Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка способов длительного хранения спермы петухов и их использование при воспроизводстве птицы

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктора сельскохозяйственных наук, Нарубина, Лидия Евгеньевна, Санкт-Петербург-Пушкин

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

и

г

г

Л'

На правах рукописи

НАРУБИНА Лидия Евгеньевна

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ДЛИТЕЛЬНОГО .ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ ПЕТУХОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИ ВОСПРОИЗВОДСТВЕ

ПТИЦЫ

Специальность: 06.02.01 — разведенке, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук в форме научного доклада

Л

V

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ-ПУШКИН 1998

Работа выполнена в отделе генетики и разведения сельскохозяйственной птицы Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных.

Научный консультант — лауреат премии Совета Министров СССР и Государственной премии Российской Федерации в области науки и техники, доктор сельскохозяйственных наук, профессор И. Л. Гальперн.

Официальные оппоненты — доктор сельскохозяйственных наук, профессор И. А. Сочкан; доктор сельскохозяйственных наук, профессор П. П. Царенко; доктор биологических наук В. М. Прокопцев.

Ведущая организация — 'Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства.

Защита диссертации состоится " на заседании диссертационного совета Д и.... на соискание ученой степени доктора наук ледовательском институте генетики и ра^ вотных по адресу: 189620, Сан*: Н се, 55-'а.

С диссертацией можно ознакомятас* в

Диссертация в форме научного :

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор сельскохозяйственных наук, ¡. , профессор

г. в

часов

01 по защите диссертаций I3 ).•.(•• -"'.'чо'.: научно-ис-•уйственных жи-.ковское шос-

1ИГРЖ.

^<■4998 г.

ВОЛГИН

-гк*

аЗМЗ-П

1. Общая характеристика работы

В условиях интенсификации и специализации отрасли птицеводства большое распространение получил прогрессивный способ воспроизводства птицы - искусственное осеменение. Этот метод позволяет быстрее оценить производителей по качеству потомства, рационально использова ть их генетический потенциал, сохранять и восстанавливать генофонд исчезающих пород птицы.

Применение метода искусственного осеменения в племенном птицеводстве неразрывно связано с изучением особенностей спермопродукции самцов и режимом их использования, а также с разработкой способов разбавления и хранения спермы при плюсовых и минусовых температурах.

Однако иетенснфикация селекционного процесса и дальнейший прогресс в селекции возможны лишь при использовании криоконсервированной спермы самцов-улучшатеяей. Поэтому крайне необходимо иметь простые и надежные методы хранения и криоконсервации спермы самцов сельскохозяйственной птицы.

Сперму петухов начали замораживать раньше других видов животных. Еще в 1941 г. Шаффнеру удалось получить 30% подвижных спермиев, а в !949 г. Полдж и Смит из 600 проинкубированных яиц получили 3 нормальных цыпленка ( Shaff-ner C.S. et al., 1941; Poige C. et a!., 1949 ).

В последующие годы во многих странах мира интенсивно проводились исследования по разработке способов криоконсервации спермы самцов сельскохозяйственной птицы ( Lake Р.Е. et al., 1967, 1984; Sexton T.J.,1972, 1981; Watanabe M. et al., 1967, 1977; Wishart G.J. et al., 1985, 1997 ). Однако показатели оплодотворенное™ яиц были невысокими и нестабильными ( на уровне 50% ). Только в опыта* Лейка получены более высокие показатели - до 92,6% ( Lake Р.Е. et al., 1980; Lake Р.Е.,. 1984).

Тем не менее способы замораживания, описанные этими авторами, не удалось воспроизвести. Кроме того в этих опытах были использованы куры и петухи, спе-• циалыю отобранные на высокую воспроизводительную способность, и использована техника глубокого внутриматочного осеменения, которая в птицеводстве практически применяться не может.

Согласно современным представлениям, основными факторами, повреждающими клетки в процессе низкотемпературной консервации, являются: формирование внеклеточного льда, увеличение концентрации электролитов во внеклеточной среде, обезвоживание клеток и внутриклеточная кристаллизация ( Осташ-коФ.И., 1978; ПушкарьН.С., Banoyc A.M., 1981;LakeР.Е.,¡984).

Главным способом защиты клеток от повреждающих факторов при замораживании является подбор оптимального сочетания среды, криопротектора, режима охлаждения и оттаивания.

Изучению этих вопросов применительно к сперме птиц, начиная с 70-х годов, были посвящены наши исследования, которые легли в основу при разработке новых способов криоконсервации спермы петухов.

Цель и задачи исследований Основная цель-исследований - разработка способов длительного хранения спермы петухов и их использование при воспроизводстве, птицы.

В процессе работы поэтапно были поставлены следующие основные задачи: Разработать:

1 .Способы хранения спермы при плюсовой температуре и режимы иктенсивно-о использования петухов.

2. Синтетические среды для хранения спермы при плюсовой и минусовой температуре.

3. Оборудование дчя криоконсервации и оттаивания спермы птиц.

4. Способы использования криопротектора М^М-диметшшцетамида при замораживании и оттаивании спермы петухов.

5. Способы криоконсервации спермы птиц,

6. Технологию использования храненной спермы при воспроизводстве птиц .

Научная новизна исследований Определены оптимальные условия эффективного

хранения спермы петухов при плюсовых температурах.

Впервые в птицеводческой практике показана чозможность интенсивного использования петухов путем получения нескольких полноценных эякулягов в день.

Разработаны новые синтетические среды: для разбавления и продления срока хранения спермы до 72 часов при плюсовой температуре ( а.с. № 553973, а.с. № 586908 ), для разбавления-и замораживания спермы петухов в жидком азоте ( а.с. Лв 1130339, а.с. № 1298974 ). Выявлено высокое криозащиткое свойство криопротектора К,М-диметилацетамида в сочетании со средой Л КС-!.

На основе изучения температурных режимов в период экспонировгшия, замораживания и оттаивания разработаны принципиально новые эффективные способы криоконсервации спермы петухов ( а.с. №656621, а.с. № ¡343587; а.с. № 1515443), сконструировано оборудование для криоконсервации и оттаивания спермы птиц ( а.с. № 994874 ), установлены оптимальные условия искусственного осеменения кур замороженно-оттаянной спермой, позволяющие получать ошюдотвореиноеть яиц на уровне 80-95%. '

Впервые в мировой практике птицеводства осущестадено замораживание спермы племенных петухов в больших объемах и транспортировка в другое хозяйство. '

Обосновано использование криоконсераированной спермы петухов в селекции.

Теоретическая значимость работы

Впервые на сперме птиц доказана высокая эффективность использования криопротектора К,М - диметилацетамида при криоконсервации и выявлены оптимальные условия его применения.

Криопротектор ДМА не вызывает осмотических перегрузок на мембранах при различных манипуляциях со спермой, связанных с подготовкой к замораживанию и оттаиванию.

Являясь сильнейшим органическим растворителем, ДМА при длительном воздействии ( более 1 часа ) оказывает отрицательное влияние на мембранные структуры спермиев, ответственные за оплодотворяющую способность. При кратковременном воздействии ДМА проявляет высокое крнозащитное свойство, не окаэыает отрицательного влияния на спермин.

Впервые показано, что интенсивное использование петухов не нарушает процесс сперматогенеза и не влияет на образование зрелых спермиев, способных выдерживать замораживание.

Практическая значимость работы Разработанные приемы хранения спермы и интенсивного использования петухов вошли в инструкции по искусственному осеменению сельскохозяйственной птицы ( 1970, 1973, 1991); в методические рекомендации по биологическим основам повышения продуктивности сельскохозяйственной птицы ( 1987 ); в рекомендации по искусственному осеменению сельскохозяйственной птицы (1988).

Способ криоконсервации спермы петухов в виде мелких гранул путем прямого накалывания в жидкий азот, разработанный нами .является самым эффективным в мире, оплодотворенносТь яиц достигает 80-98%.

Разработанные способы хранения спермы петухов вошли составной частью в - материалы «Разработка и внедрение экономически эффективной комплексной технологии искусственного осеменения птиц», отмеченные премией Совете Министров СССР (1990).

Анпобадияр.аоотм Материалы исследований были ежегодно доложены на заседаниях Ученого Совета ВНИИГРЖ; на координационных совещаниях по птицеводству ( 1970-19.97); 1-1X координационных совещаниях по искусственному осеменению птиц ( 197Ы983); научных конференциях по птицеводству национального отделения ВИАП ( 1973-1995 ); научных конференциях в институте биофизики РАН в Пушимо « консервация генетических ресурсов» ( 1983-1995).

___Публикация, результатов исследовании Материалы исследований защищены 8

авторскими свидетельствами, опубликованы в 97 научных работах, в том числе разделы в 2-х методических рекомендациях и 3-х инструкциях по искусственному осеменению птицы, главы в 2-х книгах.

_1<а защиту наносятся сдедймце положения :

-Приемы хранения спермы петухов при плюсовой температуре. -Синтетические среды для разбавления и продления срока хранения спермы при плюсовой и минусовой температуре.

-Эффективность использования различных криопротекторов при замораживании спермы петухов.

- Способы низкотемпературной консервации и оттаивания спермы петухов.

- Технология использования храненной спермы при воспроизводстве птицы.

2. Материал н методика исследований Работа выполнена в лаборатории искусственного осеменения птиц ВНИИГРЖ, его Экспериментальном хозяйстве по птицеводству и птицеводческих хозяйствах' России и стран СИГ в период 1970-1997 гг. на курах и петухах яичного и мясного направления продуктивности.

Кормление птицы осуществляли по нормам ВНИТИП, содержание кур и петухов напольное в секциях, гнездах и клеточных батареях КБИ-4.

Сперму от петухов получади методом массажа абдоминальной области ( Burrows W.H. a. Quinn G Р., 1939).

Первый отбор петухов по экстерьеру и развитию вторично-половых признаков проводили при бонитировке цыплят в 60-дневном возрасте; второй отбор петухов По реакции на массаж в 145-150 дней и окончательный отбор - в 7-7,5-месячном возрасте по качеству спермы.

Физиологические показатели спермы оценивали по общепринятым методикам: объем эякулята определяли градуированной пипеткой; концентрацию - в счетной камере Горяева; акт ивность и густоту под микроскопом с термостатированным столиком; осмотическое давление - путем регистрации точки замерзания криоско-пичееким методом при помощи термометра Бекмана; для измерения рН спермы использовали лабораторный рН-метр ЛПУ-01; переживаемое! ь как разбавленной, так и заморожеино-оттаянной спермы определяли по методу Милованова В.К. (1962).

Криоконсервацшо спермы петухов проводили разработанными нами способами ( а.с. ЛЬ 65662, а,с. Ms 1343587, а.с. № 1515443 ).

Подопытные группы кур формировали методом аналогов по возрасту, развитию и продуктивности.

Осеменение кур проводили во второй половине дня, когда большинство кур закончило яйцекладку.

Во всех опытах при использовании свежерззбавленной спермы осеменение кур осуществляли.на глубину яйцевода 3-4 см с интервалом 1 раз в 5-7 дней дозой 0,05 мл, а при использовании замороженно-оттаянвон спермы - 1 раз в 3-4 дня дозой 0,2 мл. В'специальных опытах интервалы и дозы осеменения кур были различными в зависимости от задач эксперимента.

Сбор яиц на инкубацию начинали чгрез 1 день после повгорногб осеменения.

Оплодотворенность яиц определяли сшоскопнрованием на 5-7-е сутки инкубации.

Цыплят при выводе метили крьшометками, вели учет сохранности и хозяйственно-полезных признаков потомства.

Результаты исследовании обработаны статистически ( Меркурьева Е.К.,!970).

Основными критериями оцеуки результатов экспериментов были оплодотво-ренность; выводимость яиц и вывод молодняка.

Часть экспериментов и производственная проверка опытных данных были проведены на Западно-Сибирской и Белорусской ЗОСП, нлемптидефабрике (Степная» Ростовской обл. 1

Схема

исследован я й

Разработка способов длительного хранения спермы петухов и их использование при воспроизводстве птицы

Биотехнология, размножения и воспроизводство

Хранение спермы петухов in vitro

Отбор петухов зля искусственного осеменения й режим их ис -пользования

Разработка ситгагаеских сред для раэбав.тення и пропе-виясрока хранения cncpiiEi петухов при плюсовых и MHHVCO-вых температурах

Оборудование дм замораживания и оттаивания спер>!Ы

Ш1Щ

Длительное ' хранение спсрмы петлхов

Особенности хранения спермы петухов при плюсовых температу рах

Выявление оптимального сочетания сред и крпопротекторов при заиораживашш спермы петухов

Разработка способа замораживания спермы птиц во флаконах без криостата

Изучение воспроизводительных и продуктивных качеств потомства, полуденного от использования заморо^ешю-оттаянной спермы

Особенности оттаивания спермы, замороженной во флаконах с использованием криостата

Разработка способа з;':лор:!Жпва;шя спермы петухов в гранулах-прямым накалыванием в жидкий азот

Эффективность использования криоконсервированной спермы

В селекции

Для сохранен« и восстановления генофонда • Для .получения гибридных цыплят

3. Результаты исследований 3.1. Отбор петухов длв искусственного осеменения кур и режима их использовании

При отборе племенных петухоз для искусственного осеменения необходимо, чтобы они хорошо выделяли сперму высокого качества при массаже.

В опытах Давтяна А.Д. ( !96б< ) выявлена высокая положительная корреляция, между концентрацией, подвижностью и резистентнотью спермы с опподотворен-ностью яиц и выводом здоровых цыплят.

Наши опыты показали ( табл.1 ), что наибольшей изменчивости подвержены такие показателе«, как объем эякулята и концентрация спермиев. При'отборе петухов для искусственного осеменения мы оставляли тех, которые давали- при массаже не менее 0,3 ми спермы с концентрацией не ниже 2 млрд/мл и активностью не .. менее 7 баллов. В дальнейших наших опытах, где на курах 7-м» гнезд использовались одни и те же петухи сначала при искусственном осеменении индивидуальными эякулятами в дозе 0,025 мл ( неразбавленной;спермы ). а через Ю дней после .последнего осеменения при естественном спаривании ( табл.2 ), показано, что 6 петухов из 7 дают одинаковые результаты при двух способах осеменения кур. При искусственном осеменении кур оплодотворенность яиц 91,6%, выводимость яиц » 92,0%, вывод цьгплят - 84,4%, при естественном спаривании еоответственно'90,2%,

89,0% и 80.3%.

Таблица I

____Показатели качества спермы петухов породы белый леггорн

| Показатели Число эикулятов МЬт 1ш

! Объем эякулята ( мл) 574 9,48±0,13 0,10-1,50

| Концентрация 384 г ,34±0,04 0,92-4,0

! спермиев ( млрд/мл) ■

1 Активность шерммев | (балл) 574' 7,8±0ДО 6,0 - 9,0 |

| рК шфмы ¡38 7,9340^02 6,8 - 7,3 1

1 А: 'аочка депрессии | (грахКО 132 -о.бке,» . . . - 1 •• -0,6-0,66 |

, ' Таблица 2

Характеристика инкубационных качеств иод ролученных от кур мрн искусственном осеменении и. естественном сжфввакии.

Гш¥ Способ осеме- Показатели ш исубации

> тяухов нения кур Заложено ниц Опяодо'(ворш Выводимость Вывод ЦЫПЛЯТ,

1 поеть, % ¡ши, % . % 1

11 . И.О. ¡61 96,3 96,7 93,1 . !

! Е.С. - 78 96,1 95,3 91,0

! 2 И.О. 99 95,9 88,4 84,8

1 Е.С. 87 . 96,5 86,9 83,9

3 И.О. 122 92,6 '92,0 85,2

Е.О. 92 89,1 . 87,8 . : 78,2

1 4 и.о 90 . 90,0 96,3 86,7

1 Е.С.. 91 92,3 90,4 '. 83,5

¡5 И.О. 71 . 88,7 85,7 76,8

Е.С. 68 79,4 ' 85,1 67,6

6 И.О 72 87,5 87,3 63,7

Е.С.. 85 96,4 89,0 85,8

7 . И.О. { ¡42 87,3 91,9 80,3

. £.С. 94 ■ 80,8 88,1 71,2

В 1 ера«- . ' И.О. 757 91,5±1,5 92;0±1,8 84,4±3,9

[нем Е.С. . 595 90,2±2,8 89,0±1,3 80,3±3,0

Примечание: И.О. - искусственное осеменение; Е.С. - есютвешюс спаривание.

Эффективность использования петухов и рациональное расходование их спермы - один из важных вопросов при применении метода искусственного осеменения в воспроизводстве кур.

Проведенный нами анализ качества спермы петухов в различных эякулят;«, полученных методом массажа с интервалом I час в течение дня, выявил значительное снижение в последовательных эякулятах (табл.3 ) объема, концентрации спермиев и их резистентности. Однако влияние последовательных спариваний на инкубационные качества яиц , когда всех петухов поочередно подпускали к курам одного гнезда и, как только петух делал одно спаривание, его пересаживали к курам следующего гнезда ( и т.д. ) не отразило достаточно четкой взаимозависимости этих показателей качества спермы с ее оплодотворяющей способностью. '

Таблица 3

Качество спермы петухов в различных эякулятах

Показатели Номера шезд •35 36 37 38 56 39 40 41

№№ • эякуля-тов 1 2 3 4 5 6 .7 . 8 9

Часы сугок 9-10 10-1! 11-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18

Объем эякуля-то», мл 0,57 0.42 0,32 0,31 0,38 0,25 0,19 0,20 0,21

Концепт-риипя спсрмнсв, млрд/мл 3,26 3.30 2,14 1,68 1,12 8.85 0.47 0.37 0,58

Рсшсгсн-"ШОСТЬ к 1% ЫаСХ 22 26 20 16 19 15 14 9 20

РН 6,6 6,8 7,0 7,1 7,5 8.2 8,0 8,0 8,0

Оплодо-таорсц- иость «щ, % 88,7 85,0 77,2 85,3 90,3 73,5. 79,8 69,4

Выводимость Я1Щ,% 86,5 92,3 85,2 88,6 85,1 92,5 91,6 93,2

Примечаете: в гнезде 56 куры были оссмепсны 5 и 6-м эякулятами.

Результаты данных экспериментов свидетельств�