Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Видовые особенности структуры плазматических мембран и функциональная полноценность гамет петуха и хряка при криоконсервации

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Видовые особенности структуры плазматических мембран и функциональная полноценность гамет петуха и хряка при криоконсервации"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА Институт физиологии

На правах рукописи

БАЛАН Иван Васильевич

УДК 636.22.28.082.453

ВИДОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ПОЛНОЦЕННОСТЬ ГАМЕТ ПЕТУХА И ХРЯКА ПРИ КРИОКОНСЕРВАЦИИ

03.00.13 — физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кишинев — 1992

Работа выполнена в лаборатории криобиологии Института физиологии Академии наук Республики Молдова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Наук Василий Архипович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Степанов Григорий Се-

мионович

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Сочкан Иван

Абрамович

Ведуи^ая организация:

Государственный аграрный университет Молдовы

Защита состоится « » 1992 г. на заседании спе-

циализированного Совета Д 012.08.01 по защите диссертации на соискание степени доктора наук по специальности «физиология человека и животных» (03.00.13) при Институте физиологии Академии наук Республики Молдова (277028) г. Кишинев, ул. Академическая, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Академии наук Республики Молдова (г. Кишинев, ул. Академическая, 1).

Автореферат разослан « » 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

ТУГОЦИ Наталья Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Дальнейшее повышение производства продуктов животноводства во многом зависит от интенсификации воспроизводства сельскохозяйственных животных на основе генотнпи-ческой селекции. Решение этой важной проблемы в значительной степени зависит от эффективноети метода долгосрочного хранения оперш животных в глубокозаморокенном состоянии.

К настоящему времени достигнуты определенные успехи в области криоконсерзации спермы сельскохозяйственных -лшотных. Однако, в свиноводство и птицеводстве метод криопнеервации спермы производителей еще не нашел широкого практического применения из-за нестабильности результатов искусственного осеменения самок и технологических сложностей. Поэтому задачей первостепенной важности в области фундаментальных и прикладных исследований по криобиологии спермы сельскохозяйственных животных и птиц является раскрытие особенностей криоповрендонпя спермиев на разных уровнях их организации и выявление на этой основе дифференцированных подходов в разработке эффективных способов криозащнти спермы применительно для конкретного вида.

В последние годы в лаборатории криобиологии Института физиологии АН РМ доказано, что в основе повреждения спермиев сельскохозяйственных животных при заморанивзшш и оттаивании логлт структурные нарушения биомембран и, в частности, плазматических, за счет развития термодинамических, фгтзикохнг.:лчесх;гх и биохимических процессов, которые предопределяются составом, свойством и соотношением основных структурных компонентов, каталитической активностью мембранносвязанных ферментов, уровнем перскисного окисления лппидов и др. (Наук, 1987, 1991). Учитывая, что криопоз-рездеиня и криопротекция опермиев различных видов животных про- . текает неодинаково, особый интерес представляет изучение видовых особенностей структурно-функционального состояния плазматических, мембран спермиев и выяснение их механизмов в процессе криокон- : сервации.

Исследование этого вопроса одновременно позволят более направленно и обоснованно подходить к разработке методов кркоконсервации спермы различных видов животных.

Цель п задач:? нсоледодзпп.';. Целью настоящей работы, явилось выявление особенностей структуры плазматических мембран я фукк-

ционалыюй полноценности опермиев петуха и хряка при криоконсервации.

Для достижения цели намечалось решение следующих основных ' задач:

1. Выяснить функциональную устойчивость опермиев петуха и хряка к температурному шоку и соотношение основных .структурных компонентов их плазматических мембран при криоконсервации.

2. Изучить липидный состав мембран опермиев петуха и хряка в зависимости от состава синтетических сред при криоконсервации.

3. Определить аминокиолотный состав белков плазматических мембран, спермиев и плази спермы петуха и хряка при криоконсервации. '

4. Исследовать морфофункциональные показатели опермиев петуха в зависимости от введения в состав криозащитной среда аи-тиоксидантов и испытать оптимальные варианты в производственных условиях.

Научная новизна работы. Впервые определен аминокислотный и липидный соотав плазматических мембран спермиев петуха, а также индекс Фишера и активность мембранносвязанных ферментов- Мк+2 (На+ + К+)-АТФазы и щелочной фосфатазы.

Доказано, что видовые особенности устойчивости спермиев петуха и хряка к действию низких температур обусловлены величиной белок:лиг.ид, холестерин:фосфолипиды и индексом Фишера, а также содержанием связанных аминокислот плазматических мембран спермиев и свободных аминокислот плазмы спермы.

Показано, что стабилизация морфологических и функциональных показателей сперми в петуха и хряка выше при введении в соотав криозащитних сред антиоксиданта Н-зид и использовании дифференцированных приемов техлолопшеской обработки спермы.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в раскрытии видовых особенностей структуры плазматических мембран и функциональной активности спермиев, а также в углублении представлений о структурной организации биомембран спермиев петуха и хряка. .

.Результаты исследования соотношения белок:липвд и холесте-'рнн:фосфоиипида, активности мембранносвязанных ферментов, ли. пиднрго и аминокислотного оостава плазматических мембран спер-ыкев .петуха и хряка, а также выявленные взаимосвязи между этими 'показателями и устойчивостью спермиев к действию низких темпе-

ратур будут,яспользованы при дальнейшем углублении исследований структурно-метаболических и функционалышх перестроен мембран • спермиев и разработке более эффективных способов длительного хранения спермы производителей при -196°С.

Полученные данные по стабилизации морфофункцконалышх показателей спермиев петуха и хряка при криоконсервации с использованием антиоксидантов, стабилизатора мембран и дифференцированных технологических приемов обработки спермы, а такие результаты научно-производственного опыта по искусственному осеменению кур криоконсервированной спермой петуха свидетельствуют о возможности их использования в селекционно-племенной работе в свиноводстве и птицеводстве.

Основные полокения. выносимые на защиту.

1. Видовые особенности устойчивости спермиев петуха и хряка к действию низких температур предопределяются величиной белок: липид, холестерин:фосфолипиды и индексом Фишера, а также содержанием связанных аминокислот плазматических мембран спермгг-ев и свободных аминокислот плазмы сперма.

2. Стабилизация морфофункцнональких показателей опермпев петуха и хряка при криоконсервации доотигастся введением в с состав синтетических сред антиоксидантов я использованием дкффе-

' ренцпрованннх приемов обработки спермы.

Апробация работы. Матеркаш диссертационной работы доложена по Республиканской конференции "Пробяега научного обеспечения кивотпозодетва Молдавии" (Кишинев, 1500), 1У Есооопзмом симпозиуме "Стресс, адаптации и дисфункции" (К:г;;::;гез, IS9I), ежегодных заседаниях лаборатории криобйопэгке Ннсгктуга физиологии лиг:.! (1939, ISS0, 1991), заседаниях Ученого совета Института физиологии /dl ?М (1989, 1990, I9SI).

материала диссертации опубликованы в семи печатных работах.

Работа изложена на КО страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и II рисунков. Список пелользовашюй литературы включает 104 источника, в том числе 141 иностранных авторов.

¡.LiT'iiPlLUlI П 13Т0Д;Д

Зкспер:!г.;е:1тсль;ц'.е исследования выполнены в лаборатории криобиологии Института физиологии All Pi,i, з центре автоматизации, и метрологии АН ?1Д и в лаборатории лкпкдкого обмена г'лстк-тутп биохпмп;; Д-Т Республики Узбекистан. Научно-производствен-

гае опиты проводили на базе вивария Института фивиологии АН РМ и опытного хозяйства Украинского НИИ птицеводства. Опыты проведены с использованием спермы хряков крупной белой и петухов родайланд-окой пород, а также на курах коллекционных пород Украинокого НИИ птицеводства.

Плазматичеокие мембраны выделяли по метод"ке 1чапоу, РгоП-ГС^ (1981) в модификации В.А.Наука, Г.В.Борончука, Н.Г.Дмитрен-ко (1986).

Активность Ке+2<На+ + К+)~АТФазы и Б^-нуклеотидааы определяли по методике 1ушюу, РгоПгоу (1Э81). Активнооть щелочной фосфатазы изучали по методике Боданокого, опиоанной А.Покровоким (1969). Определение неорганического фосфора проводили по оьеп et »1. (1956).

Определение общего белка проводили по методу Ьдаггу et в1. (1951).

Экстракцию общих ЛИПИДОВ проводили ПО В11^,-ЦувГ (1959). Содержание общих липвдов в экстракте исоледовали по Вгавйоп (1951), описанному В.И.Скороходом, М.В.Стефанником (1983).

Аминокиолотный анализ проводили в Центре автоматизации и метрологии АН РМ при помощи аминокислотных анализаторов фирмы "Хитачи" (Япония) и "Бекман" (ФРГ).

Разделение липвдов осуществляли при помощи тонкоолойной хроматографии в лаборатории липидного обмена Инотитута биохимии АН Республики Узбекистан. Содержание общих фосфолипидов и их фракции определяли по. липидному фосфору методом Васильковского, описанным Н.Е.Кучеренко, А.Н.Васильевым (19В5).

Замораживание опермы петухов проводили в пайетах объемом 0,25 мл на программном замораживателе биоматериалов, при использовании среды БсИгатт, НиЬпег (1989), содержащей 21$ димегил-формамида (Терещенко, 1988).

Оценку качества оттаянной спермы петухов по подвижности спермиев проводили под микроскопом при 450-кратном увеличении, по десятибалльной шкале. Определение количества спермиев-с целыми и поврекдешшми мембранами головок проводили по методу На-1апйк, ВоЬпепзоск (1982), модифицированному (Терещенко, 1988) для анализа спермы петухов, на флуоркметре о применением для окраски образцов флуорохрома-этвдиум бромида.

Замораживание оперыы хряков проводили по методу Всесоюзного института животноводства (Мнлованов к др., 1974) о использованием криозащнтной среды этого яе института (Кононов, Голышев,

Нарижный, 1978) и стабилизатора мембран (Саатов, Исаев, 1989).

Искуоотвенное осеменение нур заморояенно-огтаянной спермой проводили в яйцевод на глубину 2 см. Первое и второе ооеменение проводили о интервалом в одни сутки, а последующие - один рад в 3 дня. Сбор яиц проводили через день пооле второго ооеменения. Результаты ооеменения кур определяли по итогам иннубации яиц.

Биометрическую обработку подученных результатов проводили по Е.К.Меркурьевой (1964) и Г.Ф.Лакину (1980).'

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

• I. Химичеокий соотав плазматических мембран спермиев

петуха и хряка при криоконоервавди .'1,1. Криоуогойчивооть спермиев, соотношение основных отруктурных компонентов и активность ферментов плазматических мембран опермиев петуха и хряка

На современном этапе развития иооледований по "нриоконс'ф-вации биологичеокьх объектов показано, что биомембраны являются довольно чувствительными к действию низких температур. Наряду о втим, обнаружено, что спермии одних видов животных хорошо поре-нооят замораживание, тогда как других - претерпевают существенные изменения. В авязи с этим важное значение приобретают ис-' следования химического соотава плазматических мембран и его взаимосвязи о устойчивостью опермиев при криоконобрвации.

Проведанные нами наследования показали существенные видовые различия в устойчивости опермиев петуха и хряка н холодово-му шоку. Так, коэффициент устойчивости опермиев петуха к холо-довому шоку ооотавляет 0,87+0,123 против 0,43+0,096 у хряка (Р< 0,001). Это моет? бить обьяонано особенностью химического оостава спермиев указаклнх видов животных.

Исследования величины соотношения бегокглипид илазматичес-ких мембран свежеполучешшх г замороженно-оттаянных спермиев петуха и хряка также выявили существенные межвидовые особенности. Так, например, величина соотношения белок:липвд плазматических мембран нативных спермиев петуха составляет 0,398+0,042, тогда как у хряка - 0,179+0,009 (Г-¿0,01). Из этих данных видно, что величина исследуемого показателя плазматических гломбран спермиев петуха более чем в 2 раза выше по сравнении с таковой у хряка.

Сопоставление соотношения белок:шшвд плазматических мембран спермиев петуха и хряка с устойчивостью спермиев этих животных к действию низких температур позволяет заключить, что существует прямая взаимосвязь мекду исследуемыми показателями. Эти данные подтверждают высказанное руководителем настоящей работы положение о том, что степень устойчивости спермиев сельскохозяйственных животных к действию низких температур предопределяется величиной соотношения белок:липид плазматических мембран слермиев.

Таким образом, выявленные особенности величины белок:липвд плазматических мембран спермиев петуха и хряка дополняют современные представления о структурной организации спермиев животных.

В связи с тем, что соотношение белок: лшнад плазматических мембран спермиев является одним из показателей устойчивости спермиев к действию низких температур, особый интерес представляет поиск условий, обеспечивающих стабилизацию величины данного подавателя кап для споршев хряка, так и для спермиев петуха при криокоасервации. Результаты наших исследований в этом направлении показывают увеличение данного соотношения в обоих случаях,когда сперму хряка охлавдали в течение 1 ч при 1М-20°С с последующей выдержкой при 4°С на протяжении 4 часов и при 18-20°С в течение I ч с последующей выдержкой в течение 3 ч при 15°С и I ч при 4°С. Данные технологические приемы позволят повысить Соотношение белок:липкд плазматических мембран, соответственно, до 0,50+0,039 и 0,4740,037 по сравнению о ОДЭчО.ОЮ», когда поэтапное охлаждени оперш не проводилось (Р.*: 0,001). Эти данные свидетельствуют о возможности образования новых о'иокомплексов плазматических мембран спермиев с белками плазмы сперш, что повышает устойчивость спермиев при криокоисервации.

Важное значение представляют и исследования интогралышх белков, так как большинство представителей этого класса участвуют в осуществлении важнейших биологических процессов. Сред» них следует отметить мембрашюсвязашше ферменты, играющие важную роль в сохранении жизнеспособности спермиев.

Выполненные исследования но шяоиению активности глй+г{+ + К+)-АМ,ази, Ь^-цуклеотцвдзы и щелочной фосфатовы плазматических мембран спермиев петуха п сравнении с ранее полученными результатами при изучении активности мембранносвязанных ферментов хрякй (Наук, 1991) показали, что охлаждение и замораживание-от-.таивание сперш по-разному воздействует на них, вызывая сущест-

венные разрушения плазматической мембраны спермиев данных видов животных. Поскольку + К+)-АТФаза выполняет транспорт-

ную функцию и роль трансформатора энергии, аккумулированной в АТф для активного транспорта Иа+ и К+ на мембране, то выявленные изменения активности данной ферментативной системы указывают на значительную деэнергизацию плазматических мембран спермиев петуха и хряка, Важно отметить, что наиболее значительное снижение активности данной ферментативной сиотемы имеет меото в процессе замораживания-оттаивания спермы хряка (Р<0,01), что указывает на более лабильные связи фермента с плазматической мембраной спермиев, При этом, изменения активности 1^+2(Па+ + К+)-АТФазн в мембранах спермиев петуха менее значительны. Это свидетельствует о более прочной овязи фермента о мембраной, а следовательно и о более выоокой криоустойчивоати опермиев петуха, что согласуется о полученными нами данными о взаимосвязи соотношения белок:липид плазматических мембран и устойчивости опермиев к . температурному шоку.

Активность 5*-чуклеотидазы и щелочной фосфатааы плазматических мембран опермиев петуха и хряка в процесое криоконоврвации практически не претерпевает изменений. Характерной особенностью являются установленные нами межвидовые различия по активности данных ферментов» В частности, в мембранах спермиев петуха активность 5 -нуклеотидазЫ в 2 раза выше чем у хряка (Р*с0,05) и наоборот, акгивнооть щелочной фосфатазИ более чем в 2,5 раза выше в. мембранах спермиев эфяка по оравненив о таковой у петуха (Р < 0,01). Отмеченные особенности свидетельствуют о ввдовой специфичности исследуешх ферментов.

Таким образом, результаты иооледований активности вышеуказанных ферментов плазматических мембран опермиев петуха и хряка при криоконсервации позвоЯгит отметить, что изменение их активности является следствием изменения молекулярной организации плазматических мембран, перестройка которых проявляется в процессе технологической обработки спермы данных видов животных.

1.2. Влияние низких температур на содержание лииидов мембран спермиев петуха и хряка

Структурная организация и функциональная активность биомембран в значительной мере определяется составом и свойством входящих в них компонентов. В связи с этим, дальнейшие углубления исследований структурных характеристик плазматических мембран

сиермиев представляют интерес для вияснешш механизмов криопо-ьревдений и криопротокщш сиермиев .различных вод о в животных.

Выполненные нами, совместно с сотрудниками ' лаборатории липидного обмена Института биохимии АН Республики Узбекистан, исследования липидов мембран свежеполученных, а также после за-моражнЕания-оттаиБания спермиев петуха и хряка позволили выделить и определить содержание фосфолипидов, холестерина, глице-ридов и цереброзвдов.

В результате исследований фосфолипвдов мембран спермиев петуха и хояка идентифицированы следующие фосфолипидные фракции: офингомлелин, фюсфатгдилхолин, фосфатвдилсерин, фосфатидилэта-нолашш, кардиолипин и фосфатидная кислота. Среди выявленных фосфолипвдних фракций мембран замороженно-оттаянных . спермиев обоих видов животных в большом количестве содержится фосфатидная кислота (46,01+0,289$ у петуха и 54,85+0,360$ у хряка), фо-сфатвдилэтаноламин (20,60+0,147$ у петуха и 16,73^0,174^ у хряка) » фосфатвдилхолин (19,41+0,054$ у петуха и 21,08+0,129$ у хряка). Наишше большого количества фосфатидной кислоты указывает на значительный биооинтетический потенциал спермиев, поскольку она является промежуточным продуктом, общим для биосинтеза триглицервдов и глицорофосфолипидов. Вместе с тем, ее преобладание свидетельствует о наличии репаративных процессов в мембранах при замораживании и оттаивании спермы. Повышенное содержание фосфатвдилатанолаыина (самый ненасыщенный фосфолипид) в мембранах деконсервированных спермиев исследуемых ввдов животных свидетельствует об увеличении содержания. ненасыщенных жирных кислот. В свою очередь, высокое содержание фосфатидил-эганоламина приводит к увеличению количества фосфатидилхояина, поскольку из фосфатвдилэтаноламина в ферментативной системе плазматических мембран образуется фосфатвдилхолин, которому отводится важная роль в метаболизме фосфолипидов и защите спермиев от! температурного шона.

. ■ ■ В аналогичных условиях-проведения опытов на опермиях петуха и хряка, процесс криоконсервации спермы хряка приводит к практическому отсутствию фракции фосфатидилоерииа. Однако, замораживание-оттаивание спермы хряка разбавленной средой Всесо-кганого института животноводства (Кононов, Нарижный, 1978), содержащей стабилизатор мембран (Саатов, Исаев, 1989) способствует выявлению данного фосфокипида, который составляет 1,79 + + 0,029$.

Наряду_с этим, в процессе криоконсервации о перш петуха имеет место значительное снижение содержания холестерина от 36,51+0,290 % в мембранах свежеполученных до II, 06^0,24674 (Р< 0,001) в мембранах деконсервированных спермиев. Это приводит к снижению в деконсервированных спермиях величины соотношения холестерингфосфолипиды, которое составляет 0,139 против 0,815 в нативных спермиях, что свидетельствует об усилении деструктивных процессов при замораживании-оттаивании спермы. Кроме того, существенное уменьшение содержания холестерина при криоконсервации указывает на более высокую лабильность по сравнению с фосфолипадами и необходимость учета этого фактора при разработке криоэащитных сред.

Что же касается содержания холестерина в мембранах спермиев хряка при аналогичных условиях опыта, то оно составляет в мембранах деконсервированных спермиев 0,06/1, которое приводит к существенному снижению соотношения холестерингфосфолипиды, что указывает на взаимосвязь мезду величиной данного показателя и низкой устойчивостью спермиев к низким температурам. В го же время, процесс криоконсервации спермы хряка после разбавления ее со средой ВИК и этой же средой + отабилизатор мембран приводит к увеличению содержания холеотернна, соответственно, • до 5,13+0,230 и 4,33+0,015^ (Р< 0,001). Это, в свою очередь, сопровождается увеличением величины холестерингфосфолипиды до 0,229 во втором сдучае.

Вместе с тем, среди внявлзгшых липиднпх компонентов мембран спермиев хряка установлено высокое содержание триглгадери-дов в деконсервировашшх спермиях, замороженных с использованием среды В 1-Е (60,87+0,326^) по сравнению с неразбавленными заморокенио-оттаянными спсрмиями (20,41+0,5267.') (Р-<.0,001),что свидетельствует о положительном влиянии компонентов крнозащит-ной среды на сохраннооть спермиев при низких температурах.

Другими лишшшми компонентами биомембран спермиев ксоле-дуешх видов животных являются переброзидн. Результаты их исследований показали, что в плазматических мембранах спермиев петуха и хряка они представлены, соответственно, 6-ю и 8-ю фракциями, при отсутствии у петуха цереброзидов 2 и 4. Установлено, что общее содержание цереброзидов плазматических мембран спермиев петуха более чем в 6 раз выше по сравнению с таковыми у хряка, что указывает на выраженные информационные изменения

липидов и снижение температуры фазовых переходов фоофолилидов мембран опермиев петуха, которые оказывают положительное влияние при криоконсервации.

Таким образом, в результате проведенных исследований опи-оаны фосфолипида, хэлеотерин, глицериды.и цереброэиды мембран спермиев петуха и хряка при криоконсервации, _ также показаны видовые особенности их содержания. В частности, установлены вы-оокодосговерные количественные различия у петуха и хряка между сфингомиеляном, фосфатидилхо ли ном, фосфатидилэтанолаыином, фос-фатидной киолотой, холестерином, триглицеридами, диглицеридом-2, цереброзидными фракциями (Р«;0,01 - Р<0,001) и качественные различия цореброзкдного соотава.

1.3. Содержание аминокиолот в плазматических мембранах спермиев петуха п хряка при криоконсервации

Проведенные нами исследования соотношения белок:липид плазматических мембран опермиев петуха и хряка выявили межвидовые отличия по данному показателю. В связи о этим, большой интерес представляло изучение содержания структурных компонентов белков - аминокиолот плазматических мембран спермиев петуха и хряка.

В результате проведенных нами исследований показано, что в плазматических мембранах опермиев петуха больше всего содержится аминокислот, входящих в группу гидрофобных (33,55+0,171/°) и нейтральных (26,66+0,199/0. Что же насается содержания аминокиолот, входящих в группу кислых и основных, то они, соответственно, составляют 18,10+0,642 и 22,24+0,222;?. В процессе криоконсервации спермы петуха изменениям подвергаются гидрофобные и нейтральные аминокислоты (р<0,05 - Р<;0,01), которые свидетельствуют о модификациях гидрофобных взаимодействий между белками и липидами плазматических мембран спермиев при данных условиях.

В плазматических мембранах спермиев хряка в большом количестве содержатся аминокислоты, входящие в группу основных (47,09+0,847$). Промежуточное положение занимают аминокислоты, которые относятся к гидрофобной группе и составляют 20,00+0,095$. Минорными компонентами белков являются аминокислоты, входящие в группы нейтральных и кислых, которые, соответственно, составляют 16,94+0,151 и 13,33+1,240^. В процеосе криоконсервации спермы хряка происходит изменение содержания нейтральных аминокислот (Рс 0,01).

Анализ результатов исследования содержания аминокислот в плазматических мембранах спермиев исследуемых видов животных показал, что количество аминокиолот, входящих в группы гидрофобных и нейтральных в 1,5 раза ниже в мембранах спермиев хряка по сравнению'со опермиями петуха, что указывает на боле'е слабые гидрофобные взаимодействия меяду белками и липидами мембран спермиев хряка.

2. Аминокислотный состав спермиев и плазмы спермы петуха и хряка при криоконоервации

Исследования структурных элементов белков - аминокиолот олермиев петуха показали, что в слежено луче тих спермиях больше всего содержится аминокиолот, входящих в группу гидрофобных (30,88+0,296$), количество которых онижаетоя в деконсервирован-ннх спермиях до-22,83+0,40 (Р^0,001). Среди отдельных аминокиолот этой группы более высокое содержание занимает изолейцин (10,33+0,096$) и валин (7,95+1,720$). Первому принадлежит важная роль в сохранении динамического соотояния белков.

Значительный удельный вео в нативкых опермиях петуха занимают и аминокислоты, входящие в нейтральную группу (26,85+ +0,210$), содержание которых в замороженно-оттаянных опермиях снижается до 23,87+0,160 (Р-с 0,001). Аминокислоты кислых и основных групп свежеполученных опермиев петуха составляют, соответственно, 17,54+0,291 и 24,54+0,179$. После замораживания-оттаивания в спермиях петуха обнаружено увеличение количества аминокислот, входящих в кислую группу до 25,43+0,132 (Р^ 0,001).

Изучение содержания аминокислот в нативных и оттаянных спермиях хряка показало, что больше Есего содержится аминокислот нейтральной группы (29,18+0,210 и 26,14+0,176$, соответственно (Р^ 0,001). На втором месте находится содержание аминокислот, входящих в щелочную группу, которое как в нативных, так и в оттаянных спермиях составляет 25$, В свежеполученшх и замороженно-оттаянных спермиях меньше всего содержится аминокиолот кислой группы (соответственно, 21,70+0,319 и 20,64+0,121$). Что же касается гидрофобных аминокислот, то они составляют 23,18+0,082$ в натившх и 25,82+0,076$ в оттаянных спермиях

(р^о7оо1):

Таким образом, проведенными исследованиями описан аминокислотный состав спермиев петуха и хряка. Анализ аминограмм

белков спермиев иосладуешх видов животных показал, что концентра щи аминокислот в опермиях петуха выше чем у хряка, что, в свою очередь, и определяет более высокую устойчивость спермиев петуха к низким температурам.

Результаты исследований свободных аминокислот плазмы спермы петуха и хряка представлены в таблице I.

Таблица I

Свободные аминокислоты плазмы спермы петуха

и хряка, п = 5

Тип .( Концентрация аминокислот (мг/100 мл плазмы) аминокислоты | в плазме спермы

!-!-~

| петуха | хряка

0,92 + 0,114 9,15 + 1,153 15,80 + 0,088 5,86 + 0,081

16,47 4 0,237 48,26 4 0,237н

* Статистически достоверные видовые различия.

Анализ данных табл. I показывает наличие существенных видовых особенностей по содержанию свободных аминокислот плазмы спермы петуха и хряка. Так, их концентрация в плазме спермы петуха составляет 644,63+11,128 против 48,26+0,237 мг/100 мл плазмы таковой у хряка (?■< 0,001). Высокое содержание кислых аминокислот в плазме спермы петуха, при подавляющем количестве глу-таминовой кислоты, свидетельствует о прочной отруктуре белковых молекул, более высокой регуляции их свойств и продолжительности кизни. В плазме спермы петуха обнаружены 20 аминокислот и 4 их производных против 20 и 6 в плазме спермы хряка. У петуха не выявлены орнктин и цитрулш, участвующие в орнитиновом цикле образования мочевины, а также /-аминомасляная кислота, у -амино-масляпая кислота у хряка не выявлена. Кроме того, в плазме спермы хряка выявлено низкое содержание аргинина (оледы), которое свидетельствует о более слабом проявлении адаптивных процессов при криоконсервации спермы по сравнению со спермой петуха. Вместе с тем, низкое содержание мочевины (следы) в плазме спермы

Основные

Кислые

Нейтральные

Гидрофобные

Производные аминокислот

Всего

5,50 + 0,360 557,02 +55,638 19,90 + 0,169 5,02 + 0,081

17,19 + 0,691 644,63 + 11,128

петуха коррелирует с высокой криоустойчивостью спермы, поскольку шенно в малой концентрации она проявляет антиоксидантннй эффект.

Наряду с этим, нами изучен в плазме спермы петуха и хряка индекс Фишера, который является объективным критерием аминокислотного дисбаланса (таблица 2).

Таблица 2

Индеко Фишера плазмы спермы петуха и хряка при криоконсервации, п = 5

---1-

Объект исследования | Индеко Фишера

Плазма нативной спермы петуха 1,90 + 0,078

Плазма замороженно-отгаянной спермы петуха 1,83 + 0,013

Плазма нативной спермы хряка 4,77 + 0,091кх

Плазма замороженно-оттаянной спермы хряка 2,12 + 0,027х

* Различия статистически достоверны между показателями

нативной и замороженно-оттаянной плазмы.

*** Статистически достоверны видовые различия.

Данные табл. 2 показывают, что индекс Фишера в плазме спермы хряка в 2,5 раза выше чем в таковой у петуха. Кроме того, в ответ на действие низких температур данный показатель в плазме оперш петуха практически не претерпевает изменений. Это свидетельствует о том, что при криоконсервации спермы петуха, которая является более устойчивой, индеко Фишера является стабильным. В плазме оперш хряка после охлаждения, замораживания и оттаивания спермы величина исследуемого показателя снижается более чем в 2 раза по сравнению о таковой в плазме.свекеполученной опермы, что свидетельствует о существенном дисбалансе аминокислот, а также о нарушении метаболизма белков в плазме опермы данного вида животного.

3. Морфофункциональные показатели опермизв петуха при криоконсервации спермы в различных синтетических средах

Выполненные нами исследования соотношения белок:липид и холестерин «фосфолипида*, активности мембранносвязанных ферментов, липидного и аминокислотного оостава плазматических мембран спер-миев петуха при криоконсервации ^позволили выявить ряд опецифк-

чеоких особенностей повревдения спермиев в ответ на действие низких температур. Эти исследования послужили основой поиска условий стабилизации структурных и функциональных показателей опер.миав при криоконоервашш. С этой целью нами были проведаны исследования по выявлению эффективности действия антиокси-дантов (глутатиона, Н-звда и Б-зида) в соотаве криозащитных сред для криококсервации спермы петуха.

На первом этапе, в составе нриозащитной среда (watanabe, Teroda, 1980) была определена оптимальная концентрация анти-оксидантов посредством изучения функциональных показателей за-мороженно-оттаянных опермиев петуха. Лучшие результаты по стабилизации подвижности опермиев по сравнению о. контролем, были получены при введении в состав синтетической ореды антиокои-дантов в концентрации 5 мг$. При атом восстановление подвижности опермиев после оттаивания сперш было выше на 27$ в случае использования Н-зида в составе сроды по сравнению о контролем, а также на 16 и 19$, соответственно, при применении глутатиона и Б-зида.

На втором втапе, нами, оовмеогно о сотрудниками Украинского НИИ птицеводства, иоследовано действие глутатиона, Н-ви-да и Б-зида в установленной нами концентрации в ооставе нриозащитной ореды Schramm, Hutmer (1989). Результаты доследований представлены в таблице 3,

Таблица 3

Действие антиоковдантов на морфофункциональные показатели опермиев петуха после замораживания и оттаивания, п = 8

Варианты опыта

Подвижность опермиев после оттаиьа-Иия, балл

Спермин о целыми головками, %

Ёоего

!С поврежденной акросо-мой

С целой акросо-мои

Среда Schramm +диметилформамид (по Терещенко) + глутатион

То ке + Н-зид

То ке + Б-зид

Данные табл.

4,5+0,21 42,3+3,3 26,3±2,5 15,8±2,0

5,4^0,38 4,2+0,42

56,1+5,2 45,8^3,7

35,1+4,4 38,8^3,6

21,1+3,9 13,0+1,3

3 свидетельствуют о том, что как и на первом

8типе, оамые лучшие результаты но восстановлению подвижности

опермиов пигукп после замораживания и оттаивания получены при иопользовгшин и составе синтетической среды Н-зида.

Но ол'адуищом этапе исследований действия антионсгздантов был проведен ьпучно-производствешш^ опыт по определению эффективности ппмороженно-оттаянной спермы петухов разбавленной син-тепгчвыгиЛ ородой, содержащей глутатион, Н-зид и Б-звд (табл.4).

Таблица 4

Г»)!|у аьтити инкубации яиц при осеменении кур эпг.о[-оженно-оттаянной спермой

И/ьшенование |Проинкуби- ¡Оплодотво-, Вывод ' 'уии ¡ровано яиц,¡ренность, {цыплят,

I ШТ. { % |. %

Выводи-

моет^ яиц,

%

Сри.ца ЯсЬгаппа

+д.и1етилформамид 195 47,2+3,57 39,5+3,50 83,7+2,64

(по Терещенко) + — — глутатион

То же + Н-зид 191 55,5+3,59 46,1+3,60 83,0^2,71

То же + Б-зид 136 47,8+4,28 41,2+4,22 86,2+2,95

Из данных табл. 4 видно, что введение в состав синтетической среды для криоконоервации спермы петуха глутатиона, Н-зида и Б-зида обеспечивает получение 47,2+3,57; 55,5+3,59 и 47,8+4,28£> оплодотворенноети яиц. Кроме того, в результате проведенных исследований показана прямая взаимосвязь между морфофункционаявными показателями деконоервировашых спермиев петуха и результативностью осеменения кур замороженно-оггаянной спермой.

Таким образом, результаты исследований по криоконоервации спермы петуха свидетельствуют о возможности применения способа длительного сохранения опермиев при -196°С в селекционно-племенной работе в птицеводстве, а также транспортировки спермы особо ценных производителей.

ВЫВОДЫ

I. Доказано, что криоустойчивость спермиев петуха выше чем опермиев хряка и предопределяется величиной белок:липид, холес-тершпфосфолишзды, шздекоа Фишера, активностью %+2(Иа+ + К+)~ АТФазы и щелочной фосфатазы, а также содержанием связанных ами-иоксилот плазматических мембран- спермиев и свободных аминокислот плазмы спермы.

2. Количественные изменения ципвдного состава плазматических мембран спермиев петуха и хряка, в ответ на действие низких температур, свидетельствуют о том, что нарушения отруктуры плазматических мембран при нриоконоервации спермиев хряка более выражены, чем у петуха,

3. Технологическая обработка спермы петуха при нриоконоервации сопровождается значительным снижением содержания триглице ридов и холестерина, а также величины соотношения холестерин: фосфолипиды в плазматических мембранах опермиев.

4. Высокая концентрация гидрофобных и нейтральных аминокислот в плазматических мембранах спермиев петуха (более чем в 3 раза выше по сравнению о мембранами опермиев хряка) свидетельствует о лучшей стабилизации гидрофобных взаимодействий в мембране спермиев при криоконсервации.

5. Стабилизация величины соотношения белок:липвд плазматических мембран опермиев хряка при криоконсервации лучше достигается в случае охлаждения спермы в течение I ч при 18-20°С с последующей .'выдержкой при 4°С на протяжении 4 чаоов,

6. Сохранение морфологических показателей акросомы и восстановление подвижности опермиев пооле замораживания и оттаивания спермы петуха выше при использовании в ооставе синтетической среды антиокоиданта - Н-зида,

7. Криоконоервация опермы петуха в полимерных соломинках с использованием оинтегической ореды, содержащей антиоксвд^нт -Н-зид и использование ее пооле оттаивания для иокуоотвенного осеменения кур обеспечивает 55,Ъ% оплодотвореннооти яиц.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для криоконсервации спермы петухов-производителей и использования ее в селекционно-генетической работе специализированных племенных птицеводческих хозяйств реномендуем применение антиокоиданта - Н-аида в составе синтетической ореды.

2. С целью повышения качества замороженно-оттаянной спермы хряков считаем целесообразным криоконсервацию ее проводить после охлаждения по следующему режиму: в течение I ч при 18-20°С с. последующей выдержкой при 4°С на протяжении 4 чаоов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Криогенные изменения и|+(На+ + К+)-АТФазной активности плазматтеоких мембран гамет сельскохозяйственных животных / Соавторы:, Наук В.А., Борончук Г.В., Гранач .".Г. // Тез. докл. конф.: Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии. Кишинев, 1990. С. 36-36.

2. Криовоадействие на активнооть маркерных ферментов плазматических мембран гамет сельскохозяйственных животных/ Соавторы: Наук В.Л., Борончук Г.В., Грайач В.Г. // Извеоткя АН РМ: Сер. биол. и хим. наук. 1991. № I. С. 45-48.

3. Аминокислотный опектр семени петуха / Соавторы: Наук

В.А., Борончук Г.В., Гранач В.Г., Бостан Г.С. // Известия АН РМ: Сер. биол. и хим. наук. 1991. № Э. С. 38-42.

4. Плазматическая мембрана: структура и изменение при . отреосовнх температурах / Соавторы: Наук В.А., Борончуи Г.В., Гуськов A.M. и др. // Стресс, адаптация и дисфункции: Тез.докл. 1У Воеооюз. оимп. Кишинев, 1991,- С. 187.

5. Влияние режимов охлаждения на соотношение белок:липид пяазмагичеоких мембран / Соавторы? Борончук Г.В., Гранач В.Г. // Стресо, адаптация и дисфункции? Тез. докл. I? Воесоюэ. оимп. Кишинев, 1991, С. 126.

6. Цереброзидннй опектр семени петуха и хряка / Соавторы: Борончук r.B.t Исаев Э.И., Саипов Т.Д. // Стреоо, адаптация и дисфункция: Tea. докл. 1У Воеооюз. оимп. Кишинев, 1991. С. 139.

7. Аминокислотный состав семени хряна и петуха при нриокон-сервации /Соавторы: Наук В.А., Борончук Г.В., Гранач В.Г. // Стресс» адиптация и дисфункции: Тез. доил. 1У Воесоюз. оимп. Кишинев,- 1991. С. IB6.

Подписано в печать 26.03.92. Формат 60x84/16. Объём 1,25. Отпечатано на ротапринте. Заказ К" 134. Тираж 120 экя.

Типография издательства "Штиинца" £'77004.г.Кишинёв, ул. .П Ловило , 8.