Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование метода криоконсервации спермы хряков на основе использования диализа против различных сред

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование метода криоконсервации спермы хряков на основе использования диализа против различных сред"

- и им РГ6 ОД

^СЕЛОСйШЕКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ~ О иНИИвИГГУТ РАЗВЕДЕНИЯ И ГЕНЕТИКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ животных

На правах рукописи

РУСТЕНОВА Елена Амангельдиевна

УД К.637.04.082.4

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КРИОКОНСЕРВАЦИИ СПЕРМЫ ХРЯКОВ НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДИАЛИЗА ПРОТИВ РАЗЛИЧНЫХ СРЕД

06.02.01. — разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ—ПУШКИ Н 1996

Работа выполнена в лаборатории воспроизводства и искусственного осеменения свиней Всероссийского научно-исследовательского института разведения и генетики сельскохозяйственных животных.

Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук В. М. Прокопцев; кандидат биологических наук Л. Г. Мороз.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Б. И. Протасов, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент О. В. Щеглов.

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургская Государственная Академия ветеринарной медицины. ^

Защита состоится 30 сентября 1996 г. в час. на заседании

Специализированного совета Д.020.07.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, Санкт-Петербург, Пушкин, Московское шоссе, 55а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных наук, профессор

В. И. Волгин

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Разработанные методы криоконсервации спермы хряков основаны на концентрировании спермы путем центрифугирования ( Шапиев И.Ш. и др. , 1985; Курбатов А.Д ч др. , 1988). Эти методы обеспечивают оплодогворясмость свиноматок в пределах 50-70%. Использование их возможно только в стационарных условиях на крупных, хорошо оборудованных станциях искусственного осеменения свиней. Разработка простого , результативного способа позволила бы повысить эффективность работ по созданию и использованию генофондного банка ценных пород свиней в условиях фермерских хозяйств.

В последние годы в нашей стране разрабатывается новый способ замораживания спермы хряков , основанный на диализе с использованием полупроницаемых мембран ( Галич В.И., 1989; Кононов В.П. и др., 1990; Мороз Л.Г., Козлхкова К.Б., 1991). В процессе диализа происходит постепенное насыщение спермы криозащитными веществами , удаляется избыток солей натрия , активизирующих сперму , и токсические гидроперекиси. Метод исключает центрифугирование и , следовательно , применение громоздкого оборудования , отличается простотой и портативностью. Однако показатели спермы , замороженной после диализа па 1020% ниже, чем после центрифугирования. Оплодотворяемость составляет около 50% ( Галич В.И., 1989). В связи с этим метод нуждается в дальнейшем совершенствовании.

В литературе имеются сведения о положительном действии белков сыворотки крови при хранении дуализированной спермы при плюсовых температурах ( Bambe К. , Takeda К. , Soné М. , 1979). Предполагается , что положительный эффект сыворотки обусловлен адсорбцией на белках токсических гидроперекисей , накапливающихся в сперме в процессе хранения. Однако возможны и другие механизмы защитного действия сыворотки крови. Эти данные послужили основанием дам исследования влияния различных веществ , обладающих сорбцнонными свойствами, при их введении в диализные среды на физиологические и биохимические показятели криоконсервированной спермы.

Важным условием повышении эффективности метода , является изучение теоретических вопросов , связанных с раскрытием мехшшзмов повреждения и устойчивости спермы к охлаждению в процессе диализа и замораживания и на этой основе совершенствование сред и условий диализа. В этом шише представляет интерес исследование скорости распределения криозащитных веществ в системе сперма У среда в процессе диализа и изучение изменения показателей , связанных с регуляцией окислительного обмена в сперматозоидах на этапах охлаждения в процессе диализа и замораживания. Показано (Мороз Л.Г. , Корбан Н.В. , Шапиев И.Ш. , 1980; 1985) , что с устойчивостью сперматозоидов к охлаждению в значительной мере связаны механизмы сопряженности дыхания с синтезом АТФ и редокс-реакции пнридиннуклеотидов (НАД-Н) на действие тестирующих веществ.

При разработке метода долговременного хранения спермы основанного на диализе , чрезвычайно важны вопросы санации спермы. В последние годы для санации спфмы успешно. применяется антибактериальный препарат Антибакс-1 , разработанный институтом антибиотиков и ферментов (медицинского назначения) совместно с ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных (A.C. 1427644. Прокопцев В.М., Урбан В.П., Марчук О.И., Гречухин А.М., Шнур В.И. , 1993). Исследование Антибакса-1 на показатели диализированной спермы представляют несомненный интерес.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. В связи с вышеизложенным с целью совершенствования метода замораживания спермы , основанного на диализе , решали следующие задачи:

- влияние состава диализной среды и условий диализа на показатели качества криоконсервированной спермы;

- скорость распределения основных криозащнтных веществ в системе сперма\среда в процессе диализа;

- влияние адсорбентов различного химического состава на показатели функциональной полноценности криоконсервированной спермы ;

-влияние Антибакса-1 на жизнеспособность криоконсервированной спермы;

- изменение показателей окислительного обмена на этапах охлаждения и замораживания спермы в процессе диализа разными адсорбентами ;

- апробация новой диализной камеры и совершенствование режима охлаждения в ней;

- оплодотворяющая способность спермы , замороженной после диализа с разными адсорбентами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Исследовано влияние состава диализной среды и условий диализа на основные функциональные показатели спермы , замороженной после диализа. Впервые в качестве адсорбентов исследовано влияние веществ белковой и небелковой природы на показатели функциональной полноценности криоконсервированной спермы. Установлено , что введение белка куриных яиц, сыворотгч крови и Антибакса-1 позволяет получить более высокие и стабильные показатели при замораживании криоконсервированной спермы. При исследовании показателей окислительного обмена на этапах охлаждения и замораживания спермы в процессе диализа установлено , что наибольшие изменения электронтранспортной системы имеют место на этапе охлаждения до + 5° С . Установлено , что наличие адсорбентов в среде . способствует снижению концентрации малонового диальдегида в сперматозоидах хряков при замораживании-оттаивании. Все опыты проводились с использованием новой диализной камеры, предложенной и подготовленной лабораторией воспроизводства и искусственного осеменения свиней ВНИИГРЖ. Оплодотворяющая способность спермы, замороженной после диализа не ниже, чем после центрифугирования.

Экспериментальные исследования , анализ полученных данных проводились автором лично.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Предложена технология криоконсерващга спермы хряков , основанная на использовании диализа , адсорбентов и нового санирующего препарата. По результативности технология не уступает криоконсервации спермы хряков с использованием центрифугирования ,

является более простой и доступной для замораживания в производственных условиях.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались на отчетных сессиях аспирантов ( ВНИИГРЖ , 1993 , 1994 , 1995) , на Международном симпозиуме : Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с.-х. животных (ВНИИГРЖ , 19940 , на 111 съезде физиологов Казахстана ( Казахстан-Уральск , УПИ, 1995).

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения , обзора литературы , материала и методов исследований , обсуждения , выводов и предложений производству. Диссертация изложена на стр.

машинописного текста , содержит 19 таблиц и 7' рисунков. Список литературы включает/Й5 источников , в том числе^ иностранных.

• 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В опытах использовали сперму хряков собственной экспериментальной базы и Акционерного объединения закрытого типа "Детскосельский" . Всего в опыте было использовано 14 хряков пород ландрас , крупная белая , дюрок и их помеси в возрасте 1-3 лет. Оценку и отбор хряков и спермы на замораживание и осеменение проводили по следующим показателям - активность , переживаемость , ковдентрацня , объем , время редукции метиленовой сини ( РМС ) , устойчивость сперматозоидов к температурному шоку , стимуляция дыхания 2,4 -ДНФ и сукцинатом калия , изменение флуоресценции НАД-Н при действии 2,4-ДНФ (Мороз Л.Г., Шапиев 11.111., Корбан Н.В., 1980). Из 14 хряков было отбрано 11 животных дня замораживания спермы на опыты и осеменения.

Сперму хряков замораживали двумя способами : после диализа с использованием полупроницаемых мембран и по технологии , предусматривающей центрифугирование ( Шапиев И.Ш. и др. , 1985; Мороз Л.Г. , Козлякова К.Б. , 1991).

Диализ осуществляли, помещая сперму в диализные мешочки из _ гидроцеллюлозной ^ембраны , которые помещали в стаканы с диализной средой.

Использовали гидропеллюлозную мембрану отечественного производства и медицинскую пленку. Соотношение сперма:среда - 1:4 ( например , в опыте количество спермы составляло 10 мл, а среды 40 мл).

Исходными средами для диализа были выбраны: глюкозо-сахарозо-калневая среда (ГСХЖКУм), используемая для замораживания концентрированной спермы (Шапиев И.Ш. и др. 1985) и листозо-глюкозная (ЛГХЦКУМ), модифицированная нами для диализа ( Мороз Л.Г. , Козлякова К.Б. , 1991). В качестве крноротектора использовали глицерин , который вводили перед замораживанием. Глицерин вводили в среды в количестве 2-5%. Желток вводили в сперму перед помещением в холодильник в количестве 10%. Среды готовили заблаговременно накануне замораживания и хранили в холодилышке при +4+5° С. В качестве адсорбентов использовали акпгвир'ванный уголь , белковые соединения , сыворотку крови свиней , инактивнрованную прогреванием , которые вводили в диализную среду в количестве от 1 до 40 мл. Контролем служил вариант с центрифугированием спермы ( Шапиев И.Ш., Мороз Л.Г.,1989).

Оттаивали гранулы в приборе при температуре +42 °С ( Шапиев И.Ш. и др. , 1985). Оттаянную сперму разбавляли средой для разбавления размороженной спермы в отношении 1:3 или 1:4 при температуре +42° С. Конечный объем спермы для осеменения составлял 100-120 мл.

Все опыты проводили методом разделенного эякулята. Свежеполучен"ый эякулят делили на части. Одну часть использовали в качестве контроля. Оставшуюся - для оценки спермы и опытных вариантов.

Оценку спермы на этапах охлаждения и после оттаивания проводили по активности , времеш! переживания , сохранности акросом , реакции дыхания и изменению флуоресценции НАД-Н на действие тестирующих веществ (сукцинат калия , 2,4-ДНФ) , определяемых микроскопическим , полярографическим и флуоресцентным методами ( Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш., 1980; 1983 ; 1988). Дыхание суспензии- сперматозоидов измеряли на полярографе марки LP-60 ЧССР в термостатированных ячейках при помощи закрытого платинового электрода

Кларка при температуре +30° С. Изменение флуоресценции определяли на флуоресцентном микроскопе ЛЮМАМ с насадкой ФМЭЛ-1 , позволяющей регистрировать сигнал на комбинированном цифровом приборе при длине волны для НАД-Н - 465 нм. Изменение флуоресценции выражали в % от исходной , принятой за 100 %.

Кроме того определяли перекиси ллпидов в свежен и замороженно-огтаянной сперме но накоплению малонового днальдепща (МДА) , определяемого на СФ-26 ( Saton К., 1978). Измеряли оптическую плотность при 535 нм. Молярный коэффициент экспозиции & =1,56 • Ю5 м"' ст"'.

Содержание глюкозы в сперме и среде определяли по реакции с пикриновой кислотой (Коренманн И.М. , 1970), содержание глицерина по методу (Harvey S.C. , Higly V. , 1951). Определение глюкозы и глицерина в сперме и среде проводили через 1 , 2 , 3 и 4 часа диализа.

Оплодотворяющую способность оценивали на основе осеменения свиноматок. Для осеменения сперму замораживали в специально изготовленной в лаборатории воспроизводства и искусственного осеменения свиней ВНИИГРЖ камере. Осеменение спило маток замороженно-отгаянной спермой проводили обычным способом согласно инструкции по искусственному осеменению свиней - первое осеменение через 12 часов после регистрации рефлекса неподвижности , второе -через 24 часа.

Результаты обрабатывали по Е.К.Меркурьевой и Н.А.Плохинскому (1970).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Выбор среды для диализа

Для выявления наилучшей среды и способа введения глицерина в первой серии опытов были исследованы показатели качества спермы , диалнзированной против ГСХЦКУМ и ЛГХЦКУМ сред. При этом глицерин вводили в концентрагии 4% двумя способами: 1) 4%- в диализную среду (варишггы 2 и 4) н 2) - 2% в диализную

Преду и 2% в сперму (варианты 3 и 5). Контролем служил вариант с центрифугированием спермы. Результаты опыта представлены в таблице 1.

Таблица 1

Показатели качества спермы хряков , замороженной после диализа в разных средах

п=8

ВАРИАНТ

Активность Активность сразу, балл через 3

часа, балл

М±т

М±т

Пережи- %

ваемость, неповрежденных акросом М ± т М ± т

1.Контроль (центр.) ДИАЛИЗ:

3,5 ± 0,47 '

1,48 ± 0,08 5,2 ± 0,13 72 ± 4,5

2. Среда ГСХЦКУМ,4% глицер. 4,7 ± 0,21 0,5 ± 0,05х* 5,0 ± 0,13"* 74 ± 2,4

3. Среда ГСХЦКУМ, 2% глицер. 4,2 ± 0,02 0,6 ± 0,08х* 4,25 ± 0,37х* 76 ± 2,2

(2% в сперме) 0,5 ± 0,09"

4. Среда ЛГХЦКУМ , 4% глицер.4,0 ± 0,34 4,1 ± 0,37х* 78 ± 2,4

5. Среда ЛГХЦКУМ, 2% ппщер. 3,8 ± 0,29 1,2 ±0,10 4,3 ±0,21 79 ± 0,5

(2% в сперме)

6. Среда ЛГХЦКУМ, 4% глицер. 5,9 ± 0,13х*

+активированный уголь 4,0 ± 0; 10 1,4 ± 0,09х 78 ± 2,4

7. Среда ВИЖ, 4% глицер. 3,0 ± 0,68 1,0 ±0,10 4,1 ±0,46 75 ± 2,86

х-достоверное отличие от контроля при р < 0,05 хх- достоверное отличие от контроля при р <0,01ч

Как видно из таблицы 1, активность спермы, замороженной после диализа ниже , чем после центрифугирования. Вариант , в котором в качестве диализной среды была использована лактозная среда , содержащая адсорбент, - активированный уголь позволяет улучшить показатели криоконсервированной спермы. Глицерин в данном варианте вводили в среду в концентрации 4% . ЛГХЦКУМ-среда бьша

■'Л

выбрана исходной для дальнейшего совершенствования. Результаты опыта подтвердили также перспективность метода с использованием диализа , как более простого ; позволяющего исключить центрифугирование.

3.2. Исследование скорости проникновения глюкозы и глицерина в сперму из диализной среды При исследовании скорости прошцаювения через полупроницаемую мембрану глицерина н Сахаров нами установлено , что содержание глицерина через 4 часа диализа составляет в сперме 1,1% , в среде - 2,7-2,8% , т.е. не происходит выравнивания концентрации глицерина в сперме и среде (таблица 2).

Таблица 2

Изменение концентрации Сахаров и глицерина в сперме

хряков в процессе диализа, п=5

Содержание Сахаров Содержание .%

Время глице рина, % в сперме

диализа, о среде в сперме в среде в сперме от концент-

час мг% мг% % от ции в

исходной среде

0 8515 170 100 4,4 0,00. 0,00.

(70-300)

1 8400 480 282 4,2 0,54 12,8

(300-450)

2 8310 700 412 4,2 0,53 13,3

(1050-300)

3 7900 803 472 3,0. 1,02 34,0.

(310-1200)

4 еооо 1025 603 2,68 1,1 39,0.

Содержание Сахаров в сперме в процессе диализа возрастает также медленно. За 4 часа в сперму из среды перрходнт лишь 10% Сахаров, содержащихся в среде. При этом увеличите конценгращш Сахаров происходит в основном за счет глюкозы.

• • 3.3 Оптимизация состава среды С целью совершенствования диализной среды были испытаны несколько вариантов лактозо-глюкозной среды (ЛГХЦКУМ) с содержанием глюкозы от 1,5 до 3,0 г. , мочевины от 0,15 до 1,5 г. , цитрата калия от 0,13 до 1,3 г. на 100 мл дистиллированной воды. Глицерин вводили в среду в концентрации 4%.

Данные , представленные в таблице 3 показали , что во всех вариантах ( среды 2" 5) <; увеличением концентрации глюкозы активность и переживаемость

криоконсервнрованной спермы выше , чем в исходной (среда 1). Увеличите в среде электролитов , снижает эффективность консервации (среда 3 : глюкоза - 3,0 г., лактоза-7,0 г., цитрата калия - 1,3 г., ЭДТА-0,1 г., мочевина - 1,5 г.).

Наиболее высокие результаты получены в 5-ой среде ( глюкоза - 3,0 г., лактоза -7,0 г., цитрат ¿алия - 0,13 г., ЭДТА - 0,1 г ., мочевина - 0,75 г.) , с высоким содержанием Сахаров и низким содержанием цитрата калия. Эта среда слабогнпертоничная Д = 0,69.

Таблица 3

Влияние различных составов ЛГХЦКУМ среды на функциональное состояние спермы хряков, п=10

Показатели качества спермы

Вариант

среды Активность Активность ■ Пережнваемость, % неповрежден-

после оттаивания, через 3 часа час ных акросом

балл инкубации, балл

I 2,4 ± 0,93 0,03 ±0,016 2,1 ±0,66 92

2 3,9 ± 0,78 1,45 ±0,78 4.9 ± 0,66 92

3 3,6 ± 0,44 0,66 ± 0,38 4,8.± 0,92 76

4 3,43 ±0,12 1,8 ±0,24 5,5 ± 0,60х 91

5 3,25 ±0,52 1,75 ±0,20 7,0 ± 0,82х 89

х - достоверно отличается от 1 и 2 составов при р < 0,05

Результаты опыта показали возможность регуляции химического состиа спермы , содержания криофилактиков в сперме , ее осмотического давления и рН в процессе холодовой подготовки к замораживанию путем использования диализа и определенного состава диализной среды , что позволяет увеличить устойчивость сперматозоидов к замораживанию. Использование диализа спермы против криозалщтной среды , также позволяет снизить повреждения, связанные с быстрым введением глицерина. Показано , что уменьшение концентрации глицерина, а также падение осмотического давления , вызванные введением глицерина, можно компенсировать увеличением концентрации других Сахаров в среде.

3.4. Испытание белкового адсорбента в составе

диализной среды

В составе диализных сред были испытаны адсорбенты различной природы. В качестве адсорбента белковой природы нами был испытан белок куриных яиц в трех сериях опытов. При этом белок вводили в различных соотношениях со средой, спермой лрн различных концентрациях глицерина. В первой серии было установлено , что при введении белка в соотношении со средой 1:3 и соотношении сперма:среда 1:3 , наибольшее увеличение активности и времени переживш'чя спермы (на 26 %) наблюдается , если концентрация глицерина в среде составляет 34 %. При более низких концентрациях глицерина (2%) и более высоких (5%) результаты консервации ухудшаются. Результаты второй и третей серии опытов (таблица 4) подтвердили данные, полученные в первом эксперименте.

Таблица 4

Показатели качества криоконсервированной спермы , дуализированной

против среды с различным количеством белка и глицерина, п=5

N/N Соотношение Количество Активность в баллах

_ глицерина_

среда: белка в среде, % сразу через через

3 часа 5 часов

Время . Сохранность пережи- акросом , % вания

час

1 Контроль,диализ, актив.уголь

2 Контроль, центр.

3,8±0,62 0,07±0,66 0 4,2±0,49 100 82±4,86

4,7±0,24 1,80±0,39 1,0±0,89 7,8±0,20 185 86±4,60

3 7:1

4 3:1

5 1,5: 1.

3 4,8±0,22 1,40±0,35 0,6±0,26 8,2±0,11 190 89±2,84 3 5,0±0,32 1,40±0,24 0,7±0,12 8,0±0,05 190 85+2,74 3 4,7±0,24 0,80±0,43 0,3±0,05 7,2±0,21 172 83±2,39

6 7:1

7 3:1

8 1,5:1

4 4,8±0,22 2,35±0,50 0,9±0,10 8,7±0,01 207 83+2,38 4 4,7+0,24 2,11 ±0,48 0,5±0,03 7,2±0,21 172 85±2,71 4 4,S±0,22 1,22±0,36 0,2±0,09 7,7±0,36 183 84±2,66

9 7:1

10 3 : 1

2 4,8+0,22 1,85±0,33 0,6±0,03 7,0±0,32 166 84±2,66 2 4,1 ±0,39 1,70±0,47 0,2±0,09 6,7±0,42 160 84±2,66

х-р <0,01

При этом получено увеличите времени переживания при всех соотношениях белок: среда(1:7; 1:3 и 1:1,15) и концентрации глицерина в диализной среде 3-4 % в пределах 72-107% , в сравнении с угольным адсорбентом. Наиболее эффективным оказалось соотношение 1:7 и выше и при концентрации глицерина 4 % (увеличе1ше времени переживания составило 107 %).

<

В обеих сериях показатели этих вариантов превысили показатели центрифугированного варианта. Уменьшение концентрации адсорбента (соотношение адсорбент:среда - I : 15,5 и 1 : 39 ) значительно снижало эффект.

Следует отметить , что в оптимальных вариантах использование диализа и белка в составе среды позволяет уменьшить повреждение акросом. Сохранность акросом составляет 83-89 %.

3.5. Испытание выворотки крови свиней в составе диализной среды

При определении оптимального соотношения сыворотка: среда наилучшие результаты получены в вариантах 1:2 и 1:3 (таблица 5).Опыты по испытанию сыворотки крови свиней , вводимой в разных количествах (таблицы 5, б ), проводилисв на сперме очень низкого качества (активность н переживаемосгь

Таблица 5

Влияние различного соотношения сыворотка крови:среда на активность и переживаемосгь крноконсервнрованной спермы, п=6 -11

Активность Время переживания

Вариант

балл % час %

Контроль белок: среда 2,6±0,65 100,0 3,25±0,62 100,0

Сыворотка: среда 1 : 1 2,6±0,78 100,0 2,3±0,9<Г 70,7

1 : 2 3,07±0,70 118,1 3,5±0,72 107,69

1 : 3 3,36±0,60 129,2 3,4±0,88 104,61

1:7 3,б±0,62 138,46 г 2,57±0,74 79,10,

1: 15 2,8±0,4! 107,69 2,5±0,78 76,92

Таблица 6

Влияние сыворотки крови свиней в составе диализной среды на показатели качества криоконсервированной спермы, п=10

Вариаш' Активность,балл Переживаемость Сохранность

акросом, %

опыта сразу после оттаивания через 3 часа инкубащш час % к контролю

Контроль:

1 .центриро-

вание 2,70±0,26 0,10±0,02 2,39±0,19 100,0 90,311,78

Диализ:

2. среда+белок

(7:1) 2,50±0,29 1,00±0,22 2,3910,19 100,0 90,212,31

З.среда+сыво- 3,3910,26х

ротка (3:1) 2,5210,22 1,13±0,36 141,8 90,2+2,86

х - достоверно отличается от контроля при р > 0,05

контрольного варианта были в два раза ниже, чем в опытах по испытанию белка). Тем не менее, в опытах по сравнительному испытанию белка и сыворотки крови свиней в составе диализной среды установлено преимущество по переживаемости оттаянной спермы сыворотки крови над белком на 41,8% (таблица 6).

3.6. Исследование влияния различных адсорбентов и Аитнбакса-1 на анализированную сперму Нами установлено, что при долговременном хранении спермы в процессе диализа введение адсорбентов в диализную среду позволяет увеличить переживаемость спермы на 22% в сравнении с контролем без адсорбентов (таблица7).

Введение же в среду Антибакса-1 в дозе , используемой для санации спермы (В.М.Прокопцев., 1993) при плюсовых температурах позволяет сразу продлить переживаемость диализированной спермы на 48-116% в сравнении со спермой днализщ.jBaHHofi без Антибакса-1 (таблица 8). По-видимому, ухудшенге результатов при использовании адсорбентов без санирующих препаратов при длительном хранении спермы обусловлено тем , что белок является субстратом для - развития микрофлоры. При замораживании спермы время ее охлаждения до +2+5°

С составляет 4-5 часов , за этот период микрофлора не успевает развиться. Тем не мгнее мы сочли необходимым ввести Антибакс-1 в диализные среды при замораживанни спермы. Установлено , что введение Антнбакса-1 позволяет получить более высокие и стабильные результаты при заморажнваннн диалнзнрованной спермы. При этом активность сперматозоидов возрастает на 100-' 200% , переживаемость на 58-70% в сравнении с контролем.

Таблица 7

Влияние адсорбентов и Антибакса-1 в составе диализных сред

на жизнеспособность спермы сохраняемой при +16 0 С, п=5

Вариант опыта Время переживания до 5 баллов, час Время % пережи- к контролю вания, час

1 .Сперма разбавленная

средой ГХЦКУМ (контроль 1) 48,0 ±0,13 72,4 ± 0,69 100

2.Сперма + среда ГХЦС-8-

(контроль 2) 42,3 ± 2,52 73,2 ± 0,92 100 .

ДИАЛИЗ:

З.Среда + активированный 88,5 ± 1,04х |

уголь (4 : 1) 48,4 ± 2,29 ' 122

4. Среда + белок (7:1) 54,2 ± 1,10х 88,6 ± 1,25х 122

5. Среда + сыворотка крови (3:1) 54,9 ± 0,83х 88,9 ± 3,80х 122

6. Среда+ белок + уннтиол + 90,4 ± 0,40х 128,5 ± 1,12х 170

+ Антибакс-1

7. Среда + уннтиол +

+Антибакс-1. 90,6 ± 0,42х 171,0 ± 0,91х 238

х - прир >0,01

Влияние различных доз Антибакса на качество спермы,замороженной после диализа., п=8

Концентрация Антибакса на Активность после оттаивания, балл Активность через 3 часа, балл ' Переживаемость, час % неповрежденных

30 мл среды, мг М+т % к контролю М+т % К контролю М+т % к контролю акросом

Контроль без Антибакса - 3,7+0,27 100 0,56+0,49 100 4,1+0,36 XX 6,5+0,44 XX 6,7+0,48 XX 7,0+0,29 100 94

1,63 4,0+0,34 108 0,81+0,36 225 158 90

3,26 4,3+0,33 116 1,1+0,38 305 163 98

4,89 4,5+0.24 122 1,0+0,51 277 170 ?8

хх - достоверно отличается от контроля при р < 0,01

3.7.Исследование влияния адсорбентов на изменение дыхания н редокс-реакции НАД-Н Результаты исследования влияния адсорбентов на изменение дыхання н редокс-реакции НАД-Н при действии тестирующих веществ на этапах охлаждения и замораживания диализировадаой спермы представлены в таблицах 9 и 10. Как видно из таблиц наибольшее снижение показателей имеет место на этапе охлаждения до +5° С. После замораживания-оттаивания в варианте с центрифугированием и вариантах диализ с белком и диализ с сывороткой крови эти показатели увеличиваются до уровня свежеполученной спермы. Это свидетельствует о том, что в вариантах диализ с белком и диализ с сывороткой крови имеет место холодовое разобщение регуляторного характера. В варианте с активированным углем

разобщение носит необратимый характер.

С1

3.8.Исследованне содержания перекисей липидов в сперматозоидах хряка при криоконсервашш спермы с адсорбентами Нами установлено , что в контрольном варианте без адсорбентов содержание малонового диальдегида в сперматозоидах после замораживания-оттаивания возрастает на 99,4%. В варианте диализ с белком содержание малонового диальдегида в сперматозоидах возрастает на 8,5% , а в варианте диализ с сывороткой на 1,4%. Наличие адсорбентов в среде способствует снижению концентрации малонового диальдегида в сперматозоидах хряков при замораживании-оттаивании в спавнении с контролем (сперма разбавленная средой ГХЦС-8). Данный эффект вызван способностью белка и сыворотки крови сорбировать токсические гидроперекиси. При этом различия сорбционных свойств белка янц и сыворотки крови свиней статистически недостоверны. По-видимому более высокий положительный эффект сыворотки крови обусловлен не только адсорбцией перекисей липидов белками , но и другими мехшшзмами ( сыворотка крови имеет более сложный состав ". альбумины , глобулины, гатопротеиды, гликопротенды , ферменты крови , гормоны, низкомолекулярные регуляторы метаболизма, небелковой природы; последние могут проникать через

Изменение флуоресценции НАД-Н в сперме На этапах охлаждения и аамсршкивания,п=10

Вариант Изменение флуоресценции НАД-Н с 2,4- ДНФ, % от исходной (М+м) Р* Достоверное отличие от контроля

свежеполученная после охлаждения до 5 С Р* после замораживания-оттаивания

1. Центрифугирование

(контроль 1) - 53,7+3,66 36,3+3,60 <0,05 42,8+3,10 >0,05

Диализ: •

2. среда + активированный

уголь (контроль 2) ■ 49,2+5,10 30,0+2,50 <0,05 30,0+2,60 <0,05

3. среда + белок 49,2+5,10 36,0+7,38 <0,05 47,7+7,20 >0,05

4. среда + сыворотка крови 49,2+5,10 39,9+5,29 >0,05 50,1+8,38 >0,05

Р* - достоверно отличастся от показателей свежеполученной спермы при р < 0,05

х - достоверно отличается от контроля при р > 0,005

Таблица 10

Изменение показателей полярографической оценки в сперме на этапах охлаждения в исследуемых вариантах, п=10

Вариант опыта Свежеполученная сперма После охлаждения до + 5 С Р* Заморожен но-оттаяннэя - Р* Достоверность

СД с сукцинато». СД с 2,4-ДНФ СД с сукцинатсм СД с 2,4-ДНФ СД с сукцинатом СД с 2,4-ДНФ отличий от свеже-

полученной

уел ед М+т уел ед М+т уел ед М+т

1 .Центрифугирование

(контроль 1) .1,0 3,0+0,04 .1,0 1,8+0,012 <0,01 .1,40 1,85+0,030 <0,01

Диализ-.

2.среда+активирован-

ный уголь (контроль 2) • 1.0 2,7+0,10 01,0 1,5+0,050 <0,01 .2,40 1,65+0,40 <0,01

3. среда + бело* • 1,0 2.7+0,10 ■ 1,0 1,6+0,050 <0,01 .2,10 1,95+0,060 <0,01

4. среда + сыворотка

крови • 1,0 2,7+0,10 .1,0 1,5+0,050 <0,01 1,44 1,60+0,100 <0,01

Р*- достоверность различия между показателями спермы охлажденной и замороженной от свежеполученной хх- достоверное отличие опыных вариантов (3 и 4 ) от контроля 2 при р < 0,01 СД- стимуляция дыхания

полупроницаемую мембрану к стабилизировать злектрон-транспорито систему в процессе охлаждения).

3.9. Апробация новой диализной камеры для замораживания спермы на осеменение.

Для намораживания спермы хряков И.Ш.Шлшевым сконструирована простая и удобная камера. Нами откорректирован режим охлаждения в ней. Камера позволяет сразу заморозшъ 75 мл спермы , т.е. 3-4 дозы на осеменение. Предложенная и изготооленг гя лабораторией воспроизводства и искусственною осеменения свиней ВНИИГРЖ конструкция камеры для диализа более проста и удобна для очистки и замены пленки.

■ Для корректировки режима охлаждения спермы в камере было испытано несколько режимов и проведена сравнительная оценка замороженио-.оттаяшюй спермы , диалиэированной в малой диализной камере , большой камере с адсорбентами и центрифугированного варианта. При этом основные показатели качества крноконсервнрованиой спермы хряков: активность , переживаемость , стимуляция дыхания 2,4-ДНФ превышали данные показатели центрифугированного варианта на 30 , 11 и 10 % соответственно.

При осеменении свиноматок спермой, диалиэированной при +15° С.в течение суток оплодотворяемость составила 100% (таблица 11). Следовательно . диализ спермы против разработанной среды не снижает оплодотворяющей способности. Средняя оплодотворяемость свиноматок осемененных спермой , замороженной после диализа с белковыми адсорбентами и Антнбаксом-1 составила 69,""5%. При этом из 8 маток , осемененных спермой, диалшироваиной и замороженной с белком оплодотворилось 5 маток, т.е. оплодотворяемость составила 62,5% , а из 5 маток осемененных замороженной диалиэированной с сывороткой крови перегуляла 1 свиноматка, т. е. оплодотворяемость составила 80% . В контроле из 5 маток , осемененных замороженной диализированной спермой без адсорбентов перегуляли 4 свиноматки , оплодотворяемость составила 20% , что на 49,2% ниже , чем средняя

Таблица11

Результаты осеменения свиноматок спцшой , замороженной и сохраняемой с использованием диализа и адсорбента

Осеменено Огшодот- Перегу- Процент Многоплодие Адсорбент маток ворнлось ляло оплодотво-

маток маток рения

ДИАЛИЗ:

Сперма , выдержанная при комнатной температуре в камере с адсорбентами в течение

24 часов 5 5 - 100,0 9,4 ± 0,40

Сперма замороженно-

-оттаяннаяс адсорбен-

тами: 13 9 4 69,2 ±12,8 10,б±0,29

белок 8 5 3 62,5 ±17,0 10,0±0,38

сыворотка 5 0 4 1 80,0 ±17,9 11,2+1,19

Контроль: диализ без

адсорбентов 5 1 4 20,0 ±17,9 9,17±0,53

Всего: 23 15 8 65,2±10,0 9,94±0,63

Контроль:

центрифугирование 22 14 8 63,6 ±10,0 11,4±0,44

Контроль: ,

иатнвная сперма 104 84 20 80,8±3,8 ' 8,70±0,24

оплодо1вориемость при использовашш адсорбентов ( разница достоверная - р < 0,05). Небольшие в 10-15% различия в оплодотворяющей способности при использовании белка и сыворотки крови статистически не достоверны. Нет разницы также в оплодотворяющей способности между этими вариантами и нентрнфушрованным контролем. Многоплодие же маток, осемененных замороженной .нермон во всех вариантах было выше , чем при осеменении нативной спермой.

Таким образом, использование белка, сыворотки крови и Антпбакса-1 в составе диализной среды, позволило повысить показатели функциональной полноценности спермы замороженной после дивализа.

выводы

1. Использование диализа и оптимального состава ЛГХЦКУМ среды позволяет регулировать скорость , поступления крноэащитных веществ в сперму и таким образом избежать осмотический шок сперматозоидов и повысить их устойчивость к охлаждению и заморажившппо.

2. Разработшшый оптимальный состав ЛГХЦКУМ среда! позволяет увеличить активность и переживаем ость спермы.

3. Введение з состав диализной среды адсорбентов белковой природы увеличивает показатели спермы замороженной после диализа.

4. ¡ведение белка куриных яиц в состав диализной среды позволяет увеличить активность спермы на 23,5% и ее переживаемостъ на 25% в сравнении с центрифугированным вариантом.

5. бдение сыворотки крови свиней в состав диализной среды в качестве адсорбента позволяет увеличить пережнваемость спермы на 30% в сравиешш с белком куриных яиц.

6. Введение в диализную среду белка (1:7) и сыворотки крови (1:3) позволяет уменьшить разобщение электрон-транспортной системы на этапе охлаждения до +5° С н увеличить реакцию НАД-Н и дыхшшя на добавле1ше 2,4-ДНФ в зак.<1рожешю-оттаяшюй сперме.

7. Введение Антнбакса-1 в сперму в диапозоне от 1,63 до 4,89 мг на 10 мл спермы , позволяет увеличить активность замороженной спермы на 100-200% , переживаемостъ на 58-70% в сравнении с контролем.

8. Криозащитный эффект.белка и сыворотки крови на показатели активности , переживаемостн и энергетический обмен обусловлен снижением количества перекисей литшов в результате их адсорбции на белках. Криозащитный эффект сыворотки крови выше , чем белка , что обусловлено более сложным составом сыворотки крови.

9. Оплодотворяющая способность спермы , диалнзированной против ЛГХЦКУМ среды с белком и Антибаксом-1 - 62,5% , с сывороткой крови и Антибаксом-1 -

80,0', о. Средняя оплодотворяемость состазила 64,9% , т.е. не ниже , чем в варианте с кштрифугированием.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предложена технология криоконсервация спермы хряков , основанная на использовании диализа и адсорбентов и нового санирующего препарата -Антнбакс-1. По результативности технология не уступает криоконссрващш спермы хряков с использованием центрифугирования , является более простой и доступной для замораживания в производственных условиях.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1. Совершенствование метода замораживания спермы хряков , основанного на диализе. Бюлл.ВНИИГРЖ , 536 , С-Петербург., 1993: 32-34./ соавторы Л.Г.Мороз., И.Ш.Шапнев., К.Б.Козлякова/.

2. Совершенствование метода криоконсервации спермы хряков на основе использования диализа. Тезисы Международного симпозиума Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных. 24-26 мая 1994 года, С.-Петербург, Пушкин, 44-45 с.

3. Современное состоите вопроса хрноконсервации спермы хряков. Тезисы 56-ой научно-практической конференции проф.-препод состава , посвященной 60-летию УПИ нм.Пушкина., Казахстан-Уральск.,1995: 210-212 с.

4. Глубокое замораживание спермы хряков. Тезисы 111 съезда физиологов Казахстана. Казахстан-Уральск.,1995,/соавторы А.Р.Рустенов ., Р.М.Рустенова/.

5. Использование тиоловых соединений для хранения и заморажившшя спермы. В сб.Физиология.Казахстан.А-Ата.,1995., 152-153 с.

6. Влияние состава диализной среды на' показатели функциональной полноценности спермы хряков при охлаждении н заморажгватт II Селекционно-биологические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Сб.каучн.тр.ВНИИГРЖ.-С.-П., 1996.-е. 127-140. /соавторы Л.Г.Мороз., И.Ш.Шапнев., В.М.Прокопцев/.