячке"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ СОВЕТ Д 063.52.08 ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ НАУКАМ

На правах рукописи ХАЛ ИЛ О В Рустам Абдуразакович

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В МЕМБРАНАХ ПРИ ГИПОТЕРМИИ И ЗИМНЕЙ СПЯЧКЕ

(03.00.04 — биологическая химия)

у

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1994

Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики и в НИИ биологии Дагестанского государственного университета.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор . биологических паук, академик

РАЕН, профессор Эмирбеков Э. 3.; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Кличханов Н. К.

доктор биологических наук, профессор Шугалей В. С. (Ростовский государственный университет);

доктор медицинских наук, с. л. с. Трапе-зонцсва Р. А. (ЦНИЛ Ростовского госмединститута).

Институт проблем криобиологии и криоме-диципы АН Украины (г. Харьков).

Защита состоится « 31» мая 1994 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д 063.52.08 по биологическим наукам в Ростовском государственном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, 105, РГУ, 2 этаж).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РГУ (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

/Р

Автореферат разослан » апреля 1994 г.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

В. Н. КИРОЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, У гомойотермзшх гявоткых и человека нормальный ход метаболических процессos осуществляется а узком температурном диапазоне (38^4°С): сниаение температуры тала пш-водит к дискоординаодя функций а метаболизма (Найстрах, 1976; Тимофеев, 1983; Сумбатов, 1985; Эмврбеков, Львова, 1985}в имеющей длительные поотгипотермвчеоквв последствия (Золколаков, Да-цисс, 1977; Мешалкин, 1985; Эмярбеков, Львова, 1985), Изучение нарушений метаболизма организма теплокровного животного„ перепивающего глубокую гипотермию, а также соответствующих восотааови-тельных бяохимачеснвх процессов после прекращения последней,, несомненно, в Составляет ¿обой одну аз важнейших и ещё недостаточно исследованных, проблем биологии я медицины.

Центральная нервная система особенно чувствительна ж гипотермии ( swan г IS74; Проссер„ 1977). Низкая температура тела го-яюйотэрмов оказывает непосредственной действие на головной мозг, вызывая неврологические осложнения »в нарушения. Установлено,, что гипотермия не нарушает проведения Емвульса а нервах, но выключает свнапсн уке при температура тела I8-20°C ((Benita, Conde , 1972; Старков, 1968). В этих условиях наблюдается снижение мембранного потенциала (Кононенко, 1976; Айрапетяя, 1977)„ Указанные эффекты связывают о воздействием низкой яемяерагури непосредственно на возбудимые мембраны (Проссер, 1977). По мэре падения температуры тела наблвдается постепенное снижение прямых ответов коры мозга и долно8 исчезновение их при гипотермии 22-20°С (Массопуст, 1970; Лабахуа, 1976), свидетельствующие о деполяризаций нервных и глйаяышх элементов а об изменении св-наптической активностя мозга (Лабахуа, 1976; Тимофеев, IS84).

Таким образом, яри гипотермии возникают такие йзмэнания в мембранах нервных клеток, которые приводят к расстройству аоно-транспортной функция и мэмбранко-синаптической трансмиссии. Для понимания механйзмоа-влияния низкой температуры тела на головной мозг представляет аяторас научение правда всего мембранных процессов в мозгу.

Для исследования структурно-функциональных-свойств мембран наиболее удобным объектом является эритроцит, вследствие язвест-

ной простоты его внутриклеточной организаций и возможности по-' лучения плазматической мембраны в наиболее чисток виде (Черниц-кий, Воробей, 1981; БоЙтлер, 1981; Леонова, 1987).

С другой стороны, эритроцит, являясь ооновным компонентом кровеносной системы, должен нести отпечаток приспособительных реакций организма. Сравнительное исследование влияния гипотермия на структурно-функциональные свойства плазматических мембран ой-наптосом коры головного мозга в эритроцитов необходимо для выяснения особенностей действия низкой температуры тела на функционально различные мембраны и в целях диагностики и последующей профилактики постгипотермических осложнений.

У зимсюпящих животных температурный диапазон активности бяохш лческих реакций более широкий (от О до 38°С). Это предполагает, что клеточные мембраны обладает таквмя термотропными свойствами, которые обеспечивают функционирование мембраносвя-заннвх ферментов и транспортных систем в условиях изменяющейся температуры.

Изучение биохимических изменений в мембранах санаптосом и эритроцитов при искусственном и естественном (зимняя спячка) ох-лаадгзин организма в сравнительном аспекте необходимо для понимания общих механизмов резистентности гомойотермных животных к низкой температуре тела.

Цель и задача исследования. Целью настоящего исследования явилось выявление закономерностей биохимических изменений б мембранах санаптосом коры головного мозга и эритроцитов при гипотермии крыс в сусликов, а такие при зимней спячке.

В работе постелены следующие задачи;

I. Определение интенсивности внутрисосудистого гемолиза и перекисного гемолиза как интегральных показателей стойкости эритроцитов; возможная коррекция обнаруженных изменений с помощью мочевины и аргинина.

2а Исследование интенсивности процессов ПОЛ в крови и коре больших полушарий головного мозга путём определения содержания диеновых коньюгатов, МДА, кетодиенов и сопряженных триенов, активности антиокислительной системы.

3. Определение количества оульфгидрильных групп и даоуль-

фидных связей в белках плазмы крови, мембран эритроцитов я синап-тосом коры больших полушарий головного мозга.

4. Исследование активности и термокннэтичеоких параметров Sа„К-АТФазы в АХЭ мембран эритроцитов и синаптосом коры больших полушарий головного мозга.

Основнва положения, выносимые на зашит?.

I. Изучение влияния гипотермии ва интенсивность внутрисооу-дистого гемолиза, парекионого гемолиза, процессов ПОЛ, количества ЗВ-грушз в 3 - а связей,, активности яа,К-АТФазы позволяет заключить, что при низкой температуре тела у крыс происходит дестабилизация мембран эритроцитов.

• 2» Гипотермия крыс сопровождается ростом процессов ПОЛ, перераспределением SH-групп мембранных белков, существенным угнетением активности ®а,К-АТФазы и АХЭ синаптосом коры больших полушарий головного мозга.

3. Биохимические изменения, происходящие в мембранах эритроцитов б синаптосом коры большие полушарий головного мозга сусликов при искусственном снижении температуры •sena а, в особенности, при зимней спячке, носят адаптивный характер я направлены на поддержание функциональной активнехзтк зтвх мембран в указанных функциональных состояниях.

Научная новизна. Исследование процессов !Ш в крови и коре головного мозга крно в динамике гзпотермиш показало» что наиболее критическим о точки зрения окислительного стресса на тканевом уровне является умеренная (30°С) гипотермия, характеризующаяся интенсификацией свободнорадикальных процессов.

Впервые обнаруяэно, *зто у крыс в состоянии гипотермии увеличивается количество связанного о мембранами эритроцитов гемоглобина. При низких температурах тела в опытах in vivo и in vitro установлено тормозящее влияние гемоглобина на активность н еД-АТФазы мембран эритроцитов.

В работе впервые изучены активность и термокинетическиа параметры На,К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом коры больших полушарий головного мозга крыс при глубокой гипотермии. Установлено, что угнетение активности АХЭ при глубокой гипотермии свя-

зано оо снижением максимальной скорости фермента. В этих условиях обнаружено перераспределение зН-грушг белков мембран синаптосом в повышение окисляемости мембранных хипидов, что в целом приводит к изменению белок-липидных взаиыодейссвий.

Новым является и обнаруженный автором тот факт, что при зимней спячке у сусликов количество сульфгидрялышх групп белков плазмы крови,, мембран эритроцитов и мембран синаптосом снижается в 2 раза, по оравнению с активным состоянием в летнее время. Однако, при этом соотношение между "поверхностными" в "скрытыми" ЭН-группами не изменяется, что свидетельствует о стабильности конформа^ии мембранных белков при зимней спячке.

Результаты работы свидетельствуют о повышении активности АХЭ мембран свнаптосом коры больших полушарий при гибернации, за счет возрастания максимальной скорости мембранного фермента, а не изменения сродства последнего к субстрату.

Научно-практическое значение работы. Полученные, в результате исследований данные представляют существенный интерес для выявления наиболез чувствительных к низкой температуре тела биохимических ¿'эакцай, отражающих как патогенез» так .и адаптацию. Практической значение имеет фактический материал с точки зрения профилактики и коррекции патобиохямическях процессов при гипотермии» .

Тема диссертации является составной частью научно-исследовательской работы Шй биологии при Дагестанском госуниверситеге (У 31.27.25, 34.15.61).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на: итоговых научных конференциях ДГУ (Махачкала, 1989-1993), Всесоюзном сампозиуме "Механизмы зимней спячки" (Махачкала, 1990), 6-ой школе-семинаре "Механизмы адаптации животных и растений к экстремальным факторам среды" (Ростов-на-Дону, 1990), П Международной конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков, 1992), симпозиуме стран содружества "Макро- и микроуровни организации мозга в норме и патологии" (Москва, 1992), научной конференции "Организованный мозг" (Москва, 1993), а также на совместном 'заседании кафедры биохимии и биофизики и НИИ'биологии Дагестанского университета (Махачкала, март 1994 г.).

)

Публикация результатов исследования. По тема дисоертации опубликовано 8 работ.

Структура а объём работы. Диссертация изложена на /£<f стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,, результатов исследования и их обсуаденяя, заключения, выводов и списка использованной литературы, который содержат /Лз отзчественных и гару-бужных источников. Работа оодервит Ло рисунков я таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на половозрелых беспородных белых крысах-самцах и на малых кавказских сусликах ( Cittelua py<j¡aalu3 Pailas ), отловленных в низменной частя Дагестана.

Гипотермию крыс вызывали в холодовнх камерах, изготовленных в нашей лаборатории, в рубашке которой циркулирует вода с температурой 4-5°С. Температуру тела крко снижали до 30°С (умеренная гипотермия) я до 20-19°С (глубокая гипотермия ) со средней скоростью 0,3°С/мин. В отдельных сериях опытов достигнутый уровень гипотермии поддерживали в течение 2 ч. У бодрствующих летом сусликов температуру тела снижали до Ю°С.

Для исследования состояния зимней спячка отловленных в мае-июне сусликов содержали в условиях вяваряя до глубокой осени. В конце октября- зверьков помещали в индивидуальные клетки и переносили в тёмную комнату с температурой 5-6°С. Животных для исследований брали после 3-х месячной спячки.

Животных, всех исследуемых групп, забивали декапитацией. Свободно вытекающую кровь собирали в пробирку с антнкоагулян-том (цитрат натрия или гепарин). Быстро вскрывали черепную коробку и отделяли кору больших полушарий мозга.

Тени эритроцитов'Получали методом гипоосмотяческого гемолиза клеток (Ка&енов и др., 1984). Синаптосомы из коры больших полушарий мозга выделяли методом низкоскоростного центрифугирования (fiajoa , 1975). Мембраны синаптосом выделяли после ги-псосмотического шока (Потапенко, 1908).

Концентрацию свободного гемоглобина в плазме крови определяли по реакции о бензидином (Каосирсккй„ 1970). Перекиснув резистентность эритроцитов определяли по методу Ю.А.Юркова к др. (1984), инкубируя эритрошты в присутствии перекиси водорода ■ Ре++аскорбат. Концентрацию ИДА в плазме кров« определяли в присутствия сульфата железа по Л.И.Андреевой и др. (1988), а в го-могенатах коры больших полуиарий мозга по В.В.Лвмевко в др. (1987). Определение продуктов ПОЯ (диеновые коныогатв (ДК)„ ке-тодиены в сопряженные триены) в крови производили в липидных экстрактах гэптановой и язопропольной фаз (Волчегорокий я др., 1989). Об АОА водорастворимо! фракции плазмы в мозге судили по скорости окисления восстановленной формы 2,6-двхлорфвноливдофе-нола (Семенов, Ярош, 1985). Активность СОД и"каталазв определяла в гемолизатах и цитозольной фракции коры больших полушарий мозга. Об активности СОД судили по окорооти ингибврования процесса восстановления нитросинего тетразолия в присутствии фенозинметасуль-фата (Дубинина, 1988), об активности каталазк - по скоростк убели перевиси всщорода в среде инкубации (Королюк и др.,1988)„

Количество назхомолекулярных тиолов в плазме, а также содержание 3Н-групп и 3 - 5 связей в белках плазмы, мембран эритроцитов в синаптосом устанавливали методом амперометрического титрования с'азотнокислым серебром (Соколовокий и др , 1962 Ь Количество поверхностных и скрытых тиоловых групп вычисляли, определяя содержание ЭН-групп в мембранах до и после их солюбиЛивадии додецялсульфатом натрия. Содержание Б-Б связей в белках устанавливали после их сульфолиза (Торчинский, 1977).

В суспензии мембран эритроцитов и синаптосом определяли активность На.К-АТФазы, которую рассчитывала как разность между общей и М^ +-зависимой АТФазой (Болдырев, 1977г Казенов и др., 1984). Исследование зависимости активности фермента от концентрации субстрата проводили в интервале 0,05-3 ммоля АТФ„ Температурную зависимость активности На,К-АТФазы определяли в диапазоне 5-40°С. Об активности фермента судили по приросту неорганического фосфора (Рожанец в др., 1978) в среде инкубации и выражали в мкмолях Рц/мг белка/ч. Концентрацию белка определяли ПО методу.Лоури ( Ьотагу ег а!., 1951).

Активность АХЭ определяли по методу Эллман ( ВИтап, 1961) в модификации М.Н.Иасловой и Л.В.Резняк (1076). В качестве суб-

страта использовали ацетилтиохолан (ATX)' в концентрации I тюль. При исследовании зависимости активности АХЭ от концентрации субстрата количество АТХ в пробе варьировало от Э'Ю-6 до 8'1(Р*М. Активность АХЭ выражали в мкмолях АТХ/мг белка/ч.

Полученное экспериментальные данные подвергали статистической обработке.по методу малой выборки (Кокунин, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕЖЕ

1с Влияние гипотермии и зимней спячки на состояние мембран эритроцитов.

Наши исследования показали

что у крыо при гипо-

термии 20 С концентрация свободного гемоглобина з плазме крови возрастает более чем в 6 раз. Усиление внутрисосудистого гемолиза свидетельствует о дестабилизации мембраны эритроцита при снижении температуры тела. В усилении внутрисосудистого гемолиза при гипотермии немаловажное значение имеет их окислительный лизис. Это подтверждается данными о возрастании при гипотермии крыс гемолиза индуцированного как Н^ (34%), так и системой Ре2+-аскорбат (54%),, Оказалось, что аргинин» введенный (в/б 120 мг/100 г) животным за 30 мин до скиязння температуры тела, защищает эритроциты от окислительного лизиса (рис. I).

50 40 30 20 10

0

Рис

I. Пеоэки^лый гемолиз (в % к контролю) эритроцитов при гипотермии 20ч! без ( □ ) и с введением аргинина

). Гемолиз: I - в присутствия НоО-; 2 - в присутствии Fe" -аскорбат.

*

Снижение перекисной резистентности эритроцитов при низкой температура тела свидетельствует как об увеличении оквсляемости мембранных липидов, так и о снижении активности противостоящих ПОЛ антиоксид.нтных систем ( Clemens, Remmer , 1982). Протекторное действие аргинина в этих условиях, видимо, связано с его ан-тиоксидантным аффектом и с регуляцией микровязкости мембран эритроцитов (Шуталей и др., 1990).

Анализ интенсивности процессов ПОЛ показал, что концентрация как первичных (ДК), так в промежуточных продуктов пероксида-ции (кетодиены и сопряженные триены, МДА) в плазме и цельной крови крыс возрастает при умеренной (30°С) гипотермии. Возможно, в качестве компенсаторной реакции возрастает АОА водорастворимой фракции плазмы крови в активность СОД и каталазы (рис. 2).

40 30 20 10

-10

-20

-30

Рис. 2. Изменение содержания продуктов ЮЛ и активности компонентов антиокислительной системы, крови при умеренной (30аС,Й ) я глубокой (20сС, £23 ) гипотермии крыс и сусликов (10 0,} (в % к контролю).: I - НДА; 2 - ДК; 3 - кетодиены к сопряженные триены; 4 - АОА водорастворимой фракции плазмы крови, 5 -СОД; 6 - каталаза.

При глубокой (20°С) гипотермии иаблвдается тенденция к нормализации процессов ПОЛ, однако, АОА и активность антиоксидантных ферментов пра этом достоверно снижается.

Глубокая гипотермия (Ю°С) бодрствующих летом сусликов приводит к повышению (23^) количества диеновых нонъюгатов крови, однако это не сопровождается ростом, промежуточных продуктов ПОЛ; количество кетодиенов ¡я сопряженных триенов при этом не ¡изменяется, а содержание МВД - снижается на 11% (рис. 2). При гипотермии -у сусликов повышается АОА крови, а активность СОД к каталазы хотя и снижается, по в меньшей степени, чем у крыс с низкой температурой тела,

. Таким образом, низкий уровень интенсивности процессов ПОД в крозя сусликов при глубокой гипотермии обеспечивается благодаря высокой активности компонентов антиокислителыюй системы.

Интенсификация процессов ПОД при умеренной гипотермии у крыс, видимо, имеет стрессовую природу и связан с акчиващаей реакций, в ¿сотовых образуются свободные радикалы. Усиление процессов ПОЛ представляет наибольшую опасность для белков я низкомолекулярных соединений, содержащих в своём составе сульфгидрильные группы (Бурлакова и др., 1982).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что глубокая гипотермия у крыс существенно не влияет на содержание низкомолекулярных тнодовых соединений в плазме крови. В то жа время, у искусственно охлажденных (-10°С) летом сусликов их количество в плазме снижается на 29$. Ещё больше снижается (на 565?) количество низкомолекулярных тиолов в плазме крови сусликов при зимней спячке. Возможно, снижение количества низкомодекулярных тиолов при низких температурах тела у сусликов связано с окислением их при участии в процессах ПОД, тем самым защищая от окисления эИ-группы мембранных белков. Это подтверждается при анализе ко-■ личества з-э связей в белках мембран эритроцитов, оказалось, что пои гипотер№'' -0°С у крыс в белках мембран эритроцитов ча 47$ возрастает количество дисульфидных связей. В то же время у сусликов и при гипотермии Ю°С и при зимней спячке их количество в мембранных белках значительно снижено (ряс. 3). '

Различия между крысами и сусликами обнаружены' и при анализе количества ЭИ-групп белков мэтлбран эритроцитов. Так, у крыс при гипотермии имеет место тенденция к повышению количества

зн-группы

э-з связи

20 "

0

'-60 ■

-40 '

-20 ■

. *

Рис. 3. Влияние гипотермии (Г~1 - крысы; БЩ - суслики) и зимней спячки (§§31) на содержание (в % к соответствующему контролю) суммарных зн-групп и э - г связей в белках мембраны эритроцитов.

их количество почте не моняется, а при зимней спячке снижается ш 51% (рис. 3)„ Прв зимней спячке наблвдается равномерное снк-гение количества как поверхностных, так в скрытых ЗН-групп, в результате чего их соотношение поддерживается на уровне такового, как у контрольных животных, что, видимо, подтзервдает устойчивость конформации белков мембран эритроцитов прк зимней спячка (Конав, 1&70).

Окисление БН-групп представляет опасность, прежде всего, для ферментов, в активном центре которых содержатся эти группы. Одним из ферментов, для которого доказано наличие в активном центре нескольких зН-групп, является Иа,К-АТФаза (.1огдепзеп, 1982). При выделении мембран эритроцитов у крыс для определения активности ва,К-АТФазы выяснилось, что при гипотермии 20°С, в отличие от контроля, мембраны не отмываются полностью от гемоглобина ("розовые" тени). Только после повышения рН отмывающего буфера (10 трис-НС1 буфер) с 7,6 до 8,2 удалось полиостью отбыть мембрану эритроцитов у охлажденных до 20°С крыс ("с'елие"

ЗД-г^ула мембранных белков. У сусликов не (прк гипотермии ХО°С)

тени)'» Эти данные указываю? на то, что гемоглобин с мембраной связывается с помощью электростатических сил и, что при гипотермии количество мест связывания гемоглобина на мембране увеличивается. 0

7 крыс с температурой тела 20 С активность и а,К-АТФазы,измеренная в "розовых" тенях, резко снижается. В полностью отмытых от гемоглобина мембранах эритроцитов активность фермента при гипотермии также снижается, ко з значительно меньшей степени, чем в частично отмытых мембранах '(табл. I). Внутрибршннноа введение мочевины не предотвращает торможение активности Яа,К-АТФазы'при гипотермии.

Таблица I.

Влияние гипотермии 20сС на активность на,К-АТФазы (м*$Л Рц/мг/ч) мембран эритроцитов крыс (М £ а ; а - 3)

Состояние -

___!_37_1___17___

Контроль

Гипотермия 20°С:

"розовые" теня

"белые" тени

Гипотермия 20°С + мочевина

Примечание-: Здесь а далее - означает- достоверные (Р< 0,05) относительно контроля различая.

В связи с полученными данными мн исследовали влияние гемоглобина яа активность на,К-АТФазы в условиях 1а --.гхгэ. Оказалось, что добавление гемоглобина в инкубационную среду ври кор-мотермии на влияет на активность фермента, в го ка время крк гипотермии 20°С снижает активность на 20>%, Торможение активности На,К-АТФазы мембран эритроцитов пря гипотермии гемоглобином, возможно, связано а его непосредственным действием на фермент в результате увеличения мест связывания на мембране, либо реализуется через его участив в процессах ПОЛ.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что у крыс при гииоторт'ки изменяются как белконые, так и лкпид-

1,99±0,07

0,84^0,06* 1,65±0,05*

1,65±а,05*

0,1920,02

0,0720,01* О,14*0,01*

ные компоненты мембран эритроцитов, что, видимо, лежит в основ© снижения их стабильности в функциональной активности. Кроме того, обнаружена существенная разница мезд^ крысами ш сусликами в действии низкой температуры тела на мембрану эритроцита.

2. Влияние гипотермии и зимней спячки ка мембраны и мембранасвязанные ферменты синаптосом коры больших полушарий мозга.

Нами обнаружено (рис. 4), что исходный уровень МДА в коре мозга при различных уровнях гипотермии существенно не изменяется, что свидетельствует о сбалансированности процессов образования и 'дегрдации продуктов ПОЛ. Вместе с тем, при умеренной гипотермии интенсивность спонтанного, ферментативного и неферм'ентатив-ного ПОЛ значительно увеличивается. При углублении же гипотермии интенсивность этих процессов несколько снижается, но остаётся выше контрольного уровня. При умеренной гипотермии повышается, а при глубокой снижается также АОА и активность СОД и каталазы гомогенатов мозга (рис, .4).

ПОД: 1 - спонтанный; I - АОА водорастворимо

2 - ферментативный; фракции;

3 - неферментативнвй. 2 ~

3 - каталаза.

Рис. 1. Влияние умеренной (30°С,! ! ) .глубокой (20°С, ) гипотермии крыс и сусликов (10°С,Ё23) на содержание продуктов ПОЛ (а) к АОА (б) гомогенатов коры больших полушарий мозга (в % к контрочю).

Пра принудительной гипотермии у сусликов, в отличие от нрво„ АОА водорастворимой фракция мозга возрастает на 25£ (рис. 4 Ö). Однако, активность СОД г каталазн, как и у крыс, онаяена.

Таким образом, динамика процессов ПОЛ и АОА при гипотермии у крыс в мозгу такая же как и в крови: повышается активность свободно-радикальных процессов при умеренной гипотермии, снижается при глубокой.

При гипотермии 20°С в белках мембран синаптосом общее количество sH-групп не изменяется, однако, содержание поверхностных тиоловых групп снижается на 13$, а скрытых - увеличивается на 36$. Перераспределение SH-групп указывает на возможные конфор-мационные изменения мембранных белков синаптосом при гипотермии. При низкой температуре отмечена тенденция к повышении досульфид-ных связей в белках.

Как при искусственной гипотермии, так и при гибернации количество SH-групп в мембранах синаптосом сусликов снижается, причем при зимней спячка снижение составляет 50$. Нужно отметить, что у сусликов при низких температурах тела количество как поверхностных, так и скрытых SH-групп снижается в одинаковой степени, поэтому их соотношение остаётся таким яв0 как у контрольных животных. Кроме того, при гипотермии и гнберкацви количество дйсульфидных связей в белках,по нашим данным, на изменяется.

На основании анализа SH-групп мембраны белков можно сделать следующие выводы. Во-первых, направленность изменений количества SH-групп белков мембран синаптосом крыс и сусликов при низких температурах тела совпадает с таковой в мембранах эритроцитов. Во-вторых, количественные изменения тиоловых групп в белках мембран синаптосом мозга крыс я сусликов при низких температурах тела противоположны. В-третьих, белки мембран синаптосом коры мозга у сусликов более устойчивы-к низкой температуре, чем у крыс.

Для выяснения влияния изменения бежевых я ляпадных компонентов мембран,'обнаруженные при низких температурах тела, на термокинетические параметры мембранных ферментов мы исследовали иа,К~АТФазу и АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга. Эти два фермента различаются по характеру встроенности в мембрану. ка,К-АТФаза пронизывает мембрану насквозь (Болдырев, 1985), а АХЭ является "эктофермэнтом" и располагается на наружной сторона бислоя (Brsin , 1984).

Активность на.К-АТФазы мы определяли при температурах выше (35°С) fi кахе (15°С) вочкк взлома на графике Аррениуса. Оказалось (табл. 2), что при гипотермии 20°С активность НаД-АТФазк синап-тосом крыс .снижается на 43 и 12$, соответственно, при температуре инкубации 35 я 150Со Яри пролонгированной (2 ч) гипотермии наблюдается дальнейшее снижение активности фермента (табл. 2)= Используя графики Лайнуивера-Барка, был?' рассчитаны максимальная скорость фермента и константа Михазлиса. При гипотермии снижается как 7И , так и Ки Нй.К-АТФазв.

Таблица 2

Влияние гипотермии 20°С на активность На,К-АТФазы (мкЧ Рд/мг/ч) мембран синаптосом головного мозга крыс (Hin; ях = 8)

Состояние животно ¡-^-ТЩОШШиШХУ&щщ, -

i 35 ; 15

Контроль 44,7^1.41 3,28%0,21

Гипотермия:

сразу 26,4±1„48* 2,89±0,24*

через 2 ч 23,9*2,42* 2,25*0„15*

Исследование температурной зависимости активности На.К--АТФазы показало, что при гипотермии 20 °С различной длительности позиция перегиба на кривой Аррениуса нэ изменяется (рис. 5). При гипотермии 20°С не изменяется ш энергия активации фермента, однако, при пролонгированной 2 ч гипотермии 20°С в низкотемпературной области кривой энергия активации возрастает на 26$.

Снижение температуры тела крыс до 20°С приводит к торможению (ка 21$) активности та¿же е АХЗ мембран свнаптосом. Продление (2 ч) состояния глубокой гипотермии не приводит к дальнейшему снижешь активности ферманта» Данные показали, что нрк гипотесмаи снижается максимальная скорость АХЭ, а сродство фермента ж субстрату при этом существенно не изменяется (та<5л.З).

Полученные результаты показали^ что у крыс при гипотермии 20°С и еа пролонгировании 2 ч не изменяется как позиция перегиба на кривой Аррениуса, так и энергия активации АХЭ. Учитывая неизменность позиции перегиба на кривой Аррениуса, энергии ак-

Г7

Рис. 5. Температурная завясжмость активности я а,К-АТФааы мембран сянаптосои хоры головноголгоага крнс: I - король; 2 - гвпотермня 2ОЧС; 3 - пшотер-

Табяицв 3

Влияние гипотермии на Тш (юй! АТХ/кг/ч) я Кв (&#) АХЭ ме»-. бран синаптосом эры больших полушарий мозга краю (И - а ;

п = 8) '

! Состояние животных ! ! 1 5 *ж ! и

Контроль 55,4*2,10 0,064^0,003

Гипотермия 20°С: 44,1±1.83*

сразу 0,060^0,002

через 2 ч 43 , 5^2 г 37* 0,069^0,002

тивацни и значения Кщ можно предположить, что свиханяэ активности АХЭ мембран синаптосом при гипотермии связано с уменьшением количества функционирующих молекул фермента.

1ь

Таким образом, при гипотермии у крыб снижается активность как на(К-АТФаэы, так и АХЭ мембран синаптосом, что может привести к нарушению генерации и проведения нервных импульсов.

У сусликов, в отличие от крыс, активность АХЭ мембран синаптосом п~ч глубокой гипотермии не только не снижается, а имеет тенденцию к повышений. В условиях дошей спячки повышение активности фермента достоверно (табл. 4).

Таблица 4

Влияние гипотермии и зимней спячки не активность АХЭ (мнМ АТХ/мг/ч) мембран синаптосом коры больших полушарий мозга сусликов (М 2 т ; п = 8)

Состояние животных I Температура инкубации, °С

! 37 8 10

Контроль 33,9*3,03 14,921,71

Гипотермия Ю°С 36,620,82 16,з1о,76

Зимняя спячка ■ 45,822,06* 17,921,60

При гипотермии и зимней спячке возрастает максимальная скорость АХЭ, но значение Кп не меняется. У сусликов с низкой температурой тела позиция перегиба на кривой температурной зависимс ти активности АХЭ смещается в низкотемпературную область. При этом энергия активации АХЭ возрастает у искусственно охлаждению животных на 37 и 28^, а у зимоспяащх на 41 и 74%, соответственно, бышз а ниже точки перегиба (табл. 5).

Таблица 5

Влияние гицотерши и зимней спячки на точку перегиба и энергию активации АХЭ мемсран синаптосом коры больших полушарий мозга сусликов (М £ я ; и -- 8)

С ост ояни~]Температура I Энергия активации, кдж/моль животных ¡излома, *(Г ; вше , ниаа

Контроль 26,3-0,66 12,12±0,71 25,6720,75

Гипотермия Ю°С 21,020,86 16,552о,В4* 32,7321,84*

Зимняя спячка 18,?2о,57 17,1420,50* 44,6021,92*

Смещение точки излома на графике Арраниуса и повышение

энергии активации АХЭ, видимо, связано как с изменением состава липидного микроокружения фермента, так и изменением давленая а бислое, т.е. за счет изменения цоверхностного натяжения биомвм-<5рани. Отношение холестерин/фосфолипиды регулирует как величину поверхностного натяжения, так и степень погружения мембранных белков в липидный матрикс (Jahnig, Bramholl , 1982). Имеющиеся литературные данные о влиянии липидных компонентов на активность АХЭ мембран синлптооом ( Tsakirie , 1985), а также данные об изменении липидного состояния мембран синаптосом сусликов при ги-бернации ( Robert et al., 1982; Demediuk, fioacatelll , 1903) дают основание полагать, что при зимней спячке оба вышеописан- • ныа механизмы регуляции активности фермента могут иметь место.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что низкая температура тела по разному влияет не активность и термокинети-ческае параметры АХЭ мембран синаптосом коры мозга крыс и сусликов. Эти различия, по-видимому, связаны с особенностями влияния температуры на мембранные белки и липады, а также на характер их взаимодействия.

ВЫВОДЫ

1. Глубокая (20°С) гипотермия крыс способствует усилению внутри-сосудастого а яврекисного гемолиза эритроцитов, что свидетельствует о дестабилизации мембран эритроцитов под действием низкой температуры тела. Аргинин, предварительно введенный животным, защищает эритроциты от окислительного гемолиза при последующей гипотермия.

2. Анализ продуктов ПОЛ (ДКС триены и кетодяены, МДА), АОА и активности антаокислитэльных ферментов (СОД, каталазы) крови крыс показал, что опасность интенсификации свободнорадикаль-ных процессов существует при умеренной (30°3) гипотермии. !ри глубокой гипотермии (20°С) интенсивность процессов ПОЛ.в крови снижается до уровня таковой у контрольных животных, а активность СОД и шаталазы снижается по отношению к контролю, соответственно, на 15% и 2Ь%. У сусликов при гипотермии Ю°С низкий уровень процзсеов ПОЛ в крови обеепечии-четан ожпчцшр!) ВЫСОКОЙ ЧКТИ'ШООТИ КСС*'{31>Ц1!?01> анттЧ(ЯСП0!Ч.'/|ЬНОЙ JKVli.ilfUwTll.

3. В гомогэнатах коры больших подуварий поэта крыс при гипотермии 30 в 20% исходный уровень ОСИ, оцениваемый по количеству МДА, не иамоняется. В тоже время активность спонтанного, ферментативного в нафермзнтапшвого ПОИ при умеренной гипо-терииш существенно увеличивается. При последующем углублении гипотермия (20°) активность процессов ГШ в мозгу остаётся, высокой, хотя несколько снижается относительно предыдущего этапа гипотермия. АОА. водорастворимо® фракции мозга, активность СОЯ в.катахаеы также возрастает при умеренной (30°) гипотермии в снижается при глубокой (20%). Таким образом, при гипотермии у крыс динамика процессов ПОЛ в мозгу сходна с таково! в крови,

4. Низкая температура тала (20°С) на влияет на содержание

3 Н-групп в балках и низксмолекужяршх тиолов плазмк крови крыс» В отличие от крыс у искусственно охлажденных летних бодрствуицих сусхикоз найдено снижение (на 29$) количества низкомсхзхухярннх тиолов в шшзмэ крове. Зимняя спячке приводит к почтк двукратно^ снижена» как белковых, так в небелко-внг» зБ-грушз плазмакрозя»

5. В бехках мембраа эритроцитов крыс гипотермия 20% вызывает увеличение (на 47£) количества двсухьфвдакх связей. При гипотермии 10% з мембранных балках эритроцитов сусликов происходи? перераспределение 3Н-групп с увеличением (на 75£) дели скрытых групп. Одновременно .на 59£ снксаэтся в количество ди-сушьфвдных саязей. В условиях зимне! спячка количество как поверхностных, так в скрытых ЗЕ-груш белков мембран эритроцитов снижается в 2 раза, а количество дксульфадных .связей

' а 3 раза, во отношению к летшы контрольным животным.

6. Пря гяпотерииЕ 20% в бедках мембран свнаптосом коры больших золушарй4 мозга жрве общее количество 3Н-групп не изменяется поверхностных моховых груш снижается на 13$, а скрытых -

- увеличивается на 36%. Как при искусственной гипотермии, так я ври гибернацвн количество всах БВ-групп белков мембран си-наптосом су слетов снижается, причем при спячке это снижение выражено сильнее (50%). При низких температурах тела у сусликов численное значение соотношения поверхностных 3Н-групп к скрытым в мембранах сннадтосом такое же, как у контрольных жи вотиых, что свидетельствует об устойчивости конформации мем-

бранных белков к яяэкой температура.

7. В условиях низкой (20°С) температуры тела обнаружено снижение активности На,К-АТФазы мембран эритроцитов крыс. Мочевина, введенная животным до охлаждения, не защищает фермент о? низкотемпературного подавления его активности. Обнаружено,, что при гипотэрмии гемоглобин оказывает, иигибярувдее влияние на активность иа,К-АТФазы мембран эритроцитов.

8. В условиях глубокой (20°С). гипотермии и„ особенно, при пролонгированной 2 ч снижается активность, максимальная скорость и Ки яаД-АТФазы мембран сянаптосом керн большие полушарий мозга крыо. При этом позиция перегиба на температурной нрявой на изменяемся, однако,, достоверно увеличивается энергия акт р.- . йаияш фермента в низкотемпературной области кряЕой.

9. ¡'ратковремзнная и пролонгированная 2 ч гипотермия 20° приводят к снигэяйю активноста в максимальной скорости АХЭ мембран синаптосом коры больших полушаряй мозга круо„ При этом не изменяется как точка перегиба на кравой Арренвуса, так и энергия активации фермента.

У сусликов при гипотермия 10°С активность АХЭ в мембранах синаптосом не только не сннжаатся, а насколько повышается. При- зимней спячке происходит повышение активности в максимальной скорости фермента* При низких температурах тела у сусликов позиция перегиба на кривой температурной .загисимости активности АХЗ смещается з область низких тэмпаратур к увеличивается энергия активации фермента как выше, так и ипяе точки перегиба.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ. ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кличханов Н.К., Халилов P.A. Влияние гипотермии на активность Яа.К-АТФазы мембран, эритроцитов крыс„ // Механизму зимней спячки СТаз. докл. Всес. симп„). Махачкала, 1990. - С. "6-57..

2. Сфиев Кличханов Й.К., Халилоа P.A., t Эм.чрбексв Э.З. Влияние зимней спячке на активность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов сусликов. // Механизмы адаптации животных а растений к экстрем, факторам среды. Тез. 6-й Ростовской оо'л4 научно-практ. школа-семинара. - Ростов-на-Дону, 1990, т. 2. --С.' 103-107.

3. Кличханов Н.К„, Сфиев АЛ,, Халилов P.A., Авшалумов М.В. Влияние зимней спячка на активность АХЗ мембран эритроцитов сусликов. // Биохимические аспект» холодовых адаптаций. - Харьков, 1991. - С. 62-67.

4. Кличханов Н.К., Халилов P.A., Сфвев A.A. Влияние гипотермии на мембраны эритроцитов. Усгохя совр. криобиологии (Тез. докл. 2-ой Мввд. хонф. >. - Харьков, 1992.

5." Львова С.П., Мейланов Й.С,, Кличханов Н.К., МусаевБ.С., Нурмагомедозе П.М.;, Халилов P.A., Гусейнов Г,0., Симмалавояг С. Особенности нейрохимических язменений при гипотермическах состояниях. (Тез. докл. 2-ой Медд. хонф„} - Харьков, 1992. - С. IÜ7-108.

6. Кличханов Н.К., Халилов P.A. Влияние гипотермии на активность АХЭ мембран санаптосом коры головного мозга крыс. Тез. докл. сими, стран содружества "Макро- я микроуровни организации мозга

в норме а патологии". - М,; НШ мозга РАМН. - 1992. - С. 76.

7„ Кличханов Н,К., Халилов P.A., Авшалумов М.В. Стабильность мембран эритроцитов при гипотермии 20°С и при введении мочевины и аргинина. Сб„ статей студентов, аспирантов я преподавателей ДГУ. Махачкала, 1992. - 0, 24-30.

8. Кличханов Н.К., Халилов P.A., Шюсварова H.A. Влияние зимней сеячхе к гипотермии на АХЭ мембран санаптосом коры головного мозга суслихов„ Тез. докл. научной кокф. "Организованный мозг". -М., НШ мозга РАМН, 1993» - С. 46.

с СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. AOA - антвокиолитвльная активность,

2. АХЭ - ацетйлхолинэоте^аза,

3. Д!К .-диеновые конъюгаты,

4. УДА - малоновый диальдегид,

5. ПОЛ - пврекисное окисление липидов,

6. СОД - суяероксиддисмутаза,

7. АТХ - ацйтвцтвохозин.

Форш-е 60x90 1/16. Заказ 1% 374. Тираж 100

Типография Дагестанского научного центра РАН 3670Т5, г.Махачкала, 5-й килгородок, корпус, 10