Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрические и структурные параметры эритроцитов в криозащитных растворах, содержащих полиэтиленоксид

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кочережская, Ирина Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизмы криоповреждения и криозащиты

1.2. Электрические параметры биологических объектов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Электрические параметры суспензии нативных эритроцитов

3.2. Реакция эритроцитов на контакт с растворами ПЭ0-1500, хлористого натрия и сахарозы

3.3. Реакция эритроцитов, экспонированных с различными концентрациями ПЭ0-1500, на возвращение в изотонические условия

3.4. Экспериментальная проверка гипотез о связанных с осмосом причинах повреждения эритроцитов.

3.5. Электрометрическое исследование модели процесса кристаллизации физиологических сред.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Электрические и структурные параметры эритроцитов в криозащитных растворах, содержащих полиэтиленоксид"

Современное состояние криобиологии характеризуется повышенным интересом к исследованию процессов, протекающих на всех этапах низкотемпературного консервирования биологических объектов, поскольку разработка новых методов криоконсервирования уже не может проводиться на уровне интуитивного подбора сред и условий замораживания-отогрева, а должна опираться на четкое понимание механизмов криоповреждения и криозащиты.

Однако, несмотря на многолетнюю историю, вопрос о ведущих факторах, определяющих жизнеспособность замороженного биологического материала, остается открытым. 8то связано с одновременным протеканием различных процессов, реализуемых в замораживаемом биоматериале, со сложностью в реальных условиях исключения какого-либо из факторов с целью изучения действия остальных. Установленные причины повреждения клеток при низкотемпературном консервировании все еще остаются предметом дискуссии и число их продолжает увеличиваться.

К нерешенным актуальным проблемам криобиологии относится создание метода низкотемпературного консервирования эритроцитов, при котором перед трансфузией не нужно удалять из суспензии криозащитную добавку [12,92] . Все разработанные до настоящего времени способы низкотемпературного консервирования отдельных фракций периферической крови человека неудовлетворительны по той причине, что на завершающем этапе требуют проведения трудоемкой дорогостоящей стерильной операции отмывания от криопротектора, что не позволяет использовать их в ординарных условиях и проводить трансфузию в широких масштабах [92] .

Хотя применяемые криопротекторы, как правило, физиологически мало токсичны, это не исключает процедуру отмывания, так как контакт деконсервированных клеток с нормальной физиологической средой приводит к гибели большого количества клеток за счет постгипертонического лизиса [25,204-] .

Теоретический анализ процессов массопереноса в предельном случае не проникающих через клеточную мембрану веществ приводит к выводу, что чувствительность клеток к постгипертоническому лизису в этом случае должна снижаться [4-2] . В связи с этим при разработке способов низкотемпературного консервирования эритроцитов, не требующих удаления криопротектора из суспензии перед трансфузией, большие надежды связывались с применением в качестве криозащитных агентов не проникающих в клетки высокомолекулярных полимеров и, в частности, полимергомолов полиэтиле-ноксида с молекулярной массой от 1000 до 4-000 [92] . Однако, до сих пор эти надежды не оправдались. Одним из препятствий явилась опасность накопления в организме реципиента высокомолекулярного .полимера при массивных трансфузиях, что снижает допустимую дозу и приводит, в конечном счете, к необходимости частичного удаления криопротектора из суспензии эритроцитов до переливания [38,92] .

Кроме того, вопреки теоретическим прогнозам, оказалось, что применение высокомолекулярных веществ в качестве криопротек-торов не исключает повреждение деконсервированных клеток при контакте с изотонической средой [б?] . Это обстоятельство резко снижает эффективность и целесообразность внутривенного введения деконсервированной эритроцитарной массы без предварительного отмывания даже в сравнительно небольших количествах.

В настоящее время стало очевидным, что трудности, возникшие на пути к безотмывочному варианту низкотемпературного консервирования эритроцитов, могут быть преодолены лишь в результате всестороннего изучения реакции эритроцитов на контакт с растворами не проникающих через клеточную мембрану веществ и выявления механизма повреждения клеток в результате этого воздействия.

Целью настоящего исследования является изучение электрических и структурных параметров цитоплазмы и мембраны эритроцита при циклическом изменении состава окружающей его среды: физиологическая среда - раствор не проникающего через клеточную мембрану криопротектора ПЭО-1500 - физиологическая среда.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить электроспектроскопические характеристики, структурную целостность и динамику изменения формы эритроцитов на этапе экспозиции с растворами ПЭ0-1500 различной тоничности.

2. Изучить электроспектроскопические характеристики, структурную целостность и динамику изменения формы эритроцитов в процессе одно- и многоступенчатого удаления криопротектора из суспензии.

3. Изучить влияние ПЭ0-1500 на электропроводность и вязкость консервирующих сред.

Для достижения цели исследования и для решения поставленных перед нами задач наиболее эффективными и адекватными явились электроспектроскопические методы исследования, поскольку они позволили изучить параметры среды суспендирования и клеток в исследуемых условиях без дополнительной фиксации материала, что особенно важно при изучении слабых взаимодействий. Использование этих методов дало возможность оценить состояние мембраны и внутреннего содержимого эритроцитов на этапе экспозиции с криопротектором в условиях с различной концентрацией ПЭ0-1500 и ионов Na .

Сложность изучаемых явлений, влияние на результаты экспериментов большого числа параметров обусловили необходимость независимого измерения параметров, характеризующих статус клеток, с помощью других, более традиционных методик. Для оценки сохранности клеток привлекали фотоколориметрический метод определения свободного гемоглобина в суспензионной среде, метод измерения концентрации эритроцитов в камере Горяева, пламеннофото-метрическое определение концентрации ионов натрия и калия в суспензионной среде. Изменение формы эритроцитов изучено методом фазово-контрастной микроскопии, а также определением среднего диаметра эритроцитов по модифицированному методу Паппен-гейма. Микровязкость цитоплазмы эритроцитов оценивали по подвижности спинового зонда в цитоплазме на ЭПР-спектрометре. Физико-химические свойства растворов ПЭ0-1500 исследовали измерением электропроводности и вязкости сред, поверхностного натяжения и поверхностной активности ПЭ0-1500.

Примененный впервые комплекс электроспектроскопических методов позволил всесторонне исследовать электрические параметры эритроцитов и консервирующих сред на этапе экспозиции с криопротектором, обнаружить особенности взаимодействия эритроцитов с ПЭ0-1500 в случае присутствия в криозащитной среде ионов натрия. Исследование электрических параметров суспензии нативных эритроцитов впервые показало, что результат криоконсервирования может быть улучшен за счет выбора степени разведения суспензии с криозащитной средой с учетом исходных характеристик суспензии: для суспензий с исходной удельной электропроводностью ниже 0,27 См/м замораживание-отогрев приводит к минимальному повреждению эритроцитов при разведении суспензии с 20 ПЭО-1500 в соотношении 3:1, а при более высокой удельной электропроводности - в соотношении 1:1. Впервые показано, что по мере увеличения концентрации ПЭ0-1500 в криозащитной среде результат замораживания-отогрева эритроцитов все слабее зависит от плотности клеток в замораживаемой суспензии. Таким образом., понятие об оптимальной концентрации криопротектора в криозащитной среде не является абсолютным, а зависит от других режимных параметров консервации. Получено экспериментальное подтверждение неправомочности определения показателей сохранности замороженной-отогретой эритромассы без отмывания ее от криопротектора. Комплексное исследование электрических и структурных параметров эритроцитов впервые показало, что присутствие в криозащитном растворе ПЭ0-1500 ионов натрия сенсибилизирует эритроциты к постгипертоническому лизису.

Проведенные исследования обосновывают целесообразность применения высокомолекулярных полиэтиленоксидов в качестве криопротекторов для разработки эффективного способа низкотемпературной консервации эритроцитарной массы, не требующего проведения трудоемкой операции отмывания от криопротектора перед трансфузией. Электроспектроскопические исследования суспензии эритроцитов при циклическом изменении состава окружающей клетки среды могут быть использованы в лекционных курсах для студентов биологических факультетов, специализирующихся в области биофизики. Материалы диссертации по электрометрическому исследованию модели процесса кристаллизации физиологических сред вошли в монографию "Низкотемпературная кристаллизация в биологических системах", 1977 г.

Основные положения диссертации опубликованы в открытой печати в 9 научных работах и докладывались на 5 Всесоюзных и областных конференциях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Максимальную сохранность эритроцитов, ( 75,0 * 3,0) после цикла замораживание-отогрев с учетом потерь при возвращении в изотонические условия обеспечивает 40 $-ный водный раствор ПЭ0-1500 при разведении с эритроцитарной массой в отношении 1:1.

2. Форма эритроцитов, электрические и структурные параметры определяются как осмотическим давлением, так и составом внешней среды при неизменном осмотическом давлении.

3. Сохранность эритроцитов на этапе экспозиции с ПЭ0-1500 не коррелирует с объемом обезвоженных клеток и со скоростью изменения их объема, но становится зависящей от этих параметров при отмывании деконсервированных эритроцитов.

4. Присутствие в растворе ПБ0-1500 ионов натрия сенсибилизирует эритроциты к постгипертоническому лизису.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I.I Механизмы криоповреждения и криозащиты.

Важнейшей задачей криобиологии является раскрытие механизмов криоповреждений и криозащиты биологических структур и разработка на этой основе методов консервирования, обеспечивающих длительное сохранение жизнеспособности биологического материала [87] .

Наиболее перспективным в настоящее время признано консервирование биологических объектов при температуре жидкого азота (-196°С), которое позволяет осуществить обратимую остановку жизненных процессов [10,86,88] .

Процесс замораживания до сверхнизких температур условно можно разделить на несколько этапов, различающихся физико-химическими условиями, в которых оказывается биологический объект, а, следовательно, и основными механизмами криоповреждений: I) охлаждение объекта до О °С; 2) охлаждение от О °С до зоны фазовых переходов; 3) замораживание до полного затвердевания системы; 4) охлаждение затвердевшего образца до -196 °С.

Важной характеристикой процесса замораживания биоматериала является скорость снижения температуры на каждом этапе.

Установлено, что быстрое падение температуры до О °С приводит к повреждению или даже гибели некоторых клеток ("температурный шок"), в то время как медленное их охлаждение в тех же температурных пределах практически безвредно [40,79,158,198] . Реакция клеток на быстрое охлаждение до околонулевых температур зависит от состояния клетки, предварительной обработки [145] , среды суспендирования [202] .

Экспозиция эритроцитов в гиперконцентрированных растворах при +25 °С приводит к повышению их чувствительности к температурному шоку [l58,I8l] , однако, более длительная экспозиция может повышать устойчивость клеток к дальнейшему охлаждению [l8l] . VSoolcjM' и WloviM [204] показали, что эритроциты подвергаются действию температурного шока и в гипертонических растворах сахарозы. Эритроциты, охлажденные от +25 °С до О °С в гипертонических растворах сахарозы (40 f вес/объем) и Ha.it (2,53 % вес/объем), повреждаются при ресуспендировании в изотонических растворах больше, чем контрольные, содержащиеся при постоянной температуре [I8l] .

Рядом авторов показано [145,I8l] , что повреждение мембраны клетки может наступить и при незначительных скоростях охлаждения до зоны фазовых переходов.

Несмотря на обширный экспериментальный материал, механизмы температурного шока остаются мало изученными.

TflCLffjWt- [ 168] считает, что этот процесс вносит относительно небольшой вклад в общее криоповреждение при скоростях охлаждения, больших оптимума, но особенно важен, если клетки сморщены до замораживания большими концентрациями непроникающих добавок. В то же время и Штл [131] придерживаются мнения о весомости вклада температурного шока в повреждение клеток при замораживании.

Дальнейшее понижение температуры приводит к кристаллизации свободной воды, внеклеточной, а затем и внутриклеточной. Развивающиеся при этом физико-химические процессы оказывают наибольшее влияние на сохранность клеток.

Мнения различных исследователей по поводу основной причины криоповреждения разделились. ^мЧоск. [15б] основным повреждающим фактором считает гиперкондентрации солей, образующиеся при вымораживании воды, которые оказывают лиотропное действие на клеточные мембраны. Изучая действие концентрированных растворов электролитов на эритроциты человека, он пришел к выводу, что разрушающее действие их связано со способностью растворять наиболее важные составные части клеточной оболочки, в особенности липиды и липопротеиды [159] . Им установлено, что высокая концентрация хлорида натрия (0,8 М) делает оболочку эритроцитов проницаемой для катионов, а еще более концентрированные соли (3 М) разрушают структуру клетки.

Возражение У(\оЛЖ [168] против гипотезы fs/btioch. , что криоповреждение эритроцитов связано с мембранным эффектом, заключается в несоизмеримости времени, необходимого для проявления такого эффекта, с временами, реализующимися в опыте. С другой стороны, эритроциты начинают гемолизировать приблизительно при той же температуре замораживания, находясь в растворах других солей и даже неэлектролитов [177] .

В ответ на предположение, что этот эффект можно объяснить повышением концентрации внутриклеточных солей до губительных величин, [177] показал, используя обедненные по калию клетки, что повреждение не связано с концентрированием внутриклеточного калия, а имеет осмотическую природу.

Причиной повреждения не может быть удаление воды из клеток, поскольку эритроциты, в которых клеточная вода на 50 % замещена глицерином, гемолизируются при таком же относительном объеме, как и незащищенные [174] .

Птат [173,175] предположил, что повреждение связано с осмотичностыо суспензионной среды в большей степени, чем с характеристиками или абсолютной концентрацией растворенных веществ. В основе повреждения в гиперосмотических концентрациях солей, по мнению W&^tio^ [ 175] , лежит неспособность клетки уменьшить свой объем после достижения некоторого "критического объема", в результате чего она повреждается возникающим на мембране осмотическим напряжением.

Дж. Фарант [102] все же считает, что достижение минимального объема определяет только момент, когда происходит повреждение клетки, но механизм повреждения пока остается невыясненным.

Уменьшение клеточного объема до критического вызывает ряд физико-химических и биологических изменений, которые в той или иной мере отражаются на состоянии клетки (являясь обратимыми или необратимыми). Так, основываясь на ряде предположений о поведении белков при дегидратации клетки и о роли J>-J> связей, jjjtfdt [155] предполагает следующую гипотезу повреждения. В результате дегидратации клетки молекулы соседних белков сближаются, при этом между ними возможно образование связей, которые осуществляются либо за счет разрыва внутримолекулярных связей и соединения освободившихся -групп с аналогичными группами в соседней молекуле, либо просто путем соединения свободных -групп этих молекул. При оттаивании расто-яние между молекулами снова увеличивается. Существование межмолекулярных связей обуславливает при этом раскручивание этих молекул, то есть денатурацию.

В целом повреждение клетки прямо или опосредовано связано с образованием льда [160,161] . Для биологических объектов важное значение имеет наличие как внеклеточного льда, так и внутриклеточного.

Многими исследователями поддерживается гипотеза о том, что в случае внутриклеточного кристаллообразования клетки повреждаются в большей степени [58,127,163,169,182] .

В настоящее время накоплен обширный экспериментальный и "теоретический материал по изучению условий, необходимых для образования внутриклеточного льда. Общепризнано, что основным фактором, определяющим этот процесс, является скорость снижения температуры в зоне фазовых переходов [129] . Следует заметить, что само понятие быстрой и медленной скорости в данном случае является относительным и определяется свойствами биологического материала, а именно коэффициентом диффузии молекул воды через мембрану [24,165] , поверхностно-объемным отношением клетки [165] , упругостью клеточной мембраны [167] и осмотическим давлением внутриклеточного раствора [41] .

Определение области скоростей, при которых происходит внутриклеточное льдообразование, имеет важное значение для эффективного контроля за криоповреждением. УЮоДШ [165] разработал аналитическую модель, в которой вероятность кристаллизации клетки аналитически связывается со степенью переохлаждения, с геометрией клетки (поверхностно-объемным отношением), скоростью диффузии воды через мембрану и другими параметрами.

Согласно двухфакторной теории Tf\oJWi [153,166] , степень выживаемости клеток при замораживании до -196 °С существенно зависит от скорости замораживания. Для большинства клеток существуют некоторые оптимальные скорости замораживания, обеспечивающие больший уровень жизнеспособных клеток.

Однако физико-химические приближения, принятые в этой модели, не всегда выполняются в реальных биологических системах и наряду с экспериментальными данными, подтверждающими теорию WOJIWi [170,192] , есть результаты, противоречащие ей [128] .

Экспериментальное подтверждение получил тот факт, что как клетки млекопитающих, так и микроорганизмы, имеют двухфазную кривую выживаемости как функцию скорости охлаждения [153] , при этом численные значения оптимальных скоростей замораживания для разных клеток не совпадают.

Теория УАаДШ- имела большое значение. Она побудила криобиологов уделять больше внимания скоростям охлаждения и дала единую схему для интерпретации различных сообщений о повреждении при замораживании. Однако оказалось, что механизмы криопов-реждения и криозащиты сложнее, чем это представлялось в 60-е годы [190] .

Продолжает обсуждаться также вопрос о механизмах повреждения за счет внутриклеточного льдообразования. 'IPflQJJUtiti считает [169] , что повреждение, обусловленное этим процессом, является следствием непосредственного физического действия льда на внутриклеточные мембраны. ческие исследования показали, что изменения в мембранах эритроцитов наблюдались при наличии как внеклеточного, так и внутриклеточного льда, что автор объясняет сжатием мембраны изнутри и снаружи кристаллами льда, в результате чего в ней образуются отверстия. $CiR/lOt/bd [132] выдвинул гипотезу, согласно которой повреждение за счет внутриклеточной кристаллизации объясняется осмотическими эффектами, особенно при появлении воды во время льда вне и внутри клетки само по себе не губительно для нее.

Аналогичные данные получены плавления

156] также считает, что наличие

Несмотря на большой экспериментальный и теоретический материал, единой теории криоповреждения нет.

В настоящее время общепризнано, что эффективная защита от криоповреждения для большинства биологических объектов возможна только в присутствии криопротекторов [92] .

Исторически первым криопротектором, успешно примененным для замораживания эритроцитов, был глицерин [197] , отнесенный к криопротекторам эндоцеллюлярного действия [157] . По мнению ^"bttock. [157] , механизм защитного действия глицерина основан рена другими исследователями [169] .

Как правило [169] , криопротекторы эндоцеллюлярного действия сдвигают оптимум скорости охлаждения к меньшим значениям. Этот эффект связывают с увеличением вязкости клеточного содержи' мого и, следовательно, уменьшением скорости диффузии воды через мембрану [169] .

Показано [13,26] , что в присутствии глицерина уменьшаются количество и размеры, а также изменяется форма образующихся в клетке кристаллов льда, с чем, вероятно, связано криозащитное действие глицерина. связывает защитные свойства криопротекторов эндоцеллюлярного действия со способностью предотвращать осмотическое сжатие при замораживании.

Однако, в объяснении механизмов защитного действия эндоцел-люлярных криопротекторов возникли новые трудности в связи с появлением данных о наличии защитного эффекта этих соединений даже в том случае, когда они не проникают в клетку [171,172] . При этом, как только глицерин попадает в клетку, ее реакция на на его коллигативных свойствах. Гипотеза была расши

Исходя из гипотезы минимального замораживание и отогрев при тех же скоростях изменяется [171].

Механизм защитного действия криопротекторов экзоцеллюляр-ного действия остается также невыясненным. Они не проникают в клетку в связи с большим молекулярным весом, а их эффективная концентрация очень низка для проявления антифризных свойств [178] .

Наибольшее распространение получило представление о том, что криопротекция непроникающими соединениями связана с предотвращением или уменьшением повреждения клетки гиперконцентрированными растворами солей во время охлаждения [172] .

Коллигативное действие как эндоцеллюлярных, так и экзоцел-люлярных криопротекторов снижает вероятность внутриклеточной кристаллизации. При этом различие состоит в том, что криопротек-торы эндоцеллюлярного действия создают условия, при которых потеря воды клеткой происходит при значительно более низких температурах, что сокращает время нахождения клетки в концентрированных растворах, а криопротекторы экзоцеллюлярного действия осмотически вытягивают воду из клетки сразу же во время начальной фазы замораживания, когда эти вещества концентрируются во внеклеточном растворе [172] .

В качестве расширенной модели для понимания механизмов криозащиты fadfoi предложил многофакторную теорию [189,190]. Самой важной в этой теории является идея о биологическом взаимодействии криопротектора с мембраной. Повышение стабильности клеточной мембраны криопротектором является одним из факторов, повышающих устойчивость клеток к замораживанию-отогреву. Это подтверждается работами Скорнякова Б.А., Вишневского В.И. [96] , I[194] .

По мнению Wvupnam [176] , взаимодействие высокомолекулярных криопротекторов с элементами плазматической мембраны клеток обеспечивает стабилизацию нативной конформации макромолекул и тем самым предупреждает или смягчает деградацию мембраны при воздействии гипертонических сред.

Необратимое повреждение мембран при замораживании рядом авторов связывается с окислением сульфгидрильных групп белков до межмолекулярных дисульфидных связей [154] . В эти окислительные процессы, вероятно, вовлекаются гидроксильные радикалы ( *0Н ). Следовательно, удаление этих радикалов может внести вклад в криопротекцию. Экспериментальные данные подтверждают, что большинство исследованных криопротекторов (глюкоза, сахароза, метанол, этанол, ДМСО, диметилацетамид, глицерин, диметил-формамид и другие) хорошо связывают радикалы *0Н [180] .

Некоторые полимеры обладают способностью поддерживать структурированное состояние воды, характерное для биологических объектов, что, по мнению Пушкаря Н.С. и соавт. [91] , а также Ct^urtW- [119] , препятствует развитию процесса кристаллизации.

В последнее время синтезирован целый ряд защитных соединений производных оксиэтилена - полиэтиленоксиды (ПЭО) различного молекулярного веса - от 100 до 6000 и выше. Целесообразность использования этих соединений как криопротекторов обусловлена прежде всего тем, что эти соединения оказывают заметное структурирующее действие на воду клетки и являются относительно малотоксичными [88] .

В механизме криозащиты ПЭО, по-видимому, значительную роль играет способность этих соединений связывать воду, так как увеличение количества связанной воды, не участвующей при замораживании в образовании кристаллов, способствует ослаблению действия повреждающих факторов [71,90] .

Несмотря на наличие большого числа различных полимергомо-логов ПЭО, они, при всем их многообразии, обладают общностью физико-химических свойств [92] . Это обусловлено присутствием в молекуле полимера периодически повторяющихся оксиэтильных групп, которые являются основным структурным элементом ПЭО любой степени полимеризации. Количество звеньев и пространственное расположение их в молекуле определяют физико-химические свойства ПЭО [92] . Уже в (10 * 15) ^-ных растворах ПЭО при замораживании образуются аморфные структуры, а также происходит замедление процесса кристаллизации и значительное уменьшение размеров образующихся кристаллов. Кроме того, увеличивается тенденция к переохлаждению сред и заметно снижается температура начальной фазы их кристаллизации. В процессе кристаллизации ПЭО, концентрируясь в пространстве между кристаллами, разбавляет солевые растворы и не допускает образования высокой концентрации электролитов [39,89] .

Методами рентгеноструктурного анализа было показано [60, 89] , что ПЭО изменяют характер кристаллизации воды и размер кристаллов, образующихся в среде при замораживании и оттаивании.

Растворы ПЭО способны образовывать комплексы с металлами (JUm) Си, Со ), что приводит к понижению концентрации солей в среде замораживания [73] .

Криопротекторы ряда ПЭО способны связываться с белками, например, сывороточным альбумином быка [35] , существенно не изменяя его структуру, трипсином и ^-глобулином [72] . Эти соединения определенным образом влияют на физико-химические свойства микроокружения белков [30] , систему водородных связей, что приводит к изменению квантово-механического состояния хромофорных групп мембранных белков [29] .

В то же время отмечается реакционноспособность полиэтилен-оксидов по отношению к мембранным липидам [ 7] , причем степень взаимодействия определяется концентрацией криопротектора.

Полиэтиленоксиды специфически взаимодействуют с поверхностью мембран эритроцитов, уменьшая конформационную подвижность поверхностного слоя, что сопровождается нарушением белково-ли-пидных взаимодействий [36] .

Отмечается защитное действие криопротекторов группы ПЭО (400,4000) по отношению к мембранам эритроцитов, подвергнутых действию таких гемолитиков, как сапонии и 10 ный раствор хлористого натрия [114] .

Бойко Н.М. и соавт. [ 6] высказали предположение, что в клетках существуют как основные, так и переходные типы архитектуры поверхности мембран, причем некоторые из переходных типов (в частности, индуцированные криопротекторами) могут быть более устойчивыми к действию низких температур по сравнению с основными.

В целом же, имеющиеся в настоящее время данные о наличии взаимодействия высокомолекулярных криопротекторов с мембранами клеток не позволяют сделать однозначный вывод о защитном эффекте этого взаимодействия.

ПЭО, за исключением образцов с низкой молекулярной массой, по характеру взаимодействия с клеткой могут быть отнесены преимущественно к экзоцеллюлярным криопротекторам [92] .

Осмотическое поведение клетки в гипертонических растворах не проникающих через мембрану веществ описывается аналитически следующим выражением [27] : где

V - объем клетки; gB (V-V.)/V,j поверхностно-объемное отношение клетки; £ - модуль упругости мембраны; р- коэффициент фильтрации плазматической мембраны; if - осмотическое давление раствора.

Индекс "о11 относится к начальным значениям; " I " и "е" -соответственно к значениям внутри клетки и вне ее. Уравнение (I) выведено в приближении, когда:

1) относительное изменение объема I;

2) клетка находится в безграничной среде;

3) внеклеточная концентрация непроникающего вещества считается заданной.

Экспериментальное изучение кинетики изменения клеточного объема в гипертонических средах подтвердило справедливость соотношения (I) [59] . Процесс обезвоживания клеток сопровождается неоднородной деформацией клеточных мембран, они растягиваются в области впадин и сжимаются в области выступов. Следовательно, чрезмерное обезвоживание клетки может вызвать такие же эффекты, как и оводнение [59] . Поэтому исследование обезвоживания клеток высокомолекулярными криопротекторами чрезвычайно важно как для предсказания дальнейшего поведения клетки при охлаждении, так и для понимания механизмов криоповреждения.

Наибольшую криозащитную активность по отношению к эритроцитам человека проявили полимергомологи ПЭО молекулярной массы 01 1000 до 4000 [115] , в частности, ПЭ0-1500 [ИЗ] . Криоза-щитные свойства ПЭ0-1500 изучены еще недостаточно и описаны в единичных работах [35,59,66,76,78] .

В то же время, как невозможно использовать выводы об оптимальных условиях криоконсервирования, найденных для одного биологического объекта, для консервирования другого [43] , так, по-видимому, нельзя решать вопрос о ведущих механизмах криопро-текции применительно к разным веществам и по отношению к разным клеткам. Тем более, что проявление тех или иных защитных свойств криопротектора будет зависеть и от используемых условий криоконсервирования, таких как режим замораживания, концентрация криопротектора, концентрация клеток.

Таким образом, вопрос о механизмах защитного действия ПЭО-1500 по отношению к эритроцитам человека остается открытым. Выбор ПЭ0-1500 в качестве исследуемого вещества определяется не только задачами трансфузиологии, но и возможностью использования его для модельного исследования поведения эритроцитов в растворах непроникающих высокомолекулярных веществ.

В работе Гордиенко Е.А. и соавт. [25] подчеркивается, что успех низкотемпературного консервирования достигается, если на каждом его этапе учитывается предыстория образца, начиная с момента его получения. Особенности протекания процессов на любом этапе консервирования могут сильно сказываться на характере взаимодействия клетка - окружающая среда на последующих этапах цикла низкотемпературного консервирования. В полной мере это относится к этапу экспозиции эритроцитов с криопротектором.

В настоящее время в связи с открывшейся перспективой использования ПЭ0-1500 в качестве основного компонента криозащит-ных сред, не требующих удаления из эритроцитарных суспензий перед трансфузией, стал особенно актуальным вопрос о характере, обратимости и возможной защитной функции изменений, вызванных в суспензии добавлением криопротектора. Несмотря на несомненную важность, исследования в этой области проведены недостаточно широко.

Заключение Диссертация по теме "Криобиология", Кочережская, Ирина Александровна

ВЫВОДЫ

1. На этапе экспозиции эритроцитов в растворах ПЭ0-1500 с увеличением концентрации криопротекюра и уменьшением количества ионов Л/а увеличивается коэффициент поляризации и проводимость мембраны и уменьшается проводимость цитоплазмы эритроцитов.

2. При отмывании эритроцитов от плаз2лы физиологическим раствором хлористого натрия их преобразование из дискоцитов в эхиноциты сопровождается повышением устойчивости к гипотонии.

3. Форма эритроцитов во время экспозиции в растворах ПЭО-1500 определяется не только осмотичностью среды, но и наличием в ней ионов Nou , а также составом среды, в которой находились клетки перед добавлением криопротекюра.

4. Увеличение концентрации ПЭ0-1500 свыше 15 % приводит к подавлению эхиноцитоза.

5. На этапе экспозиции с ПЭ0-1500 сохранность эритроцитов не коррелирует с объемом обезвоженных клеток и со скоростью изменения их объема, но зависит от этих параметров на этапе отмывания деконсервированных клеток от криопротекюра.

6. В области концентраций ПЭ0-1500 в среде замораживания, меньших 20 % (об./об.), сохранность деконсервированных эритроцитов увеличивается при уменьшении концентрации клеток в замораживаемой суспензии; по мере увеличения концентрации ПЭ0-1500 до 40 fo результат замораживания все слабее зависит от концентрации клеток.

7. Для суспензий эритроцитов с исходной удельной электропроводностью ниже 0,27 См/м замораживание-отогрев приводит к минимальному повреждению клеток при разведении суспензии с

20 /£>-ным ПЭ0-1500 в соотношении 3:1, а при более высокой удельной электропроводности - в соотношении 1:1.

8. Максимальную сохранность эритроцитов, (75,0 * 3,0) после цикла замораживание-отогрев с учетом потерь при возвращении в изотонические условия обеспечивает 40 %-тж (об./об.) водный раствор ПЭ0-1500 при разведении с эритроцитарной массой в соотношении 1:1.

9. Присутствие в растворе молекул НЭ0-1500 стабилизирует значения электропроводности незамерзшей фазы консервирующего раствора за счет увеличения вязкости.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ В ПРАКТИКУ

1. Результаты исследований, касающиеся улучшения условий консервирования эритроцитов с ПЭ0-1500 и методики оценки сохранности деконсервированных эритроцитов, используются на Харьковской областной станции переливания крови (справка об использовании от 20 января 1984 г.).

2. Материалы диссертационной работы по электрометрическому исследованию модели процесса кристаллизации физиологических сред использованы в монографии "Низкотемпературная кристаллизация в биологических системах" (Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Иткин Ю.А., Вишневский В.И., Розанов Л.Ф. - Киев: Наукова думка, 1977. - 242 е.).

3. По результатам диссертационной работы опубликовано в открытой печати 9 работ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из важных этапов, обеспечивающих успешное криоконсер-вирование, является подбор концентрации криопротектора [19,113, 126 ] . С одной стороны, оптимальная концентрация криопротектора должна обеспечивать максимальную защиту клеток при замораживании суспензии [49,113,126 ] , с другой стороны - минимальные , потери при возвращении в изотонические условия [48,67] . Вывод о пригодности криопротектора определенной концентрации к консервации данных клеток может быть сделан только после проведения всего цикла консервации: изотоническая среда - экспозиция с криопротектором - замораживание - отогрев - возвращение в изотоническую среду. Кроме того, для оценки криозащитной эффективности разных криопротекторов и сред, на которых они приготовлены, необходимо сравнивать результаты криоконсервирования при оптимальных для каждого криопротектора концентрации и составе криозащитной среды.

В работах [5,66,92] было показано, что лучший результат замораживания эритроцитов получается при использовании ПЭ0-1500, приготовленного на дистиллированной воде. Нами установлено [48], что добавление в среду замораживания хлористого натрия в физиологической концентрации оказывает различное влияние на результат консервирования в зависимости от используемой концентрации ПЭО-1500. Добавление к концентрированной суспензии 15 % ПЭ0-1500 в соотношении 1:1 приводит к одинаковому результату замораживания эритроцитов в водном растворе П30-1500 и содержащем НоЛ* гемолиз (22,4 ± 0,2) % и (24,7 ± 2,6) Однако клетки, замороженные в присутствии хлористого натрия, переносят отмывание в этом случае лучше. При добавлении 40 %-ного ПЭ0-1500 наблюдается обратная зависимость. При близких результатах замораживания после возвращения в изотоническую среду лучшая сохранность достигается при разведении криопротектора дистиллированной водой: гемолиз (24,6 ±3,0) % при использовании ПЭО-1500, приготовленного на дистиллированной воде, и (75,0 - 10,0) $ для приготовленного на физиологическом растворе.

Сохранность эритроцитов при замораживании в больших концентрациях ПЭ0-1500 (свыше 20 $ в среде замораживания) слабо зависит от концентрации клеток в замораживаемой суспензии [49] . Наши данные качественно согласуются с результатами [126] по замораживанию бычьих эритроцитов в среде с ДМСО.

В области концентраций ПЭ0-1500 в среде замораживания, меньших 20 сохранность эритроцитов после замораживания-отогрева существенно зависит от концентрации клеток в замораживаемой суспензии [49] . Аналогичные результаты получены А.М.Воро-гилиным и соавт. [21] при использовании в качестве криопротектора ПЭО-4000 и Р^^ и соавт. [187] при использовании глицерина.

Для объяснения связи гемолиза эритроцитов после замораживания-отогрева с гематокритом были предложены различные гипотезы. З'Ьчиъиа Л. и J^ZL [126]считают, что увеличение лизиса при высоких значениях гематокрита происходит за счет увеличения вероятности повреждения эритроцитов формирующимися кристаллами льда, когда плотность клеток между кристаллами возрастает. Кроме того, возрастает вероятность их повреждения при ановысказал предположение, что этот эффект связан с более низкой теплопроводностью клеток по сравнению с плазмой. Однако, это не обнаружили, что высокие концентрации клеток повышают гемолиз, когда скорости охлаждения больше оптимальной и не влияют на уровень гемолиза при оптимальных или более низких скоростях. Связь между концентрацией клеток и другими факторами, проявляющимися во время замораживания, является сложной и требует дальнейших исследований.

Результат замораживания эритроцитов с низкими концентрациями ПЭ0-1500 (до 20 приготовленными на дистиллированной воде, зависит от исходных характеристик суспензии нативных эритроцитов, в частности, от их концентрации и электропроводности плазмы [19] . Это позволило использовать измерения электропроводности нативных эритроцитов для дифференцированного подхода к выбору концентрации ПЭ0-1500 и степени разведения суспензии с ним [19] . Для суспензий с удельной электропроводностью не выше 0,27 См/м лучший результат замораживания получается при использовании 20 fo ПЭ0-1500 в разведении 3:1, для суспензий с более высокой удельной электропроводностью - в разведении 1:1. Это обеспечивает оптимальные условия как по концентрации клеток и криопротектора в замораживаемой суспензии, так и по снижению осмотического градиента при перенесении эритроцитов в изотоническую среду.

Для понимания механизма защитного действия криопротекторов важное значение имеет выяснение изменений в клетках и среде, мальном контакте [183] . С другой согласуется с результатами которые вызванных добавлением криопротекюра, и их возможного защитного эффекта.

Поскольку показано [49] , что результат замораживания в одинаковых концентрациях ПЭ0-1500 эритроцитов, предварительно экспонированных с различными концентрациями криопротекюра, слабо зависит от концентрации ПЭ0-1500 во время экспозиции, можно предположить, что обнаруженные различия вряд ли связаны с необратимыми изменениями, вызванными в клетке криопротектором. При перенесении эритроцитов из раствора ПЭ0-1500 одной концентрации в раствор другой концентрации изменения в клетке соответствуют той концентрации криопротекюра, в которой она находится, и повреждением, обусловленным разностью осмотических давлений этих растворов. Исследование формы эритроцитов при отмывании от 11301500 (5 -г- 20) fo свидетельствует об обратимости изменений, вызванных в клетке криопротектором. Поэтому можно сделать вывод, что силы поверхностного взаимодействия молекул ПЭ0-1500 с мембранами эритроцитов слабы, и наиболее пригодными методами для исследования состояния поверхностной и внутренней фаз эритроцитов являются электроспектроскопические методы, позволяющие тестировать эритроциты непосредственно в исследуемом растворе криопротекюра без дополнительной фиксации [17,50] .

Коэффициент поляризации и проводимость мембран и электропроводность цитоплазмы эритроцитов, экспонированных в растворах ПЭ0-1500, определяются как концентрацией криопротекюра, так и составом среды, на которой он приготовлен [ 18,50] . Так, увеличение концентрации П30-1500 в суспензии приводит к росту коэффициента поляризации, причем в случае ПЭ0-1500, приготовленного на дистиллированной воде, увеличение составляет в среднем 90 а в случае ПЭ0-1500, приготовленного на физиологическом растворе - не более 30 % [50] . Увеличение Кд мембран эритроцитов свидетельствует о положительной адсорбции молекул ПЭ0-1500 на мембране, что приводит к ее утолщению за счет обволакивания эритроцита слоем из молекул полимера, либо за счет обратимого внедрения молекул ПЭ0-1500 в структуру мембраны. Если в качестве растворителя использован физиологический раствор хлористого натрия, взаимодействие молекул полиэтиленоксида с мембраной выражено в меньшей степени. Насыщение мембраны полиэтиленоксидом происходит при добавлении в суспензию 15 % ПЭ0-1500, приготовленного на дистиллированной воде, и 25 % - приготовленного на физиологическом растворе.

Увеличение проводимости мембраны в растворах ПЭ0-1500, приготовленных на дистиллированной воде и в 30 ^-ном ПЭ0-1500, при-, готовленном на физиологическом растворе, свидетельствует о том, что эти процессы сопряжены со структурными перестройками в мембране эритроцитов, не вызывающими потери ее целостности.

Известно, что изменения внутренней структуры эритроцита вызывают изменения структуры мембраны [147] , поэтому помимо изучения формы эритроцитов важное значение имеет выяснение состояния их цитоплазмы. Электроспектроскопическое исследование эритроцитов позволяет изучать состояние внутриклеточного содержимого без нарушения целостности мембраны [151,152] .

Показано, что степень и направленность изменений электропроводности цитоплазмы эритроцитов в растворах ПЭ0-1500 определяется концентрацией криопротектора, присутствием в среде ионов натрия, а также состоянием эритроцитов перед добавлением криопротектора, а именно - находились ли они в плазме или в физиологическом растворе [50] .

Установлено, что отмывание эритроцитов от плазмы физиологическим раствором хлористого натрия приводит к изменению коэффициента поляризации мембран эритроцитов и электропроводности цитоплазмы при неизменной проводимости мембраны.

Микроскопические исследования формы эритроцитов показали, что помещение эритроцитов в физиологический раствор приводит к обратимой трансформации дискоцит-эхиноцит. К возможным причинам этого перехода можно отнести снятие ряда белков с поверхности эритроцита при увеличении ионной силы среды [95] и нескомпен-сированность избыточного онкотического давления белков клетки при удалении плазменных белков [бЗ] . В пользу последнего предположения свидетельствует отсутствие шипов на поверхности эритроцитов при экспозиции с ПЭ0-1500, приготовленным на физиологическом растворе, в концентрации 15 % и выше. Возможно, высокомолекулярный полимер способен уравновесить давление белков клетки, в то время, как сахароза не обладает таким действием. Не исключено, что полиэтиленоксид предотвращает трансформацию формы эритроцитов за счет обволакивания клетки слоем из молекул полимера [75].

Специфика взаимодействия молекул ПЭ0-1500 с эритроцитами в присутствии ионов натрия, по-видимому, определяется не только изменением свойств клеток в физиологическом растворе [50,бб] , но и изменением физико-химических свойств молекул ПЭ0-1500, о чем свидетельствуют измерения вязкости, поверхностного натяжения и поверхностной активности ПЭ0-1500 в водных растворах и в присутствии ионов натрия. Меньшая реакционноспособность полиэти-леноксида при наличии в среде хлористого натрия по отношению к мембранам эритроцитов, вероятно, определяется комплексообразованием молекул полимера с ионами Nd+ [77] .

Наличие в растворе ПЭ0-1500 ионов натрия сенсибилизирует эритроциты к постгипертоническому лизису.

Одним из возможных механизмов криоповреждения представляется воздействие на клетки высокой концентрации электролита, возникающей при образовании льда в биологической системе. Так объясняется причина повреждения клеток при замораживании в класчается в связи с малым временем экспозиции клеток в растворах солей [168] . В работах Ф.И.Осташко [80] и исследованиях предположение о действии на клетки градиента осмотического давления в процессе замораживания, когда принципиально возможно значительное повышение осмотического давления и снижение его в фазе оттаивания.

Электроспектроскопическое исследование модели процесса кристаллизации консервирующих сред показало [47] , что электропроводность растворов электролитов по мере вымерзания воды растет, достигая максимума, соответствующего точке эвтектики [45]. В этом же диапазоне концентраций NdCt наблюдается и максимальный гемолиз эритроцитов. При вымерзании воды во время замораживания физиологических сред с криопротектором ПЭ0-1500 удельная электропроводность жидкой фазы изменяется незначительно. Присутствие в растворе молекул ПЭ0-1500 стабилизирует значения электропроводности незамерзшей фазы консервирующего раствора за счет увеличения вязкости [47] .

В низкотемпературной консервации представляет несомненный интерес выяснение роли в указанных процессах растворов криопро

157] . Лиотропное действие исклк* текторов, которые сами по себе обладают определенной осмотической активностью [114] . Результаты наших исследований показывают, что сохранность эритроцитов на этапе экспозиции с ПЭ0-1500 не коррелирует с объемом обезвоженных клеток и со скоростью изменения их объема, но становится зависящей от этих параметров при отмывании деконсервированных эритроцитов.

Множественность факторов, действующих на клетку при замораживании в сложных средах, включающих растворы криопротектора и различные добавки, не позволяет однозначно ответить на вопрос о вкладе каждого из изменений, вызываемых в клетке и среде крио-протектором, в общий механизм криозащиты. По-видимому, дальнейшее решение этой проблемы возможно только с использованием математического моделирования, учитывающего исследованные эффекты действия ПЭ0-1500 на суспензию эритроцитов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кочережская, Ирина Александровна, Харьков

1. Азаров Ю.К., Дубровин Э.Д. Устройства для получения электроспектроскопической информации о биологических объектах. -

2. В кн.: Радиоэлектронные приборы для биологических и медицинских исследований. М.: Медицина, 1966, с.30-46.

3. Андреев B.C. Кондуктометрические методы и приборы в биологии и медицине. М.: Медицина, 1973, - 335 с.

4. Бейтс Р. Определение рН. Теория и практика: Пер. с англ. -Л.: Химия, Ленингр. отд., 1972. 400 с.

5. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев: Наукова думка, 1982. - 256 с.

6. Белоус A.M., Шраго М.И., Пушкарь Н.С. Криоконсерванты. Киев: Наукова думка, 1979. - 200 с.

7. Бойко Н.М., Бондаренко В.А., Белоус A.M. Влияние криопротек-торов на свойства поверхности мембран митохондрий, определяемых по распределению в двухфазных водных системах. Биохимия, 1982, 47, вып.5, с. 773-777.

8. Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П., Белоус A.M. Взаимодействие полиэтиленоксидов с искусственными фосфолипидными и митохонд-риальными мембранами. Криобиология и криомедицина, 1978, вып.4, с. 7-9.

9. Букаускас Ф.Ф., Ветейкис Р.П. Пассивные электрические свойства атриовентрикулярной области сердца кролика. Биофизика,1977, 22, № 3, с.499-504.

10. Васильев П.С., Петрова МЛ. Физико-химическая структура эритроцита и ее изменения при действии гемолитических факторов (Сообщение 2-ое). В кн.: Вопросы биофизики, биохимии и патологии эритроцитов. Красноярск: Кн. изд-во, I960, с. 25-34.

11. Виноград-Финкель Ф.Р., Киселев А.Е. Актуальные проблемы замораживания крови. Проблемы гематологии и переливания крови, 1970, № 4, с.3-12.

12. Виноград-Финкель Ф.Р., Кудряшова С.В., Разумова Л.Л. Рентгенографическое изучение кристаллизации во взвесях эритроцитов при ультранизких температурах. Докл. АН СССР, 1966, 169, № 5, с. II84-II88.

13. Вишневский В.И. Электрометрия биофизических процессов в сперме быков-производителей при замораживании: Автореф. Дис. канд. биол. наук. Харьков, 1970. - 15 с.

14. Вишневский В.И. Электропроводность спермы быков как показатель активности спермиев. Сельскохозяйственная биология,1971, 6, № 6, с. 882-886.

15. Вишневсышй В.Й. Зв'язок м1ж електропров1дн1стю нативно1 сперми буга1в-пл1дник1в та II основними як1сними показника-ми. Молочно-м'ясне скотарство, 1971, № 26, с. 42-45.

16. Вишневский В.И., Кочережская И.А., Инютин Г.А. Электроспектроскопия некоторых криобиологических процессов. В кн.: Тезисы докладов I Всесоюзного биофизического съезда. Москва, 1982, 3, с. 221.

17. Вишневский В.И., Скорняков Б.А., Кочережская И.А. Электропроводность крови и ее связь с выживаемостью эритроцитов после замораживания. В кн.: Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических структур. Киев: Наукова думка, 1977, с. 12-14.

18. Воротилин A.M., Гучок М.М., Гучок В.М., Лоевский М.М. Сравнительное изучение эффективности криоконсервации эритроцитов под защитой 1,2-пропандиола ( Л -пропиленгликоля) и глицерина. Проблемы гематологии и переливания крови, 1982, № 10, с. 15-18.

19. Воротилин A.M., Манжелий В.Г., Данилина В.В., Гасан В.М. О механизме повреждения эритроцитов человека в растворах по-лиэтиленоксидов при низких температурах. Биофизика, 1969, 141 № 3, с. 575-576.

20. Гаврилов В.П. Исследование электрических свойств модельных систем с различными биологически важными веществами при охлаждении и низких температурах. Ученые записки Горьковско-го университета и ГНИИЭиМ, т.ПО, сер. биологическая, 1970, с. I5I-I53.

21. Гаврилов В.П. Физико-химические изменения при замораживании бактериальных суспензий. I. Анализ физико-химических изменений при замораживании модельных систем путем исследования электропроводности. Биофизика, 1971, 16, № I, с. 60-66.

22. Гордиенко Е.А. Количественный анализ механизмов криоповреж-дения и криозащиты при низкотемпературном консервировании биологических суспензий: Автореф. Дис. . канд. биол. наук. Киев, 1980. - 25 с.

23. Гордиенко Е.А., Бронштейн В.Л. К механизму лизиса. II. Приложение к криобиологии. В кн.: Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины. Киев: Наукова думка, 1974, с.15-18.

24. Гордиенко Е.А., Бронштейн В.Л., Козьмин Ю.В. Особенности внутриклеточной кристаллизации в эритроцитах. В кн.: Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины. Киев.: Наукова думка, 1974, с. 10-12.

25. Гордиенко Е.А., Иткин 10.А., Ишков Г.С. Кинетика обезвоживания клеток в п -компонентных растворах веществ, не проникающих в клетку. В кн.: Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических структур. Киев: Наукова думка, 1977,с. 14-16.

26. Гордиенко О.И. Критерии качества консервированной крови человека. II. Влияние исходного состояния крови на результат низкотемпературного консервирования. Мед. реф. журнал,1980, разд.18, № II, публ. II9I.

27. Грек A.M., Луговой В.И., Бондаренко Т.П. Влияние криопро-текторов на белковую флуоресценцию мембран эритроцитов человека. Криобиология и криомедицина, 1975, вып.1, с.42-45.

28. Грек A.M., Луговой В.И., Морозов И.А. Изучение люминесцентных характеристик клеток костного мозга при действии полиэтиленоксида. В кн.: Актуальные вопросы консервации и трансплантации костного мозга и крови. Харьков, 1972,с. 220-224.

29. Григорян С.С., Дамаскин Б.Б., Стенина Е.В., Иоселевич В.А. и др. О механизме эффекта Томса. Докл. АН СССР, 1979, 248, N2 5, с. 1074-1076.

30. Григорян С.С., Каменева М.В., Шахназаров А.А. О влиянии растворимых в крови высокомолекулярных соединений на гемодинамику. Докл. АН СССР, 1976, 231» № 5, с. 1070-1073.

31. Гулевский А.К. Влияние низкотемпературного воздействия на проницаемость мембран эритроцитов, реконструированных в средах различного ионного состава. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1981, № 5, с. 551-553.

32. Донскова Л.П., Поротиков В.И. Изменение сопротивления мембраны и миоплазмы мышечных волокон при длительном воздействии высоких температур. В кн.: Биофизика живой клетки. Вып.1. Пущино, 1970, с. 81-84.

33. Иванов JI.В., Гаврилова И.И., Моисеев В.А. Исследование действия низких температур и криопротекторов на белки различной структуры. В кн.: Механизмы криоповреждения и криоза-щиты биологических структур. Киев: Наукова думка, 1977, с.34.

34. Инструкция по клиническому изучению эритроцитов, замороженных в растворе полиэтиленоксида-1500. МЗ СССР. М., 1978,5 с.

35. Иткин Ю.А. Микроскопическое исследование процессов замораживания биологических объектов. В кн.: Актуальные вопросы консервации и трансплантации костного мозга и крови. Харьков, 1972, с. 26-29.

36. Иткин Ю.А., Гордиенко Е.А., Бронштейн В.Л. Физико-математический анализ механизмов криоповреждений и криозаидаты клеток. В кн.: Актуальные проблемы криобиологии. Киев: Наукова думка, 1981, с. 300-343.

37. Иткин Ю.А., Гордиенко Е.А., Бронштейн В.Л., Цуцаева А.А. К вопросу о быстром двухступенчатом замораживании клеточныхсуспензий. В кн.: Криоконсервирование иммунокомпетентной ткани. Киев: Наукова думка, 1979, с. I27-I3I.

38. Иткин Ю.А., Розанов Л.Ф., Гордиенко Е.А., Сагалов В.Л. Процессы кристаллизации при низкотемпературной консервации биологических объектов. В кн.: Механизмы криоповрежденияи криопротекции биологических структур. Киев: Наукова думка, 1976, с. 36-39.

39. Калугин Ю.В., Пашковская О.В. О взаимодействии криопротек-тора полиэтиленоксида с эритроцитами человека. Криобиология и криомедицина, 1977, вып.З, с. 79-81.

40. Клочко М.А. О связи между составами максимальной электропроводности и эвтектической точки в системах соль-вода. Докл. АН СССР, 1952, 82, № 2, с. 261-264.

41. Кочережская И.А. Электрометрические исследования модели замораживания физиологических растворов. В кн.: Вопросы криоконсервирования биологических объектов. Киев: Наукова думка, 1978, с. 53-56.

42. Кочережская И.А., Вишневский В.И. Влияние условий экспозицииэритроцитов с ПЭ0-1500 на результат последующего замораживания. Криобиология и криомедицина, 1983, вып.12, с.50-53.

43. Кочережская И.А., Вишневский В.И., Инютин Г.А. Влияние отмывания от ПЭ0-1500 на электрические параметры эритроцитов. -Криобиология и криомедицина, 1983, вып.13, с. 2Г-36.

44. Кочнев М.В. Электрический импеданс при экспериментальном отеке головного мозга. В кн.: Новое в клинике, диагностике и лечении различных видов нейрохирургической патологии, т.1, М., 1974, с. 126-128.

45. Кригер Ю.А. Исследования свойств стром методом электропроводности. Современные проблемы гематол. и перелив, крови, 1946, вып 22-23, с. 278-285.

46. Кригер Ю.А., Вайнсон А.А. Изменение электрического сопротивления эритроцитов при действии гамма лучей. Научные докл. высшей школы. Сер. биол. наук, 1963, Ш 4, с. 80-83.

47. Кригер Ю.А., Свердлова Е.А. Влияние гамма-лучей и вибрации на физико-химические свойства красных кровяных телец. -Докл. АН СССР, 1965, 160, Ш 3, с. 713-716.

48. Кригер Ю.А., Свердлова Е.А. Структура и свойства мембран нормальных и поврежденных кровяных телец. В кн.: Прото-плазматические мембраны и их функциональная роль. Киев, 1965, с. 108-123.

49. Кригер Ю.А., Свердлова Е.А., Вайнсон А.А. Изменение физикохимических свойств эритроцитов при нагревании. Научные докл. высшей школы. Сер. биол. наук, 1964, Н2 3, с. 76-81.

50. Кулешова Л.Г. Кинетика льдообразования в живых клетках и модельных системах: Автореф. Дис. . канд. биол. наук. -Харьков, 1983, 24 с.

51. Кулешова Л.Г., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Реакция клеток на гипертонические воздействия при криопротекции. Биофизика, 1982, 27, № 4, с.660-664.

52. Кулешова Л.Г., Моисеев В.А., Иткин Ю.А. Кристаллизация водных растворов некоторых криопротекторов. Криобиология и криомедицина, 1976, вып.2, с. 27-31.

53. Кулешова Л.Г., Розанов Л.Ф. Изучение кинетики взаимодействия эритроцитов человека с криопротекторами и солями. -Криобиология и криомедицина, 1980, вып.7, с. 40-44.

54. Курелла Г.А., Гордиенко О.И. Критерии качества консервированной донорской крови человека. I. Определение исходного состояния эритроцитов по выходу из них калия. Мед. реф. журнал, 1981, разд. 18, № I, публ. 22.

55. Лайтфут Э. Явления переноса в живых системах: Пер. с англ.-М.: Мир, 1977. 520 с.

56. Лапоногов О.А., Колотилов Н.Н. Электрический импеданс в диагностике опухолей головного мозга. В кн.: Нейрохирургия. Киев: Здоров*я, 1976, вып.9, с. 92-93.

57. Лев А.А. Ионная избирательность клеточных мембран. Л.: Наука, Ленингр. отд-ние, 1975. - 323 с.

58. Лобынцева Г.С. Влияние замораживания-оттаивания на электрокинетические свойства эритроцитов человека. Криобиология и криомедицина, 1977, вып.З, с. 45-47.

59. Мартыненко А.А., Луговой В.И. Влияние ПЭ0-1500 .и низких температур на изоосмотическую резистентность эритроцитов человека. Криобиология и криомедицина, 1981, вып.8, с. 22-24.

60. Марха К., Мусия Я. Клетка как электрический контур. II. Экспериментальная часть. Биофизика, 1977, 22, № 5, с.821-823.

61. Методические указания к лабораторным работам по гематологии. Харьков, 1979. - 102 с.

62. Михнович Е.П. Изучение количества гемоглобина, прочно связанного со стромой в эритроцитах консервированной крови. -Проблемы гематологии и переливания крови, 1964, 9, N5 10, с. 42-45.

63. Моисеев В.А., Манк В.В., Зинченко В.Д., Леонов Б.Н., Марковский А.Л. Гидратационные и дегидратационные свойства гемоглобина. В кн.: Механизмы криоповреждения и криопротек-ции биологических структур. Киев: Наукова думка, 1976,с. 44- 47.

64. Морозова Т.Ф., Микулинский Ю.Е., Моисеев В.А. Влияние поли-этиленоксида на спектры поглощения некоторых глобулярных белков. Криобиология и криомедицина, 1978, вып.4, с.17-20.

65. Нардид О.А., Моисеев В.А., Лемешко В.В. Эффекты комплекси-рования полиэтиленоксидов с "биометаллами". Криобиология и криомедицина, 1976, вып.2, с. 19-21.

66. Николаев А.Ф., Охрименко Г.И. Водорастворимые полимеры. -Л.: Химия, Ленингр. отд-ние, 1979. 144 с.

67. Новиков А.Н., Олейник С.Т., Черныш Е.Н., Пашковская О.В. Адсорбционное понижение прочности мембран эритроцитов при холодовом воздействии ПЭО-1500. Криобиология и криомедицина, 1984, вып.14, (в печати).

68. Новиков А.Н., Пичугин Ю.И., Кулешова Л.Г. Влияние ряда крио-протекторов на процесс зародышеобразования льда в плазме крови человека. Криобиология и криомедицина, 1981, вып.9, с. 47-50.

69. Овчинников Ю.А., Иванов В.Т., Шкроб A.M. Мембрано-активные комплексоны. М.: Наука, 1974. - 463 с.

70. Осташко Ф.И. О природе холодового удара живчиков. В кн.: Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. Харьков: Прапор, 1963, с. 22-40.

71. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. Киев: Урожай, 1968. - 248 с.

72. Осташко Ф.1., Вишневський В.Й. Визначення об'ему льоду у заморожуваних розбавлювачах сперми з кр1оф1лактичними речо-винами. Молочно-м'ясне скотарство, 1970, вип.22, с.55-61.

73. Осташко Ф.1., Вишневський В.Й., Бугров О.Д. Питомий onlp розбавлювачХв сперми буга1в при заморожуванн1. Молочно-м'ясне скотарство, 1970, вип.20, с. 76-82 .

74. Перов Ю.Ф. Материалы к изучению физико-химических основ гемолиза: Автореф. Дис. . канд. мед. наук. Воронеж, 1971. - 23 с.

75. Поливода Б.И. Влияние радиации на мембранную емкость клеток при облучении в среде с различным содержанием калия. Радиобиология, 1969, 9, N2 4, с. 488-491.

76. Путилова И.Н. Руководство к практическим занятиям по коллоидной химии. М.: Высшая школа, 1961, с. 126-128.

77. Пушкарь Н.С. Консервирование глубоким охлаждением (-196°С) костного мозга и его использование в клинических целях. -Дис. . докт. мед. наук. Харьков, 1968. - 396 с.

78. Пушкарь Н.С. Низкотемпературное консервирование тканей. (Итоги и перспективы развития). Криобиология и криомеди-цина, 1977, вып.З, с. 3-8.

79. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. Киев: Наукова думка, 1975. - 343 с.

80. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Иткин Ю.А., Вишневский В.И., Розанов Л.Ф. Низкотемпературная кристаллизация в биологических системах. Киев: Наукова думка, 1977. - 242 с.

81. Пушкарь Н.С., Емец Б.Г., Калугин Ю.В., Наконечный А.А., Степин Л.Д., Шульга Н.Н., Бабийчук Г.А. Гидратация криопро-тектантов. Харьков, 1972. - 24 с. (Препринт / АН УССР, Институт проблем криогенной биологии и медицины).

82. Пушкарь Н.С., Калугин Ю.В., Степин Л.Д., Емец Б.Г., Онищен-ко Н.А. К вопросу о механизме действия криофилактиков груп-^ пы полиэтиленоксида. В кн.: Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины. Киев: Наукова думка, 1974, с. 26-29.

83. Пушкарь Н.С., Шраго М.Й., Белоус A.M., Калугин Ю.В. Крио-протекторы. Киев: Наукова думка, 1978. - 204 с.

84. Рождественская М.А. Определение гемоглобина в плазме консервированной крови. В кн.: Актуальные вопросы переливания крови. Л.: Медгиз, 1955, 4, с. 55-57.

85. Рубинштейн Д.Л. Физико-химические основы биологии. М.-Л., 1932. - 210 с.

86. Свиридов Б.Е., Левин С.В., Янушка А.Л., Сабаляускас ИЛ)., Комиссарчик ЯЛ)., Мошева Ф.И. Исследование слабосвязанных мембранных белков и ультраструктура теней эритроцитов. -В кн.: Биофизика мембран: Материалы конф., 1973. Каунас, 1973, с. 558-563.

87. Скорняков Б.А., Вишневский В.И. Особенности механизма крио-протекции глицерином. Криобиология и криомедицина, 1980, вып.6, с. 59-62.

88. Справочник по переливанию крови и кровезаменителей /Под ред. О.К.Гаврилова. М.: Медицина, 1982. - 304 с.

89. Тарусов Б.Н. Электропроводность как метод определения жизнеспособности тканей. Архив биол. наук, 1938, 52, № 2, с. 178—181.

90. Сравнительные данные по измерению электропроводности различных тканей. Бюллетень экспер. биол. и мед., 1941, П, № 3, с. 228-229.

91. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии: Пер. с англ. София: Медицина и физкультура, 1961. -784 с.

92. Топчиева И.Н. Применение долиэтиленгликолей в биохимии. -Успехи химии, 1980, 49, № 3, с. 494-517.

93. Фарант Дж. Пересмотр некоторых криобиологических концепций. Криобиология и криомедицина, 1977, вып.З, с. 12-20.

94. Ханаи Т. Электрические свойства эмульсии. В кн.: Эмульсии / Под ред. Ф.Шерман. Пер. с англ. - Л.: Химия, Ленингр. отд-ние, 1972, с. 313-415.

95. Челидзе Т.Л., Деревянко А.И., Куриленко О.Д. Электрическая спектроскопия гетерогенных систем. Киев: Наукова думка, 1977. - 232 с.

96. Челидзе Т.Л., Кикнадзе В.Д., Кевлишвили Г.Е. Диэлектрическая спектроскопия крови. 1У. Диэлектрические спектры крови при физико-химическом воздействии. Биофизика, 1974, 19, N2 3, с. 479-484.

97. Челидзе Т.Л., Кикнадзе В.Д., Кевлишвили Г.Е. Диэлектрическая спектроскопия крови. У. О механизме диэлектрической поляризации крови в области j»>-дисперсии. Биофизика, 1974, 19, Ш 5, с. 859-863.

98. Челидзе Т.Л., Кикнадзе В.Д., Кевлишвили Г.Е., Чхаидзе В.Т. Диэлектрическая спектроскопия крови. I. Диэлектрические спектры нормальной крови человека. Биофизика, 1973, 18, Y& 5, с. 932-935.

99. Челидзе Т.Л., Кикнадзе В.Д., Кевлишвили Г.Е., Чхаидзе В.Т. Диэлектрическая спектроскопия крови. II. К расчету емкости мембран эритроцитов человека по диэлектрическим спектрам крови. Биофизика, 1973, 18, № 5, с. 868-873.

100. ПО. Челидзе Т.Л., Кикнадзе В.Д., Кевлишвили Г.Е., Яковлев И.Л., Кикнадзе Т.Л. Электропроводность цитоплазмы эритроцитов. -Биофизика, 1980, 25, № 6, с. 1023-1026.

101. I. Шван Г. Спектроскопия биологических веществ в поле переменного тока. В кн.: Электроника и кибернетика в- биологии имедицине: Пер. с англ. М.; Иностр. лит-ра, 1963, с.71-108.

102. Шраго М.И. О криозащитном действии полимеров окиси этилена на эритроциты человека при глубоком охлаждении: Дис. . докт. биол. наук. - Харьков, 1971. - 215 с.

103. Шраго М.И., Карева Л.В., Бредихина Л.П. О гемолизирующеми противогемолизирующем действии криопротекторов. В кн.: Механизмы криоповреждения и криопротекции биологических структур. Киев: Наукова думка, 1976, с. 95-99.

104. Asami К., Hanai Т., Koizumi N. Dielectric properties of yeast cells. J. Membrane Biol., 1976, 28, p. 169-180.

105. Asami K., Hanai Т., Koizumi N. Dielectric approach to suspensions of ellipsoidal particles covered with a shell in particular reference to biological cells. Japaness J. of Appl. Physics, 1980, 12., N2, p. 359-365.

106. Ashwood-Smith M.J., Voss W.A.G., Warby C. Gryoprotection of mammalian cells in tissue culture with pluronic poly-ols. Cryobiology, 1973, 10, N6, p. 502-504.

107. Bessis M. Living blood cells and their ultrastructure. -Berlin-Heidelberg-New York: Springer-Verlag, 1973. 767p.

108. Carstensen E.L., Smearing R. V/. Dielectric properties of osmium-fixed erythrocytes. IEEE Trans. Biomed. Engin., 1967, Ц» p. 216-222.

109. Chang Y.C. The electrical properties of the membrane of the amphiuma red blood corpuscles. Rev. biol., 19641965, 1, p. 119.

110. Cole K.S. Electric conductance of biological systems. -•Cold. Spring Harbor Symp. on quant, biol., 1933, 1, p.107.

111. Cook H.F. A comparison of the dielectric behaviour of pure water and human blood at microwave frequencies. -Brit. J. Appl. Physics, 1952, 2» P« 249-255.

112. Curtis H.J. Electric impedance of injured and sensitized red blood corpuscles. J. Gen. Physiol., 1936, 20, N1, p. 105-109.

113. Dalgliesh R.J. Effect of an interaction between haemato-crit and cryoprotectant concentration on freeze-thaw haemolysis of bovine erythrocytes. Cryobiology, 1976, 13,1. N2, p. 254-257.

114. Diller K.R. Intracellular freezing: effect of extracellular supercooling. Cryobiology, 1975, 12., p. 480-485.

115. Diller K.R., Cravalho E.G. A cryomicroscopic investigation of intracellular ice formation in frozen erythrocytes.-Cryobiology, 1971, 8, p. 398.

116. Diller K.R., Cravalho E.G., Huggins C. Intracellular freezing in biomaterials. Cryobiology, 1972, 9, 115, p. 429440.

117. Donlon J.A., Rothstein A. The cation permeability of erythrocytes in low ionic strength media of various tonicities.-J. Membrane Biol., 1969, 1, p. 37-52.

118. Parrant J., Morris G.J. Thermal shock and dilution shock as the causes of freezing injury. Cryobiology, 1973, 10, p. 134-140.

119. Parrant J., Woolgar A.E. Human red cells under hypertonic conditions; a model system for investigating freezing damage. 1. Sodium chloride. Cryobiology, 1972, p.9-15.

120. Parrant J., Woolgar A.E. Human red cells under hypertonicconditions; a model system for investigating freezing damage. 2. Sucrose. Cryobiology, 1972, p. 16-21.

121. Poster K.R., Bell R.T., TOiittington R., Denysky B. Effect of DMSO on the dielectric properties of canine kidney. -Cryobiology, 1976, 1J3., p. 581-585.

122. Pricke H. A mathematical treatment of the electric conductivity and capacity of disperse systems. Phys. Rev., 1925, 26, p. 678-681.

123. Pricke H. Electric capacity of suspensions with special reference to blood. J. Gen. Physiol., 1925, 2* N4,p. 137-152.

124. Pricke H. The electric permittivity of a dilute suspension of membrane-covered ellipsoids. J. Appl. Phys., 1953, 2/j., p. 644-646.

125. Pricke H., Morse S. The electric resistance and capacity of blood for frequencies between 800 and 4 I^ million cycles. J. Gen. Physiol., 1925, p. 153.

126. Pricke H., Schwan H., Li K., Bryson V. A dielectric study of the low conductance surface membrane in E. coli. -Nature, 1956, 177, p. 134-135.

127. Fujikawa S. Preeze-fracture and etching studies on membrane damage on human erythrocytes caused by formation,of intracellular ice. Cryobiology, 1980, 1J, U4, p.351-362.

128. Purchgott R.P., Ponder E. Disk-sphere transformation in mammalian red cells, il. The nature of the antisphering factor. J. Exp. Biol., 1940, P« 117.'

129. Gavrilova I.I., Ivanov L.V., Moiseyev V.A. Investigation of the membrane integrity of human erythrocytes at lowtemperatures using spin probes. Cryo-Letters, 1.981, 2, p. 197-200.

130. Griffiths J.В., Beldon I. Assessment of cellular damage during cooling to -196°C using radiochemical markers. -Cryobiology, 1978, p. 391-402.

131. Hober R. Eine methode die elektrische Leitfahigkeit in in-nern von Zellen zu messen. Arch. Ges. Physiol., 1910, 133, s. 237-253.

132. Hollan S.R., Szelenyi J.G., Hasitz M., Szasz I., Gardos G. Haemoglobin and the red cell membrane. Physiol, bo-hemosl., 1977, 26, Ю» p. 219-224.

133. Irimajiri A., Hanai Т., Inouye A. Dielectric propertiesof synaptosomes isolated from rat brain cortex. Biophys. Struct. Mechanism, 1975, 1, p. 273-283.

134. Krupa J., Kalinowski M. Uber den Einfluss der Konservier-rungsdauer auf die elektrische Leitfahigkeit des Erythro-zytenplasmas. Folia haematol. (DDR), 1973, 22.» N2-3,s. 273-278.

135. Krupa J., Kalinowski M., Adamiak E. Conductance of the cytoplasm of erythrocytes as a criterion for evaluating the quality of blood preservation. Polia Haematol., Leipzig, 1977, 104» H3, p. 396-405.

136. Krupa J., Kwiatkowski В., Terlecki B. Metode zur Leitfah-igkeitsbestimmung des Inneren der menschlichen Erythrozy-ten auf der Grundlage der Messung elektrischer Grossen der Suspension. Biophysik, 1972, 8, s. 227-236.

137. Krupa J., Terlecki J. A nondestructive method for measuring electrical conductivity of intracellular matter oftissue in situ. Radiat. Environ. Biophys., 1976, N2, p. 79-88.

138. Leibo S.P., Mazur P. The role of cooling rates in low-temperature preservation. Cryobiology, 1971, 8, p.447-452.

139. Levitt J. Status of the sulfhydryl hypothesis of freezing injury and resistance. In: Molec. Mech. Temperat. Adap-tat. Washington, 1967, p. 41-51.

140. Levitt J., Dear J. The role of membrane proteins in freezing injury and resistance. In: The Frozen Cell /G.E.W. Wolstenholme and M.O'Connor, Eds. London: Churchill, 1970, p. 149-173.

141. Lovelock J.E. The haemolysis of human red blood cells by freezing and thawing. Biochim. Biophys. Acta, 1953, 1С), p. 414-426.

142. Lovelock J.E. The mechanism of the protective action of glycerol against haemolysis by freezing and thawing. -Biochim. Biophys. Acta, 1953, Ц, p. 28-36.

143. Lovelock J.E. Haemolysis by thermal shock. Brit. J. Haematol., 1955, i, p. 117-129.

144. Lovelock J.E. Denaturation of lipid-protein complexes as a cause of damage by freezing. Proc. Roy. Soc. London. Ser. B, 1957, U7, N1, p. 427-433.

145. Luyet B.J. Attempt at correlating some of the extent data on low temperature preservation of various cells. Fed. Proc., Supplement, 1965, p. 315-322.

146. Luyet В., Keane J. A critical temperature range apparently characterized by sensitivity of bull semen to high freezing velocity. Biodynamica, 1955, 7, p. 281-292.

147. Luyet В., Keener R. Relationship between freezing injury and amount of ice formed in suspensions of human leucocytes. Biodynamica, 1971, lb P- 83-94.

148. Mandell M.S., Diller K.R. Intracellular freezing in human erythrocytes. Cryobiology, 1974, Ц, U6, p. 540.

149. Maxwell J.C. A treatise on electricity and magnetism. -Oxford: Clarendon Press, 1904, !•

150. Mazur P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and likelihood of intracellular freezing. -J. Gen. Physiol., 1963, £7, p. 347-369.

151. Mazur P. Causes of injury in frozen and thawed cells. -Fed. Proc. Ped. Amer. Soc. Exp. Biol., 1965, 2£, p. 175182.

152. Mazur P. The role of cell membranes in the freezing of yeast and other single cells. Ann. N. Y. Acad. Sci.,1965, 12£, p. 658-676.

153. Mazur P. Physical and chemical basis of injury in single-celled microorganisms subjected to freezing and thawing.-In: Cryobiology /Н. T.Meryman, Ed. London: Acad. Press,1966, p. 213-315.

154. Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptical rates. Cryobiology, 1977, 11, N3, p. 251-272.

155. Mazur P., Leibo S.P., Parrant J., Chu E.H.Y., Hanna M.G.Jr. Smith L.H. Interactions of cooling rate, warming rateand protective additive on the survival of frozen mammalian cells. In: Ciba Foundation Symposium on the Frozen

156. Cell /G.E.N.Wolstenholme and M.O'Connor, Eds. London: Churchill, 1970, p. 89-104.

157. Mazur P., Miller R.H., Leibo S.P. Survival of frozen-thawed bovine red cells as a function of the permeation of glycerol and sucrose. J. Membrane Biol., 1974, 15., p. 137-158.

158. Mc-Gann L.E. Differing action of penetrating and nonpenetrating cryoprotective agents. Cryobiology, 1978, 15» N4, p. 382-390.

159. Meryman H.T. Modified model for mechanism of freezing injury in erythrocytes. Nature (London), 1968, 218,p. 333-336.

160. Meryman H.T. The exceeding of a minimum tolerable cell volume in hypertonic suspension as a cause of freezing injury. In: The Frozen Cell. London: Churchill, 1970, 51, p. 10-67.

161. Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing injury. Cryobiology, 1971, 8, p. 489-500.

162. Meryman H.T. Red cells membrane changes produced by extracellular cryoprotectants and allied compounds. Cryobiology, 1971, 8, N8, p. 401-408.

163. Meryman H.T. Freezing injury and its prevention in living cells. Annual. Rev. Biophys. Bioeng., 1974, 2» P* 341~ 363.

164. Meryman H.T. Cryobiology of the red blood cell. In: The red blood cell. New York, London: Acad. Press., 1974, 1, p. 575-583.

165. Meryman H.T., Hornblower M. Changes in red cells following rapid freezing with extracellular agents. Cryobiolo-• gy, 1972, 2, N4, p. 262.

166. Miller J.S., Cornwell D.G. The role of cryoprotective agents as hydroxil radical scavengers. Cryobiology, 1978,1. Л5, p. 585-588.

167. Morris G.J., Parrant J. Effects of cooling rate on thermal shock hemolysis. Cryobiology, 1973, 10, p. 119-125.

168. Nei T. Freezing injury to erythrocytes. 1. Freezing patterns and post-thaw hemolysis. Cryobiology, 1976, 13» Ю, p. 278-286.

169. Uei T. Effect of initial cell concentration on the post-thaw hemolysis of frozen erythrocytes. Cryobiology, 1976, 12, N6, p. 651.

170. Pauly H., Packer L., Schwan H.P. Electrical properties of mitochondrial membranes. Biophys. and Biochem. Cytol., 1960, 7, E4, Р» 589-601.

171. Pauly H., Schwan H.P. Uber die Impedanz einer Suspension von kugelformigen Teilchen mit einer Schale. Z. TTatur-forsch., 1959, lib, s. 125-131.

172. Pauly H., Schwan H.P. Dielectric properties and ion mobility in erythrocytes. Biophys. J., 1966, 6, N5, p. 621639.

173. Pegg D.E., Diaper M.P. Cell packing and the recovery of human erythrocytes frozen and thawed in the presence of glycerol. Cryobiology, 1980, 17., N6, p. 609.

174. Ponder E. Hemolysis and related phenomena. New York: Grune and Stratton, 1948. - 248 p.

175. Pribor D.B. PVP contrasted with dextran and a multifactortheory of cryoprotection. Cryobiology, 1974, Ц, N1, p. 60-72.

176. Pribor D.B. Biological interactions between cell membranes and glycerol or DMSO. Cryobiology, 1975, 12, N4, p. 309-320.

177. Rajewsky В., Schwan H.P. Die Dielektrizitatkonstante und Leitfahigkeit des Blutes bei ultrahohen Prequenzen. Na-turwissenschaften, 1948, s* 315.

178. Rapatz G., Luyet B. Hemolysis in several animal species after rapid freezing of blood. J. Cell. Physiol., 1971, 77» ИЗ, P. 373-376.

179. Rapatz G., Rapatz L. Effect of cell concentration on the extent of injury to erythrocytes by freezing. Cryobiology, 1973, jo, p. 529.

180. Rowe A.W. Biochemical aspects of cryoprotective agents in freezing and thawing. Cryobiology, 1966, 2» N1, p.12-18.

181. Schwan H.P. Electrical properties of tissue and cell suspensions. Advances in Biol, and Med. Physics, 1957,p. 119-289.

182. Schwan H.P. Determination of biological impedances. In: Physical Technics in Biological Research. /W.L.Nastuk, Ed. Hew York: Acad. Press, 1963, 6, p. 323-407.

183. Smith A.U. Prevention of haemolysis during freezing and thawing of red blood cells. Lancet, 1950, 2» N7» P* 910918.

184. Smith A.U., Parkes A.S. Thermal shock in a new vibrio phase. Proc. Soc. Exptl. Biol, and Med., 1952, §1, p. 254259.

185. Thiele P.A. et al. Evaluation of skin damage. 1. Skin resistance measurements with alternating current (impedance measurements). Br. J. Dermatol., 1973, §9, p. 873-882.

186. Wagner K.W. In: Isolierstoffe der Elektrotechnik. /H.Sche-ring, Ed. Berlin: Springer-Verlag, 1924, p. 3-47.

187. Williams R.J. A proposed mechanism for PVP cryoprotection. Cryobiology, 1976, 12' P- 653.

188. Williams R. J., Meryman H.T. Osmotic augmentation of thermal shock in human erythrocytes. Cryobiology, 1976, 13. N6, p. 652.

189. Woodin A.M. Impedance of leucocyte suspensions treated with leucociding or streptolysin 0. Experiment. Cell Res., 1966, 42, И2, p. 311-318.

190. Woolgar A.E., Morris G.J. Some combined effects of hypertonic solutions and changes in temperature on posthyper-tonic hemolysis of human red blood cells. Cryobiology, 1973, 10, p. 82-86.

191. Yee J.P., Mel H.C. Cell-membrane responses during dynamic osmotic hemolysis. Biophys. J., 1976, 16, N2, p. 219.