Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение штамма - суперпродуцента нейтральной протеазы из бактерий рода Bacillus и разработка промышленного способа его культивирования

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение штамма - суперпродуцента нейтральной протеазы из бактерий рода Bacillus и разработка промышленного способа его культивирования"

На правах рукописи

Нафиков Риф Султанович

Получение штамма - суперпродуцента нейтральной протеазы

из бактерий рода Bacillus и разработка промышленного способа его культивирования

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа -2005

Работа выполнена в лаборатории бактерийных препаратов Уфимского филиала «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник Кузнецова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мелентьев Александр Иванович

доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Айрат Радикович

Ведущая организация: Казанский государственный университет

Защита диссертации состоится « Z8 _» 2005 г. в 14 ч на заседании

Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме

Академии наук Республики Башкортостан по адресу: 450014 г. Уфа, ул. Новороссийская, 105

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке филиала «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским

иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 450014 г. Уфа, ул. Новороссийская, 105

Автореферат разослан « и .» 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Лукманова К.А.

иъчво 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Существенным стимулом для разработки способов получения протеолитических ферментов является растущее использование их в народном хозяйстве. Протеолитические ферменты медицинского назначения применяются в лечении болезней желудочно-кишечного тракта [Резник С.Р., 1995], сердечнососудистой системы [Егоров Н.С., 1996], в хирургии для обработки гнойных ран, ожоговых и обмороженных поверхностей [Салаганик Р.И. и др., 1993; Глянцев С.П., Савина Т.В., 1996]

В медицине до настоящего времени в основном используются протеолитические ферменты животного происхождения. Однако природное сырьё, применяемое для получения ферментов, может включать в себя инфекционные агенты, проонкогены, нуклеиновые кислоты, прионы [Белоусова Е.А. и др., 2003]. Прогеолитические ферменты микробного происхождения лишены этих недостатков. Короткий цикл развития бактерий, высокая длительность хранения фермента без потери его активности, отсутствие затруднений при культивировании и очистке ферментов, всё это делает микроорганизмы перспективными продуцентами ферментов.

Одним из важнейших объектов современной биотехнологии, как продуцентов ферментов, благодаря их многим положительным свойствам, в том числе ферментативной активности, а также производственной технологичности и безопасности для человека являются бактерии Bacillus subtilis. Бактерии Bacillus subtilis продуцируют, как правило, нейтральную и щелочную протеазу [Гребешова Р.Н. и др., 1999; Fredhila S. et al, 2002]. Применение в медицине щелочной протеазы ограничено из-за её специфической активности, т.е. она является поверхностноактивным веществом, обладает гемолитической активностью и адьювантными свойствами [Смирнов В.В. и др., 1982]. В научной литературе имеются сообщения о природных штаммах рода Bacillus -продуцентах нейтральной протеазы, но они или недостаточно активны для производственного применения, или требуют длительного периода культивирования [Шарапов А.П. и др., 1985].

Для получения штаммов, обладающих высокой продукцией нужного метаболита, используются различные пути, в том числе методы генной

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА • ^[¿Петербург Ли*

инженерии, но они длительны и требуют специальных сложных приёмов, а также оценки безопасности их использования.

Одним из доступных способов получения сверхпродуцентов ряда ферментов таких как протеаза, является получение антибиотикоустойчивых мутантов природных штаммов, у которых в результате приобретения плейотропной мутации устойчивости к антибиотикам, часто увеличивается синтез экзоферментов [Дебабов В.Г., Лившиц В.А., 1988; Шарипова М.Р. и др., 1994; Буланцев А.Л. и др., 1995,1998].

Цель исследования

Получение производственного штамма на основе бактерий рода Bacillus -суперпродуцента нейтральной протеазы методом селекции антибиотикоустойчивого мутанта и разработка способа его культивирования с целью получения фермента.

Задачи исследования

1 Получить штамм бактерий рода Bacillus - суперпродуцент нейтральной протеазы методом направленной селекции антибиотикоустойчивого мутанта.

2 Изучить биологические и культуральные свойства селекционированного штамма.

3 Изучить генетические особенности селекционированного штамма в сравнении с исходным штаммом.

4 Разработать научные основы технологии культивирования штамма с целью получения промышленных объёмов протеазы.

5 Изучить влияние высоких концентраций протеазы на штамм - продуцент в процессе культивирования.

Научная новизна

Получен и запатентован новый штамм В. subtilis Р-1-суперпродуцент нейтральной протеазы, являющийся S-формой стрептомицинустойчивого мутанта коллекционного природного штамма В. subtilis 534.

Впервые разработаны научные основы многоциклического процесса культивирования штамма В. subtilis Р-1 с целью получения ферментсодержащей Kynbtyp^Hoft жидкости, включающие: оптимизацию состава питательной среды и технологических параметров процесса культивирования, построение фазового портрета оптимизированного периодического процесса культивирования и прогнозирование на его основе многоциклического процесса, осуществление многоциклического процесса культивирования.

Впервые выявлены адаптивные изменения морфологии и физиологии клеток штамма продуцента В subtilis Р-1 под влиянием высоких концентраций прот сазы в процессе культивирования.

Научно-практическая значимость

Получен производственный штамм В. subtilis Р-1 - суперпродуцент нейтральной протеазы.

Разработана схема получения штаммов - супернродуценюв про1еазы из природных штаммов бактерий рода Bacillus.

Показана возможность геномной паспортизации штаммов - продуцентов бактерий рода Bacillus.

» Разработны способы кулыивирования штамма В. subtilis Р-1 для

получения промышленных объёмов нейтральной протеазы - периодический и многоциклический.

Внедрение результатов исследования в практику

По ма1ериалам диссертации получено два патента Российской Федерации. Нейтральная протеаза, получаемая при культивировании штамма В. subtilis Р-1, может быть использована для ферментолиза мозговой ткани в производстве препарата «Церебролизат» наряду с применяемым в настоящее время Геррилитином.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Новый штамм В. subtilis Р-1 - суперпродуцент нейтральной протеазы.

2 Разработанная схема получения штамма - продуцента нейтральной протеазы, которая включает получение антибиотикоустойчивого мутанта на основе природного штамма В. subtilis 534 в R-форме, проведения гомогенного глубинного культивирования и выделения из популяции S-формы с наибольшей зоной гидролиза казеина.

3 Штамм В. subtilis Р-1 отличный от исходного штамма В. subtilis 534 отсутствием плазмид и внутрихромосомной перестройкой генетического материала.

4 Технология культивирования штамма В subtilis Р-1 периодическим или многоциклическим способом на стандартизованных по составу питательных средах, являющаяся оптимальной для промышленного получения нейтральной протеазы.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на общероссийской научной конференции «Актуальные вопросы диагностики, терапии и профилактики инфекционных заболеваний» (Москва 1997), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммубиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа 2000), международной научно-практической конференции памяти Галины Ивановны Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва 2002), Всероссийской научной конференции молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа 2004). Диссертационная работа доложена и обсуждена на заседании Учёного совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и CP РФ «Иммунопрепарат» (протокол № 1 от 3. 02. 2005 г.)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ, получено 2 начента РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 119 страницах, содержит 19 таблиц и 13 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (3 главы), собственных исследований (пять глав), заключения," выводов. Библиографический список включает 155 источников (127 отечественных и 28 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом исследований служили штаммы В. subtilis 534 и полученные на его основе антибиотикоустойчивые мутанты: штамм В. subtilis ЗН, используемый в производстве препарата бактиспорин и являющийся рифампицинустойчивым мутантом (В. subtilis rif), пенициллинустойчивый мутант (В. subtilis реп'), стрептомицинустойчивый мутант (В. subtilis str4") и В. subtilis Р-1 - суперпродуцент нейтральной протеазы.

В опытах по изучению безвредности селекционированного штамма использовали белых беспородных мышей массой 14-16 г.

В работе применяли методы периодического поверхностного и гомогенного глубинного и многоциклического культивирования микроорганизмов [Баснакьян И. А., 1992].

Выделение бактерий рода Bacillus - продуцента нейтральной нротеазы и их идентификацию проводили методами изложенными в «Методических рекомендациях по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных» [Смирнов В. В. и др., Киев, 1993].

Антагонистические свойства бацилл устанавливали способом отсроченного антагонизма [Егоров Н. С., 1986]. Антибиотикоустойчивость бацилл изучали с помощью стандартных дисков, пропитанных ангибиошками [ЕгоровН. С., 1986].

Изучение безвредности (вирулентность, токсичность, токсигенность) штамма проводили в соответствии с методическими указаниями Минздрава СССР «Постановка исследований для обоснования предельно-допустимых концентраций производственных штаммов микроорганизмов и на их основе готовых форм препаратов в воздухе рабочей зоны» (М., 1983) и «Методическими рекомендациями по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных» [Смирнов В. В. и др., Киев, 1993].

Протеолитическую активность культуральной жидкости определяли экспресс методом, изложенным в ФС 42-2245-90 на Террилитин сухой.

Биохимические свойства изучали согласно методическим рекомендациям по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных [Смирнов В. В.и др., Киев, 1993].

Содержание растворённого в культуральной жидкости кислорода peí истрировали полярографическим методом с использованием мембранного датчика кислорода со свинцово-платиновыми электродами и ацетатным буфером в качестве приэлектродной жидкости.

Изучение морфологии клеток проводили с применением оптического микроскопа «МБИ-6». Окраску бактерий производили по Граму.

Количество бактериальных клеток в культуральной жидкости устанавливали по её мутности в оптических единицах (ОЕ), используя стандартный образец мутности па 10 ЕД и фотоэлектроколориметр КФК-2МП при длине волны Х=540 нм.

Для определения соотношения нейтральной и щелочной протеазы, проводили исследование культуральной жидкости с помощью специфических ингибиторов протеаз [Долидзе Д. А. и др., 1974].

Внехромосомные элементы генома бактерий выделяли методом щелочного лизиса в модификации [Маниатис Т. и др., 1984]. Фракционирование препарата ДНК осуществляли методом электрофореза в трис-ацетатном (ТАЕ) буфере. Анализ геномного полиморфизма штаммов проводили методом RAPD (Random Amplified Polymopphic DNA). Для паспортизации и последующей идентификации штамма применяли метод концевого мечения рестриктазных фрагментов (КМРФ). Для проведения RAPD и КМРФ, ДНК выделяли фенольно-детергентным методом [Graham D.E., 1978], RAPD анализ проводили в амплификаторе PEA 3002 (Labotek, Латвия), с применением 15-звенного праймера.

Для проведения КМРФ ДНК бактерий расщепляли рестрикционной эндонуклеазой Hind III в буфере рекомендованном поставщиком (MBI Fermentas, Литва). Мсчение 3 -концов с помощью [a-j2 Р] 1 дАТФ (Нуклид-Транс, Обнинск) осуществляли Клёновским фрагментом ДНК полимеразы I (MBI Fermentas, Литва) в том же буфере. Меченные Hind Ill-фрагменты прогревали при 85 °С в течение 2 мин. и разделяли в денатурирующих условиях в секвенирующем 6 %-ном иолиакриламидном i еле с 7 М мочевиной в приборе Макрофор (Pharmacia-LKB, Швеция).

Статистическую обработку результатов проводили на основе статистических методов [Ашмарин И. П., Воробьёв А. А., 1962].

Результаты исследований и их обсуждение

Одним из путей создания производи!венных штаммов - продуцентов ферментов на основе бактерий является получение антибиотикоустойчивых мутантов, у которых отмечается повышенный синтез экзоферментов в культуральной жидкости [Дебабов В.Г., Лившиц В.А., 1988; Шарипова М.Р. и др., 1994; Буланцев А.Л. и др., 1995, 1998].

Стрептомицин является часто используемым антибиотиком для получения штаммов микроорганизмов - продуцентов ферментов, в том числе и протеазы [Балабан П.П. и др., 2003].

Для получения стрсптомицинустойчивого муганга штамм В. subtilis 534 многократно пересевали на плотные и жидкие питательные среды с

возрастающей концешрацией стрептомицина (от 10 мкг/мл до 2000 мкг/мл). В результате ступенчатой селекции с чередованием пассажей па жидкую и твёрдую питательные среды, был получен стрептомицинустойчивый штамм В. БиЬ^Пв б1г+. Для оценки уровня продукции протеазы популяции исходного и полученного штаммов высевали на 1 % казеиновый агар моноспоровым рассевом и измеряли в миллиметрах диаметр зоны просветления среды вокруг колоний через (18±1) часов выращивания при (37±1) °С. В результате было выявлено, что эти штаммы имеют разный уровень продукции протеазы, т.е. образуют разные по величине зоны гидролиза казеина: штамм В.БиЫШБ 534 - (6,0+0,5) мм, штамм В-виЫШв - (13,0±2,0) мм.

Признак стрептомицинустойчивости был стабильным при пассажах культуры клеток штамма В.виЫШя на твёрдой питательной среде и не утрачивался популяцией в течение 10 пассажей при поверхностном культивировании на средах без добавления стрептомицина с сохранением свойства повышенной продукции протеазы.

При выращивании бактериальной популяции клеток стрептомицинусгойчивого мутанта в бутылях, на жидкой питательной среде без стрептомицина, в течение 3 суток с принудительной аэрацией происходила диссоциация популяции на К- и Б- формы. И-форма стабильно сохраняла стрептомицинустойчивость, в то время как Б-форма утрачивала свойство стрептомицинустойчивости, но приобретала устойчивость к антибиотикам /3-лактамного ряда. При изучении способности продуцировать протеазу исследуемыми штаммами выше описанным методом было выявлено, что И- и Б-формы имели разный уровень продукции протеазы, причём Б-формы имели зоны гидролиза казеина больше чем Я-формы (рисунок 1).

Для установления закономерности выявленного свойства, повышенной продукции протеазы Б-формой по сравнению с И-формой, проведено сравнительное изучение уровня продукции протеазы диссоциативными Я-и Б-формами исходного штамма В. виЫШв 534 и его антибиотикоустойчивых мутантов: В. виЫШв п^, а также полученных нами В. виЫШв бЬ^и В. виЫШв реп+ (таблица 1).

Рисунок 1 - Я- и Я-формы штамма В. эиМШя ей-* на казеиновом агаре

Таблица 1 - Уровень продукции протеазы исходным штаммом и антибиотикоустойчивыми мутантами

Исходный штамм В.зиЫШз 534 Антибиотикоустойчивые мутанты штамма В.виЫШв 534

В.виЫШв пГ(ЗН) В.виЫШз В.виЫШв реп+

Зона гидролиза казеина, мм

1 Я-вар 2 3 4 5 6 7 8

8-вар И-нар Б-вар И-вар Э-вар Я-вар Э-вар

2,0±0,5 4,0+0,5 4,0±1,1 10,0+1,0 13,0±2,0 30.0±2.0 5,0±1,1 12,0±1,5

Р ,.2 < 0,05 Рз-4 < 0,05 Р2-4 < 0,05 Р5 в < 0,05 Р2-6 < 0,01 Р.-б<0,01 Р7-8<0,05 Р2-8 < 0,05

* - Представлены средние данные 8 опытов

Из таблицы следует, что антибиотикоустойчивые мутанты имеют зоны гидролиза казеина больше, чем исходный штамм; диаметр зоны гидролиза Б-форм выше, чем у Л-форм примерно в 2 раза. Самая большая зона гидролиза наблюдается у 8-формы стрептомицинустойчивого мутанта.

Таким образом, результаты проведённых исследований уровня продукции протеазы диссоциативными вариантами исследованных штаммов показали, что самый высокий уровень продукции протеазы у Б-формы стрептомицинустойчивого мутанта - В. энЫШб вЦ-"1".

В результате проведенных экспериментов была разработана схема получения штаммов-продуцентов протеазы.

Рисунок 2 - Схема получения штамма-продуцента протеазы

Из схемы следует, что в результате воздействия антибиотика на исходный природный штамм бактерий рода Bacillus в R-форме получают антибиотикоустойчивый мутант в R-форме, из которого выделяют в результате проведения гомогенного глубинного культивирования S-форму - продуцент протеазы. В данном конкретном случае исходным являлся штамм В. subtilis 534 и из него получен продуцент протеазы, названный В. subtilis Р-1.

С целью сравнения продукции протеазы проведено культивирование S-формы исходного В. Subtilis 534 и полученного В. Subtilis Р-1 штаммов, в ферментёре АК-10 на синтетической питательной среде Егорова с добавлением пептона 5 г/л и 1 % мальтозы.

После проведения процессов культивирования было выявлено, что активность протеазы в культуральной жидкости штамма В. subtilis 534 составляла (0,4±0,01) ПЕ/мл, а штамма В. subtilis Р-1 (8,2±0,04) ПЕ/mji, т.е. превышала продукцию протеазы исходным штаммом в 20 раз (рисунокЗ). Следовательно получен штамм В. subtilis Р-1, являющийся суперпродуцентом протеазы по сравнению с исходным штаммом В. Subtilis 534.

Рисунок 3 - Уровень продукции протеазы S-формой штаммов

В. Subtilis 534 и В. subtilis Р-1 при жидкостном кулы ивировании

* - Различие штаммов (В. subtilis 534 и В. subtilis Р-1) статистически значимы (Р< 0,01), приведены средние данные 6 опытов.

Известно, что шгаммы В. subtilis синтезируют одновременно нейтральные и щелочные протеазы [Мосолов В. В., 1971; Гребешова Р. Н. и др., 1999; Fredhila S. et al, 2002]. Для выявления их содержания в к/ж жидкости штамма В. subtilis Р-1 мы воспользовались свойством ингибиторов по разному влиять на эти протеазы.

Инактивацию металлосодержащих нейтральных протсаз в к/ж осуществляли обработкой двунатриевой солыо этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТЛ), а щелочные сериновые протеазы ингибировали диизопропилфторфосфатом (ДФФ) [North М. I., 1982; Харвурд К., 1992]. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Полученные данные позволили установить, что штамм В. subtilis Р-1 продуцирует на 99 % мегаллосодержащую нейтральную прогеазу и около 1 % щелочной протеазы.

Таблица 2 - Влияние ингибиторов на протеолитическую активность культуральной жидкости штамма В. $иЬНН$ Р-1

Концентрация ингибитора, моль Остаточная протеолитическая активность, %

ЭДТЛ ДФФ

110"5 30±0,7 99±0,3

1-Ю"4 23±0,5 99±0,5

1-Ю"1 10±0,5 99±0,7

МО"'' 1±0,02 99±0,7

контроль 100 100

* - Приведены средние данные 5 опытов

Определение значений рН, в пределах которых протеолитический ферментный комплекс проявляем свою активность, подтвердило преимущественное содержание нейтральной протеазы и минорное содержание щелочной (таблица 3).

Таблица 3 - Определение рН-оптимума протеолнтической активности к/ж штамма В. виЬйНв Р-1

Значения рН 4,5 5,0 6,0 7,0 7,4 8,0 9,0 9,2 10,0 11,0 12,0 12,5

Активность,% к контролю 0 10 50 90 100 55 30 10 5 1,0 1,0 0

* - Приведены средние данные 5 опытов

Как следует из представленных данных, протеолитическая активность к/ж наблюдалась в интервале значений рН от 5,0 до 9,2 с наибольшей активностью в пределах рН от 7,0 до 7,4 и имела 1 пик максимума при рН=7,4, что свидетельствовало о наличии одной протеазы с действием в нейтральной области рН -- нейтральной протеазы

Полученные данные показывают, что штамм В. зиЫШз Р-1 является продуцентом нейтральной протеазы.

Изучение морфологических свойств исследуемых штаммов показало, что исходный штамм - В. виМИз 534 и полученный - В. виЫШз Р-1 имеют некоторые различия: штамм В. зиЬШ1я 534 имеет размеры (0,3-0,7 х 1,8) мкм, штамм В. виЫШэ Р-1 - (0,5-0,7 х 1,3) мкм. Установлено, что штамм В. зиМИБ Р-1 аспорогенен (в популяции могут лишь иногда встречаться единичные споры), тогда как штамм В. виЬйНв 534 является спорообразующей палочкой до 100%.

Другие морфологические свойства сравниваемых штаммов аналогичны друг другу и характерны для первой группы рода Bacillus подгруппы Б: клетки не раздуваются при спорообразовании, споры элипсовидныс, расположены центрально, не образуют глобул в цитоплазме клеток при выращивании на глюкозном агаре. Оба штамма аэробы, грамположительные, обладают подвижностью, оптимальный рост при температуре 37 °С и pH 6,0-7,5.

Изучение морфологии колоний штамма В. subtilis Р-1 на 1 % казеиновом агаре показало, что штамм В. subtilis Р-1 образует белые круглые крупные, колонии с ровными краями (рисунок 1). При культивировании штамма В. subtilis Р-1 на мясопептонном бульоне (МПБ) при температуре 37 °С через 18 - 24 ч наблюдается равномерное помутнение бульона.

Полученный штамм В. subtilis Р-1 отличается от исходного штамма В. subtilis 534 не только морфолого-культуральными признаками, но и некоторыми биохимическими свойствами: наличием фибринолизина, повышенной способностью к редукции нитратов и гидролизу мочевины.

С целью установления безвредности штамма изучали вирулентность токсичность, токсигенность. Установили, что штамм В. subtilis Р-1 безвреден (нетосичен, нетоксигенен, невирулентен).

Изучение антибиотикоустойчивости стрептомицинустойчивого мутанта выявило различие устойчивости у S- и R-форм. R-форма устойчива к полимиксину, стрептомицину и рифампицину, S-форма (B.subtilis Р-1) устойчива к полимиксину, карбенициллину, пенициллину, ампициллину и оксациллину, но чувствительна к стрептомицину и рифампицину.

При многократных пересевах (5-7 пассажей) культуры клеток штамма B.subtilis Р-1 через твердые питательные срсды не содержащие антибиотик, из нее выщеплялась R-форма, устойчивая только к полимиксину (как и исходный штамм B.subtilis 534).

Селекционированный штамм В. subtilis Р-1, обладающий повышенной продукцией протеазы, устойчивостью к ряду антибиотиков, и характеризующийся безвредностью, может быть использован в качестве суперпродуценза нейтральной протеазы.

Получение новых производственных штаммов требует изучения его генетических особенностей. В связи с чем проведили исследование на содержание плазмид у клеток исходного штамма В. subtilis 534, а также у штаммов В. subtilis str+ (R-форма) и В. subtilis Р-1 (S-форма). Шзамм

В ьиЫтШ 534 выбран в И-форме, так как па форма являлась исходной для получения птгамма В йиЬи!¡8 Р-1 Провели электрофорез гшазмидной ДНК, вг.щеленной и? клеток исследуемых штаммов. На рисунке 4 представлены плазмидные профили.

При сравнении электрофореграмм с плазмидными профилями исходного шгамма и его сфептомицинусгойчивого мутанта обнаружили, что исследуемые штаммы имеют различный плазмидный состав. На дорожке

электрофореграммы, соо1ветс!вующей штамму В. хиЬпН8 534 видны плазмиды мелкого и крупного размера. На дорожке соответствующей Н-форме штамма В виМЛ^э присутствуют плазмиды мелкого и средне! о размера. У 8-формы штамма В.БиЫШв 5(г\ с помощью электрофореза плазмид не выявлено. Возможно, происходит встраивание плазмид в бактериальную хромосому при диссоциативных переходах, или их потеря.

12 3 4

Рисунок 4 - Плазмидные профили исследуемых штаммов В. яиЬШк

1 -исходный штамм - В. зиЫШз 534; 2 - В. виЬьНв з1т+ (Я-форма); 3 - В. БиЫШБ Р-1 (8-форма); 4 - фаг X, расщеплённый рестриктазой Вв1Е II.

Частая потеря плазмид, при диссоциативных переходах описана у других бацилл [Jensen S. et al, 1995; Лотарёва О.В., 2002].

Для выявления возможной вариабельности диссоциантов на уровне ДНК исходного штамма В. subtilis 534, а также В. subtilis str+ и В. subtilis Р-1 произвели анализ геномного полиморфизма методом RAPD, заключающийся в проведении ПЦР с использованием относительно короткого (15-звенного) праймера.

Полученные данные показали, что в структуре генома исходного штамма и стрептомицинустойчивого варианта имеются различия. Обнаруженные различия Могут быть обусловлены перестройкой генетического материала исходной культуры, что приводит к появлению вариантов с изменённым фенотипом.

12 3 4

Рисунок 5 - Сравнительный анализ ЯАРО исследуемых штаммов В. виЫШв

1 - исходный штамм В. виЫПю 534; 2 - В. зиЬйНя яй^ (К.- форма); 3 - В. виЫШэ Р-1 (Б-форма); 4 - фаг X, расщеплённый рестриктазой Вз1Е II.

Для паспортизации и последующей идентификации штамма В. виЫШв Р-1 применён метод концевого мечения рестриктазных фрагментов (КМРФ). Данный метод позволяет идентифицировать полосы, принадлежащие фрагментам ДНК, с

точностью до одного нуклеогида. На фрагментах ДНК, показанных на рисунке 6, для штаммов В. зиЫШв 534, В. эиЫШя яи-*, В. зиЫШв Р-1, характерно наличие большого числа совпадающих полос, более или менее равномерно распределенных по длине трека. Вместе с тем можно отметить присутствие ряда полос, позволяющих выявить различия между этими штаммами.

Зи1;

!- !- г

12 3 12 3

А Б

Рисунок 6 - Радиоавтограф КМРФ анализа штаммов В.яиЫШв

А - радиоавтограф полиакриламидного геля; Б - схема оцифрованного радиоавтографа. 1 - исходный штамм В. виЫШБ 534; 2 - В. виЫШв эй-*; 3-В. виЫШкР-!

Популяцию штамма В. яиЫШя Р-1 размножили путем посева на матрасы с МПА, смыли сахарозо-желатиновой средой, разлили в ампулы и лиофильно высушили. Изучили сшбильность высушенного штамма В. виЫШв Р-1 в процессе хранения. Результаты исследования показали, что лиофильно высушенный штамм В. виЫШв Р-1 является стабильным в течении 3 лет при температуре хранения (6±2) °С (количество Я-форм не превышает 7 %). При других температурах хранения происходила постепенная реверсия лиофильно высушенного штамма в И-форму и снижение продукции протеазы штаммом.

Для разработки технологии получения фермента на основе штамма В-виМНв Р-1 необходимо было изучить кинетику роста микроба и продукцию протеазы в периодическом процессе культивирования. Для этого требовалось подобрать жидкую питательную среду для культивирования в реакторе, позволяющую получать в культуральной жидкости достаточное количество протеазы с высокой активностью.

При оптимизации состава питательной среды за основу выбрали синтетическую среду Егорова (1989). В результате проведённых экспериментов установили, что оптимальным углеводом для продукции протеазы штаммом В.зиЫШв Р-1 является мальтоза в концентрации (1-5) %. В качестве источника азота наилучшими оказались дрожжевой экстракт и мочевина.

Подбор параметров культивирования показал, что посевная доза равная (2,0 ± 0,2)-109 кл/мл является оптимальной для обеспечения максимальной продукции протеазы штаммом В. виЫШв Р-1. Количество подаваемого воздуха должно соответствовать (60 ± 5) % от полного насыщения среды, частота вращения мешалки ( 400 ± 10) мин*', температура (37 ± 1) °С.

Процесс периодического, гомогенного глубинного культивирования штамма В. БиЬиНв Р-1 был осуществлён в реакторе БИОР - 0,1. График, отражающий рост культуры и накопление протеазы в оптимизированном периодическом процессе культивирования штамма В. яиЬйНз-Р-1 представлен на рисунке 7.

Как следует из рисунка, на графике отсутствует лаг-фаза и синтез протеазы начинается с первых часов роста культуры. Рост биомассы сопровождается увеличением активности протеазы. При переходе в стационарную фазу роста активность протеазы продолжает возрастать.

- млрд кл/мл лротеопитическая активность

Рисунок 7 - Динамика роста и накопление протеазы штамма В. зиЬйПа

Р-1 в периодическом гомогенном глубинном культивировании

Исследование морфологической стабильности популяции в динамике процесса культивирования штамма В.эиЫШз Р-1 показало, что после 22 часов роста при высоких концентрациях протеазы изменяется морфология и физиология штамма - продуцента. При активности протеазы в культуральной жидкости более 24 ПЕ/мл, в популяции появлялись клетки, дающие особый тип колоний. Эти клетки теряли способность роста на обычных плотных питательных средах (МПА, картофельный агар) и образовывали «карликовые» колонии (мелкие, круглые или неправильной формы) на средах, содержащих казеин или на «голодном» агаре с 1 % казеином (рисунок 8). При исследовании этих клеток на способность продуцировать протеазу на 1 % казеиновом агаре, установили, что продуктивность их не высокая (зона гидролиза казеина менее 2,0 мм).

Пересевы популяции карликовых колоний через плотные или жидкие питательные среды, содержащие казеин, приводили к восстановлению способности роста на обычных питательных средах, не содержащих казеин. Указанные факты дали возможность предположить, что появление карликовых колоний не является контаминацией популяции клеток штамма В. ЗиЬиПэ Р-1, а является следствием адаптивного изменения морфологии и физиологии клеток в ответ на воздействие высоких концентраций протеазы в культуральной жидкости.

С целью проверки этого предположения проведены исследования по изучению влияния разных концентраций протеазы на физиологию клеток культуры

В. виЬйНБ Р-1. Для этого готовили ряд последовательных разведений фермента в МПБ с протеолитической активностью (10, 20, 24, 30, 40, 50) ПЕ/мл и вносили суспензию клеток штамма В. БиЫШз Р-1 с концентрацией 1-Ю8 кл/мл. После инкубации в термостате при температуре 37 "С в течение (18±1) час производили посев культуры на МПА и на 1 % казеиновый агар методом 10-кратных разведений.

Рисунок 8 - Карликовые колонии штамма В. яиЬННв Р-1 на казеиновом агаре

Доля карликовых колоний в популяции штамма зависела от концентрации протеазы (таблица 4).

Полученные данные указывают, что под влиянием высоких концентраций протеолитического фермента (24 ПЕ/мл и выше) происходит адаптивное изменение морфологии и физиологии клеток популяции штамма В. здЫШз Р-1, выражающееся в утрате способности роста на обычных питательных средах, не содержащих казеин, и образовании мелких карликовых колоний, выявляемых на средах с казеином. Адаптивное изменение клеточной популяции является обратимым и после пересевов через среды, содержащие казеин, без протеазы, физиология и морфология клеток восстанавливается.

Таблица 4 - Количество выявленных карликовых колоний в популяции штамма В. виЬйИв Р-1 в зависимости от активности протеазы

Активность протеазы, ПЕ/мл 10 20 24 30 40 50

Число карликовых колоний, % 0 0 10,0±3,7 62,0±3,2 78,0±2,2 94,0±3,3

* - В таблице представлены средние данные 5 опытов.

Для увеличения продуктивности процесса получения ферментсодержащей культуральной жидкости разработан отъёмно-доливной процесс культивирования штамма В. зиЫШв Р-1 на основе оптимизированного периодического процесса. Степень оптимизации периодического процесса культивирования штамма В. виЫШя Р-1 с целью получения нейтральной протеазы оценивали графическим методом построения фазового портрета, отражающего зависимость уровня протеазы от количества клеток штамма — продуцента (рис. 9). Фазовая траектория оптимизированного процесса представляет собой прямую линию, что отражает высокую степень его оптимизации и даёт возможность прогнозирования множества непрерывных процессов по любой точке, лежащей на этой прямой, или сливно-доливных процессов с различной длительностью цикла.

При осуществлении прогноза на основе оптимизированного периодического процесса культивирования мы исходили из того обстоятельства, что требуется получить культуральную жидкость с высоким уровнем протеолитической активности, однако необходимо было устранить негативное воздействие высокой активности протеазы на клетки штамма-продуцента, поскольку клетки продуцента будут использоваться в'последующих циклах. Поэтому для нас представлял практический интерес момент достижения активности протеазы в культуральной жидкости 22'"ПЕ/мл. На рисунке 7 показано, что активность протеазы 22 ПЕ/мл, соответствовала 20 часам от начала роста культуры. Биомасса к этому времени составляла 18-Ю9 кл/мл и находилась в фазе замедления скорости роста.

1,9 4,6 5,6 6,8 8,4 11 12,5 14,5 16 163 18 20 млрд. кл ип

Рисунок 9 - Фазовый портрет оптимизированного процесса культивирования В. виЬНИР-!

В этой фазе клетки продуцента обладали высокой физиологической активностью, способностью возобновить рост при доливе свежей питательной среды и не были подвержены адаптивному изменению морфологии под воздействием высокой активности протеазы.

На основании полученных данных был осуществлён отьёмно-доливной процесс культивирования В. киЫШя Р-1 на синтетической питательной среде с мочевиной и дрожжевым экстрактом. Выращивание культуры бактерий проводили в реакторе БИОР - 0,1 с коэффициентом заполнения аппарата 0,7. При достижении концентрации биомассы (18±1) 109кл/мл и уровня протеазы (22±1) ПЕ/мл, в оптимизированном процессе периодического культивировании, сливали половину объёма реактора культуральной жидкости и доливали равный объём свежей питательной среды. После отъёма культуральной жидкости и долива свежей питательной среды концентрация микроорганизмов, а также и уровень активности протеазы снижались примерно в два раза и восстанавливались до исходного значения за 4 часа (рисунок 10). Многоциклический процесс позволил повысить производительность получения протеазы за счёт сокращения времени, необходимого для получения промышленных объёмов ферментсодержащей культуральной жидкости. Таким образом, разработали промышленную технологию культивирования штамма В.зиЫШБ Р-1 для получения нейтральной протеазы периодическим или многоциклическим способом.

час

Рисунок 10 - Отьёмно-доливной процесс культивирования штамма В. виЬйНв Р-1 на питательной среде с мочевиной и дрожжевым экстрактом

Выводы

1 Получен и запатентован новый штамм B.subtilis Р-1 суперпродуцент нейтральной протеазы, позволивший увеличить выход фермента по сравнению с исходным штаммом B.subtilis 534 в 50 раз, т.е. с 0,4 ПЕ/мл до 20 ПЕ/мл.

2 Установлено, что штамм B.subtilis Р-1 аэроб, грамположительный, спор не образует, устойчив к пенициллину, а также к его аналогам (карбенициллину, оксациллину, ампициллину) и полимиксину, штамм безвреден (нетоксичен, нетоксигенен, невирулентен).

3 Разработана схема получения штаммов - продуцентов протеазы из природных штаммов бактерий рода Bacillus.

4 Показано, что штамм B.subtilis Р-1 отличается от исходного штамма B.subtilis 534 отсутствием плазмид и перестройкой генетического материала бактериальной хромосомы.

Для геномной паспортизации штаммов бактерий рода Bacillus может использоваться метод концевого мечения рестриктазных фрагментов ДНК, позволяющий получать индивидуальный геномный портрет культуры штамма в виде штрих-кода.

5 Оптимизирован периодический процесс Гомогенного глубинного культивирования штамма B.subtilis Р-1 в ректоре и на'его основе осуществлён отъёмно-доливной процесс культивирования с целью получения промышленных объёмов нейтральной протеазы.

6 Установлено адаптивное, обратимое изменение морфологии и физиологии клеток штамма продуцента B.subtilis Р-1 в процессе культивирования в ответ на влияние высокой концентрации протеазы в культуральной жидкости.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Михайлова H.A., Кузнецова Т.Н., Зобова Т.И., Холодная Ж.В., НафиковР.С. Технологические аспекты одновременного получения бактерийного препарата-пробиотика и протеолитического фермента при культивироании Bacillus subtilis // 2-й съезд биохим. О-ва РАН: Тез. докл. -Москва, 1997.-С. 516-517.

2 Михайлова H.A., Кузнецова Т.Н., Зобова Т.Н., Холодная Ж.В., НафиковР.С. Новый лечебно-профилактический препарат бактаспорин // Актуальные вопросы диагностики, терапии и профилактики инфекционных заболеваний: Тез. докл.. - Москва, 1997. - С. 28.

3 Холодная Ж.В., Кузнецова Т.Н., Нафиков P.C. Изучение влияния источников углевода на синтез экзопротеазы при культивировании Bacillus

2005-4 45460

subtilis // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Мат. конф. - Уфа, 2000. -42- С. 8-10.

4 Холодная Ж.В., Кузнецова Т.Н., Нафиков P.C. Изучение субстратной специфичности протеолитнческого ферментного препарата «Бактилин» // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Мат. конф. - Уфа, 2000. -42,-С. 10-12.

5 Кузнецова Т.Н., Михайлова H.A., Нафиков P.C. Изучение свойств антибиотикоустойчивых мутантов штамма Bacillus subtilis // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Мат. конф. - Уфа, 2000. -41.- С.184-185.

6 Нафиков P.C., Кузнецова Т.Н. Изучение вариабельности геномов штаммов Bacillus subtilis - основы пробиотических препаратов И Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования: Мат. конф. - Москва, 2002. - С. 21.

7 Нафиков P.C., Кузнецова Т.Н. Культивирование штамма Bacillus . subtilis Р-1 с целью получения протеолитнческого фермента // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии: Мат. конф. - Уфа, 2004.- С. 229-331.

8 Кузнецова Т.Н., Нафиков P.C., Садыкова А.Ф. Изучение влияния протеазы на культурально-морфологические свойства штамма Bacillus subtilis Р-1 // Медицинские иммунобиологические препараты в 21 веке: разработка, производство и применение: Мат. конф. - Уфа (в печати).

9 Способ получения протеолитических ферментов из бактерий рода Bacillus: Пат. 2112035 РФ / H.A. Михайлова, Т.Н. Кузнецова, Т.И. Зобова, P.C. Нафиков, Ж.В. Холодная. - Заявл. 23.01.97; 0публ.24.06.97. //Бюл. - 1998. - №15.

10 Штамм Bacillus subtilis P-l - Продуцент протеазы: Пат. 2208633 РФ / -Т.Н. Кузнецова, P.C. Нафиков, М.М. Алсынбаев, В.Ф. Кулагин. - Заявл. 14.11.01; 0публ.20.06.03. // Бюл. - 2003. - № 20.

Подписано в печать 25.03.2005. Формат 60*84/16. Бумага типографская Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,2. Уч.-изд. л. 1,4 Тираж 100 экз. Заказ № 199 Издательство Башкирского государственного аграрного университета Типография Башкирского государственного аграрного университета Адрес издательства И типографии: 450001, г. Уфа, ул. 50 лет Октября, 34

2 2 АПР 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нафиков, Риф Султанович

Введение

Обзор литературы

Глава 1 Протеазы, продуцируемые бактериями рода Bacillus

Глава 2 Диссоциация бактерий рода Bacillus

Глава 3 Генетические основы получения штаммов бактерий рода Bacillus - продуцентов ферментов

Собственные исследования

Глава 4 Материалы и методы исследований

4.1 Материалы исследований

4.2 Методы исследований

Глава 5 Получение штамма - суперпродуцента нейтральной протеазы из бактерии Bacillus subtilis 534

5.1 Селекция штамма бактерии рода Bacillus - продуцента протеазы

5.2 Изучение продукции протеазы диссоциативными R- и S-формами исходного штамма В. subtilis и его антибиотикоустойчивых мутантов

5.3 Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма В. subtilis Р-1

5.4 Изучение чувствительности штамма В. subtilis Рк антибиотикам

5.5 Изучение безвредности штамма В. subtilis Р-1

5.6 Исследование генетических особенностей штамма В. subtilis Р-1

5.7 Генетическая паспортизация штамма В. subtilis Р-1

5.8 Изучение влияния ингибиторов на активность продуцируемого фермента

Глава 6 Разработка технологии получения нейтральной протеазы на основе штамма В.БиЫШэ Р-1

6.1 Оптимизация питательной среды для культивирования штамма В.БиЫШБ Р-1

6.2 Подбор параметров культивирования штамма В.зиЫШз Р-1

6.3 Разработка многоциклического (отъёмно-доливного) процесса культивирования штамма В.БиЫШБ Р-1

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение штамма - суперпродуцента нейтральной протеазы из бактерий рода Bacillus и разработка промышленного способа его культивирования"

Существенным стимулом для разработки новых способов получения протеолитических ферментов является растущее использование их в народном хозяйстве. Важнейшей областью применения протеолитических ферментов является медицина. Нейтральная протеаза широко используется в лечении болезней желудочно-кишечного тракта [Резник С.Р., 1995], сердечно-сосудистой системы [Егоров Н.С., 1996], в хирургии для обработки гнойных ран, ожоговых и обмороженных поверхностей [Салаганик Р.И. и др., 1993; Глянцев С.П., Саввина Т.В., 1996], а также для лечения некоторых опухолей [Гулько Л.Б. и др., 2000].

Применение в медицине щелочной протеазы ограничено из-за её специфической активности, т.е. она является поверхностноактивным веществом и обладает гемолитическими свойствами [Смирнов В.В., 1982]. Щелочные протеазы используют в качестве добавок к стиральным порошкам, в лёгкой и пищевой промышленности [Харвурд К., 1992; Mala В. et al, 1998]. Кроме того, щелочные протеазы способствуют колонизации грамотрицательных бактерий на поверхности слизистой и коже [Бондаренко В.М. и др., 2002].

В медицине до настоящего времени, в основном, используются протеолитические ферменты животного происхождения [Белоусова Е.А. и др., 2003]. Однако, природное сырьё может включать в себя инфекционные агенты, проонкогены, нуклеиновые кислоты, прионы. Протеолитические ферменты микробного происхождения лишены этих недостатков. Короткий цикл развития бактерий, длительное хранение фермента без потери его активности и отсутствие затруднений при очистке, всё это делает микроорганизмы перспективными продуцентами ферментов.

Растущее применение протеолитических ферментов микробного происхождения в народном хозяйстве и медицине выдвигает важную задачу поиска удобных и экономичных продуцентов протеаз. Помимо уровня продукции у штаммов продуцентов немаловажное значение придаётся исследованиям, направленным на изучение токсигенности и токсичности этих штаммов с целью исключения вредного воздействия метаболитов, продуцируемых наряду с протеолитическими ферментами [Хотимченко С.А., 2003].

Одним из важнейших объектов современной биотехнологии, как продуцентов ферментов, благодаря их многим положительным факторам, в том числе ферментативной активности, а также производственной технологичности и безопасности для человека являются бактерии Bacillus subtilis. В научной литературе имеются сообщения о природных штаммах рода Bacillus - продуцентах протеолитических ферментов, но они или недостаточно активны для производственного применения, или требуют длительного периода культивирования [Шарапов А.П. и др., 1985]. Имеются также штаммы бацилл, которые могут давать протеазу с большой активностью, но она не стабильна, так как для их культивирования требуется питательная среда, состоящая из нестандартных компонентов.

Для получения штаммов, обладающих высокой продукцией нужного метаболита, используются различные пути, в том числе методы генной инженерии, но они длительны и требуют специальных сложных приёмов. Кроме того, для генетически модифицированных штаммов необходима комплексная оценка их безопасности для внедрения в окружающую среду.

Одним из доступных способов получения суперпродуцентов ряда ферментов, таких как протеаза, щелочная фосфотаза является получение антибиотикоустойчивых мутантов природных штаммов методом направленной селекции, у которых в результате приобретения плейотропной мутации устойчивости к антибиотикам, часто увеличивается синтез экзоферментов [Дебабов В.Г., Лившиц В.А., 1988; Шарипова М.Р. и др., 1994; Буланцев А.Л. и др., 1995, 1998; Нехотяева Н.В., 1995; Кругликов В.Д. и др., 1996; Ito S. et al., 1991; Gileadi О. et al., 1992].

Цель исследования

Получение производственного штамма на основе бактерий рода Bacillus - суперпродуцента нейтральной протеазы методом селекции антибиотикоустойчивого мутанта и разработка способа его культивирования.

Задачи исследования

1 Получить штамм бактерий рода Bcillus - суперпродуцент нейтральной протеазы методом направленной селекции антибиотикоустойчивого мутанта.

2 Изучить биологические и культуральные свойства селекционированного штамма.

3 Изучить генетические особенности селекционированного штамма в сравнении с исходным штаммом.

4 Разработать научные основы технологии культивирования штамма с целью получения промышленных объёмов протеазы.

5 Изучить влияние высоких концентраций протеазы на штамм -продуцент в процессе культивирования.

Научная новизна

Получен и запатентован новый штамм В. subtilis Р-1-суперпродуцент нейтральной протеазы, являющийся S-формой стрептомицинустойчивого мутанта коллекционного природного штамма В. subtilis 534.

Впервые разработаны научные основы многоциклического процесса культивирования штамма В. subtilis Р-1 с целью получения ферментсодержащей культуральной жидкости, включающие оптимизацию состава питательной среды, технологических параметров процесса культивирования, построение фазового портрета оптимизированного периодического процесса культивирования и прогнозирование на его основе многоциклического процесса и его осуществление, изучение влияния высоких концентраций протеазы на штамм - продуцент.

Впервые выявлено адаптивное изменение морфологии и физиологии клеток штамма продуцента В. subtilis под влиянием высоких концентраций протеазы в процессе культивирования.

Начно-практическая значимость работы

Получен производственный штамм В. subtilis Р-1 - суперпродуцент нейтральной протеазы.

Разработана схема получения суперпродуцентов протеазы из природных штаммов бактерий рода Bacillus.

Показана возможность геномной паспортизации штаммов -прдуцентов бактерий рода Bacillus.

Разработаны способы культивирования штамма В. subtilis Р-1 для получения промышленных объёмов нейтральной протеазы - периодический и многоциклический.

Внедрение результатов исследования в практику

По материалам диссертации получено два патента Российской Федерации.

Нейтральная протеаза, получаемая при культивировании штамма В. subtilis Р-1, может быть использована для ферментолиза мозговой ткани в производстве препарата «Церебролизат» наряду с применяемым в настоящее время.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Новый штамм В. subtilis Р-1 - суперпродуцент нейтральной протеазы.

2 Разработанная схема получения штаммов - суперпродуцентов протеазы, которая включает: получение антибиотикоустойчивого мутанта на основе природного штамма В. subtilis в R-форме, проведение гомогенного глубинного культивирования и выделение из популяции S-формы с наибольшей зоной гидролиза казеина.

3 Штамм В. БиЫШБ Р-1, отличающийся от исходного штамма

В. БиЫШБ 534 внутрихромосомной перестройкой генетического материала.

4 Технология культивирования штамма В. бчЫШб Р-1 периодическим или многоциклическим способом на стадартизованных по составу питательных средах, являющаяся оптимальной для промышленного получения нейтральной протеазы.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на общероссийской научной конференции «Актуальные вопросы диагностики, терапии и профилактики инфекционных заболеваний» (Москва 1997), Всероссийской научной конференции « Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, 2000), Международной научно-практической конференции памяти Галины Ивановны Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002), Всероссийской научной конференции молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004). Диссертационная работа доложена и обсуждена на заседании Учёного совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ (протокол № 1 от 3. 02. 2005 г.)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, получено 2 патента РФ.

Объём и структура диссертации Диссертация изложена на 118 страницах, содержит 18 таблиц и 12 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (3 главы), собственных исследований (3 главы), заключения, выводов. Библиографический список включает 153 источников (124 отечественных и 29 зарубежных).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Нафиков, Риф Султанович

Выводы

1 Получен и запатентован новый штамм Bacillus subtilis P-l -суперпродуцент нейтральной протеазы с активностью не менее 20 ПЕ/мл, то есть превышающей активность фермента исходного штамма Bacillus subtilis 534 в 50 и более раз.

2 Установлено, что штамм Bacillus subtilis P-l - аэроб, грамположительный, спор не образует, безвреден (нетоксичен, нетоксигенен, невирулентен), устойчив к пенициллину, карбенициллину, оксациллину, ампициллину и полимиксину.

3 Разработана схема получения различных штаммов суперпродуцентов протеазы из природных штаммов бактерий рода Bacillus.

4 Показано, что штамм Bacillus subtilis Р-1 отличается от исходного штамма Bacillus subtilis 534 перестройкой генетического материала бактериальной хромосомы. Для геномной паспортизации штаммов бактерий рода Bacillus может использоваться метод концевого мечения рестриктазных фрагментов ДНК, позволяющий получать индивидуальный геномный портрет культуры штамма в виде штрих-кода.

5 Оптимизирован периодический процесс гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis Р-1 в реакторе, и на его основе осуществлён отъёмно-доливной процесс культивирования для получения промышленных объёмов нейтральной протеазы.

6 Установлено адаптивное обратимое изменение морфологии и физиологии клеток штамма Bacillus subtilis Р-1 в процессе их культивирования под воздействием продуцируемой протеазы по достижении ее высокой концентрации в культуральной жидкости.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Создание новых производственных бактериальных штаммов для получения ферментов требует проведения селекции высокопродуктивных вариантов на основе популяции дикого штамма, подвергнутого мутационному воздействию или селекционному давлению. Одним из важнейших объектов современной биотехнологии, как продуцентов ферментов, являются бактерии рода Bacillus, благодаря их многим положительным факторам, в том числе и высокой ферментативной активности, а также производственной технологичности и безопасности для человека.

Получение антибиотикоустойчивых вариантов является одним из методов современной селекции и используется для создания промышленных штаммов микроорганизмов, у которых в результате приобретённой плейотропной мутации часто увеличивается синтез ряда ферментов [Дебабов В. Г., Лившиц В. А., 1998]. Целесообразность получения ферментов на основе бактерий рода Bacillus, обладающих устойчивостью к антибиотикам, послужила причиной проведения исследований по получению антибиотикоустойчивых вариантов на основе штамма В. subtilis 534 [Михайлова Н. А. и др., 1997]. Кроме того, возможность управления продукцией фермента, в процессе гомогенного глубинного культивирования штамма продуцента, позволяет значительно увеличить выход нейтральной протеазы [Работнова И.Л., 1990; Баснакьян И.А., 1992].

Всё выше сказанное обуславливает актуальность проведённых исследований с целью получения штамма - продуцента нейтральной протеазы.

Основываясь на данных литературы [Ito S. et al, 1991; Gileadi О. et al, 1992; Шарипова M. Р. и др., 1994; Буланцев А. Л., 1998] о повышении выхода фермента у антибиотикоустойчивых мутантов, нами проведены исследования по созданию нового производственного штамма для получения нейтральной протеазы путём направленной селекции под воздействием стрептомицина на исходный штамм В. subtilis 534. При работе с чистыми популяциями культур микроорганизмов, используемых в биотехнологии, обнаруживается антибиотикоустойчивость чаще всего обусловленая появлением хромосомных мутаций в селективных условиях. Показано существование стрептомицинрезистентных безплазмидных мутантов штамма В. anthracis [Степанов A.C. и др., 1999].

При воздействии стрептомицина на популяцию штамма В. subtilis 534, появляются устойчивые штаммы микроорганизмов, у которых возникают мутации, приводящие к изменению белков 30 Б субъединиц рибосом. Измененные рибосомальные белки не связываются с антибиотиком стрептомицином и не происходит ингибирования синтеза белка на рибосомах у устойчивых штаммов под воздействием стрептомицина.

В результате приобретенной мутации устойчивости к стрептомицину, в бактериальных клетках происходит нарушение координации процессов транскрипции и трансляции белка на рибосомах, часто сопровождаемое увеличением проницаемости внешней мембраны для некоторых метаболитов. Эти изменения в белковом синтезе являются одним из способов повышения продуктивности ферментов у микроорганизмов [Знаменская Л.В., 1986; Дебабов В.Г., 1988].

Естественно, что большинство мутаций в аппарате трансляции у бактерий является для них летальными, что и объясняет относительно низкую частоту обнаружения подобных мутантов среди штаммов выделенных из естественных источников. Стрептомицинустойчивые мутанты обычно получают в лабораторных условиях при целенаправленной селекции, начиная селекцию с очень низких концентраций антибиотика из-за сильного бактериостатического влияния.

В результате ступенчатой селекции в популяции штамма В. БиЫШэ 534, под воздействем антибиотика стрептомицина, начиная с 10 мкг/мл и с последующей возрастающей концентрацией антибиотика, с чередованием жидкой и твёрдой питательной среды, был получен стрептомицинустойчивый штамм В. БиЫШБ б^"1" , устойчивый к концентрации антибиотика 2 мг/мл. Изучение уровня продукции протеазы, оцениваемое по величине зон гидролиза казеина, показало, что клетки штамма В. эиЫШз б1г+ обладали повышенной способностью к синтезу протеазы по сравнению с исходным штаммом штамм В. бцЫШб 534. Диаметр зоны гидролиза штаммов В. БиЫлНБ 534 и В.б чЫШб б1:г+ составил соответственно 6,0 и 13,0 мм.

Признак стрептомицинустойчивости был стабильным при пассажах культуры клеток селекционированного штамма на твёрдой питательной среде и не утрачивался популяцией в течение 10 пассажей на питательных средах без добавления стрептомицина с сохранением свойства повышенной продукции протеазы.

При выращивании бактериальной популяции штамма В. БиЫШз б1г+ на жидкой питательной среде без стрептомицина в течении 3 суток с принудительной аэрацией и перемешиванием, выявлена диссоциация популяции на Я- и 8-формы. Я-форма стабильно сохраняла признак стрептомицинустойчивости, в то время как 8-форма утрачивала свойство стрептомицинустойчивости, но приобретала устойчивость к антибиотикам [3-лактамного ряда. Изучение уровня продукции протеазы Я- и 8-формами, полученных в результате расщепления штамма В. биЫШб б^1" показало, что 8-форма продуцирует протеазу примерно в 2 раза больше, чем Я-форма.

Для установления закономерности выявленного свойства повышенной продукции протеазы 8-формой, по сравнению с Я-формой, проведено сравнительное изучение уровня продукции протеазы диссоциативными Я-, 8-формами дикого штамма В. бцЫШб 534 и его антибиотикоустойчивыми мутантами, в том числе: рифампицинустойчивым мутантом- В. эиЫШБ ЗН, стрептомицинустойчивым В. бчЫШб б^и пенициллинустойчивым-В. БиЫШв реп+.

Проведенные исследования показали, что все изученные 8-формы различных штаммов продуцируют протеазы примерно в 2 раза больше, чем Я-формы. 8-форма штамма В. БиЫШэ , обладала самым высоким уровнем продукции протеазы, превосходящим другие 8-формы в 2,5-7,5 раз.

Полученные результаты согласуются с литературными данными о повышенном уровне протеазы у Б-форм бацилл по сравнению с Я-формами [Бурцева З.И. и др., 1991; Нефёдова Л.И. и др., 1996]. Вероятно, это обуславливается тем, что 8-формы отличаются от Я-форм повышенной проницаемостью клеточной стенки [УеНапоу Б.К., Нпб^у А.Е., 1984], так как пептидогликановый компонент их истончён и более разрыхлён [Блохина Т.П. и др., 1992], что способствует увеличению секреции экзопродуктов.

Выделенная нами S-форма антибиотикоустойчивого мутанта В. subtilis str+ являлась суперпродуцентом фермента протеазы и получила название В. subtilis Р-1.

Исходя из полученных результатов была разработана схема получения штаммов-суперпродуцентов протеазы из бактерий рода Bacillus.

Схема показывает, что в результате воздействия антибиотика на исходный природный штамм бактерий рода Bacillus в R-форме получают антибиотикоустойчивый мутант в R-форме, из которого выделяют в результате проведения гомогенного глубинного культивирования S-форму -продуцент протеазы. В нашем исследовании был взят исходный природный коллекционный штамм В. subtilis 534 и из него получен суперпродуцент протеазы названный В. subtilis Р-1.

При изучении антибиотикоустойчивости R- и S-форм исходного штамма - В. subtilis 534 и его антибиотикоустойчивых мутантов выявлено наличие различий в устойчивости к антибиотикам у R- и S-форм.

При отсутствии селективного давления антибиотика R-формы антибиотикоустойчивых мутантов стабильно наследовали устойчивость к селективному антибиотику. У S-форм отмечалась потеря приобретённой устойчивости к селективному антибиотику и появление у них устойчивости к антибиотикам ß-лактамного ряда и сохранялась повышенная продукция протеазы.

Проведенные нами исследования показали, что антибиотикоустойчивость, возникшая вследствие приобретенной мутации устойчивости к стрептомицину, рифампицину и пенициллину, является характерным признаком изменения компонентов белкового синтеза в клетке, оказывающим влияние не только на уровень продукции белка, но и на структуры клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. Такие мутации носят плейотропный характер и затрагивают одновременно несколько важных свойств бактериальной клетки в R-форме. У S-форм, возможно, происходят более интенсивно репаративные процессы, восстанавливающие исходный генотип клетки, поэтому и происходит потеря устойчивости к селективному антибиотику. Но в результате множественности произошедших в результате мутации изменений, у S-форм остается повышенным уровень продукции и секреции протеаз и возникает устойчивость к антибиотикам ß-лактамного ряда, свидетельствующая о различном строении клеточной стенки R- и S-форм.

Предложенная схема получения штаммов-сверхпродуцентов протеазы из бактерий рода Bacillus предполагает 2 этапа. На 1 этапе получают антибиотикоустойчивый мутант в R-форме, у которого повышен уровень продукции протеазы, вероятно за счет изменения белкового синтеза, в результате приобретения мутации устойчивости к антибиотику, влияющему на процессы трансляции, или транскрипции белка в бактериальной клетке. На 2 этапе выделяют в популяции S-форму, у которой сохраняется повышенный уровень синтеза фермента и увеличен, по сравнению с R-формой, его секреция за счет особенностей строения клеточной стенки.

Поскольку мутация устойчивости к стрептомицину носит плейотропный характер и может затрагивать одновременно много свойств, проведены сравнительные исследования свойств исходного штамма

В. subtilis 534 и полученного супер продуцента протеазы В. subtilis Р-1.

Исходя из того, что исходный штамм - В. subtilis 534 является антагонистически активным [Никитенко В. И., Никитенко И. К., 1992], было проведено сравнение антагонистических свойств исходного штамма В. subtilis 534 и штамма В. subtilis Р-1 в отношении тестовых штаммов патогенных микроорганизмов. Проведённые исследования показали, что у штамма В.subtilis Р-1 уровень антагонистической активности снижен по сравнению с исходным штаммом.

Снижение уровня антагонистической активности объясняется тем, что штамм В. subtilis Р-1 является S-формой, а штамм В. subtilis 534 существует исходно в R-форме. В литературе указывается на снижение способности S-форм различных штаммов бактерий рода Bacillus к синтезу антибиотиков по сравнению с R-формами [Смирнов В.В., 1982; С.Н.Выборных и др.,1990]. Указывается также на взаимосвязь между синтезом антибиотиков споруляцией, и продуцированием сериновой протеазы [Смирнов В.В., 1982].

Поэтому можно было предположить, что снижение антагонистической активности у штамма В. subtilis Р-1 свидетельствует также о снижении способности штамма к споруляции и выработке щелочной протеазы по сравнению с исходным штаммом, что нашло подтверждение в наших дальнейших исследованиях.

Изучение морфологических свойств исследуемых штаммов показало, что исходный штамм - В. subtilis 534 и полученный - В. subtilis Р-1 имеют некоторые различия: штамм В. subtilis 534 имеет размеры (0,-;0,7х- 1,8) мкм. Размеры штамма В. subtilis Р-1 - (0,5-0,7 х 1,3) мкм. Установлено, что штамм В. subtilis Р-1 аспорогенен (в популяции могут иногда встречаться лишь единичные споры), тогда как штамм В. subtilis 534 является спорообразующей палочкой до 100%. Остальные морфологические свойства сравниваемых штаммов аналогичны друг другу и характерны для первой группы рода Bacillus подгруппы В: клетки не раздуваются при спорообразовании, споры элипсовидные, расположены центрально, не образуют глобул в цитоплазме клеток при выращивании на глюкозном агаре.

Биохимические свойства штаммов - В. subtilis 534 и В. subtilis Р-1 в основном аналогичные. Штамм В. subtilis Р-1 отличается от штамма В, subtilis 534 наличием фибринолизина, повышенной способностью к редукции нитратов, гидролизу мочевины, уровнем гиалуронидазы.

Известно, что S-формы характеризуются более высокой вирулентностью по сравнению с R-формами [Смирнов В.В. 1982], поэтому были проведёны исследования безопасности штамма В. subtilis Р-1. Сравнительное исследование вирулентности штаммов при внутрибрюшинном введении показало, что для штамма В. бцЫШб 534 1ЛЭ50 составляло 8,4-109 микробных клеток на животное, для штамма В. БиЫШБ Р-1 1ЛЭ50 определялось 4,7-109 микробных клеток, т.е. не является вирулентным штаммом. Исследование безвредности показало, что штамм В. БиЫШя Р-1 не обладает токсичными, токсигенными и вирулентными свойствами, что подтверждает возможность использования его в качестве продуцента нейтральной протеазы в производстве.

Проводилось исследование генетических особенностей штамма В. БиЫШБ б1г+ (Я-форма) и В. бцЫШб Р-1 (8-форма) в сравнении с исходным штаммом В. БиЫШБ 534, исходной формой существования которого является Я-форма.

Изучение вариабельности геномов на уровне ДНК исходного штамма В. бцЫМб 534 и стрептомицинустойчивого варианта произведён анализ геномного полиморфизма методом ЯАРЭ. Анализ геномного полиморфизма, позволил обнаружить вариабильность на уровне ДНК исходного штамма В. бцЫШб 534 и штамов В. бцЫШб б1г+ (Я-форма) и В. виЫШв Р-1 (Б-форма).

Обнаруженные различия в геноме ДНК могут коррелировать с выявленными нами изменениями морфологических и фенотипических признаков исследуемых штаммов, и могут быть обусловлены перестройками генетического материала исходной культуры. В работах по изучению внутрипопуляционной диссоциации у микроорганизмов установлено, что спонтанные морфологические варианты связаны между собой обратимыми взаимными переходами по типу реверсий, их морфологический полиморфизм имеет диссоциативный характер и сопровождается определёнными геномными перестройками [Филиппова С.Н. и др., 1999].

Применение КМРФ-анализа для идентификации штаммов микроорганизмов показало высокую эффективность данного метода. Серьёзным преимуществом является хорошая воспроизводимость результатов, что делает данный метод весьма удобным для паспортизации штаммов за счёт получения набора специфических для конкретного штамма микроорганизма фрагментов ДНК, образованных под действием той или иной рестриктазы и выявляемых на радиоавтографах в виде множественных полос. Для определения и идентификации вновь выделенного штамма микроорганизма потребуется в таком случае проведение КМРФ-анализа с последующим сравнением полученного профиля полос со стандартными образцами. Более того, данный подход позволяет идентифицировать полосы, принадлежащие фрагментам ДНК, с точностью до одного нуклеотида, что имеет решающее значение для эффективной паспортизации штаммов. Создание специальных каталогов, описывающих штаммы микроорганизмов с точным указанием в каком-либо выбранном диапазоне длин индивидуальных фрагментов, образующихся при расщеплении бактериальной ДНК подходящей рестриктазой, позволит достаточно легко определить данный штамм микроорганизма по наличию тех или иных полос определённого размера в его КМРФ. Сама длина фрагментов может быть определена с помощью маркерной лестницы [Баймиев А.Х. и др., 1999].

Таким образом, составленный генетический паспорт исходного штамма В. subtilis 534 и селекционированных штаммов В. subtilis str+ (Ii-форма) и В. subtilis Р-1 (S-форма) позволил получить индивидуальный геномный портрет штаммов в виде штрих-кода. Это обеспечивает возможность генетического контроля изменений генома микроорганизма.

Из литературы известно [Мосолов В. В., 1971; Yong J. et al, 2000; Fredhila S. et al, 2002], что бактерии рода Bacillus продуцируют протеолитические ферменты, относящиеся к классам нейтральных и щелочных протеаз. Общим свойством нейтральных протеаз является инактивация при обработке ЭДТА, щелочных - ДФФ. Проведённые исследования показали, что штамм В. subtilis Р-1 продуцирует 99 % нейтральной протеазы.

При разработке технологии получения нейтральной протеазы на основе селекционированного штамма была проведена оптимизация периодического процесса культивирования данного штамма. Максимальное образование того или иного фермента зависит не только от продуцента, но и от состава питательной среды и условий культивирования. Синтез многих экзоферментов и антибиотиков подавляется легко усваяемыми источниками углевода и энергии, а также азота [Фениксова Р.В., 1973; Дебабов В. Г., Лившиц В. А., 1988]. Кроме того, легко утилизируемые углеродсодержащие соединения и среды нестандартного состава способствуют диссоциации микроорганизма-продуцента, а синтетические среды с некоторыми аминокислотами - препятствуют [Выборных С.Н. и др., 1990, Милько Е.С., 1990]. Поэтому была проведена оптимизация состава питательной среды по источникам углевода и азота.

В качестве источников углевода были испытаны глюкоза, мальтоза и лактоза. В результате проведённых экспериментов установлено, что оптимальным углеводом для продукции протеазы штаммом В. subtilis Р-1 является мальтоза в концентрации (1-5) %. Снижение концентрации мальтозы ниже 1% ведет к значительному снижению уровня протеазы, повышение содержания мальтозы выше 2,0 % не сказывается существенным образом на максимальном накоплении протеазы.

При изучении потребности селекционированного штамма в источниках азотного питания были испытаны органические и минеральные источники азота. Известно, что для большинства бактерий рода Bacillus наилучшим источником азота является пептон, гидролизат казеина и автолизат дрожжей [Смирнов В.В., 1982]. Использование в питательной среде пептона обеспечивало высокий уровень биомассы, но уровень протеолитической активности (8,2 ±0,1) ПЕ/мл при этом был ниже, чем на среде с мочевиной (10,2 ± 0,1) ПЕ/мл, что достоверно согласуется с литературными данными об азотной катаболитной репрессии продукции экзоферментов легко усвояемыми источниками азота. Использование в качестве источника азота мочевины с добавлением дрожжевого экстракта позволило повысить уровень активности протеазы в 2,2 раза, до (24,0±0,5) ПЕ/мл при меньшем содержании бактериальных клеток.

Существенное влияние на рост бацилл оказывают параметры культивирования. В ходе проведённых исследований установлено оптимальное значение посевной дозы для культивирования штамма В. subtilis Р-1 с целью получения протеазы.

Результаты исследований показали, что при увеличении посевной дозы с (0,6±0,12)-109 до (2,0±0,2)-109 кл/мл, приводило к увеличению биомассы и продукции протеазы, а также к укорочению лаг-фазы. Дальнейшее увеличение посевной дозы до (5,5±0,38)-109 кл/мл приводило к снижению роста биомассы и продукции протеазы. Посевная доза (2,0±0,2)'109 кл/мл была выбрана как оптимальная.

Одним из важных факторов оптимизации периодического процесса культивирования бацилл является выбор режима аэрации. Наибольшей потребностью в кислороде обладают клетки R-форм в сравнении с S-формами. [Милько Е.С., Егоров Н.С., 1991]. Для культивирования штамма В. subtilis Р-1 количество подаваемого воздуха в культуральную жидкость должно соответствовать (60±5) % от полного насыщения среды. При данных условиях культивирования получали биомассу с концентрацией (18,0±1,0)-109 кл/мл и протеолитическую активность культуральной жидкости (24,0±0,1) ПЕ/мл

Исследование морфологии клеток в динамике процесса культивирования штамма В. subtilis Р-1 показало, что при высоких концентрациях протеазы изменяется морфология и физиология природного штамма. При активности протеазы в культуральной жидкости более 24 ПЕ/мл в популяции появляются клетки, дающие особый «карликовый» тип колоний. Эти клетки теряют способность роста на обычных питательных средах (МПБ, МПА, картофельный агар) и образуют карликовые колонии (мелкие, круглые или неправильной формы) на средах, содержащих казеин или на голодном агаре с 1 % казеина. Продукция протеазы этими колониями слабая - зона гидролиза казеина менее 2 мм.

Способность клеток к росту на обычных питательных средах восстанавливается при пересевах через среды с 1 % казеиновым агаром.

Таким образом, установлено, что под влиянием высоких концентраций протеолитического фермента (24 ПЕ/мл и выше) происходит адаптивное изменение физиологии и морфологии клеток популяции штамма В. БиЫШБ Р-1, выражающееся в утрате способности роста на питательных средах, не содержащих казеин и образовании мелких колоний -«карликовых».

Адаптивное изменение клеточной популяции является обратимым и после пересевов через среды содержащих казеин без протеазы физиология и морфология клеток восстанавливается.

Описание подобного явления мы не встретили в доступной литературе.

На основе оптимизированного периодического процесса культивирования штамма В. БиЫШз Р-1 разработан отъёмно-доливной процесс культивирования, позволяющий получить большее количество ферментсодержащей культуральной жидкости при сокращении длительности процесса.

Для оценки степени оптимизации периодического процесса культивирования штамма В. БиЫШэ Р-1 с целью получения нейтральной протеазы, был построен фазовый портрет, отражающий зависимость уровня протеазы от количества клеток штамма-продуцента [Баснакьян И.А. и др., ]. Фазовая траектория, отражающая зависимость уровня протеазы от нарастания биомассы представляла собой прямую линию, что отражает высокую степень оптимизации процесса по выходу протеазы и в свою очередь даёт возможность прогнозирования множества непрерывных процессов по любой точке, лежащей на этой прямой, или сливно-доливных процессов с различной длительностью цикла.

Анализ фазового портрета периодического процесса культивирования штамма В. БиЫШБ Р-1 показал, что отъём ферментсодержащей культуральной жидкости и долив свежей питательной среды целесообразно проводить в конце экспоненциальной фазы на (18±1) ч роста культуры. Биомасса к этому времени составляла (18±1)-109 кл/мл, при уровне активности протеазы в культуральной жидкости (22±1) ПЕ/мл, и находилась в фазе замедления скорости роста. В этой фазе клетки обладают высокой физиологической активностью, способностью возобновить рост при доливе свежей питательной среды и не подвержены адаптивному изменению морфологии под воздействием высокой активности протеазы.

На основании полученных данных был осуществлён отъёмно-доливной процесс культивирования В. биЫШб Р-1 на синтетической питательной среде с мочевиной и дрожжевым экстрактом. Выращивание культуры бактерий проводили в реакторе БИОР - 0,1 при температуре (37±1) °С, частоте вращения мешалки (400±10) мин"1 с постоянной подачей воздуха, при уровне аэрации (60±5) % от насыщения среды кислородом и коэффициенте заполнения аппарата 0,7.

При достижении концентрации биомассы (18±1)'109кл/мл и уровня протеазы (22±1) Пе/мл, в оптимизированном процессе периодического культивирования, сливали половину объёма реактора культуральной жидкости и доливали равный объём свежей питательной среды. После отъёма культуральной жидкости и долива свежей питательной среды концентрация микроорганизмов, а также и уровень активности протеазы снижались примерно в два раза. Начиная со второго цикла культивирования, после слива культуральной жидкости и долива свежей питательной среды, уровень биомассы и протеазы восстанавливались до исходного значения за 4 часа. Многоциклический процесс позволил повысить производительность получения протеазы за счёт сокращения времени, необходимого для получения промышленных объёмов ферментсодержащей культуральной жидкости.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нафиков, Риф Султанович, Уфа

1. Актуальные проблемы филогенетической классификации бактерий / В.А. Романовская, П.В. Рокитко, С.О. Шилин, Ю.Р. Малашенко // ISSN 0201 8462. Мкробюл. журн. - 2003. - Т. 65, № 5 - С. 46-50.

2. Антипова И. Морфологическая изменчивость бактерий Bacillus subtilis продуцента амилазы / И. Антипова, А. Дагис, Ю. Василяускас // Производство и применение микробных ферментных препаратов. Вильнюс. - 1974. - вып. 1. - С. 3-9.

3. Антипова J1.B. Исследование ДНК повреждающего эффекта протеолитических ферментных препаратов / JI.B. Антипова // Биотехнология: состояние и перспективы: Материалы конгресса. - М., 2003. - С. 94-96.

4. Аспераза энзиматический препарат для очищения ран / В.Т. Чернобай, П.И. Кабачный, В.Ф. Рудик и др. // химико-фармацевтический журн. - 1991. - Т. 25, № 1 - С. 86-87.

5. Ахапкина, И.Г. Питательные среды как искусственная среда роста и развития микроорганизмов / И.Г. Ахапкина, Л.П. Блинкова // Микробиология.- 2001.- № 1. С.99-104.

6. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами / И.А. Баснакьян. М.: Медицина, 1992. - 188с.

7. Баснакьян, И.А. Непрерывное культивирование генно-инженерных штаммов микроорганизмов / И.А. Баснакьян, В.А. Мельникова, H.H. Алексахина// ЖМЭИ. 1994. - №5. - С. 110-115.

8. Бахматова, И.В. Биосинтез L амилазы вариантами Bacillus subtilis RG 23 / И.В. Бахматова, Г.Г. Жарикова // Микробилогия. - 1979. - Т. 50, № 3. - С. 893-899.

9. Биргер, М.О. Справочник по микробиологичиским и вирусологическим методам обследования. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам / М.О. Биргер. -М.: Медицина, 1982. 180 с.

10. Бирюков, B.B. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / В.В. Бирюков, В.М. Кантере. М.: Наука, 1985.-291 с.

11. Бондаренко, В.М. Сериновые протеазы грамотрицательных бактерий структура, механизм секреции, биологическая активность / В.М. Бондаренко, А.Р. Мавзютов, О.В. Агапова // Микробиология. 2002 -№ 6. - С. 80-85.

12. Боринская, С.А. Структура прокариотических геномов / С.А. Боринская, Н.К. Янковский // Молекулярная биология. 1999. - Т. 33, №6.-С. 941-957.

13. Бурцева, Э.И. Влияние состава среды на диссоциацию Bacillus subtilis 82 / Э.И. Бурцева, A.C. Тихомирова A.C. // Тезисы доклада Всесоюзной конференции «Достижения биотехнологии агропром. Комплексу» ( г. Черновцы, 14-16 окт.). - 1991. - С. 86.

14. Вельков, В.В. Новые представления о молекулярных механизмах эволюции; стресс повышает генетическое разнообразие / В.В. Вельков // Молекулярная биология. -2002. Т. 36, № 2. - С. 277- 285.

15. Влияние состава среды на синтез бацитрацина и спорообразование Bacillus licheniformis 28 КА / Н.С. Егоров, Ж.К. Лория, С.Н. Выборных, Р. Хамрук // Прикладная биохимия и микробиология.-1986.-Т 22, № 1.-С. 107-111.

16. Возможные пути увеличения синтеза экзотоксина культурой Bacillus thuringiensis продуцентом битоксибациллина / Л.И. Абросимова, А .Я. Лескова, П.В. Бабаева, В.В. Швецов // Микробиология. - 1985. -Т. 54, № 5. - С. 770-773.

17. Выборных, С.Н. Биосинтез микроорганизмами рода Bacillus фибринолитических ферментов различного механизма действия / С.Н. Выборных, Н.С. Ландау, Н.С. Егоров // Микробиология. 1991. -Т.60, Вып. 1 - С. 93-98.

18. Выделение и характеристика металлопроитеназы Bacillus megaterium / И.П. Морозова, Г.Г. Честухина, М.Е. Борматова, и др. // Биохимия. -1993. Т. 58, № 6. - С. 896-907.

19. Выборных, С.Н. Скрининг бациллярных протеаз плазминового и активаторного типа действия на фибрин / С.Н. Выборных, Н.С. Ландау, Н.С. Егоров // Микробиология. 1990. - Т.59, Вып. 5 - С. 782789.

20. Гайденко, Т. А. Характеристика нового плейотропного регуляторного гена Bacillus licheniformis / Т.А. Гайденко, Б.Р. Белицкий, М.Я. Хайкинсон // Биотехнология. 1992. № 3. - С.13-19.

21. Гамалея, Н.Б. Изучение мутантов Salmonella typhimurium с изменённой чувствительностью к антибиотику фузидину / Н.Б. Гамалея, B.C. Левашёв // ЖМЭИ. 1978. - № 2. - С. 78-85.

22. Гейл, Э. Молекулярные основы действия антибиотиков / Э. Гейл. -М.: Наука, 1975. С. 323-427.

23. Глянцев, С.П. Сравнительное изучение активности протеолитических ферментов, применяемых в хирургии для очищения гнойных ран / С.П. Глянцев, Т.В. Саввина, Т.Л. Заец // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - № 6. - С. 716-720.

24. Головлёв, E.JI. Метастабильность фенотипа у бактерий / E.JI. Головлёв //Микробиология. 1998. - Т. 67, № 2 - С. 149-155.

25. Головлёв, Е. JI. Введение в биологию стационарной фазы бактерий. Механизм общего ответа на стрессы / E.JI. Головлёв // Микробиология. 1999. - Т. 68. - с. 623-631.

26. Грачёва, И.М. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов: Учебное пособие для вузов / И.М. Грачёва, Ю.П. Грачёв, М.С. Мосичев М.: Лёгкая и пищевая пром-ть., 1978.- 271 с.

27. Гребешова, Р.Н. Сериновая протеаза Bacillus subtilis R / Р.Н. Гребешова, Л.А. Сальседо-Торрес, М.А. Идальго // Прикладная биохимия и микробиология. 1999.- Т. 35, № 2. - С. 150-154.

28. Дебабов, В.Г. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов / В.Г Дебабов, В.А Лившиц. М.: Высшая школа, 1988. - 280 с.

29. Денисов Г.В. Множественные формы ферментов / Г.В. Денисов // Успехи совр. биологии. 1977. - Т. 84, № 4. - С. 22-37.

30. Добрица, C.B. О возможной роли плазмиды В. brevis var. G.B. в диссоциации и спорообразовании / C.B. Добрица, А.П. Добрица // Экспериментальное изучение микроорганизмов: Сб. науч. Тр. -Пущино, 1978.-С. 7-11.

31. Долидзе, Д.А. Исследование комплекса протеолитических ферментов Actinomyces fradiae 119 / Д.А., Долидзе И.С Петрова, Р.В Фениксова // Прикл. биохим. и микроб.- 1974. Т. 10, № 5. - С. 271.

32. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров. М.: Высшая школа, 1986. - 447 с.

33. Жеребцов, H.A. Влияние источников углеродного и азотного питания на биосинтез протеиназ с керотинрасщепляющим действием / H.A. Жеребцов, JI.B. Насонов // Прикладная биохимия и микробиология.- 1989.- Т.25. №4.- С. 508-513.

34. Заворотная, С.А. Генетическая нестабильность признака стрептомицинустойчивости у Streptomeces erythraeus / С.А. Заворотная, В.А. Федоренко, В.Н. Даниленко // Антибиотики и химиотерапия. 1990. - Т 35, № 12. - С. 18-21.

35. Знаменская, JI.B. Биосинтез внеклеточных ферментов Bacillus intermedius / JI.B. Знаменская, Е.Р. Ромахина, С.В.Филатова // Микробиология. 1986. - Т. 55, вып. 3 - С. 449-454.

36. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков / И.Г. Осипова, Сорокулова И.Б., Н.В. Терёшкина, Л.В. Григорьева // ЖМЭИ. 1998. - № 6. - С. 68-70.

37. Изучение внутрипопуляционных спонтанных морфологических вариантов Streptomyces oligocarbonilus isp5589 / С.Н. Филиппова, В.Д, Кузнецов, Д.Н. Бадяутдинов и др. // Микробиология. 1999. - Т. 68, №3.- С. 375-382.

38. Изучение белковых компонентов пептидных регуляторов природного происхождения / Г.А. Рыжак, П.А. Некрасов, О.И. Кисилёв, В.Х. Хавинсон // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. 2003. -Т. 135, № 1 - С. 105-108.

39. Ильин, Г.И. Производство ферментных препаратов микробного синтеза для медицины / Г.И. Ильин, БВ. Москвичёв // Ферменты микроорганизмов: Сб. статей ВНИИЭНТИ. М., 1989. - С.320-324.

40. Иммобилизованные ферменты для медицины и ветеринарии / JI.A. Богданова, Т.Н. Быстрова, A.M. Гончар и др. // Науч. прикл. Разраб. (Генетика, селекция, биотехнология): Ин-т цитол. и генет. СО РАН. -Новосибирск. -1997. - 70 с.

41. Кемпбелл, П.Н. Губкообразные энцефалопатии крупного рогатого скота / П.Н. Кемпбелл // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1998. - № 4. - С. 34-40.

42. Коваленко, Э.А. Закономерности биосинтеза гидролаз Bacillus intermedius на разных средах. / Э.А. Коваленко, Н.В. Колтунова, Т.В. Стрельчина // Прикладная биохимия и микробиология.- 1990.-Т. 26, вып. 4.- С. 528-533.

43. Композиция для ферментативного гидролиза белков: ПАТ. 2003346 РФ / Р.И. Салаганик, A.M. Гончар, A.B. Троицкий. Опубл. ЗОЛ 1.93 // Бюл. - 1993. - №43.

44. Кудлай, Д.Г. Генетика лекарственной устойчивости бактерий / Д. Г. Кудлай, В.Ф. Чубуков, М.Г. Оганесян. М.: Медицина, 1972. - 255 с.

45. Ленцер, A.A. Актуальные проблемы микроэкологии человека /A.A. Ленцер, Х.П. Ленцер // Аутофлора человека в норме и патологии: Сб. науч. тр. Горький. - 1988. - С. 10-14.

46. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / Т. Маниатис, Э. Фритч, Д. Сэмбрук.-. -М.: Мир, 1984 480 с.

47. Мартьянов, В.А. Получение высокоактивных препаратов нейтральной протеазы Bacillus subtilis / В.А. Мартьянов, А.Ф. Зябрев, Б.П. Финогенов // Ферменты микроорганизмов: Сб. статей ВНИИЭНТИ. М., 1989. - С.175-185.

48. Мембранно-связанные формы сериновых протеиназ Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Н.П. Марданова, Н.П. Балабан и др. // Микробиология. 2003. - Т. 75, № 5. - С. 639-644.

49. Металлопротеиназы Bacillus megaterium, штамм В 313 / И.П. Морозова, М.П. Юсупова, М.Ю. Гололобов и др. // Биохимия. - 1993. -Т. 58, №9.-С. 1420-1429.

50. Мигольтина, Е.И. Глутамилэндопептидазы. Структура, функции. Практическое применение / Е.И. Мигольтина, T.J1. Вьюшина, Г.Г .Честухина// Биоорганическая химия. 2003.-Т.29, №6.-С. 563-576.

51. Милько, Е.С. Нестабильность синтеза практически ценных веществ. Процесс диссоциации / Е.С Милько // Прикл. биохимия и микробиология. -1990.- Т. 26, Вып. 6- С. 732-740.

52. Милько, Е.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации / Е.С Милько, Н.С Егоров. М. Изд-во Моск. Универс-та.- 1991.- 142 с.

53. Милько, Е.С. Влияние физических и химических факторов среды на рост и диссоциацию Pseudomonos aeruginosa / Е.С Милько, JI.A. Никитенко // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34, №2.-С. 171-174.

54. Мосолов, В.В. Протеолитические ферменты / В.В. Мосолов. М.: Наука, 1971.-414 с.

55. Нефёдова, Л.И. Получение активного варианта бактериальной культуры продуцента стабильной альфа-амилазы / Л.И. Нефёдова, Б.А. Устинова, // Хранение и переработка сельхозсырья. - 1996, № 2 -С. 42-43.

56. Нехотяева, Н.В. Современные представления о механизме секреции белков у бацилл / Н.В. Нехотяева, О.А. Вершинина, М.Р. Шарипова. Казань, 1996. -28 с. - Деп. В ВИНИТИ 11.11.96, № 3301-В96.

57. Ноздрина, Т.Д. О ферментативной модификации мясного сырья / Т.Д Ноздрина // Вопросы общей биологии в ветеренарии: Сб. Науч. Трудов. Мое. Гос. Акад. Вет. Мед.и биотехнол.- М. 2000.- С. 108-109.

58. Острый синусит в практике врача терапевта / JI.A. Богданова, Т.Н. Быстрова, A.M. Гончар и др.// Журнал доказательной медицины для практических врачей. 2002- Т.5, № 10. - С. 80-84.

59. Очистка и характеристика щелочной протеиназы алкофильного штамма Bacillus sp. / А. Мудерризаде, М.Я. Инсари, С.Агюлоглу, Б. Отлудин // Прикладная биохимия и микробиология. -2001, № 6.- С. 674-677.

60. Перт, С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Дж. Перт. М.: Мир, 1978. - 331 с.

61. Петрова, И. С. Протеолитическая активность / И.С. Петрова, М.М. Винцюкайте // Прикладная биохимия и микробиология. 1966. - № 2. - С. 322.

62. Пехов, А.П. Плазмиды бактерий / А.П. Пехов. М.: Знание, 1979. -64 с.

63. Питательная среда для выращивания спорообразующих аэробных бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis: A.c. 1708832 / В.Я. Чаплинский. Опубл. 01.01.92 // Бюл. - 1992 - № 4.

64. Позмогова, H.H. Об устойчивости микроорганизмов к изменениям условий существования или культивирования / И.Н. Позмогова // Прикладная биохимия и микробиология. 1988. - вып. 6. - С. 739-744.

65. Покровский, В.И. Молекулярные основы прионовых болезней / В.И. Покровский, О.И. Кисилёв // Вестник РАМН. 1998, № 10. - С. 4555.

66. Полиморфизм как закономерность развития популяций прокариотических организмов. / В.В. Высоцкий, П.Л. Заславская, A.B. Машковская, О.И. Баулина // Биологические науки. 1991. - № 12. С. 5-18.

67. Прист, Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов / Ф. Прист . -М.: Мир, 1987. 33 с.

68. Прист, Ф. Бациллы: Генетика и биотехнология / Ф. Прист. М.: Мир, 1992.- 87 с.

69. Прозоров, A.A. Генетическая трансформация у микроорганизмов /

70. A.A. Прозоров. М.: Наука, 1966. - 112 с.

71. Прозоров, A.A. Геном бактерий: нуклеоид, хромосома, нуклеотидная карта / A.A. Прозоров // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 4. - С. 437451.

72. Прозоров, A.A. Горизонтальный перенос генов у бактерий: лабораторное моделирование, природные популяции, данные геномики / A.A. Прозоров // Микробиология. 1999. - Т. 68, № 5. - С. 632-646.

73. Работнова, И.Л. Физиология микроорганизмов и управляемое культивирование / И.Л. Работнова // Успехи микробиологии. 1990. -вып. 24. - С. 88-99.

74. Рубан, Е.Л. Хранение культур микроорганизмов / Е.Л. Рубан // Прикладная биохимия и микробиология. 1989. - Вып. 3. - С. 291301.

75. Секретируемые гидролазы стрептомицинустойчивых бактерий Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова и др.//Биохимия. 1996.-Т. 61, вып. 1.-С.110-118.

76. Селезнёва, Ю.Л. Выделение и характеристика плазмид природных штаммов бактерий Bacillus subtilis / Ю.Л. Селезнёва, М.А. Титок,

77. B.А. Прокулевич // Микробиология и биотехнология на рубеже 21 столетия: Мат. Междунар. Конф. Минск., 2000. - С.89-91.

78. Серкина, A.B. Структура и функция предшественников бактериальных протеиназ / A.B. Серкина, А.Б. Шевелёв, Г.Г. Честухина// Биоорганическая химия. 1990. - Т. 24. - С. 1363-1372.

79. Серкина, O.A. Об адаптивности процесса диссоциации у Bacillus thuringiensis / О.А Серкина, В.И Чемерилова // Микробиология.-2003. Т.72, №5.- С. 689-694.

80. Сидоренко, C.B. Происхождение, эволюция и клиническое значение антибиотикорезистентности / C.B. Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - Т. 44, № 12 - С. 19-22.

81. Синтез и секреция протеиназ Bacillus intermedius на поздних стадиях спорообразования / Н.П Балабан, М.Р Шарипова, JI.A. Габдрахманова, и др. // Микробиология.- 2003. Т.72, № 3.- С. 338342.

82. Ситкин, Б.В. Могут ли автолизины бактерий являться предшественниками внеклеточных бактериолитических ферментов / Б.В. Ситкин, И.М. Цфасман, O.A. Степная // Доклады академии наук . 2003. - Т. 392, № 3. - С. 406-409.

83. Слабоспицкая, А.Т. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов / А.Т. Слабоспицкая, С.С. Крымовская, С.Р. Резник // Микробиология. -1990.-Т. 52, №2.-С. 9-14.

84. Смирнов, В.В Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская. - Киев: Наукова думка, 1982. - 280 с.

85. Смирнов, В.В. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных /В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова. Киев, 1983.- 50 с.

86. Смирнов, В.В. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации /В.В. Смирнов, А.И. Осадчая, В.А. Кудрявцев // Мпсробюл. журн. 1993. Т. 55, № 3. - С. 38-44.

87. Способ получения протеолитических ферментов из бактерий рода Bacillus: Пат. 2112035 РФ / H.A. Михайлова, Т.Н. Кузнецова, Т.Н. Зобова и др. Заявл. 23.01.97; Опубл. 24.06.97. // Бюл. - 1998. - №15.

88. Способ получения протеолитического ферментного препарата террилитина: Пат. 860523 РФ / А.А Селезнёва, Т.И. Рожанская, Г.А. Бабенко и др. Заявл. 13.10.78; Опубл. 02.04.80.

89. Способ получения гидролитических ферментов из штамма бактерий Bacillus subtilis ВКМП В 1989: Пат. 1342022 РФ / А.П.Шарапов, Т.И. Костромина, Г.В. Комарова и др. - Заявл. 1980; Опубл. 08.04.85.

90. Способ получения амилолитических и протеолитических ферментов: Пат. 1044040 РФ / В.И. Сухаревич, Н.М. Павловец, В.И. Яковлев и др.-Заявл. 25.09.79; Опубл. 20.02.81.

91. Сравнительное электронно-микроскопическое исследование клеток Bacillus thuringiensis, выращенных в хемостате / Т.П. Блохина, H.A. Кострикина, З.В. Сахарова, В.И. Бирюзова // Микробиология. 1992. -Т. 61, №4. -С. 672-677.

92. Сравнительное изучение множественности экзоферментов, продуцируемых различными мутантами Bacillus subtilis / А .Я. Стронгин, A.A. Лукин, JI.C. Изотова и др. // Микробиология. 1977. -Т. 16, вып. 3. - С. 539-546.

93. Старые и новые аспекты применения ферментных препаратов в гастроэнторологии / Е.А. Белаусова, А.Р. Златкина, H.A. Морозова, Н.Н.Тишкина // Фармотека. 2003. - № 7.- С. 39-44.

94. Стимуляция роста и спорообразования Bacillus subtilis оптимизацией углеводного питания при глубинном культивировании /А.И. Осадчая, В.А. Кудрявцев, JI.A. Сафронова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т. 33, № 3. - С. 321-324.

95. ЮЗ.Талалаев, Е.В. К вопросу о диссоциации и изменчивости / Е.В. Талалаев // Тр. ВНИИ с-х микробиологии. 1976. - вып. 45. - С. 1114.

96. Ю4.Терёшкина, О.И. О прионовых болезнях / О.И. Терёшкина, O.JI. Верстакова, А.Г. Рудакова // Вестник фармакологического комитета. 1998.-№ 1.-С. 9-10.

97. Юб.Товкач, Ф.И. Изучение популяционной диссоциации коллекционных штаммов Erwinia cartovora / Ф.И. Товкач, А.Ф. Товкач, С.Н. Мороз // Мшробюл. журн. 2002. - Т. 64, № 1. - С. 11-19.

98. Удалова, Т.П. Кинетика роста культуры Bacillus brevis var. G.B. и биосинтез грамицидина С в зависимости от внешних факторов / Т.П. Удалова, Т.М. Гуськова, Н.С. Егоров // Антибиотики и химиотерапия. 1977. - № 4. - С. 301-307.

99. Фениксова, Р.В. Биосинтез ферментов микроорганизмами / Р.В Фениксова // Ферменты микроорганизмов: М.: Наука.- 1973.-С. 725.

100. Ю9.Харвурд, К. Бациллы генетика и биотехнология: Пер. с англ / К. Харвуд. М.: Мир, 1992. - 530 с.

101. ПО.Хесин, Р.Б. Непостоянство генома / Р.Б. Хесин. М.: Наука, 1985. - 472 с.

102. Ш.Хилько, Т.В. Оптимизация питательных сред для роста и спорообразования бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis / Т. В. Хилько // ISSN 0201 8462. Мшробюл. журн. -2004.-Т. 66.-№1.-С. 36-40.

103. Ховрычёв, М.П. Биосинтез термостабильной а амилазы при непрерывном культивировании / М.П. Ховрычёв, Е.А. Мурова, И.Л. Работнова // Микробиология. -1987. -Т. 56, - вып. 3. - С. 425.

104. Ховрычёв, М.П. Рост и развитие Bacillus thuringiensis в условиях многостадийного непрерывного культивирования /М.П.

105. Чумаков, В.Н. Изучение кинетических характеристик химерных металлопротеиназ из бацилл / В.Н. Чумаков, М.И. Азимова, И.С. Хромов, C.B. Костров // Молекул, биол. 1996. Т. 30, № 2 - С. 339-342.

106. Шарипова, М.Р. Продукция внеклеточной щелочной фосфатазы антибиотикоустойчивыми штаммами Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Н.В. Нехотяева // Микробиология. -1994.-Т. 63, № 1.-С. 52-58.

107. Шарп, Р. Генетика и биотехнология / Р. Шарп, М. Скавен, Т. Аткинсон. Москва, 1992. 398 с.

108. Шкидченко, А.Н. Динамика потребления и пороговая концентрация глюкозы при культивировании дрожжей / А.Н. Шкидченко // Микробиология. 1975. - Т. 44, вып. 2 - С. 228-232.

109. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения препарата для профилактики и лечения воспалительныхпроцессов и аллергических заболеваний: А.с. 1723116 / В. И. Никитенко, И. К. Никитенко. Опубл. 1992.

110. Штамм Bacillus subtilis P-l Продуцент протеазы: Пат. 2208633 РФ / Т.Н. Кузнецова, Р.С. Нафиков, М.М. Алсынбаев и др. -Заявл. 14.11.01; Опубл.20.06.03. // Бюл. - 2003. - № 20.

111. Berhlohr, R. W. Postlogarithmic phase metabolism of sporulating microorganisms. Protease of Bacillus licheniformis / R.W. Berhlohr // J. Biol. Chem. 1964. - Vol. 239, № 2- P. 238 - 241.

112. Biddle, F.J. Thermal profile of a Bacillus species extremely resistant to dry heat / F.J. Biddle, W.W. Bond, M.S. Favero // Mol. Microbiol. -1975. Vol. 29, № 6. - P. 859-860.

113. Biosynthesis and localization from glutamul endopeptidase of bacillus intermedius 3-19 / L. A. Gabdrakhmanova, E.V.Shakirova, N.P Balaban et al // Microbios.- 1999. Vol. 100, № 1 - P. 97-108.

114. Cao, M. Antibiotics that inhibit cell wall biosynthesis induce expression of the Bacillus subtilis sigma (W) and sigma (M) regylons / M. Cao, T. Wang, R. Ye, J. Helmann // Mol. Microbiol. 2002.- Vol. 45, №5.-P. 1267-1276.

115. Chandra, A.K. Streptomycin dependent B. Subtilis, streptomycin sensitivity of spontaneously reverted mutants / A.K. Chandra et al. // Indian J. Exp. Biol. 1967. - Vol. № 5. -P. 263-4.

116. Dowds, B. The oxidative stress response in Bacillus subtilis / B. Dowds//Microbiol. 1994. - Vol. 124, № 3. - P. 255-263.

117. Errigton, J. Basillus subtilis sporulation, regulation of gene expression and control of morfologensis. / J Errigton // Microbiol. Rev.- 1993. -Vol.57, № 1.-P. 1-33.

118. Faust, R. Extrachromosomal DNA in Bacillus thurigiensis var.kurstahi var. finitimus, var sotto and in bacillus popilliae. / R. Faust, J. Spizizen, V. Gage , R.Travers // J. Invertor. Pathol. 1979. Vol. 33, № 2. - P. 233-238.

119. Fleming, G.T. Plasmid instability in an industrial strain of Bacillus subtilis grown in chemostat culture / G.T. Fleming, J.W. Patching // J. Ind. Microbiol. 1994. - Vol. 13, № 2. - P.106-111.

120. Grohman, E. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria / E. Grohman, G. Mith, M. Espinosa // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2003. Vol. 67, № 2. - P. 277-301.

121. Gupta, R. Bacterial alkaline proteases: molecular approches and industrial applications / R. Gupta, Q.K. Beg, P. Lorenz // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - Vol. 59, № 1. - P. 15-32.

122. Ito, S. Enhancedprohave acguired resistance to vancomycin and ristocttin / S. Ito, Y. Ochta, M. Shimooka, et al // Agr. And Biol. Chem. 1991. - Vol. 55, № 9. - P. 2387-2391.

123. Kobayashi, T. Purification and properties of an alkaline protease from alkalophilic Bacillus sp. KSM K16 / T. Kobayashi, Y. Hakamada, S. Adachi // Appl. Microbiol, and Biotechnol. - 1995. - Vol. 43, № 3. - P. 473-481.

124. Long, R. On bacterial dissociation / R. Long // Theor. Biol. 1977. -Vol. 64, № 4. - P. 761-764.

125. Maiden, M.C.J. Horizontal genetic exchange, evolution, and spread of antibiotic resistance in bacteria / V.C.J. Maiden // Clin. Infec. Diseases. 1998.-Vol. 27, № l.-P. 12-20.

126. Mala, B. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases / B. Mala, M. Aparna, S. Mohini // Microbiol, and Molecular Biology. 1998. - Vol. 62, № 3. - P. 597-635.

127. Maravic, G. Microbiol resistance to macrolide lincosamide -streptogramin type antibiotics based on ribosome methylation / G. Maravic, M. Flogel //Apll. Microbiol, and Biotechnol. - 1995. - Vol. 43, № 3. - P. 389-393.

128. Mascher, T. Cell wall stress responses in Bacillus subtilis: the regulator network of the bacitracin stimulon / T Mascher, N. G. Margylis, T. Wang, R.W. Ye, J. D. Helmann // Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 47, № 5.-P. 1591-1604.

129. Mohapatra, B.R. Production of industrial enzyme (amylase, carboxymethylcellulase and proteases) by bacteria isolated from marien sedimentary organisms / B.R. Mohapatra, M. Bapuji, A. Sree // Acta biotechnol. 2003. - Vol. 23, № 1. - P. 75-84.

130. Molecular and biotechnological aspects of microbiol proteases / M.B. Rao, A.M. Tanksale, M.S. Ghate et al // Microbiol. Mol. Biol. Rew. -1998. Vol. 73, № 62. - P. 597-635.

131. Puri, S. Optimization of alkaline protease production from Bacillus sp. by response methodology / S. Puri, B. Q. Khalil, R. Gupta. // Curr. Microbiol. 2002. - Vol. 44, № 4. - P. 286-290.

132. Spizizen, J. Transformationin genetic traits associated with sporulation in Bacillus subtilis / J. Spizizen, B. Reilly, B. Dahl // Proc.XI Internat Congr. Genetics.- 1963. Vol. 1, № 3. - P.339-402.

133. Sung, H. Adaptive, or stationary phast. Mutagenesis, a component of bacterial differentiation in Bacillus subtilis / H. Sung, Yasbin R. // J. Bacterid. 2002. - Vol. 84, № 20. - P. 5641-5653.

134. The genetic basis of the aggregaition system in Bacillus thurringiensis subsp. israelensis is locate on the large conjugative plasmid px016 / S. Jenstn, A. Wilcks, S. Petersen et al // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177, № 10.-P. 2914-2917.

135. Tsuge, K. One step assembly of DNA fragments with a designed order and orientation in Bacillus subtilis plasmid / K. Tsuge, K. Matsui, M. Itaya //Nucleic Asids Res. 2003. -Vol. 31, № 21. - P. 126-133.

136. Ueda, M. Genetic immobilization of proteins on the yeast cell surface / M. Ueda, A. Tanaka // Biotechnol Adv. 2000 - Vol. 18, № 2. - P. 121-140.

137. Wahlstrom, E. The extracytoplasmic folding factor PrsA is reguried for protein secretion only in the presense of the cell wall in Bacillus subtilis / E. Wahlstrom, M. Vitikainen, V.P. Kotinen // Microbiology. -2003. Vol. 149, № 3. - P. 569-577.

138. Yang, J. Production and purification of protease from Bacillus subtilis that can deproteinize wastes / J. Yang, I. Shih, Y. Tzeng // Enzyme and Microb. Technnol. -2000.- Vol. 26, № 5-6.- P. 406-413.