Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Криозащитное влияние различных антиоксидантов и БАВ при хранении спермы хряков в охлаждённом и замороженном состоянии

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Криозащитное влияние различных антиоксидантов и БАВ при хранении спермы хряков в охлаждённом и замороженном состоянии"



На правах рукописи

ФЕДИНА Наталья Игоревна

КРИОЗАЩИТНОЕ ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ И БАВ ПРИ ХРАНЕНИИ СПЕРМЫ ХРЯКОВ В ОХЛАЖДЁННОМ И ЗАМОРОЖЕННОМ СОСТОЯНИИ

06.02.01 - Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

п. Лесные Поляны, Московская область 2007 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте племенного дела.

Научный руководитель; доктор биологических наук, профессор ЕРОХИН Анатолий Сергеевич

Официальные опноненты: доктор биологических наук, профессор

КОНОНОВ Валентин Петрович

доктор биологических наук, профессор НАРИЖНЫЙ Александр Григорьевич

Ведущая организация: Российская академия менеджмента н животноводстве.

Защита диссертации состоится 18 мая 2007 г. в ] I часов на заседании диссертационного совета Д 220.017.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте племенного дела: 141212, Московская область, Пушкинский район, п. Лесные Поляны, ВНИИплем, факс: (8 495) 515-95-57.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИплем.

Автореферат разослан 16 апреля 2007 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Ерохин А.С.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из важных технологических вопросов в свиноводстве является улучшение воспроизводства стада путем использования искусственного осеменения Искусственное осеменение животных является высокоэффективным методом улучшения породных и продуктивных качеств животных путем испопьзования высокоценных племенных производителей

Важным фактором, определяющим результативность искусственного осеменения свиней, является совершенствование методов хранения спермы хряков в охлажденном и замороженном состоянии

При технологической обработке спермы, разбавлении ее синтетическими средами и хранении в охлажденном и замороженном состоянии происходят заметные структурные и биологические повреждения сперматозоидов, что значительно снижает их фертильность Поэтому весьма актуальной задачей является применение более современных технологических разработок, способствующих повышению биологической полноценности криокон-сервированной спермы хряков Кроме того, необходима разработка синтетических сред для спермы хряков, позвочяющих сохранять биологическую полноценность сперматозоидов при хранении в охлаждённом состоянии в течение 5-7 дней

Причины снижения фертильности охлажденной и замороженной спермы хряков до настоящего времени окончательно не выяснены Одной из них является активизация процессов перекисного окисления липидов при крио-консервации спермы В этой связи проводятся исследования по повышению защитных свойств синтетических разбавителей для этого вида животных, путем введения в их состав различных натуральных или синтетических антиок-сидантов, а также других биологически активных веществ

Поэтому разработка более совершенных синтетических сред для хранения спермы хряков в охлажденном и глубоко замороженном состоянии путем использования новых БАВ представляет значительный научный и практический интерес

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение защитного влияния различных антиоксидантов при хранении спермы хряков в охлажденном и замороженном состоянии, а также разработка усовершенствованной среды для замораживания их спермы

Дчя достижения этой цели были поставлены следующие задачи

- изучить влияние различных антиоксидантов на подвижность и живучесть сперматозоидов хряка, сохраняемых в охлажденном до 4 или 16°С состоянии,

- выяснить результативность осеменения свиней охлажденной спермой, сохраняемой в усовершенствованной ГХЦС среде с бычьим сывороточным альбумином и тиольным соединением,

- разработать новую синтетическую среду для глубокого замораживания спермы хряков,

- проанализировать втаяние различных антиоксидантов на криоустой-чивость сперматозоидов хряка при замораживании в новой среде,

- изучить возможность замены желтка куриного яйца в составе разбавителей для криоконсервации семени хряка на сухой соевый лецитин,

- выяснить криопротективное влияние при замораживании спермы хряков монометилового эфира глицерина и других заменителей глицерина

Научная новизна исследований. Впервые изучено влияние ряда синтетических и натуральных антиоксидантов на устойчивость сперматозоидов хряка к хранению в охлажденном состоянии Выяснена результативность осеменения свиней охлажденной спермой, сохраняемой при 16°С в течение 3-5 дней с использованием усовершенствованной ГХЦС среды Усовершенствована синтетическая среда для глубокого замораживания спермы хряков Проведено сравнительное изучение влияния различных антиоксидантов на криоустойчивость спермы хряков при замораживании Впервые изучена возможность замены желтка куриного яйца в составе сред для криоконсервации спермы хряков на сухой соевый лецитин Проанализирована эффективность замораживания спермы хряков с монометиловым эфиром глицерина и другими заменителями глицерина

Практическая значимость. Введение в состав усовершенствованной синтетической ГХЦС среды для хранения спермы хряков в охлажденном до 16°С состоянии бычьего сывороточного альбумина и тиольного соединения способствует повышению результативности осеменения свиней и продолжительности хранения спермы Разработанная синтетическая среда для глубокого замораживания спермы хряков позволяет стабильно получать после оттаивания подвижность сперматозоидов в пределах 40-45% Введение в состав усовершенствованной синтетической среды для глубокого замораживания спермы хряков восстановленного глутагиона способствует повышению подвижности и живучести оттаянных сперматозоидов

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на

- международной научной конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», ВИЖ Дубровицы, 2004 г ,

- ученых советах ВНИИплем, 2004-2006 гг,

- расширенной межотдельской конференции ВНИИплем, 2007г

Публикации по результатам исследований. По 1еме диссертации

опубчиковано 6 статей

Объём работы. Диссертация изложена на 112 стр машинописного текста и включает 23 таблицы Состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, собственных результатов, обсуждения, выводов и практических предложений Список литературы включает 188 источников, в том числе 109 на иностранном языке

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования выполнены в лаборатории криобио-тогии и физиочогии размножения животных ВНИИплем и на свинокомплексе «Новое Литвиново» Московской области

Все исследования проводились согласно прилагаемой схеме опытов (рис 1)

В опытах по изучению влияния различных антиоксидантов на устойчивость сперматозоидов хряков к хранению в охлажденном состоянии применяли кверцетин, эфир поливинилового спирта с фенозаном, сукцинат хитоза-на и синтетические гидрофобные антиоксиданты ИХФГАН-1, ИХФГАН-2, ИХФГАН-3

Свежеполученные эякуляты хряков разбавляли ГХЦ и ГХЦС средами с добавлением различных концентраций изучаемых веществ и помещали образцы семени на хранение при 4 или 16°С Анализировали подвижность сперматозоидов и абсолютный показатель их живучести

Для выяснения влияния антиоксиданта ИХФГАН-3 на результативность искусственного осеменения свиноматок охлажденной до 16°С спермой, свежеполученные эякуляты хряков в опытной группе разбавляли 1 3 ГХЦС средой, с добавлением 0,004 мг/мл антиоксиданта В контроле препарат в состав спермы не вводился Затем проводили искусственное осеменение маток спермой, сохраняемой при 16°С в течение 24 и 72 часов Маток осеменяли дважды в течение эструса

При сравнительном изучении результативности осеменения свиней с использованием усовершенствованной ГХЦС среды, в опытной группе свежеполученные образцы семени разбавляли 1 3 усовершенствованной ГХЦС средой, содержащей 0,2% бычьего сывороточного альбумина и 0,002% ти-ольного соединения В контроле использовали обычную ГХЦС среду Затем образцы спермы хранили в термобоксе при 1б°С в течение 24, 72 и 120 часов, после чего проводили искусственное осеменение маток двухкратно в течение эструса

При разработке усовершенствованной среды для глубокого замораживания спермы хряков использовали различные комбинации соотношений изотонических растворов глюкозы, трилона-Б и трис-(оксиметил)-аминометана Затем вычисляли абсолютный показатель живучести сперматозоидов в различных группах по методу Милованова В К (1962)

Для оценки криозащитного влияния различных антиоксидантов и БАВ при замораживании спермы хряков, свежеполученные эякуляты разбавляли 1 1 усовершенствованной средой с добавлением различных концентраций изучаемых веществ Разбавленные образцы семени эквилибрировали в холодильнике при 4°С в течение трёх часов После эквилибрации замораживали сперму на фтороптестовой пластине в виде гранул объемом 0,5 мл и переносили их в жидкий азот Оттаивали гранулы семени в гидрооттаивателе при

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние различных факторов на:

Рис I Общая схема исследований

температуре 60°С и инкубировали образцы семени в термобоксе при 37°С Через каждый час инкубации определяли подвижность сперматозоидов до полной их гибели Затем вычисляли абсолютный показатель живучести сперматозоидов в различных группах

С целью изучения возможности замены желтка куриного яйца в средах для криоконсервации семени хряков на сухой соевый лецитин, мы изучали влияние препарата «Центролекс-Ф» Германия Бычо изучено влияние этого препарата в различных концентрациях при хранении спермы хряков при 4°С и при глубоком замораживании

В экспериментах по изучению результативности искусственного осеменения маток спермой, замороженной в усовершенствованной среде, сперму замораживали и оттаивали аналогичным образом Моток осеменяли оттаянной дозой спермы, содержащей 3 мчрд подвижных сперматозоидов Ана-тазировали оплодотворяемость и многоплодие маток

Биометрическую обработку данных проводили по Е К Меркурьевой (1964)

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение защитного влияния антиоксидантов на сперму хряков, сохраняемую в охлаждённом состоянии

3 1.1. Влияние антиоксиданта кверцетина на живучесть спермы хряков при 4 и 16°С

В процессе хранения сперматозоидов в охлажденном состоянии, в них может происходить накопление супероксидных радикалов, являющихся предшественниками высокоактивных кислородных радикалов Их образование приводит к повреждению ДНК, белков, липидов и т д (Aitken RI е а, 1989)

С целью предотвращения ПОЛ и накопления токсичных продуктов пе-рексидации липидов, некоторые исследователи предлагают использовать в составе сред различные антиоксиданты (Наук В А , Гуськов АМ ,1983, Еро-хин А С ,1994, Нарижный А Г и др ,1994, Tomolli Rea ,1996)

В связи с вышеизложенным, в задачу наших исследований входило изучение влияния различных антиоксидантов на устойчивость сперматозоидов к хранению в охлажденном до 4-16°С состоянии

В последние годы из сибирской лиственницы бьп выделен натуральный антиоксидант кверцетин, который нашел применение в пищевой промышленности, медицине и других отраслях народного хозяйства

В задачу наших экспериментов входило выяснение влияния данного антиоксиданта в составе синтетической среды на устойчивость сперматозоидов хряков к хранению в охлаждённом состоянии

Результаты проведенных экспериментов показали, что добавление кверцетина в состав разбавителя в дозах 0,015-2 мг/мл и хранение спермы при 4 или 16°С, не оказало положительного влияния на живучесть сперматозоидов при обоих температурных режимах В дозах 0,25-2 мг/мл среды, данный препарат способствовал достоверному снижению живучести сперматозоидов по сравнению с контролем

3.1.2 Анализ защитного влияния на охлаждённую сперму хряков эфира поливинилового спирта с фенозаном

Данный антиоксидант был синтезирован в Институте химической физики г Москва и используется для хранения криоконсервированных образцов донорской крови Мы решили изучить влияние различных дозировок данного препарата на живучесть сперматозоидов хряков при 16°С

Проведенные эксперименты показали, что эфир поливинилового спирта с фенозаном не оказал положительного влияния на подвижность и живучесть сперматозоидов хряков, сохраняемых в охлажденном состоянии

3 1.3. Изучение влияния сукцината хитозана на живучесть охлажденной спермы хряков

Экспериментально установлено, что хитозан представляет собой М-диацетилированную форму хитина, обладает сорбционными, антибактериальными и антиоксидантными свойствами

В связи с тем, что защитное влияние хитозана на сперму хряков не изучалось, мы решили выяснить влияние данного препарата на подвижность и живучесть сперматозоидов хряков при 4 и 16°С Результаты показали, что хигозан в концентрациях 1,25-5 мг/мл среды заметно снизил абсолютный показатель живучести сперматозоидов при обеих температурах хранения Остальные изученные дозы препарата также не оказали положительного влияния на живучесть сперматозоидов хряков в ГХЦС среде

3.1.4. Выяснение защитного влияния антиоксидантов ИХФГАН при хранении спермы хряков в охлажденном состоянии

Данные по изучению влияния антиоксиданюв ИХФГАН на подвижность и живучесть сперматозоидов хряка, сохраняемых при 16°С, приведены в таблице 1

Таблица 1

Втяние антиоксидантов ИХФГАН на живучесть сперматозоидов хряка

при 16°С

Концентрация антиоксидантов, мг/мл п Подвижность сперматозоидов % Абсолютный показатель живучести сперматозоидов при 16°С, уел ед

Антиоксиданты

ИХФГАН-1 ИХФГАН-2 ИХФГАН-3

0,5 7 80 0 492* 144*

0,25 7 80 0 618* 240*

0,12 7 80 0 999* 288*

0,06 7 80 434* 1035 696*

0,03 7 80 522* 1269 1386

0,015 7 80 1149 1485 1552*

0,008 7 80 1300 1545* 1562*

0,004 7 80 1471 1557* 1602*

0,002 7 80 1506 1522 1548*

Контроль (без антиоксидантов) 7 80 1400 1379 1300

* - Р<0,05

Из данных таблицы 1 видно, что все изученные антиоксиданты в оптимальных концентрациях способствовали повышению живучести сперматозоидов хряка при 16°С Более высоким защитным эффектом обладали антиоксиданты ИХФГАН-2 и ИХФГАН-3 в концентрациях 0,015-0,002 мг/мл Так, при концентрации ИХФГАН-3, равной 0,004 мг/мл и 0,008 мг/мл, живучесть сперматозоидов повысилась по сравнению с контролем на 12,9 и 12% соответственно Меньшим защитным эффектом обладал антиоксидант № 1 Его защитное действие проявилось только при концентрации 0,002 мг/мл В этой группе живучесть сперматозоидов по сравнению с контролем была выше на 7,5%

В связи с тем, что при изучении защитного влияния на охлажденную сперму хряков было установлено определенное защитное влияние антиокси-данта ИХФГАН-3, мы решичи выяснить действие данного препарата на оплодотворяющую способность спермы кряков

С этой цетью нами были проведены опыты по искусственному осеменению маток спермой, сохраняемой с оптимальной дозировкой данного ан-тиоксиданта (0,004 мг/мл) в течение 24 и 72 часов при температуре 16°С Результаты данного эксперимента приведены в таблице 2

Таблица 2

Резучьтаптеность искусственного осеменения свиней спермой, с добавлением антиоксиданта ИХФГАН-3

1 Соствсре-1 ды Время хранения спермы, часов Осеменено маток Опоросилось Многоплодие маток

Число %

1 опытная 24 30 15 50* 10,2*

1 контрольная 24 24 18 75 11,3

| опытная 72 32 14 43,7* 9,8*

!контрольная 72 30 | 22 73,3 11,1

* - Р<0,05

Результаты таблицы 2 свидетельствуют, что введение в состав ГХЦС среды для хранения охлажденной спермы хряков антиоксиданта ИХФГАН-3 оказало отрицательный эффект на фертильность спермы После 24 часов хранения спермы с данным препаратом опоросилось на 25% меньше свиноматок по сравнению с контротем

3.2. Результативность осеменения свиней охлажденной спермой,

разбавленной усовершенствованной ГХЦС средой с бычьим сывороточным альбумином и тиольным соединением

В предыдущих экспериментах, проведенных в лаборатории криобиологии и физиологии размножения животных ВНИИплем было установлено, что добавление в состав ГХЦС среды оптимальной концентрации бычьего сывороточного альбумина и тиольного соединения, значительно улучшает живучесть и подвижность сперматозоидов хряка, сохраняемых при 16°С (Пухти-нов О Н ,2004) На основании лабораторных исследований была предложена усовершенствованная ГХЦС среда, содержащая вода дистичлированная - 1000 мл, пкжоза - 60 г, грилон-Б - 3,7 г, бикорбонат натри»-- 2 г, бычий сывороточный альбумин - 2 г, гиольное соединение - 0,02 г, полиген - 0,3 г

Однако, данная среда не была изучена в практических условиях по результативности искусственного осеменения маток спермой, сохраняемой в этой среде при 16°С в течении 3-5 суток Поэтому, в задачу наших исследований входило проведение производственного эксперимента по изучению ре-

зультативности искусственного осеменения маток охлажденной спермой, сохраняемой в данной среде при 16°С в течение 24, 72 и 120 часов

Результаты производственных испытаний по осеменению свиноматок охлажденной спермой, разбавленной усовершенствованной ГХЦС средой, представлены в таблице 3

Таблица 3

Эффективность осеменения свиней с использованием усовершенствованной

ГХЦС среды

Состав сре- Время Осеменено Опоросилось Среднее

ды хранения маток многоплодие

спермы маток % маток

при 16°С,

часы

опытная 24 74 62 83,8 11,3

контрольная 24 70 54 77,1 112

опытная 72 40 32 80,0 11,0

контрольная 72 40 30 75,0 10,6

опытная 120 10 7 70,0 10,2

контрольная 120 9 5 55,5 9,8

Результаты, приведенные в таблице № 3, показывают, что усовершенствованная ГХЦС среда способствует повышению биологической полноценности сперматозоидов и их оплодотворяющей способности после хранения в охаажденном состоянии в течение 1-5 суток

3 3 Разработка синтетической среды для глубокого замораживания спермы хряков

3.3.1. Выявление оптимальных соотношений веществ, входящих в состав усовершенствованной среды для замораживания спермы

хряков

Актуальной задачей в свиноводстве остается дальнейшее совершенствование синтетических сред для глубокого замораживания семени хряков

К настоящему времени разработаны различные среды для замораживания спермы хряков (Кононов В П,1983, Корбан HB,1988, Нарижный А Г,1995, Larsson К еа,1977, Pursei V, Johnson L ,1975, Westendorf P e а,1975)

Но основным недостатком многих сред является то, что большое число сперматозоидов погибает в процессе замораживания-оттаивания и результативность искусственного осеменения свиней замороженной спермой все еще

остается не достаточно высокой и стабитьной Для повышения криоустойчи-вости спермы хряков предложено использовать различные антиоксидаиты в составе разбавителей спермы (Гуськов А М, 1997, Нарижный А Г и др ,1995)

Поиск более эффективных препаратов для защиты сперматозоидов хряка от чрезмерной пероксидации липидов при замораживании представляет несомненный научный и практический интерес В связи с этим, целью нашей работы в данном разделе диссертации было совершенствование синтетической среды для хранения спермы хряков в глубокозамороженном состоянии путем использования различных криопротекторов и антиоксидантов В качестве неэлектролита за основу среды мы взяли глюкозу В качестве вешеств, оказывающих буферное действие, были использованы трис-(оксиметил)-аминометан и трилон-Б

На основании этих лабораторных исследований, нами были отобраны 7 вариантов смесей изучаемых компонентов, которые обеспечивали наиболее высокую живучесть сперматозоидов хряков при 37°С После чего, была проверена эффективность этих вариантов сред при замораживании спермы хряков Результаты этих опытов показали, что наиболее оптимальным вариантом была среда № 44, которая содержит вода дистиллированная - 100 мл, глюкоза - 1,32 г, трис-(оксиметил)-аминометан - 0,4 г, трилон-Б - 2,8 г

После этого мы уточнили защитное влияние разных концентраций глицерина в составе данной среды При этом сперму хряков перед замораживанием разбавляли этой средой 1 1 Эксперименты показали, что оптимальной концентрацией глицерина, обеспечивающей высокую подвижность и живучесть оттаянных сперматозоидов, является 5-6% гчицерина

Анализ влияния разных концентраций желтка куриного яйца показал, что оптимальной концентрацией в составе усовершенствованной среды является 20-25 мл желтка на 100 мл среды (таблица 4)

Таблица 4

Вчияниеразных концентраций желтка в составе среды на криоустойчивость спермы хряков

Концентрация Число Подвижность Подвижность Абсолютный

желтка в сре- опытов спермиев до спермиев по- показатель

де, мл/100мл заморажива- сле оттаива- живучести при

среды ния, ния, 37°С, уел ед

в% в%

5 5 82 30±2,1 66±4,8

10 5 82 35±1,7 82±5,3

15 5 82 38±2,2 88±6,1

20 5 82 44±1,9 120±5,0

25 5 82 42±2,3 122±7,2

30 5 82 32±1,8 82±3,7

Таким образом, в результате лабораторных экспериментов нами была разработана синтетическая среда для замораживания спермы хряков, состоящая из следующих компонентов

1 Вода дистиллированная —100мл

2 Трис-(оксиметил)-аминометан — 0,4 г

3 Глюкоза —1,32 г

4 Трилон-Б — 2,8 г

5 Глицерин — 6,0 г

6 Желток куриного яйца — 20 мл

7 Полиген — 30 мг

3.3.2. Влияние различных антиоксидантов на устойчивость сперматозоидов хряка к замораживанию

Известно, что в сперме животных, при криоконсервации могут индуцироваться процессы перекисного окисления типидов, что способствует повреждению мембранных структур сперматозоидов, ДНК и других биомолекул В результате этого может снижаться оплодотворяющая способность замороженной спермы (Наук В А , Гуськов А ,1983, Aitken Rea ,1989)

Поэтому во многих странах мира проводятся эксперименты по изучению возможности снижения пероксидации липидов при замораживании спермы хряков, путем введения в состав разбавителя различных натуральных и синтетических антиоксидантов (Кононов В Г, Нарижный А Г, 1985, Watson PFea, 1995)

В задачу наших исследований входило изучение защитного влияния разчичных синтетических антиоксидантов на устойчивость сперматозоидов хряка к глубокому замораживанию при использовании нашей усовершенствованной ГХЦС среды Эксперименты были проведены с использованием спермы хряков крупной белой породы

В первом опыте изучали криозащитное влияние антиоксидантов ИХФ-ГАН-1, 2 и 3 Предварительные лабораторные исследования показали, что нетоксичные дозировки этих трех гидрофобных антиоксидантов находятся в пределах 0,02-0,016 мг/мл среды

Результаты замораживания спермы хряков в усовершенствованной ГХЦС среде с добавлением различных дозировок этих препаратов показали отсутствие их защитного действия

В следующем эксперименте мы выясняли защитное влияние гидрофобного антиоксиданта кверцетина на устойчивость спермы хряка к замораживанию в нашей усовершенствованной среде

Препарат во всех изученных дозировках не оказал положительного влияния на подвижность и живучесть оттаянных сперматозоидов, а в дозировках 0,12-0,5 мг/мл достоверно снизил их живучесть по сравнению с контролем

Анализ изучения криозашитного влияния гидрофильного антиоксиданта сукцината хитозана на сперматозоиды хряков показал отсутствие защитного влияния сукцината хитозана при замораживании спермы хряков

Затем мы выяснили влияние антиоксиданта эфира поливинилового спирта с фенозаном на устойчивость сперматозоидов хряка к замораживанию Но этот препарат также не оказал криозащитного влияния

3 3,3 Изучение криозащитного влияния тиольных соединений

Ранее было у станов чено, что при криоконсервации семени животных, в сперматозоидах может индуцироваться окисление сульфгидрильных групп в белках и низкомолекулярных тиолах, что способствует повреждению мембранных бечков, инактивации ферментов и нарушению энергетических процессов в к четках (Курбатов А Д и др ,1988)

Дополнительное введение в состав криоконсервирующих сред низко-мочекулярных тиолов, в частности унитиола, снижало окисление тиольных групп и оказывало протективное влияние на регуляцию энергетического обмена в почовых клетках хряков и быков (Мороз Л Г и др ,1990, МоишЬ М Б ,1978)

В связи с этим, мы решили изучить действие различных низкомолекулярных тиолов на устойчивость спермы хряков к замораживанию Результаты этих экспериментов приведены в таблице 5 Из таблицы 5 видно, что такие тиолы как глутатион и цистеин, оказали определенное защитное влияние на подвижность и живучесть оттаянных сперматозоидов

Практически во все изученные периоды после оттаивания, подвижность сперматозоидов в опытных группах была выше, чем в контроле

Особенно заметная разница была отмечена через 5 часов после оттаивания спермы

Унитиоч в изученных дозировках не оказал защитного влияния на устойчивость спермы хряков к глубокому замораживанию

Таблица 5

Влияние тиочьных соединений на устойчивость спермы хряков к замораживанию

Препарат и его

Подвижность оттаянных сперматозоидов хряка, в %

Время хранения оттаянной спермы при 37°С, часов

дозировка, мг/мл среды 0 1 2 3 4 5 6

Глутатион 0,08 40 35 35* 31* 50* 20* 4

0,04 50 50 37* З'О* 28* 22* 8

0,02 50 45 33 28 25* 17* 4

Цистеин

0,08 40 37 31 28 28* 24* 3

0,04 45 48 34* 31* 24* 20* 5

0,02 40 49 32 26 25* 20* 2

Унитиол

0,08 40 32 24 20 16 12* 4

0,04 40 33 20 17 11 9 5

0,02 45 41 21 15 9 5 2

Контроль 45 36 20 17 10 8 ед

: - Р<0,05

3 3 4. Анализ криозащитного влияния сухого соевого лецитина

В последние годы исследователями предпринимаются попытки исключения из состава синтетических сред для криоконсервации семени животных соединений животного происхождения (молока, желтка куриных яиц, лактозы и т д) с целью снижения риска переноса различных инфекционных заболеваний при искусственном осеменении животных (Chnstensen Pea ,2000, Thibier М , Guerm В ,2000)

В экспериментах на сперме быков было установлено, что желток куриного яйца в составе среды можно успешно заменить на сухой фосфолипид-ный экстракт из соевых бобов (Chnstensen Pea ,2000, Евтух В П ,2004)

Так как при криоконсервации спермы хряков данные вещества не ис-пытывались, в задачу наших исследований входило изучение возможности замены желтка куриных яиц в составе среды для хранения спермы хряков в охлажденном до +4°С состоянии, а так же в среде для ее замораживания, на сухой соевый лецитин под торговым названием «Центролекс Ф»

Данные по изучению влияния сухого соевого лецитина марки «Центролекс Ф» на подвижность и живучесть сперматозоидов хряка в холодильнике

при 4°С показали, что сухой соевый лецитин в определенных дозировках оказывает защитный эффект при сохранении охлажденной спермы в холодильнике при 4°С Более высокое защитное действие оказали концентрации сухого соевого тецитина, находящиеся в пределах 2-4%

Однако защитное действие 5% желтка куриного яйца было достоверно выше Например, абсопотный показатель живучести сперматозоидов в контрольной группе был выше, по сравнению с 3 и 4% сухого соевого лецитина, соответственно на 12,8 и 10,6%

Результаты изучения защитного влияния сухого соевого тецитина при пубоком замораживании спермы хряков (таблица 6) свидетельствуют, что при глубоком замораживании спермы хряков сухой соевый лецитин во всех изученных дозировках оказал очень слабый защитный эффект на подвижность сперматозоидов по сравнению с желтком куриного яйца

Таблица 6

Битные сухого соевого чецитина «Центролекс Ф» на устойчивость сперматозоидов хряка к гтубоко иу замораживанию

Дозировка Подвижность оттаянных сперматозоидов, в %

сухого лецитина, в% В ремя хранения сперматозоидов при 37°С, часы

0 1 2 3 4 5

1 10 8 4 1 м м

2 24 17 8 5 м м

з 22 17 8 4 м м

4 11 7 3 1 м м

5 7 4 1 м м м

6 5 1 м м м м

7 6 1 м м м м

8 4 м м м м м

9 м м м м м м

10 м м м м м м

Контроль | 42* (20% лсеттка) 1 34* 28* 21* 22* ед

* - Р<0,05

На основании проведенных экспериментов можно заключить, что сухой соевый лецитин «Центролекс Ф» способен оказывать в определенных концентрациях защитное действие при хранении спермы хряков в охлажденном состоянии, но не обладает защитным эффектом при глубоком замораживании

Возможно, использование других препаратов сухого соевого лецитина может оказывать более высокое криозащитное влияние на сперму хряков Необходимы дальнейшие углубленные исследования в данном направлении

3 3 5. Устойчивость сперматозоидов хряка к замораживанию при использовании метилового эфира глицерина и других заменителей глицерина

В настоящее время основным криопротектором при замораживании спермы сельскохозяйственных животных является глицерин

Но наряду с защитным действием, глицерин оказывает и отрицательное влияние на мембранные структуры сперматозоидов при замораживании (Варнавский А Н ,1978, Slavic Т ,1987) Поэтому проводятся исследования по изучению возможности замены глицерина в составе криоконсервирующих сред на другие криопротекторы

В литературе имеются сообщения о криопротективном влиянии различных эфиров глицерина при замораживании костного мозга и тромбоцитов чеповека, а также спермы баранов и быков (Ерохин А С и др ,1998, Евтух В П ,2004)

Учитывая, что на сперме хряков криозащитное влияние данных эфиров глицерина не изучалось, мы решили выяснить защитное влияние монометилового эфира глицерина при глубоком замораживании спермы хряков

Кроме того, в задачу наших экспериментов также входило выяснение защитного влияния при замораживании спермы хряков в усовершенствованной среде ряда других криопротективных соединений

- диметилацетамида,

- 1,2-пропан-диола, -этиленгликоля,

- почиэтиленгликоля

Результаты замораживания спермы хряков с монометиловым эфиром глицерина (таблица 7) свидетельствуют, что монометиловый эфир глицерина при всех изученных дозировках практически не защищает сперматозоиды хряка при глубоком замораживании

Изучение криозащитного влияния других заменителей глицерина, также не выявило их преимущества по сравнению с глицерином

Более заметным протективным действием на сперму хряков из изученных заменитетей глицерина обладал 1,2-пропан-диоя в концентрации 3%, но его защитное действие было значительно ниже, чем глицерина

Таблица 7

Сравнительное вчияние глицерина и метилового эфира глицерина на криоустойчивостъ спермы хряков

Криопротектор Подвижность сперматозои- Абсолютный

и его концен- п дов, в % показатель

трация, в % До заморажи- После оттаи- живучести

вания вания при 37°С, уел ед

1 Эфир глице-

\ рина

■ ! 5 82 м —

2 5 82 м —

3 5 82 ед —

4 5 80 5*0,3 —

.5 5 80 7±0,9 —

6 5 80 5±0,2 —

7 5 75 4±0,5 —

Глидерин 1 5 82 40±3,5 129±9,3

2 5 82 42±3,3 135±7,1

3 5 82 42±2,2 130±4,8

4 5 82 45±3,1 148±10,6

5 5 82 45±5,4 156±7,9

6 5 80 40±2,7 145±12,3

7 5 80 35±3,0 Ю8±6,6*

* - Р<0,05

3 3 6 Результативность осеменения свиней при использовании для замораживания спермы усовершенствованной среды

Дчя выяснения результативности искусственного осеменения свиней спермой, замороженной в нашей среде, были проведены специальные эксперименты по осеменению 10 свиноматок оттаянной спермой

В результате этого эксперимента было установлено, что из 10 маток опоросилось 4 свиноматки (40%) Среднее многоплодие составило 8,2 поросенка

Эти предварительные результаты свидетельствуют о необходимости дачьнейших исследований по изучению результативности осеменения маток криоконсервированной спермой, замороженной с использованием новой среды

ВЫВОДЫ

1 Установлено, что введение в состав синтетической среды для хранения спермы хряков в охлажденном состоянии антиоксидантов квер-цитина, сукцината хитозана и поливинилового спирта с фенозаном в различных дозировках не оказывает положительного влияния на подвижность и живучесть сперматозоидов, сохраняемых при 4 и 16°С состоянии

2 Синтетические фенольные антиоксиданты ИХФГАН-2 и ИХФГАН-3 оказывают заметное протективное влияние на сохранение подвижности сперматозоидов, подвергнутых холодовому шоку

3 Антиоксидант ИХФГАН-3 в дозе 0,004 мг/мл среды, повышает живучесть сперматозоидов хряка при 16°С, но оказывает отрицательное влияние на их фертильность

4 Использование для хранения охлажденной спермы хряков усовершенствованной ГХЦС среды, содержащей бычий сывороточный альбумин и тиольное соединение, способствует повышению опло-дотворяемости свиноматок на 5-11 %, в зависимости от сроков хранения спермы

5 Разработанная синтетическая среда для глубокого замораживания спермы хряков способствует получению 40-45% подвижных сперматозоидов после процесса замораживания-оттаивания и 40% опло-дотворяемости свиноматок

6 Применение изученных синтетических и натуральных антиоксидантов в составе усовершенствованной среды для замораживания спермы хряков, не оказало положительного влияния на подвижность и живучесть оттаянных сперматозоидов

7 Введение в состав усовершенствованной среды для замораживания спермы хряков цистеина и восстановленного глутатиона в дозах 0,02-0,08 мг/мл среды, способствует повышению живучести оттаянных сперматозоидов

8 Замена желтка куриного яйца на сухой соевый лецитин в составе синтетической среды для замораживания спермы хряков оказала отрицательное влияние на подвижность и живучесть оттаянных сперматозоидов

9 Замораживание спермы хряков с монометиловым эфиром глицерина не оказало положительного влияния в сравнении с глицерином на криоустойчивость сперматозоидов хряка

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Предлагаем свиноводческим хозяйствам использовать для длительного хранения спермы хряков при 1б°С усовершенствованную глюкозо-хелатно-цитратно-сульфатную среду следующего состава вода дистиллированная - 1000мл, глюкоза - 60г, трилон-Б -3,7 г, бикарбонат натрия - 1,2 г, цитрат натрия - 3,6 г, бычий сывороточный альбумин - 2 г, тиольное соединение - 0,02 г, полиген - 0,3 г

2 С целью глубокого замораживания спермы хряков предлагаем свиноводческим хозяйствам для практического испытания синтетическую среду следующего состава вода дистиллированная - 1000 мл, трис-(оксиметил)-аминометан - 4 г, глюкоза - 13,2 г, трилон-Б -28 г, восстановленный глутатион - 0,04 г, желток куриного яйца -200 мл, полиген - 0,3 г

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Ерохин А С , Фомичев Ю П , Федина Н И Епишина Т М Изучение защитного влияния хитозана при криоконсервации семени сельскохозяйственных животных // Аграрная Россия - 2004 - №5 - с 18-20

2 Епишина Т М , Федина Н И Влияние хитозана на живучесть сперматозоидов хряка при 4 и 17°С // Сб научных трудов ВНИИплем -2004 -Вып 17 -с 96-98

3 Ерохин А С , Федина Н И , Епишина Т М Влияние жирорастворимых синтетических антиоксидантов на криоустойчивость спермы хряка // Научные труды ВИЖА - 2004 - Вып 62 - т 2 - Свиноводство - с 45-49

4 Федина Н И Изучение защитного влияния сухого соевого лецитина при криоконсервации семени хряков // Сб научных трудов ВНИИ плем -2007 - Вып 20 - с 87-91

5 Федина Н И Влияние кверцетина и эфира поливинилового спирта с фенозаном на криоустойчивость сперматозоидов хряка // Сб научных трудов ВНИИплем - 2007 - Вып 20 - с 83-87

6 Ерохин А С , Федина Н И , Епишина Т М Влияние бычьего сывороточного альбумина на фертильность охлажденной спермы хряков // Свиноводство -2007 -№3 -стр 15-17

Заказ № б_Объем 1.0 п.л._Тираж 60 экз.

Типография ВНИИплем

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федина, Наталья Игоревна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные синтетические среды для хранения спермы хряков в охлажденном состоянии.

1.2. Влияние различных факторов на живучесть сперматозоидов хряков в охлаждённом состоянии.

1.3. Основные повреждающие факторы при глубоком замораживании спермы хряков.

1.4. Способы повышения устойчивости сперматозоидов хряков к глубокому замораживанию.

1.5. Современные синтетические среды для глубокого замораживания спермы хряков.

2. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Изучение защитного влияния различных антиоксидантов на сперму хряков, сохраняемую в охлаждённом состоянии.

3.1.1. Влияние антиоксиданта кверцетина на живучесть спермы хряков при 4 и 16°С.

3.1.2. Анализ защитного влияния на охлаждённую сперму хряков эфира поливинилового спирта с фенозаном.

3.1.3. Изучение влияния сукцината хитозана на живучесть охлаждённой спермы хряков.

3.1.4. Выяснение защитного влияния антиоксидантов ИХФГАН при хранении спермы хряков в охлаждённом состоянии.

3.2. Результативность осеменения свиней охлаждённой спермой, разбавленной усовершенствованной ГХЦС средой с бычьим сывороточным альбумином и тиольным соединением.

3.3. Разработка синтетической среды для глубокого замораживания спермы хряков.

3.3.1. Выявление оптимальных соотношений веществ, входящих в состав усовершенствованной среды для замораживания спермы хряков.

3.3.2. Влияние синтетических антиоксидантов на устойчивость сперматозоидов хряка к замораживанию.

3.3.3. Изучение криозащитного влияния тиольных соединений.

3.3.4. Анализ криозащитного влияния сухого соевого лецитина.

3.3.5. Устойчивость сперматозоидов хряка к замораживанию при использовании метилового эфира глицерина и других заменителей глицерина.

3.3.6. Результативность осеменения свиней при использовании для замораживания спермы усовершенствованной среды.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Криозащитное влияние различных антиоксидантов и БАВ при хранении спермы хряков в охлаждённом и замороженном состоянии"

Актуальность работы. Одним из важных технологических вопросов в свиноводстве является улучшение воспроизводства стада путём использования искусственного осеменения. Искусственное осеменение животных является высокоэффективным методом улучшения породных и продуктивных качеств животных путём использования высокоценных племенных производителей. Важным фактором, определяющим результативность искусственного осеменения свиней, является совершенствование методов хранения спермы хряков в охлаждённом и замороженном состоянии.

При технологической обработке спермы, разбавлении её синтетическими средами и хранении в охлаждённом и замороженном состоянии происходят заметные структурные и биологические повреждения сперматозоидов, что значительно снижает их фертильность. Поэтому весьма актуальной задачей является применение более современных технологических разработок, способствующих повышению биологической полноценности криоконсервированной спермы хряков. Кроме того, необходима разработка синтетических сред для спермы хряков, позволяющих сохранять биологическую полноценность сперматозоидов при хранении в охлаждённом состоянии в течение 5-7 дней.

Причины снижения фертильности охлаждённой и замороженной спермы хряков до настоящего времени окончательно не выяснены. Одной из них является активация процессов перекисного окисления липидов при криоконсервации спермы. В этой связи проводятся исследования по повышению защитных свойств синтетических разбавителей для этого вида животных, путём введения в их состав различных натуральных или синтетических антиоксидантов, а также других биологически активных веществ. Поэтому разработка более совершенных синтетических сред для хранения спермы хряков в охлаждённом и глубоко замороженном состоянии путём использования новых БАВ представляет значительный научный и практический интерес.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение защитного влияния различных антиоксидантов при хранении спермы хряков в охлаждённом и замороженном состоянии, а также разработка усовершенствованной среды для замораживания их спермы.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- изучить влияние различных антиоксидантов на подвижность и живучесть сперматозоидов хряка, сохраняемых в охлаждённом до 4 или 16°С состоянии;

- выяснить результативность осеменения свиней охлаждённой спермой, сохраняемой в усовершенствованной ГХЦС среде с бычьим сывороточным альбумином и тиольным соединением;

- разработать новую синтетическую среду для глубокого замораживания спермы хряков;

- проанализировать влияние различных антиоксидантов на криоустойчивость сперматозоидов хряка при замораживании в новой среде;

- изучить возможность замены желтка куриного яйца в составе разбавителей для криоконсервации семени хряка на сухой соевый лецитин;

- выяснить криопротективное влияние при замораживании спермы хряков монометилового эфира глицерина и других заменителей глицерина.

Научная новизна исследований. Впервые изучено влияние ряда синтетических и натуральных антиоксидантов на устойчивость сперматозоидов хряка к хранению в охлажденном состоянии. Выяснена результативность осеменения свиней охлаждённой спермой, сохраняемой при 16°С в течение 3-5 дней с использованием усовершенствованной ГХЦС среды. Усовершенствована синтетическая среда для глубокого замораживания спермы хряков. Проведено сравнительное изучение влияния различных антиоксидантов на криоустойчивость спермы хряков при замораживании. Впервые изучена возможность замены желтка куриного яйца в составе сред для криоконсервации спермы хряков на сухой соевый лецитин. Проанализирована эффективность замораживания спермы хряков с монометиловым эфиром глицерина и другими заменителями глицерина.

Практическая значимость. Введение в состав усовершенствованной синтетической ГХЦС среды для хранения спермы хряков в охлаждённом до 16°С состоянии бычьего сывороточного альбумина и тиольного соединения способствует повышению результативности осеменения свиней и продолжительности хранения спермы. Разработанная синтетическая среда для глубокого замораживания спермы хряков позволяет стабильно получать после оттаивания подвижность сперматозоидов в пределах 40-45%. Введение в состав усовершенствованной синтетической среды для глубокого замораживания спермы хряков восстановленного глутатиона способствует повышению подвижности и живучести оттаянных сперматозоидов.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на:

- Международной научной конференции: «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», ВИЖ Дубровицы, 2004 г.;

- Учёных Советах ВНИИплем, 2004-2006 гг.;

- Расширенной межотдельской конференции ВНИИплем, 2007г.

Публикации по результатам исследований. По теме диссертации опубликовано 6 статей.

Объём работы. Диссертация изложена на 112 стр. машинописного текста и включает 23 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, собственных результатов, обсуждения, выводов и практических предложений. Список литературы включает 188 источников, в том числе 109 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных", Федина, Наталья Игоревна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что введение в состав синтетической среды для хранения спермы хряков в охлаждённом состоянии антиоксидантов кверцетина, сукцината хитозана и поливинилового спирта с фенозаном в различных дозировках не оказывает положительного влияния на подвижность и живучесть сперматозоидов, сохраняемых при 4 и 16°С состоянии.

2. Синтетические фенольные антиоксиданты ИХФГАН-2 и ИХФГАН-3 оказывают заметное протективное влияние на сохранение подвижности сперматозоидов, подвергнутых холодовому шоку.

3. Антиоксидант ИХФГАН-3 в дозе 0,004 мг/мл среды, повышает живучесть сперматозоидов хряка при 16°С, но оказывает отрицательное влияние на их фертильность.

4. Использование для хранения охлаждённой спермы хряков усовершенствованной ГХЦС среды, содержащей бычий сывороточный альбумин и тиольное соединение, способствует повышению оплодотворяемости свиноматок на 5-11%, в зависимости от сроков хранения спермы.

5. Разработанная синтетическая среда для глубокого замораживания спермы хряков способствует получению 40-45% подвижных сперматозоидов после процесса замораживания-оттаивания и 40% оплодотворяемости свиноматок.

6. Применение изученных синтетических и натуральных антиоксидантов в составе усовершенствованной среды для замораживания спермы хряков, не оказало положительного влияния на подвижность и живучесть оттаянных сперматозоидов.

7. Введение в состав усовершенствованной среды для замораживания спермы хряков цистеина и восстановленного глутатиона в дозах 0,02-0,08 мг/мл среды, способствует повышению живучести оттаянных сперматозоидов.

8. Замена желтка куриного яйца на сухой соевый лецитин в составе синтетической среды для замораживания спермы хряков оказала отрицательное влияние на подвижность и живучесть оттаянных сперматозоидов.

9. Замораживание спермы хряков с монометиловым эфиром глицерина не оказало положительного влияния в сравнении с глицерином на криоустойчивость сперматозоидов хряка.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предлагаем свиноводческим хозяйствам использовать для длительного хранения спермы хряков при 16°С усовершенствованную глюкозо-хелатно-цитратно-сульфатную среду следующего состава: вода дистиллированная - 1000мл; глюкоза - 60г; трилон-Б - 3,7 г; бикарбонат натрия - 1,2 г; цитрат натрия - 3,6 г; бычий сывороточный альбумин - 2 г; тиольное соединение - 0,02 г; полиген - 0,3 г.

2. С целью глубокого замораживания спермы хряков предлагаем свиноводческим хозяйствам для практического испытания синтетическую среду следующего состава: вода дистиллированная - 1000 мл; трис-(оксиметил)-аминометан - 4 г; глюкоза - 13,2 г; трилон-Б - 28 г; восстановленный глутатион - 0,04 г; желток куриного яйца - 200 мл; полиген - 0,3 г.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Федина, Наталья Игоревна, п. Лесные Поляны Московской обл.

1. Антонюк B.C. Биохимический контроль за качеством спермы. // Доклады ВАСХНИЛ 1980. - №1 - с. 27-30.

2. Антонюк B.C. Изменение содержания липидов в сперме хряка в процессе глубокого замораживания. // Доклады ВАСХНИЛ 1982. - №4. -с. 31-34.

3. Антонюк B.C. Усовершенствование методов замораживания спермы хряков. // Сб. тр. БелНИИЖ 1982. - т. 22. - с. 22-36.

4. Балашов Н.Г., Силаева М.В. Новая среда для сохранения спермы хряков. // Труды Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии. -1970.-т. 37.-с. 97-101.

5. Балашов Н.Г., Смирнов В., Манько Ю. Новая среда ГХЦС -Н РУ-1. // Свиноводство. - 1987. - №6. - с.39-40.

6. Баранов Ф.А. Впервые получены поросята от искусственного осеменения замороженным семенем. // Животноводство. 1972. - №2 -с. 68-69.

7. Белоус A.M., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Замораживание и криопротекция. -М.: Высшая школа. 1987. - 251 с.

8. Берилло И.М., Пухальский Л.Х. Вопросы длительного сохранения спермы быка и барана. // Проблемы животноводства. 1936 - №10 -с. 24-40.

9. Вишневский В.И., Марющенко А.В. Влияние УЗ колебаний на кристаллизацию спермы быков-производителей. // Криобиология и криомедицина. Киев: Наукова Думке. 1975. - №1. - с. 48-50.

10. Вишневский В.И. Повышение качественных показателей спермы быков УЗ обработкой. // УЗ в сельском хозяйстве. Межвуз. сб. н. тр. Москва. - 1988.-с. 55-57.

11. Гайворонский Г., Ирицян Г. Удачный опыт. // Свиноводство. 1973. -№7.-с. 23.

12. Гуськов A.M., Дмитриенко Н.Г., Букарчук М.Г. Особенности криогенных изменений липидов плазматических мембран и функционального состояния гамет быка и хряка. // Доклады ВАСХНИЛ.- 1989.-№2-с. 26-28.

13. Евтух В.П. Совершенствование метода криоконсервации семени крупного рогатого скота с использованием биологически активных веществ.// Дисс. канд. биол. наук. Лесные Поляны. 2004.

14. Ерохин А.С., Жуковская Н.В., Кузнецов Ю.В. Влияние воднорастворимых антиоксидантов на устойчивость спермы хряков к охлаждению. // Свиноводство. 1998. - №3 - с. 22-24.

15. Ерохин А.С., Жуковская Н.В., Пырикова С.И. Влияние лазерного облучения на криоустойчивость спермы животных. // Бесплодие, вспомогательные репродуктивные технологии. Сб. науч. трудов межд. симпозиума. Киев. 1997. - с. 171.

16. Ерохин А.С., Семёнова В.А., Тимофеев К.Н. О влиянии компонентов синтетических сред на плазматические мембраны сперматозоидов быка и барана. // Сельскохозяйственная биология. Серия биология животных.- 1989-№6.-с. 35-38.

17. Ерохин А.С., Чернова И.Е., Епишина Т.М. Действие эфиров глицерина на криоустойчивость спермы баранов. // Доклады РАСХН. 1998. - №3. -с. 39-41.

18. Загорски Д., Бобадов Н., Кичева М. Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины. // Межд. конференция. Тезисы докладов. Харьков,- 1988.-с. 67-68.

19. Ильинская Т. Замораживание спермы на поверхности жидкого азота. // Свиноводство. 1976. - №7. - с. 29-30.

20. Квасницкий А.В. Искусственное осеменение свиней. Киев: Урожай. -1983.-с. 187.

21. Кичева М.Г., Загорски Д.Т., Бобадов Н.Д. Исследование криопротективного действия ЕНГ-20 на замораживание, реанимацию и морфологию сперматозоидов хряка. // Biol, et Immund. Reprod. 1989. -v. 15.-p. 45-51.

22. Кононов В.П., Галич B.H., Осадчук B.C. и др. Современное оснащение криоконсервации спермы хряков. // Зоотехния. 1990. - №1. - с. 68-71.

23. Кононов В.П., Голышев Н.А., Нарижный А.Г. Выход трансаминаз из живчиков как показатель оплодотворяющей способности. // Сельскохозяйственная биология. 1978. - т. 13. - с.104-108.

24. Кононов В.П., Голышев Н.А., Осадчук B.C. и др. Методические рекомендации по криоконсервации семени хряков. // Дубровицы. 1991.

25. Кононов В.П. Замораживание семени хряка. Теория и практика. // Дисс. докт. биол. наук. Дубровицы. 1982.

26. Кононов В.П. Значение слабодиссоциирующих катионов при охлаждении семени. // Доклады ВАСХНИЛ. 1977. - №5. - с. 25-26.

27. Кононов В.П. Криопротективное действие плазмы спермы на сперматозоиды хряков. // Доклады ВАСХНИЛ. 1984. - №6. - с. 29-31.

28. Кононов В.П., Нарижный А.Г. Защитное действие антиоксидантов при замораживании семени хряка. // Вестник с-х. науки. 1985. - №5. -с. 123-128.

29. Кононов В.П. Повышение функциональной и морфологической устойчивости живчиков хряка при замораживании. // Сельскохозяйственная биология. 1980. - т. 15. - №6. - с. 914-917.

30. Кононов В.П., Хачапуридзе Э. Оптимальные режимы глубокого охлаждения и оттаивания семени хряка. // Доклады ВАСХНИЛ. 1975. -№8. - с. 23-24.

31. Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. Оценка замороженно-оттаянной спермы по морфологическим и биохимическим показателям. // Сб. научн. трудов ВНИИРГЖ. 1979. - №27. - с. 24-30.

32. Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. Совершенствование технологии замораживания спермы хряков. // Животноводство. 1980. - №7. -с. 23-25.

33. Кузнецова Н.А. Первый опыт применения искусственного осеменения в каракулеводстве. // Проблемы животноводства. 1932. - №2. - с. 27-28.

34. Левин К.Л., Бабенко Г., Поздняков А. и др. Среда для разбавления спермы хряков. // Свиноводство. 1988. - №2. - с. 33-34.

35. Левин К.Л. Искусственное осеменение свиней. М.: Россельхозиздат. -1986.-с. 192.

36. Левин К.Л, Ющенко Н. Замораживание спермы хряков. // Свиноводство. 1973.-№7.-с. 23.

37. Ленинджер А. Митохондрия. Молекулярные основы, структуры и функции. М: Мир. - 1966 - с. 325.

38. Луговой В.И., Моисеев В.А. Влияние низких температур на растворимые ферменты. // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Биофизика. 1978. -т. 9.-с. 53-79.

39. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственного осеменения животных. М. 1962. - с. 696.

40. Милованов В.К., Семёнова В.А., Кононов В.П. Химическая структура и криозащитное действие липопротеидов желтка куриного яйца на живчиков животных. // Вестник с.-х. науки. 1988. - №5. - с. 133-139.

41. Милованов В.К., Соколовская И.И. Теория холодового удара живчиков млекопитающих. // Доклады ВАСХНИЛ. 1959. - №8. - с. 3-9.

42. Морозов В.А. О защитной роли глицерина при замораживании семени с.-х. животных. // Труды Дагестанского НИИ сельского хозяйства. -1965. т. 3,-№2.-с. 54-60.

43. Мороз Л.Г., Корбан Н.В., Шапиев И.Ш. К вопросу прогнозирования оплодотворяющей способности замороженной спермы хряков. // Бюлл. ВНИИРГЖ. 1979. - В. 39. - с. 23-26.

44. Мороз Л.Г., Рустенов А.Р., Шапиев И.Ш. и др. Значение серосодержащих соединений в устойчивости спермы к замораживанию. // Доклады ВАСХНИЛ. 1990. - №9. - с. 51-55.

45. Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. Влияние состава сред и охлаждения на содержание НАД.Н и ФАД в сперме хряков. // Бюлл. ВНИИРГЖ. 1987. - № 94. - с. 5-6.

46. Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш., Корбан Н.В. Криоконсервация гамет и эмбрионов с.-х. животных. Л. - 1988. - 48 с.

47. Нарижный А.Г., Галич С.К., Ерохин А.С. Влияние способа криоконсервации спермы хряков на ПОЛ. // Генетика, селекция. и воспроизводство с.-х. животных. 1994. - вып. 1.-е. 135-140.

48. Нарижный А.Г. Интенсификация воспроизведения в условиях промышленного свиноводства. Теория и практика // Дисс. док. биол. наук. Дубровицы. - 1995.

49. Наук В.А., Буга Н.Ф. Глубокое замораживание семени хряков-производителей в гранулах. // Животноводство на промышленную основу. Кишинёв. 1975. - с. 58-67.

50. Наук В.А., Гуськов A.M. Особенности перекисного окисления липидов при замораживании спермы быков и хряков. // Доклады ВАСХНИЛ. -1983.-№2.-с. 27-29.

51. Наук В.А. Криогенные изменения аминокислотного состава спермиев. // Свиноводство. 1971. - №11. - с. 21-22.

52. Наук В.А. Криоконсервация семени животных. Консервация генетических ресурсов. Пущино. 1982.

53. Наук В.А. Среда для разбавления и замораживания спермы хряков. // Автор, свидет. № 1143413. БИ №9. - 1985.

54. Николов И., Георгиев С., Чизмаров К. Влияние на лазерното излъчване върху семена течност от бици при технологията за криоконсервация. // Животновъдни Науки. София. - 1986. - т. 23. - №11. - с. 3-7.

55. Николов И., Нестерова Ю. Ефект на нискоинтенсивно лазерно лъчение въерху биологичните качества и оплодителната способност на сперматозоиди от кочове. //. Животновъдни Наука. София. - 1994. -№1.-с. 210-212.

56. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. Киев: Урожай. 1978. - с. 254.

57. Осташко Ф.И. Причины и механизмы холодового удара клеток. // Международный с-х. журнал. 1964. - №3. - с. 106-109.

58. Паршутин Г.В., Смирнов-Угрюмов Д.М., Михайлов Н.Н. Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. М: Колос. 1970.

59. Платов Е.М. Теоретические и практические основы замораживания семени производителей с-х. животных. // Дисс. докт. биол. наук. Дубровицы. 1973.

60. Плишко Н., Вельможный Б., Лисовенко А. Получено потомство при использовании замороженной спермы. // Свиноводство. 1973. - №4. -с. 24.

61. Плишко Н.Т. Среды для хранения спермы хряков. // Свиноводство. -1968.-№3.-с. 19-21.

62. Прокопцев В.М., Рустенов А., Мороз Л.Г. Действие унитиола на сперму хряков. // Сельскохозяйственная биология. 1974. - т. 9. - №4. -с. 581-584.

63. Пухтинов О.Н. Влияние различных факторов на устойчивость семени хряков к хранению в охлаждённом состоянии и оплодотворяемость свиноматок. // Дисс. канд. биол. наук. Лесные Поляны. 2004.

64. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Цветков Ц.Д. Теория и практика криогенного и сублимационного консервированного. Киев: Наукова Думка.-1984.-с. 350.

65. Рустенов А.Р., Мороз Л.Г. Влияние серосодержащих соединений на устойчивость спермы хряков к замораживанию. // Бюлл. ВНИИРГЖ. -1989.-№116.-с. 7-10.

66. Рэ Л. Консервация холодом. М. - 1962. - 390 с.

67. Семаков В.Г., Рыжков Т.Ф. Проницаемость цитоплазматических мембран сперматозоидов быка и хряка для натрия, калия, кальция и фосфора под влиянием низких температур. // Сельскохозяйственная биология. 1971. - №2. - с. 200-204.

68. Сердюк С.И., Беликов А.А. Исследования по замораживанию спермы хряков. // Теория и практика воспроизводства с-х. животных. Харьков. -1972.-с. 81-86.

69. Сердюк С.И. Искусственное осеменение в промышленном свиноводстве. М: Колос. 1977. - 160 с.

70. Сердюк С.И. Среда для спермы хряков. // Доклады Советских учёных к 6 международному конгрессу по размножению и искусственному осеменению животных. М. - 1968. - с. 138-141.

71. Скаткин Н.П. Температурный шок сперматозоидов жеребца. // Доклады ВАСХНИЛ. 1940. - №8. - с. 29-34.

72. Скрябин К.Г., Вихорев Г.А., Варламова В.П. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. М. 2002.

73. Смирнов И.В., Елец А.З. Осмотическое давление в сперме животных и его значение при замораживании. // Мат. 5-го Межд. конгресса по размнож. и искусств, осем. животных. Мюнхен. 1972. - с. 1394-1397.

74. Смирнов И.В. Влияние температуры на осмотическую устойчивость спермиев. // Животноводство. 1976. - №1. - с. 61-64.

75. Смирнов И.В. К теории глубокого охлаждения спермы. // Животноводство. 1974. - №11. - с. 65-70.

76. Хачапуридзе Э., Церетели П. Применение замороженной спермы. // Свиноводство. 1987. - №6. - с. 40-42.

77. Шапиев И.Ш., Мороз Л.Г., Корбан Н.В. К вопросу технологии замораживания спермы хряков. // Животноводство. 1976. - №12. -с. 60-62.

78. Aalbers I.G., Johnson L.A. Rademaker I.H. Motility, acrosom morphology and fertilizing capacity of boar spermatozoa frozen in pellets and strows.// Deep Freezing of Boar Semen. Uppsala. Sweden. 1985. - p. 277-281.

79. Aitken R. J., Clarkson L.S., Fishel S. Generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation and human sperm function. // Biol. Reprod. 1989. -v. 40.-p. 183-197.

80. Baier W. Erfahrungen in der ktinstlichen Besamung des Hausschweines einschlisslich der Verwendung von Tiefkuhlsamen. // Zootecnica e veterinaria la fecondazione artificiale. 1962. - v. 17. - №5-6. - p. 94-99.

81. Bamba K., Cran D.G. Effects of treatment with butylated hydroxytoluene on the susceptibility of boar spermatozoa to cold stress and dilution. // J. Reprod. Fertil. 1992. - v. 95. - p. 69-77.

82. Bamba K., Kojima Y., Iida I. Studies of deep-freezing of boar semen. 5. The effect of honey-yolk diluent on the livability of frozen boar spermatozoa. // Jap. J. Zootechn. Sci. 1968. - v. 39. - №10. - p. 415-421.

83. Berger Т., Clegg E.D. Effect of male accessory gland secretion on sensitivity of porcine sperm acrosomes to cold shock, initiation of motility and loss of cytoplasmic droplets. // J. Anim. Sci. 1985. - v. 60. - №5. - p. 1295-1302.

84. Best P. Extending the life fresh semen. // Pig. Amer. 1982. - v.7. - p. 24-26.

85. Boehko H. Zur Tiefgefrierung von Ebersperma. 3. Weitere Labor und weitere Besamungsversuche unter Verwendung von TEST und TESNaK Verdunner sowie, verschiedenen Auftaumethoden. // Dtsch. Tierarztl. Wschr. - 1974. -v. 81.-№14.-p. 336-340.

86. Bower R.E. Effect of dilution and glycerol on the release of glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) from boar spermatozoa. // J. Anim Sci. -1973. v. 36. - №2. - p. 319-334.

87. Brass K.E. Die Sonographie in der andrologishen Untersuchung bei verschiedenen Haussaugetierarten. // Inaug. Diss. Hannover. - 1987. -p. 102.

88. Canvin A.T., Buhr M.M. Effect of temperature on the fluidity of boar sperm membranes. // J. Reprod. Fert. 1989. - v. 85. - p. 533-540.

89. Christensen P., Guo Z., Pedersen K.M. e.a. The viability, motility and fertility of bovine semen frozen in Triladyl and Biociphos plus. // ESDAR NEWSLETTER. 2000. - №5. - p. 25.

90. Courtens I.L., Paquignon M. Ultrastructural aspects of stored boar semen. // Deep freezing of boar semen. Uppsala. Sweden. Ed. Johnson L., Larsson K. -1985.-p. 37-61.

91. Crabo B.G., Bower R.E., Graham E.F. The effect of glycerol on bull and boar spermatozoa in vitro measured as loss of intracellular glutamic transaminase (GOT). // Abstr. 11. Nord. Vet. Congr. Bergen. 1970. - p. 242-245.

92. Crabo В., Brown K.I., Graham E.F. Effect of some hydrogen ion buffers on storage and freezing of spermatozoa. // J. Anim. Sci. 1972. - v. 35. - №2. -p. 377-382.

93. Crabo B.G. Einarsson S. Fertility of deep-frozen boar spermatozoa. // Acta Vet. Scand.- 1971.-v. 12.-p. 125-127.

94. Dalrymple I.R., Macpherson I.W. Low temperature preservation of boar spermatozoa. // Canad. J. Anim. Sci. 1969. - v. 19. - №1. - p. 45-49.

95. Darin-Bennet A. Influence of the cholesterol content of mammalian sperm on susceptibility to cold-shock. // Cryobiology. 1977. - v. 14. - p. 466-470.

96. Darin-Bennet A., Poulos A., White I.G. The effect of cold shock and freeze-thawing on release of phospholipids by ram, bull and boar spermatozoa. // Austr. J. Biol. Sci. 1973. - v. 26. - p. 1409-1420.

97. Dukelow W.R., Graham E.F. Freezing of porcine semen. // J. Anim. Sci. -1962. v. 21. -№4. - p. 1020-1024.

98. Einarsson S., Viring S. Distribution of frozen-thawed spermatozoa in the reproductive tract of gilts at different time intervals after insemination. // J. Reprod. Fertil. 1973. - v. 32. - p. 117-120.

99. Enne G., Beccaro P. Congelamento del materiale spermatiko di verm // Riv. Suinic. 1982. - v. 23. - №9. - p. 65-72.

100. Foulkes I.A. The separation of lipoproteins from egg-yolk and their effect on the motility and integrity of bovine spermatozoa. // J. Reprod. Fertil. 1977. -v. 42.-p. 277-284.

101. Gorovoj L., Kosjakov V. Advances in chitin science. // Proc. 7 th Int. Conf. on Chitin-Chitosan. Lyon, France. - 1997. - v.2. - p. 858-863.

102. Graham E.F., Rajamannan A.N., Schmehl M.K. Fertility studies with frozen boar spermatozoa.//A.I. Dig. 1971.-v. 19.-p. 16-18.

103. Hahn R., Lorrman W., Zoder H. Zur Tiefgefrierung von Ebersperma 2. Mitteilung: Besamung versuche unter Verwendung von TEST- und TESNaK

104. Verdunner sowie, verschiedenen Aufiaumethoden. // Dtsch. Tierarztl. Wschr. - 1974. - v. 81. - № 12. - p. 281-283.

105. Hammerstedt R.H., Keith A., Snipes W. e.a. Use of spin labeles to evaluate effect of cold chock and osmolarity on sperm. // Biol. Reprod. 1978. - v. 18. - №4. - p. 685-696.

106. Hanstein W.G., Hatefi Y., Tejada P. Lipid oxidation in biological membranes. 2. Kinetics and mechanism of lipid oxidation in submitochondrial particles. // Arch. Biochem. Biophys. 1970. - v. 138. - №1. - p. 87-95.

107. Harrison R.A., White I.G. Glycolytic enzymes in the spermatozoa and cytoplasmic droplets of bull, boar and ram, and their leakage after shock. // J. Reprod. Fertil. 1972. - v. 30. - p. 105-115.

108. Hernandes I.I., Moya A., Duverger O. Algunos resultados en la cjngelacion del semen porcino en Cuba. // Rev. Cub. Cienc. Vet. 1988. - v. 19. - №1. -p. 39-45.

109. Hess E.A., Ludwick T.M., Teagua H.S. Motility of boar spermatozoa as influenced by semen freezing procedures. // J. Anim. Sci. 1960. - v. 19. -№3. - p. 926-931.

110. Iida I., Adachi I. Studies on deep-freezing of boar semen. 1. Effect of various diluents, glycerol levels and glycerol equilibration period on deep-freezing of boar spermatozoa. //Jap. J. Zoot. Sci. 1966. -v. 37. -№11. - p. 411-416.

111. Johnson L. Fecundity of boar spermatozoa stored in Beltsville Liqued and Kiev extenders for three days at 18°C. // J. Anim. Sci. 1982. - v. 54. - №1. -p. 132-136.

112. Johnson L.A., Pursel V.G. Effect of cold shock and freezing on acrosomal proteinase of porcine spermatozoa. // Cryobiology. 1974. - v. 11. - №6. -p. 558-560.

113. Jones R.C. Changes occurring in the head of boar spermatozoa: vesiculation of the acrosome.// J. Reprod. Fertil.- 1973. -v. 33,- №1,- p. 113-118.

114. Kampachmidt R.F., Meyer D.T., Herman H.A. Lipid and lipoprotein constituents of egg yolk in the resistence and storage of bull spermatozoa. // J. Dairy. Sci. 1953. - v. 36. - №3. - p. 733-742.

115. Kato S., Miyano Т., Nanjo I. Effect of concentration of sodium laurylsulfate on motility and acrosome morphology of frozen boar spermatozoa. // Japan J. Anim. Reprod. 1990. - v. 36. - №1. - p. 26-30.

116. King G.I., Macpherson I.W. Boar semen studies. 2. Laboratory and fertility results of method for deep freezing. // Canad. J. Compar. Med. Vet. Sci. -1967.-v. 31.-№2.-p. 46-47.

117. Kovacs L. A sertessperma molyhutes hazai tapasztataj. // Magy allat. lapja. -1981. v. 36. - №6. - p. 398-403.

118. Kozumplic I. Velikost pellet a individualni viaatnost semen kancu ve vztanu к postu pohyblivjoh spermii po roznirazeni. // Vet. Med. 1978. - v. 23. - №8. -p. 457-463.

119. Larsson K. Current research on the deep freezing of boar semen. // World Rev. Anim. Prod. 1978. - v. 14. - №4. - p. 59-64.

120. Lee A. G. Lipid phase transition and phase diagrams. // Biochem. Biophys. Acta. 1977. - v. 472. - №2. - p. 237-281.

121. Levitt I. A Sulphydryl-disulfide hypothesis of frost injury and resistance in plants. //J. Theor. Biol. 1962.-№3. - p. 183-185.

122. Lavelock J.E. Denaturatien of lipid-protein complex as a cause of damage by freezing. // Proc. Roy. Soc. 1957. - v. 147. - №2. - p. 427-433.

123. Luyet B.I., Gehenik P.M. Life and death of low temperatures. // Biodynamica. 1940.-p. 1-341.

124. Luyet B.I., Hodapp E.L. Revival of frogs spermatozoa vitrified in liquid air! // Proc. Soc. Exp. Biol, and Med. 1938. - v. 39. - p. 433-434.

125. Lyczynski A., Martin Rillo S. Fertilizing ability of boar semen stored for five days in MR-A diluent. // J. of Physiology and Pharmacology. 1996. -Supplement 1. - v. 47. - №2. - p. 156.

126. Lormann W., Hahn R. Our experiences with deep frozen boar semen. // Deep freezing of boar semen. Uppsala. Sweden. 1985. - p. 295-298.

127. Maryman H.T., Williams R.I., Doiglas M.S. Freezing injurey from „Solution effect" and its prevention by natural or artificial cryoprotection. // Cryobiology. 1977. - v. 14. - №3. - p.287-302.

128. Masuda H., Sonohara K. Effect of magnetic field on frozen-thawed boar spermatozoa. // Japan. J. of Swine Sci. 1995. - v. 32. - №3. - p. 203-205.

129. Maxwell W.M., Salamon S. Fertility of boar semen after long term frozen storage. // Theriogenology. 1977. - v. 8. - №4. - p. 206-208.

130. Mazur P. Basic concepts in freezing cell. // Deep freezing of boar semen. Uppsala. Sweden. 1985. - p. 91-112.

131. Moore H.D., Hibbitt K.G. Fertility of boar spermatozoa after freezing in the absence of seminal vesicular proteins. // J. Reprod. Fertil. 1977. - v. 50. -p. 349-352.

132. Mounib M.S. Cryogenic preservation of fish and mammalian spermatozoa. // J. Reprod. Fertil. 1978. -v. 53. - p. 13-18.

133. Neville W.I., Macperson I.W., King G.I. The contraceptive action of glycerol in gilts. // J. Anim. Sci. 1970. - v. 31. - p. 227-229.

134. Niva Т., Taguchi K. Cryomicroscopic observation on processer of freezing and thawing of boar semen. // Iwate Univ. Morioka. Jap. Artif. Insem. Lab. Bull.- 1962.-№1.-p. 21-35.

135. Obando H., Tamaus Т., Almaro C. Evaluation of some factors affecting swine spermatozoa during freezing. // 10 th Int. Congr. Anim. Reprod. A.I. Urbana. 1984. - v. 11.-p. 193-195.

136. Osinovo O., Salamon S. Fertility test of frozen boar semen. // Austr. J. Biol. Sci. 1976. - v. 29. - №4. - p. 336-339.

137. Pacova I. Overeni droee rordilnyeh technologikych postupu zmrazovani kaciho spermatu ve vztahv к laboratornim vysledkum, zabrezavanni a plodnosti plemenici. // Zivozisnna Vyroba. 1983. - v. 28. - №10. -p. 765-767.

138. Paquignon M. Freezing and thawing extendere for boar spermatozoa. // In: Deep freezing of boar semen. Uppsala. Sweden. 1985. - p. 129-145.

139. Park C.S., Pursel V.G. Effect of cooling rate and duration of freezing point plateau on boar sperm frozen in maxistraws. // Deep freezing of boar semen. Uppsala. Sweden. 1985. - p. 267-276.

140. Phillips P.H., Lardy H.A. A yolk buffer pabulum the preservation of bull semen. // J. Dairy Sci. 1940. - v. 23. - №15. - p. 339-404.

141. Pickett B.W., Komarek R.I. Effect of cold shock and freezing on loss of lipid from spermatozoa. // J. Dairy. Sci. 1967. - v. 50. - p. 753-757.

142. Polge C., Salamon S., Wilmut I. Fertilizing capacity of frozen boar semen following surgical insemination. // Vet. Rec. 1970. - v. 87. - p. 424-428.

143. Polge C., Rowson L. Fertilization capacity of bull spermatozoa after freezing at -79°C. // Nature. 1952. - v. 169. - №4307. - p. 626-627.

144. Polge C., Smith A.U., Parkes A.S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperature. // Nature. 1949. - v. 164. - №4172. -p. 666-667.

145. Polge C. The fertilizing capacity of boar spermatozoa following freezing and thawing. // 8 th Int. Congr. Animal Reprod. A.I. Krakow. 1976. - v. 4. -p. 1081-1084.

146. Pursel V.G. Advances in preservation of swine spermatozoa. // Agric. Res. -1979.-v. 3.-p. 145-157.

147. Pursel V.G., Johnson L.A. Freezing of boar spermatozoa, fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure. // J. Anim. Sci. -1974.-v.38.-№l.-p. 113-116.

148. Pursel V.G., Johnson L.A. Procedure for the preservation of boar spermatozoa by freezing. // U S. Dept. Agric. A.R.S. 1971. - v. 44. - p. 227-229.

149. Pursel V.G., Johnson L.A., Schulman L.L. Interaction of extender composition and incubation period on cold shock susceptibility of boar spermatozoa. //J. Anim. Sci. 1972. - v. 35. -№3. - p. 580-584.

150. Pursel V.G., Park C.S. Duration of thawing on post-thaw acrosome morphology and immotility of boar spermatozoa frozen in 5-ml maxi-straws. // Theriogenology. 1987. - v. 28. - p. 683-690.

151. Pursel V.G., Schulmann L.L., Johnson L.A. Effect of orvus es paste on acrosome morphology, motility and fertilizing capacity of frozen-thawed boar sperm. // J. Anim. Sci. 1979. - v. 47. - p. 198-202.

152. Rapatz L.I., Menz B.I., Luyet B.I. Anatomy of the freezing process in biological materials. // Cryobiology. N.Y.: 1966. - p. 139-162.

153. Revell S.G. Diluent for longer semen storage. // Pig International. 1990. -v. 30. - p. 73-75.

154. Richter L., Liedecke A. Ein Verfahren zum Tiefgefrieren von Ebersperma. // 7 th Int. Congr. Tierisch. Fortpflanz KB Munchen. 1972. - v. 2. - p. 16171619.

155. Rillo M.S., Sanchez R., Garena Casado P. Current situation of swine artificial insemination technique with liquid semen in Spain. // Proceed. 2 nd Int. Conf. on Boar Semen Preservation. 1991. - p. 321-324.

156. Rohloff D., Allmeling C. Beitrag zur Ebersperma Tiefgefrierung. // Zuchthygiene. 1970. - v. 5. - №2. - p. 88-90.

157. Romeny E., Hillmann K., Richter L. Zur Tiefgefrierung von Ebersamen. 4. Mitteilung: Labor- und Besamungsversuche mit dem Htilsenberg-Verdiinner. // Dtsch. Tierarztl. Wschr. 1974. - v. 81. - №1. - p. 353-354.

158. Salamon S. Deep freezing of boar semen. 3. Effect of centrifugation diluent and dilution rate, pellet volume and method. // Austr. J. Biol. Sci. 1973. -v. 26. - p. 239-247.

159. Salamon S., Wilmut I., Polge C. Deep freezing of boar semen. 1. Effect of diluent composition, protective agents and method of thawing on survival of spermatozoa. // Austr. J. Biol. Sci. 1973. - v. 26. - p. 219-230.

160. Salisbury G.W., Hart R.G. The spermatozoan. // Persp. Biol. Med. 1977. -v. 2.-p. 372-395.

161. Samouilidis S.G., Saoulidis K.I., Kohler-Samoulidis G. Kunstliche Besamung mit in Pailletten und Pellets tiefgefrorenem Ebersamen. // Zuchthygiene. -1987. v. 22. -№l.-p. 34-36.

162. Sandford L.M., King G.J., Macpherson J.W. Influence of glycerol concentration and freezing to -79°C on oxygen uptake and livability of boar and bull spermatozoa. // Canad. J. Anim. Sci. 1972. - v.52. - №1. - p.65-72.

163. Schaap P. Verlangerung der Haltezeit von Frischsperma. // Zuchtwahl u. Besamung. 1987. - v. 114. - p. 26-29.

164. Schmidt D. Der Einflusse des Einfriez- und Auftauer Regimes auf die verlebenstate Gefrierkonservierter Eberspermien. // Vort. Anla Int. Sym. Zur Gefr. von Sperm. Schonow. (DDR). 1978. - p. 211-218.

165. Schmidt D. Die Konservierung in Tabletten. // Tierzucht. 1982. - v. 25. -№3. - p. 209-220.

166. Senegacnic I., Vengust M., Bajt G. The influence of some freezing and thawing buffers on liveability of thawed boar spermatozoa. // 9 th Int. Congr. Anim. Reprod. A.I. Madrid. 1980. - v. 5. - p. 445-448.

167. Tamann G., Bucher A. Die Unterkuh Lungsfanigkeit des Wassers und die linlare Kristallisations Geschwindigkeit des Eises in Wasseringen Losungen. // Ztschr. Anorg. und Allg. Chem. 1935. - №4. - p. 85-92.

168. Taupin C., Dvolaitzky M., Santerey C. Osmotic pressure induced pores in phospholipids vesicle. // J. Biochem. 1975. - v. 14. - №21. - p. 4771-4776.

169. Thibier M., Guerin B. Hygienic aspects of storage and use of semen for artificial insemination. // Anim. Reprod. Sci. 2000. - v. 62. - p. 233-251.

170. Toniolli R. Effect of indole-3-acetic acid (plant auxin) on the preservation at 15°C of boar semen for artificial insemination. // Reprod. Nutr. Dev. 1996. -v. 36.-p. 503-511.

171. Upreti G.C., Oliver J.E., Duganzich D.M. e.a. Development of a chemically defined ram semen diluent (RSD-1). // Animal Reproduction Sci. 1995. -v. 37.-p. 143-157.

172. Urban F., Zizlavsky J. Vliv laseroveno zareni na reprodukci Skotu. // Acta Universitatis Agriculturae. 1993. - v. 41. - №3-4. - p. 261-271.

173. Vazques I.A., Graham E.F. Effect of dialysis and glycerol on diluents for freezing boar semen. // 9 th Int. Congr. Anim. Repr. A.I. Madrid. 1980. -v. 5.-p. 442-444.

174. Vengust M., Tomsic M., Senegacnik I. Neue Erfahrungen in der Verwendung von Tiefgefriersamen von Ebern. 1978. - v. 22. - №3. - p. 123-125.

175. Vicente A. Technology of freezing boar semen. // 7 th Int. Congr. Anim. Reprod. A.I. Munchen. 1972. - v. 2. - p. 1623-1626.

176. Visser D., Salamon S. Effect of composition of Tris-based diluent on survival of boar spermatozoa following deep-freezing. // Austr. J. Biol. Sci. 1974. -v. 27.-p. 485-497.

177. Waberski D., Weitze K.F., Rath D. e.a. Wirkung von bovinen Serumalbumin und Zweitterionenpuffer auf fliissigkonservierten Ebersamen. // Zuchthygiene. 1989. - v. 24.-p. 128-133.

178. Waide Y., Soejema A., Masuda H. Studies on deep freezing of boar semen. 2. Survival and fertility of sperm in the rapid freezing of boar semen. // Jap. J. Zoot. Sci. 1969. - v. 39. - p. 142-143.

179. Watson P.F., Plummer I.M. The response of boar sperm membranes to cold shock and cooling. // Deep freezing of boar semen. Uppsala. Sweden. 1985. -p. 113-129.

180. Watson P.F. Recent development and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. // Reprod. Fertil. Devel. 1995. - v. 7. - p. 871-891.

181. Watson P.F. The interaction of egg yolk and ram spermatozoa. Studies with a fluorescent probe. // J. Reprod. Fertil. 1975. - v. 42. - №1. - p. 105-111.

182. Weitze K.F., Rath D., Baron G. Neue Aspekte der Tiefgefrierkonservierung von Ebersperma in Plastikrohren. // Deutsche Tierarztliche Wochen. Schrift. -1987.-v. 94.-p. 485-487.

183. Westendorf P., Richter L., Treu H. Zur Tiefgefrierung von Ebersperma: Labor- und Besamungsergebnisse mit dem Hiilsenberger Pailletten-Verfahren. // Dtsch. Tierarztl. Wschr. 1975. - v. 82. - p. 261-267.

184. Wilmut I., Polge C. Recent progress in the deep-freeze preservation of boar semen. // J. Reprod. Fertil. 1971. - v. 25. -№2. - p. 301-302.

185. Wilmut I., Polge C. The freezing of boar spermatozoa. // 7 th Int. Congr. Anim. Reprod. Munchen.- 1972.-v. 2.-p. 1611-1615.

186. Wilmut I., Polge. C. The low temperature preservation of boar spermatozoa. 2. The motility and morphology of boar spermatozoa frozen and thawed in diluent which contained only sugar and egg-yolk. // Cryobiology. 1977. -v.14. -p. 479-482.