Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическая характеристика мембран эритроцитов при гипотермии и зимней спячке

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическая характеристика мембран эритроцитов при гипотермии и зимней спячке"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РСФСР ПО ДЕЛАМ НАУКИ И ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ

РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Специализированный совет К 063. 52. 09 по биологическим наукам

БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ГИПОТЕРМИИ И ЗИМНЕЙ

СПЯЧКЕ

На правах рукописи

СФИЕВ АГАМУРАД АГАБУБАЕВИЧ

03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Росгов-нз-Дону 1221

Работа ¡шгголнгка яз кафедре 6:-гоаПп:к п бкоф;гзк";: и с проблемкой научно-исследовательской лаборатории нейрохимнн Дагестанского государственного университета, ,

Научный руководитель: доктор биологических наук, чл.-корр. АЕН РСФСР,

профессор Эмирбеков Э. 3.

'Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Шепелев А. П.

(Ростовский медицинский институт)

доктор биологических наук, профессор Шугалей В, С. (Ростовский государственный университет)

Ведущее учреждение: Дагестанский^ государственный медицинский институт

&1» О/НС О 1991 года

анализированного совета К 063.52.0

Защита диссертации состоится

ла.

часов на заседании специализированного

____. >.09 по

биологическим наукам в Ростовском государственном университете (344711, г. Ростов-иэ-Дону, ул. Энгельса, 105, РГУ, биолого-почвенаый факультет, ауд. 304).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РГУ (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан

'1991 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, доктор биологических наук

В. Н. КИРОИ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Использование метода гипотермии б экспериментальной биологин и практической медицине основано на снижении низкой температурой общей метаболической активности организма, что защищает органы и ткани от гипоксии (Петров, Гус-лер, 1961; Мешалкин, Верещагин, 1985). Вместе с тем, кару с:;;;:*, гомойотермпв сопряжено с возникновением патологических сцькгоь в физиологических, физико-химических процессах.

Несмотря на то, что вопросы влияния на организм общего охлаждения изучены довольно подробно (Петров, Гуоле?,1961; Мае-страх, 1975; Волколаков, Лацис, 1978; Тимофеев, IS83; ЬмирСеков, Львова, 1985; Сумбатов, 1985 и др.), молекулярные механизмы, ле-аащае в основе развитая гипотермии, до настоящего времени окончательно не выяснены.

В современных представлениях о механизмах влияния гипотермии на организм центральное место отводится нарушению структурных компонентов мембран (Белоус, Бондаренко, 1982; Тимофеев, 1983; Шепелев и др., 1984; Эмирбеков, Львова, 1985; Гулевекий н др., 1988). Однако мембраны прз низкой температуре изучены либо в модельных опытах, либо в условиях глубокого замораживания.

Для исследования влияния гипотермия на структуру мембран наиболее удобным объектом являются эритроцита (ЧеряицкиЯ, Воробей, 1981; Леонова, 1987). Одним из чувствительных тестов, характеризующий изменение структуры мембран в целом является устойчивость эритроцитов к кислотному гевдлатику. О степени стабильности эргтроцитаряой мембраны а уровне вкутрпсосудистогс гемолиза иожяо судить такие по концентрации свободного гемоглобина в плазме крови.

Прз анализе влияния гипотермии на характер балок-дкпидких взаимодействий в иекбраяе гажяое значение имеет изучение интегральных мембранных белков. Одним из такьх белков-ферментов является ацетнлхоляяэстераза (АХЭ). Активность фермента в мембранах в значительной степени зависит от состава липидясго кикро-окруаакая ( Heger, 1979; В1оЗ et al., 1979; si ?rsncesco> Ътоб-boct, 1931). Исследование АХЭ важно тем, что являясь интегральным белком, она слузсит как-бы эоадом, характеризующий состояние всей

мембраны. Кроме того, АХЭ обладает сложным механизмом регуляции активности, особенности которого возможно, раскроются в экстремальной ситуации.

Оценка как патологических, так и адаптивных изменений, происходящих у гомойотермных животных при гипотермии, возмогла лишь б сравнении с данными, полученными у аимосдящих яивотных» Зи.'/кяя спячка яваяется уникальной моделью природной адаптация к низкой температуре тела, которая обеспечивается специальными механизмами метаболизма клеток (Aloia, ISSQ; Крепе, 1981; Wang , 1985; Ьмирбеков, Львова, 1985; Хочачка, Сомеро, 1988). Полученные фундаментальные данные при изучении механизмов зимней спячки могут Сыть положены в основу разработки методов создания искусственно пониженной жизнедеятельности, управляемой естественным:! резервными процессами регуляции.

Цель и задачи работы. Цель исследования состояла в сравнительном изучении стабильности эритроцитов и активности АХЭ мембран эритроцитов у крыс при глубокой гипотермии и у сусликов в динамике зимней спячка и пробуждения.

Основное внимание было направлено на решение следующих конкретных задач:

1. Исследование устойчивости эритроцитов к кислотному гемо-лмтику а уровня свободного гемоглобина в плазме крови крнс при кратковременной в пролонгированной 2 ч гипотермии 20°С, а такка ■ через сутки поело самосогревания.

2. Изучение устойчивости эритроцитов сусликов к кислотном? гешдатику в динамике зимней спячки и пробуздения.

3. Анализ ьляяния гипотермии на активность, кинетические параметры и температурную зависимость активности АХЭ мембран эратроцитов крыс при гипотермии 20°С и при её пролонгирования 2 *

4. Исследование активности, кинетических параметров а температурной зависимости активности АХЭ мембран эритроцитов сусликов з динамике зимней спячки п пробуждения.

Осяо?ннд положения. вуносиязе на зе^яту: I. Глубокал гипотермия (20°С) крыс приводит к дестабилизации мембран эритроцитов, оцениваемой по опакенаа резистентности эргтрецзтев к кислотному гекишткку и Еовыаенлэ урозля свободного гемоглобина в плазме крогн.

2. У сустиков по море удлинения срока зимне;: спячки повышается устойчивость чр.чтроцитов к кислотному гсмолитику. На фокс максимально сниженной реакции эрвтрона, увеличение резистентности направлено на удлинение срока кизки эритроцитов при глубокой зимней спячке.

3. Анализ влияния низкой температуры тола на активность, кинетические параметры и температурную зависимость активности АХЭ мембран эритроцитов крыс указывает, что пролонгированная 2 ч гипотермия 20°С угнетает активность фермента в большей степени, чем кратковременная гипотермия 20°С.

4. При зимаей спячке исследованные параметры АХЭ мембран эритроцитов сусликов коррелирует с функциональным состоянием животного, продолжительностью спячки и температурой тела кивот-кого.

Научная новизна. Настоящая работа является первым систематическим исследованием, направленным на сравнительное изучение стабильности мембран эритроцитов а активности мекбракосвязадяых ферментов при гипотермии и зимней спячке.

Установлено, что при общей глубокой гипотермии снижается резистентность эритроцитов я кислотному гемолитику а повка-енге уровня свободного гемоглобина в сыворотке крови крыс, что свидетельствует о дестабилизации мембран "эритроцитов.

Впервые изучена устойчивость эритроцитов сусликов к кислотно^ геыолатаку как в середине непрерывного. периода спячки, так а прз спонтанном пробуждении (бауты), а таю-в при различной длительности спячки. Полученные данные свидетельствуют о повыгьшш резистентности эритроцитов сусликов при углубления зимней спячка и постепенном ее снижения перед окончательны« пробужден:!?:,;.

Получен ряд новых экспериментальных данных о влиянии гипотермии 20°С на мембранную АХЭ эритроцитов крыс: снижение реальной активности, полное торможение активности при высоких концентрациях субстрата, снижение va и повышение Кц. , возрастание энергии активации. Обнаружено, что пролонгированная 2 ч гипотермия 20°С, в отлзгае от кратковременной гипотермии, сракоднт к существенному угнетению АХЭ.

Автором показано, что у сусликов изменение активности, кинетических параметров,-.температурной зависимости активности АХО

мембран эритроцитов связано с глубиной и длительностью спячки.

Чоучпо-иодкткческое значение работы. Проведенные исследования асетг «ову» информацию об изменениях в мембране эритроцитов ¡;р:; г:он:::?:ениа температуры тела, способствующая расширению наших зкячвй о механизмах патогенеза и адаптации гипотермии. Результаты рпсота могут быть использованы для разработки рациональных г.-> р косьекцп.и последствий принудительной гипотермии,

',"¡следование резистентности эритроцитов, уровня свободного глобина в плазме крови, активности АХЭ мембран эритроцитов бить использованы как тест для оценки глубины гипотерми-ческой патологии, также для отбора и определения эффективности протекторных веществ при этом. • .

диссертации является составной частью научно-асследо-кательслод работы Дагестанского госуниве^ситета, выполняемой в па:..:-ах Общесоюзной программы ГКНТ СССР 0.69.14 и Координационного плаа-ч АН СССР 2.28.4.7.5 и 2.28.4.7.6. Материалы диссертации используются в НИР кафедры биохимии и биофизики и проблемной лаборатории нейрохимии ДГУ и при чтении спецкурсов "Сравнительная биохимия" и "Биохимия животных".

Апробация работа. Материалы диссертационной работы доложены на итоговых научных конференциях ДГУ (Махачкала, 1987-1989), научно-практической конференции "Механизмы интеграции биологических систем. Проблемы адаптации" (Ставрополь, 1989), Объединенной научной конференции молодых ученых, специалистов и студентов "Медицинская наука- практическому здравоохранению". (Махачкала, 1990), 6-ой шксле-сеышаре "Механззкы адаптации живот-лих и растений к экстремальным факторам среды" (Ростов-на-Дону, 1?50), Всесоюзном симпозиуме "Механизмы зимней спячки" (Махач-139С), совместном заседании кафедры биохимии и биофизики V! Проблемой лаборатории нейрохимии Дагестанского университета С!ас.хач::а ла, 1891).

П'.'Сдпптяя результатов ясоледовч^я. По теме диссертации опубликовано 5 работ, 2 статьи находятся в печати.

Структур .и объёг расотн. Диссертация изложена кз 131 страницах галкнкеппсного текста и состоит из введения, обзорэ лптг-ратуры, описания катериьлов к методов исследования, результате?' собственных исследований в их обсукгсния, заключения к пт.-.-дог.

Работа содержит 24 таблицы, 13 рисунков, список псиользсга;;-ной литератур»; включает I9G наиг/енованиЗ, в то;/ числе 70 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ К ;>£Т0ДЫ ИССЛЕДСВАНМ

Эксперименты выполнены на I4D половозрелых беспородных белых крысах-сащах в на 142 малых кавказских сусликах (oiteiius pygsa-lus Pallas), отловленных в низменной части Дагестана.

Гипотермию крае вызывала е холодовнх какерах (Абдул.тзев, 1980), в рубанке которой циркулирует вода с температурой 4-5°С. Температуру тела животного снижали до 20-19°С равномерно в течение 60^5 мин. В отдельных сериях опытов достигнутый уровень гипотермии поддерживали в течение 2 ч. В отдельных случаях, после пролонгированной 2 ч гипотермии 20°С, крыс переносили в клетки с комнатной температурой зля самосогревания до 37°С. Zhbothkx Орали в опыт через одни сутки после самосогревания.

Для исследования состояния зимней спячки стлозлс-нных в кз<?-ише сусликов содержали в условиях вивария до глубокой осени, -В конце октября зверьков помещали в индивидуальные клетки и переносили в темную комнату с температурой 5-6°С. Исследования проводили при I- а 3-месячной загаей спячке, перед пробупдэнгс?'. после 6-та нес. спячка и через 10 дней после окончательного пробуждения от длительной (6 мес) зижей спячки.

Известно, что в течение всего периода зимией сиячкп суслик:: систематически пробуждаются через каине 10-15 дней Uang ,TSft5; Калабухоз, IS85). Основываясь на литературных и олегг.

собственных наблюдениях ж исследовали ппвотнвх в сс-.рглгго ¡-'t-r;;-равного цикла спячки сусликов, ваходяаахся в спччг.с- 3 1.г. г. довали сусликов после их споятаяяого прос-у.%геяия, Е гс*чегт: контроля использовали бодрствующих в летний период суслугов.

Еавотных, всех асслодуемых групп, засевали декапктыз-ей. Свободно вытекающую кровь собирали в пробирки с вктикоагулянто.ч [цитрат натрия или гепарин). Определение кислотной резистентное-

tiî эритроцитов проводили по методу И.А.Терскова и И.И.Гительзо-на (1957) с использованием 0,004 н соляной кислоты. Уровень свободного гемоглобина в плазме крови определяли по реакции с бея-згдпном (Касснрскяй, 1970). Тени эритроцитов получали с помощью г:-:поосмотического гемолиза по методу АЛЛ.Казенова и др. (1984). Активность AI3 в мембранах эритроцитов определяла по методу Элл- • мана ( £llmaa et al. , IS6I) в модификации 1>!.Н.1«аслово;1 и др. (1976). В качестве субстрата использовали ацетилтиохолин иодид г "онцектрациЕ 0,5 толя. Зависимость активности АХЗ от концентрации субстрата исследовали при S концентрациях ацетилтиохолина ксдида ? интервале 0,005-4,4 мыоля. Определяла температурную зависимость активности фермента при инкубации проб в интервале температур от- 5 до 37°С, через кандые 5°С. Активность АХЭ выражали в ь.кмоаях АТХ/мг белка/ч.

Полученные экспериментальные данные подвергали статистической обработке по методу малой выборки (Кокукин, 1975),

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖШИЕ

Кислотная резистентность аоитоопитов и уровень свободного гемоглобина в плазму крови кшс при гипотешии. .

Полученные наш данные свидетельствуют о том, что по.мере удлинения состояния глубокой (20°С) гипотерши снижается резистентность эритроцитов крыс к кислотному гемолитику. При этом время выхода основного пика уменьшается с 4,4*0,16 мин (у контрольных крыс) до 3,7*0,08 мин при пролонгированной 2 ч гьпо-термии 20°С (табл. I). При этом снижается количество повышенно-стойких эритроцитов на 38;?, а количество клеток с пониженной резистентностью возрастает в 2,6 раза по сравнению с контролем. Появление у этих животных на эритрограше второго максимума и '¡охранение длины ее правой ветви, видимо, свидетельствуют о наличии е сосудистом русле двух популяций эритроцитов с различны-свойствами.

Снижение резистентности эритроцитов, обнаруженное в динамику гидотзрави. чрреа сутки после самосогревания животных продол-■хас-тся. Эрм.; г ¡хода основного пика сокращается в 2 раза по ссав-

Таблица I.

Распределение эритроцитов крыс по группам стойкости к кислотному геколктику (в /К к обвему числу эритроцитов) при гипотержи 2СсС СМ - ш ; п = 10)

Группа стойкости ;

!3рег,-я ,'геколя-!за, г/ян

Состояние животного

•Контголь (Гилотер- {Пролонги-¡Через су;

;гхя ¡роваяная после

¡2 ч гипо-¡самосог-Iтермин ¡ревания

1 (

• Сферуляцион-нне изменения

0,5-2,5 ' 5,9*0,51 7,1±0,44 7,1±0;47 I2.lil.3i

Пониженно-стойкие 2,5-3,5 6,4±0,59 4,7^0,4^ 16,5^1,51/ 36.6i2.8E?

Средне-стойкие 3,5-5,0 30,0±1,34 40.9i3.0f 30,2-1,44 7,9-0, ВСГ

Повышенно-стойкие 5,0-7,5 17,3-1,50 И,9±1,1£ 10,7±0,70*10,7±0,7Й*

Высокостойкие. 7,5-9,5 . 5,7±0,34 е,4±0,27 6,0^0,46 I8.4il.es*

Сверхвысоко-стошсие Свыше 9,5 29,8-2,19 22,9-1,43 3i.7ii.5e 7,э^г,е]*

Бремя выхода основного пика,

КЕН.

.4,4±0,16 -3,8±0,18 3,7^0,08 ",2-0,

У/

Примечание. Здесь н на последующих таблицах звездочкой обозначены достоверные (Рс 0,05) относительно контроля различия.

ненню с контролем, длина превоа ветви эргтрограымы сокращается до 10 мин. На эритрограмме при этом отчетливо появляется второй максимум. У крыс после самосогревания в крови, количество понэтек-ностойких эритроцитов возрастает (в 6 раз), при одновременном снижении среднестойких (на 73,7?), повшенностойких (на 38,15) и сверосвысокостойких (йа 73,5$) клеток.

Таким образом, в динамике гипотермии и, в особенности, после самосогревания значительно снижается резистентность эритроцитов. За столь короткий период гипотермии невозможно предположить, что происходит внезапное старение эритроцитов. Снижение устойчи-ьости эр.:троцитоЕ к кислотному гемолитику при гипотермии, по-ви-днмсму, связано с физико-химическими изменениями в мембране клеток г.сд действием нлзкол температуры тела, особенно лвсидных компонентов (Лиячевская, Яонзратьева, 1932), которые, в основном,

,:г.еа;.'Т резистентность эритроцитов (Бриллиант, Воробьев, IX?; Апуховская и др., 1379; Леонова, 1957!.

Сджеапе стойкости эритроцитов, однако, еде кг означает, что при зтсм происходит гемолиз их в сосудистом русле (Сайкин, Тсродсв, 19Е£). Одной из критериев-, интенсивности гемолиза является уровень свободного гемоглобина б плазме крови (Турбина и др., ;27С; Кагарскиа, 197С).

Полученные кем-; результаты свидетельствуют о том, что сни-:.-:-5.-;гз томшерагуры тела у.июткых до состояния холодового "наркоза" прзводзт к резкому увеличению концентрации свободного гемоглобина в плазме крови. Ери зтсм количество гемоглобина возрастает в 3,4 раза (табл. 2). Уровень свободного гемоглобина в плазме при пролонгированной 2 ч гипотермии 20°С возрастает в 4,1 раза. Вместе с тем, через сутки после самосогревания у крыс, подвергнутых пролонгированной 2 ч гипотермии 20°С, концентрация свободного гемоглобина не только нормализуется, но и оказывается ни_т.е контрольного уровня.

Таким образом, при гипотермии и ее пролонгирование 2 ч устойчивость осяовно:' массы эритроцитов к кислоте падает. При .->тск, воз растает уровень свободного гемоглобина в плазме крови.

ме.чду эти:.:;; двумя процесса.'.-! нет прямой связи, т.е. с-...-•-.-.гие устойчивости клеток к кислоте еще не яьляетск причиной и.-: гу'сссео гемолиза. Повц^экие виутрисосудястого лазпеа зрпт-лгов, /.о -видимому, связано с другими параллельно здущю про-г. 06 это?.: свидетельству:-:)? каин даише, полученные через . доело оагоссгрегзаяя крыс, перенесших пролонгированную 2 ч .•;т-.тс-рг„аэ ;<огда дальнепсео сник-ееие стойкости эритроцитов ц© ■!сг.ровссг'даьтся возрастанием уровня свободного гемоглобина в ..лазмо у ров;:.

"з£-~стко, что ар;-. сЕ2:«.енк2 температуры тела наблюдается

Таблица 2.

Уровень свободного гемоглобина е плазме крови крыс при гг.1:стерм::к {II -т ; п = 8)

Группа животных К, 1 {концентрация гемогло- ) в Я"

Контроль 9,3^0,43 100

Гипотермия 2С°С:

сразу 31,5-1,81* ззе,7

через 2 ч 40,1-2,5? ' 431,2

Через I сут после е,4±0,54

самосогревания 6Ь,8

спазм сосудов и повышение периферического сопротивления крови (Волколаков, Лацис, 1977). В то не время при низкой температуре увеличивается вязкость липидов мембран (ЧерницкиЗ, Воробей, 1981). Эта обстоятельства, возможно, затрудняют прохождение эритроцитов через узкие капилляры и способствуют повышению степени внутрйсосудистого гемолиза.

При гипотермия в эритроцитах обнаружена активация процессор перекиского окисления липидов (Василькова, Кухта, 19Ь6; .'.гнчэь-скея, Кондратьева, 1989). Перекиси и продукты их распада, окисляя ненасыщенные гарные кислоты мембранных липидов, приводят к увеличения проницаемости мембран эритроцитов (Атауллахеков и др., 1986; Биленко, 1359). Углубление этого процесса псиводит к лизису клетки. Существенное значение в стабильности эритроцитов -имеет изменение химического состава плазмы крови при гкпотер;.:п» (Тимофеев, 1981; Гурин, 1986; Эмярбеков, Львова, 1555).

Вышеуказанные Факторы, вызывающие гемолиз эритроцптог пр-' гипотермии, отсутствует в постгапотерий«е,зко;й пергодр. Сднаг.о, изменения в мембране клетки при снижении температуры тело ьяс?:'.«-* ко существенны, что остаются и б блн-.айшем постггшотер'.ачеекок периоде.

■ На основании полученных наш данных по резистентности эритроцитов к кислотному гемолитику и степени внутрасосудистого гемо-'лиза можно прийти к выводу, что глубокое снижение температуры те-

ла гомойотермного животного приводит к дестабилизации мембран эритроцитов.

Для оценки вышеприведенного материала, мы исследовали зимо-спя^их -ивотных (сусликов), для которых снижение температуры тела б 3"KKi:ü период является условием их выживания ( Wang, 1985; дэлз.'ухов, 1585).

'•::с:-.-тняя резистентность эритроцитов сусликов при or-q-Kft к псобгглен:»;.

Сопостзрлекзе эратрогра^ы бодрствующего летом (контрольного) суслика и крысы показывает (табл. I, рис. I), что эритро-i'P'i.-.r-'a суслика почти симметрична îî~ вдвое короче, чем у крысы. 3гмоода осйовного лика у суслика составляет 3,9^0,15 мин в о'т.-.ич;:^ с с 4,4^0,16 :.:ак у крысы. Основную группу эритроцитов £гдсстьун~его суслика составляют средяестойкие эритроциты и в :•;.с гг. »иеотного отсутствуют внсокостойкие и сверхвысокостойкие клеток.

Исследование устойчивости эритроцитов к геыолитику показало, что в течение первого месяца зимней спячки наблюдается смещение эритрограммы вправо с вершиной уяе на 4,8^0,26 млн. Продолжительность гемолиза при этом увеличивается до 9 мин. В крови гиберкируодих животных происходит перераспределекие популяции эритроцитов:'количество среднестойких клеток снижается на 27,8 а повнаенностойкях возрастает на 43,0$ по сравнению с контролем. При месячной спячке в крови сусликов обнаруживается небольшая i^oyr.izü зысокостойких эритроцитов, отсутствующая у контрольных

Ир;-, спонтанном пробуждении сусликов, находящихся в спячке Г. :-:;я.г1, кзчостбсйны.'; состав эритроцитов подвергается дальнейшим (р:;с. I).

"?р»э 3 чесяц: после впадения сусликов в спячку правый •• ярэтрогрегл» усажЕьется. У "т.еотных, находящихся в глу-,

i-сугЛ ь-с-~;"ег::зясЛ сг.ячке (через 5-7 дней после последнего

•.г.слтаьасгс r.poúy-дения), время выхода основного пшга на эрптро-псяходктсч ка 5,6^0,13 мин. 7 этих «ивотных количество к. :• ■ r.í ' о с т ок : ü к соедкйстойках эритроцитов снляается, соотзетст-•j5.:.-.q, Cí.S'r a €Q,¿2, а ¿йв^енчостслких, наоборот, всзрестает, .ífi¡:..tí-;to, в Z раза. Такая же тенденция сохраняется у сусликов и

2010-

I 2 3

середина спячки середина спячки перед пробуждением

"1-1 I I I—Г—1—Г-1

Т-1—I—I—I—1—I—I—I

I3579I 357913

1—1—I—I—1—I—i—!—I

7 9

Э,*

20 10

спонтанное пробулданне

спонтанное пробуждение

iiiiiiiri

через Ю дней после пробуждения

1 I I I I I I г 1

111111111 1357913 57913579

Рис. I. Динамика кислотных эрятрограич сустаков прп цикле гибернация-пробуздение: I - месячная спячка; 2 -3-х месячная спячка; 3 - £-та месячная спчч::и. 'Сплошная линия - контроль; прерывистая - опкт.

лра периодических спонтанных пробужденкях.

Перед пробуждением спящих в течение £ мес сусликов

а у С

iJTV::-

вость эритроцитов к кислотному геколитвку снижается, г>;\~?.'д выхода основного пика сокращается до 4,4*0,13 ьжн. По;; ptoi.; в irrer;; увеличивается волзчество пон:'.женкссто;1к1;х (ка 31,"%) г с;--зд>->"— стойках (на 13,8:?) эритроцитов. Парад:егьпо слг.-.-.1<отс<5 ;t,T"} количество BOBuaoHiiocToiiKi.x эритроцитов. У ыа г- кгпг Еыоокостойкке эр/.троцити.

Мы не обнаружили иоргалкзоуи: эрагрегрзкм; у су о. г иг,: • г с через 10 дней после окончательного пробугсдыгая от л."'"тг. зишеЗ спятеи. На эритрограмке у этих тшвотнкх с'иэрут^'^ся два максимума (на 3 п 5 кин). И это, видимо, свицетельстпует о наличии в крови двух популяций эритроцитов и об упилосчог; обновлении кле:ок красной крови после выхода из зимней спячке.

Установление», что в период спячки активность костно-мсзго-вого кроветворения значительно снижается (Колаев, Андреещева, 1975).При этом эритрон переведен на максимально экономный режим. Очевидно, в этих условиях повышение устойчивости эритроцитов имеет адаптивное значение и направлено на удлинение срока жизни клеток.

Повышение стойкости эритроцитов достигается, по-видимому, в результате изменения как метаболизма эритроцитов, так и перестройки структурных компонентов в.мембране. В период зимней спячки четко прослеживается перестройка липадного состава мембран сусликов: возрастает количество мононенасьтан.ных жирных кислот, меняется соотношение холестерин/фосфолипиды (Дапинский, Левретдинова, 1987).

Таким образом, в условиях глубокой зиыней спячки, когда все .метаболические процессы в организме резко .снижены, устойчивость эритроцитов возрастает, что свидетельствует"о наличии у зидаспя-цих киеотных специальных механизмов, обеспечивающие функционирование клеток при низкой температуре тела.

Метод кислотных эритрограмм позволяет оценить состояние мембраны эритроцита в целом (Леонова, 1987). Для оценки реакции белковых компонентов эритроцитарной мембраны на искусственное а естественное снижение температура чет животных мы исследовали мембранный фермент - АХЗ. Данный фермент является интегральным мембранным белком (Heger , 1979), активность которого зависит от состава и фазово-структурного состояния лилидного микроокру-женкя ( Bloj et al. , 1979; Di France sic о , Brodbeck , 1981) и, таким образом, служит как-бы зондом,'характеризующим состояние определенных участков мембраны,

Влияние гипотермии на активность апетчлхолинэстеоазы мембран эритроцитов крыс.

Полученные нами данные по определению активности АХЗ в мембранах эритроцитов показывают, что при гипотермии 20°С суиествен-но не ыеяя&тся активность фермента при температуре инкубации как 37°, гак и 20°С (табл. 3). У крыс в состоянии пролонгированной 2 ч гипотермии 20°С наблюдается тенденция к снижению активности ЛХЭ мембран эритроцитов.

Таблица 3.

Влияние температуры инкубации на активность АХЭ (мкмоль АТХ/мг/ч) мембран эритроцитов при гипотермии Ш - а ; а = ю)

----------------"Г Группа животных i ! i Температура инкубации

37°С | 20°С

Кентсоль 49,5-1,08 40,6±0,94

Гипотесмся 20°С:

сразу 49,9^1,16 42,1±0,83

через 2 ч 47,4^-1,24 35,3-1,51

Анализ начальных скоростей реакции гидролиза ацетилтиохо-лина (АТХ) ферментом показал, что при всех изученных состояниях и температурах инкубации зависимость скорости реакции от концентрации субстрата носит гиперболический характер. Пра этом связывание субстрата с ферментом происходит некооператЕвно, поскольку во всех случаях коэффициент кооперативностз Хилла (пц) близок к единице.

Исследование активности АХЭ в широком интервале концентраций субстрата (от 9'Ю-6 до 4,4"Ю-3М) показало, что субстратное торможение фермента, характерное для интактяых зсявотннх, обнаруживается и у охлавденянх крыс (рис. 2). Вместе с тем, при пролонгированной 2 ч гипотермии 20°С при температуре инкубации 37°С наблюдается полное торможение активности АХЭ пра высоких концентрациях АТХ. Нужно отметить, что в динамика гипотермии дря температуре инкубации 20°С, е отлична от 37°С, имеет место плавное торможение активности фермента избытком субстрата (рас. 2).

В области физиологических температур (37°С), когда липидное микроокрунекие фермента находится в жидком состоянии (Черницкий, Воробей, 1981), полное торможение активности АХЭ высокими концентрациями субстрата при пролонгированной 2 ч гипотермии 20°С, видимо, связано с конформашонными изменениями в самой молекуле фермента. Изменение пространственной конфигурации фермента под делствием низкой температуры тела происходит в напревленш усиле-

Рис. 2. Зависимость активности АХЭ (мкдаль АТХ/мг/ч , ось ординат) мембран эритроцитов крыс от концентрации ацетилтиохолияа (ось абсцисс) при гипотермии: а - контроль; б - гипотермия 20°С; в - пролонгированная 2 ч гипотермия 20°С; г - через I сутки после самосогревания. Температура инкубации: I -37°С; 2 20°С.

иия тормозного эффекта избытка субстрата.

Используя координаты Лайнуивера-Берка (Корниш-Боуден, I97S), нами былв вычислены квиетические параметры {Уш и К^) АХЭ мембран эритроцитов при гипотермии (табл. 4). Полученные результаты свидетельствуют о tow, что при гипотермии повышается значение V АХЗ, т.е. возрастает скорость превращения фермент-субстратного комплекса. Через сутки после восстановления температуры тела крыс значение V- фермента остается повышенной. При гипотермии, а также через сутки после самосогревания снижается сродство субстрата к ферменту, на что указывает возрастание значения Ка АХЗ.

Таким образом, по нашим данным гипотермия изменяет кине-

Таблица 4.

Влияние температуры инкубации на 7а (мкмоль АТХ/мг/ч) I Кд (ммоль) АХЭ мембран эритроцитов крыс при гипотермии.

Группа зшвотных !_Дг_^

! 37 °С | 20°С • 37°С ! 20°С

Контроль 59,4 42,9 0,072 0,056

Гипотермия 20°С:

сразу 35,2 51,7 0,111 0,091

через 2 ч 71,1 46,6 0,101 0,083

Через I сут после

самосогревания 81,5 46,4 0,110 0,079

гнческие характеристика исследуемого фермента, прячем это находит своё отражение и в постгппотермическом периоде. Изменение кинетических свойств АХЭ мембран эритроцитов при гипотермии, возможно, происходит как в результате прямого действия низкой геыпературы на молекулу фермента, так и модификации ее различите ^ункционатытах групп. В регуляции активности АХЭ значительную роль играют окружающие ее лилида ( В1оЗ е-ь , 1574; 2зак1г±з » [985). Исследование температурной зависимости активности кем-5ранкых ферментов в определенной мере способствует гыяснвнзв характера белок-липидянх взаимодействий в мембране (Зегал-Соггав! , !1е1еа=1 , 1979; Болдырев, 1985).

Показано, что у контрольных крыс на графике Арренауса обнаруживается излом активности АХЭ эритроцитов при температуре 20°С [табл. 5). При гипотермии 20°С а ее пролонгировании 2 ч перегиб на

1 рафике для АХЭ сохраняется, а температура излома существенно не вменяется.

По нашим данным, прл гипотермии 20°С существенно не меняется шергия активации фзрмектатиЕной реакции. Однако, при аролояги-хжйнной 2 ч гипотескии 20°С наблюдается некоторое повышение ?яег>-'ии активации как выше, так и ниже точки перегиба.

Таким образом, только пролонгированная 2 ч гипотзруая ока— )ывае™ существенное влияние на АХЭ эритроцитов. Прл этой происходит полное торьюкенпв активности А1С? от язбиттд субстрата г»

Таблица 5

Влияние гипотермии не температуру излома и анергию активации (ккал/моль) АХЭ мембран эритроцитов крыс

Группа животных ¡Температура | Энергия активации

¡излома, С ! I 1 ! выше излома ; ни.че излома

Контроль 20,0 2,21 5,79

Гипотермия 20°С:

сразу 20,7 2,02 5,34

через 2 ч 21,8 2,82 6,23

области температур выше излома на кривой Аррениуса, значительно изменяются Ут и К и фермента. Кроме того, через сутки после восстановления температуры тела кивотных резко изменяются кинетические параметры АХЭ. Эти данные дают возможность предположить, что при пролонгированной гипотермии происходит изменение конфор-мации фермента в результате модификации функциональных групп как в ходе снижения температуры, так и при ее пролонгировании.

Для сравнения и оценки полученных результатов по определению активности АХЭ мембран эритроцитов крыс при гипотермии № исследовали этот фермент у сусликов в динамике зимней спячки.

Активность ацетилхолинэстерззы мембран эритроцитов сусликов при зимней спячке в цикле спячка-бодрствование.

Ео нашим данным (табл. 6), активность АХЭ (температура инкубации 37°С) мембран эритроцитов сусликов имеет тенденцию к снижению при спонтанном пробуждении животных после 3-х мес. зимней спячки и перец выходом из 6-ти мес. спячки. При более низкой температуре инкубации (Ю°С), близкой к температуре тела спящего животного, активность фермента после первого месяца спячки возрастает на 70% по сравнению с таковой у контрольных сусликов, а по мере удлинения срока спячки ее активность постепенно возвращается к контрольному уровню.

Таким образом, более существенное изменение активности фермента (при низкой температуре инкубации) наблюдается в течение

Таблица 6.

Влияние температуры инкубации на активность АХЭ (мкмоль АТХ/мг/ч) мембран эритроцитов суОликов при зимней спячке (М^а ; п = 8-10)

Состояние животных 5 Температуру инкубации •

! 37 °С ' S Ю°С

Контроль ЗСй.а-ГС.'Й' 154.9^,58

Спячка I мес. .. 308,7^5,23 268,4-9,98 *

Спячка 3 мес. • 310,2^3,37 182;0-5,Зв *

Спячка 3 мес., спонтанное пробуждение : 278,6*5,81 167,8*4,04

Песзд пробуждением ет'б-ти'мес. спячки I 265,3*12,94 147,6*4,681

Через 10 дней после полного пробуждения от 6 мес. спячка 313,3*6,43 151,615,14

I - температура инкубации 15°С.

первого месяца зимней спячкл^'- Возрастание активности .1X3 при этом, видимо, яе связано с увелиедяйём' количества фермента при спячке, т.к. в этсм случае активнойть-'фермента возрастала бы и при пературе инкубации 37°С. '• ~

При исследовании собстратной зависикостп активности ЛХЭ нами обнаружен«?, что максимальная активность о^ермента проявляется з присутствии 1,1 ымаля АТХ (рис. 3). Прячем, зто характерно зэк для температуры инкубации 37°С, так и Ю°С (или 15°С) в дляамлке зимней спячка. Далы-э-Плеэ повышение концентрата субстрата резко угнетает фе рента тиЕнуа активность (рис. 3). Субстратное торможение, характерное для контрольных -мгастккх, обнаружено тззже и з состоянии глусскоД зимне."! спячкс к при пробуждении ст нее. Ну?-'яо ответить, что ц исследованных состояниях яря температуре нрк?ба— аил Ю°С (15°С) используемая нами высокая концентрация субстрата (4,4 м&оля) зе подавляет активность чанного фермента (ргс. 3).

У яонтролышх сусликов, тякяв как и у кркс, злписямссть :гп-ОКОрССТ" ГИДрОХЯЗЗ ATX (ieOiCUTCM от кенцеятрпттзй суйстпп-

7л -''"г ггпсс^сллчвсккл x'";tj^'г6с пгп , i [- ' ' '}/'

v.

зосГ

20Cf IOO^

V.

зосГ 200; ioo;

I ыес.спячка контроль

^ , .

спячка

|~i—■—г

-2 -I

3-х мес.спячка спячка

/ \

спонтанное пробуждение

6-tz мес.спячка, пробукекие начало

/у

"I—'—I——Г"

через ю .дней

i—•—г -2 -I

О I is[s]

Рис. 3 Зависимость активности ацетилхолинэстеразы

(мкмоль АТХ/мг/ч, ось ординат) мембран эритроцитов сусликов при зимней спячке от концентрации ацетилтиохолина (ось абсцисс). Температура инкубации: I - 37°С, 2 - Ю°Й (2*-15°С).

и Ю°С. Такой характер завискшсти не меняется в динамике зимней спячки. Коэффициент Хилла при изученных состояниях близок к I. Полученные данные по определению кинетических параметров

( Vffi, Кв) АХЗ показывают, что при температуре инкубации 37 С значение

Тс фермента в динамике зимней спячки подвергается не-

значительным колебаниям. Лишь при низкой температуре инкубации (Ю°С) у сусликов, находящихся в спячке I мес., наблвдается повышение скорости превращения ферыент-субсгратяого комплексе.

при зимней спяч-В

При температуре инкубации 37 С значение Ки ке и пробуждении от неё меняется незначительно, состоянии зимней спячки значение Кп АХЭ при температуре инкубации, соогветствугацая температуре тела спящего животного (Ю°С), на 20-25? ниже по сравнению с таковой у бодрствующих сусликов.

Таким образом, в состоянии зимней спячки увеличивается сродст-4 во субстрата к ферменту.

Исследование температурной зависимости активности АХЭ мембран эритроцитов показало, что по мере снижения температуры инкубации с 37 до 5°С постепенно падает и активность фермента. Наиболее низкие значения активности АХЭ при спячке характерны для сусликов перед выходом из длительной спячки. Анализ температурной зависимости активности АХЭ в координатах Аррениуса обнаружил у контрольных животных на графике излом при температуре 27,9±1,2°С (табл. 7). При зимней спячке и по мере её удлинения точка перегиба на графике смещается в область более низких температур. В то же время, при спонтанном пробуждении сусликов, находящихся в спячке 3 мес. и перед выходом из длительной спячки в зависимости от температуры тела меняется точка перегиба на графике температурной зависимости активности АХЭ. Однако, через 10 дней после окончательного пробуждения сусликов от зимней спячки на кривых температурной зависимости излом отсутствует.

Как видно по нашим данным (табл. 7), в начальный период спячки (I мес) энергия активации гидролиза АТХ ферментом возрастает лишь в высокотемпературной области кривой. При удлинения срока спячки энергия активации возрастает как выше, так я ниже точки излома. Наоборот, перед пробундением энергия активации достоверно возрастает только в низкотемпературной области кривой. Согласно теории развиваемой Иенигом (Jahnig , Breahall , 1982), смещение точки излома яа графике Аррениуса и изменение энергии активации фермента возможны как за счет изменения химического состава липидяого микроокружения белка, так и в результате изменения давления в бислое, т.е. за счет изменения поверхностного натяжения биомембран. Изменение поверхностного натяжения возможно за счет изменения содержания холестерина в мембране. При определенных соотношениях холестерия/фосфолипиды происходит вытеснение белков из липиднО'З матрицы, и степень их погруженности уменьшается, а, следовательно, уменьшается энергия взаимодействия белок-липид. Особенно это относится к полуутопленным белкам, к которым относится и АХЗ (Brsln at а1ъ 1983). В отличие от изменений химического состава локальных участков мембраны этот механизм может иметь генерализованный характер»

on ¿.ti.

Таблица 7

- ^.•ЭнеряшсакткваЦЕЕ.' (ккал/моль) температура излома :-:pr.5ux температурной зависимости активности Алс кгморая эритроцитов су.слЕкхж:,прг. зимнеС- спячке'- л ; п= 4-8)

Груша''животных jТекпер'&тура Знезгкя актквацм:. -кал

- • ■•• - ■ -излома,.. С- ■ : Н1ае g3J;0..s

Контроль. • -.27,9*1,20 - 1,-43*0,13 3,18*0,10

Спячка.I мес. 19,4*0,29*' 11,84*0,08* 3,07*0,10

Спячка 3 мес, . 15,7*0,41* --2,15*0,10* 3,86*0,16*

Спячка 3 мес., ;-

спонтанное про-- , - .- •. ,

буздение- 23,0*0,55. .1,80*0,11 3,35*0,11

Перед пообувде-

нием от 6—те мес. * ' ~ ;—;' . *

спячки - 20,8*0,62 , - 1,69*0,10 3,63*0,03

Через 10 дней . - ,. .

пс^ле окончатель- .

ьогс пробуждения'- нет 1 ' 2,58-0,03

О

Имеющиеся литературные данные.о,влияние лвпидных компонентов мембраны на активность АХЭ ( Bloj et al. , 1974; Di Frsnceako , Brodbsck , 1931; Тагаиовач к др.,- 1985), а также данные об изменении лшшдного состава мембран эритроцитов сусликов в диязтке зимней спячки Цапинский, Кевретдинова, 1987) дают основание полагать, что при зимней спячке оба вышеописанных механизма регуляции активности фермента могут иметь место.

Анализ полученных нага результатов показывает, что наиболее заметные изменения в активности АХЗ.эритроцитов наблюдаются Б течение первого месяца зимней спячка. При этом повышается активность фермента, возрастает скорость превращения фермент-субстратного комплекса к сродство субстрата к ферменту, значительно снижается температура, при которой наблюдается перегиб на кривой температурной зависимости активности, остаётся неизменной энергия активации в низкотемпературной области кривой. Наоборот, перед пробуждением животных от длительной спячки эти же параметры в большинстве случаев меняются в противоположную сторону. Видимо, в начале зимней спячки все вышеперечисленные изменения в актив-

носта АХЭ направлены на углубление состояния спячки в результате интенсивного гидролиза ацетилхолина в плазме крови, а в конце спячки - на выход сусликов из гибернации. Направленность этих изменений, по всей вероятности, имеет адаптивный характер.

Сравнительный анализ полученных нами экспериментальных данных по изменению биохимических показателей мембран эритроцитов (резистентность к кислотному гемолитику, уровень внутрисо-судистого гемолиза, кинетические характеристики ацетилхолинэс-теразы) при гипотермии гомойотермов (крыс) и гибернирующих гете-ротермов (сусликов) позволяет заключить, что указанные изменения у крыс отражают гипотер'мическую патологию.

ВЫВОДЫ

1. При гипотермии 20°С у крыс наблюдается снижение резистентности эритроцитов к кислотному гемолитику. По мера пролонгирования гипотермии наблюдается нарастание количества свободного гемоглобина в.плазме крови крыс. Однако, через I сут. после самосогревания после перенесенной гипотермии содеряаняо свободного гемоглобина в плазме крови падает при резко сниженной устойчивости эритроцитов

2. В отличие от искусственной гипотермии (у крыс), у сусликов углубление и удлинение зимней спячки приводит к повышению устойчивости эритроцитов к кислотному гемолитику. Перед про-бундением сусликов от длительной зимней спячка резистентность эритроцитов приближается к контролю. Однако, через 10 дней после пробуждения животных полной нормализация эрзтрограгасы не происходит.

3. Исследование АХЭ мембран эритроцитов крыс показало, что лишь при пролонгированной 2 ч гипотермии 20°С наблюдается тенденция к снижению активности фермента при температура инкубации как 37°, так и 20°С. При этом наблюдается полное торможение активности АХЭ от избытка субстрата при температуре инкубации с/

4. При гипотермии 20°С а ее пролонгировании 2 ч повышается скорость превращения фермент-субстратного комцлокса (7 ), которая тенормализуется через сутки после дальнейшего самосогрозянуя. Одновременно возрастает значение К АХЭ.

5. Гипотермия 20°С и ее пролонгирование (2 ч) не влиякт на позицию перегиба на графике температурной зависимости активности АХЭ эритроцитов. Энергия активации АХЭ при гипотермии 20°С имеет слабую тенденцию к сникению, а при се пролонгировании 2 ч возрастает.

С. У сусликов активность АХЭ при температуре инкубации 37°С существенно не меняется как при зимней спячке, так и при пробуждении. При более низкой температуре инкубации (10°С), близкой к температуре тела спящего кпвотного, активность фермента после I мес спячки возрастает на 7С% по сравнению с таковой у контрольных сусликов. По мере изменения срока зимней спячки активность АХЗ эритроцитов постепенно возвращается к контрольному уровню.

7. Субстратное торможение активности АХЭ (температура инкубации 37°С), характерное для бодрствующих сусликов, обнаруживается такяе и при глубокой спячке и пробуждении от неё. В условиях же температуры инкубации 10°С высокая концентрация АТХ (4,4 ммоля) не подавляет активность АХЭ.

8. При температуре инкубации 37°С значение Vm фермента в динамике зимней спячки подвергается незначительным колебаниям. Лииь лри температуре инкубации Ю°С у сусликов, находяпдахся в зимней спячке I ыес, наблюдается повышение VB АХЭ. Значение К^ фермента, измеренное при температуре 10°С, во время зимней спячки снижается.

Э. При зимней спячке точка перегиба на графике Аррениуса смещается в область низких температур в зависимости от периода гиберкации.

В начальный период спячки (I мес) энергия активации гидролиза АТХ ферментом возрастает лишь в высокотемпературной области кривой. При удлинении зимней спячки ее значение возрастает как выше, так и ниже точки излома. Перед пробуждением от зимней спячки энергия активации АХЗ эритроцитов сусликов возрастает только в низкотемпературной области кривой.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кличханов Н.Х., Сфиев A.A. Влияние гипотермии па активность ацетнлхолинэстеразы в срезах мозга. // Важнейшие теоретич. и практич. проблемы терморегуляции. Тезисы докл. П Всес. конф. -Минск, I98C. - С. 126.

2. Клнчхаяов Н.Х., Сфиев A.A., Гусейнов Г.О. Активность ацетилхоликэстеразы мембран эритроцитов при снижении температуры тела. // Механизмы интеграции биологич. систем. Проблема адаптации. Тез. докл. науч.-практич. конф. молодых ученых. -Ставрополь, 1989. - С. 66.

3. С^иез A.A., Кличхаясв К.К. Устойчивость эритроцитов к кислоте при зимней спячке. // Объединенная науч. конф. молодых ученых, специалистов и студентов "Медицинская наука - практическому здравоохранению". Тез. докл. - Махачкала, 1990. - С. 375.

4. Сфиев A.A., Хличханов П.К., Халилов P.A., Эмирбеков 3.3. Влияние зимней спячки на активность ацетидхолаяэстэрази мембран эритроцитов сусликов. // Механизмы адаптации животных я растений к экстремальным факторам среды. Тез. 6-й Ростовской областной научно-практич. школы-семинара. - Ростов-на-Дону, 1990, т. 2. -С. 106-107.

5. Кличхаяов Н.К., Сфиев A.A. Ацетплхоляяэстераза мембран эритроцитов при искусственной и естественной гипотермия. // Механизмы зимней спячка. Тез. докл. Всес. симпозиума. - Махачкала, 1990. - С. 54-551

6. Кличханов К.К., Сфиев A.A., Хадилсв P.A.» Авшалуыов М.В. Влияние зимней спячки на активность ацетллхолияэстеразы мембран эритроцитов сусликов. // Биохимические аспекты холодоешс адап-тйцпЙ. - Харьков, I9SI. - С. G2-G7.

7. Зкирбеков Э.З., Сфиев A.A., Кличханов Н.К. Исследование устойчивости эритроцитов при гипотермии. // Проблемы криобиологии (в печати).