Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка способа получения лекарственных препаратов на основе иммобилизованных протеаз Bac. subtilis

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка способа получения лекарственных препаратов на основе иммобилизованных протеаз Bac. subtilis"

На правах рукописи УДК 577.156.615.72-032:611.23

Троицкий Александр Васильевич

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРОТЕАЗ Вас. виЫЙк

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 1998

Работа выполнена в отделе молекулярной генетики Института цитологии и генетики СО РАН

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

академик РАН, профессор Р. И. Салганик

доктор медицинских наук, Л. М. Поляков; доктор биологических наук, Г. М. Дымшнц

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

СО РАН

Защита диссертации состоится " \ 998 года

в /часов на заседании диссертационного Совета К 001.37.01 в Институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан " /У* " _ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат медицинских наук " ^ Т. Г. Филатова

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

В настоящее время особый интерес вызывает разработка доступных и эффективных способов иммобилизации протеаз, поскольку такие стабилизированные биокатализаторы начинают интенсивно использоваться в медицине в качестве фармакологических средств для лечения гнойно-воспалительных процессов. Их терапевтический эффект обусловлен высокоспецифичным, селективным лизисом белков некротических тканей, всегда присутствующих в гнойно-воспалительном очаге и поддерживающих патологический процесс. Удаление нежизнеспособных, некротизированных тканей приводит к стимуляции процессов репарации и регенерации тканей. Неполитическое действие иммобилизованных протеаз широко используется в хирургии, стоматологии, пульмонологии, гинекологии, офтальмологии .

Большинство опубликованных работ по иммобилизации протеаз относится к получению их нерастворимых форм, в то время как по получению и исследованию биохимических свойств растворимых иммобилизованных протеаз в литературе имеются лишь единичные сообщения (Л. В. Земцова и соавт., 1981; Р. И. Салганик и соавт., 1983). В значительной мере это объясняется тем, что перечень пригодных для иммобилизации водорастворимых полимеров весьма ограничен, к тому же многие из них инертны и не поддаются активации традиционными химическими методами.

Наиболее перспективными полимерными носителями для получения водорастворимых иммобилизованных ферментов медицинского назначения являются полиэтиленоксиды. Полиэтиленоксид 1500 выпускается отечественной промышленностью и применяется в медицине для изготовления композиционных лекарственных форм (мазей, эмульсий, линиментов). Полиэтиленоксид практически нетоксичен и в организме не подвергается биотрансформации, выделяясь при парэнтеральном введении в неизменном виде (В.Ф. Карташев, 1984). Однако, ввиду высокой химической инертности полиэтиленоксида 1500 возникают сложности с его активацией. Наиболее перспективным, по нашим представлениям, может стать физико-химический метод активации полиэтиленоксида с использованием ионизирующего излучения.

Одним из основных критериев при выборе фермента для иммобилизации с целью получения препарата медицинского назначения является его доступность и экономичность. Протеолитические ферменты, получаемые из животного сырья (пепсин, трипсин, химотрипсин) и растительного (папайи), неперспективны вследствие ограниченности сырьевой базы. В отличие от них, бактериальные протеазы доступны.

При получении иммобилизованных на полиэтиленоксиде протеаз наше внимание привлекли протеазы Вас.БиЫШз, выпускаемые отечественной промышленностью в больших масштабах для биотехнологических целей.

Цель работы - создание медицинских препаратов на основе протеаз Вас.БиЫШэ, иммобилизованных на полиэтиленоксиде 1500 и гидрофильном геле полиэтиленоксида 1500 (далее полиэтиленоксид).

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние ионизирующего излучения на водные растворы полиэтиленоксида с целью введения в полимер химически активных групп для последующей иммобилизации протеаз.

2. Разработать способ радиационной иммобилизации протеаз на полиэтиленоксиде.

3. Изучить физико-химические свойства иммобилизованных на полиэтиленоксиде протеаз.

4. Разработать радиационный способ получения гидрофильных гелей полиэтиленоксида.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В результате проведенных исследований установлено, что поли-тиленоксид в растворе под действием ионизирующего излучения окисляется с образованием карбонильных групп.

Полиэтиленоксид, активированный радиационным способом, способен связываться с протеазами Вас.зиЫШэ, образуя иммобилизованную форму фермента.

Впервые разработан радиационный способ иммобилизации протеаз Вас.зиЫШБ на полиэтиленоксиде позволяющий получать стерильную форму лекарственного препарата.

С использованием ионизирующего излучения впервые получен гель полиэтиленоксида и гелевая форма иммобилизованной протеазы.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

На основе проведенных исследований разработаны лекарственные препараты имозимаза и стоматозим, представляющие собой иммобилизованные радиационным способом на полиэтиленоксиде и геле полиэтиленоксида протеазы Вас.БиЫШз. Препараты прошли полный цикл доклинических исследований в соответствии с утвержденной программой МЗ РФ. Препарат имозимаза официально разрешен приказом министра здравооохранения РФ для применения в медицинской практике и включен в Государственный Реестр лекарственных препаратов, регистрационный N94/128/5.

Анализ результатов по использованию имозимазы в клинической практике показал высокую терапевтическую эффективность препарата в хирургии, стоматологии, пульмонологии, гинекологии, офтальмологии.

Разработан высокочувствительный метод количественного определения полиэтиленоксида в физиологических средах, который позволил исследовать фармакокинетику иммобилизованных на полиэтиленоксиде протеаз при различных путях введения экспериментальным животным.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Под действием ионизирующеего излучения на водные растворы полиэтиленоксида происходит активация полимера с образованием карбонильных групп.

2. Гамма-излучение в дозах, обеспечивающих радиационную активацию полиэтиленоксида, не оказывает существенного повреждающего действия на протеазы.

3. При облучении растворов протеазы, содержащих полиэтиленоксид, происходит образование иммобилизованной формы фермента.

4. Иммобилизация на полиэтиленоксиде протеаз Bac.subtilis приводит к увеличению их стабильности.

5. На основе специфической реакции образования окрашенных комплексов полиэтиленоксида с йодом и иодидом калия может быть разработан высокочувствительный метод количественного определения полимера в физиологических средах для изучения фармакокинетики иммобилизованных на полиэтиленоксиде протеаз Bac.subtilis.

6. При действии на водные растворы полиэтиленоксида ионизирующим излучением с высокой мощностью дозы происходит образование гидрофильных гелей.

7. Гидрофильные гели полиэтиленоксида полученные радиационным способом могут быть использованы для иммобилизации протеаз Bac.subtilis. Иммобилизованные в геле протеазы обладают высокой термостабильностыо.

8. Разработанные препараты иммобилизованных протеаз яляются высокоэффективными энзиматическими средствами для лечения гнойно-воспалительных процессов различной этиологии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на V Всесоюзном симпозиуме по медицинской этимологии (Махачкала, 1986), на II Всесоюзной конференции "Раны и раневая инфекция" (Москва, 1986 ), на XXXI Всесоюзном съезде хирургов (Ташкент, 1987), на научно-практической конференции по биотехнологии "Применение достижений биотехнологии в народном хозяйстве" ( Уфа, 1987 ), на семинаре по медицинским аспектам применения иммобилизованных протеаз в институте хирургии СО РАМН (Иркутск, 1997), на межлабораторном семинаре института цитологии и генетики СО РАН ( Новосибирск, 1998 ).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав и выводов. Содержит 27 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает 109 источников.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, получено 2 авторских свидетельства, 5 патентов России и 1 патент США.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для работы использовали:

- полиэтнленоксид-1500 (молекулярная масса 1300 - 1600 Да) по ФС 421885-82 производства Харьковского химико-фармацевтического завода "Красная звезда";

- полиэтиленоксид-4000 (молекулярная масса 3800 - 4100 Да) по ВФС 42110-72 производства Харьковского химико-фармацевтического завода "Красная звезда";

- протосубтилин из Вас. subtilis по ТУ 59.01.003.74-84, получаемый из культуральной жидкости Вас.subtilis штамм 4-15 в результате очистки от балластных белков методом спиртового осаждения с последующей сублимационной сушкой;

- кульгуральную жидкость Вас.subtilis штамм 4-15 после очистки от балластных белков методом спиртового осаждения.

Для исследования действия ионизирующего излучения на водные растворы полиэтиленоксида использовали полимеры с молекулярными массами 1,5 и 4,0 кДа. Из них готовили 2-14 % водные растворы. Растворы облучали в полиэтиленовых пробирках емкостью 1 мл на гамма-установке с источником излучения Со60 при 20 °С. Интервал исследуемых доз гамма-излучения составлял от 2 до 10 кГр, при постоянной мощности дозы, составляющей 1,65 кГр/ч.

После облучения растворы полиэтиленоксидов анализировали на содержание карбонильных соединений по методу Лаппина и Кларка.

Исследование влияния гамма-излучения на протеазы Bac.subtilis проводили методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ целлюлозе, ДЕ-52, "Serva" (ФРГ).

Протеолитическую активность в хроматографических фракциях определяли по гидролизу азоказеина - субстрат ОКА-АС (НИИ прикладной энзимологии, Вильнюс).

Исследование белков культуральной жидкости Bac.subtilis, проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе GPC-800 с колонкой размером 2 х 150 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом Separon SGX С 18, "Tesla" (ЧССР). Элюентом служил 20 % водный раствор метанола. Для нейтрализации положительно заряженных групп исследуемых белков и увеличения времени их удерживания на колонке в состав элюента вводили 0,01 % трихлоруксусной кислоты.

При исследовании влияния гамма-излучения на растворы протеаз, содержащих полиэтиленоксид, использовали культуральную жидкость Bac.subtilis, содержащую 10 % полиэтиленоксида с молекулярным весом 1,5кДа. Концентрация белка в смеси составляла 2 мг/мл. Полученную смесь облучали тормозным гамма-излучением на ускорителе электронов ИЛУ-6 (ИЯФ СО РАН), доза излучения составляла 6 кГр. Облученные растворы исследовали методом ионообменной хроматографии.

Гель-хромагографию белков протосубтилина Г10Х проводили на Ultrogel АсА 44 "LKB" (Швеция). Хроматографическая колонка 1,7 х 60 см. Элюентом служил 0,05 М калий-фосфатный буфер с рН 7,0.

При исследовании физико-химических свойств иммобилизованной протеазы Вас.БиЫШБ протеолитическую активность определяли по гидролизу казеината натрия.

Термостабильность протеаз в отсутствии субстрата определяли при 37, 45, 50 и 60 °С в 0,05 М боратном буфере с рН 8,2.

Термостабильность протеаз Bac.subt.ilis в присутствии субстрата определяли, инкубируя смесь растворов протосубтилина и 2 % казеината натрия в интервале температур от 37 до 80 "С.

При разработке метода количественного определения полнэтиленоксидов нами были использованы полимеры с молекулярными массами от 1,5 до 40 кДа в виде водных растворов с концентрациями от 5 до 30 мкг/мл ; сыворотка крови, содержащая полиэтиленоксид с молекулярной массой 1,5 кДа в концентрациях от 10 до 70 мкг/мл и полиэтиленоксид с молекулярной массой 20 кДа в концентрациях от 10 до 180 мкг/мл.

Исследования фармакокинетики иммобилизованных на полиэтилен-оксиде протеаз Вас.зиЫШв при различных путях введения проводили на крысах линии \Vistar весом 150 - 200 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование действия ионизирующего излучения на водные растворы полиэтилсноксида по выходу карбонильных групп

Исследования показали, что при действии гамма-излучения на водные растворы полиэтиленоксида в полимере в ходе радиационно-химического окисления образуются карбонильные группы (КГ)- Выход КГ для полнэтиленоксидов с мол. массой 1,5 и 4,0 кДа имеет дозовую зависимость в интервале от 2 до 10 кГр (Рис.1).

мэету^лл

8,0 7.0 6.0 5,0 -4.0 3,0 -2,0 1.0 -

-1-Г"

2.0 4,0

I

6,0

10.0 Доза.сГр

Рис. 1 Образование карбонильных групп » 10 % растворах

полиэтиленоксидое ПЭО-4000 (I) и ПЭО-1ЕОО (2) ■ зависимости от лозы излучения.

,0

С повышением концентрации раствора полиэтиленоксида, при постоянной дозе гамма-излучения, выход карбонильных групп в полиэтиленоксидах увеличивается ( Рис 2 ). мэке/мл

С 10-

С >

&

--!--!-,-,--1-1-

2,0 4,0 6.0 8.0 10,0 12,0 14,0 £ %

Рис. 2 Образование карбонильных групп в зависимости от концентрации растворов ПЭО-4000 (1) и ПЭО-1500 (2). Доза излучений 6 кГр.

Существенных отличий в поведении различающихся по молекулярной массе полиэтиленоксидов в ходе их радиационно-хнмического окисления нами не установлено.

2. Исследование действия ионизирующего излучения на водные растворы

протеаз ВаслиЫНк

Как показали проведенные нами эксперименты, протеазы Вас.зиЬиНэ в растворе под действием ионизирующего излучения подвергаются инактивации, степень которой зависит ог дозы излучения. В исследованном интервале доз гамма-излучения от 15 до 35 кГр протеазы Вас.БиЫШз теряют от 10 до 80 % специфической активности. При этом отчетливо выражено пострадиационное падение активности. Проверка активности облученных растворов Вас.БиЫШз в течение 1 недели показала, что потери специфической активности после радиационной нагрузки могут составлять до 75 % от исходного значения, причем скорость пострадиационной инактивации зависит от дозы гамма-излучения (Рис 3).

5 40-

X

I

сразу пгсяе аСлученхя, чсргз 2 с,ток псгле об.т/чеяяя, через ? суток пселе облучения.

Падение протеолитич»скои активноси культуральнои жидкости { КЖ } Вас. зиЬ?1119 а «авксимости от дезы иомилируюеего излученмл.

2 - облученная КЗ, лоза кГр,

3 " облученная КГ, лээа ¿0 кГр,

4 ~ овлу^емяа« КЖ, деза 2С кГр,

5 - облученная КЖ, доза 25 кГр.

Дозы гамма-излучения (6-10 кГр), активирующие полиэтиленоксид, позволяют одновременно обеспечить стерильность растворов при сохранении специфической активности протеаз.

3. Исследование действия ионизирующего излучения на водные растворы протеаз ВаслиЫШ* в присутствии полиэтиленоксида. Радиационный способ иммобилизации протеаз на полютиленокевде

При разработке радиационного способа иммобилизации протеаз Вас. яиМк на полиэтиленоксиде 1500 нам важно было установить, какое влияние оказывает полимер на радиолиз растворов протеазы и происходит ли под действием гамма-излучения образование иммобилизованной формы фермента.

С этой целью методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе нами исследованы облученные в дозе 6 кГр и необлученные растворы КЖ Вас.виЬМз, содержащие 10 % полиэтиленоксида 1500.

Мы полагали, что в результате действия гамма-излучения произойдет взаимодействие протеазы с полиэтиленоксидом и, как следствие, изменение хроматографической картины разделения белков КЖ Вас.зиЫШэ и распределения полиэтиленоксида по основным белковым фракциям.

Дм»

Рис. Фракционирование культурсльной жидкости Вас.5иШ&,

облученной в доза 6 кГр,на колонке с ДЭАЭ-целлюпозой.

(О-

- протеолитическая активность

- содержание белка

¿и

У/

ГТТТТПп

20

80 объеы элю«вта, мл

Рис. 4а Фракционирование кулыуральной жидкости Вас.яиЬШз, содержащей полиэтиг.еноксип;на колонке с ДЗАЭ-цел-люлоэой.

(1)- содержание белка

(2) - содержание полиэтиле ноксида

Как видно из хроматограмм, представленных на Рис.4 и Рис.4а, несвязанный полиэтиленоксид 1500 не оказывает влияния на фракционирование белков КЖ Вас.зиЫШБ. Полиэтиленоксид 1500 на хроматограмме представлен в виде асимметричного пика.

Выраженная деформация профиля элюирования полиэтиленоксида, вероятно, вызвана его неспецифическим взаимодействием с целлюлозной матрицей ионообменника и адсорбированным белком.

При действии гамма-излучения на раствор КЖ Вас.БиЫШз, содержащий полиэтиленоксид 1500, происходят изменения профиля элюирования белков на хроматограмме, связанные с объединением второго и третьего пиков концентрации белка в один пик, совпадающий с пиком ферментативной активности. При действии ионизирующего излучения изменяется также распределение полиэтиленоксида по основным белковым фракциям КЖ Вас.БиЬиНз. На хроматограмме облученной смеси появляется добавочный пик концентрации полиэтиленоксида, совпадающий с пиком ферментативной активности, что свидетельствует о связывании протеазой части полиэтиленоксида (Рис.5).

40 -ЭО .

го .10

объем злюснта, ил

Рис. 5 Фракционирование культуральной жидкости Еас.знЫШз,

содержащей полиэтиленоксид и облученной в дозе 6 кГр, на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

(1)- содержание белка

(2)- содержание полиэтиленоксида

(3)- протеолитическая активность

пи-

во -

100

л> -

во -

« -

30 -

20

10 -

При исследовании гамма-радиолиза раствора протосубтилина, содержащего полиэтиленоксид, методом гель-хроматографии на иКп^е!

АсА 44 также оказалось, что протеаза взаимодействует с карбонил-содержащим полиэтиленоксидом. На хроматограмме, представленной на Рис. 6, видно, что прогосубтилин содержит высокомолекулярную фракцию, выходящую в свободном объеме колонки, и группу фракций с большими объемами выхода.

Рис. 6 Фракционирование пратосубтилина на и11:го9е1 АсА 44

При действии гамма-излучения на раствор протосубтилина, содержащий пролиэтиленоксид, хроматографическая картина фракционирования белков на икп^е1 АсА 44 изменяется (Рис.7). Фракции с объемом выхода свыше 60 мл объединяются и на хроматограмме представлены двумя пиками. Определение полиэтиленоксида в хроматографических фракциях также показало наличие двух пиков концентрации полимера, модулирующих основные белковые пики. Облученный в растворе при эквивалентной дозе гамма-излучения полиэтиленоксид элюируется одним пиком.

Таким образом, проведенные исследования показали, что при действии гамма-излучения на раствор, содержащий КЖ Вас.эиЫШз или протосубтилин и полиэтиленоксид 1500, в результате радиационно-хими-

ческих реакций происходит иммобилизация протеаз на полимерном носителе.

30 60 90 120 объем

элюента, мл

Рис. 7 Фракционирование на UHroQel АсА 44 лротосубтмлина. иммобилизованного на л опиат пленок сидв 1500.

1 • лротосубтипин,иммобилизованный на полиэтилежжсиде 1500 (содержание белка. О 280);

2- протосубтилин, иммобилизованный на полиэтиленоксиде 1500

{содержание полиэтиленоксида, мг/мл);

3-лопиэтиленоксмд, мг/мп

4. Физико-химические свойства протеаз Bac.subtilis, иммобилизованных на

полиэтиленоксиде

Известно, что иммобилизация ферментов приводит к изменению их физико-химических свойств ( И. В. Березин и соавт., 1987; И. В. Березин, Мартинек К., 1987 ). В целом эти изменения можно свести к увеличению термостабильности, стабильности при хранении, смещению рН-оптимума активности при сохранении субстратной специфичности. При разработке радиационного способа иммобилизации протеаз Bac.subtilis на полиэтиленоксиде 1500 мы полагали, что в результате иммобилизации исходные характеристики протеазы изменятся. Для исследования нами использован иммобилизованный на полиэтиленоксиде 1500 протосубтилин Г10Х.

Изучение зависимости протеолитической активности иммобилизованного протосубтилина от рН субстрата показало, что его активность максимальна при рН 8,2. Ненммобилизованный протосубтилин также имеет оптимум ферментативной активности в области рН 8,2 (Рис.8).

Активность, %

6,0 7,0 8.0 9,0 10,0 рН

Рис. 8 Зависимость протеолитической активности от рН субстрата.

Д - лротосубтилин иммобилизованный на полиэтиленоксиде 1500 О - протосубтилин

• • трипсин

За 100 % принято наивысшее значение активности фермента.

Исследование термостабильности иммобилизованного иротосубтилина в отсутствии субстрата показало, что иммобилизация приводит к увеличению термостабильности при 45 и 50 °С (Рис.9).

При 60°С в отсутствии субстрата происходит термоинактивация как иммобилизованного, так и свободного протосубтилина. Присутствие в растворе протосубтилина несвязанного полиэтиленоксида практически не влияет на термостабильность протеазы Вас.виЫШз.

В присутствии субстрата термостабильность иммобилизованного на полиэтиленоксиде протосубтилина резко увеличивается. Иммобилизованная протеаза Вас.БиЫШз сохраняет в присутствии казеината натрия от 85 до 100 % протеолитической активности в интервале температур от 37 до 70 "С (Рис. 10 ). Даже при 80°С сохраняется 36 % от максимальной активности иммобилизованного фермента. Температурный оптимум активности для иммобилизованного на полиэтиленоксиде 1500 протосубтилина составил 60°С, что на 15°С выше температурного оптимума свободного фермента.

Наличие в растворе протосубтилина несвязанного полиэтиленоксида не оказывает существенного влияния на термостабильность протеазы в присутствии субстрата.

Протеолитическэя активность, %

г 1

8

3

40

Рис. 9 Термостабильность протеаз о растворах в отсутствии субстрата.

А - протосубтилин. иммобилизованный на палиэтиленаксиде 1500, Б - протосубтилин в растворе полиэтиленоксида Г500, В - протосубтилин, Г - трипсин

1-45'С 3-60"С

2- 50*0

За 100 % принята активность после 1 ч инкубации при 37*С в отсутствии субстрата.

5. Разработка высокочувствительного метода определения полиэтиленоксида и исследование фармакокинетнки иммобилизованных на полиэтилепоксиде протеаз ВаслиЬШ1$

При разработке лекарственных средств на основе растворимых форм иммобилизованных протеолитическнх ферментов одной из наиболее важных задач является исследование фармакокинетнки препарата, необходимое для определения спектра терапевтической активности, выбора лечебной дозы и токсикологической оценки препарата ввиду возможности кумуляции в организме. С целью изучения фармакокинетнки протеаз Вас.эиЫШз, иммобилизованных на полиэтилепоксиде, нам необходимо было разработать высокочувствительный способ количественного определения препарата в крови, моче и тканевых гомогенатах. Количественное определение препарата в физиологических жидкостях по протеолитической активности невозможно по двум причинам:

-существующие методы определения активности бактериальных протеаз отличаются низкой чувствительностью и неспецифичны;

-физиологические жидкости, как правило, обладают собственной протеолитической активностью и содержат эндогенные ингибиторы протеолиза.

Рис. ¡0 Термостабильность в присутствии субстрата.

д - протосубтилин, иммобилизованный на полиэтиленоксиде 1500 Ф . протосубтилин в растворе попиэтилэжжсида 1500 О - протосубтилин в водном растворе. За 100 % принято наивысшее значение активности фермента.

В настоящее время установлено, что полиэтилеиоксиды при поступлении в организм не метаболизируются и выделяются в неизменном виде с мочой (80 %) и желчью (20 %). Таким образом, для изучения фармакокинетики протеаз Вас.БиЫШБ, иммобилизованных на полиэтиленоксиде, полимерный носитель может быть использован в качестве маркера препарата.

К наиболее чувствительным методам количественного определения полиэтиленоксида следует отнести метод Шеффера, основанный на реакции полиэтиленоксида с неорганическими гетерополикислотами и чувствительностью 50 мкг/мл и метод Моргана, основанный на взаимодействии полиэтиленоксида с кобальтотиоцианатом аммония и чувствительностью 100 мкг/мл (Снггиа С., Ханна Дж. Г., 1983). Оба метода не могут быть использованы для изучения фармакокинетики иммобилизованных на полиэтиленоксиде протеаз Вас.БиЫШз из-за большого объема исследуемой пробы и низкой чувствительности.

Нами разработан способ количественного определения полиэтилен-оксидов (ПЭО) различной молекулярной массы в водных растворах, отличающиеся от известных способов не только высокой чувствительностью, но и простотой в исполнении.

~ 220

о со с

о

п

го <

2

5;

п О 2 X

к И

£

ш =г

X

о

а

200

100-

24 час-

Рис. 11 Выведение из крови (1) и экскреция с мочой (2) имозимазы после внутривенного введения крысам.

Метод позволяет проводить количественный анализ полиэтиленоксидов любой молекулярной массы, содержащихся в водных растворах, физиологических жидкостях и тканевых гомогенатах. В основе метода используется способность полиэтиленоксидов образовывать окрашенные комплексы с йодом в концентрированном растворе хлорида лития. Мотод использован нами для изучения фармакокинетики имозимазы. Исследование фармакокинетики препарата при наружном способе применения показало, что резорбция имозимазы с поверхности экспериментальной раны крайне мала. Максимальную концентрацию в крови наблюдали через 25 минут - 7,5 х Ю-3 мг/мл , что составляет менее 0,01 % аплицированной разовой дозы.

Исследование внутривенного введения имозимазы показало, что максимальная концентрация препарата в крови, составляющая 210 мкг/мл достигается спустя 2 часа после внутривенной инъекции препарата.

Полная элиминация препарата происходила через 24 часа после введения (Рис.11).

Внутрибрюшинное введение имозимазы крысам выявило неоднозначное распределение препарата во внутренних органах (Рис.12). Ранее всего произошло накопление препарата в печени, более длительно происходила

Рис. 12 Распределение имозимазы в органах крыс после однократного внутрибрюшин-ного введения: 1- печень; 2 - селезенка; 3 - легкие; 4 - почки.

6. Радиационный способ получения геля полиэтиленоксида и иммобилизованных в геле протеаз Вас-виЫШэ.

Исследование физико-химических свойств протеаз, иммобилизованных в геле полиэтиленоксида

Разработка способа получения геля полиэтиленоксида представляла для нас особый интерес в связи с перспективностью создания мазевых форм препаратов иммобилизованных протеаз для применения в медицине. С этой целью было исследовано влияние потока ускоренных электронов с

энергией 2 МэВ и высокой мощностью дозы на водные растворы полиэтиленоксида с молекулярной массой 1,5 кДа.

г

Л____I.___-1 -I-.___1_.-1-г-1__I--1-.

; ю го зс <о 50 Концентрация раствора полиэтиленоксида 1500, %

Рис. 13 Зависимость дозы гелеобразоаания от

концентрации раствора полиэтиленоксида

Как показали исследования, облучение растворов полиэтиленоксида с молекулярной массой 1,5 кДа при мощностях дозы 5 кГр/с и выше позволяет получать гидрофильные гели. Доза гелеобразования зависит от концентрации раствора полиэтиленоксида и для растворов с концентрациями от 1 до 50 % составляет от 40 до 420 кГр (Рис.13). Гель полиэтиленоксида с молекулярной массой 1,5 кДа и содержанием основного вещества 10% был использован нами для получения препарата "стоматозим", представляющего собой протеазу Bac.subt.nis, иммобилизованную вышеописанным радиационным способом на полиэтиленоксиде и включенную в гель полиэтиленоксида.

Исследование зависимости активности стоматозима от рН раствора субстрата показало, что препарат наиболее активен при рН 9,0. При нейтральном значении рН раствора субстрата активность стоматозима составляет 70 % от максимального значения.

Рис. 14 Термостабильность при ЬО"С протваз Вас.зиЬШв, иммобилизованных в геле полиэтиленоксида 1500 (препарат "Стоматозим").

Исследование термостабильности стоматозима в отсутствии субстрата показало, что препарат обладает значительно большей термостабильностью, чем имозимаза. Стоматозим сохраняет 37% активности после прогревания препарата при 50°С в течение 24 часов ( Рис.14). Имозимаза, в отличие от стоматозима, при 50°С в течение 1 часа теряет 43 % исходной активности. Стабилизирующий эффект геля полиэтиленоксида на протеазу, вероятно, связан с так называемым эффектом "двойной иммобилизации", при которой иммобилизованный на полиэтиленоксиде фермент связывается в результате действия ионизирующего излучения с матрицей геля полиэтиленоксида, при этом достигается наибольшая конформационная стабилизация протеазы и, как следствие, устойчивость к денатурационному воздействию повышенной температуры и автолизу.

Применение препаратов иммобилизованных протеаз Вас. БиЫШз в медицине

В настоящее время протеаза Вас. БиЫШз, иммобилизованная на полиэтиленоксиде 1500 радиационным методом, разрешена для медицинского применения и внесена в Государственный Реестр лекарственных средств России под официальным названием "имозимаза"(ВФС 42-9415-94).

Клинические испытания имозимазы и ее последующее внедрение в практическое здравоохранение показали высокую терапевтическую

активность препарата при лечении гнойно-воспалительной патологии различного патогенеза. Основу фармакологического эффекта имозимазы составляет способность препарата вызывать ферментативный лизис белков некротизированных тканей. Энзиматический некролизис ведет к сокращению 1 фазы раневого процесса - очищению поверхности тканей, поврежденных патологическим процессом, от денатурированных белков. Ускорение очищения раневой поверхности от нежизнеспособных тканей способствует появлению грануляций в более ранние сроки и соответсвенно вызывает ускорение эпителизации.

Наиболее широко имозимаза используется в хирургии, пульмонологии и стоматологии. В хирургической практике препарат применяется при лечении острых и хронических гнойно-некротических процессов различной этиологии и локализации: нагноившиеся послеоперационные раны, гнойные раны после вскрытия абсцессов и флегмон, первично инфицированные раны, ожоги и отморожения различной степени тяжести, длительно незаживающие раны, трофические и лучевые язвы, хронические остеомиелиты. В пульмонологии имозимаза применяется при лечении заболеваний, сопровождающихся выделением вязкой гнойной мокроты: острые и хронические трахеобронхиты, пневмонии, бронхозктатическая болезнь, муковисцидоз и др. В ряде клинических сшуаций имозимаза высокоэффективна в качестве муколитического препарата для санации бронхов в предоперационном периоде с целью профилактики постоперационных обтурационных осложнений. В стоматологии имозимаза используется в комплексном лечении глубокого кариеса молочных и постоянных зубов, острых эксудативных пульпитов, воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта и тканей пародонта, острых и хронических периодонтитов, гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области.

В качестве примеров, демонстрирующих терапевтический спектр и эффективность имозимазы, можно привести некоторые результаты клинической апробации препарата:

1. Клиника общей хирургии Тернопольского медицинского института. Имозимаза применялась в качестве местного протеолитического средства у больных гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей и трофическим язвами. При применении препарата отмечался выраженный положительный клинический эффект, снижалась микробная обсемененность ран и фаза воспаления сокращалась на 2-3 дня в сравнении с традиционными способами лечения. Отмечен положительный эффект имозимазы при очищении трофических язв нижних конечностей, возникших на фоне постгромбофлебитического синдрома.

2. Клиника хирургии Иркутского института усовершенствования врачей.

Имозимаза применялась при лечении больных с гнойно-некротическими

заболеваниями мягких тканей (панариции, абсцессы, флегмоны, инфицированные раны, нагноившиеся послеоперационные раны, гнойные маститы, фурункулы, карбункулы, парапроктиты). Применение имозимазы в течение 1-2 суток после вскрытия и дренирования гнойного очага существенно уменьшало интенсивность воспалительного процесса, очищение ран

от фибринозно-гнойного содержимого и очагов некроза происходило в 1,5-2 раза быстрее по сравнению с традиционными способами лечения.

3. Онкологический научный центр Российской Академии медицинских наук.

Применение имозимазы у больных раком молочной железы, которые имели в послеоперационном периоде нагноение в ране, показало, что препарат обладает способностью стимулировать рост грануляционной ткани, что особенно важно при лечении послеоперационных осложнений на фоне сниженной регенерационной способности тканей после проведения лучевой и химиотерапии онкологических больных.

4. Таллинский ожоговый центр.

Имозимаза применялась у больных с нагноившимися открытыми переломами костей голени, стоп и пальцев кисти, термическими ожогами III А-Б степени, посттравматическими дефектами кожи нижних конечностей и трофическим язвами голени. Применение препарата позволило ускорить очищение гнойных ран, способствовало росту грануляционной ткани, тем самым срок нахождения больных в стационаре сокращался в 1,5-2 раза. Особенно положительный клинический эффект достигнут при сочетанном применении имозимазы и антибиотиков широкого спектра действия.

5. Клиники Министерства обороны России: 19 отдел Военно-медицинской Академии им. С. М. Кирова, военно-медицинская служба Забайкальского военного округа, лечебные учреждения войсковых частей во время военных действий в Афганистане, 333 Окружной военный госпиталь СибВО.

Имозимаза применялась при лечении гнойных ран после вскрытия флегмон и абсцессов, панарициев, нагноившихся послеоперационных ран, при свежих и осложненных гнойно-воспалительным процессом минно-взрывных и пулевых ранений, свищей после огнестрельных ранений. При применении имозимазы, в сравнении с традиционными методами лечения, значительно быстрее устраняются признаки общей интоксикации организма, очищение ран и созревание грануляционной ткани происходит на 2-3 суток раньше, что позволяет в более сжатые сроки провести аутодермопластику или наложить вторичные швы. Отмечен противовоспалительный и противоо гечный эффекты препарата.

6. Детальные клинические исследования эффективности применения имозимазы в стоматологической практике проведенны в Центральном НИИ стоматологии МЗ России, кафедре терапевтической стоматологии Новосибирского медицинского института и кафедре стоматологии Иркутского института усовершенствования врачей.

На кафедре терапевтической стоматологии Новосибирского медицинского института имозимаза применялась при лечении больных с воспалительной патологией пародонта, сочетанной с инсулинозависимым сахарным диабетом. Использование имозимазы в комплексном лечении больных сахарным диабетом с патологией пародонта позволило сократить сроки местного лечения на 40% при гингивитах , на 29,5% при легких формах пародонтитов, на 33,3 % при пародонтитах средней тяжести и 20 % при тяжелых формах заболевания.

В Центральном НИИ стоматологии России и Иркутском институте усовершенствования врачей проведена комплексная оценка эффективности имозимазы (жидкая форма) и стоматозима (гелевая форма имозимазы ) в лечении глубокого кариеса, острых частичных и генерализованных пульпитов и обострившихся хронических периодонтитов.

В лечении глубокого кариеса во всех клинических случаях был достигнут положительный эффект. Применение имозимазы и стоматозима позволило отказаться от машинной препаровки дна и стенок кариозной полости. Использование препаратов имозимаза и стоматозима в терапии обострившихся хронических периодонтитов позволило отказаться от применения других лекарственных средств и сократить сроки лечения до 3 -4 дней вместо обычных 10-15 дней.

Ферментативная препаровка кариозных полостей при лечении глубокого кариеса позволяет в значительной степени устранить негативные стороны машинной некрэкгомии, такие как вибрация, локальный нагрев и болевая реакцая. По данным электроодонтометрии пульпы пораженных зубов имозимаза и стоматозим оказывают благотворное влияние на ткани пульпы, приводят к восстановлению элекровозбудимости до нормального уровня в более короткие сроки и тем самым выступают как профилактические средства рецидива кариозного процесса.

ВЫВОДЫ

1. При действии ионизирующего излучения на водные растворы полиэтиленоксида в результате радиационно-химических реакций происходит активация полимера с образованием карбонильных групп.

2. Методами ионообменной и гель-хроматографии показано, что при облучении растворов протеаз Вас.БиМШз, содержащих полиэтиленоксид, в дозах, обеспечивающих активацию полимера, происходит иммобилизация ферментов.

3. Иммобилизованные на полиэтиленоксиде протеазы Вас.зиЫШБ обладают высокой термостабильностью (до 50°С в отсутствии субстрата и до 80°С в присутствии субстрата) и обладают высокой специфической активностью в интервале рН от 6,0 до 11.0.

4. Разработанный радиационной способ получения протеаз Вас.БиЫШБ, иммобилизованных на полиэтиленоксиде 1500, использован нами при создании лекарственного препарата имозимаза, применяемого в медицине в качестве высокоэффективного неполитического средства при лечении гнойно-воспалительных процессов в хирургии, офтальмологии, пульмонологии, гинекологии.

5. При действии на водные растворы полиэтиленоксида ионизирующего излучения с высокой мощностью дозы (5 кГр/с) образуется гидрофильный

гель. Доза гелеобразования зависит от концентрации раствора полиэтилен-оксида.

6. Гель полиэтиленоксида использован нами при получении композиционной лекарственной формы на основе иммобилизованной протеазы (препарата "стоматозим"). Иммобилизованные в геле полиэтиленоксида протеазы Вас.зиЬиНз обладают высокой термостабильностью в отсутствии субстрата (до 24 часов при 50°С) и высокой протеолитнческой активностью в интервале рН от 6,0 до 9,5.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Создание и использование различных лекарственных форм иммобилизованных бактериальных протеаз для лечения гнойных заболеваний // Тез. докл. V Всесоюзного симпозиума по медицинской энзимологии. - М., 1986. - С. 106 (соавт. Л.А. Богданова, A.M. Гончар, В.И. Дерибас, С.И. Смирных).

2. Лечение гнойных ран протеазами, иммобилизованными на различных носителях // Тез. докл.II Всесоюзной конференции " Раны и раневая инфекция ". - М., 1986. - С. 166 -167 (соавт. A.A. Вельш, A.M. Гончар, A.C. Коган, П.Г. Сысолятин).

3. Пролонгированный прогеолиз иммобилизованными бактериальными протеазами и его применение в гнойной хирургии // Тез. докл. XXXI Всесоюзного съезда хирургов. - Ташкент, 1986. - С. 197 - 198 (соавт. С.Н. Бочаров, Б.Е. Ким, A.C. Коган, Р.И. Салганик, Л.А. Семенова, В.Ф. Соботович, Б.Н. Соколов, С.А. Усов).

4. Водорастворимая иммобилизованная протеаза. Получение, свойства и метод количественного анализа II Тез. докл. научно-практической конференции по биотехнологии. - Уфа, 1987. - С. 9 (соавт. Л.А. Богданова, A.M. Гончар).

5. Изучение интратрахеального введения иммобилизованных протеаз в эксперименте // Тез. докл. научно - практической конференции по биотехнологии. - Уфа, 1987. - С. 95 - 96 (соавт. Е.П. Гуляева, И.В. Рожков ).

6. A.c. N 1381401, СССР, МКИ 4, С 01 N 33/52. Способ определения полиэтиленоксида в водных растворах. Заявл. 25.02.86. Опубл. 15.11.87 (соавт Л.А. Богданова, A.M. Гончар, Р.И. Салганик, С.И. Смирных).

7. Исследование свойств бактериальных протеаз, иммобилизованных на водорастворимом полимере // Прикладная биохимия и микробиология, 1987 - Т. XXIII - N 6, - С. 762 - 767. (соавт. Л.А. Богданова, A.M. Гончар, Р.И. Салганик).

8. Создание гелевых форм иммобилизованных ферментов для применения в медицине, ветеринарии, промышленности // Материалы VI Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии. - Вильнюс, 1988.-Ч. II. - С. 58. (соавт. Л.А. Богданова, A.M. Гончар, В.И. Дерибас, Р.И. Салганик, В.Е. Толмачев).

9. Применение иммобилизованных протеолитических ферментов при лечении переломов нижней челюсти, осложненных гнойной инфекцией // Актуальные вопросы гнойной челюстно-лицевой хирургии. Сб. науч. тр. Под ред. проф. А. А. Левенца. - Красноярск, 1988. - С. 134 - 142. (соавт. А. М. Гончар, П. Г. Сысолятин, В. Е. Толмачев).

10. A.c. N 1442548, СССР, МКИ 4, С 12 N 11/00, 9/56. Способ получения иммобилизованного протосубтилина. Заявл. 23.12.85. Опубл. 8.08.88 (соавт. JI.A. Богданова, A.M. Гончар, Т.Ф. Ломовская, А.И. Пахтуев, Л.В. Плаксюк, Р.И. Салганик, С.И. Смирных, Ф.Н. Чегодаев ).

11. Патент N 2003346, Россия, МКИ 5, А 61 К 37/54. Композиция для ферментативного гидролиза белков. Заявл. 31.07.91. Опубл. 30.11.93 (соавт. A.M. Гончар, Р.И. Салганик).

12. Патент N WO 93/20838, США, МКИ 5, А 61 К 37/62, 37/54, 37/547. Метод и композиция для лечения пионекротических процессов. Заявл. 20.04.92. Опубл. 28.10.93 (соавт. A.M. Гончар, Р.И. Салганик).

13. Патент N 2005487, Россия, МКИ 5, А 61 К 37/48. Способ лечения бронхолегочных заболеваний. Заявл. 26.06.89. Опубл. 15.01.94 (соавт.

A.M. Гончар, Б.Е. Ким, A.C. Коган, И.В. Рожков, Р.И. Салганик).

14. Патент N 2007183, Россия, МКИ 5, А 61 К 37/48. Способ лечения кариеса зубов. Заявл. 26.06.89. Опубл. 15.02.94 (соавт. A.M. Гончар, В.И. Дерибас, О.И. Заря, С.А. Лебедев, Р.И. Салганик).

15. Патент N 2026349, Россия, МКИ 6, С 12 N 11/04. Способ получения геля. Заявл. 24.07.89. Опубл. 9.01.95 (соавт. Л.А. Богданова, A.M. Гончар,

B.И. Дерибас, Р.И. Салганик).

16. Патент N 2072866, Россия, МКИ 6, А 61 К 38/43. Способ лечения эндометритов. Заявл. 24.03.92. Опубл. 10.02.97 (соавт. A.M. Гончар, Т.А. Кузнецова, Р.И. Салганик).