Получение и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis

Хазиев, Артур Фатыхович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis"

На правах рукописи

Хазиев Артур Фатыхович

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПРОТЕАЗЫ, СИНТЕЗИРУЕМОЙ BACILLUS SUBTILIS

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва; Федеральном государственном унитарном предприятии "НПО "Микроген" Министерства Здравоохранения Российской Федерации, филиал "Иммунопрепарат", г. Уфа.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Михайлова НА, доктор биологических наук, Блинкова Л.П.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Баснакьян И.А. доктор медицинских наук, профессор Вертиев Ю.В.

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита состоится " *//" мА^утЛ 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Яковлева И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ;

Актуальность проблемы

В современной медицине широко применяются лекарственные препараты, имеющие ферментную природу. В. 1996 г. мировой объем производства ферментов осуществлен на 1 млрд. долларов США (Godfrey Т.; West S., 1996). При этом доля ферментов медицинского назначения составляла более 10 % от этой суммы. Основным источником их получения являются органы и ткани животных, например, цито-хром С из бычьего сердца, панкреатин, трипсин, тестикулярная гиалуронидаза, аце-тилхолинэстераза из эритроцитов и т.д. (Веремеенко К.Н., 1971; Знаменская Л.В. и др., 1986; Глянцев СП., Саввина.Т.В., 1996; Hartley B.S., 1960; Диксон М., Уэбб Э., 1982).

Однако в связи с достижениями в области вирусологии и открытием прионо-вых заболеваний, по рекомендации ВОЗ, использование препаратов из тканей животных с каждым годом сокращается. Поэтому получение ферментов путем микробиологического синтеза является актуальной проблемой.

Из множества известных ферментов микробного происхождения практическое применение в медицине и различных отраслях промышленности нашли протеолити-ческие ферменты, доля которых в мировом производстве достигает 60 % (Godfrey Т.; West S., 1996). В связи с этим, исследователи уделяют большое внимание разработке технологичных способов получения протеолитических ферментов, продуцируемых микроорганизмами (Выборных С.Н. и др., 1990; Паршина С.Н. и др., 1990; Слабо-спицкая А.Т. и др., 1990; Демина Н.С., Лысенко СВ., 1991; Глянцев СП., Саввина Т.В., 1996; Егоров Н.С, 1996; Qiu Xiubao et al., 1994; Chang Qinghoug, Chen Jia-Jong,1995).

В научной литературе описаны способы микробного биосинтеза протеолитиче-ских ферментов при культивировании штаммов рода Bacillus, используемых для получения этих препаратов в лабораторных условиях и в крупномасштабных производствах (Мартьянов В.А. и др., 1989; Паршина С.Н. и др., 1990; Северин А.И. и др., 1990; Говорунова В.А. и др., 1991; Знаменская Л.В. и др., 1995; Ицкович Е.Л. и др., 1995; Дембровская Е.М. и др., 1996).

В настоящее время в медицинской при

производстве питательных сред и органопрепаратов (церебролизина, церебролизата, сирепара). Кроме того, их используют как самостоятельные лекарственные препараты (террилитин, терридеказа, протосубтилин, стрептокиназа, мезим форте, ируксол и т.д.) при терапии различных заболеваний; органов пищеварения, глаз, сердечнососудистой системы, при гнойно-воспалительных заболеваниях, онкологической патологии и др.

С 1989 года в Уфимском НИИВС им. И.И. Мечникова под руководством д.м.н., профессора . Н.А Михайловой было - начато изучение штаммов бактерий Bacillus subtilis,, обладающих антагонистической активностью. При их; культивировании отходом является фильтрат культуральной жидкости с высокой ферментативной активностью, обусловленной протеолитическими, амилолитическими, липолитическими ферментами.

При исследовании продукта биосинтеза Bacillus subtilis 3 Н, получившего название Бактилин (Михайлова Н.А, и др., 1998; Холодная Ж.В., 1999), установлено, что его действие связано с двумя протеазами - металлопротеазой и минорными примесями сериновой протеазы, имеющими молекулярную массу 29±2 kD, активность в диапазоне рН 6,0-12,0 и субстратную специфичность в отношении большого числа белков.

Однако помимо протеаз в комплексе содержатся примеси белковой, липидной, полисахаридной. природы, а также остатки минеральных солей, которые, по-видимому, совокупно обусловливают некоторую биологическую токсичность бакти-лина, что делает невозможным его медицинское применение.

Существуют различные способы очистки протеолитических ферментов: высаливание, ионообменная, гель- и аффинная хроматографии, избирательная адсорбция на нерастворимых носителях, изофокусирование, электрофорез и т.д. (Остерман Л.А., 1985;СкоупсР., 1985.).

В экспериментах многим исследователям удавалось получить высокоочищен-ные препараты протеаз, комбинируя между собой различные методы выделения и очистки. Однако лабораторные методы чрезвычайно трудоемки, малопроизводительны и относительно дороги. Кроме того, их невозможно полностью адаптировать к условиям промьшшетптого производства (Черкасов А.Н., Пасечник В.А., 1991;

Демина Н.С., Лысенко СВ., 1995; Takegawa Kaoru et al., 1993). Все это обосновывает необходимость поиска оптимальных технологических приемов для разработки эффективных способов получения и очистки ферментов.

Цель работы

Получение, очистка, стабилизация и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis ЗНв различных питательных средах при периодическом глубинном гомогенном культивировании.

Задачи исследования

1. Подобрать состав питательной среды для получения препарата с оптимальными физико-химическими и биологическими свойствами.

2. Изучить протеазосинтетическую активность морфологических вариантов промышленного штамма-продуцента Bacillus subtilis ЗН и выбрать наиболее активные клоны.

3. Определить рациональный способ получения посевного материала.

4. Получить стандартный нативный ферментный препарат, содержащийся в культуральной жидкости после выращивания наиболее активного клона Bacillus subtilis ЗН методом периодического глубинного гомогенного культивирования с использованием мочевино-дрожжевой среды и выбранного способа подготовки посевной культуры.

5. Разработать оптимальные методы очистки и стабилизации протеолитическо-го фермента.

6. Изучить физико-химические свойства и специфическую биологическую активность полученного ферментного препарата.

7. Испытать лабораторную схему получения протеолитического фермента в производственных условиях.

Научная новизна

Научно обоснована промышленная технология получения металлопротеазы Bacillus subtilis ЗН.

Увеличен уровень биосинтеза протеазы путем отбора высокоактивных клонов штамма-продуцента и их культивирования в мочевино-дрожжевой среде с использо-

ванием подобранной схемы подготовки посевного материала.

Оптимизированные условия культивирования позволили применить метод ультрафильтрации для эффективной очистки фермента..

Показана возможность стабилизации очищенного протеолитического фермента путем иммобилизации на полиглюкине и внутримолекулярной сшивки глютаровым альдегидом.

Очищенная металлопротеаза и ее модифицированные аналоги охарактеризованы по величинам рН и температурным оптимумам, субстратной специфичности, молекулярной массе, кинетике Михаэлиса-Ментен.

Экспериментально доказана раноочищающая и ранозаживляющая активность полученного протеолитического препарата.

Практическая значимость работы

Разработана промышленная технология.получения очищенного протеолитического фермента, включающая следующие стадии:

- предварительная очистка дрожжевого экстракта от балластных белков перед приготовлением питательной среды с использованием метода ультрафильтрации на мембранах с пропускной способностью 15 kD;

- выбор высокоактивных клонов штамма-подуцента Bacillus subtilis ЗНпо морфологическим характеристикам;

- периодическое глубинное гомогенное культивирование производственного штамма Bacillus subtilis ЗН в питательной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной;

- освобождение ферментсодержащей культуральной жидкости от микробных клеток методами сепарирования и микрофильтрации;

- очистка фракции, обладающей протеолитической активностью, от балластных белков методом ультрафильтрации на мембранах с пропускной способностью 15 Ш.

Выход протеолитического фермента, полученного по этой технологии, достигает не менее 70 %, а его удельная активность составляет не менее 40 ПЕ/мг белка.

Препарат очищенного протеолитического фермента может быть рекомендован, для разработки лекарственного средства с раноочищающей и ранозаживляющей активностью.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Оптимизирован процесс периодического глубинного гомогенного культивирования высокоактивных клонов штамма Bacillus subtilis ЗН, продуцирующего про-теазу, с использованием мочевино-дрожжевой питательной.среды и рациональной схемы подготовки посевного материала.

2. Подобраны условия выделения, очистки, иммобилизации и стабилизации протеазы, обеспечивающие получение препарата с высокой удельной протеолитиче-ской активностью.

3. Очищенный стабилизированный протеолитический фермент является метал-лопротеазой с широким оптимумом величины рН, температуры, а также обладает в опытах in vivo раноочищающим и ранозаживляющим действием.

Апробация работы

Диссертация апробирована на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (г. Москва, ноябрь 2003 г.) и заслушана на Ученом Совете ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, филиал «Иммунопрепарат», г. Уфа.

Материалы доложены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 95-летию УфНИИВС им. И.И. Мечникова ГУЛ «Иммунопрепарат» (г. Уфа, июнь 2000 г.) и Интернациональном Конгрессе «Биокатализ-2002».

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 121 странице. Она состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных результатов (5 глав), заключения и выводов. Список литературы включает 174 источника (121 отечественный и 53 зарубежных). Работа содержит 21 рисунок и 17 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований

Объекты исследований

Использованы штамм-продуцент Bacillus subtilis ЗНи питательные среды с солевым составом (г/л): калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 0,3; аммоний сернокислый — 2,0; натрий лимоннокислый 5,5-водный — 2,0; медь сернокислая 5-водная - 0,005; цинк сернокислый 7-водный - 0,004; железо (II) сернокислое 7-водное — 0,0005; кальций хлористый - 0,165; марганец (II) сернокислый 5-водный -

0,05; магний сернокислый 7-водный - 0,3; d-мальтоза для бактериологических целей - 5,0; рН среды 7,0±0,2.

В качестве органического источника азота в одной питательной среде применяли пептон сухой ферментативный для бактериологических целей в количестве 5 г/л, в другую питательную среду добавляли мочевину в конечной концентрации 0,5 % и 150 мл/л среды жидкого дрожжевого экстракта производства ФГУП "НПО "Микроген? МЗ РФ, филиал "Иммунопрепарат", г. Уфа.

Для выделения фермента использованы бесклеточные культуральные жидкости, полученные в процессе периодического гомогенного глубинного культивирования штамма-продуцента Bacillus subtilis ЗН в реакторе БИ0Р-100 в различных питательных средах.

Исследованы свойства полученных вариантов фермента.

Методы исследований

Периодическое глубинное гомогенное культивирование

Лиофильно высушенную культуру штамма Bacillus subtilis 3H дважды пересевали в жидкую питательную среду и инкубировали по 18-24 ч при 37°С. Культурой третьего пассажа засевали ферментер (АК-210) или реактор (БИ0Р-100), инкубировали при температуре 37°С с постоянным перемешиванием и оксигенацией.

Определение концентрации биомассы

Концентрацию микробных клеток в 1 мл культуральной жидкости определяли: на КФК - 2 МП при длине волны 540 нм или использовали отраслевой стандартный образец мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича на 10 ЕД.

Изучение морфологии

Для изучения морфологии микробной популяции готовили 10-кратные разведения исходной культуры, пробы высевали на казеиновый агар и выращивали в термостате при 37°С в течение 18-24 ч, затем для дальнейшего исследования выделяли S- и R-варианты.

Определение растворенного кислорода

Концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде определяли при помощи портативного оксиметра HI 9142 фирмы "HANNA" (Госреестр РФ №14302-99).

Определение протеолитической активности

Определение протеолитической активности проводили по гидролизу 1 % раствора казеина, очищенного по Гамерстену. За единицу протеолитической активности принимали количество фермента, которое за 1 мин при 37°С повышает в неосаждае-мых трихлоруксусной кислотой продуктах протеолиза содержание тирозина на 1 микроэквивалент или за 10 мин при той же температуре повышает оптическую плотность раствора при 280 нм на 1 единицу.

Определение скорости ферментативной реакции

Скорость ферментативной реакции (V) определяли по концентрации тирозина, выделяемого в реакции за 1 мин и фиксируемого по оптической плотности при длине волны 280 нм. Расчет его количества осуществляли по калибровочной кривой.

Единицы скорости реакции выражали в мкг-экв(тирозина)/(мл х мин) (Варфало-меев С.Д., Гуревич К.Г., 1999)..

Построение калибровочной кривой проводили с использованием навески тирозина (1 мг/мл), которую растворяли в 2,5% растворе трихлоруксусной кислоты в 0,05 М фосфатном буфере. Из этого раствора готовили последовательные разведения тирозина, соответствующие 50; 100; 150; 200; 250 мкг/мл.

Приготовление 0,1 М фосфатного буфера; 1% раствора казеина и 5% раствора трихлоруксусной кислоты проводили по ФС 42-2245-90 на террилитин сухой.

Определение белка

Концентрацию белка в растворах определяли по методу И.О. Ьстму (1951). В качестве калибровочного препарата применяли ОСО белка ГИСК им. Л.А. Тарасеви-ча для этого метода.

Определение величины удельной активности

Удельную активность рассчитывали как отношение величины протеолитиче-ской активности к величине концентрации белка и выражали в ПЕ/мг белка (СкоупсР., 1985).

Определение выхода фермента на стадии очистки

Выход фермента оценивали по соотношению общей протеолитической активности до и после стадии очистки и выражали в % (Скоупс Р., 1985).

Определение величины степени очистки

Степень очистки вычисляли как соотношение удельной активности фермента до и после стадии очистки и выражали в единицах кратности очистки (Скоупс Р.; 1985).

Определение влияния рН на протеолитическую активность

Зависимость активности протеолитического фермента от величины рН определяли с 1% раствором казеина. Для значений рН 6,0-8,5 применяли 0,1 М фосфатно-щелочной буфер; для рН 9,0-11,5 - 0,1 М глицин-щелочной буфер. Буферы готовили с интервалом величины рН, равным 0,5.

Определение субстратной специфичности

Субстратную специфичность протеолитического фермента определяли. методом диффузии в агаре (Егоров Н.С.,.1971). Активность протеолитического фермента определяли по диаметру зоны расщепления 1% субстрата в 1% агаре. В качестве субстратов использовали казеин, желатину, коллаген, бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин, трипсин, пепсин.,

Определение кинетических параметров уравнения Михаэлиса-Ментен

Для определения кинетических параметров уравнения Михаэлиса-Ментен в качестве субстрата использовали казеин по Гамерстену в концентрации 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0; 4,0%.

Кинетические параметры уравнения представляли в системах координат Лайнувера-Берка и Мармассе (Келети Т., 1990).

Определение влияния температуры на протеолитическую активность

Температурный оптимум протеолитического фермента определяли с 1 % раствором казеина в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,6 (Келети Т., 1990).

Определение влияния температуры на инактивацию протеолитического фермента

Динамику инактивации протеолитического фермента определяли путем его инкубации при различных температурных режимах (Келети Т., 1990).

Определение влияния ингибиторов на протеолитическую активность

В качестве ингибиторов использованы диизопропилфторфосфат и этилендиа-минтетрауксусная кислота (Долидзе Д.А. и др., 1974).

Стабилизация протеолитического фермента

Активацию полиглюкина осуществляли с помощью натрия йоднокислого мета, а внутримолекулярную сшивку - глютарового альдегида (Мартинек К., 1980).

Солевое фракционное осаждение

Фракционирование высаливанием проводили сухой солью сульфата аммония. Величину рН раствора фермента поддерживали на уровне 7,0-8,0 (Скоупс Р., 1985).

Фракционирование методом гель-хроматографии

Гель-хроматографию проводили на колонке, заполненной сефадексом G-75 с рабочим объемом 1000 мл и размерами 4,5x80 см (Скоупс Р., 1985).

Определение молекулярной массы методом гель-хроматографии

Молекулярную массу (м.м.) определяли методом гель-хроматографии на колонке, заполненной сефадексом G-75 с рабочим объемом 1000 мл и размерами 4,5x80 см. В качестве калибровочных белков использовали препараты фирмы "Sigma" овальбумин (м.м. 43 KD), химотрипсиноген (м.м. 25 KD), рибонуклеазу (м.м. 13,7 KD) (Остерман Л.А., 1985).

Фракционирование методом ионообменной хроматографии

Ионообменную хроматографию проводили на анионообменнике (DEAE-целлюлоза) и катионообменнике (КМ-целлюлоза) в статических условиях (Остерман Л. А., 1985).

Фракционирование адсорбцией на неорганических сорбентах

В качестве адсорбентов применяли гели гидроокиси алюминия и фосфата кальция. Процесс проводили методом сорбции в объеме при непрерывном перемешивании компонентов в течение 30 мин, температуре 20±3°С и рН 7,5±0,5 (Скоупс Р.; 1985).

Фракционирование методом ультрафильтрации

Процесс ультрафильтрации осуществляли в модуле АР-2 с заправленными в него мембранами ВПУ-15.

Определение константы скорости реакдии инактивации

Константу скорости реакции инактивации протеолитического фермента определяли графическим методом спрямления кинетических данных (Варфаломеев С.Д., ГуревичК.Г.,1999).

Изучение раноочишаюшего и ранозаживляющего действия

Работа проведена на 28 белых беспородных крысах (самках) массой 180-200 г. Раноочишаюшее и ранозаживляюшее действие протеолитического фермента изучали на модели плоскостных полнослойных кожных раю (Меркулов Г.А., 1969; Стручков В.И. и др., 1975 КостЕ.А., 1975; Кованова В.В., 1978). В качестве препарата сравнения использовали коммерческую коллагеназу КК (ФГУП НПО "Микроген" МЗ РФ, филиал "Иммунопрепарат", г. Уфа).

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили по обшепринятым методикам (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962; Беленький М.Л., 1963). Результаты считали статистически значимыми при р<0,05. Значимость различий между средними (X)

значениями экспериментальных; данных оценивали' по критерию Стьюдента или

по X .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Известно, что компоненты питательной среды могут, в значительной степени, оказывать воздействие на микробную культуру. В исследованиях Ж.В. Холодной (1999) подобрана питательная среда, обеспечиваюшая оптимальный синтез фермента, а также достаточное количество биомассы, обладающей антагонистической активностью. Однако полученный фермент проявлял биологическую токсичность, а процедуры его очистки оказались недостаточно эффективными.

Влияние компонентов питательной среды на процесс накопления биомассы и синтез протеазы оценивали на основе изучения действия неорганического и органического компонентов.

Выявлено, что отсутствие сульфата железа позволяет микробным клеткам, минуя лаг-фазу, переходить в экспоненциальную фазу роста. При отсутствии сульфата меди лаг-фаза была короткой и составляла 18 ч. Ее продолжительность увеличива-

лась при выращивании на питательной среде, в которую не добавляли сульфата аммония или сульфата цинка. Удаление из питательной среды фосфата калия и цитрата натрия приводило к снижению количества биомассы, а отсутствие хлорида кальция -к полному подавлению роста клеток.

Полученные нами результаты в этой серии экспериментов не выявили статистически значимого усиливающего влияния неорганических ингредиентов среды на синтез протеазы.

Для изучения влияния органических субстратов питательной среды на синтез фермента пептон заменяли на химически определенный компонент мочевину, а также на очищенный от высокомолекулярных белков дрожжевой экстракт.

Использование в питательной среде дрожжевого экстракта и мочевины позволило получить более высокую удельную продуктивность. фермента по сравнению с пептонной питательной средой (таблица 1).

Таблица 1

Результаты выращивания S- и R-форм Bacillus subtüis ЗН на средах с раз-

личными источниками азота (Х±т)

Морфологический вариант культуры • Количество; биомассы, млрд. кл/мл Протеолити- ческая; активность, ПЕ/мл Продолжительность процесса выращивания, ч Удельная продуктивность, -ПЕ/млрд. кл

Питательная среда с пептоном i

Sr 40±2 3,9±0,5 30,2±4,0 0,0975

R 24±2 2,1 ±0,3 14,0±0,5 0,0875

Питательная среда с дрожжевым экстрактом и мочевиной

S 1б±3 4,3±0,4 25,0±3 0,268

R 12±2 1,9±0,3 20,0±2 0,158'

В связи с этим в дальнейших1 исследованиях при культивировании штамма-продуцента использовали мочевино-дрожжевую среду.

Известно много способов получения штаммов-продуцентов, в частности путем мутагенеза и целенаправленной селекции (Дебабов В.Г., Лившиц ВА, 1988).

Возможность управления свойствами культур с помощью отбора R- и S-морфологаческих вариантов; позволяет изменять биосинтетическую активность штамма-продуцента.

В процессе выращивания Bacillus subtilis 3Hобнаружены различия в морфологии выросших на плотной питательной среде колоний, диссоциировавших на R- и S- варианты. Их культивирование на разных питательных средах не выявило различий в накоплении протеолитической активности, однако удельная протеазосинтети-ческая активность на мочевино-дрожжевой питательной среде оказалась значительно выше, чем на пептонной и особенно у S-вариантов.

В дальнейших исследованиях S-вариантов выявлена их способность к расщеплению на несколько типов колоний.

В результате изучения протеазосинтетической активности 200 колоний, находящихся в S-форме, обнаружено, что 6 из них обладали максимальной активностью (4-6 ПЕ/мл). Визуально они представляли собой маленькие колонии, размером, не превышающим 1 мм, с диаметром зоны гидролиза казеина 12-17 мм.

0 12 3

Время, сут

Рис. 1. Динамика синтеза протеолитического фермента активными S-клонами Bacillus subtilis ЗН

Динамика синтеза протеолитического фермента у всех изученных клонов в

первые 2 сут различалась незначительно (рис. 1). В процессе дальнейшего культивирования накопление протеазы у клонов 1,2,3,5 не происходило. У клонов 4 и 6 продолжался синтез фермента и через 72 ч протеолитическая активность у клона 4 составляла 32,7 ПЕ/мл, а у клона 6 - 35,9 ПЕ/мл. Величины показателей протеолити-ческой активности, полученные для клонов 6 и 4, 10-кратно превысили активность исходной популяции.

При переходе от лабораторного способа биосинтеза фермента к экспериментально-производственному проведено масштабирование процесса периодического, глубинного гомогенного культивирования штамма Bacillus subtilis ЗН.

Для этого вначале изучили влияние способа подготовки посевной культуры на уровень накопления протеазы (таблица 2).

Таблица 2

Данные по использованию различных схем инокуляции реактора посев-

ной культурой Bacillus subtilis ЗН (X±m)

Способ подготовки посевной культуры- Концентрация биомассы в реакторе после: инокуляции, млрд. кл/мл Концентрация; биомассы в реакторе в конце. процесса, млрд; кл/мл Протеолитическая активность, ПЕ/мл Продолжительность • культивирования, ч

Колба, ферментер (10 л), реактор (72 л) (3 пассажа) 0,47±0,1 15,4±1,4 15,6±2,5 22,6±1,1 (с учетом выращивания иноку-лята)

Колба, реактор (24 л), реактор (72 л) (3 пассажа) 1,08±0,12 15,6±1,4 18,1±1,9 22,0±0,9 (с учетом выращивания иноку-лята)

Колба, реактор (72 л) (2 пассажа) 0,036±0,007 15,4±1,4 15,9±1,9 25,0±1,2

Из данных таблицы 2 видно, что наибольший уровень протеолитической активности 18,1 ±1,9 ПЕ/мл в течение 22,0±0,9 ч достигнут при использовании культуры 3 пассажа с посевной дозой 1,08±0,12 млрд. кл/мл. При использовании культуры 2 пассажа с посевной дозой 0,036+0,007 млрд. кл/мл уровень протеолитической активности составлял 15,9± 1,9 ПЕ/мл, при этом продолжительность культивирования : составила 25±1,2 ч. Разница в уровне накопления протеазы статистически не значима. Однако подготовка культуры с 2 пассажами, минуя промежуточное выращивание в реакторе, позволяет накапливать достаточный уровень протеолитической активности, одновременно упрощая аппаратурное оформление процесса культивирования.

Поэтому для получения протеолитического фермента в дальнейших исследованиях для засева использовали культуру второго пассажа.

В масштабированном процессе периодического культивирования изучены динамика накопления биомассы, протеолитическая активность фермента, концентрация глюкозы и растворенного кислорода (рис. 2).

Кривая роста культуры имела лаг-фазу продолжительностью 4 ч, экспоненциальную фазу -12 ч, после чего микробная популяция замедляла рост и переходила в стационарную фазу.

Известно, что при утилизации мальтозы, используемой в питательной среде в качестве источника углеводов, в процессе роста культуры происходит выделение глюкозы, поэтому была определена динамика ее концентрации.

Из рис. 2 следует, что в первые 3 ч глюкоза в культуральной жидкости отсутствовала. Затем происходило ее интенсивное накопление, достигающее максимальной величины к 8 ч культивирования. В последующие 2ч концентрация глюкозы снижалась вследствие интенсивного роста микробной популяции и снова увеличивалась, достигая второго максимального значения к 14 ч от начала процесса. Далее ее концентрация вновь снижалась до минимальных значений к 22 ч, чему соответствовала фаза замедления скорости роста микробной популяции.

Клетки

Протеаза Глюкоза Кислород

Время, ч

Рис. 2. Динамика основных параметров культивирования Bacillus subtilis ЗН

В процессе культивирования изучали также концентрацию растворенного кислорода в питательной среде при давлении подаваемого воздуха 0,2 кгс/см2 (рис. 2). Растворенный кислород имел минимальную концентрацию в период наибольшей активности роста популяции.

Эксперименты показали, что увеличение давления воздуха на входе в реактор не приводило к повышению растворимости кислорода.

Таким образом, в ходе проведенных исследований установлены оптимальные значения параметров процесса культивирования: инокуляция реактора посевной культурой протеолитически активного клона второго пассажа с посевной дозой 0,036±0,007 млрд. кл/мл, подача воздуха под давлением 0,2 кгс/см2. При данных условиях за 25,0±1,2 ч выращивания получена концентрация биомассы, равная 15,4+1,4 млрд. кл/мл, обеспечивающая протеолитическую активность 15,9±1,9ПЕ/мл.

Следующая задача наших исследований состояла в выборе эффективных методов выделения и очистки фермента, полученного в процессе гомогенного глубинного культивирования на различных питательных средах.

Таблица 3

Сравнительная характеристика эффективности методов очистки протео-литического фермента

Метод очистки Удельная активность фермента, ПЕ/мг белка Выход фермента, %

1. Очистка протеолитического фермента, полученного на пептон-

ной питательной среде

Гель-хроматография 39,5+2,5 94,4±3,4

Высаливание 21,6±0,6 78,5±2,2

Адсорбция на геле фосфата 10,7±0,8 98,3±1,7

кальция

Адсорбция на геле гидроокиси алюминия 5,6±0,7 76,6±0,4

Ионообменная хроматография на КМ-целлюлозе 24,6811,26 98,5+0,7

Ионообменная хроматография на ОЕАЕ-целлюлозе 6,3±0,3 89,3±1,2

Ультрафильтрация ; 2,25+0,08 40,7±2,9

2. Очистка протеолитического фермента, полученного на дрожже-

вой питательной среде с мочевиной

Гель-хроматография 96,0±2,1 85,1+2,0

Ультрафильтрация 55,3±0,9 74,4±2,1

Отделение микробных клеток от ферментсодержащей культуральной жидкости без потерь протеолитической активности удалось осуществить методом микрофильтрации без механического побуждения.

Для очистки целевого продукта от балластных примесей использовали несколько методов: гель-хроматографию, ультрафильтрацию, осаждение сульфатом аммония, адсорбцию на неорганических сорбентах, ионообменную хроматографию. Сравнительная характеристика их эффективности в зависимости от состава

ферментсодержащей жидкости представлена в таблице 3.

При очистке материала, полученного на пептонсодержащей среде, высокие показатели по удельной активности и выходу фермента получены с использованием хроматографических методов и высаливания, которые считаются неэкономичными и трудоемкими для масштабирования в производстве.

При очистке ферментсодержащего материала, полученного на мочевино-дрожжевой питательной среде, повысилась эффективность более технологичного метода ультрафильтрации, что обосновывает возможность его использования в промышленных условиях.

По данным литературы, иммобилизация стабилизирует конформацию фермента, повышая стабильность иммобилизованных ферментов (Мартинек К., 1980; Уап-Коуа Н. ег а1., 1994 КоЬиус«Ы Какала ег а1., 2002).

В качестве водорастворимого носителя для иммобилизации использовали по-лиглюкин, активированный перйодатом натрия. Иммобилизованный фермент имел молекулярную массу 70 Ш.

Помимо этого для стабилизации фермента применили метод внутримолекулярных сшивок с использованием глютарового альдегида. Стабилизированный фермент представлял собой мономолекулярную структуру с протеолитической активностью. Стабилизирующее действие иммобилизации на полиглюкине и сшивки глютаровым альдегидом изучали в опьнах термоинактивации.

Полученные результаты свидетельствуют, что при 37°С время полуинактивации нативного фермента составляло 72 ч. Для фермента, иммобилизованного на по-лиглюкине, оно составляло 169,5 ч, а для фермента, стабилизированного глютаровым альдегидом - 12,8 ч. Однако при температуре 67°С активность нативного фермента обнаружить не удалось. Активность иммобилизованного на полиглюкине фермента обнаруживалась в течение 100 мин, а фермента, стабилизированного глютаровым альдегидом, регистрировалась в течение 150 мин. Это указывает на повышение стабильности активной конформации молекул.

На следующем этапе работы изучили физико-химические свойства различных форм фермента.

Максимальная активность нативного фермента выявлена при значениях

рН 7,0-10,0. Максимум протеолитической активности фермента, иммобилизованного на полиглюкине, обнаружен при величине рН 7,0. Фермент, стабилизированный глю-таровым альдегидом, имел наибольшую активность при значении рН 8,0.

Субстратная специфичность определена в отношении казеина, желатина, коллагена, бычьего сывороточного альбумина, яичного альбумина, трипсина, пепсина. Следует отметить, что активность в отношении термически денатурированных белков оказалась выше по сравнению с их нативными аналогами.

Экспериментальные данные, полученные в реакции протеолиза казеина, указывают, что при высоких концентрациях субстрата активность протеолитического фермента ниже, чем можно было бы ожидать теоретически по уравнению Михаэлиса-Ментен. Это свидетельствует об ингибировании протеолитической активности избытком субстрата. Иммобилизация протеолитического фермента на полиглюкине и стабилизация его глютаровым альдегидом уменьшали ингибирующее действие субстрата.

Температурный оптимум нативного фермента отмечен при 52°С, с повышением температуры его активность резко падала. Фермент, иммобилизованный на полиглюкине, имел температурный оптимум 57°С, а для фермента, сшитого глютаровым альдегидом, он соответствовал 62°С.

Определение действия ингибиторов сериновых протеаз (диизопропилфторфос-фат) и металлопротеаз (этилендиаминтетрауксусная кислота) в отношении протеоли-тического фермента, выявило, что диизопропилфторфосфат не ингибировал активности фермента, а этилендиаминтетрауксусная кислота вызывала полную потерю про-теолитической активности.

При изучении биологической активности протеолитического фермента на модели плоскостной раны выявлено выраженное раноочищающее и ранозаживляющее действие. Наибольшей активностью обладал раствор протеолитического фермента в концентрации 25 ПЕ/мл. Эффективность его раноочищающего и ранозаживляющего действия превосходила таковую у препарата сравнения — коллагеназы КК.

ВЫВОДЫ

1. Научно обоснована и разработана промышленная технология получения ме-таллопротеазы, синтезируемой Bacillus subtilis ЗН, которая включает периодическое глубинное гомогенное культивирование и последующую очистку фермента методами мембранного разделения.

2. Оптимизированы параметры процесса культивирования штамма-продуцента, обеспечивающие максимальную продукцию фермента. Выбран оптимальный состав питательной среды по органическому компоненту путем замены пептона мочевиной с добавлением очищенного дрожжевого экстракта. Определен способ подготовки посевного материала, обеспечивающий получение высокоактивной культуральной жидкости при минимальной посевной дозе.

3. Разработан способ получения очищенного фермента, включающий отделение микробных клеток от ферментсодержащей культуральной жидкости без потерь протеолитической активности с помощью микрофильтрации и очистку фермента от неактивных белков с использованием метода ультрафильтрации.

4. Получен стабилизированный протеолитический фермент путем иммобилизации на полиглюкине и сшивки глютаровым альдегидом.

5. Показано, что полученный протеолитический фермент и его модифицированные аналоги являются металлопротеазами с охарактеризованными параметрами (молекулярными массами, оптимальными значениями рН, температуры и спектрами субстратной специфичности).

6. Экспериментально доказана раноочищающая и ранозаживляющая активность протеолитического фермента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хазиев А.Ф., Гатауллин А.Г., Михайлова Н.А. Изучение субстратной специфичности протеолитического ферментного комплекса «Бактилин» // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 95-летию УфНИИВС им. И.И. Мечникова ГУЛ «Иммунопрепарат», г. Уфа, 5-7 июня 2000 г., т. 1., с. 10-12.

2. Хазиев А.Ф., Гатауллин А.Г., Михайлова Н.А. Сравнительное изучение эффективности методов очистки протеолитического фермента «Бактилин» // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 95-летгао: УфНИИВС им. И.И. Мечникова ГУЛ «Иммунопрепарат», г. Уфа, 5-7 июня 2000 г., т. 1., с. 12-16.

3. Хазиев А.Ф., Гатауллин А.Г., Михайлова Н.А. Иммобилизация Бактилина на нерастворимых носителях // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 95-летию УфНИИВС им. И.И. Мечникова ГУП «Иммунопрепарат», г. Уфа, 5-7 июня 2000 г., т. 1., с. 16-17.

4. Хазиев А.Ф., Михайлова,Н.А., Алсынбаев М.М. Изучение эффективности методов очистки металлопротеазы, продуцируемой Bacillus subtilis //Журн. микро-биол., 2002,6: 75-78.

5. Khaziev A.F., Mikhailova N.A. Development ofthe method foT the stabilization of proteolytic enzyme produced by bacteria of Genus Bacillus // International conference "Biocatalysis-2002": Fundamentals&Applications. 2002, p. 103-104.

6. Хазиев А.Ф., Михайлова НА., Алсынбаев М.М. Изучение свойств высоко-очищенной металлопротеазы, продуцируемой Bacillus subtilis II Журн. микробиол. -2003,3:91-93.

Принято к исполнению 16/02/2004 Исполнено 17/02/2004

Заказ № 50 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 ^го^аийогеГегайи

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хазиев, Артур Фатыхович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Протеолитические ферменты бактериальной природы, ме- 9 тоды получения и очистки

Глава 2. Способы стабилизации ферментов и сфера их применения

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Объекты и методы исследований

3.1. Объекты исследований

3.2. Методы исследований

Глава 4. Разработка способа микробного биосинтеза протеолитиче- 44 ского фермента

4.1. Изучение влияния компонентов питательной среды на рост и 44 продукцию протеазы

4.2. Исследование протеазосинтетической активности Bacillus 47 subtilis ЗН

4.3. Масштабирование процесса культивирования и биосинтеза про- 52 теолитического фермента штаммом-продуцентом Bacillus subtilis ЗН

Глава 5. Разработка способа очистки протеолитического фермента 60 Bacillus subtilis 3 Н

5.1. Очистка протеолитического фермента, полученного в питатель- 60 ной среде с пептоном

5.2. Очистка протеолитического фермента, полученного в питатель- 72 ной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной

Глава 6. Получение стабильных форм протеолитического фермента

6.1. Иммобилизация протеолитического фермента на полиглюкине

6.2. Образование внутримолекулярных сшивок глютаровым альде- 79 гидом

6.3. Изучение стабильности нативного, иммобилизованного на полиглюкине и сшитого глютаровым альдегидом протеолитического фермента

Глава 7. Изучение свойств различных форм протеолитического 83 фермента

7.1. Влияние величины рН на протеолитическую активность

7.2. Определение субстратной специфичности

7.3. Изучение кинетики протеолиза

7.4. Изучение температурного оптимума

7.5. Молекулярная масса

7.6. Ингибиторный анализ

7.7. Изучение раноочищающего и ранозаживляющего действия про- 93 теолитического фермента

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis"

Актуальность проблемы В современной медицине широко применяются лекарственные препараты, имеющие ферментную природу. В 1996 г мировой объем производства ферментов осуществлен на сумму 1 млрд. долларов [130]. При этом доля ферментов медицинского назначения составляла более 10 % от этой суммы, основным источником их получения являются органы и ткани животных, например: цитохром С из бычьего сердца, панкреатин, трипсин, тестикулярная гиалуронидаза, ацетилхолинэстераза из эритроцитов и т.д. [23, 28,41,102,134], Однако в связи с последними достижениями вирусологии и открытием прионовых заболеваний, по рекомендации ВОЗ, использование препаратов из тканей животных с каждым годом сокращается. Поэтому получение ферментов путем микробиологического синтеза является актуальной проблемой.Из множества известных ферментов микробного происхождения практическое применение в медицине и различных отраслях промышленности нашли протеолитические ферменты. Их доля в мировом производстве равна 60 % [130]. В связи с этим разработке технологических способов получения протеолитических ферментов, продуцируемых микроорганизмами, исследователи уделяют большое внимание [25,28, 38, 71, 94, 106,123, 161], В научной литературе детально представлены способы микробного биосинтеза протеолитических ферментов при культивировании штаммов рода Bacillus с целью получения протеолитических ферментов в лабораторных и в крупномасштабных производствах [29, 36, 55, 60, 77, 94,103], В настоящее время в медицинской промышленности протеазы применяют при производстве питательных сред и органопрепаратов (Церебролизина, Церебролизата, Сирепара). Кроме того, их используют как самостоятельные лекарственные препараты (Террилитин, Терридеказа, Протосубтилин, Стрептокиназа, Мезимфорте, Ируксол, Knol и т,д,) при терапии различных заболеваний органов пищеварения, глаз, сердечно-сосудистой системы, гнойной хирургической патологии, онкологических заболеваний и т.д.С 1989 года в Уфимском НИИВС им. И.И. Мечникова под руководством Д.М.Н., профессора Н.А. Михайловой началось изучение антагонистически активных штаммов Bacillus subtilis. При их культивировании отходом является фильтрат культуральной жидкости, с высокой ферментативной активностью, обусловленной протеолитическими, амилолитическими, липолитическими ферментами.При исследовании продукта биосинтеза Bacillus subtilis 3 И, получившего название Бактилин [114], установлено, что его действие связанно с двумя протеазами - металлопротеазой и минорными примесями сериновой протеазы, имеющими молекулярную массу 29+2 kD, активность в диапазоне рН 6,0-12,0 и субстратную специфичность в отношении большого количества белков.Однако помимо протеаз в комплексе содержатся примеси белковой, липидной, полисахаридной природы, а также остатки минеральных солей, которые, по-видимому, совокупно обусловливают некоторую биологическз^о токсичность Бактилина. Это делает невозможным его медицинское применение.Сушествз^ют различные способы очистки протеолитических ферментов: высаливание, ионообменная, гель- и аффинная хроматографии, избирательная адсорбция на нерастворимых носителях, изофокусирование, электрофорез и т.д. [89,105].В экспериментах многим исследователям удавалось получить высокоочищенные препараты протеаз, комбинируя между собой различные методы.Однако лабораторные методы чрезвычайно трудоемки, малопроизводительны, относительно дороги. Их невозможно полностью адаптировать к условиям промышленного производства [40, 117, 168]. Все это обосновывает необходимость поиска технологически приемлемых путей объединения эффективных способов получения и очистки ферментов.Цель работы Полз^ение, очистка, стабилизация и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis ЗН в различных питательных средах при периодическом глубинном гомогенном культивировании.Задачи исследования 1. Подобрать состав питательной среды для получения препарата с оптимальными физико-химическими и биологическими свойствами.2. Изучить протеазосинтетическую активность морфологических вариантов промышленного штамма-продуцента Bacillus subtilis ЗН и выбрать наиболее активные клоны, 3. Определить рациональный способ получения посевного материала.4. Получить стандартный нативный ферментный препарат, содержащийся в культуральной жидкости после выращивания наиболее активного клона Bacillus subtilis ЗН методом периодического глубинного гомогенного культивирования с использованием мочевино-дрожжевой среды и выбранного способа подготовки посевной культуры.5. Разработать оптимальные методы очистки и стабилизации протеолитического фермента.6. Изучить физико-химические свойства и специфическую биологическую активность полученного ферментного препарата.7. Испытать лабораторную схему получения протеолитического фермента в производственных условиях.Научная новизна Научно обоснована промышленная технология получения металлопротеазы Bacillus subtilis ЗН. Повышен уровень биосинтеза протеазы njnrcM отбора и культивирования высокоактивных клонов штамма-продуцента с использованием мочевинодрожжевой среды и рационально подобранной схемы подготовки посевного материала.Подобранные условия культивирования позволили использовать метод ультрафильтрации для эффективной очистки фермента.Показана возможность стабилизации очищенного протеолитического фермента, путем иммобилизации на полиглюкине, а также внутримолекулярной сшивкой глютаровым альдегидом.Очищенная металлопротеаза и ее модифицированные аналоги охарактеризованы по величинам рН и температурных оптимумов, субстратной специфичности, молекулярной массе, кинетике Махаэллиса-Ментен.Экспериментально доказана раноочищающая и ранозаживляющая активность полученного протеолитического препарата.Практическая значимость работы Разработана промышленная технология получения очищенного протеолитического фермента, включающая следующие стадии: - предварителънзоо очистку дрожжевого экстракта от балластных белков перед приготовлением питательной среды с использованием метода ультрафильтрации на мембранах с пропускной способностью 15 Ш; - выбор высокоактивных клонов штамма-подуцента Bacillus subtilis ЗН по морфологическим характеристикам; - периодическое глубинное гомогенное культивирование производственного штамма Bacillus subtilis ЗН в питательной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной; - освобождение ферментсодержащей культуральной жидкости от микробных клеток методами сепарации и микрофильтрации; - очистку фракции, обладающей протеолитической активностью, от балластных белков методом ультрафильтрации на мембранах с пропускной способностью 15 Ш. Выход протеолитического фермента, полученного по этой технологии, достигает не менее 70 %, а его удельная активность составляет, не менее 40 ПЕ/мг белка.Препарат очищенного протеолитического фермента может быть рекомендован для разработки лекарственного средства с ранозаживляющей активностью.Основные положения, выносимые на защиту 1. Оптимизирован процесс периодического глубинного гомогенного культивирования высокоактивных клонов штамма Bacillus subtilis ЗН, продуцирующего протеазу, с использованием мочевино-дрожжевои питательной среды и рациональной схемы подготовки посевного материала.2. Подобраны условия выделения, очистки, иммобилизации и стабилизации протеазы, обеспечивающие получение препарата с высокой удельной протеолитической активностью, 3. Очищенный стабилизированный протеолитический фермент является металлопротеазой с широким оптимумом величины рН, температуры, а также обладает в опытах in vivo раноочищающим и ранозаживляющим действием.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Хазиев, Артур Фатыхович

выводы

1. Научно обоснована и разработана промышленная технология получения металлопротеазы, синтезируемой Bacillus subtilis ЗНУ которая включает периодическое глубинное гомогенное культивирование и последующую очистку фермента методами мембранного разделения.

5. Показано, что полученный протеолитический фермент и его модифицированные аналоги являются металлопротеазами с охарактеризованными параметрами (молекулярными массами, оптимальными значениями pH, температуры и спектрами субстратной специфичности).

6. Экспериментально доказана раноочищающая и ранозаживляющая активность протеолитического фермента.

104

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разнообразие свойств протеолитических энзимов, продуцируемых различными микроорганизмами, их прионовая безопасность по сравнению с ферментами животного происхождния, а также обширная область применения требуют пополнения номенклатуры применяемых в практике микробных протеаз.

Основываясь на данных литературы, наиболее перспективными, на наш взгляд, являются ферменты бактерий рода Bacillus. Благодаря генетической и биохимической вариабельности, нетоксичности, авирулентности они наиболее удобны для использования в качестве источника протеаз [29, 36, 54, 60, 77, 94, 103, 156,164].

Известно много способов получения штаммов-продуцентов путем создания мутаций и соответствующей селекции [35].

Однако возможность управления синтетическими свойствами культур путем отбора высокопродуктивных клонов, образующихся при диссоциации штамма-продуцента, позволяет значительно увеличить выход целевого продукта.

По данным литературы бактерии рода Bacillus диссоциициируют на R- и S-формы, образуя при этом несколько типов колоний, отличающихся формой и консистенцией на различных агаризованных средах и чаще всего при выращивании на мясопептонном агаре [16, 19, 25, 26, 110]. Известно, что R- и S-формы, способны образовывать субварианты и отличаются выработкой промышленно-ценных метаболитов.

Наши экспериментальные данные показали, что в процессе гомогенного глубинного культивирования штамма-продуцента Bacillus subtilis ЗН происходило расщепление микробной популяции на R- и S-морфологические варианты. Установлено, что S-вариант имел большую продуктивность по ферменту при выращивании, как на пептонной, так и мочевино-дрожжевой питательной средах.

При дальнейших исследованиях S-варианта обнаружено его способность к расщеплению на несколько типов колоний.

В результате исследования протеазосинтетической активности 200 колоний, находящихся в S-форме, обнаружено, что 6 из них (3 %) проявляли максимальную активность (4-6 ПЕ/мл), которые визуально представляли собой маленькие колонии, размером не более 1 мм, образующие зону гидролиза казеина 12-17 мм.

Для этих клонов исследовали протеазосинтетические свойства. Была установлена идентичность кинетических кривых синтеза протеолитического фермента. Они имели длительные лаг-фазы, соизмеримые экспоненциальные и фазы замедления продукции протеолитического фермента. Отличительной особенностью кинетических кривых 4 и 6 является то, что они не имеют фазы замедления скорости синтеза на изучаемом отрезке времени. Уровень накопления протеолитической активности для клона 4 - составлял 32,7+2,2 ПЕ/мл, а для клона 6 - 35,9+1,8 ПЕ/мл.

Таким образом, нами установлено, что выделение активных клонов из "S-популяции" приводило к 10- кратному увеличению протеазосинтетической активности штамма-продуцента Bacillus subtilis ЗН, по сравнению с исходной культурой.

Для бактерий рода Bacillus в литературе имеются данные об интенсивном потреблении многих неорганических ионов при развитии микробной популяции [74, 108, 112].

Доказано, что отсутствие сульфата железа позволяет микробным клеткам, минуя лаг-фазу, переходить в экспоненциальную фазу роста. При отсутствии сульфата меди лаг-фаза была короткой и составляла 18 ч. Ее продолжительность увеличивалась при выращивании на питательной среде, в которую не добавляли сульфата аммония или сульфата цинка. Удаление из питательной среды фосфата калия и цитрата натрия приводило к снижению количества биомассы, а отсутствие хлорида кальция - к полному подавлению роста клеток.

Таким образом, основными неорганическими компонентами среды, влияющими на процесс накопления биомассы, являются сульфат аммония, цитрат натрия, сульфат цинка, хлорид кальция. Вместе с тем, фосфат калия, может влиять и на продукцию фермента, вызывая замедление клеточного роста.

При исследовании влияния индивидуальных ингредиентов среды на синтез протеазы установлено, что ни один из них не оказывает явного стимулирующего действия.

При масштабировании процесса культивирования штамма-продуцента с использованием промышленного реактора объемом 100 л нами подтверждены закономерности, полученные в лабораторных условиях.

В ходе исследований установлены оптимальные значения параметров процесса культивирования: схема инокуляции реактора, посевная доза от 0,031 до 0,043 млрд кл./мл, давление воздуха 0,2-0,4 кгс/см2. При данных условиях за 25,0+1,2 ч культивирования получали биомассу с концентрацией 15,4+1,4 млрд кл./мл и культуральную жидкость с протеолитической активностью 15,9±1,9 ПЕ/мл.

При проведении следующего этапа исследований основной задачей являлся выбор метода выделения и очистки экзопротеаз, полученных в процессе гомогенного глубинного культивирования на различных питательных средах.

Предложенные рядом авторов [29, 24, 67, 83, 84, 87, 102, 118] методы для выделения и очистки ферментов (сепарирование, центрифугирование, фракционирование) оказались нетехнологичными в силу ряда недостатков: больших потерь объемов материала, трудоемкости, энергоемкости, значительной продолжительности процессов, отсутствия возможности масштабировать.

Наши исследования были проведены в двух направлениях. В начале работы выделение и очистку фермента осуществляли из культуральной жидкости, полученной при выращивании производственного штамма в питательной среде >» с пептоном.

Разделение ферментсодержащей культуральной жидкости гель-хроматографией позволило получить ферментный препарат с удельной активностью 39,5+2,5 ПЕ/мг белка, с выходом 94,4±3,4 %.

Методом ультрафильтрации получили препарат с удельной активностью 2,25+0,08 ПЕ/мг белка, при выходе в пределах 40,7±2,9 %. Низкая степень очистки и выхода фермента указывала на необходимость обратиться к другим методам.

Солевым фракционированием достигли удельной активности фермента, которая составила 21,6±0,6 ПЕ/мг белка при выходе 78,5+2,2 %.

Следующим апробированным методом очистки фермента являлась адсорбция на неорганических гелях гидроокиси алюминия и фосфата кальция. Использование геля гидроокиси алюминия позволило достичь удельной активности 5,6±0,7 ПЕ/мг с выходом 76,6+0,4 %. Более высокие результаты были получены при использовании геля фосфата кальция, при этом удельная активность фермента увеличилась до 10,7±0,8 ПЕ/мг, а выход целевого продукта составил 98,3±1,7 %.

В результате проведенного фракционирования методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе, удельная активность протеолитического фермента увеличилась в 12,78 раз и составила 24,6±1,26 ПЕ/мг белка, а выход протеолитической активности находился в пределах 98,5±0,7 %.

Использование БЕАЕ-целлюлозы позволило достичь активности фермента, соответствующей 6,3±0,3 ПЕ/мг белка, при этом выход продукта составил 89,3+1,2 %.

На следующем этапе отрабатывали технологию очистки культуральной жидкости, полученной при культивировании продуцента в питательной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной.

Разделение ферментсодержащей культуральной жидкости гель-хроматографией позволило получить ферментный препарат с удельной активностью 96,0±2,1 ПЕ/мг белка, при выходе целевого продукта 85,1+2 %.

Методом ультрафильтрации получен препарат с удельной активностью 55,3±0,9 ПЕ/мг белка, при выходе в пределах 74,4±2,1 %.

Полученные нами результаты позволили использовать в дальнейших исследованиях метод ультрафильтрации для выделения протеолитического фермента из культуральной жидкости с дрожжевым экстрактом и мочевиной.

По литературным данным, иммобилизация стабилизирует конформацию фермента, повышая стабильность иммобилизованных ферментов, изменяя его свойства [85, 135,141, 163].

В качестве водорастворимого носителя для иммобилизации использовали полиглюкин, широко используемый в медицине, активированный перйодатом натрия. Иммобилизованный фермент имел активность 80,6±0,4 ПЕ/мл и молекулярную массу 70 kD.

Для стабилизации фермента внутримолекулярными сшивками использовали глютаровый альдегид. Стабилизированный фермент представлял собой мономолекулярную структуру с протеолитической активностью на уровне 69,8+0,6 ПЕ/мл.

На следующем этапе работы изучили свойства металлопротеазы, продуцируемой Bacillus subtilis на мочевино-дрожжевой питательной среде.

Активность нативного фермента выявлена при значениях pH 7,0-9,0. Наибольшая активность иммобилизованного на полиглюкине протеолитического фермента определена при величине pH 7,0. Стабилизированный глютаровым альдегидом фермент имел максимум при значении pH 8,0.

Субстратная специфичность проявлялась в отношении казеина, желатина, коллагена, бычьего сывороточного альбумина, яичного альбумина, трипсина, пепсина. Активность в отношении термически денатурированных белков выше, чем по отношению к нативным белкам.

Экспериментальные данные, полученные в реакции протеолиза казеина, указывали, что при высоких концентрациях субстрата активность протеолитического фермента ниже, чем можно было бы ожидать теоретически по уравнению Михаэлиса-Ментен [61]. Это свидетельствует об ингибировании протеолитической активности избытком субстрата. Иммобилизация протеолитического фермента на полиглюкине и стабилизация его глютаровым альдегидом уменьшала ингибирующее действие субстрата.

Температурный оптимум протеолитической активности нативного фермента отмечен при 52 °С, с повышением температуры его активность резко падала. Фермент, иммобилизованный на полиглюкине, имел температурный оптимум 57 °С, а для фермента, сшитого глютаровым альдегидом,он соответствовал 62 °С.

Время полуинактивации нативного фермента составляло при 37 °С 72 ч. Для фермента, иммобилизованного на полиглюкине составляло 169,5 ч, а для фермента, стабилизированного глютаровым альдегидом - 12,8 ч. Однако при температуре 67 °С активность нативного фермента обнаружить не удалось. Для иммобилизованного на полиглюкине фермента активность обнаруживается в течение 100 мин, а для фермента, стабилизированного глютаровым альдегидом активность регистрировалась в течение 150 мин. Это, очевидно, указывает на стабилизацию молекул фермента.

Ингибирование диизопропилфторфосфтом не оказывало влияния на про-теолитическую активность фермента. Использование этилендиаминтетрауксус-ной кислоты приводило к полной потере активности протеолитического фермента.

При изучении биологической активности протеолитического фермента на модели плоскостной раны выявлено выраженное раноочищающее и ранозажив-ляющее действие. Наибольшей активностью обладал раствор протеолитического фермента в концентрации 25 ПЕ/мл. Эффективность его раноочищающего и ранозаживляющегодействия превосходила таковую у препарата сравнения -коллагеназы КК.

В заключение можно отметить, что ряд вопросов, возникших в процессе работы, требует дальнейшего изучения.

103

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хазиев, Артур Фатыхович, Москва

1. Абрамов В.П. Способ непрерывной очистки растворов биологически активных веществ / В.П. Абрамов, И.М. Сороцкин, Л.С. Лукавый // А.с. № 1009097, S.U. опубл. 1980. - Бюл. № 15.

2. Акмарова В.Х. Субтилизин 72 сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамма 72, близкая субтилизину Карлсберг / В.Х. Акмарова, Л.Г. Беля-нова, Л.А. Баратова и др. // Биохимия. - 1979. - Т. 44, № 5. - С. 886-891.

3. Алексеева В.В. Применение ультрафильтрации для концентрирования ферментного комплекса Bacillus subtilis 103 / В.В. Алексеева, К.А. Калу-нянц // Ферментная и спиртовая промышленность. 1977. - № 4. - С. 28-33.

4. Алексеева В.В. Выделение и исследование некоторых свойств про-теолитических ферментов Bacillus subtilis штамма 103 / В.В. Алексеева, К.А. Калунянц, А.К. Овчаров // МУб промышленность: Реф. сб. 1975. - № 10. -С. 24-26.

5. Аль-Нури М.А. Некоторые свойства экзопротеазы Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens, способная свертывать плазму крови / М.А. Аль-Нури, Т.А. Острошко, Н.С. Егоров // Микробиология. 1978. - Т. 47, № 5. - С. 900905.

6. Амирханян М.М. Способ выделения ферментных препаратов ами-ноацилазы, амилаз и протеаз из Aspergillus otyzae / М.М. Амирханян, В.М. Степанов, О.М. Амирханян, М.Ф. Еланян I/ А.с. № 1654335, опубл. 1989.

7. Ахапкина И.Г. Штамм Bacillus subtilis продуцент фунгицидного вещества / И.Г. Ахапкина, Л.П. Блинкова, Л.Г. Бутова, И.П. Фомкина // Журн. микробиол. - 1995. - № 17. - с. 91-92.

8. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

9. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами / И.А. Баснакьян. М.: Медицина, 1992. - 188 с.

10. Баснакьян И.А. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / И.А. Баснакьян, В.В. Бирюков, В.М. Кантере. М.: Наука,1985.-291 с.

11. Беленький M.J1. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта / M.JI. Беленький. -JL: Медгиз, 1963. С. 81-106.

12. Белокрицкая Г.Ф. Протеаза как усилитель иммунного ответа при иммунизации адсорбированным стафилококковым анатоксином / Г.Ф. Белокрицкая, Ю.В. Дичешко // Журн. микробиол. - 1980. - № 11. - с. 49-52.

13. Березин И.В. Основы физической химии ферментативного катализа / И. В. Березин, К. Мартинек. М.: Высшая школа, 1977. - 233 е.

14. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы / Под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинека // М.: Изд-во Московского университета, 1976. 296 с.

15. Блохина Т.П. Сравнительное электронно-микроскопическое исследование клеток Bacillus thuringiensis, выращенных в хемостате / Т.П. Блохина, H.A. Кострикина, З.В. Сахарова, В.И. Бирюзова // Микробиология. 1992. - Т. 61,№4.-С. 672-677.

16. Бондарчук A.A. Ферментные свойства комплексных препаратов из Bacillus mesentericus в зависимости от состава питательных сред / A.A. Бондарчук, И.В. Колтукова, В.Т. Васкивнюк // М/б. журнал. 1983. - Т 45, № 2. - С. 9295.

17. Бурханов Н.Д. О структуре матриц на основе производных полисахаридов для иммобилизации биологически-активных веществ / Н.Д. Бурханов, С.М. Югай, М.Ю. Юнусов и др. // Химия природ, соед. 1997. - № 4. - С. 632638.

18. Бурцева Э.И. Влияние состава среды на диссоциацию Bacillus subtilis 82 / Э.И. Бурцева, A.C. Тихомирова // Достижения биотехнол. arpoпром. комплексу: Тез. докл. Всес. конф., Черновцы, 14-16 окт., 1991. Черновцы, 1991.-Т. 1.-С. 86.

19. Быков В.А. Производство белковых веществ: В 8 т. Т. 5. Технология ферментных препаратов / В.А. Быков, М.Н. Манаков, В.И. Панфилов и др. -М.: Высш. шк., 1987. 105 с.

20. Варфаломеев С.Д. Биокинетика: Практический курс / С.Д. Варфа-ломеев, К.Г. Гуревич. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

21. Василевская И.А. Эластазная активность бактерий рода Bacillus / И.А. Василевская, A.A. Бондарчук, М.Т. Сергейчук // М/б журнал. 1979. - Т. 41,№6. -С. 607-612.

22. Веремеенко К.Н. Ферменты протеолиза и их ингибиторы в медицинской практике / К.Н. Веремеенко. Киев; 1971. - 215 с.

23. Веселов И .Я. Протеолитический препарат из культур бактерий Bacillus polymyxa штамма 13-13 / И.Я. Веселов, Т.А. Смирнова, H.A. Балашова // Прикл. биохимия и микробиол. 1975. - Т. 11, № 6. - С. 824-826.

24. Выборных С.Н. Биосинтез микроорганизмами рода Bacillus фибри-нолитических ферментов различного механизма действия / С.Н. Выборных, Н.С. Ландау, Н.С. Егоров // Микробиология. 1990. - Т. 59, вып. 5. - С. 782-789.

25. Выборных С.Н. Колониально-морфологическая изменчивость Bacillus licheniformis 28КА в связи с образованием антибиотиков, экзопротеаз и спор / С.Н. Выборных, Е.В. Парыгин, Н.С. Егоров // Биологические науки. -1991.-№12.-с. 127-134.

26. Высоцкий В.В. Полиморфизм как закономерность развития популяций прокариотных организмов /В.В. Высоцкий, П.Л. Заславская, A.B. Маш-ковцева и др. //Биологические науки. -1991. № 12. - с. 5-18.

27. Глянцев С.П. Сравнительное изучение активности протеолитиче-ских ферментов, применяемых в хирургии для очищения гнойных ран / С.П. Глянцев, Т.В. Саввина // Бюл. Эксперим. биологии и медицины. 1996. -№6.-С. 716-720.

28. Говорунова В.А. Способ получения протеолитических ферментов /

29. В.А. Говорунова, П.В. Бабаева, В.В. Шевцов // A.c. № 3794948. -опубл.30.07.91. Бюл. № 28.

30. ГОСТ 12.1.007-76 Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. ССБТ., М., 1976.

31. Государственная фармакопея СССР. Изд. XI. М.: Медицина, 1987. - Вып. 1. - 333 с.

32. Грачева Н.М. Эффективность нового бактерийного препарата био-спорина при лечении острых кишечных инфекций / Н.М. Грачева, А.Ф. Гаври-лов, А.И. Соловьева//Журн. микробиол. 1996. - № 1. - С. 75-77.

33. Гурвич А.Е. Использование целлюлозных матриц в иммунохимии // Иммуносорбенты и их использование в биотехнологии / А.Е. Гурвич // Имму-носорбенты и их использование в биотехнологии: Сб. тр. М.; 1986. С. 5-22.

34. Данющенкова Н.М. Действие линкомицина, химотрипсина и их сочетаний на течение экспериментальной стафилококковой инфекции / Н.М. Данющенкова, Г.А. Карлович, Т.Ф. Беренштейн // Антибиотики. 1978. - № 4. - С. 330-333.

35. Дебабов В.Г. Современные методы создания промышленных штаммов / В.Г. Дебабов, В.А. Лившиц. М.: Высш. шк., 1988. - С. 81.

36. Дембровская Е.М. Способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов / Е.М. Дембровская, О.С. Кузнецова, Е.П. Яковлева // Пат. № 2054479, R.U. опубл. 1996. Бюл. № 5.

37. Демидюк И.В. Вариант очистки генно-инженерной металлопротеи-назы Bacillus amyloliquefaciens / И.В. Демидюк, E.H. Звонкова, Е.А. Носовская // Биотехнология. 1994. -№ 11-12. - С. 13-15.

38. Демина И.С. Микроорганизмы, синтезирующие ферменты тромбо-литического действия / И.С. Демина, С.В. Лысенко // Биологические науки. -1991.-№9.-С. 136-153.

39. Демина Н.С. Морская бактерия Alteromonas piscicida продуцент ферментов тромболитического действия / Н.С. Демина, Е.Ф. Веслова, Г.П. Га-енко // Известия АН СССР: Серия биология, - 1990. - № 3. - С. 415-419.

40. Демина Н.С. Экзопротеазы культуры Streptomyces lovendulae / Н.С. Демина, С.В. Лысенко // Микробиология. 1995. - Т. 64, № 4. - С. 458-460.

41. Диксон М. Ферменты: В 3 т. Т. 1. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982.-340 с.

42. Долгова Г.В. Экспериментальное исследование нового лекарственного препарата для местного применения на основе гентамицина, эритромицина и протеазы С / Г.В. Долгова, В.В. Бережинская, Г.Г. Егоренко // Антибиотики. 1990. - Т. 35, № 9. - С. 28-29.

43. Долгова Г.В. Экспериментальное изучение протеазы С протеоли-тического фермента микробного происхождения / Г.В. Долгова, В.В. Бережинская, Т.П. Свиногеева // Антибиотики. - 1991. - Т. 36, № 1. - С. 29-31.

44. Долидзе Д.А. Исследование комплекса протеолитических ферментов Actinomyces fradiae 119 I Д.А. Долидзе, И.С. Петрова, Р.В. Фениксова // Прикл. биохимия и микробиол. 1974. - Т.10, № 5. - С. 721-726.

45. Дорохов В.В. Специфичность щелочной протеиназы Bacillus mesentericus / В.В. Дорохов, Т.А. Гладких, И.С. Коршунов // Тр. фермент, отд. ВНИИ биосинтеза белковых веществ. 1972. - № 1. - С. 64-65.

46. Дытнерский Ю.И. Баромембранные процессы / Ю.И. Дытнерский. -М.: Химия, 1986.-272 с.

47. Егоров Н.С. Метод диффузии протеолитических ферментов из блоков агара с культурами микроорганизмов / Н.С. Егоров. М.: Наука, 1971. -18 с.

48. Егоров Н.С. Протеолитические ферменты микроорганизмов, обладающие фибринолитической и коагулазной активностями / Н.С. Егоров // Итоги науки и техники. 1978. - № 9. - С. 5-40.

49. Егоров Н.С. Очистка i §ея1а властвост1 протеази Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens, здатно i згортати плазму Kpoei / Н.С. Егоров, М.А. Аль-Нури, Т.А. Острошко // М/б журнал. 1977. - № 4. - с. 507-509.

50. Егоров Н.С. Влияние аминокислот на синтез экзопротеазы Bacillus thuringiensis / Н.С. Егоров, Ж.К. Лория, Т.Г. Юдина // Прикл. биохимия и микробиол. 1983. - Т. 19, № 5. - С. 610-614.

51. Егоров Н.С. Способ получения очищенного протеолитического фермента / Н.С. Егоров, Т.Г. Юдина, Ж.К. Лория // Пат. № 732382, СССР. -Опубл. 1980. Бюл. № 17.

52. Ежов В.А. Способ выделения комплекса литических ферментов / В.А. Ежов, Л.В. Троицкая, П.П. Рухлова // A.c. № 1755581, S.U. Опубл. 1995. Бюл. № 23.

53. Ефимов Ю.М. Способ лечения гнойных ран / Ю.М. Ефимов, С.Н. Загребельный, Л.В. Земцова // A.c. № 1936919, СССР. Опубл. 1982. Бюл. № 23.

54. Знаменская Л.В. Биосинтез внеклеточных ферментов Bacillus intermedius / Ю.М. Ефимов, С.Н. Загребельный, Л.В. Земцова // Микробиология. 1986. - Т. 55, вып. 3. - С. 449-454.

55. Знаменская Л.В. Регуляция биосинтеза внеклеточных ферментов Bacillus intermedius 3S-19 / Л.В. Знаменская, Н.В. Феоктистова, И.Ф. Лобашева и др. // Приют, биохимия и микробиол. 1995. - Т.31, № 4. - С. 412-416.

56. Иванова Л.Г. Содержание растворенного кислорода в микробиологических питательных средах / Л.Г. Иванова, А.К. Варгина, И.Д. Горбачев // Журн. микробиол. 1985. - № 8. - С. 22-26.

57. Ильин Г.И. Производство ферментных препаратов микробного синтеза для медицины / Г.И. Ильин, Б.В. Москвичев // Сб. науч. ст.: Ферменты микроорганизмов: Сб. науч. Статей. Ленинград, 1987. - Ч. 2. - 320 с.

58. Имшенецкий A.A. О фибринолитической активности естественных вариантов Bacillus mesentericus / A.A. Имшенецкий, Г.В. Черкесова, И.Д. Касаткина//Микробиология. 1987. - Т. 56, № 9. с. 947-950.

59. Ицкович Е.Л. Биосинтез щелочной внеклеточной протеазы Bacillusintermedius / E.JI. Ицкович, Jl.B. Знаменская, Н.П. Балабан // Микробиология. -1995. Т. 64, № 5. - С. 623-629.

60. Келети Т. Основы ферментативной кинетики: Пер. с англ. / Т. Келе-ти. М.: Мир, 1990. - 350 с.

61. Клепикова Ф.С. Штамм бактерий Bacillus megaterium продуцент металлопротеиназы / Ф.С. Клепикова, Г.Г. Честухина, М.Е. Борматова // A.c. № 1440921, S.U. - Опубл. 1988. Бюл. № 44.

62. Коваленко Э.А. Закономерности биосинтеза гидролаз Bacillus mesentericus на разных средах / Э.А. Коваленко, Н.В. Колтукова, Т.В. Стрель-чина // Прикл. биохимия и микробиол. 1990. - Т. 26, № 4. - С. 528-533.

63. Кованова В.В. Коллагенопластика в медицине / Под ред. В.В. Кова-нова.-М. 1978.-260 с.

64. Койдуш Г.А. Очистка и концентрирование кислой протеазы / Г.А. Койдуш // Ферментная и спиртовая промышленность. 1982. - № 5. - С. 2325.

65. Колтукова Н.В. Стабилизация комплексного ферментного препарата из Bacillus mesentericus двухвалентными катионами металлов / Н.В. Колтукова // М/б. журнал. 1983. - Т. 45. - № 2. - С. 94-95.

66. Колтукова Н.В. Подбор методов выделения протеолитического ферментного комплекса из Bacillus mesentericus, штамма 316 при глубинном выращивании / Н.В. Колтукова, В.Т. Васкивнюк // М/б. журнал. 1980. - Т. 42, №2.-С. 245-251.

67. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под ред. Е.А. Кост. М.: Медицина. 1975. - 389 с.

68. Кушнер В. П. Конформационная устойчивость и денатурация биополимеров / В. П. Кушнер. Л.: Наука. - 1977. - 230 с.

69. Лазорев Н.В. Воспроизведение заболеваний для экспериментально-терапевтических исследований / Под ред. Н.В. Лазорева. М.: Медгиз. - 1954. -392 с.

70. Ландау Н.С. Особенности накопления в среде и некоторые свойствапротеолитических ферментов, образуемых Nocardia minima / Н.С. Ландау, Н.С. Егоров // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 1. - С. 42-47.

71. Логинова Л.Г. Использование ферментных препаратов (протеазы и амилазы), выделенных из термоустойчивого штамма Bacillus mesentericus / Л.Г. Логинова, В.Г. Бабакина, Г.Я. Калмыкова // Прикл. биохимия и микробиол.- 1965.-Т. 1, № 3. -С. 263-268.

72. Лория Ж.К. Влияние аминокислот на синтез внеклеточных протеаз у Serratia marcescens / Ж.К. Лория, Б. Брюкмер, Н.С. Егоров // Микробиология.- 1977.-№ 1.-С. 41-44.

73. Лысенко C.B. Действие солей металлов на экзопротеазную активность культуры Streptomyces lavendulae / C.B. Лысенко, Н.С. Демина // Прикл. биохимия и микробиол. 1996. - Т. 32, № 2. - С. 228-230.

74. Маркарян А.Н. О субстратной специфичности внутриклеточной се-риновой протеиназы Bacillus subtilis I А.Н. Маркарян, В.И. Остославская, В.К. Швядас // Биохимия. 1980. - Т. 45, № 7. С. 71-75.

75. Мартинек К. Успехи химии / К. Мартинек, И. В. Березин // T. XLIX.- Вып. 5, Май. 1980. - С. 737-762.

76. Мартьянов В.А. Получение высокоактивных препаратов нейтральной протеазы Bacillus subtilis / В.А. Мартьянов, А.Ф. Зябрев, Б.П. Финогенов // Ферменты микроорганизмов: Сб. ст. -М.: ВНИИСЭНТИ, 1989. С. 175-185.

77. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А. Меркулов.- Л.: Медицина, 1969. 423 с.

78. Милько Е.С. Нестабильность синтеза практически ценных веществ бактериями и процесс диссоциации / Е.С. Милько // Прикл. биохимия и микробиол. 1990. - Т.26, № 6. - С. 732-742.

79. Милько Е.С. Влияние физико-химических факторов среды на рост диссоциантов некоторых грамположительных бактерий / Е.С. Милько, Н.С. Егоров И Биол. науки. 1992. - № 5. - С. 89-96.

80. Михайлова H.A. Способ получения протеолитических ферментов из бактерий рода Bacillus / Михайлова Н.А, Кузнецова Т.Н., Зобова Т.И. и др. //

81. Пат. № 2112035, РФ. Опубл. 1998. Бюл. № 15.

82. Морозова И.П. Выделение и характеристика металлопротеиназы Bacillus megaterium / И.П. Морозова, Г.Г. Честухина, М.Е. Борматова // Биохимия. 1993. - Т. 48, № 6. - С. 896-907.

83. Морозова И.П. Металлопротеиназа Bacillus mesentericus штамма В-313 / И.П. Морозова, М.П. Юсупова, М.Ю. Гололобов // Биохимия. 1993. - 58. - № 9. - С. 1420-1429.

84. Неклюдов А.Д. Получение и свойства панкреатина иммобилизованного на карбоксиметилцеллюлозе / А.Д. Неклюдов, А.Н. Иванкин, М.И. Бабурина // Прикл. биохимия и микробиол. 1998. - Т. 34, № 1. - С. 61-65.

85. Нестерова Н.Г. Субстратная специфичность ферментов Bacillus mesentericus / Н.Г. Нестерова, Г.В. Черкесова, Н.Ф. Кириллова // Микробиология. 1989. - Т. 58, № 4. - С. 48-55.

86. Нехотяева Е.В. Внеклеточные гидролазы Bacillus intermedius. Выделение и свойства / Е.В. Нехотяева, М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан. Казань: Казан, университет, 1995. - 18 с.

87. Николаев Ю.А. Адгезивные и ростовые свойства R- и S-диссоциантов Pseudomonas fluorescens / Ю.А. Николаев, Е.С. Милько // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 2. - С. 293-294.

88. Остерман J1.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / JI.A. Остерман. М.: Наука, 1985. - 536 с.

89. Паберит Н.Ю. Способ выделения нейтральной металлопротеазы / Н.Ю. Паберит, М.С. Панк, A.A. Авиксаар // A.c. № 908088, S.U. Опубл. 1980. Бюл. № 16.

90. Паберит Н.Ю. Очистка и свойства нейтральной металлопротеиназы из термофильной бактерии Bacillus brevis / Н.Ю. Паберит, М.С. Панк // Биохимия. 1984. - Т. 49, № 2. - С. 275-281.

91. Павлова Е.С. Очистка культуры Bacillus subtilis 82 перед концентрированием методом ультрафильтрации / Е.С. Павлова, В.А. Кудряшова, Н.С. Погоржельская. М.: ВНИИ Пищ. биотехн., 1989. - 14 с.

92. Парр Г.С. Ультрафильтрационные процессы выделения биологически активных веществ / Г.С. Парр, Т.И. Рожанская. М.: ЦБНТИ Медбиопрома, 1986.-Вып. 6. -32с.

93. Паршина С.Н. Штамм бактерий Bacillus cereus продуцент протео-литических ферментов с тромболитическим действием / С.Н. Паршина, A.A. Имшенецкий, Н.Г. Нестерова //A.c. № 1615177, S.U. - Опубл. 1990. Бюл. № 47.

94. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / Перт С. Дж. М.: Мир, 1978. - 330. с.

95. Петрова К.П. Влияние углеводов на биосинтез внеклеточных про-теиназ с молокосвертывающим действием М-вариантом Bacillus subtilis штамма 76 / К.П. Петрова, Т.Н. Антонова, У.А. Николаева // Act. microbiol. bulg. 1991. -№28. -С. 40-45.

96. Позмогова И.Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях / И.Н. Позмогова. М.: Наука, 1983. - 104 с.

97. Полянцев Н.И. Среда для культивирования бактерии-симбионта Bacillus pulvifaciens или Bacillus subtilis продуцента пробиотика / Н.И. Полянцев, JI.B. Ропаева, В.В. Подберезный // Пат. № 2100029, RU. - Опубл. 27.12.97. Бюл. № 36.

98. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов / Ф. Прист. -М.: Мир, 1987.- 113 с.

99. Прокопенко Л.Г. Влияние трипсина на иммунный ответ при локализованной стафилококковой инфекции / Л.Г. Прокопенко, Г.А. Чалый // Журн. микробиол. 1984. - № 4. - С. 104-108.

100. Работнова И.Л., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов / И.Л. Работнова, И.Н. Позмогова. М.: Наука, 1979. - 208 с.

101. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды / А. Сассон. М.: Мир, 1987.-411 с.

102. Северин А.И. Металлопротеиназа / А.И. Северин, O.A. Степная, И.С. Кулаев // A.c. № 1594214, S.U. Опубл. 1990. Бюл. № 35.

103. Сиголаева Л.П. Влияние температурного коллапса матрицы на активность иммобилизованного фермента а-химотрипсина / Л.П. Сиголаева, H.A. Еремеев, Н.Ф. Казанская // Биотехнология. 1993. - №5. - С.36-39.

104. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М.: Мир, 1985.358 с.

105. Слабоспицкая А.Т. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов / А.Т. Слабоспицкая, С.С. Кры-мовская, С.Р. Резник // М/б. журнал. 1990. - Т. 52, № 2. - С. 9-14.

106. Смирнов В.В. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации / В.В. Смирнов, А.И. Осадчая, В.А. Кудрявцев и др. // М/б. журнал. 1993. - Т. 55, № 3. - С. 38-44.

107. Смирнов В.В. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская. - Киев: Наукова Думка, 1982. - 280 с.

108. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов / И.Б. Сорокулова // Антибиот и химиотер. 1996. - Т. 41, № 10. - С. 13-15.

109. Стронгин А.Я. Сравнительное изучение множественности экзо-ферментов, продуцируемых различными мутантами Bacillus subtilis / А.Я. Стронгин, A.A. Лукин, Л.С. Изотова и др. // Микробиология. 1977 - Т. XLV1. -Вып. З.-с. 539-546.

110. Стручков В.И. Гнойная рана / В.И. Стручков, A.B. Григорян, В.К. Гостищев. М. - 1975. -311 с.

111. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология / К. Харвуд. -М.: Мир, 1992.-472 с.

112. Хванг С.Т. Мембранные процессы разделения / С.Т. Хванг, К. Коммермейкер. М.: Химия, 1981. - 464 с.

113. Холодная Ж.В. Разработка технологи получения протеолитического ферментного комплекса из бактерий рода Bacillus: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Ж.В. Холодная; УфНИИВС им. И.И. Мечникова ГУЛ "Иммунопрепа-рат". Уфа, 1999.-30 с.

114. Чалый Г.А. Иммуностимулирующее и протективное действие препаратов террилитина при стафилококковой инфекции / Г.А. Чалый, Л.Г. Прокопенко, В.В. Вельский // Антибиот. и химиотер. 1988. - Т. 33. - № 5. - С. 362364.

115. Чанг Т. М. Искусственная клетка / Т. М. Чанг. Киев: Наукова думка, 1979. - 204 с.

116. Черкасов А.Н. Мембраны и сорбенты в биотехнологии / А.Н. Черкасов, В.А. Пасечник. Л.: Химия, 1991. - 240 с.

117. Шагинян К.А. Металлопротеиназа из Bacillus subtilis внеклеточные и внутриклеточные ферменты / К.А. Шагинян, Л.С. Изотова, Ю.В. Йоман-тас // Биохимия. - 1980. -Т. 45, № 11. - С. 2083-2095.

118. Шишкова Э.А. Концентрирование и очистка щелочной протеазы методом ультрафильтрации / Э.А. Шишкова, С.С. Фокина // Прикл. биохимия и микробиол. 1981. - Т. 17, № 2. С. 187-192.

119. Шишкова Э.А. Способ получения очищенной щелочной протеина-зы Bacillus subtilis / Э.А. Шишкова, С.С. Фокина, Л.И. Орещенко // A.c. № 942428, S.U. Опубл. 1980. Бюл. № 32.

120. Bond W.W. Termal profile of a Bacillus species (ATCC 27380) extremely resistant to dry heat / W.W. Bond, M.S. Favero // Appl. Microbiol. 1975. -V. 29.-№6.-P. 859-860.

121. Chen Jie. Sugar-based prtease composition for use with constant-pH borate buffers / Chen Jie. United States Patent № 5494817. - 1996.

122. Claire Vieille, Gregory J. Zeikus. Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanisms for Thermostability / Claire Vieille, Gregory J. Zeikus // Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2001. Vol. 65? № 1. -P. 1-43.

123. Czor R., Bucher T. Crystallised enzymes from the myogen of rabbit skeletal muscle / R. Czor, T. Bucher // Advan. Prot. Chem. 1960. - Vol. 15. - P. 315-415.

124. Damodaran M. The proteolytic system of Bacillus licheniformis / M. Damodaran, V.S. Govindarajan, S.S. Subramanian // Biochim. Biophys. Acta. 1955. -Vol. 17.-P. 99-103.

125. Dijhuizen L. Microbial responses to changes in growth conditions / L. Dijhuizen // Forum Microbiol. 1989. - V. 12. - № 1-2. - P. 40-43.

126. Fukumoto J. Purification and some properties of a neutral proteinase of Bacillus subtilis / J. Fukumoto, T. Yamamoto, K. Ickikacva // Studies on bacterial proteinases // J. Agric. Chem. Soc. 1958. - Vol. 32. - P. 230-233.

127. Godfrey T. Industrial enzymology / T. Godfrey; S. West. 2nd ed., Mac-millan Publisher Inc., Ney York, 1996. - P. 3.

128. Guntelberg A.V. Preparation of crystals containing the plakalbumin -forming enzyme from Bacillus subtilis / A.V. Guntelberg, M. Ottesen // Nature. -1952.-Vol. 170.-P. 802-809.

129. Hagihara B. Crystalline bacterial proteinase. I. Preparation of crystalline proteinase of Bacillus subtilis / B. Hagihara, H. Matsubara, M. Nakai // J. Biochem. -1958.-Vol. 45.-P. 185-191.

130. Hall F.F. Multiple proteolytic enzymes of Bacillus licheniformis / F.F. Hall, H.O. Kunkel, J.M. Prescott // Arch. Biochem. Biophys. 1966. - Vol. 114.-P. 145-150.

131. Hartley B.S. Proteolitic enzymes / B.S. Hartley // Annual Rev. Biochem. 1960. - Vol. 29. P. 45-72.

132. Hayashi Sachia. Immobilization of p-fructofroanosidase from Aureo-basidium on DEAE-cellulose / Hayashi Sachia, Sasao Siniji, Takasaki Yoshiuki, Imada Kiyohisa. // J. Ind. Microbiol. 1994. - Vol 13. - № 2. - P. 103-105.

133. Hunt J.A. A comparison of three proteinases from various strains of Bacillus subtilis / J.A. Hunt, M. Ottesen // Biochim. Biophis. acta. 1961. - Vol. 48. -P. 411-415.

134. Keay L. Neutral proteases of the genus Bacillus / L. Keay // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1969. - Vol. 36. - P. 257-262.

135. Kohlmann K.L. Purification and characterization of an extracellular protease produced by Pseudomonas fluoresceins / K.L. Kohlmann, S.S. Nielsen, M.R. Ladisch // J. Dai rysci. 1991. - Vol. 74, № 12. - P. 4125-4136.

136. Kubo M. Mechanism of thermostability in thermolysin analysis of subsite S2 mutant enzymes of thermolysin / M. Kubo, K. Itoh, K. Nishikawa et al. // Letters in Applied Microbiology 1999. - Vol. 28, № 6. - P. 431-438.

137. Lowry O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent /

138. O.H. Lowry, H.I. Rosenbrough, A.L. Faar // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - p. 265275.

139. Maceda-Coronel L. Production of proteolytic enzyme from a local strain of Bacillus subtilis / L. Maceda-Coronel, V.E. Orillaza, L. Arguelles // Philipp. J. Sci. 1974. - Vol. 103, № 3. - P. 149-163.

140. Martinez I. Immobilizacion de trypsina en diferentes soportes / I. Martinez, M. Gonzales // Rev.biol. 1992. - Vol. 6, № 2. - P. 90-95.

141. Matsubara H. Crystalline bacterial proteinase. On the reaction with di-isoproppyl fluorophosphate / H. Matsubara, S. Nishimura // J. Biochem. 1958. -Vol. 45. - P.503.

142. McConn I.D., Tsuru D., Yasunobu K.T. Bacillus subtilis neutral proteinase. A zinc enzyme of high specific activity / I.D. McConn, D. Tsuru, K.T. Yasunobu//J. Biol. Chem. 1964. - Vol. 239. - P. 3706-3708.

143. Melander W. Salt effects on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: An interpretation of the lyotropic series / W. Melander, C. Horvath // Arch. Biochem. Biophys. 1977. — Vol. 183, № 3. - P. 200-215.

144. Michotey Valerie. Characterization of an endoserine protease secreted by Arthrobacter aureus / Michotey Valerie, Blanco Carlos // Appl. and Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 60, № 1. - P. 341-343.

145. Neet K.E. The conversion of serin at the active site of subtilisin to cysteine: a chemical mutation / K.E. Neet, D.E. Koshland // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1966.-Vol. 56.-P. 1606-1609.

146. Nelson, J.M., Criffit E.G.J. (1916) J. Amer. Chem. Soc., 38, 1109.

147. North M.I. Comparative biochemistry of the proteinases of eucaryotic microorganism / M.I. North // Microbiol., Rev. 1982. - Vol, 46. - P. 308-340.

148. Parrado Juan. Immobilization and stabilization keraza, a serine protease from Streptomyces fradiae, by covalent attachment to porous glass / Parrado Juan, Bautista Juan // Biosci. Biotechnol. and Biochem.-1995. -Vol. 59, № 5. P. 906-907.

149. Peek Keith. Thermus sp. purification and characterization of a thermostable proteinase isolated from Thermus sp. strain Rf 41A / Peek Keith, Daniel Roym, Menk Colin, Purker Lynne, Coolbear Tim // Eur. J. Biochem. 1992. - Vol. 207, № 3.-P. 1035-1044.

150. Phamthi T. Serin neutral proteinase from Bacillus pumilis as metalloenzyme / T. Phamthi, H. Urbanek // Acta microbiol. pol. 1974. - Vol. 36, № 1. - P. 2125.

151. Polgar L. The reactivity of thiol-subtilisin an enzyme containing a synthetic functional group / L. Polgar, M.L. Bender // Biochemistry. 1967. - Vol. 6. - P. 610-615.

152. Priest F.G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus / F.G. Priest // Bacteriol. Rev. 1977. - Vol. 41. - P. 711-753.

153. Qiu Xiubao. Изучение очистки и ряда свойств протеазы из Bacillus pumilus / Qiu Xiubao, Gao Dong, Wang Yingda et al. // Acta microbiol. sin. 1994. -Vol. 34, № 4. - P. 293-300.

154. Rappaport H.P. A Bacillus subtilis proteinase. Production, purification and characterization of a proteinase from a transformable strain of Bacillus subtilis / H.P. Rappaport, W.S. Riggsby, D.A. Holden // J. Biol. Chem. 1965. - Vol. 240.1. P. 78-81.

155. Rodriewicz A. Wykorzystanie bacterii z rodzaju Bacillus do produckcj'i pozakomoakowych proteinaz Cz.II / A. Rodriewicz // Zesz. nauk. AR Wroclawiu Technol. Zyw. 1989. - № 5. - P. 207-217.

156. Ruttlof H. Proteasen aus thermophilen microorganismen / H. Ruttlof // Naturwiss. R. 1978. - Vol. 27, № 2. - P. 123-133.

157. Santos I.A.L. Recovery of alkaline proteases by membrane filtration. Effect of membrane type and addition of submicron sized charged particles / I.A.L. Santos, I.M.S. Cabral, C.C. Cooney // Bioprocess. Eng. 1992. - Vol. 7, № 5. -P. 205-211.

158. Stoeva S.T. Studies on the inhibition of a zinc proteinase from Bacillus mesentericus strain 76 by 1,10 phenanthroline / S.T. Stoeva // Докл. A.H. -1991. T. 44, № 6.-C. 41-44.

159. Strongin A.Y. Dicect comparison of the subtilisin like intracellular protease of the Bacillus licheniformis with the homologous enzymes of Bacillus subtilis / A.Y. Strongin//J. Bacterid.- 1979.-Vol. 137, №2.-P. 1017-1019.

160. Takegawa Kaoru. Purification and characterization of alkaline proteinase from Arthrobacter protophormiae / Takegawa Kaoru, Мои Le Hong, Miyauchi Chiemi, Iwahara Shojiro // Tech. Bull. Fac. Agr. Kagawa Univ. 1993. - Vol. 45, №2.-P. 115-120.

161. Tanford C. The hydrophobic effect: Formation of micelles and biological membranes: 2nd ed. / C. Tanford. New York: Wiley-Interscience, 1980. - 231 p.

162. Van Duzee. Stable liquid enzyme compositions and methods of use / Van Duzee, Barry F. Stone, P. Ralph // United States Pat. № 5,576,278. 1996.

163. Van-Kova H. Stabilization of trypsin by glycosylation / H. Van-Kova, M. Pospililovi, M. Ticha, I. Turkova // Biotechnol. Techn.-1994. Vol. 8, № 6. - P.375.380.

164. Ward O.P. Proteinases / O.P. Ward // in: Microbiol Enzymes and Biotechnology. Applied Science. 1983, London. - P. 251-317.

165. Welker N.E. Unrelatedness of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis / N.E. Welker, L.L. Campbell // J. Bacteriol. 1967. - Vol. 94. - P. 11241127.1. БЛАГОДАРНОСТЬ

166. Выражаю глубокую признательность директору Уфимского ФГУП НПО "Микроген" МЗ РФ, филиал "Иммунопрепарат" д.м.н. Алсынбаеву Махамату Махаматуловичу за помощь и советы при выполнении работы, а также сотрудникам лаборатории бактерийных препаратов.

Информация о работе

Хазиев, Артур Фатыхович
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Получение и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы