Диссертации » Зоотехния » Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Совершенствование методов замораживания и оценки спермы хряков
ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов замораживания и оценки спермы хряков"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ НСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

ШАПИЕВ ИСМАИЛ ШАПИЕВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЗАМОРАЖИВАНИЯ И ОЦЕНКИ СПЕРМЫ ХРЯКОВ

Специальность 06.02.01,- разведенре,селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук

Санкт-Петербург - Пушкин 1998 -

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском .. институте генетики и разнесения сельскохозяйственных животных.

Научный консультант доктор сельскохозяйственных наук Прокопцев В.М.

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Б.П.Завсртиев,

доктор биологических наук А.Г.Нарижный,

доктор сельскохозяйственных наук, профессор А.А.Шестилеров.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт племенною дела.

Защита диссертации состоится "/<? " ¿Р^хрС^^ 1998 г в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д.С&0.07.01. по защите докторских диссертаций при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу:

189620, С-П-Пушкин, Московское шоссе, 55-а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан " 3 " /^с^лууГ^ 1998.1.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор сельскохозяйственных

наук, профессор В.И. Волгни

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Теоретические исследования в криобиологии спермы животных открыли большие перспективные возможности не только в ускоренном развитии и широком внедрении методов искусственного осеменения с.-х. животных, но и в сохранении генетически наиболее ценных и исчезающих пород и видов животных.

В свиноводстве метод криоконсервации спермы еще не получил такого же размаха как в искусственном осеменении крупного рогатого скота. Это связано с низкой криоустойчивости спермы хряков, необходимостью замораживания значительно больших объемов спермы, технологическими и методическими трудностями, нестабильностью результатов осеменения. Поэтому проблема совершенствования метода криоконсервации спермы хряков и поиск подходов и способов повышения криоустойчивости сперматозоидов остается актуальной.

Хотя сперматозоиды разных видов животных различаются по крноусгойчивости, исследования, направленные на изучение механизмов криоповреждения сперматозоидов хряка и на поиск способов повышения их устойчивости при охлаждении и замораживании-оттаивании, могут быть использованы и при разработке методов замораживания спермы на других видах животных.

Нестабильность результатов искусственного осеменения с.-х. животных при использовании криоконсервированной спермы обусловлена значительной видовой, индивидуальной и сезонной изменчивостью устойчивости сперматозоидов к охлаждению и замораживанию. Поэтому существенное значение имеет отбор животных с целью получения криорезистентной спермы, а также отбор эякулятов для замораживания и криоконсервированной спермы на осеменение. В связи с этим большое внимание уделено разработке методов опенки сперматозоидов и их функциональной полноценности до и после замораживания-оттаивания. Особо важное значение точная и объективная оценка функциональной полноценности спермы имеет при создании банка генофондного материала.

Цель и задачи исследований. Исходя из изложенного целью работы было усовершенствование методов криоконсервации спермы и прогнозирования функциональной полноценности сперматозоидов до и после криоконсервации.

Для достижения 'поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать ультраструктурные изменения сперматозоидов хряка при замораживании-опаивании.

2. Изучить влияние Охлаждения и замораживания-оттаивания на обшую активность и изоферментийй спектр фермента лактатдегидро-геназы. ' .-ю ■

3.Исследовать влияние охлаждения и замораживания-оттаивания на функционирование дыхательной цепи митохондрий сперматозоидов. ', .

4.Исследовать влияние тиоловых соединений на криоустойчи-вость сперматозоидов. >

5.Изучить возможность неспецифического повышения крио-устойчивости сперматозоидов.

6.Разработать среду и температурный режим охлаждения для криохонсервации спермы хряков.

'/.Разработать среду для разбавления криоконсервироваиной спермы после ее оттаивания.

З.Исследовать связь показателей качества сперматозоидов после замораживания-оттаивания с их оплодотворяющей способностью.

9.Разработать методы оценки криоустойчивости сперматозоидов и их функциональной полноценности после замораживания-оттаивания.

Научная новизна исследований. Полученные нами данные экспериментальных исследований позволили: развить имеющиеся знания по криобиологии сперматозоидов; показать многофакторный характер криоповреждений; выдвинуть ряд новых положений о механизме и особенностях устойчивости и повреждения сперматозоидов при охлаждении и замораживании-оттаивании. Показано, что наиболее чувствительны к охлаждению и замораживанию-опаиванию механизмы регуляции энергетического обмена сперматозоидов.

Замораживание-отгаивание сперматозоидов хряка приводит к повреждению мембранных структур митохондрий и нарушению функционирования дыхательной цепи - разобщению дыхания и фосфорили-рования ,и увеличению свободного окисления. Впервые установлены характер и локализация криоповреждений дыхательной цепи. На начальном этапе криоконсервации спермы наиболее чувствителен к охлаждению 1-ый,НАД - зависимый участок дыхательной цепи, а при замораживании-оттаивании повреждению более подвержен 2-ой участок дыхательной цепи. Выявлено, что криоустойчивость сперматозоидов зависит от исходного уровня кислородзависимых окислительных процессов. При высоком исходном уровне дыхания, не сопряженного с фосфорилированием, сперматозоиды обладают низкой криоусточи-востью.

Установлено, что повреждения дыхательной цепи сперматозоидов, возникающие при холодовом шоке и замораживании-оттаивании спермы не идентичны. Холодовой шок приводит к необратимому повреждению, а при замораживании-оттаивании в защитных средах, наряду с необратимыми повреждениями,наблюдаются регуляторные изменения функционирования дыхательной цепи.

Впервые показана возможность повышения криоустойчивости сперматозоидов введением, в среду криоконсервации низких концент-

раций веществ со специфическим и неспецифическим действием (низкомолекулярные SH-соединения, мочевина, бензимидазол и его производные).

Выявлено, что разбавление спермы средой повышает активность изоферментов ЛДГ ответственных за гликолиз и состоящих преимущественно из М субьединиц. Показано, что увеличение отношения М субъединиц к Н субъединицам (М/Н) сопровождается повышением криоустойчивости сперматозоидов.

Впервые установлено, что сопряженность дыхания и фосфори-лирования в замороженно-оттаянных сперматозоидах, оцениваемая по величине стимуляции дыхания при действии разобщителя 2,4-динитрофенола, может служить показателем их функциональной полноценности. На основе проведенных исследований разработаны:

1. Среды для криоконсервации спермы хряков пригодные также для разбавления спермы при плюсовых температурах (A.C. № 540634; № 938990; № 1534042).

2. Метод замораживания спермы путем ее концентрирования центрифугированием (A.C. № 1561250).

3. Синтетическая среда для разбавления замороженно-оттаянной спермы (A.C. № 1191073).

4. Способы оценки качества сперматозоидов полярографическим и флуоресцентным методами, которые позволяют прогнозировать криоустойчивость сперматозоидов и их оплодотворяющую способность после замораживания-опаивания (A.C. № 938990).

Основные положения выносимые на защиту:

1. Особенности механизмов криоповреждения и криоустойчивости сперматозоидов хряков.

2. Способы повышения криоустойчивости сперматозоидов и усовершенствованный метод замораживания-оттаивания спермы хряков.

3. Методы оценки качества сперматозоидов и прогнозирования их оплодотворяющей способности.

Практическая значимость работы и реализация результатов исследований. Результаты экспериментальных исследований позволили расширить понимание молекулярных механизмов криоповреждений и криозащиты клеточных структур, определить способы и направление повышения криоустойчивости к повреждающему действию низких температур. Введение в состав среды криоконсервации мочевины и унитиола или производных бензимидазола увеличило результативность криоконсервации сперматозоидов хряка, а предложенный способ концентрирования спермы уменьшил потребность в хладоагенте и емкостях для хранения замороженной спермы. Методы оценки качества

криоконсервированной спермы и прогнозирование ее оплодотворяющей способности дают возможность отбирать для осеменения и хранения наиболее полноценную сперму после ее криоконсервации.

Материалы работы использованы при, разработке научно-методических и нормативных документов:

1. Методические указания по исследованию физиологии и биохимии спермы (Ленинград, 1974);

2. Методические рекомендации по низкотемпературной консервации спермы хряков (Ленинград, 1980);

3. Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков ири низкотемпературной консервации (Ленинград, 1980);

4. Методические рекомендации по криоконсервации концентрированной спермы хряков (Ленинград, 1985);

5. Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков и баранов (Ленинград, 1989).

Апробация работы. Изложенные в диссертации результаты исследований были доложены и обсуждены на: ежегодных координационных совещаниях по криоконсервации спермы с.-х. животных в 19751985 г.г.(ВИЖ); Советско-американском семинаре "Физиология воспроизведения сельскохозяйственных животных" Москва, 1977; XXXIII конференции БАЖ, Ленинград, 1982; 1-Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; Н-Всесоюзной конференции "Механизм криопо-врсждения и криозащиты биологических объектов", Харьков, 1984; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа", Ташкент, 1986; Международной конференции "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины", Харьков, 1988; Научно-практической конференции "Биологически активные вещества в сельском хозяйстве", Ленинград, 1988; На координационных совещаниях стран СЭВ по криоконсервации спермы, 1981 (СССР), 1988 и 1990 г.г. (ГДР); На международном симпозиуме по молекулярной генетике и биотехнологии, С-Петербург, 1994.

По материалам диссертации опубликовано 60 научных работ, в том числе: 1 методические указания, 4 методические рекомендации. По теме диссертации получено 6 авторских свидетельств и зарегистрировано 1 изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов и предложений„ списка литературы. Работа изложена на ¡307 стр. машинописного текста, содержит 75 табл., 26 рис. Список литературы включает 458 источников, из них 232 иностранных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВНИЙ

Экспериментальные исследования выполнены в отделе биологии воспроизведения ВНИИ генетики и разведения с.-х. животных и лаборатории электронной микроскопии института цитологии РАН. Научно-производственные опыты проводили на базе АО "Детскосельский" Ленинградской области и Экспериментального хозяйства ВНИИГРЖ.

Объектом исследований служила сперма: хряков различных пород (крупная белая, ландрас, крупная черная, дюрок); быков головного племпредприятия "Невское" Ленинградской области; петухов экспериментальной базы ВНИИГРЖ; баранов, замороженная в лаборатории биологии воспроизводства ВНИИ племенного дела и предоставленная зав. лабораторией Е.М.Платовым и научным сотрудником Е.М.Малиновским.

Основные зоотехнические показатели: объем эякулята, концентрация сперматозоидов, активность определяли общепринятыми методами.

Время переживания (ВП) сперматозоидов определяли при постоянной температуре и выражали в часах. Учитывали время от начала опыта до полного прекращения поступательной подвижности сперматозоидов.

Морфологическую оценку сперматозоидов проводили фазово-контрастным методом. Электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов проводили на фиксированных ОзОд в фосфатным буфере препаратах, которые заливали аралдитом. Ультратонкие срезы приготовляли на микротоме фирмы Рейхарт (Машанский и др., 1971) и просматривали на электронном микроскопе ,]ЕМ-5£ при ускоряющем напряжении 80 кв. Исследования проводили совместно с сотрудником института цитологии д.б. наук В.Ф.Машанским.

Коэффициент окислительного фосфорштирования Р/О определяли по Кондрашовой и др. (1965).

Оценку спермы по дыханию проводили полярографическим ме-том, разработанным нами (Шапиев,Мороз,Корбан, 1989).

Содержание НАДН и ФАД измеряли на флуресцентном микроскопе ЛЮМАМ с насадкой ФМЭЛ-1. Длина волны возбуждения лю-минисценщш НАДН - 365нм, ФАД-465нм. Регистрацию НАДН проводили при длине волны 465нм, ФАД-530нм. Количество НАДН и ФАД выражали в условных единицах и расчитывали изменение флуоресценции после каждой добавки в процентах от исходной, принятой за 100%.

Общую активность лактатдегидрогеназы определяли фени-лгидразиновым калориметрическим методом (Яауе1а, Тоуагек. 1959). Определение шоферментного спектра ЛДГ проводили методом электрофореза на агаре по Маркелову (1966). Активность цитохромокси-

;; 6 , : дазы (ЦХО) определяли реактивом НАДИ (Шергин, 1967). Общую активность дегидрогеназ определяли по времени обесцвечивания мети-леновой сини по Шергину (1967) в нашей модификации (Мороз, Ша-пиев, Корбан, 1980).

Содержание общих SH-групп в плазме спермы и в отмытых сперматозоидах определяли спектрофотометрическим методом при помощи реактива Эльмана - 5,5-дитиобис / 2-нитрозобензойной/ кислоты (Торчинский, 1977). „.,...

, . Замораживание спермы проводили на фторопластовой пластине! Запись режима, охлаждения спермы при замораживании осуществляли с помощью медь-константановой термопары и потенциометра КСП-4. Оттаивали с, помощью гидрооттаивателя конструкции ВИЖ. (Кононов и др., 1975).

Температурный (холодовой) шок сперматозоидов вызывали погружая флаконы с Змл спермы в воду с температурой 0...2°С на .10 мин.

Проверку оплодотворяющей способности сперматозоидов спермы хряков проводили на свиноматках опытного поголовья ВНИИ генетики и разведения с.-х. животных и АО "Дегскосельское" Ленинградской обл. Свиноматок в охоте выявляли два раза в сутки с помощью хряка пробника. Осеменяли свиноматок двухкратно, через 12 и 24 часа после выявления рефлекса неподвижности.

Исследования по разработке методов оценки и криоконсервации сперму хряков проводились совместно с Л.Г. Мороз и Н.В. Корбан. Эксперименты на сперме баранов проводили совместно с сотрудником лабортории воспроизводства ВНИИ племенного дела A.M. Малиновским; на сперме петухов - совместно с сотрудником лаборатории и.о. птиц ВНИИГРЖ М.С. Ворониной.

Результаты экспериментальных исследований обрабатывали методами вариационной статистики (Лакин, 1968; Меркурьева, 1970; Гублер, Генкин, \974).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ '

3.1. Структурно-функциональные изменения сперматозоидов хряка при охлаждении и замораживании-оттаивании.

Сперматозоиды - это высокоспециализированные клетки, состоящие из головки, шейки, тела и хвоста, каждый из которых выполняет свою определенную функцию и имеет свои особенности строения. Нарушения функционирования любого отдела приводит к нарушению основной функции сперматозоидов - оплодотворения яйцеклеток.

Исследование сперматозоидов методом фазово-контрастной микроскопии показало, что наиболее типичными изменениями части сперматозоидов, после медленного охлаждения до начала заморажи-

вания, являются частичное набухание (разрыхление), а в некоторых случаях и отслоение акросомного чехлика.

При быстром охлаждении спермы до 5...2° С - холодовом шоке, наблюдаются резко выраженные отслоения акросомного чехлика, изломы в области шейки и деформации в хвостовом отделе.

После замораживания-оттаивания можно выделить следующие изменения в области головки сперматозоидов хряков: I - разрыхление акросомного чехлика и частичное отслоение его от головки; 2-сморщивание, образование складчатости в области акросомного чехлика; 3 -сильное набухание и перфорация (везикуляция) акросомного чехлика; 4 - полное отслоение акросомного чехлика; 5-оголение головки - отсутствие акросомного чехлика. Если сперму не подвергали хо-лодовому шоку перед замораживанием , выраженных изменений в хвостовой части у замороженно-оттаянных сперматозоидов не наблюдали. Однако активность и переживаемость сперматозоидов после замораживания-оттаивания резко снижались.

При электронно-микроскопическом исследовании сперматозоидов после эквилибрации спермы при температуре +5°С в течение 3-х часов у части сперматозоидов наблюдали структурные изменения в промежутке между плазматической мембраной и остальными мембранами оболочки в виде набухания и частичных разрывов. Имеет место и некоторое отслоение внешней акросомной мембраны от внутренней.

Замораживание-оттаивание вызывает ряд структурных изменений сперматозоидов. Оболочка в большинстве случаев сильно отслаивается и частично фрагментирустся. Мембраны, образующие стенку головки, выявляются с трудом. Между отслоенной наружной и следующей за ней мембранами можно заметить фрагменты мйкротрубо-чек. Перинуклеарное пространство сужается. В нем образуются элек-гроннопрозрачные "разрывы", расположенные друг от друга через 3050 нм. Ядро в основном сохраняет такую же структуру, что и в свеже-разбавленной сперме. Наблюдается фрагментация ограничивающей их мембраны. Спирали митохолдриального тела в отличие от нормы, располагаются рыхло, между ними обнаруживаются большие расстояния, соизмеримые с шириной митохондрий. Происходит частичное разрушение отдельных митохондрий, либо существенное разбухание всей структуры.

Таким образом, замораживание-оттаивание вызывает ряд структурных изменений в головке и в митохондриях сперматозоидов, которые приводят к утрате функциональной полноценности сперматозоидов., . , . : 1. V- ••

3.2. Физиологические и биологические изменения спермы хряков при охлаждении и замораживании-оттаивании

. 3.2.1. Изменение активности лактатдегидрогеназы

Изменение условий окружающей среды всегда приводит к регу-ляторным изменениям реакций обмена веществ, задачей которых является приспособление живых организмов к этим изменениям. Эта регуляция обеспечивается благодаря наличию совершенной системы ферментов. Исходя из этого было исследовано влияние холодового шока и замораживания-оттаивания на общую активность дегидроге-наз, активность лактатдегидрогеназы и ее изофермеитный спектр в сперматозоидах хряка.

Охлаждение шермы до 2...0°С вызывает снижение активности дегидрогеназ в сперматозоидах более чем в 2,5 раза. Снижение активности дегидрогеназ наблюдается и после замораживания-оттаивания спермы. Это связано с выходом ферментов из клеток в окружающую среду, а так же инактивацией в результате криогенных изменений мембранных структур сперматозоидов.

Исследование изоферментного спектра ЛДГ свежеполученной спермы хряков показало наличие 5 изоферментов ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГЗ, ЛДГ4 и ЛДГ5, характеризующихся различной элекхрофоретической подвижностью, зарядом и активностью. Наибольшая доля от общего количества фермента приходится на ЛДГ4 и составляет соответственно 36,1%. Остальные изоферментьг распределяются в следующем порядке: сперматозоиды - ЛДГ1 - 8,6%; ЛДГ2 - 4,9%; ЛДГЗ - 25%; ЛДГ5 -25,4%. ЛДГ5/ ЛДГ1=3,0.

Разбавление спермы глюкозо-хелато-цитратно-желточно-калиевой (ГХЦЖК) средой вызывает изменения в изоферментном спектре ЛДГ. В клетках и плазме увеличивается активность изоэнзима ЛДГ5. Возрастает и отношения йоэнззима ЛДГ5, состоящего только из субъединиц М к изоэнзиму ЛДГ1 состоящему из субъединиц Н. Охлаждение разбавленной спермы до +5° С в период эквилибрации вызывает выход фермента из клеток в плазму. • Еще больший выход фермента из сперматозоидов наблюдается после замораживания-оттаивания (табл.1). Активность фермента в плазме спермы после замораживания-оттаивания выше, чем в плазме свежеразбавленной спермы, однако, меньше чем наблюдалось после эквилибрации. После замораживания и оттаивания, за счет сильного снижения активности изоферментов (вплоть до полной инактивации отдельных изоферментов) происходит изменение их процентного соотношения. Однако из

- - Таблица 1

"Влияниеохлаждения и замораживания-оттаивания спермы хряков в среде ГХЦЖК на процентное соотношение изофермеитов ЛДГ в сперматозоидах *

'__п=6

Сперма

Общая активность ЛДГ мкМ на 109 клеток

Активность изоферментов в %

лдп

ЛДГ2

ЛДГз

лдп

ЛДГ5

ЛДГз ЛДГ.

5М

т

Свежеразбавлен-наяя

После охлаждения до +5°С

После замораживания

6,7+0,17 100%

5,4+0,15** 80%

3,7+0,12*** 55%

3,9+0.10

6,7+0.14

7,3+0,43

2,8+0,12

3,1+0,14

2,5+0,05

9,8+0,90

8,8+0,52

7,8+0,67

33,4+2,10

34,6+3,50

41,3±2,80

44.9+0,01

45,6+0,40

41,1+0,90

5,0

6,8

5.6

3,4

3,8

3,3

* - осенне-зимняя серия опытов

**Р<,05, *** - Р<0,01

менения в соотношении изоферментов не влияют на общее соотношение МиН субъединиц Л ДГ,

Проверка влияния защитных компонентов среды желтка и глицерина на активность ЛДГ при замораживании-оттаивании спермы хряков, выявила различный характер защитного действия. Желток не оказывает защитного действия при охлаждении и замораживании-оттаивании спермы в отношении "аэробных" изоферментов ЛДГ1 и ЛДГ2 сосредоточенных в митохондриях сперматозоидов, в то время как глицерин предохраняет данные изоферменты от инактивации. Изоферменты "анаэробного" типа ЛДГ5 и ЛДГ4, которые в основном сосредоточены в цитоплазме клеток, лучше сохраняют активность после замораживания-оттаивания спермы в среде содержащей желток.

3.2.2. Криобиохимия сульфгидрильных (БН-) групп.

Одной из причин повреждения клеток при криоконсервации считается окисление БН-групп с образованием дисульфидных (-Б-Б-) связей, что приводит к денатурации белков. Исходя из этого исследовали влияние температурного шока и замораживания-опаивания спермы хряков на содержание БН-групп. В сперматозоидах подвергнутых температурному шоку наблюдалось снижение содержания БН-групп в сперматозоидах в среднем на 14.7%. Замораживание спермы без криопротектора привело к понижению сульфгидрильных групп в сперматозоидах на 40,2%. При замораживании и оттаивании по разработанной нами технологии содержание БН-груш; снизилось в среднем на 32,8% по сравнению с исходным уровнем в свежеразбавленной сперме.

3.2.3. Окислительное фосфорилирование и дыхание сперматозоидов хряков после охлаждения и замораживания-опаивания сперматозоидов

Как известно, в сперме хряка окислительное фосфорилирование преобладает над гликолизом и является основным источником синтеза АТФ. Многочисленными исследованиями установлено, что соотношение дыхания и фосфорилирования является чувствительным показателем функционального состояния клетки и целого организма (Скулачев, 1962).

Исследовали изменение окислительного фосфорилирования сперматозоидов через 2 часа после разбавления, после эквилибрации (с охлаждением до +5° С) и после замораживания - оттаивания спермы в среде ГХЦЖК с 5% глицерина. Результаты опытов показали, что в свежеразбавленной сперме отношение Р/О приближается к теоретическому, равному 2. После эквилибрации наблюдается снижение отношения Р/О на 55% (Р<0,01) по сравнению с фосфорилированием в свежераз-

бавленной сперме. Поглощение фосфора из среды инкубации уменьшилось в два раза, а поглощение кислорода достоверно не менялось. Это свидетельствует о начинающемся разобщении дыхания и фосфо-рилирования в дыхательной цепи митохондрий сперматозоида. Замораживание-оттаивание спермы приводит к резкому разобщению дыхания и фосфорилирования. В результате чего окислительное фосфори-лирование сперматозоидов снижалась на 85% (РЮ-0,3), а вряде опытов падала до нуля.

Поскольку окислительное фосфорилирование сопряжено с переносом электронов (протонов) по дыхательной цепи, проводили оценку функционального состояния дыхательной цепи митохондрий в сперматозоидах по реакции дыхания и редокс-состояния пиридин-нуклеотидов (НАД-НАДН) на добавление субстрата дыхания сукцина-та калия , разобщителя дыхания 2,4-динитрофенала (ДНФ) и ингибиторов дыхания амитала (Ам) и антимицина (А). Оценку проводили разработанными нами полярографическим (авт. свидетельство № 938990) и флуоресцентным методами.

Установлено, что экзогенный сукцинат калия не проникает в свежеполученные инактивные сперматозоиды и не усиливает их дыхания. Стимуляция дыхания Усц/Уэ=1. Добавление ДНФ вызывает возрастание скорости дыхания в 2,5 раза и более. Добавление 10_3М амитала вызывает подавление 76% скорости дыхания сперматозоидов по отношению к скорости дыхания с ДНФ. Дополнительное добавление 10-7 М антимицина вызывало дальнейшее снижение скорости дыхания -более чем в 10 раз по отношению к дыханию с ДНФ (табл.2). При охлаждении спермы до 20...22° С наблюдается тенденция к увеличению скорости эндогенного дыхания и усилению дыхания сукцинатом калия. Величина стимуляции дыхания ДНФ при сравнении со стимуляцией в свежеполученной сперме снижается. Но чувствительность дыхания к амиталу и антимицину не уменьшается, т.е. усиление свободного окисления носит герморегулягорный характер и не является показателем повреждения дыхательной цепи митохондрий сперматозоидов. Охлаждение спермы до 4...5° С снижает величину скорости дыхания сперматозоидов, что связано со снижением количества подвижных клеток на 20...40% после охлаждения. При пересчете дыхания на количество подвижных клеток установлено возрастание скорости дыхания на Ю...15% по сравнению со свежеполученными сперматозоидами. Одновременно наблюдается небольшая стимуляция дыхания сукцинатом калия при снижении величины стимуляции дыхания ДНФ; уменьшается на 49% чувствительность дыхания к амиталу. После замораживания-оттаивания возрастает стимуляция дыхания сукцинатом калия, что связано с увеличением проницаемости мембран сперматозоидов. Более чем на 20% снижается чувствительность к антимицину (2-й пункт сопряжения), амиталчувствителыюе дыхание сохраняется на том же уровне, что наблюдается после охлаждения спермы до 4...5° С (табл.2).

Таблица 2

Влияние охлаждения и замораживания-оттаивания на дыхание сперматозоидов

Сперма Скорость дыхания в наноА О2 на 109 клеток в минуту Амитал чувствительное дыхание, % Антимицин чувствитель ное ыхание %

глюкоза V* +сукцинат Усц +ДНФ Уднф + амитал +антимици

Свежеполученная 229+19,2 229+19,2 568+53,7 138+15,3 54+16,0 76 ' 92

(63-85) (81-98)

Охлажденная до

20-22 С 235+17,1 243+20,1 472+28,8 94+15,6 23+3,3 74 95

(60-83) (94-96)

Охлажденная до

4-5 С 182+21,3 208+25,8 407+26,4 221+21,3 80+9,5 51 ' 81 .

(26-79) (66-90)

Замороженно-отта-

янная 64+3,9 83+3,6 179+8,9 84+5,3 • 51+3,3 50 71

(32-75) • (40-85)

Таким образом, после охлаждения и замораживания наблюдается активация внешнего пути окисления НАДН.

Результаты оценки редокс-состояния пиридиннуклсотидов и флавопротеидов в сперматозоидах хряка полученные флуоресцентным методом полностью согласуются с данными полярографической оценки. 2,4-ДНФ снижает флуоресценцию НАДН и ФАД в свежей сперме соответственно на 68 и 61%, а в замороженио-оттаянной - на 47 и 27%. Ингибитор дыхания аитимицин увеличивает флуоресценцию НАДН и ФАД в свежей сперме на 46 и 74%, а после замораживания и оттаивания лишь на 15 и 36%, т.е. реакция на добавление 2,4-ДНФ и ингибитора после замораживания-оттаивания снижается. После температурного шока наблюдается более глубокие изменения: возрастает содержание НАДН и имеется очень слабая редокс-реакция НАД и ФАД на добавление 2,4-ДНФ и антимицина, что свидетельствует о почти полном повреждении первых двух пунктов сопряжения дыхательной цепи.

3.3. Пути повышения криоустойчивости сперматозоидов.

Разработка метода криоконсервации спермы хряков.

3.3.1.Влияние некоторых химических агентов на выживаемость (активность) и структурно-функциональное состояние сперматозоидов после замораживания-оттаивания.

На основании данных о неспецифическом повышении устойчивости клеток к повреждающим факторам действием низких концентраций химических соединений различной природы, исследовали возможность повышения криоустойчивости сперматозоидов, введением в среду для замораживания хлоралгидрата и мочевины.

Введение хлоралгидрата в среду для замораживания во всех испытанных концентрациях оказало отрицательное действие на активность сперматозоидов после замораживания-оттаивания и на время их переживания при температуре 37° С .

Мочевина в концентрациях 0,30; 0,45; 0,60% повышала активность сперматозоидов после оттаивания более чем в 1,5 раза при одновременном повышении их переживаемости на 30% по сравнению с контролем.

При замораживании спермы происходит окисление БН-групп белковых соединений сперматозоидов, исследовали возможность предотвращения их окисления введением в среду для криоконсервации низ-комолекулярпых гиоловых соединений: цистеина, цистеамина, меркап-тоэтанола и унитиола.

Цистеамин не оказал защитного действия. Сперматозоиды теряли подвижность при всех испытанных концентрациях цистеамина.

Цистеин при концентрациях 10;3М вызывал достоверное увеличение выживаемости сперматозоидов, но не повлиял на их. иереживае-

мость. Все остальные концентрации цистеина не оказали достоверного влияния на выживаемость и переживаемость сперматозоидов.'

Меркаптоэтанол в концентрациях 3,9 х10'4 и 5 х 10_2М снижал выживаемость и время переживания сперматозоидов после замораживания-оттаивания. Концентрации 6,25 х 10~3 - 2,5 х 102 М увеличивали время переживания замороженно-оттаянных сперматозоидов' на 22...47%, не повышая активности.

Влияние унитиола на активность и время переживания сперматозоидов при замораживании исследовались в концентрациях 0,014%; 0,021%; 0,028% и 0,035%. Активность семени, замороженного в среде с унитиолом, после оттаивания значительно выше, чем в контроле. Достоверное увеличение активности сперматозоидов наблюдается под воздействием унитиола в концентрациях 0,014; 0,021; 0,028%. Наибольший процент подвижных клеток и наибольшее время переживания заморажвнно-оттаянной спермы наблюдали при концентрации укитиола 0,21%.

Исследование активности цитохромоксидазы показало, что все тиоловые препараты уменьшают активность данного фермента, участвующего в терминальном участке дыхательной цепи. Наибольшее снижение активности, более 10 раз, наблюдалось в пробах замороженных с меркаптоэтанолом.

При замораживании спермы б среде с меркаптоэтанолом наблюдали усиление свободного окисления не связанного с синтезом АТФ, что видно по низкой величине стимуляции дыхания с ДНФ, Уднф/Ус>кц=1,47 против 1,7 в контроле. Унитиол оказал значительное защитное действие на сохранность сопряженности дыхания с фосфори-лированием. Величина стимуляции дыхания сперматозоидов с ДНФ -(\'днф/Усукц) в сперме разбавленной средой с унитиолом после замораживания-оттаивания - 1,80 и более против 1,70 в контроле. При разбавлении спермы средой с унитиолом (0,028%) увеличивается активность ЛДГ в сперматозоидах на 18...25% больше, чем в контроле (Р<0,01). После замораживания-оттаивания спермы активность ЛДГ сперматозоидов в контрольном варианте падает до 45%, а в опытном варианте на 33%. Активность изоферментов сперматозоидов после замораживания в среде с унитиолом выше чем активность после замораживания в контрольной среде: ЛДГ1 на 8,7%; ЛДГ2 - 57,8%; ЛДГЗ -24,2%; ЛДГ4 - 27,4% и ЛДГ5 на 49,3%.

Так как наибольшее увеличение активности сперматозоидов после их оттаивания было получено при введение в среду мочевины, а увеличение времени переживания - под воздействием унитиола, исследовали совместное влияние этих вещесгв. При совместном введении в среду для замораживания унитиола 0,014% и мочевины 0,30% активность сперматозоидов после оттаивания составляла 2,9 балла против 2,0 балла в контроле. ВП сперматозоидов увеличивается на 35%. Благоприятное влияние на устойчивость сперматозоидов к заморажива-

нию оказало отделение плазмы спермы от сперматозоидов. При замораживании сперматозоидов отделенных от плазмы и разбавленных средой с унитиолом и мочевиной в сочетании 0,028% и 0,30% соответственно, активность спермы составляла 4,8 балла против 2,0 в контроле, а ВП превышало в 3,5 раза.

3.3.2. Влияние совместного введения унитиола и мочевины в среду на активность ЛДГ и се изоферментов.

Разбавление спермы средой с унитиолом и мочевиной вызывает значительное увеличение активности изоферментов сперматозоидов по сравнению с их активностью в среде ГХЦЖК (контроль): ЛДГ1 на 56; ЛДГ2 - 43,6; ЛДГ4 - 20,7 и ЛДГ5 на 21,8%. Наблюдаемое увеличение ЛДГЗ статистически не оправдано. Замораживание-оттаивание вызывает снижение ак тивности изоферментов в сперматозоидах. Но в среде с унитиолом и мочевиной это снижение с высокой достоверностью меньше чем в контрольной среде. Разница между опытом и контролем для ЛДГ1 достигает до 177%, для ЛДГ2 - 96,8%, ЛДГ4 - 27,4% и ЛДГ5 -44,7%. Можно отметить, что в среде с унитиолом (0,028%) и мочевиной (0,30) наряду с повышением общей активности всех изоферментов, наблюдается лучшее сохранение в сперматозоидах активности изоферментов ЛДГ1 и ЛДГ2, связанных с дыханием и сосредоточенных в митохондриях.

Электронно-микроскопические исследования показали, что совместное введение унитиола и мочевины в среду для заморахивания позволяет качественно повысить сохранность мембранных структур сперматозоидов при их замораживании-оттаивании. Наблюдаемые отслоения наружной оболочки в виде пузырков, главным образом касаются передней, акросомальной области головки сперматозоидов. Внутренняя оболочка акросомы остается в плотном соединении с мембранами ядра. В структуре хвоста сперматозоидов, замороженно-отгаянных в среде с унитиолом и мочевиной в основном существенных изменений не наблюдается. Имеются только небольшие расширения между некоторыми митохондриальными телами и незначительные нарушения целостности плазматической мембраны, ограничивающей хвост.

Таким образом, при совместном введении унитиола и мочевины в среду дая замораживания спермы хряков, мембранные структуры, в частности акросома и митохондрии сперматозоидов, меньше подвергаются повреждению после замораживания-огтаивания.

Лучшая сохранность митохондрий и ферментов, ответственных за энергетический обмен, подтвердилась при исследовани и окисли-тельнго фосфорилирования. Коэффициент фосфорилирования Р/О сперматозоидов после замораживания в среде с унитиолом и мочеви-

Таблица 3

Дыхание и фосфорйлирование сперматозоидов хряка на различных этапах замораживания в глюкозо-хелато-цитратно-желточной (контроль) и Г'ХЦЖКУМ) средах (1+28°С).

11=8-10

Этап замораживания Вариант Поглощено Ог на 108 клеток за 10 мин. мкатомов : Поглощено Р на Коэффициент фосфорилирования 108 клеток за 10 мин. (Р/О)

М+ггь- Р М+ш : Р М+ш - % - Р

Разбавление Контроль 0,40+0,06 >0,1 0,92+0,17 >0,1 2,02+0,21 100 >0,1

опыт ; 0,42+0,05 1,17+0,15 2,00+0,17 100

Эквилибрация Контроль 0,46+0,02 >0,01 0,46+0,12 >0,1 0,91+0,22 45 >0,1

опыт 0,36+0,02 0,64+0,02 1,21+0,26 60,5

Замораживание- Контроль 0,42+0,04 >0,1 0,17+0,01 >0,02 0,30+0,19 14,9 <0,01

оттаивание опыт 0,44+0,04 0,56+0,11 1,10+0,23 55,0

ной равен 1,1, что на 40% выше чем Р/О в среде без унитиола и мочевины (табл.3).

Проведенные исследования позволили разработать базовую среду для криоконсервации спермы хряков (авторское свидетельство № 540634). Рекомендуемый состав среды на 1 л дистиллированной воды: 50 г глюкозы, 2,78 г цитрата натрия трехзамещенного 5-ти водного, 0,650 г цитрата калия, 1,0 г хелатона, 3 г мочевины, 0,21 г унитиола, 30...40 мл глицерина и 100 мл яичного желтка. рН разбавителя 6,2...6,4, точка депрессии - 0,63...0,67. Условное название среды - ГХУЖКУМ. Исследовали влияние среды ГХЦЖКУМ на оплодотворяемость, многоплодие свиноматок и качество потомства при осеменении свежераз-бавленной спермой. Контролем служила молочная среда и среда ГХЦС-8, широко применяемая в практике искусственного осеменения свиней (табл.4). На основании полученных данных считаем возможным и целесообразным использовать среду ГХЦЖКУМ также на пунктах искусственного осеменения свиней для осеменения свиноматок свежеразбавленной и храненной спермой.

Таблица 4

Результаты осеменения свиноматок свежеразбавленной спермой и сохраненной в течение 3-х суток.

Разбавитель Число свиноматок % Число поросят

опо- на свиноматку

о семе пере- опоро- роса мерт-

нен - гуляв- сивших живых вых

ных ших ся

ГХЦЖКУМ 56 3 53 94,6 +3,12 12,7+0,23 1,05

Молочный 57 11 46 80,7 +5,23 10,1+0,30 0,6

ГХЦС-8 31 6 25 80,6 +7,10 11,2+0,51 1,0

ГХЦЖКУМ,

хранение 3-е

суток 22 4 18 81,8+8,2 9,4+0,36 0,5

3.3.3. Повышение криозащитных свойств среды ГХЦЖКУМ, введением в ее состав дисахаров.

• Эффективным криозащитным свойством при замораживании большинства биологических объектов обладают сахара. С целью изыскания возможностей увеличения криозащитного действия среды ГХЦЖКУМ нами было изучено влияние ряда защитных веществ (сахара и их сочетания, многоатомные спирты) на активность и время

/8 -

переживания замороженно-оггаянной спермы. Установлено,'что замена гГХЦЖКУМ среде глюкозы на сахарозу, лактозу, мальтозу или раффинозу уменьшает активность и ВП спермы на 10...40%. Сочетание глюкозы с сахарозой при соотношении изотонических концентраций 3:1 или сахарозы с фруктозой в соотношении 1:1 'соответственно, 1,3 и 1,24 раза увеличил активность спермы после замор;зживайия на 24%, ВП - на 10%. Многоатомные спирты (инозйг, сорбит, маннит, дульцит) не дали положительного эффекта. ' , ' '

Для проверки защитных свойств среды ГХЦЖКУМ и ее модификаций при криоконсервации спермы хряков провели контрольное замораживание спермы по усовершенствованному технологическому методу и в производственных опытах осеменили 121 свиноматку спермой хряков, замороженной в средах ГХЦЖКУМ, ГСХЦЖКУМ (соотношение глюкозы с сахарозой 3:1, 1:1, 1:3) и в СФХЦЖКУМ (соотношение сахарозы с фруктозой 1:1) табл. 5.

На основании полученных данных, для разбавления спермы при ее замораживании, мы выбрали среду ГХЦЖКУМ с добавлением сахарозы, под условным названием ГСХЦЖКУМ.

Таблица 5.:

Результаты осеменения свиноматок замороженно-оттаянной спермой в различных вариантах среды ГХЦЖКУМ

Число свиноматок

Вариант опьщх . % опо- Много

осеме- перегу- опоро- роса плодие

...... ч ненных лявших сившихся

ГХЦЖКУМ 26 10 16 61,5 9,0

ГСХЦЖКУМ: Г:С=3:1 32 8 24 75,0 9,5

Г:С=1:1 24 7 17 70,6 9,3

Г:С=1:; 18 6 12 66,7 8,6

ГФХЦЖКУМ: опыт I 8 2 6 75,0 8,1

опыт II 13 6 7 53,8 8,4

3.3.4. Влияние бензимидазола и его производных на криоусгойчивость сперматозоидов хряка.

По данным литературы бензимидазол и его производные обладают свойством неспецифического и специфического повышения резистентности клеток и тканей к повреждающим воздействиям.

Нами была исследована возможность повышения устойчивости сперматозоидов хряка при замораживании введением в среду бензи-

мидазола, 2-бензилбензимидазола, глюкозида бензимидазола и нитро-производного бензимидазола в диапазоне концентраций от 10-'° до 10"3 моля. Сперму замораживали в концентрированном варианте. В качестве контроля служила среда с унитиолом без мочевины.

Наиболее эффективное криопротективное действие оказали: бензимидазол в концентрации 10* М, 2-бензилбензимидазол 106 М, глюкозид бензимидазола 10-7... Ю-9 М, нитропроизводное бензимидазола 107 М. Производные бензимидазола в 1,3 раза повышают ВГ1 сперматозоидов при 39° С по сравнению с переживаемостью сперматозоидов замороженных в среде с унитиолом. При этом на 5% выше и сохранность акросом по отношению к контролю. Величина стимуляции дыхания ДНФ-ом сперматозоидов, замороженных в среде с дибазолом, приближается к величине характерной для свежеразбавленной спермы. Уменьшается доля свободного, не связанного с фосфорилиро-. ванием, которое характерно для поврежденной системы дыхательной цепи.

Результаты осеменения свиноматок спермой замороженной с использованием бензимидазола приведены в табл.6.

Таблица 6.

Результаты осеменения свиноматок спермой, замороженной в среде с бензимидазолом

Вариант Число свиноматок % опороса Число поросят на 1 свиноматку

осеменено опоросилось

Контроль-среда с

унитиолом 11 7 63+12,5 9,6

Среда с бензими-

дазолом 9 7 78+10,6 9,6

3.4. Разработка метода замораживания концентрированной спермы хряков

3.4.1. Концентрирование спермы хряков

Применение метода замораживания цельноразбавленной спермы в производственных условиях лимитируют несколько факторов: 1) большие объемы (около 100 мл) доз замораживаемой спермы на одно осеменение; 2) необходимость больших емкостей для хранения и транспортировки замороженной спермы; 3) значительный расход

НО

хладоагента. Поэтому в. технологии замораживания спермы хряков важным остается вопрос концентрирования спермы с целью уменьшения объемов для замораживания, длительного хранения и транспортировки консервированной спермы. Концентрирование позволяет уменьшить объем одной дозы замороженной спермы на осеменение в 4...5 раз по сравнению с методом криоконсервации цельноразбавлен-ной спермы. В связи с этим нами были поставлены опыты по изучению влияния удаления плазмы и самого процесса центрифугирования на фертильность свежеполученной спермы и многоплодие свиноматок. Центрифугирование проводили через 1 час после получения и охлаждения спермы до комнатной температуры. Результаты осеменения показали, что центрифугирование спермы при 70(^ в течение 10 мин. без удаления плазмы не оказывает влияния на ОС спермы и плодовитость маток: все 16 осемененных маток стали супоросными, при опоросах получено 13,5 поросят на матку. Полное удаление плазмы после центрифугирования спермы при вышеуказанном режиме с заменой ее ГСХЦЖКУМ средой снизило ОС спермы на 30%, а многоплодие ма-гок на 29% по сравнению с контролем (отцентрифугированная сперма с сохранением плазмы).

Провели сравнительное испытание устойчивости к замораживанию в среде ГСХЦЖКУМ концентрированной различными приемами:

Таблица 7

Оплодотворяемость свиноматок от осеменения заморожено-оггаянной спермой, концентрированной различными способами

№ варианта п/п Вариант опыта Число свиноматок % опороса Многоплодие

осемененных перегулявших опоросившихся

1 Целый эякулят -

контроль 26 9 17 65,4 9,0

2 Густая фракция 15 10 5 33,3 8,0

3 Полное удаление

плазмы 14 9 2 14,3 8,5

4 Частичное удаление

плазмы 10 5 5 50,0 9,0

вариант 1 - замораживание целого эякулята, разбавленного средой в отношении 1:1 (контроль); вариант 2 - замораживание густой фракции при разбавлении 1:1; вариант 3 - сперму центрифугировали при 700g 10 мин, плазму полностью сливали, осадок сперматозоидов ресуспен-дировали в равном объеме среды ГСХЦЖКУМ; вариант 4 - после центрифугирования удаляли только часть плазмы. Осадок ресуспен-

и

дировали в оставшейся плазме и разбавляли средой в отношении 1:1 (табл.7). Результаты опытов показали, что концентрирование спермы центрифугированием следует проводить с неполным удалением плазмы.

3.4.2. Выдержка свежеполученной спермы и разбавление ее криозащитной средой

Мнгочислснными исследованиями установлено, что успешному замораживанию спермы способствует 3-6 часовая выдержка разбавленной спермы при температуре 16-22° С (Милованов и др., 1974) и во многом зависит от состава среды для замораживания. Мы использовали варианты среды ГСХЦЖКУМ с соотношением глюкозы и сахарозы 1:3 и 3:1 (табл.8).

Таблица 8

Состав сред для замораживания спермы хряков

Компоненты сред Масса вещества, г

Среда 1 Среда 2

Глюкоза 38,0 15,0

Сахароза 22,5 70,0

Цитрат натрия 3-х замещенный 5,5 водный 2,78 2,78

Цитрат калия 3-х замещенный 0,65 0,65

Этилендиамин тетраацетат (хилатон) 1,0 1,0

Мочевина 3,0 1,5

Унитиол 0,20-0,25 0,25

Желток куриного яйца - 100 мл

Вода 1000 мл 1000 мл

Изучение влияния состава среды на качественные показатели спермы после замораживания-оттаивания показало, что при замораживании спермы, концентрированной путем центрифугирования, целесообразно использовать разные по содержанию Сахаров среды до и после центрифугирования. Результаты по физиологическим и биохимическим показателям были лучше при использовании среды 1 до центрифугирования и среды 2 после центрифугирования. При этом время переживания на 13% , а сопряженность дыхания и фосфорилиро-вания на 36% выше чем в контроле. Стимуляция дыхания сукцинатом калия на 30% меньше, чем в контроле (среда ГХЦЖКУМ).

Фазовые переходы липидов являются важным фактором в устойчивости клеток к холодовому шоку Белоус, Бондаренко,1982). Хотя температура фазовых переходов липидов в основном зависит от липидного состава мембран, очевидно существенную роль в этом

играют и температурозависимые структурные изменения винициаль-ной воды которые возникают при температурах 45°,30° и 15° С, близких к температурам фазовых переходов липвдов. Чтобы сперматозоиды успевали адаптироваться к изменившимся условиям среды, процедуры со спермой, как разбавление и введение криопротектора должны происходить при температурах не лежащих в области фазовых переходов липидов и воды, когда мембраны клеток находятся в наиболее неустойчивом состоянии.

Исходя из вышесказанного при замораживании спермы после ее концентрирования центрифугированием, технология подготовки спермы к замораживанию и замораживание включают следующие этапы: 1. Получение и выдержка целого эякулята спермы при температуре 34° С в течение 45...60 мин. 2. Разбавление спермы средой 0 32...34°) в соотношении 1:1 и охлаждение до температуры 22...22° С в течение двух часов, т.е. со скоростью 0,1...0,15 град/мин. 3. Центрифугирование спермы в течение 15 мин при 700g и удаление надосадка так, чтобы концентрация сперматозоидов в оставшейся части составляла около 1,5 млрд клеток на 1 мл. 4. Ресуспендирование суспензии в среде (1 20...22° в отношении 1:1 и охлаждение спермы, вначале при температуре 14...16°С в течение 30 мин. Затем при температуре 4...5°С со средней скоростью 0,2 градуса в минуту. 5. Введение глицерина до конечной концентрации 2%. Затем сперму переносили в холодильник с I 4...5°С или в ледяную ванну на 20-30 мин. 6. Замораживание.

3.4.3. Замораживание спермы.

В наших опытах замораживание производили гранулированием на фторопластовой пластине с лунками в парах жидкого азота. Серией предварительных опытов было установлено, что оптимальная температура замораживания (в парах жидкого азота) -85°...-95° С на поверхности пластины.

Обычно сперму замораживают в виде 1ранул объемом по 0,2 мл. Нами обоснована возможность увеличения объема гранул при замораживании спермы хряков до 1 мл . С увеличением объема гранул происходит значительное снижение скорости охлаждения во всех температурных зонах. Режим замораживания гранул объемом 1 мл был наиболее благоприятным при замораживании спермы хряка - снижение скорости в температурной зоне от 0° С до -1° С составляла всего 1...1,5° С в мин. В то же время скорость падения температуры в критической зоне температур от -20° С до -60° С остается достаточно высокой -20° С в мин., что позволяет быстро пройти опасную для клеток кристаллизационную зону замерзания.

играют и темиературозависимые структурные изменения винициаль-ной воды которые возникают при температурах 45°,30° и 15° С, близких к температурам фазовых переходов липидов. Чтобы сперматозоиды успевали адаптироваться к изменившимся условиям среды, процедуры со спермой, как разбавление и введение криопротектора должны происходить при температурах не лежащих в области фазовых переходов липидов и воды, когда мембраны клеток находятся в наиболее неустойчивом состоянии.

Исходя из вышесказанного при замораживании спермы после ее концентрирования центрифугированием, технология подготовки спермы к замораживанию и замораживание включают следующие этапы: 1. Получение и выдержка целого эякулята спермы при температуре 34° С в течение 45...60 мин. 2. Разбавление спермы средой (1 32...340) в соотношении 1:1 и охлаждение до температуры 22...22° С в течение двух часов, т.е. со скоростью 0,1.„0,15 град/мин. 3. Центрифугирование спермы в течение 15 мин при 700g и удаление надосалка так, чтобы концентрация сперматозоидов в оставшейся части составляла около 1,5 млрд клеток на 1 мл. 4. Ресуспепдирование суспензии в среде О 20...220 в отношении 1:1 и охлаждение спермы, вначале при температуре 14...16°С в течение 30 мин. Затеи при температуре 4...5°С со средней скоростью 0,2 градуса в минуту. 5. Введение глицерина до конечной концентрации 2%. Затем сперму переносили в холодильник с I 4...5°С или в ледяную ванну на 20-30 мин. 6. Замораживание.

Т°С 40

35

30

25

20

15

10

5

0 40 80 120 160 200 240 280 321

Время, мил

Схема технологическою режима охлаждешм спермы при се подготовке к замораживанию

3.4.4. Размораживание спермы.

Среда разбавления оттаянной спермы.

Наиболее существенные повреждения при оттаивании спермы обусловлены процессом рекристаллизации и возникают в интервале температур от -80° С до 0° С (Фаррант, 1977). Показано, что процесс рекристаллизации можно замедлить увеличением скорости оттаивания. Нами были исследованы различные способы отогрева концентрированной спермы, а именно: 1) размораживание в приборе для оттаивания конструкции ВИЖ,( В.Кононов и др.,1975), с последующим разбавлением средой; 2) размораживание "сухим способом" в подогретой до 50°С колбе с последующим разбавлением; 3) размораживание в подогретой среде. Активность и время переживания спермы, размороженной в приборе при 42°С, на 44% и 43% соответственно выше, чем при опаивании в подогретой колбе и на 60 и 56%, чем при оттаивании в подогретой до 50°С среде.

Удаление большей части плазмы, играющей важную роль в процессе оплодотворения потребовало совершенствования среды для разбавления оттаянной концентрированной спермы. На основании проведенных исследований нами разработаны среды глюкозо-солевая (Г-солевая), и ФИГ1, в состав которых введены компоненты, имеющиеся в плазме спермы хряка. Состав среды ФИП (в г на 1 л бидистил-лированной воды): фруктоза - 25, инозитол - 15, цитрат натрия - 2,76, цитрат калия - 0,65, пируват натрия - 2,20, сернокислый магний - 0,24, хлористый кальций - 0,10, унитиол - 0,21. Депрессия точки замерзания среды - 0,62, рН - 6,2. (авт. свид. № 1191073). В Г-солевой среде, в отличие от среды ФИП, вместо инозитола и фруктозы используется эквивалентное количество глюкозы.

При сравнительном испытании ГХЦК, ОЛЕР (1/аг5$оп,1980), Г-солсвой и ФИП сред подвижность спермы сразу после размораживания во всех средах была на уровне 3,5 .., 3,7 баллов.. Существенные различия в подвижности клеток в пользу среды ФИП выявлены через 3 часа инкубации спермы при 38°С. В этой среде была наиболее высокая переживаемость спермы - 7,7 часа. В Г-солевой ВП было на 42% выше, чем в ГХУК-среде. Время переживания сперматозоидов в среде ФИП было на 71% выше, чем в ГХЦК-срсде и на 87% выше, чем в ОЛЕП. Преимущество ФИП перед Г-солевой по времени переживания составило 29%.Результаты полярографического анализа показали, что величина стимуляции дыхания ДНФ в сперме, инкубированной в ГХЦК-среде, составила 1,8, в Г-солевой - 2,3 и в ФИП - 2,5. Повреждение ак-росом в Г-солевой среде и среде ФИП на 4% и 6% меньше, чем в ГХЦК и ОЛЕП.

. Таким образом, разработанный нами состав среды ФИП является более оптимальным для сохранения сперматозоидов после замораживания-опаивания.

Исследовали влияние степени разбавления, скорости разбавления и температуры среды, при разбавлении оттаянной спермы, на жизнеспособность сперматозоидов. Увеличение степени разбавления оттаянной спермы от1:1 до 1:5 не влияет на активность и время переживания спермы, однако, при разбавлении в отношении более чем 1:4 средой ФИП, увеличивалось количество поврежденных акросом на 2,5...3,0% (р<0,01).

Установлено, что разбавление спермы в 3 этапа с интервалом 2...3 минуты позволяет снизить количество поврежденных акросом на 5% (Р<0,01) в сравнении с одномоментным разбавлением. Время переживания сперматозоидов при всех способах разбавления одинаково. Оптимальной температурой среды при при разбавлении спермы является 37°С.

Результаты осеменения свиней замороженной спермой, разбавленной после оттаивания разными средами, даны в табл. 9.

Таблица 9

Влияние различных срсд для оттаивания на оплодотворяющую

способность спермы хряков.

Среда Число свиноматок % оплодотворения М±ш Р

осемененных перегулявших

ГХЦК Г-солевая ФИП 23 16 39 15 7 14 34,8+9,9 56,3+12,4 64,1+7,7 >0,2 <0,02

ОЛЕП - 53-57 *

* - по литературным данным

3.4.5. Влияние срока хранения замороженной спермы на показатели качества сперматозоидов

Исследование влияния срока хранения криоконсервированной спермы показало, что хранение спермы хряков в жидком азоте в течение 4-х лет не повлияло на активность и время переживания спермато-

зондов после оттаивания спермы; также не оказало влияния на величину стимуляции дыхания сперматозоидов и оплодотворяемость свиноматок осемененных замороженно-оттаянной спермой.

3.5. Оценка криоустойчивости сперматозоидов и их оплодотворяющей способности после замораживания-оттаивания.

3.5.1. Сезонные изменения криоустойчивости сперматозоидов хряка

С целью изучения динамики криорезистентности по сезонам года в каждый сезон исследовали по 27...32 эякулята от 9 хряков по комплексу показателей, характеризующих функциональную полноценность замороженно-оттаянной спермы. Как видно из таблицы 10,

Таблица 10

Динамика показателей криорезистентности спермы хряков

по сезонам года п=27-32

Сперма Показатели спермы Сезоны года

весна лето осень-зима

Объем эякулята, мл 189±8,93 164+13,09 187+13,37

Концентрация сперма-

тозоидов, млн/мл 259+16.46 311+20,09 249+11,00

Активность, балл 8,6+0,09 8,3+0,13 8,4+0,11

Свеже- Активность дегидро-

полу- геназ, мин. (РМС) 5,7+0,60 7,2+0,65 7,4+0,80

ченная Скорость эндогенног о

дыхания (Уэнд) 178+18,60 81 + 11,20* 92+9,70**

Стимуляция дыхания.

2,4-ДНФ (Уднф/Усц) 3,3+0,17 3,1+0,26* 3,3+0,32*

Стимуляция дыхания

сукцинатом калия (Vcu) 1.1+0.02 1,0+0,00 1,0+0,03*

Активность, балл 1,6+0,16 3,3+0,20* 3,7+0,07**

Заморо- Время переживания, ч 3,8+0,17 4,4+0,26 5,4±0,15**

женно- Процент поврежденных

оттаян- акросом 24,3+1,46 16.1+2,11** 16,4+1,17**

ная РМС, мин 15,0+1,62 13,0+1,64 12,5+1,00

Уэнд 24+4,2 22+2,0 37+3,0*

Усц/Уэнд 2,8+0,26 2,4+0,37 1,8+0,09**

Уднф/Усц 1,6+0,05 2,4+0,37* 1,8+0,04*

*Р< 0,05; **Р< 0,001

имеется сезонная вариабельность в устойчивости спермы к ТШ и крио-коисервации. Достоверное снижение криоустойчивости наблюдалось весной.Анализ результатов исследования показал, что снижение криоустойчивости спермы в весенний период связано с увеличением интенсивности окислительных процессов в свеженолученной сперме подопытных животных, снижением сопряженности дыхания и синтеза АТФ и увеличением проницаемости мймбран сперматозоидов. Изменение структурно-функционального состояния мембран сперматозоидов в весенний период, приводящее к снижению криоустойчивости спермы, по-видимому, связано с изменением гормонального статуса животных.

3.5.2. Взаимосвязь показателей качества спермы с ее криоустойчивостью

В литературе нет единого мнения относительно принципа отбора животных и отдельных эякулятов для заморажнвания, а заморожен-но-оттаянной спермы для осеменения, гарантирующего высокую опло-дотворяемость.

С целью разработки методов отбора спермы для замораживания изучали связь оплодотворяющей способности замороженно-огтаяиной спермы отдельных хряков с физиологическими и биохимическими показателями свежеполучснной спермы этих животных. Оплодотворяющая способность (ОС) замороженной спермы от хряков отобранных в опыт по общепринятым зоотехническим показателям спермы, варьировала от 12,5 до 85,7%. Активность, объем и концентрация свеженолученной спермы, будучи в пределах зоотехнической нормы, не имеют достоверной корреляционной связи с ОС замороженно-оттаянной спермы.

Оценка активности фермента ЛДГ в сперматозоидах и плазме свеженолученной спермы показала, что нет корреляции между содержанием ЛДГ и сохранностью оплодотворяющей спесобности сперматозоидов после замораживания.

Скорость дыхания (Уэ) спермы с низкой устойчивостью к замораживанию выше чем у сперматозоидов с высокой устойчивостью. Коэффициент корреляции г= -55, Р<0,05. Наличие отрицательной связи между скоростью дыхания и устойчивостью спермы к замораживанию-оттаиванию дает основания предполагать о том, что сперматозоиды с высокой скоростью окислительных процессов менее устойчивы к охлаждению и замораживанию-оттаиванию. Однако использование данного теста для оценки криорезистентности спермы и отбора животных приемлем только при предварительном "грубом" отборе животных, поскольку сперма животных обладает не только индивидуальной, но и породной изменчивостью интенсивности дыхания. Добавление сукцината к сперме с низкой оплодотворяющей способностью после ее

замораживания-оттаивания (I- группа) приводит к увеличению (стимуляции) скорости дыхания сперматозоидов, что указывает на повреждение их внешней мембраны или нарушение се проницаемости. Стимуляция дыхания сперматозоидов при добавлении сукцината более чем в1,1 раза (Усц/Уэ> 1,1) является показателем низкой криоустойчи-вости сперматозоидов. Но отсутствие стимуляции дыхания сукцина-том не всегда является критерием высокой криоустойчивости сперматозоидов. Более точно устойчивость спермы к замораживанию характеризует реакция дыхания сперматозоидов на добавление ДНФ. Коэффициент корреляции между величиной стимуляции дыхания ДНФ и оплодотворяющей способностью спермы равен +0,71 (Р<0,001). Установлено, что для сохранения оплодотворяющей спесобности сперматозоидов после замораживания-оттаивания >50% необходимо отбирать .для криоконсервации свежеполученную сперму со стимуляцией дыхания - Уднф/Уэ >3,0, при стимуляции дыхания сукцинитом калия менее 1,05 раза (Усц/Уэ<1,05).

Таблица 11

Связь между показателями шокированной спермы и се оплодотворяющей способностью после замораживания-оттаивания

Показатели спермы, подвергнутой температурному шоку Оплодотворяющаяя способность замороженно-оттаянной спермы, о / /0 Коэффициент корреляции

меньше 50 (32,7+3,7) больше 50 (78,1+6,1)

Активность, балл 2,65+0,11 3,13+0,04 +0,29

Время переживания,

час 4,38+0,12 5,33+0,11 +0,64*

Время редукции ме-

тиленовой сипи, мин 22,35+2,00 15,90+0,55 - 0,59*

Поврежденных ак-

росом,% 35,05+2,82 14,20+2,68 - 0,84*

Дыхание исходное,

Уэнд 76,5+12,21 69,9+15,28

Дыхание с 2,4-ДНФ,

Уднф 117,26+6,93 142,96+10,60

Стимуляция дыхания

2,4-ДНФ, Удпф/Уэнд 1,54 2,05 +0,70*

Нами была исследована возможность использования теста устойчивости спермы к холодовому шоку с целью разработки мегода отбора спермы хряков для замораживания. Время переживания, стимуляция дыхания ДНФ, время редукции метиленовой сини и процент сохранности акросом сперматозоидов после температурного шока имеют достоверную корреляцию с оплодотворяющей способностью. Наиболее высокую корреляцию при этом имеют сохранность акросом и величина стимуляции дыхания сперматозоидов (табл. 11.).При отборе спермы для замораживания считаем целесообразным использовать показатель стимуляции дыхания ДНФ свежеполученной и шокированной спермы в сочетании с оценкой сохранности акросом.

3.5.3.Взаимосвязь показателей качества замороженно-оттаянной спермы с ее оплодотворяющей способностью. Прогнозирование оплодотворяющей способности.

С целью разработки метода прогнозирования оплодотворяющей способности (ОС) сперматозоидов хряков после заморожнвания-оттаивания, исследовали связь между оплодотворяемостью свиноматок,осемененных замороженно-оттаянной спермой и физиологическими и биохимическими показателями сперматозоидов после замораживания-оттаивания. Исследования проводили на сперме хряков породы крупная белая и крупная белая эстонской линии в возрасте 2...3,5 лет. Было отобрано 11 хряков. Спермой каждого хряка осеменяли двукратно по 14... 16 свиноматок.

По данным оценки ОС животные были разбиты на две 1руппы. В I вошли животные с низкой ОС замороженно-отгаянного семени (25+4,6), во 11 группу с высокой ОС (81+6,0). Различия между средними значениями ОС этих групп статистически достоверны.

После замораживания-оттаивания лишь 35...40% сперматозоидов сохраняли поджвижность и не имели достоверной связи с ОС. ВГ1 сперматозоидов с высокой ОС было выше, чем с низкой ОС и составляло 5,3+0,19 часа против 4,4+0,21, однако, не имело достоверной корреляционной связи с оплодотворяющей способностью г = +0,47 Р>0,05.

Показателем ОС сперматозоидов не может служить и активность ЛДГ в заможенно-оттаянных сперматозоидах и плазме, по-сколько величина коэффициента корреляции не достоверна. Анализ замороженно-оттаянной спермы подопытных хряков по величине отношения активности ЛДГ в сперматозоидах к его активносги в плазме выявил достоверную положительную связь с ОС (г=+0,60, Р<0,05). Данный показатель является полезным и информативным при разработке и совершенствовании метода криоконсервации спермы животных, но не может служить надежным критерием для достаточно точного прогнозирования оплодотворяющей способности сперматозо-

идов, так как величина коэффициента корреляции находится на пороге достоверности.

Скорость дыхания сперматозоидов не имеет корреляционной связи с оплодотворяющей способностью замороженно-оттаянной спермы. Высокая достоверная связь имеется между величиной стимуляции дыхания ДНФ • замороженных сперматозоидов и оплодотворяющей способностью (г=0,70, Р<0,01).

Суммарный анализ результатов осеменения свиней нескольких серий опытов дал возможность определить размах колебаний величины стимуляции дыхания,которые позволяют прогнозировать оплодотворяющую способность замороженно-оттаянной спермы (табл. 12).

Таблица 12

Прогнозирование оплодотворяющей способности замороженно-оттаянной спермы хряков по стимуляции дыхания 2,4-ДНФ

г р Величина стимуляции дыхания после добавления 2,4-ДНФ (УДПФЛ'сп) Ошгодотворяю-ющая способ-

ность сперматозоидов, %

У п Свежеподученная Замороженно оттаян-

п а сперма ная сперма

I 1,6-2,5 1,2-1,4 11-35

II 2,6-3,5 1,5-1,8 36-60

III >3,5 >1,9 61-85

Для проверки надежности прогноза ОС по данному показателю осеменили 42 свиноматки спермой замороженной по усовершенствованной технологии. Спермой с величиной стимуляции дыхания до 1,4 осеменили 9 свиноматок - I группа; до 1,8-13 свиноматок II группа; и 1,9 и более 20 свиноматок - III группа. Фактические результаты после опоросов осемененных свиноматок: 11%; 46% и 75% - соответственно.

Рецессивным анализом найдено эмпирическое уравнение, позволяющее прогнозировать оплодотворяющую способность сперматозоидов хряка: у=39х-18, где у - ОС, х - величина (коэффициент) стимуляции дыхания.

Высокая чувствительность редокс-состояния промежуточного переносчика дыхательной цепи митохондрий сперматозоидов НАД при охлаждении и замораживании-оттаивании спермы послужила основанием для исследования наличия связи между оплодотворяющей способностью сперматозоидов и изменением флуоресценции НЛДН в ответ на добавление тестирующих веществ.- Добавление ДНФ-ла к сперматозоидам сохранившим оплодотворяющую способность вызы-

вает снижение флуоресценции НАДН более чем на 40% , а в пробах спермы утратившей оплодотворяющую способность , снижение флуоресценции НАДН , после добавления ДНФ, значительно меньше и составляет около 20% . При добавлении антимицина, ингибитора II участка сопряжения дыхательной цепи, увеличение флуоресценции НАДН зависит от функциональной полноценности сперматозоидов.

Анализ связи показателей флуоресцентной оценки сперматозоидов хряков с их оплодотворяющей способностью показал, что ,при разнице между изменением флуоресценции НАДН в сперматозоидах после добавления ДНФ и антимицина от 0 до 11 % оплодотворяющая способность может быть в пределах от 11 до 35%, при изменении НАДН в пределах 10...20%, оплодотворяющая способность находится в пределах 36...60% и при при разнице более 20% - оплодотворяющая способность >60%. Коэффициент корреляции Чупрова между изменением флуоресценции НАДН после добавления ДНФ и антимицина и оплодотворяющей способностью равен 0,8 (<0,01).

Сравнительное исследование дыхания сперматозоидов хряков, быков, баранов и петухоз показало идентичность в характере ответных реакций на действие сукцината калия , 2,4-динитрофенола и антимицина А. Различия заключались лишь в силе ответа на действие тестирующих веществ (табл. 13). Это дало нам основание для исследования наличия взаимосвязи между реакцией дыхания на действие ДНФ и оплодотворяющей способностью заморожснно-оттаянных сперматозоидов названных видов животных.

Не установлено наличие корреляции между величиной стимуляции дыхания ДНФ дыхания замороженно-оттаянных сперматозоидов быков и оплодотворяемостью телок. В то же время при осеменении коров выявлена связь между их оплодотворяемостью и величиной стимуляции дыхания сперматозоидов замороженно-огтаянной спермы (г=0,62 Р<0,05). Регрессивным анализом найдено уравнение, которое позволяет судить о предположительной оплодотворяемое™ коров в зависимости от величины стимуляции дыхания у=76х-55 где у - опло-дотворясмость коров, а х - величина стимуляции (СД) сперматозоидов. При осеменении коров для достижения оплодотворяемосги коров 70% и более необходимо использовать сперму со стимуляцией дыхания сперматозоидов не менее 1,6 раза.

Совместно с сотрудниками отдела биологии воспроизведения и искусственного осеменения ВНИИ племенного дела Е.М.Платовым и А.М.Малиновским в двух сериях опытов исследовали дыхание замо-роженно-оттаянной спермы баранов. Всего было исследовано 79 эяку-лятов замороженно-оттаянной спермы.

Установлена корреляция между стимуляцией дыхания заморо-женно - оттаянных сперматозоидов баранов ДНФ и оплодотворяю-

щей способностью сперматозоидов, оцениваемой по суягности овец . Коэффициент корреляции г=+0,85 (Р<0,01). Рассчитанное уравнение имеет вид: у=50,8х-40,6, где у - суяпадсгь овец, х - величина стимуляции дыхания ДНФ-.

Таким образом, величина стимуляции дыхания сперматозоидов баранов ДНФ- . после замораживания- оттаивания спермы, может служить критерием для прогнозирования оплодотворяющей способности.

Таблица 13

Сравнительные данные показателей дыхательной активности сперматозоидов хряков, быков, баранов и петухов.

Животное, сперма п А

Хряки

Свежеразбав-

ленная 6 9,0

Замороженно-

оттаянная 6 3,5

Быки

Свежеразбав-

ленная 8,0

Замороженно-

оттаянная ¡0 5,0

Бараны

Замороженно-

оттаянная 8 4,0

Петухи

Свежеразбав-

ленная 4 9,0

Замороженно-

оттаянная 7 4,5

Скорость дыхания

Стимуляция дыхания Анти-мицин устойчивое дыхание,%

с сукцина-натом +ДНФ

1,02+0,020 3,30+0,050 8

1,50+0,141 2,45+0,150 24

1,06+0,048 2,20+0,350 14

1,92+0,100 1,59+0,072 16

1,38+0,054 1,52+0,059 28

1,00+0,010 1,87+0,040 2

1,36+0,139 1,66+0,114 11

178+18,6 98+11,4

130+9,0 82+10,0

200+33,6

220+20,4 120+14,6

Исследовали возможность использования полярографического и флуоресцентного методов для оценки функциональной полноценности спермы петухов для прогнозирования оплодотворенности яиц после осеменения кур замороженно-оттаянной спермой .

Величина стимуляции дыхания сперматозоидов ! ДНФ . в исследованных пробах колебалась от 1,39 до 2,25, а оплодотворяемость яиц - от 24 до 95%. Корреляционный анализ связи между оплодотво-ряемостью яиц при осеменении кур замороженно-оттаянной спермой и величиной стимуляции дыхания сперматозоидов после добавления ДНФ показал, что эта связь достаточно высокая и достоверная (г=+0,76 Р<0,01). Регрессивным анализом найдено эмпирическое уравнение у=67х-50, где у - оплодотворенность яиц, а х - коэффициент стимуляции дыхания сперматозоидов ДНФ,

В опыте на свежеполученной и замороженно-оттаянной сперме петухов исследовали также влияние тестирующих веществ: сукцината калия, ДНФ и антимицина на флуоресценцию НАДН в сперматозоидах. Установлено, что концентрация тестирующих веществ и характер редокс-реакций 11АДН на их действие аналогичны установленным нами для спермы хряков. Корреляционным анализом установлено наличие достоверной связи между величиной изменения флуоресценции НАДН после добавления ДНФ и оплодотворенностьшяиц (г=0,65, Р<0,05). Регрессивным анализом найдено эмпирическое уравнение у=0,7х+ 32,7, где у - оплодотворенность яиц, х - изменение флуоресценции НАДН после добавления ДНФ.

Таким образом, полярогафический и флуоресцентный методы оценки спермы пригодны для прогнозирования оплодотворяющей способности замороженно-оттаянных сперматозоидов разных видов животных.

В настоящее время отечественная промышленность не выпускает серийных приборов, которые позволяли бы проводить одновременную оценку качества сперматозоидов по нескольким показателям, в частности но скорости дыхания, флуоресценции и концентрации ионов. С целью создания прибора для одновременной оценки спермы животных по данным показателям, нами разработана и предлагается блок-схема прибора и ячейки к нему. На основе данной схемы нами была собрана и опробирована лабораторная установка, на которой одновременно определяли дыхание и флуоресценцию НАД.Н и ФАД.

ВЫВОДЫ

1. Потеря оплодотворяющей способности сперматозоидов хряка после замораживания-оттаивания связана с рядом сгруктурных, биохимических изменений сперматозоидов: нарушением упорядоченности и целостности мембран плазматической и акросомальной оболочек, а также митохондрий, выходом ферментов, в том числе и ЛДГ из клеток и частичной ее инактивацией, разобщением дыхания и фосфоршшро-

вания, снижением аэробного синтеза АТФ и времени переживания сперматозоидов.

2. Медленное охлаждение спермы до +5° С при ее консервации приводит к обратимым регуляторным изменениям функционирования дыхательной цепи митохондрий сперматозоидов. "Холодовой шок", возникающий при быстом охлаждении приводит к повреждениям необратимого характера.

3. При охлаждении и замораживании сперматозоидов наиболее уязвимым является начальный НАД - зависимый участок дыхательной цепи.

4. Разбавление свежеполученной спермы средой приводит к увеличению общей активности фермента ЛДГ и изменению изофер-ментного спектра. Наблюдается повышение активности "анаэробных" изоферментов ЛДГ4 и ЛДГ5. Замораживание не вызываег изменения соотношение "М" и "Н" субъединиц.

5. Криозашитное действие тиоловых соединений связано с их антиокислительным действием, предотвращающим окисление БН-групп белковых молекул, что приводит к специфическому повышению устойчивости мембранных структур и функционирования дыхательной цепи митохондрий сперматозоидов.

6. Введение в среду для криоконсервации мочевины и производных бензимидазола в малых концентрациях вызывает неспецифическое увеличение устойчивости сперматозоидов к повреждающему действию охлаждения и замораживания-оттаивания.

7. Центрифугирование спермы хряков в течение 10...15 мин. при 700-800g при ее концентрировании не повреждает сперматозоиды и их функциональную полноценность. Снижение оплодотворяющей способности сперматозоидов после центрифугирования происходит при полном удалении плазмы спермы.

8. Разработан усовершенствованный метод замораживания спермы хряков. Замораживание спермы, после ее концентрирования путем центрифугирования с частичным удалением плазмы позволяет уменьшить объем криоконсервированной спермы в 4...5 раза при сохранении оплодотворяющей способности на уровне варианта без удаления плазмы.

9. Установлена зависимость криоустойчивости сперматозоидов от степени сопряженности дыхания и фосфорилирования и обратимости редокс-состояния дыхательной цепи.

10. Установлено, что добавление субстрата дыхания сукцината калия в сперму не вызывает усиления дыхания интактных сперматозоидов. Стимуляция дыхания при добавлений сукцината наблюдается только в случае повреждения мембран сперматозоидов. Свежеполу-ченная сперма при наличии стимуляции дыхания сперматозоидов сук-цинатом калия в 1,1 раза и более и ДНФ менее чем в' 3 раза не устойчива к замораживанию.

11. Показано наличие индивидуальной и сезонной изменчивости в устойчивости спермы хряков к охлаждению и заморажива-нию.Сезонные изменения устойчивости спермы к охлаждению и замораживанию связаны с изменением интенсивности дыхания и окислительных процессов в сперматозоидах.

12. Установлено наличие корреляционной связи между оплодотворяющей способностью и стимуляцией дыхания ДНФ сперматозоидов хряков, баранов,быков и петухов после замораживания-оттаивания. Для получения высоких результатов от осеменения свиноматок криоконсервирозанной спермой хряков необходимо отбирать сперму со стимуляцией дыхания ДНФ в 1,9 раза и более.

13. Длительное хранение криоконсервированной спермы хряков при температуре -196°С не снижает ее оплодотворяющую способность.

14. Определены параметры для оценки спермы флуоресцентным методом. Разработана блок-схема прибора для объективной оценки спермы с.-х. животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. С целью уменьшения затрат хладоагента, емкостей для хранения и транспортировки замороженно-оттаянной спермы предлагаем использовать метод криоконсервации спермы хряков концентрированной центрифугированием (A.C. № 1561250).

2. Для повышения результативности искусственного осеменения криоконсервированной спермой рекомендуем использовать:

а) для ¡замораживания спермы среду состава: глюкоза - .15 г, сахароза - 70 г, натрий лимоннокислый 3-х замещенный 5,5 водный - 2.78 г, калий лимоннокислый 3-х замещенный - 0,65 г, трилон Б - 1,0 г, мочевина - 1,5 г, унитиол - 0,25 г, желток куриного яйца - 100. мл, вода ди-стилированная 1000 мл;

б) для разбавления криоконсервированной спермы после ее оттаивания среду следующего состава: глюкоза или фруктоза - 25 г, инозитол - 15 г, натрий лимоннокислый 3-х замещенный - 2,76 г, калий лимоннокислый 3-х замещенный - 0,65 г, натрий пировинограднокис-лый - 2,2 г, магний сернокислый - 0,24 г, кальций хлористый - 0,1 г, унитиол - 0,21 г, вода дисгалированная - 1000 мл (A.C. № 1191073).

3. Предлагаем проводить оценку качества свежеполученной спермы до замораживания и замороженно-оттаянной спермы для осеменения свиноматок, или при закладке на хранение полярографическим методом по величине стимуляции дыхания сукцинатом калия и 2,4-динитрофенолом (ДНФ) (A.C. № 983990). Для замораживания ис* пользовать сперму со стимуляцией дыхания динитрофенолом больше 3-х раз при отсутствии стимуляции дыхания сукцинатом калия. Замо-

роженную сперму для осеменения и хранения использовать при стимуляции дыхания динитрофенолом больше 1,9 раза.

4. Рекомендуем использовать в - средах для замораживания спермы дибазол (2-бензил-бензимидазол) в концентрации 109 - 10х моля.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шапиев И.Ш. Структурные изменения сперматозоидов хряка при замораживании-оттаивании //Цитология.- 1975,- е.- 856-857.

2. Мороз Л.Г., шапиев И.Ш., Корбан Н.В., Машанский В.Ф. Физиологические и биохимические изменения сперматозоидов хряка при замораживании //Сельскохозяйственная биология. 1976. - 6. -с. 850-856.

3. Шапиев И.Ш., Корбан Н.В., Мороз Л.Г. Среда для замораживания спермы сельскохозяйственных животных //Авторское свидетельство № 540634, 1976, Бюл. 48.

4. Шапиев ИЛИ., Мороз Л.Г., Корбан Н.В. К вопросу технологии замораживания семени хряков //Животноводство. - 1976. - 12. - с. 60-62.

5. Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. Метод замораживания спермы хряка //Свиноводство. - 1977. -12.-е. 29.

6. Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. Сравнительное испытание различных способов замораживания спермы хряков //Сельскохозяйственная биология. - 1978. - №6. - с. 902-908.

7. Шапиев И.Ш., Корбан Н.В., Беззубцева Н.И. О режиме замораживания спермы хряков в гранулах различного объема //Бюл. ВНИИГРЖ. - 1978. - вып. 33. - с. 23-25.

8. Шапиев И.Ш., Мороз Л.Г. Полярографический мнтод оценки спермы хряков //Бюл. ВНИИГРЖ. - 1980. - вып. 50. - с. 4-5.

9. Мороз Л.Г., Шзпиев И.Ш., Корбан Н.В. Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков при низкотемпературной консервации, Л. - 1980. - 61 с.

10. Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. Методические рекомендации по низкотемпературной консервации спермы хряков. Л. -1980.-60 с.

11. Мороз Л.Г., Корбан Н.В., Шапиев И.Ш. и др. Устойчивость к температурному шоку - метод оценки и отбора спермы хряков для замораживания //Бюл. ВНИИГРЖ. - 1980. в. 50. - с. 3-4.

12. Мороз Л.Г., Шапиёв И.Ш., Корбан Н.В. Способ оценки спермы с.-х. животных //Авторское свидетельство № 938990. 1982. -Бюл. 24.

13. Мороз Л.Г., Корбан Н.В., Шапиев И.Ш. Оценка спемы хряков для замораживания и прогнозирования ее оплодотворяющей способности //Сельскохозяйственная биология. - 1982. -3.-е. 394-397.

14. Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. Структурно-функциональные изменения сперматозоидов при действии низких температур //Всесоюзный биофизический съезд. - 1982. - т.Н. - с. 7.

15. Шапиев И.Ш., Мороз Л.Г., Рустенова P.M. Влияние тиопре-паратов на время переживания и энергетический обмен сперматозоидов //Бголл. В11ИИРГЖ.-В.57.-5-6.

16. Мороз Л.Г..Корбан Н.В.. Рустенова P.M., Шапиев И.Ш. и др. Устойчивость семени хряков при замораживании в присутствии тиоловых соединений //Сельскохозяйственная биология.-1983,- ll.-c.88-91.

17. Шапиев И.Ш. Влияние концентрации спермы хряков на функциональное состояние сперматозоидов при замораживании //Бюлл. ВНИИРГЖ.- 1983.- в.65.- с. 7-9.

18. Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. и др. Оценка крио-резистентносги семени хряков по устойчивости к холодовому удару //Животноводство.- 1983.-3,-с. 44-46.

19. Мороз Л.Г.,Шапиев И.Ш., Корбан Н.В. Исследование механизмов неодинаковой устойчивости спермы хряков к замораживанию //Криоконсервация гамет и эмбрионов с. - х. животных. Сб. научи, тр., Л.- 1983.-с. 48-54.

20. Мороз Л.Г.,шапиев И.Ш., Корбан Н.В. Совершенствование технологии оттаивания криоконсервированной спермы хряков //Животноводство,- 1986,- с.54-56.

21. Шапиев И.Ш., Мороз Л.Г., Корбан Н.В. Оценка функциональной польноценности спермы производителей //Биохимия с.-х. животных и продовольственная программа., Ташкент,- 1986.- с. 141-142.

22. Шапиев И.Ш., Мороз Л.Г., Корбан Н.В. Среда для разбавления криоконсервированной спермы хряков II Авторское свидетельство № 1191073.1986,- Бюлл.42.

23. Шапиев И.Ш. Ингибиторный анализ состояния энергетической системы спермиев на разных этапах охлаждения и замораживания//Бюлл. ВНИИРГЖ,- 1988,- в. 106.- с. 14-16.

24. Шапиев И.Ш., Мороз Л.Г., Корбан Н.В. Влияние охлаждения и замораживания на дыхательную цепь сперматозоидов //Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины, Харьков. - 1988.-с. 39-40.

25. Малиновский A.M., Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. и др. Зависимость оплодотворяющей способности спермы барана от ее биоэнер-гегипческих показателей //Использование высокоплеменных с.-х. животных / Сб. научн. трудов, ч.2, ВНИИПлем, М.- 1988.-С.18-21

26. Шапиев И.Ш., Мороз Л.Г., Корбан Н.В. Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков и баранов, Л. - 1989. -20 с.

27. Способ криоконсервации спермы хряков //Авт. свид. № 1561250, 1990.

28. Шапиев И.Ш., Мороз Л.Г., Коваленко Г.П. Влияние синтетических антиоксидантов и производных бензимидазола на оплодо-творяемость свиноматок//Бюлл. ВНИИРГЖ,- в. 128,- 1991.- с.5-7.

29. Шапиев И.Ш., Мороз Л.Г., Прокопцев В.М. Методы оценки качества спермы животных и прогнозирование ее оплодотворяющей способности //Сельскохозяйственная биология,- 1994,- 4,- с. 114-122.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктора сельскохозяйственных наук, Шапиев, Исмаил Шапиевич, Санкт-Петербург-Пушкин

«С?? .9? -Мга

»«; ченую степень ДОЮ/С -1

---------------------------------------------~-------------------------------> 1 ^

Начальник управления БАК Рос

//У- 6/3 - £

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ НСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ

ЖИВОТНЫХ

ШАПИЕВ ИСМАИЛ ШАПИЕВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЗАМОРАЖИВАНИЯ И ОЦЕНКИ СПЕРМЫ ХРЯКОВ

Специальность 06.02.01.- разведение,селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук

Санкт-Петербург - Пушкин 1998

Список сокращений

А - активность сперматозоидов АА - антимицин А АТФ- аденозинтрифосфат ВП- время переживания

ГХЦЖК-глюкозо-хелато-цитратно-калиевая среда ГХЦЖКУМ-глюкозо-хелато-цитрат-желтчно-калиевая среда с унитиолом и мочевиной

ГС X Ц Ж К У М - - г л ю к о з о -сахарозно- хелато-цитрат-желточно-ка-

лиевая среда с унитиолом и мочевиной

ГХЦС-8- глюкозо-хелато-цитрат-сульфатная среда

ДНФ - 2, 4-динигрофенол

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

М, Н - субъединицы,из которых состоят изоферменты ЛДГ -ЛДГ1....ЛДГ5

НАДН- никотнамидадениндинуклеотид восстаноленный МЭ - а- меркаптоэтанол

ОЛЕП- среда для разбавления замороженной спермы

ОС - оплодотворяющая способность

ПН - пиридиннуклеотиды

РМС- редукция метиленовой сини

СД - стимуляция дыхания

Сц - сукцинаткалия

SH - сульфгидрильные гуппы

ТШ (ХШ) - температурный (холодовой) шок

ФАД - флавинадениндинуклеотид

ФП - пиридиннуклеотид

ФИП- среда для разбавления оттаянной спермы хряков Уэ - скорость эндогенного дыхания

Усц - скорость дыхания в присутствии экзогенного сукцината Уднф- скорость дыхания в присутствии динитрофенола

л

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................7

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................14

1.1. Влияние охлаждения на живые клетки Концепция о механизмах криоповреждения и криоустойчивости клеточных структур.......................................14

1.1.1. Температурный шок........................................................15

1Л .2. Повреждение и устойчивость клеток при замораживании...........................................................................20

1.2. Структурно-функциональные и биохимические изменения сперматозоидов при охлаждении и замораживании- оттаивании...........................................................26

1.2.1. Действие низких температур на подвижность, структуру и оплодотворяющую способность сперматозоидов........................................................................................26

1.2.2 Некоторые биохимические изменения сперматозоидов при охлаждении и замораживании..............................30

1.3. Защита сперматозоидов от повреждающего

действия низких температур при криоконсервации...................35

1.3.1. Защитные среды..............................................................35

1.3.2. Неспецифическое повышение устойчивости

клеток- как способ криопротекции сперматозоидов..................43

1.4. Замораживание и оттаивание спермы хряков.................51

1.4.1. Разбавление и подготовка спермы к замораживанию....................................................................................52

1.4.2. Замораживание................................................................57

1.4.3. Оттаивание спермы.........................................................59

1.5. Современные методы оценки качества спермы животных.....................................................................................62

1.5.1. Морфологические методы.............................................64

1.5.2. Биофизические методы....................................................67

1.5.3. Биохимические методы....................................................70

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............71

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................74

3.1. Структурно-функциональные изменения сперматозоидов хряка при охлаждении и замораживании-оттаивании...................................................................................74

3.1.1. Фазово-контрастная микроскопия сперматозоидов............................................................................75

3.1.2.Ультраструктурные изменения сперматозоидов

при охлаждении и замораживании-оттаивании.........................78

3.2. Физиологические и биохимические изменения сперматозоидов хряка при охлаждении и замораживании-оттаивании .........................................................................92

3.2.1. Криобиохимия ферментов...............................................92

3.2.1.1. Общая активность дегидрогеназы...................................93

3.2.1.2. Лактатдегидрогеназа........................................................94

3.2.2. Криобиохимия сульфгидрильных групп.......................108

3.2.3. Окислительное фосфорилирование и дыхание сперматозоидов хряка после охлаждения и замораживания-оттаивания спермы..........................................................110

3.2.3.1. Окислительное фосфорилирование...............................110

3.2.3.2. Дыхательная цепь и методы ее исследования................112

3.2.3.3. Влияние охлаждения и замораживания на

дыхание сперматозоидов............................................................123

3.3. Пути повышения криоустойчивости сперматозоидов.

Разработка метода криоконсервации спермы хряков...............131

3.3.1. Влияние некоторых химических агентов на выживаемость и структурно-функциональное состояние

сперматозоидов после замораживания-оттаивания...............131

3.3.1.1. Влияние хлоралгидрата на активность и

время переживания сперматозоидов.......................................133

3.3.1.2. Влияние мочевины на время переживания

и активность сперматозоидов..................................................136

3.3.1.3. Влияние унитиола на активность и время переживания сперматозоидов...................................................138

3.3.1.4. Влияние цистеамина, цистеина и меркапто-этанола на выживаемость сперматозоидов после замораживания-оттаивания.......................................................140

3.3.1.5. Влияние совместного действия мочевины и унитиола

на активность и время переживания сперматозоидов..............141

3.3.1.6. Сравнительное исследование тиоловых веществ на некоторые структурно - метаболические показатели сперматозоидов после их замораживания.................................147

3.3.1.7. Влияние унитиола на общую активность и изоферментый спектр ЛДГ.........................................................151

3.3.1.8. Влияние совместного введения унитиола и мочевины в среду на активность ЛДГ и ее изоферментов................156

3.3.1.9. Влияние унитиола и мочевины при совместном введении в среду ГХЦЖК на ультраструктуру и окислительое фосфорилирование сперматозоидов.................160

3.3.1.10. Оплодотворяющая способность спермы

хряков разбавленной средой ГХЦЖКУМ................................168

3.3.2. Повышение криозащитных свойств среды ГХЦЖКУМ с введением в ее состав дисахаров........................171

3.3.3. Влияние бензимидазола и его производных

на криоустойчивость спрматозоидов........................................173

3.4. Разработка метода замораживания спермы хряков......178

3.4.1. Концентрирование спермы хряков................................178

3.4.2. Выдержка свежеполученной спермы и ее разбавление криозащитной средой.......................................182

3.4.3. Замораживание спермы.................................................187

3.4.4. Размораживание спермы. Среда разбавления

оттаянной спермы...................................................................191

3.5. Оценка криоустойчивости сперматозоидов и их оплодотворяющей способности после замораживания-оттаивания........................................................................202

3.5.1. Сезонные изменения криоустойчивости сперматозоидов хряка................................................................203

3.5.2. Взаимосвязь показателей качества спермы

с ее криоустойчивостью..............................................................205

3.5.3. Взаимосвязь показателей качества заморо-енно-оттаянной с пермы с ее оплодотворяющей способностью. Прогнозирование оплодотворяющей способности................................................................................213

4. ОБСУЖДЕНИЕ........................................................236

ВЫВОДЫ...................................................................258

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.....................261

ЛИТЕРАТУРА..........................................................262

ВВЕДЕНИЕ

Теоретические исследования в криобиологии спермы животных открыли большие перспективные возможности не только в ускоренном развитии и широком внедрении методов искусственного осеменения с.-х. животных, но и в сохранении генетически наиболее ценных и исчезающих пород и видов животных.

В свиноводстве метод криоконсервации спермы еще не получил такого же размаха как в искусственном осеменении крупного рогатого скота. Это связано с биологическими особенностями низкой крио-устойчивости спермы хряков, необходимостью замораживания значительно больших объемов спермы, технологическими и методическими трудностями нестабильностью результатов осеменения. Поэтому проблема совершенствования метода криоконсервации спермы хряков и поиск подходов и способов повышения криоустойчивости сперматозоидов остается актуальной.

Хотя сперматозоиды разных видов животных различаются по криоустойчивости, исследования, направленные на изучение механизмов криоповреждения сперматозоидов хряка и на поиск способов повышения их устойчивости при охлаждении и замораживании-оттаивании, могут быть использованы и при разработке методов замораживания спермы на других видах животных.

Нестабильность результатов искусственного осеменения с.-х. животных при использовании криоконсервированной спермы обусловлена значительной видовой, индивидуальной и сезонной изменчивостью устойчивости сперматозоидов к охлаждению и замораживанию. Поэтому существенное значение имеет отбор животных с целью получения криорезистентной спермы, а также отбор эякулятов для за-

мораживания и криоконсервированной спермы на осеменение. В связи с этим большое внимание уделено разработке методов оценки сперматозоидов и их функциональной полноценности до и после замораживания-оттаивания. Особо важное значение точная и объективная оценка функциональной полноценности спермы имеет при создании банка генофондного материала.

Исходя из изложенного целью работы было усовершенствование методов криоконсервации спермы и прогнозирования функциональной полноценности сперматозоидов до и после криоконсервации.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать ультраструктурные изменения сперматозоидов хряка при замораживании-оттаивании.

2. Изучить влияние охлаждения и замораживания-оттаи-вания на общую активность и изоферментный спектр фермента лактатдегид-рогеназы.

3. Исследовать влияние охлаждения и замораживания-оттаивания на функционирование дыхательной цепи митохондрий сперматозоидов.

4. Исследовать влияние тиоловых соединений на криоустойчи-вость сперматозоидов.

5. Изучить возможность неспецифического повышения крио-устойчивости сперматозоидов.

6. Разработать среду и температурный режим охлаждения для криоконсервации спермы хряков.

7. Разработать среду для разбавления криоконсервированной спермы после ее оттаивания.

8. Исследовать связь показателей качества сперматозоидов после замораживания-оттаивания с их оплодотворяющей способностью.

9. Разработать методы оценки криоустойчивости сперматозоидов и их функциональной полноценности после замораживания-оттаивания.

Научная новизна исследований. Полученные нами данные экспериментальных исследований позволили: развить имеющиеся знания по криобиологии сперматозоидов; показать многофакторный характер криоповреждений; выдвинуть ряд новых положений о механизме и особенностях устойчивости и повреждения сперматозоидов при охлаждении и замораживании-оттаивании. Показано, что наиболее чувствительны к охлаждению и замораживанию-оттаиванию сперматозоидов механизмы регуляции энергетического обмена.

Замораживание-оттаивание сперматозоидов хряка приводит к повреждению мембранных структур митохондрий и нарушению функционирования дыхательной цепи - разобщению дыхания и фосфорили-рования и увеличению свободного окисления. Впервые установлен характер и локализация криоповреждений дыхательной цепи. На начальном этапе криоконсервации спермы наиболее чувствителен к охлаждению 1-ый НАД - зависимый участок дыхательной цепи, а при замораживании-оттаивании повреждению более подвержен 2-ой участок дыхательной цепи. Выявлено, что криоустойчивость сперматозоидов зависит от исходного уровня кислородзависимых окислительных процессов. При высоком исходном уровне дыхания, не сопряженного с фосфорилированием, сперматозоиды обладают низкой криоусточи-востью.

Установлено, что повреждения дыхательной цепи сперматозоидов, возникающие при холодовом шоке и замораживании-оттаивании спермы не идентичны. Холодовой шок приводит к необратимому повреждению, а при замораживании-оттаивании в защитных средах наряду с необратимыми повреждениями наблюдаются регуляторные изменения функционирования дыхательной цепи.

1 о

Впервые показана возможность повышения криоустойчивости сперматозоидов введением в среду криоконсервации низких концентраций веществ со специфическим и неспецифическим действием (низкомолекулярные SH-соединения, мочевина, бензимидазол и его производные).

Выявлено, что разбавление спермы средой повышает активность изоферментов ЛДГ ответственных за гликолиз и состоящих преимущественно из М субъединиц. Показано, что увеличение отношения М субъединиц к Н субъединицам (М/Н) сопровождается повышением криоусточивости сперматозоидов.

Установлено, что сопряженность дыхания и фосфорилирования в замороженно-оттаянных сперматозоидах, оцениваемая по величине стимуляции дыхания при действии разобщителя 2,4-динитрофенола, может служить показателем их функциональной полноценности. На основе проведенных исследований разработаны:

1. Среды для криоконсервации спермы хряков пригодные также для разбавления спермы при плюсовых температурах (A.C. № 540634; № 938990; № 1534042).

2. Метод замораживания спермы путем ее концентрирования центрифугированием (A.C. № 1561250).

3. Синтетическая среда для разбавления замороженно-оттаянной спермы (A.C. № 1191073).

4. Способы оценки качества сперматозоидов полярографическим и флуоресцентным методами, которые позволяют прогнозировать криоустойчивость сперматозоидов и их оплодотворяющую способность после замораживания-оттаивания (A.C. № 938990).

Основные положения выносимые на защиту:

1. Особенности механизмов криоповреждения и криоустойчивости сперматозоидов хряков.

2. Способы повышения криоустойчивости сперматозоидов и усовершенствованный метод замораживания-оттаивания спермы хряков.

3. Методы оценки качества сперматозоидов и прогнозирования их оплодотворяющей способности.

Практическое значение работы и реализация результатов исследований. Результаты экспериментальных исследований позволили расширить понимание молекулярных механизмов криоповреждений и криозащиты клеточных структур, определить способы и направление повышения криоустойчивости к повреждающему действию низких температур. Введение в состав среды криоконсервации мочевины и унитиола или производных бензимидазола увеличило результативность криоконсервации сперматозоидов хряка, а предложенный способ концентрирования спермы уменьшил потребность в хладоагенте и емкостях для хранения замороженной спермы. Методы оценки качества криоконсервированной спермы и прогнозирование ее оплодотворяющей способности дают возможность отбирать для осеменения и хранения наиболее полноценную сперму после ее криоконсервации. Полярографический метод оценки сперматозоидов был успешно опробирован на сперме баранов в ВНИИПЛЕМ и использован при выполнении диссертационных работ на сперме хряков в ВИЖе (Новикова, 1991), быков в ВНИИГРЖе (Рустенов, 1990), петухов (Очкур, 1990) в институте криобиологии и криомедицины.

Материалы работы использованы при разработке научно-методических и нормативных документов:

1. Методические указания по исследованию физиологии и биохимии спермы (Ленинград, 1974);

2. Методические рекомендации по низкотемпературной консервации спермы хряков (Ленинград, 1980);

3. Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков при низкотемпературной консервации (Ленинград, 1980);

4. Методические рекомендации по криоконсервации концентрированной спермы хряков (Ленинград, 1985);

5. Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков и баранов (Ленинград, 1989); а также включены в монографии ряда авторов (Белоус, Грищенко, Паращук, 1986 (Харьков); Курбатов, Платов, Корбан, Мороз и др. 1988 (Ленинград).

Апробация работы. Изложенные в диссертации результаты исследований были доложены и обсуждены на: ежедневных координационных совещаниях по криоконсервации спермы с.-х. животных в 19751985 г.г.(ВИЖ); Советско-американском семинаре "Физиология воспроизведения сельскохозяйственных животных" Москва, 1977; XXXIII конференции ЕАЖ, Ленинград, 1982; 1-Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; Н-Всесоюзной конференции "Механизм криопо-вреждения и криозащиты биологических объектов", Харьков, 1984; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа", Ташкент, 1986; Международной конференции "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины", Харьков, 1988; Научно-практической конференции "Биологически активные вещества в сельском хозяйстве", Ленинград, 1988; На координационных совещаниях стран СЭВ по криоконсе

Информация о работе
  • Шапиев, Исмаил Шапиевич
  • доктора сельскохозяйственных наук
  • Санкт-Петербург-Пушкин, 1998
  • ВАК 06.02.01
Диссертация
Совершенствование методов замораживания и оценки спермы хряков - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно
Автореферат
Совершенствование методов замораживания и оценки спермы хряков - тема автореферата по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы