Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и совершенствование способа криоконсервации спермы водоплавающих птиц

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андреев, Валерий Иванович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Определение показателей качества сперны и рН среды в яйцеводах птиц.

2.2.2. Разработка сред для криоконсервации спермы гусаков и селезней.

2.2.3. Определение оптимальных режимов подготовки спермы к криоконсервации.

2.2.4. Разбавление сперны криозащитной средой.

2.2.5. Определение оптимального периода выдержки (эквилибрации) спермы перед замораживанием

2.2.6. Определение оптимальных режимов замораживания и оттаивания спермы гусаков и селезней

2.2.7. Оптимизация температуры оттаивания спермы

2.2.8. Испытание эффективности разработанного способа криоконсервации спермы птиц

3. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБА ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ ПТИЦ

3.1. Изыскание способов удаления криопротекторов из оттаянной спермы.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. В Ы В О Д Ы.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и совершенствование способа криоконсервации спермы водоплавающих птиц"

Актуальность темы. В Постановлении ХХУ1 съезда КПСС по проекту ЦК КПСС "Основные направления экономического и социального развития СССР на I98I-I985 годы и на период до 1990 года" намечается существенно повысить продуктивность скота и птицы. Довести среднегодовое производство мяса до 17,017,5 млн. тонн (в убойном весе).

Для успешного выполнения поставленных задач по производству мяса необходимо создание новых высокопродуктивных пород, линий птицы и скота. Решение этого вопроса стало реальным благодаря разработке метода длительного хранения половых клеток, позволившего использовать сперму только выдающихся производителей не зависимо от сезона года, места их содержания и продолжительности жизни.

В настоящее время наиболее эффективным является хранение спермы в жидком азоте. Преимущества использования криоконсер-вированной спермы особенно ощутимы в скотоводстве. Во многих промыпшенно-развитых странах, в том числе и в СССР, почти полностью переведено все поголовье крупного рогатого скота на осеменение замороженно-оттаянной спермой. Однако, несмотря на эффективность используемых способов криоконсервирования спермы быков пока не удается избежать гибели клеток до 35-40% в процессе замораживания - оттаивания. Это приводит к потере ценного генетического материала и снижает эффективность криоконсервирования. Одним из путей повышения сохранения жизнеспособности спермиев быков в процессе криоконсервирования является тщательная оптимизация режима охлаждения и отогрева спермы в интервале температур от 0°С до -196°С,

В птицеводстве технологии криоконсервации спермы птиц все еще находятся на стадии разработки и совершенствования. Тем не менее полученные в опытах советских и зарубежных исследователей результаты по использованию замороженно-оттаянной спермы для искусственного осеменения кур,гусынь и индеек позволяют надеяться, что в ближайшее время этот метод получит широкое распространение и в практике птицеводства. Тормозом в этом вопросе является недостаточная изученность влияния низких температур на выживаемость спермиев птиц, способов криозащиты и удаления криопротекторов из деконсервированной спермы. Применение метода криоконсервации спермы в птицеводстве позволит значительно повысить эффективность селекционно-генетической работы. Что особенно важно при создании гибридов птицы, например, между мускусными и общепользовательными утками, обладающими высокой интенсивностью роста. Переход на осеменение замороженно-оттаянной спермой в гусеводстве позволит наиболее эффективно использовать ценных гусаков-производителей, проверенных по качеству потомства, повысить половую нагрузку на гусака и оплодотво-ренность яиц. Наконец,разработка метода криоконсервации спермы водоплавающих птиц позволит создать спермобанк малоиспользуемых в настоящее время пород гусей и уток, особенно аборигенных, определенные гены которых могут понадобиться селекционерам в будущем.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилось изучение влияния низких температур на выживаемость спермиев сельскохозяйственных животных, в частности, гусаков и селезней для усовершенствования и разработки практических способов криоконсервирования спермы птиц и млекопитающих, а также создания на этой основе банков глубокозамороженной спермы для генотипичес-кой селекции. Исходя из этого в задачу наших исследований входило:

1. Используя физиологические показатели полноценности сперми-ев разработать среду и определить лучший криопротектор для крио-консервации спермы гусаков и селезней.

2. Определить оптимальные режимы подготовки спермы птиц к замораживанию - температуру разбавления, скорость охлаждения от 40 до 0°С, продолжительность выдержки спермы перед замораживанием.

3. Определить оптимальные режимы охлаждения и отогрева спермы водоплавающих птиц от 0 до -196°С и от -19б°С до 0 -4°С.

4. Изучить влияние способов удаления криопротекторов из це-консервированной спермы на её биологическю полноценность.

Научная новизна. Разработана физиологически обоснованная среда и определен лучший криопротектор для криоконсервирования спермы водоплавающих птиц. Определены оптимальные режимы подготовки спермы птиц к замораживанию, режимы замораживания и оттаивания. Изучена динамика выживаемости спермиев водоплавающих птиц в зависимости от режимов охлаждения спермы от 0 до -196°С к отогрева. Изучена эффективность способов удаления криопротекторов из оттаянной спермы.

Основные положения диссертационной работы защищены авторскими свидетельствами на изобретения: № 641962, № 69II32, Jffi 9I2I65 и опубликованы в 9 печатных работах.

Настоящая работа выполнена в лаборатории популяционной генетики и сохранения генофонда птиц Украинского научно-исследовательского института птицеводства.

Исследования по диссертационной работе проведены в соответствии с плановым заданием № 166 ГК СМ СССР по науке и технике от 12.УЛ976г. "Разработать технологию хранения и использования глубокозамороженной спермы гусей" (№ Гос.per.77079182) и темы 0.С.Х.77; 02.01.04. (PH.5I.06) "Усовершенствовать технологию искусственного осеменения индеек и гусей при многолетнем использовании и замораживании спермы, повышающую на 3-5% воспроизводительные качества птицы" (№ Гос.per. 01820079883).

На защиту выносятся следующие положения диссертации:

1. Среда для криоконсервирования спермы водоплавающих птиц и использование в качестве криопротектора диметилформамида.

2. Режим подготовки спермы гусаков и селезней к криоконсер-вированию.

3. Динамика изменения выживаемости спермиев водоплавающих птиц в зависимости от режимов охлаждения и отогрева.

4. Эффективность способов удаления криопротекторов из оттаянной спермы.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.I. Некоторые особенности получения, морфологии и обмена веществ спермиев

В искусственном осеменении птиц главным моментом является получение от самцов высококачественной спермы, что является залогом успешной её криоконсервации. Известно много способов получения спермы от птиц. Так, основоположник искусственного осеменения И.И.Иванов (1914) получал сперму от забитых петухов путем выжимания ее из семяпроводов. Я В Uu.it (1929) брал сперму от петухов в часовое стекло, подставляя его к клоаке курицы в момент копуляции. А.С.Серебровская и И.И.Соколовская получали сперму у селезней, гусаков, цесарей и фазанов методом электроэякуляции. Этот метод в различных модификациях широко применяется для получения спермы птиц в Японии ( вошсСоuna. 1961), Чехословакии (Слы,^ 1979) и в других странах. Однако наиболее эффективным и широкораспространенным способом взятия спермы у птиц считается метод ручного массажа ( BbLXteur^ К; З-и+пи. fy 1937). В дальнейшем этот метод усовершенствовали и использовали для получения спермы у гусаков и селезней А.Д.Давтнн и Б.В.Пименов (1970), П.Малис (1973), Р.Г.Царенко и соавт. (1978) и другие исследователи.

По данным многих авторов, при взятии спермы у гусаков методом массажа объем эякулята составляет 0,2-0,4 мл, активность спермиев - 5,0-7,5 балла; концентрация - 55-400 млн./мл. (А.Д.Курбатов и соавт., 1976; В.П.Косов,

А.П.Бондаренко, 1977 j

Сперма селезней по этим показателям значительно отличается от спермы гусаков. Концентрация спермиев селезней более чем в 10 раз выше и достигает, в зависимости от породы и способа взятия , 2,0-8,0 млрд/мл, активность спермиев - 7,0-9,0 балла; объем эякулята - 0,2-0,9 мл ( Рс-п^Л 1972; С.В.Ши-лин и соавт. 1975; в^ск&Ж&сбг: А.Д.Давтян и соавт., 1971). Вместе с тем исследователями было отмечено, что предварительное возбуждение петуха чучелом курицы значительно улучшает качество спермы получаемой способом массажа (Боголюбс-кий С.И. и соавт. 1955), М.М.Аслонян и Г.Ф.Дуплий (1966) подтвердили это на индюках и предложили способ получения спермы на специальном станке с укрепленной в нем живой самкой. А.С. Ельчибаев и В.П.Хван (1976) получали сперму селезней на живую утку. Для осуществления этого метода селезней содержали в секциях по 10 и более голов. Перед получением спермы в секцию помещали утку. Селезня, пытающегося произвести спаривание, ловили и надавливанием руками на спину и живот получали сперму на резиновый фартук. Объем эякулята и другие показатели качества спермы были примерно в два раза выше, чем при получении спермы методом ручного массажа. Однако недостатком этого метода является то, что при групповом содержании селезней 79-84% особей не реагируют на утку. Кроме того, взятие спермы на резиновый фартук не обеспечивает её стерильности. В связи с этим более целесообразно было бы применение широкогорлого спермо-приемника предотвращающего травмирование пениса и повышающего стерильность спермы.

Таким образом, для искусственного осеменения птиц применяется несколько способов получения спермы, однако при "электроэякуляции" и "массаже" сперма значительно загрязняется моче-продуктами и малопригодна для криоконсервации. Исходя из этого особый интерес представляет совершенствование техники получения спермы у гусаков и селезней на "живую самку", то есть с использованием всего комплекса половых рефлексов.

Сперму у быков-производителей берут на искусственную вагину с одноразовым спермоприемником. Для садки самцов применяют механический станок с гидропневматической амортизацией (Ф.И.Ос-ташко, 1968). Для замораживания используют свежевзятую сперму с активностью не ниже 7 баллов и концентрацией спермиев 0,7-2,0 млрд/мл (Осташко §.И. и соавт., 1978).

Известно, что сперма млекопитающих и птиц представляет собой биологический секрет,состоящий из суспензии клеток-спермиев и окружающей их жидкости - плазмы» Плазма имеет сложный состав включающий воду, различные вещества и секреты поддерживающие биологическую полноценность спермиев. С развитием биологии размножения и искусственного осеменения многими исследователями было доказано, что плазму можно с успехом заменить искусственными средами. Это связано , в основном, с катаболитическим типом обмена веществ в половых клетках благодаря, которому обменные процессы между спермиями и плазмой находятся на минимальном уровне (Милованов В.К., 1962). В процессе своей жизнедеятельности спермии включают в обмен собственные запасы энергетических веществ и лишь, частично, некоторые вещества окружающей среды, например, сахара WUte.

Т.Mann, 1954).

Спермии млекопитающих и птиц состоят из четырех основных структурных элементов: головки, шейки, тела и хвоста, Однако, наряду со сходством, имеют ряд отличительных особенностей как в морфологии так и ультраструктуре. Так, головка спермия быка сплющена в дорсовентральном направлении, имеет вытянутую овальную форму. В верхней и средней частях головки, между ядром и цитоплазматической мембраной расположена одна из самых чувствительных к внешним воздействиям органелл-акросома. Сразу же за ядром начинается шейка спермия. Шейка имеет сложную структуру, включающую митохондрии, столбцы и центриоль. Тело спермия имеет симметричное строение и состоит из митохондриального чехла, образующего три спирали вокруг осевого комплекса фибрилл. Хвост спермия состоит из двух периферических и центральных фибрилл ( Ь&м- I960; 1965; ко^ы-а ^Зоб/иР 1966;

ЪЪ-геЛи 1968; Лс<,и.с1ог 1970; Ф.И.Осташко, 1963).

В отличие от спермиев млекопитающих, спермии птиц напоминают длинную извитую нить. Длинная узкая головка спермия заканчивается акросомой. Акросома состоит из двух отличающихся по структуре частей - акросомы головки и акросомы Лрии^. . Акросома головки У образна, покрыта цитоплазматической мембраной и состоит из гомогенного материала со средней оптической плотностью. Акросома иглоподобна и состоит из материала с высокой плотностью. Внутри акросомы имеется 5 и более вакуолей. В составе ядра спермиев птиц преобладает нуклеопротеид содержащий протамин, а не гистон, как у млекопитающих. Осевая нить спермиев птиц не окружена спиральными нитями, а покрыта лишь аморфной мембраной, быстро разрушающейся с освобождением фибрилл ( StouhL 1975, В-ег^мап 1979). Согласно литературным данным наиболее лабильными структурами спермиев млекопитающих и птиц являются цитоплазматическая мембрана и акросома, которые в первую очередь повреждаются при неблагоприятных изменениях среды. Структурная целостность этих органоидов определяет биологическую полноценность спермиев и необходима для успешного воспроизводства потомства.

Нарушение полноценности спермиев может произойти за счет исчерпания собственных энергетических ресурсов. Установлено, что в обмен веществ спермиев включаются сахара,(Т.Мапп 1945, 1946, 1948), жирные кислоты I рил^пе. &£. I968J; аминокислоты ( -d. al. 1966). В результате включения этих веществ в процессы метаболизма в сперме накапливается молочная кислота и другие вредные продукты, отравляющие среду и вызывающие гибель спермиев (аутоинтоксикация). Гибель спермиев может наступить и в следствие накопления ядовитых продуктов метаболизма, развивающихся в сперме микробов (гетероинтоксикация) ( Лоъе-пАСН. I940j

Таким образом, вместе с расходом энергетических ресурсов происходит нарушение биологической полноценности спермиев продуктами распада, а также метаболитами попавших в сперму бактерий. Кроме того, на сохранность спермиев оказывают губительное влияние резкие или чрезмерные изменения физико-химических условий окружающей среды. Отсюда основным условием длительного сохранения полноценности спермиев является устранение всех неблагоприятных факторов внешней среды, снижение или полное торможение процессов метаболизма половых клеток.

Существуют различные цути торможения обменных процессов в спермиях. Так, еще К.Н.Кржишковский и Г.П.Павлов ' использовали для этой цели двуокись углерода. Это связано с тем, что некоторая часть двуокиси углерода соединяясь с водой образует угольную кислоту, которая имеет небольшую константу диссоциации и легко проникает внутрь спермиев. В спермиях угольная кислота распадается на ионы и тормозит дыхание и гликолиз вследствие чего они переходят в состояние анабиоза. По сравнению с другими слабыми кислотами угольная кислота менее токсична для спермиев, её применение в качестве компонента сред позволяет сохранять высокую оплодотворяющую способность спермиев млекопитающих до 6-7 суток (В.К.Милованов, 1962;

ITccyi-JT-c^OL ък aJ. 1957;

Обменные процессы в спермиях можно затормозить путем введения в среды хелатона обладающего свойством связывать ряд катионов и тем самым подавлять действие некоторых ферментов (Н.Т.Плишко, 1965).

Увеличить срок хранения спермиев вне организма можно путем удаления образовавшихся в процессе метаболизма вредных продуктов распада, диализом через полупроницаемые пленки (Н.П.Хроно-пуло, 1940).

Интересно отметить, что в современной гематологии разработан и широко применяется способ хранения клеток крови в сосудах содержащих гранулы предварительно насыщенного питательными веществами активированного угля. В этом случае активированный уголь служит, как бы буфером среды, отдавая в плазму питательные вещества и поглощая вредные продукты метаболизма (В.Г.Николаев и В.В.Стрелко, 1979). Можно надеяться, что этот простой и эффектный способ будет применен и для кратковременного хранения спермы.

Хранение спермы при температуре около 0°С

Известно, что при пониженных температурах интенсивность жизнедеятельности половых клеток значительно снижается, по данным

A.И.Короткова (1958) при 0°С - примерно в 150 раз по сравнению с температурой 38°С. Впервые научно обосновал возможность хранения спермы домашних животных при температурах близких к 0°С И.И.Иванов (19Г4). Затем Г.П.Павлов (1927), М.П.Кузнецов и

B.К.Милованов (1932) успешно хранили спермы быка и барана в течение нескольких суток, при температуре около 0°С. Аналогичные результаты по сохранению биологической полноценности спермиев птиц были получены в опытах J^cck&ctci (1962) у дъсмги- (1964), Л.Е.Нарубиной и А.Д.Курбатова

1973).

Разрабатывая способы хранения спермы при пониженных температурах, исследователи столкнулись с явлением гибели спермиев при резком охлаждении (К.А.Кузнецова, 1932). Причем, было отмечено, что медленное охлаждение не вызывает сколь нибудь заметные морфофункциональные нарушения спермиев, в то же время быстрое охлаждение вызывает специфические необратимые изменения процессов и структур (И.И.Бирилло, Л.Х.Пухальский, 1936; П.П.Скаткин, 1940; В.А.Морозов и соавт., 1962; Ф.И.Осташко, 1963). Это явление было названо "температурным шоком"или "холодовым ударом", а в последствии изучено его биологическое значение.

Существует несколько теорий "температурного шока" клеток. Так, t ^kkeiuLo (1940) предположили, что резкое охлаждение клеток вызывает желатинизацию золей и сжатие геля их протоплазмы в результате чего происходит спонтанное выделение воды и гибель клетки.

По мнению В.К.Милованова и И.И.Соколовской (1959) гибель спермиев при температурном шоке наступает в результате быстрого затвердевания компонента протоплазмы плазмологена и возникающего при этом противоречия в энергетических потребностях клетки. Однако, И.В.Смирнов (1961,1962), в своих опытах, не нашел подтвервдения этой гипотезы.

В настоящее время наиболее общепризнанной является теория температурного шока предложенная Ф.И.Осташко (1963, 1964). На основании многочисленных исследований автором было показано, что температурный и осмотический шок клеток явление одного порядка. Резкое изменение температуры при различных теплоемкос-тях среды и клетки создает на цитоплазматической мембране концентрационный градиент осмотически активных веществ. При этом возникает разрушающий мембрану аномальный поток воды и растворенных веществ. Наиболее чувствительными к температурному шоку структурами являются цитоплазматическая мембрана и акросома спермия.

Для защиты спермиев от температурного шока применяют медленные режимы охлаждения и желток куриного яйца в составе криоза-щитных сред. Причем установлено, что спермии быков обработанные желточной средой сохраняют устойчивость к температурному шоку даже после многократного отмывания (с1>.И.~~Осташко, 1978)^ Это явление объясняется тем, что липоидные компоненты желтка наслаиваясь на мембрану образуют фазу препятствующую различным повреждающим факторам.

Что касается спермиев птиц, то по данным многих исследователей они проявляют малую чувствительность к температурному шоку, особенно при разбавлении защитной средой ( Л^/и-бе. I960; ЛгМ/ига. (1963); (1964); JsuiwumkL (1964);

В.В.Богомолов, З.В.Сосновская (1973). Устойчивость половых клеток птиц к температурному шоку авторы объясняют особенностями их структуры и химического состава, наличием большого количества липопротеидов и фосфолипидов в цитоплазматической мембране.

Вопреки этилу положению температурный шок спермиев птиц, в частности петухов, был обнаружен Tectum, Okcchu?tc? (1976) очевидно, в результате более тщательной постановки опыта. Авторы установили, что резкое охлаждение неразбавленной спермы до 5°С не приводило к снижению её оплодотворяющей способности, в отличие от такого же охлавдения до 2°С. Кроме того в исследованиях Б.Иванова и соавт., (1978) были отмечены значительные индивидуальные различия в устойчивости спермиев петухов к температурному шоку и обнаружена её связь с оплодотворяющей способностью замороженно-оттаянной спермы.

Следует отметить, что до настоящего времени не проведены исследования по изучению температурного шока спермиев гусаков и селезней, а также по оптимизации режимов охлаждения спермы в зоне плюсовых температур. Такие исследования на сперме индюков показали, что охлаждение клеток до 3°С со скоростью 4-8°С/мин. позволяет значительно снизить повреждения термоосмотического характера (Qieurn. 1966; 7~tL{LzA е/. 1969).

Несмотря на то, что процессы метаболизма в сперме при температуре близкой к 0°С значительно снижаются их уровень при этом еще высок, Спермии теряют оплодотворяющую способность в течение нескольких часов или дней. В связи с этим более эффективным является хранение спермы при низких температурах.

Хранение спермы при низких и сверхнизких температурах

Преимущество сверхнизких температур при хранении биологических объектов связано с тем, что скорость обменных процессов при

13 температуре жидкого азота снижается примерно в 10 раз ( клскисш1963). Клетки как бы приобретают потенциальное бессмертие и не теряют свою биологическую полноценность при многолетнем хранении.

Возможность осуществления длительного хранения биологических объектов, особенно спермы животных,издавна привлекала внимание исследователей. Еще в 1907 году И.И.Иванов, основоположник искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, указывал, что повышение продуктивности животноводства в будущем будет связано с разработкой способа криоконсервирования спермы. Исследователь сделал первый практический шаг в этом направлении и осуществил замораживание спермы жеребца до -15°С. Затем А.Д.Бернш-тейн и В.В.Петропавловский (1937) замораживали сперму кролика, морской свинки, быка, барана, хряка, селезня и петуха до -21°С. zCuyct , Hedcif>f> 1938, замораживали сперму различных животных путем погружения в жидкий воздух.-J/ut^Hct (1942) использовал для замораживания спермы петухов твердую углекислоту, при этом до 30% спермиев сохраняли активность после оттаивания при 45°С. Несмотря на сохранение в некоторых случаях хорошей активности,после замораживания-оттаивания получить потомство от самок осемененных деконсервированной спермойисследователям не удалось.

Впервые получил потомство млекопитающих после осеменения самок храненной при температуре сжиженных газов спермой

И.В.Смирнов (1949). Исследователь помещал капельку спермы в миниатюрный пакетик из тонкой алюминиевой фольги, который затем погружал в ожиженный газ. В связи с высокой теплопроводностью стенок упаковки и малым объемом замораживаемой спермы было достигнуто чрезвычайно быстрое охлаждение. Благодаря этому от 10 до 30% спермиев восстанавливало активность и оплодотворяющую способность после быстрого отогрева. j Pe^gL (I950J при испытании криозащитных свойств многоатомных спиртов и родственных им соединений убедились, что лучше всех защищает клетки от повреждений бо время замораживания и оттаивания все же глицерин. Исследователи замораживали сперму быка1содержащую после разбавления 15% глицерина, от 0°С до - 15°С со скоростью 1°С/мин., а затем со скоростью 5°С мин от -15 до -79°С. Подвижность большинства спермиев восстанавливалась после оттаивания. Используя эту методику (1951) осеменил 5 коров храненной при -79°С спермой. Одна корова родила нормального теленка. Применение медленных режимов охлаждения,по мнению авторов,связано с опасением подвергнуть спермии температурному шоку, а ускорение режима охлаждения в критическом диапазоне проведено с целью снижения уровня криоповреждений. С этой же целью рекомендуется как можно быстрее повышать температуру во время оттаивания ( Ро-б^с 1953).

В последующие годы для практического использования были предложены различные варианты хранения спермы быков в замороженном состоянии. Все варианты имеют общую схему, включающую первичное разбавление спермы глюкозо-цитратно-желточной средой без глицерина, охлаждение разбавленной спермы до 2 -5°С, вторичное разбавление средой содержащей глицерин, эквилибрацию в течение 6-18 часов, расфасовку разбавленной и охлавденной спермы по ампулам объемом 1-1,3 мл, замораживание спермы до -15°С со скоростью 0,5-1°С/мин., затем до -50°С со скоростью

2-3°С/мин. и от -50С до -80°С со скоростью 5-7°С/мин. Р&Сре я/1953.; 'fan- -JXe-MtrJi ci. а/. 1957;

Е.М.Платов, I960; Ф.И.Осташко, 1963; А.Д.Бугров, 1965] Используемый авторами медленный режим замораживания соответствовал повышенному уровню глицерина в сперме (до 15%) и большому объему ампул (до 1,3 мл).

Дальнейшие исследования по оптимизации уровня глицерина в разбавленной сперме и совершенствование режимов охлавдения позволили 'fifUjptAJl) TUurQ (1964); 'Ксу^ДС t^a^SVXA) разработать метод криоконсервации спермы в гранулах. Метод характеризуется тем, что разбавленная глицерино-желточно-углевод-ной средой сперма накапывается в лунки твердой двуокиси углерода, благодаря чему её охлаждение происходит в 10-20 раз быстрее, чем при замораживании в ампулах. В.Ф.Турбин Ц966, 1967) использовал для замораживания спермы быков в форме гранул жидкий азот. Н.Ющенко и соавт. (1968,1970) для гранулирования спермы применил предварительно охлажденную в жидком азоте фторопластовую пластину. Некоторое время метод криоконсервирования спермы в форме гранул широко применялся во многих странах мира. Однако существенные недостатки метода - трудность маркировки гранул и микробное загрязнение в процессе расфасовки и хранения резко сократили его применение.

С целью предотвращения загрязнения спермы были предложены различные упаковки гранул. (1966) замораживал сперму в форме гранул на пластиковых нитях,которые помещал затем в специальные пластиковые трубочки имеющие прорезь по всей дли

1967) для этой цели использовал желатиновые капсулы. J^awson (1968) разработал специальную установку для завертывания каждой гранулы в алюминиевую фольгу.

Однако более прогрессивным явилось замораживание спермы быэтом было установлено, что оптимальные условия охлаждения создаются при снижении температуры по параболической кривой со скоростью Ю-20°С за первую минуту, 20-60 за вторую, 35-90 за третью минуту, этот режим достигается путем размещения спермо-доз над жидким азотом на высоте 1-5 см. (Ф.И.Осташко и соавт. 1982). Для получения оптимального режима замораживания спермы по Харьковской технологии в производственных условиях загерметизированные в полиэтиленовую трубку спермодозы помещают в тонкостенные металлические тубы, в которых сперма охлаждается до 2-4°С и эквилибрируется в аппарате ЭКЗ-I. После этого обойму аппарата с тубами погружают в емкость с жидким азотом, весь процесс замораживания заканчивается за 7-10 минут.

Одной из разновидностей упаковки спермы является использование трубочек различной длины и диаметра. Целесообразность такой упаковки впервые показал В.К.Милованов (1936). Исследователь предложил использовать для охлаждения и перевозки спермы одноразовые капиллярные трубочки (соломинки) из междоузлий тростника или искусственные из парафинированной бумаги. Затем не. (1966) предложил упаковывать каждую гранулу в отдельную полихлорвиниловую чашечку. TftltMi 1966, ка в облицованных гранулах по Ф.И.Осташко/ 1978/. При ряд исследователей

20 иъс 1964) предложили для упаковки спермы полимерные трубочки (пайеты). При замораживании спермы в пайетах емкостью 0,25-0,5 мл их укладывают в специальный штатив установленный над поверхностью жидкого азота на высоте 4-5 см.

Существенными недостатками метода являются частый разрыв и нарушение герметизации пайет при оттаивании, возможность загрязнения спермы микрофлорой при расфасовке. Более эффективной по санитарным и технологическим вопросам является консервация спермы в облицованных гранулах по Харьковской технологии (Ф.И.Осташко и соавт.,1978).

Разработка способов криоконсервации спермы птиц

Хранить сперму птиц при температуре твердой углекислоты или жидкого азота стало возможным только с использованием специальных криозащитных сред и режимов замораживания. Причем по аналогии с методами криоконсервации половых клеток спермы млекопитающих в качестве упаковки исследователи стали применять ампулы, гранулы и пайеты, различные, иногда противоречивые режимы замораживания и оттаивания.

При замораживании спермы петухов в ампулах лучшие результаты были получены в опытах (1968). Исследователь получал сперму от каждого петуха не реже чем через 3-4 дня. Тщательно осуществлял все технологические операции подготовки и криоконсервирования, включающие: расфасовку свежеполученных эякулятов по 0,15мл в стерильную посуду, охлаждение в течение 5 минут до З^С, разбавление 1:3 средой сложного состава, содержащей в качестве основного криопротектора глицерин, расфасовку разбавленной спермы по 0,6 мл в I мл ампулы, охлаждение ампул со скоростью 1°С/мин. до -22°С и последующее погружение в жидкий азот. Для искусственного осеменения кур сперму оттаивали в водяной бане при 3°С. После чего удаляли глицерин методом центрифугирования. Каждой курице вводили по 0,2 мл спермы. оtou/ct. обнаружил, что спермии разных петухов не одинаково сохраняют оплодотворяющую способность после криоконсервации, у одного петуха она была на уровне 71,0% у других пяти петухов-27,0%. Через 10 лет ^LcuAl , cU, (1978) сообщили, что им удалось получить оплодотворенность яиц при осеменении кур деконсервированной спермой - 80,3%. При этом состав среды и все технологические приемы подготовки и замораживания исследователи не изменили, за исключением глубины охлаждения перед погружением в жидкий азот, которая составила - 35°С вместо --22°С. Затем ^td-Аг 1981) опубликовали сообщение о разработке для использования в производстве технологии криоконсер-вирования спермы петухов,позволяющей получать оплодотворенность яиц на уровне 90%.

При повторении технологии ^Lcukt другими исследователями результативность криоконсервирования значительно хуже. Так, в опытах ^LouoIol - ^ггоигАко. «/(1978) средний процент оплодотворенности яиц от кур осемененных деконсервированной спермой составил 56,7%. Исследованиями советских ученых А.Д.Курбатова и соавт. (1976) показано, что спермии петухов сохраняют чувствительность к температурному шоку при охлаждении до -40°С и ниже. Это связано с наличием при этих температурах, по данным Ф.И.Осташко, (1978) - до - жидкой фазы концентрированных растворов глицерина и других компонентов среды. Поэтому описанный ZLo^Ujl (1968, 1978) режим охлаждения спермы со скоростью 1°С/мин. до -22 - 35°С и последующее погружение в жидкий азот вызывает сомнение в соответствии с действительно используемым автором режимом.

По методике Wfaic^hZL^-t ^/а^(1970) сперму петухов разбавляют 1:3 средой,включающей глицерин, желток и глюкозу, расфасовывают в ампулы по 0,2 мл, охлаждают в парах жидкого азота (-110 - - 120°С) в течение 2 минут и затем опускают в азот на хранение. Используемые авторами среду и режим охлаждения можно считать несовершенными, так как после осеменения самок деконсер-вированной спермой, при огаюдотворенности яиц 60%, вывод цыплят составил всего 34%.

Использование ампул при криоконсервации спермы птиц имеет ограниченное применение в связи с трудоемкостью процесса расфасовки и герметизации. Кроме того большой объем ампул и соответственно теплоемкость спермы не позволяет использовать быстрые режимы консервации, что увеличивает вероятность криоповреж-дений в результате возникновения сильных мехнических напряжений по всему объему замороженной спермы под действием теплового расширения льда (В.П.Кононов, 1982). «'

В последнее время получило распространение, как у нас в стране так и за рубежом замораживание спермы петухов, индгоков и гусаков в форме необлицованных гранул (Л.Е.Нарубина и соавт., 1974, 1975, 1978, А.Д.Курбатов и соавт., 1976, 1978,

1979, Р.Г.Царенко и соавт. 1978, 1979, 1980;

Jkxo^MM 1976; £Z?.^I978; Bt-tCfnrfuг 1979. При этом исследователи используют для криоконсервирования спермы различные среды, криопротекторы и режи мы охлаждения. Интересно отметить, что температура фторопластовой пластины при замораживании гранул очевидно не имеет существенного значения, так как многие исследователи считают её оптимальной, например, при криоконсеювапии спермы гусаков на и соавт, и соавт, уровне 56-70 до 190°С (А.Д.Курбатов, 1979, Р.Г.Царенко, 1980).

По результативности, консервация спермы в форме гранул не уступает таковой в ампулах. Лучший результат по сохранению оплодотворяющей способности спермы петухов составил 58%, гусаков - 80%. Однако уже доказанные, при хранении спермы млекопитающих в форме гранул, недостатки этого метода делают его неперспективным в птицеводстве. Более целесообразно было бы использовать для криоконсервирования спермы птиц облицованные гранулы по Харьковской технологии (Ф.И.Осташко и соавт. 1978).

При замораживании спермы птиц в опытах зарубежных исследователей иногда применяют упаковку из полимерных трубочек (пайет). Результативность этого метода значительно ниже, чем при криоконсервации замораживании в ампулах или гранулах. Так, в опытах сперму петуха расфасовывали после разбавления и эквилибрации в пайеты и замораживали в парах жидкого азота при температуре - НО —120°С. Оплодотворенность яиц после осеменения кур замороженно-оттаянной спермой составила в среднем за две недели яйцекладки - 22,3-23,2%. При сравнительном анализе двух способов криоконсервирования спермы петухов в пайетах и ампулах -^LzxteM zt, л/. П978) в первом случае использовали равномерное снижение температуры от 5 до -196°С со скоростью

7°С/мин., во втором - от 5 до 20°С со скоростью 1°С/мин., от -20 до -70 со скоростью 50°С/мин. и от -70 до -196 С - 60 С/мин. Оплодотворяющая способность спермиев при криоконсервировании в пайетах составила 18,5%, в ампулах 35,9%.

В опытах OtklJutJt (1976) сперму индюков также расфасовывали в пайеты и замораживали с равномерной скоростью 7°С/мин. до -19б°С. Оплодотворенность яиц индеек после осеменения деконсервированной спермой была в среднем 12,8% за первую неделю сбора.

Таким образом, сперму птиц, как и млекопитающих замораживают до температуры жидкого азота в ампулах,гранулах и пайетах. Однако каждой из упаковок присущи свои недостатки, поэтому необходимо вести поиск более эффективной формы упаковки и,соответственно, совершенствовать режимы охлаждения спермы.

Режимы оттаивания спермы

Известно, что скорость оттаивания спермы влияет на процессы рекристаллизации, гидратации протоплазмы спермиев и окружающей их среды. По данным Ф.И.Осташко (1961) при повышении температуры спермы от - 150 до 51°С происходит рекристаллизация твердой фазы в сторону увеличения размеров кристаллов, выделение скрытой теплоты , а также неравномерное тепловое сжатие различных структур спермиев (В.П.Кононов, 1982). В определенных условиях эти процессы могут привести к нарушению тонкой структуры и морфологической организации спермиев. В связи с этим, по мнению многих исследователей, при отогреве необходимо "проскочить" этот температурный диапазон с максимальной скоростью. При появлении жидкой фазы, которая вначале состоит из насыщенного раствора компонентов среды, клетки могут повреждаться под действием концентрационных факторов. По мере таяния льда концентрация раствора уменьшается и постепенно исчезают его вредные свойства. Поэтому необходимо как можно быстрее перевести воду из твердого состояния в жидкое, не опасаясь проявления температурного шока спермиев при быстром отогреве (Ф.И.Осташко, 1968).

В связи с этим, вполне закономерно появление тенденции к увеличению скорости оттаивания криоконсервированной спермы млекопитающих .

Что касается применения режимов оттаивания спермы птиц, то в этом вопросе нет единого мнения. Различные технологии предусматривают оттаивание спермы на водяной бане при 0°С ( Рлхк £t. (U. 1979); при 3°С ( 1978); при 37°С f л/1968, 1972, 1976) - при 55-65°С (А.Д.Курбатов и соавт. 1979); при 68-70°С (Р.Г.Царенко, Т.Г. Мавродина, 1980). Причем в некоторых случаях примерно одинаковые результаты были получены при различных режимах оттаивания. Указанная противоречивость литературных данных требует проведение дополнительных исследований по оптимизации режимов оттаивания спермы птиц, в частности гусаков.

Следует отметить, что вопросы определения оптимальных режимов замораживания и оттаивания спермы селезней почти не изучались, за исключением сообщения японских исследователей Ш-iouha^ -ezf. cU. (1974) обнаруживших, что выдержка спермы в парах жидкого азота в течение 1-3 минут дает лучшие результаты по активности спермиев, чем 0-1 - минутная перед погружением в жидкий азот.

Состав и роль сред для криоконсервирования спермы животных

В настоящее время одним из главных технологических приемов при криоконсервировании спермы животных является предварительное её разбавление криозащитной средой. Значение и роль сред при глубоком замораживании биологических объектов были осмыслены не сразу. Так, И.В.Смирнов в первых опытах по замораживанию спермы млекопитающих не применял предварительного её разбавления. В дальнейших же экспериментах он установилt что количество выживших половых клеток увеличивается при предварительном разбавлении спермы изотоническими растворами электролитов, или их смесью с неэлектролитами. В дальнейшем была выяснена роль различных компонентов сред. Так, введением в состав сред неэлектролитов можно снизить электропроводность спермы и тем самым устранить агглютинацию за счет предотвращения потери спер-миями электрического заряда. В этом отношении особенно эффективны сахара (В.К.Милованов, 1962), которые не только изменяют физико-химические свойства сред, но и используются спермиями в энергетическом обмене . . 'Tdrfu.'ie. 1954; ТИ&пп*, 1954). Однако последнее не имеет существенного значения, к тому же без ухудшения качества спермы моносахара можно заменить дисахарами или даже аминоук-сусной кислотой (И.Соколовская, 1956; А.Коротков, 1952).

Вместе с тем многие сахара, в той или иной степени, проявляют криозащитные свойства при замораживании клеток. В опытах ei. с</. (1950); ВЛхк£ксшг{ 1955) было обнаружено благоприятное действие фруктозы, арабинозы, ксилозы на спермии при криоконсервации. При замораживании спермы быков в виде гранул хороший результат был получен при включении в состав среды лактозы ( £/#/l964). Аналогичные результаты были получены в опытах (1968) при сравнительном изучении криозащитных свойств лактозы, глюкозы, фруктозы, раффинозы и других Сахаров.

Если при замораживании спермы быков преимущество введения в состав сред лактозы доказано большинством исследователей, то по использованию Сахаров в составе криозащитных сред спермы птиц существуют противоречивые мнения. Так одни исследователи сообщают о преимуществе сахарозы в составе криозащитной среды для замораживания спермы петухов в сравнении с глюкозой (3 dutign. 1975). Другие, наоборот, получали лушцую оплодотворяющую способность спермиев петухов при включении в состав криозащитной среды глюкозы ( 1977).

Несмотря на существенную роль Сахаров в составе криозащитных сред многими исследователями отмечено, что они в чистом виде не пригодны для разбавления и криоконсервации спермы. Среда, кроме Сахаров и других неэлектролитных компонентов., должна содержать растворы электролитов, в основном, нетоксичные соли с многовалентными анионами. Известно, что растворенные соли в той или иной степени диссоциируют с образованием анионов и катионов, в связи с этим их активное действие не биологический объект значительно возрастает. Различные ионы даже в незначительных концентрациях могут оказывать на сперму, как положительное,так и отрицательное воздействие. Так, Wcdid dа/к 1958) обнаружено повышение пе-реживаемости спермиев петухов при определенном количественном сочетании ионов калия, магния и кальция в синтетической среде; ионы лития и аммония оказались токсичными. Благоприятное действие на сперму петуха (при хранении) было обнаружено у раствоpa глутамата с антибиотиками; другие анионы (боррата, цитрата, глицина, фосфата и тартрата) оказались менее эффективными ( CtuoCftX С<Л. 1964).

В опытах А.Д.Курбатова, Е.А.Мамзиной и В.В.Комаровой (1976) хорошая активность спермиев петуха после замораживания-оттаивания получена при использовании сред из лактозы, рамнозы, глутамата натрия; раффинозы, инозитола, глутамата натрия и цитрата натрия; глюкозы, инозитола, глутамата натрия и цитрата натрия.

Другие исследователи , (1978), л/(1979) предлагают использовать в составе криозащитной среды сочетание раффинозы, лактозы, фруктозы, инозита и глутамата натрия. Кроме того предложено использовать для криоконсервации спермы петухов природную биологическую жидкость-молоко, которое сочетает в себе сахара, белки, липиды, аминокислоты, витамины, органические соли (Л.Е.Нарубина и соавт. 1973). Вместе с тем было отмечено значительное изменение качества спермы после замораживания оттаивания в зависимости от качества используемого молока (А.Д.Курбатов и соавт., 1978). Повышение качества молока путем введения витамина Дэ позволило авторам получить 58% оплодотворенности яиц при осеменении кур деконсервированной спермой. В последующих опытах исследователи вводили в молочную среду глюкозу и сахарозу, однако повысить существенно эффективность криозащитной среды не удалось (А.Д.Курбатов и соавт. 1979, 1980), Несмотря на перспективность молочных криозащитных сред лучшие показатели сохранения оплодотворяющей способности спермы петухов 80,3% были получены без применения биологических жидкостей ( 1978).

Исследователи, наряду с глицерином и поливинилпирролидономf использовали в качестве неэлектролитного компонента фруктозу и сочетание электролитов глутамата натрия, ацетата магния, ацетата калия. С использованием этой криозащитной среды был разработан способ криоконсервирования спермы петухов, дающийfв условиях фермы,высокие показатели (до 90%) оплодотворенности и выводимости яиц при осеменении кур деконсервированной спермой ( Хси/<Я 1981).

Известно также применение медовых сред при криоконсервации спермы гусаков (Р.Г.Царенко и соавт., 1978, 1979, 1980). Эти среды состоят из пчелиного меда, глутамата и цитрата натрия. С использованием медовых сред авторам удалось получить высокие (до 80%) показатели оплодотворенности яиц при осеменении гусынь замороженно-оттаянной спермой. Следует отметить, что пчелиный мед, составляющий основу среды,обладает непостоянством состава, существует множество его сортов и некоторые из них могут содержать ядовитые вещества, например, алкалоиды. Все это может привести к нестабильности качества замороженно-оттаянной спермы, снизить или совсем уничтожить её биологическую полноценность.

Таким образом, анализ литературных данных по использованию различных сред для криоконсервации спермы птиц показывает преимущество состава, включающего сочетание электролитов и неэлектролитов.

Обязательными компонентами, используемыми для криоконсервации спермы,являются криопротекторы (антифризы). Как было отмечено вше, одним из основных криопротекторов для различных биологических объектов является глицерин. Его криозащитные свойства открыл русский ученый Н.А.Максимов (1913). Криозащитными свойствами обладают также этиленгликоль ( л/1941), диметилсульфоксид ( ZLolrt'&C'k 1954). Некоторые криопротек-торы, например, диметилформамид и полиэтиленоксид по своей эффективности могут приближаться к глицерину, а в некоторых случаях превосходить его (А.Д.Бугров, и .соавт 1971; Ф.И.Осташко, 1968).

В настоящее время известно множество веществ, обладающих криопротекторными свойствами, однако механизм их действия окончательно не выяснен (Н.С.Пушкарь, А.М.Белоус, 1975). Все крио-протекторы по способности проникать в клетки разделяют на эндо-целлюлярные, экзоцеллюлярные и эндо-экзоцеллюлярные. Это разделение условно, поскольку один и тот же криопротектор может легко проникать в одни клетки и плохо проникать в другие. К эндоцеллголярным криопротекторам относятся глицерин, диметилсульфоксид, диметилформамид и другие. Эти органические вещества являются хорошими растворителями, стабилизируют водородные связи молекул; проникая в клетки, изменяют кристаллическую структуру воды, повышают стабильность различных органоидов при низких температурах ( к&Юиг аЛ. 1956; 'ftUutWLK 1968; Н.С.Пушкарь, А.М.Белоус, 1975;

Известно, что экстрацеллголярные криопротекторы - поливинил-пирролидон (ПВП) и различные сахара связывают внеклеточную воду, обволакивают клетки, защищая их от кристаллов льда и действия концентрированных растворов солей. Эндо-экзоцеллюлярные криопротекторы - моно-и диэтиленгликоль, полиэтиленгликоли, полиэтиленоксиды сочетают в себе свойства проникающих и непроникающих криопротекторов, они также обладают гидратирующими свойствами, структурируют воду. Механизм их действия полностью не выяснен. Более того эффективность известных криопротекторов для спермы различных видов животных и других клеток еще окончательно не установлена и часто подвергается сомнению. Так для спермы млекопитающих, в частности быка, глицерин является лучшим криопротектором, напротив на сперму птиц он оказывает токсическое действие 1949). При криоконсервировании спермы индюков в опытах fa^puri*. -с^. (1971) обнаружены лучшие криозащитные свойства у этиленгликоля и диметилсульфоксида, глицерин отрицательно влиял на спермии независимо от состава используемой среды. Следует отметить, что авторы в основном изучали сохранение подвижности спермиями после замораживания-оттаивания. Однако при использовании глю-козо-желточной среды,содержащей 7% глицерина,отмечено, что спермии индюков в процессе замораживания и хранения в жидком азоте не теряли своей подвижности, но оплодотворяющая способность спермиев составила всего 3,8% ( t. cU. 1973) Применение для разбавления спермы индюков среды Макферсона, в состав которой входит глицерин, позволило сохранить оплодотворяющую способность спермиев после замораживания-оттаивания на уровне 12,8-21%. Исследователи отметили, что замораживание спермы отрицательно влияет на жизнеспособность эмбрионов, причем, удаление глицерина центрифугированием после деконсервации положительного эффекта не дало. Исследования ультраструктуры спермиев с помощью электронной микроскопии показали наличие повреждений митохондрий на всех этапах криоконсервации ( TftaSlfrUjCd cU!. 1977). Несмотря на повреждения возникающие в процессе замораживания-оттаивания спермии индюков при внутриматочном осеменении индеек могут обеспечить опло-дотворенность яиц до 63%, даже если введение спермы во влагалище не приводит к оплодотворению яйцеклеток 1979). Это указывает на нарушение нормальной двигательной активности спермиев и функциональной деятельности их органелл, например, митохондрий. Использование других криопротекторов, в частности диметилсульфоксида, при замораживании спермы индюка показало, что и они оказывают токсическое действие на спермии. С помощью электронной микроскопии было обнаружено 60-70% повреждений оболочки спермиев уже после разбавления средой, содержащей диметилсульфоксид. При этом 25% спермиев с поврежденной оболочкой имели изогнутую форму, 75% - набухшие митохондрии

1979). Токсический эффект диметилсульфоксида и, очевидно других криопротекторов, можно значительно снизить путем оптимизации соотношения буферных растворов и нейтральных солей в синтетической среде ( -dxsxtpn. 1980).

Токсический эффект многих криопротекторов обнаружен и при криоконсервации спермы петуха, однако причины и механизм его проявления еще окончательно не выяснен. Так,присутствие глицерина в сперме петуха даже в 1% концентрации резко снижает её оплодотворяющую способность, причем глицерин не влиял на развитие эмбрионов

1971). В связи с этим исследователи предположили, что. противозачаточное действие глицерина проявляется в процессе оплодотворения, или на ранних стадиях деления зиготы. Причем по данным ^dk^Cawiw 1976) по сравнению с другими криопротекторами,в среде с глицерином процент морфологически измененных спермиев был несколько выше. Более тонкое изучение ультраструктуры спермиев после замораживания-оттаивания показало отслоения акросомы, набухание в области шейки и тела, разрушение митохондрий, разрыв клеточных мембран и даже диструкцию хроматина в клеточных ядрах /Зг^/илил 1979). Исследователи сообщили, что эти повреждения особенно сильно проявляются при использовании глюкозо-желточной среды с глицерином и в меньшей степени в саха-рид-глутаминатной среде с этиленгликолем.

Следует отметить, что противозачаточные свойства глицерина проявлялись,в основном,при разбавлении и замораживании спермы в простых средах, состоящих из незначительного числа компонентов, и, очевидно, плохо сбалансированных по электролитам и неэлектролитам. Иначе чем можно объяснить тот факт, что при использовании в качестве криопротектора глицерина получены высокие показатели (80,3-90,0%) оплодотворенности и выводимости яиц при осеменении кур замороженно-оттаянной спермой ( Зжкл Ct-Cci, 1981).

Поиск более эффективных, чем глицерин криопротекторов при замораживании спермы петухов продолжается. В некоторых опытах более эффективным криопротектором, чем глицерин и диметилсуль-фоксид был этиленгликоль (Л.Е.Нарубина, Б.И.Иванов, 1973;

1975; ^LktCcton* -ct, <3^1976; h^OLKH

-Ci. 'aJ. 1979; А.Д.Курбатов и соавт., 1976, 1978, 1980). Однако самая высокая оплодотворенность яиц при осеменении кур замороженно-оттаянной с этим криопротектором спермой, не превысила 58% (А.Д.Курбатов, 1978).

В исследованиях Р.Г.Царенко и соавт. (1978) по криоконсер-вированию спермы гусаков также обнаружено токсическое действие глицерина, причем снижение его уровня в медовой среде с 5-10% до 1-3% оказывало положительное влияние на спермии. Кроме того авторы отметили, что сочетание глицерина с поливинилпирролидо-ном, как криопротекторов эндо-и экзоцеллюлярного действия более эффективно, чем их раздельное применение. В дальнейших исследованиях авторы испытывали эффективность глицерина, диметил-сульфоксида и этиленгликоля как криопротекторов спермы гусаков. Оплодотворяющая способность спермиев после замораживания-оттаивания сохранилась в лучших группах на уровне 34,7; 57,7; 51,1% соответственно. Таким образом, диметилсульфоксид оказался более эффективным криопротектором, чем этиленгликоль или глицерин. Следует отметить, что во всех случаях авторы использовали для разбавления спермы медовую среду, что могло внести некоторые неучтенные факторы (Р.Г.Царенко и соавт, 1979). Очевидно, поэтому при использовании для разбавления спермы гусаков инози-тол-глюкозной среды, содержащей 5% диметилсульфоксидах и последующего замораживания-оттаивания оплодотворяющая способность спермиев сохранилась в лучшей группе на уровне 77,8% (Р.Г.Царенко, Т.М.Мавродина, 1980).

Таким образом, для криоконсервации спермы птиц используются различные среды и криопротекторы, их эффективность еще низка для широкого внедрения в птицеводческую практику. Анализируя литературу по криобиологии спермы птиц можно прийти к выводу, что вещества используемых в составе криозащитных сред должны иметь низкую токсичность даже в больших концентрациях. Криоза-щитные среды должны содержать хорошо сбалансированный состав электролитов и неэлектролитов с учетом типа и свойств используемых криопротекторов.

Удаление криопротекторов из оттаянной спермы

Известно, что сразу же после оттаивания сперма млекопитеющих пригодна для искусственного осеменения самок. В процессе изучения и разработки способов криоконсервации спермы птиц исследователи наблюдали, при хорошей активности спермиев после декон-сервации полную или частичную потерю их оплодотворяющей способности. Впервые с этим явлением столкнулись pe^t^C cut. (1949). Авторы замораживали сперму петуха в средах содержащих и более глицерина и предположили, что потеря оплодотворяющей способности спермиев связана с резким выходом глицерина в половых путях курицы. В связи с этим был использован диализный метод удаления глицерина из спермы, что позволило существенно повысить эффективность криоконсервации.

Однако диализный метод удаления глицерина трудоемок и требует % значительных затрат времени. Кроме того длительная выдержка спермы птиц при плюсовых температурах снижает её оплодотворяющую способность. Поэтому в дальнейшем стали удалять криопротекторы из деконсервированной спермы методом центрифугирования,

Следует отметить, что при использовании несовершенной методики удаления криопротекторов, сам по себе процесс обработки оттаянной спермы может привести к значительным повреждениям спермиев. Так в опытах СТь-и^ссМа €~t. <2^(1966) при испытании методов центрифугирования и диализа удалось сохранить оплодотворяющую способность спермиев только в контрольной группе.

Уровень концентрации криопротектора в сперме можно снизить путем её оттаивания в среде без криопротектора. При испытании этого способа в исследованиях Л.Е.Нарубиной и соавт. (1975) криоконсервированнуто в жидком азоте сперму оттаивали в подогретой до 40° С среде ВИРШ-1 без глицерина, из расчета общего разбавления 1:10. После этого сперму центрифугировали и к осадку снова добавляли среду. Очевидно, этот технологический прием для спермы птиц оказался неудачным, так как оплодотворяющая способность спермиев полностью терялась. В данном случае причины потери оплодотворяющей способности спермиев могут быть различны, и наиболее вероятной причиной, по нашему мнению, является использование для вымывания глицерина непригодной для этой цели среды. Тогда как применение многокомпонентных и хорошо сбалансированных по составу сред Тироде и Рингера более эффективно, чем простых сред, например, изотоничного раствора поваренной ооли {ЛЬъ&Ыуц 1976). Кроме того повреяодающее действие может оказать используемый режим центрифугирования, от которого зависит плотность осадка, длительность воздействия гравитационных перегрузок ( 1977).

Учет отрицательных факторов позволил ^cukz. (1968) усовершенствовать этот способ удаления глицирина из деконсервированной спермы петухов. Наиболее успешным было очень осторожное предварительное снижение концентрации глицерина в замороженно-отта-янной сперме путем постепенного разбавления(1:27) специальной средой без криопротектора, затем её центрифугирование 15 минут при 700^в холодной центрифуге. Использование усовершенствованного способа удаления глицерина позволило исследователям получить в условиях фермы до 90% оплодотворенности яиц при осеменении кур деконсервированной спермой d а/1981).

Интересно отметить, что в медицине диализный и центрифужный методы удаления вредных веществ из крови, в настоящее время почти полностью вытеснен сорбиционной очисткой активированными углями. Этот эффективный и простой метод, к сожалению, до сих пор не используется для удаления криопротекторов и токсичных продуктов метаболизма из спермы.

Таким образом, необходимо дальнейшее совершенствование способов удаления криопротекторов из деконсервированной спермы, особенно гусей и уток, из-за отсутствия подобных исследований на сперме этих видов птиц.

Некоторые аспекты криоповреждения и криозащиты

Основными факторами,повреждающими клетку при криоконсервиро-вании,могут быть: I. температурный шок клеток. Существует несколько теорий объясняющих это явление, наиболее общепризнанной является теория,предложенная Ф.И.Осташко (1968). Согласно этой теории в основе температурного шока лежат осмотические процессы возникающие при охлаждении клеток. Причем исследователем было установлено, что под действием осмотических процессов происходят повреждения не только наружной цитоплазматической мембраны, но и мембранного аппарата органоидов клетки. Кроме того установлена единая природа температурного (осмотического шока) в зоне плюсовых и низких температур}при которых еще существует жидкая фаза. Эффективными способами устранения температурного шока является применение в составе криозащитной среды желтка куриного яйца и оптимизация режимов охлаждения.

2. Повышение концентрации электролитов во внеклеточной среде. В некоторых случаях большая часть клеточных повреждений при замораживании может возникать при увеличении концентрации внеклеточных и внутриклеточных солей (<^toc^'&ck 1954). В подтверждение этого были обнаружены критические зоны температур в которых повреждения клеток происходят с максимальной интенсивностью. Причем в первую очередь денатурирующему действию солей подвергается липопротеиновый комплекс мембран, в результате чего последняя становится проницаемой для ионов. Отсюда проявление криозащитного действия глицерина со способностью уменьшать в критической температурной зоне эффективную концентрацию солей. Уменьшить денатурирующее действие солей могут также быстрое замораживание и быстрый отогрев за счет уменьшения этого воздействия ( Zeut^ot-k 1953).

3. Повреждающее действие обезвоживания клеток. Вымерзание внеклеточной воды приводит к увеличению осмотического давления раствора, окружающего клетки, в результате чего происходит выход части свободной воды клеток и уменьшение их объема (

1968, 1974). В результате частичной дегидратации клеточных структур возникают чрезмерные механические напряжения на плазматической мембране и нарушение её полупроницаемости. Кроме того, при дегидратации клеток уменьшается растворимость внутриклеточных солей, изменение рН среды, повышение концентрации метаболитов. При уменьшении объема клеток происходит увеличение пор в плазматической мембране, которые необратимо фиксируются межмолекулярным связыванием липопротеидов, в следствие этого при оттаивании клетки теряют содержимое и погибают ( с'fL&trt-tt ct,a>t 1970). Согласно теории 1968) неспособность клетки сжиматься ниже определенного предела приводит к возникновению повреждающего клетки осмотического и гидростатического давлений. Проявлением указанных процессов автор объясняет момент возникновения криоповреждений,но не объясняет их механизма.

4. Механические повреждения клеток. При некоторых условиях замораживания клетки могут повреждаться межклеточными и внутриклеточными кристаллами льда. Это связано, в основном, с аномальным свойством воды характеризующимся объемным расширением льда. Кроме того температура кристаллизации и коэффициент объемного расширения льда может иметь различное значение в зависимости от наличия растворенных в воде органических и неорганических молекул, их концентрации. Следовательно, в пограничных зонах различных систем твердой фазы могут возникать значительные механические напряжения и соответственно разрушения клеток. (О.Смит, 1963). В связи с этим защитное действие глицерина связывают со способностью растворяться в воде наиболее гидратиро-ванных структур клетки и уменьшать их объемное тепловое расширение ( В.Кононов, 1982).

Указанные выше повреждающие факторы можно значительно уменьшить или устранить путем - а). Повышения осмомолярности растворимых в клетке веществ. В этом случае минимальный объем клетки образуется при более низкой температуре; б) Введения в клетку безвредного балластного вещества^занимающего часть её объема, это приведет к большему удалению воды из клетки при сохранении минимального объема; в) Обратимого увеличения проницаемости плазматической мембраны для некоторых веществ, это предотвратит возникновение осмотического градиента на границе клетка -окружающая среда; г) Применения в составе криозащитных сред компонентов укрепляющих клеточную мембрану, и тем самымпрепятствующих проявлению различных повреящающих факторов.

В настоящее время в некоторой степени указанным выше требованиям удовлетворяет комплексное использование,проникающих и непроникающих криопротекторов в составе криозащитных сред, а также выбор оптимальных режимов замораживания и отогрева клеток.

Разработку этих вопросов на сперме водоплавающих птиц можно считать недостаточной, что и послужило причиной проведения данной работы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Андреев, Валерий Иванович

ВЫВОДЫ

1. Измерения рН спермы гусаков и селезней, а также рН среды в яйцеводах птиц показали слабокислую реакцию в яйцеводах и щелочную в сперме.

2. Изучение влияния рН опытных сред на спермии гусаков и селезней выявили наибольшую выживаемость половых клеток при рН криозащитной среды близкой к рН среды в яйцеводах птиц.

3. Подтверждена закономерность установленная Ф.И.Осташко (1963) зависимости термогенеза спермы от биологической полноценности спермиев и условий окружающей среды, на основании которой разработан "Способ определения пригодности сред для разбавления спермы птиц а.с. № 641962.

4. При глубоком замораживании спермы гусаков и селезней физиологически обоснованным составом является среда Б-26, включающая гликокол, лактозу, маннит, калия цитрат, натрия глутамат, магния ацетат, поливинилпирролидон и дистиллированную воду.

5. Установлен факт криозащитного действия диметилформамида при замораживании спермы гусаков и селезней позволяющего сохранять её оплодотворяющую способность на уровне цельной спермы.

6. Подтверждено наличие у спермиев гусаков и селезней чувствительности к температурному шоку и определена оптимальная скорость охлаждения спермы в зоне плюсовых температур.

7. Лабораторными методами и методом биологического контроля установлено, что длительность выдержки (эквилибрации) спермы гусаков и селезней в среде содержащей в качестве криопротектора диметилформамид не должна превышать 10 минут.

8. Обработка спермы в период эквилибрации магнитным полем не оказывала отрицательного влияния на её активность после замораживания -оттаивания.

9. При замораживании спермы гусаков и селезней в металлических кюветах оптимальные физиологические условия охлаждения создаются при снижении температуры от 0°С до -98°С со скоростью 40 -60°С/мин. и от-98°С до - 196°С со скоростью 8-15°С/мин.

10. На сперме птиц подтверждено преимущество быстрого режима оттаивания (при 85°С) по сравнению с замедленными (при 0-20°С).

11. Усовершенствован способ сорбционного удаления криопротектора из деконсервированной спермы, улучшающей физиологические условия для выживаемости спермиев после оттаивания и при введении в половые пути самки.

12. Разработан способ замораживания спермы птиц (авт.свид. 9I2I65), позволивший получить при осеменении гусынь деконсервированной спермой оплодотворенность яиц до 92,1% и вывод гусят до 73,7%; при осеменении уток эти показатели составили соответственно - 39,8 и 30,0%.

13. Обнаружены общие закономерности влияния низких температур на сперму быков-производителей и водоплавающих птиц.

В частности, охлаждение спермы с равномерными скоростями падения температуры - 20-50°С/мин. вызывает значительно меньше повреждений спермиев, чем со скоростями - I -Ю°С/мин. и 60 - Ю0°С/мин.

14. Усовершенствована аппаратура для охлаждения спермы позволяющая воспроизводить заданный режим (в пределах 0,5 -300°С/мин.) с высокой точностью.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

С целью повышения эффективности селекционно-генетической работы в птицеводстве и улучшения качества замороженно-оттаянной спермы рекомендуется использовать для создания спермо-банка гусаков и селезней "Способ замораживания спермы птиц" (авт.свидетельство № 9I2I65), криозащитную среду Б 26 включающую в качестве криопротектора диметилформамид. Способ апробирован в УНИИП и Тарановской птицефабрике Харьковской области и рекомендован к широкому внедрению.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андреев, Валерий Иванович, Харьков

1. КПСС. ЦК Пленум. 1982. Май. Продовольственная программа СССР на период до 1990 года и меры по её реализации. Материалы Майского Пленума ЦК КПСС 1982 года. М., Госполитиздат, 1982,с.НО.

2. Андреев В.И. Устройство для изучения режимов охлаждения спермы птиц.- Научно-технический бюл. ВАСХНИЛ ЮО УНИИП, Харьков, 1977, 6-7с.

3. Андреев В.И. Способ измерения рН в микро-и макрообъемах исследуемых проб. Лабораторное дело. 1978, № 7, с.440.

4. Андреев В.И. Исследования по криоконсервации спермы селезней. -Тезисы докладов ХХП конференции молодых ученых и аспирантов по птицеводству. Загорск, 1979, с.30-32.

5. Андреев В.И. Установка для криоконсервации спермы птицы.-Тезисы докладов ХХШ конференции молодых ученых и аспирантов по птицеводству. Загорск, 1981, с.51-52.

6. Андреев В.И., Сахацкий Н.И. Консервация спермы селезней. -- Птицеводство, 1979, № I, с. 31.

7. Андреев В.И., Сахацкий Н.И. Способ определения пригодности сред для разбавления спермы птиц. Авторское свидетельство СССР № 641962, Опубл. в Б.И., 1979, № 2.

8. Бернштейн А.Д., Петропавловский В.В. Влияние неэлектролитов на переживание сперматозоидов (сообщ.З). Бюл. экспериментальной биологии и медицины. 1937, № 3, с.1.

9. Белькевич В.И., Ключарева З.С., Ромве С.Т., Филаретова Н.В. О предохранении сперматозоидов быка от холодового удара. Труды Всесоюзн.ин-та животноводства, 1959, вып. 23, с.68-70.

10. Бугров А.Д., Шинкаренко Н.й.,Шулиндина Т.А. Замораживаниеспермы быков с диметилформамидом. -Республ.междувед.темат.сборник, 1971, №26, с.20-25. (на укр.языке).

11. Давтян А.Д. Новый разбавитель для семени гусаков. -Материалы Всесоюз. науч.совещаний и конференций /ВНИТИП, 1971, вып.4, с.195-198.

12. Давтян А.Д., Пименов Б.В. Разработка техники искусственного осеменения гусей. Труды ВНИТИП, 1969, вып.№33, с.26-30.

13. Давтян А., Пименов Б. Искусственное осеменение гусей. -Птицеводство, 1970, № II, с.29-30.

14. Дузу П. Криобиохимия (введение) М., Мир, 1980, с.37-47.

15. Душейко О.И. Исследование защитного действия криопротектан-тов в связи с длительным хранением спермы быков-производителей: Автореф.кадд. дисс.,-Харьков, 1972 с.4-20.

16. Ельчибаев А.С., Хван В.П. Опыты по искусственному осеменению уток. Сб.научных статей Казахской ЗОСП, 1976, № 2,с. I5I-I55.

17. Енин В.П. Оттаивание и использование семени быков, замороженного ввиде гранул. В кн.: Применение методов замораживания семени быков. Байсогала, 1974, с.19-20.

18. Иванов И.И. Опыты искусственного оплодотворения птиц. -Известия С-Питербургской биологической лаборатории, 1914,т.14, вып.1, с.54.

19. Иванов И.И. Искусственное оплодотворение млекопитающих (предварительное сообщение). В газете "Русский врач", 1903, т.2, № 12, с.455-457.

20. Иванов Б.И. Влияние этиленгликоля как криопротектора при замораживании спермы петухов. Материалы 3 конференции молодых ученых по генетике и разведению с-х животных, Л., 1973,с.407-408.

21. Иванов Б.И., Курбатов А.Д., Нарубина Л.Е., Бубляева Г.В. Коэффициент устойчивости спермы петухов к температурному шоку со способностью переносить замораживание.- Бюлл./ВНИИРПК, № 32, Л., 1978, с.23-26.

22. Каланин Ф.Л., Лобов В.П., Жидков В.А. Справочник по биохимии. К., 1971, с.882-891.

23. Комарова В.В., Воронина М.С. Среда для длительного хранения спермы петухов. Бюл./ВНИИРГЖ, Л., 1978, № 32, с. 13-16.

24. Кононов Б.П. Тепловое расширение в сперме при замораживании.- Доклады ВАСХНИЛ, 1982, № 5, с.33-34.

25. Короткое А.И. Хранение семени быков-производителей при температуре -20°С и оплодотворяемость коров. Бюл./НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР, 1958, № 3, с.176-181.

26. Косов В.Н., Бондаренко А.П. Искусственное осеменение гусей как метод воспроизводства. Совершенствование технологии производства продуктов птицеводства. Труды Кубанского с-х института, 1977, вып.153 (181), с.26-29.

27. Кузнецов М.П., Милованов В.К., Нейман О.Ф., Нагаев В.Л., Скаткин П.Н. Искусственное осеменение крупного рогатого скота.-М., Сельхозгиз, 1932, с. 15-52.

28. Курбатов А.Д., Нарубина Л.Б., Иванов Б.И. Влияние добавки в сперму петухов глюкозы, фруктозы, сахарозы и лактозы на пере-живаемость сперматозоидов.-Сб. научных трудов ВНИИРПК, 1970, вып.16, с.94-97.

29. Курбатов А.Д., Богомолов В.В., Тур Б.К. Опыт хранения и транспортировки спермы петухов. Птицеводство, 1972, № 2, с.23.

30. Курбатов А.Д., Нарубина Л.Е., Иванов Б.И. Испытание некоторых криопротекторов при замораживании спермы петухов. -Новое в разведении и генетики с-х животных. Сб.научных трудов ВНИИРГЖ. 1973, вып.21, с.198-202.

31. Курбатов А.Д., Воронина М.С. Влияние разбавления спермы петухов растворами различных Сахаров и хранение её при температуре 2-4°С на распределение ионов натрия и калия клетка -- среда. -Бюл. ВНИИРГЖ, 1976, № 18, с.28-31.

32. Курбатов А.Д., Мамзина Е.А., Комарова В.В. Использование различных углеводов при разработке методов хранения спермы петухов. Теоретические основы разведения генетики и селекции с.-х. животных. 1976, вып.23, с.115-121.

33. Курбатов А.Д., Нарубина Л.Е., Иванов Б.И., Бубляева Г.Б. Разбавитель спермы птиц. Авторское свидетельство СССР553973, Опубл. в Б.И., 1977, № 14.

34. Курбатов А., Нарубина Л., Иванов Б., Бубляева Г., Царен-ко Р. Замораживание спермы гусаков в жидком азоте. -Птицеводство, 1977, № 2, с.33.

35. Курбатов А.Д., Царенко Р.Г.,Попов И.И. Влияние разбавления спермы гусаков различными средами на переживаемость и оплодотворяющую способность сперматозоидов. Сб.научных трудов ВНИИРПК, 1978, вып.24, с.150-154.

36. Курбатов А.Д., Нарубина Л.Е., Иванов Б.И., Бубляева Г.Б. Способ замораживания спермы. Авторское свидетельство СССР656621, Опубл. в Б.И., 1979, № 14.

37. Лопухин D.M. Гемосорбция. -М., 1977, с.5-20.

38. Лозина-Лозинский Л.К., Румянцева'В.Н. Сравнительное исследование действия переохлаждения и замораживания на дрожжевые клетки. Цитология, 1978, т.20, вып.Х, с.74-79.

39. Максимов Н.А. (I9I2-I9I3) Цит. по Осташко §.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. -К., 1978, с.79.

40. Малис П.З. Сравнение различных методов получения спермы у гусаков -Птицеводство, 1973, № 16, с.51-53. (на укр.языке).

41. Мамзина Е.А., Комарова В.В. Метаболизм в семени петухов.-Сб.научных трудов ВНИИРГЖ, 1973, вып.19, с.193-197.

42. Мамзина Е.А., Комарова В.В. Испытание различных Сахаров в качестве сред для сохранения спермы петухов. -Записки Ленинградского СХИ. 1975, вып.272, с.69-77.

43. Милованов В.К., Соколовская И.И. Теория холодового удара живчиков млекопитающих.- Доклады ВАСХНИЛ, 1959, № 8, с.3-8.

44. Милованов В.К., Соколовская И.И. О холодовом ударе живчиков сельскохозяйственных животных млекопитающих.- Животноводство, I960, № I, с.73-79.

45. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных. М., 1962, с.494-912.

46. Морозова Л.Д. Содержание ионов магния и кальция в сперме петухов и их связь с биологическими свойствами спермиев.- Тезисы докладов молодых ученых по птицеводству. Загорск, 1979,с.25-26,

47. Нарубина Л.Е. К вопросу о возможности снижения токсичности некоторых криопротекторов при замораживании спермы петухов.- Материалы 3 конференции молодых ученых по генетике и разведению с.-х животных. Л., 1973, с.408-409.

48. Нарубина Л.Е., Курбатов А.Д. Интраперитониальное осеменение кур замороженной в гранулах. Методические указания по исслед. физиол. и биохим.спермы, ВНИИРГЖ, Л., 1974, с.102-104.

49. Нарубина Л.Е., Курбатов А.Д., Бубляева Г.Б. Изучение защитных свойств глицерина при замораживании спермы петухов. -Бюлл ВНИИРГЖ, 1975, № 9, с.41-43.

50. Нарубина Л.Е., Курбатов А.Д., Бубляева Г.Б., Иванов Б.И. Совершенствование молочной среды для длительного хранения спермы петухов. -Бюлл./ВНИИРГЖ, Л., 1978, № 32, с.3-7.

51. Николаев В.Г., Стрелко В.В. Гемосорбция на активированных углях. К., Наукова Думка, 1979, с.284.

52. Осташко Ф.И. Длительное хранение семени быков при температуре 183°С. - Социалистическое животноводство, 1959, № II, с.14-15 (на укр. языке).

53. Осташко Ф.И. Исследования по замораживанию семени быков. Труды НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР, Харьков, 1961, т.31, вып. I, с.31 (на укр.языке).

54. Осташко Ф.И. Длительное хранение семени производителей сельскохозяйственных животных в замороженном состоянии. М., Сельхозгиз СССР, 1962.

55. Осташко Ф.И. О природе холодового удара живчиков. Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. В сб. работ НИИЖ Лесостепи и Полесья УССР, Харьков, 1963, с.22-40.

56. Осташко Ф.И. Причины и механизм холодового удара клеток (половых) Международный сельскохозяйственный журнал, 1964,3, с. 100-109.

57. Осташко §.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. К., "Колос", 1968, с. 248.

58. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. К., "Урожай", 1978, с. 38-163.

59. Осташко Ф.И., Бугров А.Д. О глубоком замораживании спермы быков-производителей.- Вестник с-х науки, 1966, № 4, с.86-91.

60. Осташко Ф.И., Андреев В.И. Влияние способов удаления криопротекторов на подвижность и оплодотворяющую способность сперми-эв селезней. Птицеводство, К., Урожай, 1982, вып.34, с.26-28.

61. Павлов Г.П. Влияние температуры на сперматозоиды.-Русск. физиологический журнал. 1927, № 10, с. 3-4.

62. Платов Е.М. Осмотическое действие глицерина на живчиков 5ыка.- Весник сельскохозяйственной науки, I960, № II, с.59-63.

63. Плишко H.T. Способ продления жизни и оплодотворяющей способности половых клеток хряка. Свиноводство, 1965, № 6, с. 37-41.

64. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. -К. Наукова Думка, 1975, с. 270-319.

65. Сахацкий Н.И. Оплодотворяющая способность спермиев индюков в связи со способами взятия и использования. -Автореф. канд. дисс., Харьков, 1976.

66. Сахацкий Н.И., Андреев В.И. Способ обработки спермы птиц. Авторское свидетельство СССР № 69II32, Опубл. в Б.И., 1979, № 38.

67. Сахацкий Н.И., Андреев В.И. Жизнеспособность спермиев птиц в зависимости от свойств сред. Птицеводство, К., "Урожай", 1979, вып.28, с.9-13 (на укр. языке).

68. Сахацкий Н.И., Андреев В.И. Действие криопротекторов на спермии гусаков. Птицеводство, К., "Урожай", 1980, вып. 29, с.20-23.

69. Сахацкий Н.И., Андреев В.И. Способ замораживания спермы птиц. Авторское свидетельство СССР № 9I2I65, Опубл. в Б.И., 1982, № 10.

70. Сахно В.Ф., Платов Е.М., Успенский А.И. Глубокое замораживание спермы быков (обзор). ВИНТИСХ, М., 1969, с.100.

71. Семаков В.Г. Совершенствование методов замораживания спермы быков (обзор). -/ВНИЙТЭИСХ. М., 1977, с.41.

72. Смирнов И.В. Сохранение спермы сельскохозяйственных животных посредством глубокого охлаждения. -Советская зоотехния, 1949, вып.4, с.93-96.

73. Смирнов И.В. К вопросу о холодовом ударе спермиев. -Научные труды киевской оп.станции животноводства, К., 1961, т.7, с.61-70.

74. Смирнов И.В. Холодовый удар спермиев взятых из придатка семенников. -Труды Киевской опытной станции животноводства, 1962, т. 8, с.

75. Смирнов И.В. Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. -К., 1976, c.II3-I30.

76. Смирнов И.В. Теоретические основы глубокого охлаждения спермы животных. Криобиология и криомедицина. - К., Наукова Думка, 1980, № 7, с.10-14.

77. Смит 0. Открытие защитного действия глицерина на птичьи сперматозоиды при низких температурах. В кн.: Биологическое действие замораживания и переохлаждения. - М., Изд-во иностр. лит., 1963, с.25-29.

78. Царенко Р.Г., Мавродина Т.Г., Попов И.И. Криопротекторное действие глицерина и ПВП при замораживании спермы гусаков. -Бюл./ВНИИРГЖ, Л., 1978, № 32, с.27-30.

79. Царенко Р.Г., Курбатов А.Д., Мавродина Т.Г. Влияние сверхнизких температур на сохранность качеств спермы отдельных петухов. Бюл./ВНИИРГЖ, Л., 1979, № 40, с.35-39.

80. Царенко Р.Г., Курбатов А.Д., Мавродина Т.Г. О снижении оплодотворяющей способности спермы гусаков к концу племенного сезона. Бюл./ВНИИРГЖ, Л., 1980, № 43, с.28-33.

81. Царенко Р.Г., Курбатов А.Д., Мавродина Т.Г. О снижении оплодотворяющей способности замороженно-оттаянной спермы гусаков к концу племенного сезона. Бюл./ВНИИРШ, Л., 1980, * 43,с.28-34.

82. Царенко Р.Г., Курбатов А.Д., Мавродина Т.Г. Способ замо-аживания спермы гусей. Авторское свидетельство СССР № 965429, Оцубл. в Б.И. 1982.

83. Хронопуло Н.П. Диализный метод сохранения спермы барана.-Доклады ВАСХНИЛ, 1940, № 5, с.28-31.

84. Шахбазов В.Г. О механизме низкотемпературного повревдения клеток, Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины. -К., Наукова Думка, 1974, с.32-34.

85. Шилин С.В., Давтян А.Д., Отпущенников В.Ф. Рекомендации по искусственному осеменению уток. Загорск, 1975, с.4-9.

86. Юшенко В.Г., Левин К.Л. Температурные режимы при замораживании семени быков. Весник сельскохозяйственной науки, 1975, № 12, с. 63-66.

87. Auger H.V., Wilcox F.H. The effect of various anions on the fertilizing capacity of fowl spermatozoa.- Poultry Sci., 1964, v.43, N 4, p.834-859.

88. Bajpaj P.K., Brown K.I. The effect of different temperatures on the metabolic activity, morfology and fertilizing capacity of turkey semen. Poultry Sci., 1964, v.43, N 6, p.1501-1508.

89. Bechstedt U., Schramm G. Hermerschmidt. Gadrum Monatshefte fur Veterinarmedizin, 1977,Jg.32, N 24, s.945-947.

90. Bergmann V., Schramm G. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zur Wirkung der Tiefgefrierkonservierung auf Hahnensper-nien. Arch. Tierzucht, 1979, Bd.22, N 1, s.47-54.

91. Berntson W.E., Foote R.H. The freezability of spermatozoa after minimal prefreezing exposure to glycerol of lactose. Crio->iology, 1972, v.9, N 1, p.57-60.

92. Blakshow A.W. Factor affecting the survival of bull and ?am spermatozoa after freezing to -79°C. Austral. Veterin., 1955, r.31, N 9, p.238-241.

93. Blom E. The ultrastructure of bull sperm. -Nord. veteri-larmed., 1960, N 12, p.261-279.

94. Blom E., Birch-Andersen A. Ultrastructure of the bull iperm. 11. The sperm head. World Veter.Med., 1965, N 17, p.193-!12.

95. Bonadonna Т. Probleme der Fortplanzung und der Kunstie-hen Besamming der Tiere in Japan. Luchthung Fortplanzungstor und Besam. Haustiere, 1961, Bd.5.

96. Brown K.I. Storage of turkey semen. Poultry Sci., 1966, v.45, N 5, Р.Ю73.

97. Brown K.I., Graham E.F. Effect of some criophylatic agents on turkey spermatozoa. Poultry Sci., 1971, v.50, N 3» p.832-835»

98. Burrows W.H., Quinn J.P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Sci., 1937, v»16, N1, p.19-24.

99. Cassou R. La methode des paillettes en plastique adapt a la generalization de la congelation. Proc. Intern. Congr. Anim. Reprod. Art. Ensem., Trento, 1964, p.14-17.

100. Chelmonska В., Dutzko M. Skutki przechowywania nasienia ptakow domowich Zomrozonego w cieklum azocie. Zesz. probl.poste-pow nauk rol., 1972, N 124, p.151-155.

101. Csuca J., Ledec M. К problematike a uloham inseminacie hydiny v CSSR. Nas Chov, 1978, v.38, N 10, p.435-436.

102. Davson P. VI Congress international de reproduction ani-mall et insemination artificial, Paris, 1968, N 11, p.1021.

103. De Silva P.L.G. Data on the lack of temperature shock in poultry semen. J. Reprod. Pert., 1963, v.6, N 3, p.325.

104. Dietz R.W., Flipse R.J., 1966. Цит. по Осташко у.И. Глубокое заморакивание и длительное хранение спермы производителей.-К., 1978, с.14.

105. Emmens C.W., Blackshow А.В. The low temperature storage of ram, bull and rabbit spermatozoa. Austr. Vet. J., 1950, v.26, N 9, p.226-228.

106. Farrant J., Knight S.C., Mc Gann L. Optimal recovery oflymphocytes and tissue culture cells following rapid. Nature, London, 1974, v.249, N 5456, p.452-453.

107. Friars G.W., Chatterjee S. Effect of semen collection and storage temperatures on sperm viability and fertility in turkeys.-Poultry Sci., 1969, v.48, N 4, p.1434-1437.

108. Goffaux M. Aptitudes des taureaux utilisables en insemination artificielle a la production de semence capable de supporter la congellation. Annales de Zootechnie, 1964, v.13, II 1,p.87-92.

109. Hulthas C.A. Versuche mit pelletiertem sperma in Schwe-den. Tierzucht, Bd.18, N 8, s.25-40.1966,

110. Hutt F.B. On the relation of fertility in fowls to the amount of testicular material and density of sperm suspension. -Pro. Roy. Soc., Edinburgh, 1929, N 49, p.102.

111. Jacquet J.L. L, insemination artificialle ans 1, espresse bovine a vingyans. Considerations et reflection sur celte technique. C.R.Acal. Acad. Agr. de France, 1966, v.32, N 5» p.236.

112. Karow A.M., Webb W.R., Stapp J.B. 1956. Цит. по Пушкарь H.C. Белоус A.M. Введение в криобиологию. К., 1975, с. 279.

113. Kojima Ioshio. Electron microscopic study of the bull spermatozoa. Jap. J. Veterin. Res., 1966, v.14, N 1/2, p.1-62.

114. Kuhnau J. Lebenenorgange beitiefen temperaturen. Allgem Sortetcht., 1963, v.11, N 10/12.

115. Lada-Gorzowska A., Watanabe M. Freezing of fowl semen (Gallus domesticus). J. Fac. Fich. Anim. Husb. (Hiroshima Univ.),1978, v.17, N 2, p.143-144.

116. Lada-Gorzowska A., Krawzyk E., Podgorny E. Badnia nad Zam-razanien nasienia kodutu w cieklum azocie. Rocz nauk Zootehn.,1979, v.6, N 2, p.29-41.

117. Lake P.E. Studies on the dilution and storage of fowl semen. J. Reprod. Pert., 1960, v.1, p.30-35•125» Lake P.E. Physiology and biochemistry of poultry semen. -Advances Reproduction Physiology, London, Logos Press, 1966, v.1, p.93-123.

118. Lake P.E. Artificial insemination in poultry and the storage of semen-areapparatus. World's Poultry Sci.J., 1967» v.7»1. N 23/2, p.111-132.

119. Lake P.E. Observations on freezing fowl spermatozoa in liquid nitrogen. 6-th Congr. in Reprod. Anim. Artif., Paris, 1968, N 2, p.1633-1635.

120. Lake P., Stewart J. Preservation of fowl semen in nitro-gen-an improved method. Br. Poultry Sci., 1978, v.19» N 2,p.187-194.

121. Lake P., Ravie 0., Mc Adam. Preservation of fowl semen in liquid nitrogen : application to freezing programmes. Br. Poultry Sci., 1981, v.22, N 1, p.71-77.

122. Levitt J., Dean J. The role of membrane proteins in freezing injury. In ; The frozen cell, London, 1970, p.148-174.

123. Lorenz P.W. Recent research on fertility and artificial Insemination of domestic birds. V Congresso internat. per. la ?eproduzione animale e la fecondazione artificielle., Trento, Italia, 1964, Sec.111, p.3-72.

124. Luyet B.J. The vitreous state of matter and devitrification temperatures. In: Temperature. New York, 1941, p.420-434.135» Luyet B.J., Hodapp E.A. Revival of frog*s spermatozoa vitrified in liquid air. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. J., 1938, N 38, p.3.

125. Luyet B.J., Gehenio P.H. The mechanism of injury and death by low temperature : a review. Biodinamica, 1940, 60, N3, p.33-39.

126. Luyet B.J., Hartung M.C. Death by devitrification in the nematode Anguillula aceti. Biodinamica, 1941, N 3, P«363-367.

127. Mann T. Fructose and fructolysis in semen in relation to fertility. Lancet, 1948, p.254, 446.

128. Mann T. On the presence and role of inositol and certain other substance in the seminal vesicle secretions of the boor. -Proc. Roy. Soc., 1954, N 142, p.906.

129. Maretta M. The ultrastrueture of the spermatozoon of the drake.1. Head, 2. Tail. Acta Veter. Acad. Sci. Hung., 1975, 25, 1, 47-60.

130. Marquez В., Ogasawara F. Ultrastructural changes in turkey spermatozoa after immersion glycerolyzed media and during various steps for criopreservation. Poultry Sci., 1977, v.56, N 6, p.1806-1813.

131. Meryman H.T. Modified model for the mechanism of freezing injury eritrocytes. Nature, 1968, N 218, p.333-335»

132. Meryman H.T. Freezing injury and its prevention in living cell. Annu Rev. Biophis. and Bioenerg., 1974, v.3, N 4, p. 341-363.

133. Nagase H., Graham E., Niwa T. Pelleted semen : the effect of glycerol level and composition of thawing solution on fertility of bovine spermatozoa. V International congress on Animal Reproduction, Trento, 1964, v.4, p.404.

134. Nagase H., Niwa T. Deep-freezing bull semen in concentrated pellet form. V-th international congress on Animal Reproduction, Trento, 1964, v.4, p.410-415.

135. Nagae Т., Tanaka E. Storage of fowl semen under reduced pressure. Japan. J. Poultry Sci., 1975» N 12, p.259-264.

136. Neville W.J. Recent advances in semen preservation. J. South Afric. Veterin. Assoc., 1975, v.46, N 4, p.311-323.

137. Neville W.J., Macpherson J., Reinhart B. The contraceptive action of glycerol in chickens. Poultry Sci., 1971, v.50, N 5, p.1411—1415•

138. Oderkirk A., Buckland R. Can the use of frosen turkey semen be made commercially feasible. Turkey World, 1976, v.51, N12,

139. O'Reilli E. Efectos de diferentes temperaturas sobre la fertilidat del semen fresco у congelado de gallos Leghorn. -Rev. Cub. Sienc. Avic., 1979, v.6, N 1, p.103-112.

140. Park R., Ogasawara F., Marques B. Fertility and hatcha-bility of eggs from turkey hens inseminated intravaginally or intramagnalli with fresh or frozen thawed semen. - Zooteh.Internal, 1979, v.12, p.27-31.

141. Payne E., Masters C. Life Science, 1968, v.7, N 18, p.935941.

142. Pingel H. Ein Beitrag zur kunstlichen Besamung in der Entenzucht. Wiss J. Humboldt Univ., Berlin, Math, naturwiss. Reihe, 1972, Jg.21, H.2, s.179-181.

143. Polge C., Smith A.U., Parkes A.S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature, London, 1949, v.164, p.666.

144. Polge C. The storage of bull semen at low temperatures. -J. Vet. Rec., 1953, N 65, p.557-559.

145. Pribor D.B. Biological interaction between cell membranes and glycerol or DMCO. Criobiology, 1975» N 5, p.309-320.

146. Sandor D. Evolation des ultrastructures de cours de la formattion de l'acrosome du spermatozoide chez la soures. J. Microsc., 1970, v.9, N 4, p.535-558.

147. Shaffner C.S., Henderson E.W., Card C.G. Viability of spermatozoa of the chicken under various environment conditions. -Poultry Sci., 1941, v.20, N 3, p.81-84.

148. Sexton T. Comparison of various crioprotective agents on washed chicken spermatozoa. 5. Effect of glucose, sucrose and polyvinylpyrrolidone. Poultry Sci., 1975, v.54, N 4, p.1297-1299.

149. Sexton T. Studies on the fertility of frozen fowl semen.-In: VIII Intern. Congr. Apim. Reprod., Krakow, 1976, v.1, p.236.

150. Sexton T. A new poultry semen extender. 5. Relationship of diluent components to cytoxic effects of dimethilsulfoxide on turkey spermatozoa. Poultry Sci., 1980, v.59, p.1142-1144.

151. Sexton Т., Buckland R., Lopaz R. Comparison of the procedures for freezing semen of high and low fertility with frozen semen. Poultry Sci., 1978, v.57, N 2, p.550-552.

152. Shaffner C.H. Longevity of fowl spermatozoa in frozen condition. Science, 1942, v.96, N 2493, p.336-337.

153. Schramm G. Stadient zur Langzeitkonservierung von Hahnen-sperma mittelschweren Rassen in flussigem stickstoff Anwendung der Pailletten methode. Mh. Veter. Med., 1975, Jg.30, N 24,s.941-944.

154. Schramm G. Die werkung der Kryoprotektiva Glizerin, Athy-lenglykol und Dimethylsulfoxid auf die Befruchtungsfahigkeit von Hahnensperma. Mh. Veter. Med., 1976, Jg.31, К 20, s.770-773.

155. Schramm G., Lohle K. Einfluss der Krioprotektiva Glizerin, Dimethylsulfoxide und Athylenglukol sowie der Glyzerin-adap-tionzeit auf die In-vitro-Qualitat des Hahnenspermas vor und nach Tiefgefrierkonservirung. Arch. Tierzucht,1976, Bd.19, s.295-305.

156. Smith A.U., Polge C. Storage of bull spermatozoa at low temperatures. Vet, Rec., 1950, v.62, p.115-116.

157. Sorensen E. 1940. Цит. по Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спертлы производителей,- К. ,1976,с.14.173» Stewart D.L. Storage of bull spermatozoa at low temperatures. J. Vet. Rec., 1951, N 62, p.65-66.

158. Szumowski P. Une etude le sperme de jars. Proc. V-th Internat. Congr. Anim. Reprod., Trento, 1964, N 4, p.572-581.

159. Tanaka K., Tomita Т., Okamoto S. Studies on deep-freezing of fowl semen. Jap. J. Zootechn. Sci., 1966, v.37, N 4, p.134-138.

160. Tanaka K., Okamoto S. Temperature shock in chicken spermatozoa. Jap. Poultry Sci., 197!6, v.4, N 3, p.111.

161. Takeda A. Studies on the cock spermatozoa during storage. -J. Tac. Text. Sci. and Technol Shhinshu Univ., 1962, N 6, p«1-55.

162. Van-Demark N.L., Sharma U.D. Preliminary fertility results from the preservation bovine semen at room temperature. J. Dairy Sci., 1957, v.40, N 4, p.438-439.

163. Van-Demark N.L., Conturier L.R. Flow dialysis as a means of preserving bovine semen at room temperature. J. Dairy Sci., 1958, N 41, p.550-536.

164. Veres J. 6-th Congr. Int. Reprod. Anim. Insem. Artif., Paris, 1968, N 1, p.473-483.

165. Wales R.G., White I.C. The interaction on phitonicity and electrolyte concentration on the motility of the spermatozoa. -A.ustral. J. Biol. Sci., 1958, v.2, N 2, p.177-188.

166. Watanabe M. Studies on deep freezing preservation of chicken semen. J. Fac. Fish. Anim* Husb., Hiroshima Univ., 1967, v.7, N 1, p.9-23.

167. Watanabe M. Studies on deep freezing preservation of fowl semen. IV Congr. Inter. Reprod. Anim. Insem. Artif., Paris, 1968, v.2, p.1175-1177.

168. Watanabe M., Miura and Moda Y. Studies on deep freezing preservation of fowl semen. 2. A quick freezing method using liquid litrogen. Japan. Poultry Sci., 1970, v.7, N 1, p.23-29.

169. Watanabe M., Kato S. Dilluents for freezedrying of fowl spermatozoa. J.Fac. Fish. Anim. Husb. Hiroshima Univ., 1972, 7.11, N 1, p.33-37.

170. Watanabe M., Miyashima Y. J. Fac. Fish. Anim. Husb. iiroshima Univ., 1973, v.12, N 2, p.117-120.

171. Watanabe M., Sato Т., Terada Т., Okara S. Jap. J. Anim. leprod., 1974, v.20, К 1, p.32-34.

172. Watanabe Ы., Ashisawa K., Terada T. A comparison of one md fifteen minutes equilibration in the technique of preserving Towl spermatozoa at subzero temperatures. Brit. Poultry Sci.,1975, v.16, N 5, p.535-539.

173. Watanabe M., Terada T. A new diluent developing preservation of fowl spermatozoa. In: VIII Intern. Congr. Anim. Reprod. Insem. Artif., Krakov, 1976, v.1, p.274.

174. Watanabe M., Terada Т., Shirakawa J. A diluent for deep freezing preservation of fowl spermatozoa. J. Fac. Fish. Anim. Husb., Hiroshima Univ., 1977, v.16, N 1, p.59-64.

175. White I.G., Wales R.G. Metabolic and motility studies relating to the low temperature storage of ram and bull spermatozoa.-Austral. Veter. J. Sci., 1954, N 34, p.85-94.

176. White I.G., Wales R.G. The susceptibility of spermatozoa to cold shock. Internat. J. Fert., 1960, v.5, p.195-201.

177. Замороженная до -i96°(J и храненная в жидком азоте сперма использовалась для получения гибридов между мускусными селезнямн к самками пекинской и украинской белой пород (б опыте Веремеенко Р.П.).

178. Накоплен необходимый запас спермы для проведения исследований (Бондаренко Ю.В.) по стимуляции партеногенетического развития в куроводстве.

179. При искусственном осеменении уток замороиенно-оттаян-ной спермой оплодотворенность яиц составляет 30,0- 3 бывод утят - - 30,гусей - соответственно - YU,H -73,U и ^3,2 - б4,9%.

180. Заведующий отделом селекции и биологииразмножения мясных видов птиц " ДуюпоЕ Э.А.

181. Старший научный сотрудник Веремеенко Р.

182. Старший научный сотрудник ^^«ц-^й^У^прошилова С. И

183. Старший научный сотрудник .рЪондаренко Ю.В

184. Старший научный сотрудник Сахацкий н.И.

185. Младший научный сотрудник Андреев Б.И.

186. Лаборант ^dbvcU Ковтун Т.А.1. УТЕЕРЗДАЮ:проректор по научной работе Харьковского зооветеринарного института имени Н.М. Еорисенко, -доцентн.И. Карташов .е-- / i."'s'!r;: > ' ■ - ' мu^wj 1933 г.1. СПРАВКА

187. Завкафедрой акуяерства, профессор г) л1. ЩРцЮл У Д.Д.Логвинов

188. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ1. АВТОРСКОЕ СВИЩЕЙШМ1. C/V? 641962 ?

189. На основании полномочий, предоставленных Правительсттеом (ХХР. Государственный комитет СССР по делам изобретений и от к pi л нйпетельство на изобретение:

190. Автор (авторы): Сахацкий Николай Иванович и Андреев Валерий Иванович

191. СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК

192. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР 110 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ u ОТКРЫТИЙ1. АВТОРСКОЕ СВИЛШЬШ)691132

193. Заявитель: УКРАШШГ. НАУЧИ ПТИЦЕВОДСТВА1. ИНСТИТУТ2491397 Приоритет изобретении т 1977rt

194. Зарепстрироиио а Гсс^и^стенно* ре*стр§22 июня 1279г.

195. Действие авторского свидетельства распространяется на всю территорию Союза СО'.1. ЛрлтгЛмим* С1. Пни ил

196. СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК

197. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ1. АВТОРСКОЕ Ш1ШИШШ1. G/V? ДШ

198. На основании полномочий, предосташзенных Правительством СССР.

199. Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийвыдал настоящее авторское свидетельство на нзоС»ретение;

200. Спосоо ваноражяьания спермы птиц*

201. Автор (авторы): Санации! Николай Ивановш ж Авдеева Ьалервй Ивановжч

202. Заявитель: JKpjfflHCMdl НАУЧНО-ИС СЩЯРШШСИЙ ИНСТИТУТ ПТИЦВОДЛЬА1. Заявка №29903111. Приоритет изобретения1. Зартг* стриромн оивобретени1. Юоиябрв 1980т1. Гщм^кмоим

203. Действие авто jk коГ^^мде^ьЙ^ распространяется на всю территорию Союза ССР.ffjwwrteiwu* KlMHNMM1. Mil* Гают.: